JP2023503302A - スピン凝集した神経系マイクロスフェアおよびその応用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養する工程と、ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程と、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程と、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、神経系マイクロスフェアを収集する工程と、を含む、神経系マイクロスフェアを取得するための方法に関する。
Description
本発明は、概して、ヒト胚性幹細胞などの幹細胞の分野に関する。幹細胞由来神経系細胞を取得するための方法が提供される。詳細には、神経系細胞を含む幹細胞由来神経系マイクロスフェアを取得するための方法が提供される。
様々な病態の治療にヒト多能性幹細胞を使用する見通しは非常に有望であると考えられる。治療には、パーキンソン病および脳卒中などの神経学的状態の細胞置換療法が含まれる。しかしながら、かかる治療が実行可能になるためには、中枢神経システム（ＣＮＳ）にそれらを送達するための幹細胞由来産物を人工的に産生するためのインビトロ方法の開発が必要である。
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を神経系統に分化させるプロセスは、２Ｄ接着培養様式において非常に効率的で堅牢なプロセスとなっている。このために、ｈＰＳＣは、典型的には、まず有糸分裂ｈＰＳＣから有糸分裂神経幹細胞または神経系前駆幹細胞（ＮＰＳＣ）に分化し、次にこれらを（任意に）最小有糸分裂または有糸分裂後中間前駆体、放射状グリアまたは神経芽細胞段階（集合的にＮＢ細胞）、最後に最終的に分化する有糸分裂後ニューロンに分化することによって、発生を再現するいくつかの段階を経る。神経系前駆幹細胞または芽細胞（ＮＳＰＢＣ）から２Ｄのニューロンへの分化は、ニューロンの純度が高い培養物を生じさせ、これらの培養物は、ニューロン間の広範な神経突起伸長および相互接続性によって特徴付けられる。しかしながら、これらの培養物は、本質的に、物理的性質によって、構築的／物理的に脆弱なネットワークである。三次元構造でニューロンを産生する三次元懸浮遊培養工程を含むいくつかのプロトコルが存在するが、これらはしばしば有糸分裂神経系細胞のニッチを含む低効率で行われ、典型的には非常に大きく、ＣＮＳへの移植には適さない。
広範な神経突起の成長、接続性、および脆弱性により、細胞死の劇的なレベルを生じさせることなく、ＣＮＳへの送達のために二次元接着性ニューロン培養物を物理的に操作、収集、または濃縮することは不可能となる。例えば細胞療法の目的で、ＣＮＳ内に追加のニューロンを配置するための主な方法は、神経性幹前駆細胞（ＮＳＰＣ）および／または神経芽細胞の調製物を移植し、インビボでニューロンに分化を進めることを可能にすることである。ＮＳＰＣは、最終的な分化ニューロンの脆弱な構造を有しておらず、酵素および／またはキレート剤で解離し、単一（または２個～１０個の細胞クラスター）細胞浮遊液として濃縮して、神経外科手術に必要な細い直径の外科用送達装置に積載することができる。次いで、分化はインビボでニューロンおよび最終的な分化細胞型に進行するが、このプロセスは完了するまでに数日から数ヶ月を要し、これをインビトロで促進および誘導するために使用される外因性因子は、ＣＮＳに容易に送達することができず、成人の脳には存在しないか、最小限しか存在しないため、容易に制御することができない。
ＮＳＰＢＣのＣＮＳへの移植にはいくつかの問題がある。ＣＮＳに送達されるＮＳＰＢＣ調製物は、完全にまたは実質的に有糸分裂細胞で構成されており、これらは、過剰な増殖または潜在的な腫瘍形成に関して安全上のリスクを提起する。さらに、神経系細胞療法のための主要な投与の方法は、ニューロンの宿主回路ネットワークへの機能的統合を介したものである。有糸分裂神経系幹細胞調製物は、移植細胞の機能的統合が達成される前に、インビボでニューロンへのさらなる分裂および分化を受けなければならず、このプロセスは、移植のずっと後に生じる。ＮＳＰＣもまた多能性であり、それらが生成し得るいくつかの最終的な細胞型を有する。ＮＳＰＣは、インビトロまたはインビボのいずれかでニューロンなどの最終的な細胞型に成熟され得る。神経系幹細胞分化プロセスの制御は、所望のサブタイプの高度に均質な最終的な分化集団を確保するために必要である。インビトロでは、このプロセスは、開始未分化細胞（ｈＰＳＣ）から最終／有糸分裂後段階（すなわちニューロン）までずっと、タンパク質および小分子で細胞を処理することによって、開始から終了までその全体で制御することができ、高純度の培養物をもたらす。インビボ分化の効率は、比較すると劇的に低い。インビボでの分化を制御することの難しさは、出生後の中枢神経システムがＮＳＣ療法の移植部位である結果である。詳細には、移植後に脳は閉鎖され、分化促進分子は移植細胞に容易に送達することができない（隣接する成人組織への付随的効果なく）。成人の脳は、分化を誘導するための発生シグナルを産生せず、分化を制御する発生ニッチ、誘導合図、または化学勾配を保有しない。
ニューロスフェアは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に対する神経系分化プロトコルの出現以来広く使用されている培養様式の一種であり、主にＮＳＣおよび前駆体細胞から成る。ニューロスフェアは非常にサイズが大きく、典型的には数千の細胞を含み、数百マイクロメートル、またはさらに数ミリメートルの直径であり、常に浮遊状態で培養され、多くの場合、それらはｈＰＳＣ自体から形成されるため、時間の経過とともに高レベルの細胞分裂およびサイズ増加を経験する。特にこれらのサイズの寸法は、外科用装置内に適合し、患者の脳に送達するのには適していない。ニューロスフェアをニューロンに分化させるためには、これは現在、インビボでの解離および移植、または二次元細胞外マトリックスコーティングインビトロシステムへのスフェア全体または解離したスフェアの再播種のいずれかを必要とする。ニューロスフェアのサイズが大きいため、ニューロスフェア全体を播種すると、付着不良が生じ、したがってこれらの細胞を維持する上で技術的課題が生じる。
現在、ＮＳＣをニューロン（高純度、＞８０％のニューロン）に成熟させるすべてのインビトロ方法は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との接触を必要とする。ＮＳＣの解離単層２Ｄ培養物または再播種もしくは解離ニューロスフェア全体は、神経突起形成およびニューロン分化のために細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の追加を必要とする。
ニューロスフェアなどの神経系統細胞を含むスフェアを生成するための代替的アプローチが存在する。しかしながら、これらはいくつかの点で異なる：典型的には、それらは、一定の寸法のスフェアを生成せず、不均一な細胞組成物を有するスフェアを生成し、より大きな寸法のスフェアをもたらす自発的凝集によって生成される。自発的に凝集したスフェアおよびスピン凝集したスフェアは、典型的には、約２００～１０００μｍの直径で、スフェア当たり＞１０００個および最大１０，０００個の細胞が播種され、約７０～１２０μｍ（げっ歯類の場合）または９００～１１００μｍ（ヒトの場合）のカニューレを介した細胞溶液の体積の送達の標準的な方法を使用してＣＮＳに送達するにはサイズが大きすぎると報告されている。これらのより大きなサイズは、それらの不均一な細胞の性質およびかかる大きなサイズの細胞構造における栄養素の拡散に関する問題のために、通常、スフェアの中心に壊死性コアを有する。神経系目的のためのスピン凝集法の事例はほとんど報告されておらず、すべて、出発物質としてｈＰＳＣを使用する。出発物質としてｈＰＳＣを使用する場合、これらのスピン法はパターン化／分化およびインビトロ培養を必要とし、大きなニューロスフェアをもたらす。上述の課題に対処する方法が存在する。特許文献１は、細胞をニューロンに培養および分化させるためのカスタムカプセル化技術および特殊なバイオリアクターによって、細胞外マトリックスタンパク質および溶液の層内にネストされた細胞の小さなクラスターとして３Ｄで分化の全体または一部を実行することにより、生存能力を損なうことなくニューロンをインビボに配置することを記載している。しかしながら、特許文献１に従った方法は、高機能のカスタムバイオプリンティング機械を必要とし、細胞外マトリックスおよび少なくともカプセル化の残存物を含む最終生成物を提供する。これは、患患者に安全な治療を提供することを目的とする場合、医薬品の観点からは望ましくない。
したがって、本発明の目的は、前述の課題を克服すること、特に、患者への送達に好適である純粋な幹細胞系ニューロン産物を得るための単純な方法を提供することである。
上記に概説した目的は、本発明の態様によって達成される。加えて、本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかになるであろうさらなる課題を解決することができる。
本発明の第１の態様は、神経系幹前駆芽細胞(neural stem precursor blast cells)を提供する工程と、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェア(neural microsphere)を形成する工程と、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、神経系マイクロスフェアを取得するための方法を提供することである。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞を提供することは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養する工程と、ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程と、を含む。したがって、本発明の一態様は、前述の方法に従って取得可能な神経系細胞を含む神経系マイクロスフェアに関する。本発明のさらなる態様は、医薬品として使用するための神経系マイクロスフェアに関する。詳細には、それは神経系状態の治療のための神経系マイクロスフェアの使用に関する。本発明の一実施形態では、神経系マイクロスフェアの神経系細胞は、パーキンソン病の治療に使用するためのドーパミン作動性前駆体細胞などの中脳ニューロンである。
本発明は、制御されたスピン凝集などの凝集を介して、最小（例えば、外因性細胞外マトリックス成分またはヒドロゲルもしくはアルギン酸塩などの他の生体材料を必要としない）および静的非接着状態で神経系マイクロスフェアをインビトロで形成するための方法を提供し、それにより、ＣＮＳ移植のための送達装置への直接的な積載に好適な、制御された最小サイズの最終的な分化子孫（特にニューロン）の生成が可能となる。したがって、従来の二次元培養法とは異なり、本発明は、細胞外マトリックスの存在下または細胞外マトリックス内に埋め込まれる培養を必要とせず、したがって、細胞を、最小限の条件で神経系細胞または他の最終的な細胞型に成熟させることを可能にする、より純粋で単純化された方法である。本発明による、従来の２Ｄ培養方法と比較した神経系マイクロスフェアの１つの利点は、より小さなサイズである。しかしながら、神経系細胞を神経系マイクロスフェアに凝集させる方法は、神経系細胞が神経系マイクロスフェアで実質的に神経突起の過剰な成長なしに成熟する条件を提供する。それにより、神経系マイクロスフェアは、通常、ヒト脳に移植された場合に、低い生存率、および統合するための低い能力を有し、拡張された分離不可能な網目にのみ存在する成熟の神経系細胞を含む。しかしながら、神経系マイクロスフェアの成熟神経系細胞は、異なる環境に移ると、それらの特性および神経突起を形成する能力を維持する。これにより、ニューロンの宿主回路ネットワークへの非常に迅速な機能的統合が可能になり、脳への生着後の神経突起の形成が直ちに生じる。したがって、本発明は、ＣＮＳへの移植のためにそれらの最終的な運命に成熟した神経系細胞を提供するという主要な課題を克服する。これは、ＣＮＳに送達される調製物は、完全にまたは実質的に有糸分裂後細胞で構成されており、これらは、過剰な増殖または潜在的な腫瘍形成に関して安全上のリスクをほとんどもたらさないため、患者の安全性を著しく改善する。さらに、本発明の方法は、インビトロで／ヒトの操作者による完全な分化プロセスの制御を可能にし、これにより、所望のサブタイプの高度に均質な最終分化集団が保証される。これにより、ＮＳＣ療法の移植部位である出生後の中枢神経システムの結果である、インビボでの分化および成熟の制御の難しさを克服する。最後に、成熟したニューロンの生着は、療法を目的とする細胞を患者に直ちに提供し、したがって、移植された細胞の機能的統合が達成される前に、移植後長期間にわたって生じるプロセスである、有糸分裂神経系幹細胞のニューロンへのインビボでのさらなる分裂および分化にかかる時間を排除する。
本発明は、ＰＳＣを分化させて、分化細胞を取得する工程と、分化細胞を凝集させて、細胞を含む幹細胞系マイクロスフェア(stem cell-based microsphere)を形成する工程と、幹細胞系マイクロスフェアの細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、幹細胞系マイクロスフェアを取得するための方法におけるより一般的な態様をさらに提供する。本発明者らは、本方法が、任意の胚葉の幹細胞系マイクロスフェアを取得するのに適用可能であることを見出した。特に、本発明者らは、それぞれ心筋細胞および膵島様細胞を含むマイクロスフェアを取得することによって本方法を示した。本発明者らは、本発明の方法に従って取得される幹細胞系マイクロスフェアのより小さなサイズおよび均質な性質が、凍結保存およびその後の解凍時に生存率が増加した細胞系産物をもたらすことを見出した。
別段の定めのない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践は、別段の指示がない限り、当業者に公知の化学、生化学、生物物理学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学、および薬理学の従来の方法を用いる。
すべての見出しおよび小見出しが、本明細書では便宜上使用されているだけであり、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。
本明細書で提示する任意およびすべての例または例示的な語句（例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより明瞭にするという意図しかなく、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。
一般的な定義
本出願全体を通して、細胞を分化させるためのプロセスを指す場合の「方法」および「プロトコル」という用語は、互換的に使用され得る。本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１つまたは複数を意味し得る。本明細書に別段の示唆がない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のうちのいずれかおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、かつそれらを包含する。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも企図する。
本出願全体を通して、細胞を分化させるためのプロセスを指す場合の「方法」および「プロトコル」という用語は、互換的に使用され得る。本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１つまたは複数を意味し得る。本明細書に別段の示唆がない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のうちのいずれかおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、かつそれらを包含する。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも企図する。
本明細書で使用される場合、プロトコルに関する「日」および同様にインビトロでの日（ＤＩＶ）という用語は、特定の工程を実施するための特定の時間を指す。
一般的に、かつ別段の定めのない限り、「０日目」は、プロトコルの開始を指し、これは例えば、幹細胞をプレーティングすること、または幹細胞をインキュベーターに移すこと、または幹細胞の移植前に、現在の細胞培養培地中の幹細胞を化合物と接触することによるが、これらに限定されない。典型的には、プロトコルの開始は、未分化幹細胞を別の細胞培養培地および／または容器に移すことにより、例えば、限定されないが、プレーティングもしくはインキュベートすることにより、および／または未分化幹細胞を、分化プロセスが開始されるような方法で未分化幹細胞に影響を及ぼす化合物と最初に接触することによって、行われる。
１日目、２日目などの「Ｘ日目」に言及する場合、これは、０日目のプロトコル開始に関連するものである。当業者は、別段の指定がない限り、工程を実施するための正確な日時が変動し得ることを認識するであろう。したがって、「Ｘ日目」は、±１０時間、±８時間、±６時間、±４時間、±２時間、または±１時間などの時間範囲を包含するよう意図される。
本明細書で使用される場合、「約Ｘ日目～約Ｙ日目から」というフレーズは、ある事象が開始される日を指す。このフレーズは、その事象が開始し得る日の間隔を提供する。例えば、「細胞が約３日目～約５日目に分化因子と接触する」場合、これは、すべての選択肢：「細胞が約３日目から分化因子と接触する」、「細胞が約４日目から分化因子と接触する」、および「細胞が約５日目から分化因子と接触する」を包含するものとして解釈される。したがって、このフレーズは、３日目～５日目の間にのみ起こる事象として解釈されるべきではない。これは、「約Ｘ日目～約Ｙ日目まで」というフレーズに準用する。
以下、本発明による方法は、非限定的な実施形態および実施例によってより詳細に記載される。幹細胞由来神経系細胞を含むマイクロスフェアを取得するための方法が提供される。したがって、方法は、幹細胞の使用においてオフセットされる。
「幹細胞」は、分化能および増殖能（特に自己複製能力）を有するが、分化能を維持する未分化細胞として理解されるべきである。幹細胞は、分化能に従って、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、単能性幹細胞、およびこれらに類するものなどの亜集団を含む。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）という用語は、インビトロで培養することができ、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）および／または胚外組織（多能性）に属する任意の細胞系統に分化する能力を有する幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、すべての種類ではないが、複数の種類の組織または細胞に分化する能力を有する幹細胞を意味する。本明細書で使用される場合、「単能性幹細胞」という用語は、特定の組織または細胞に分化する能力を有する幹細胞を意味する。多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織中の幹細胞、体細胞、およびこれらに類するものから誘導され得る。多能性幹細胞（ＰＳＣ）の例としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＧ細胞（胚性胚細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびこれらに類するものが含まれる。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得られるミューズ細胞（多系統分化ストレス耐性細胞）、および生殖細胞（例えば、精巣）から産生されるＧＳ細胞も、多能性幹細胞に包含される。本明細書で使用される場合、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知）という用語は、成体細胞から直接生成することができる一種の多能性幹細胞を意味する。多能性関連遺伝子の特定のセットの産物の導入によって、成体細胞は、多能性幹細胞に変換され得る。胚性幹細胞はまた、例えば、ＷＯ２００３／０４６１４１に記載されるような単為生殖性物に由来してもよい。胚性幹細胞は、単一の割球から、または胚を破壊することなく取得された内部細胞塊を培養することによって産生され得る。胚性幹細胞は、所与の組織から入手可能であり、市販されている。好ましくは、本発明の方法および産物は、ｈＰＳＣ、すなわち、誘導多能性幹細胞または単為生殖生物を含む胚性幹細胞のいずれかに由来する幹細胞に基づく。本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語はまた、直接的な変換（分化転換とも称される）または順方向プログラミングによって取得される細胞を包含することを意味し、同一性および主要制御因子遺伝子の過剰発現、または同一性および主要制御因子遺伝子をオンにする特定の小分子の送達を介して、任意の細胞型が神経系幹前駆体細胞（ＮＳＰＣ）に変換される。本明細書で使用される場合、「小型で移動可能な様式」という用語は、典型的に、単一細胞浮遊液または少数の細胞の小さなクラスター、ＮＳＰＢＣにのみ適用される手順、またはマイクロスフェア自体に関連する培養物を指す。
幹細胞に由来する神経系マイクロスフェアを取得するためのプロトコル
本発明の一般的な態様では、神経系幹前駆芽細胞を提供する工程と、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程と、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、神経系マイクロスフェアを取得するための方法が提供される。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞を提供する工程は、ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程を含む。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞を提供する工程は、ＰＳＣを培養する最初の工程をさらに含む。
本発明の一般的な態様では、神経系幹前駆芽細胞を提供する工程と、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程と、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、神経系マイクロスフェアを取得するための方法が提供される。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞を提供する工程は、ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程を含む。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞を提供する工程は、ＰＳＣを培養する最初の工程をさらに含む。
本発明によれば、「神経系マイクロスフェア」は、神経系細胞を含む三次元クラスターを形成する細胞組織として定義される。「マイクロスフェア」という用語は、実質的に定義された境界を有する細胞によって形成されたスフェア状構造を意味する。当業者は、細胞のクラスターが本質的に三次元空間において完全に円形の幾何学的形状を形成することは決してないことを容易に認識するであろう。クラスターは、例えば、スフェロイド様構造で伸長するか、または特定の領域で突出または陥没し得る。用語「クラスター」および「凝集」は、互換的に使用されてもよく、隣接する細胞が互いに近接および／または直接接触するように一緒にグループ化され、隣接する細胞がクラスターの三次元構造を維持するように互いに親和性を有する、複数の細胞を指す。「マイクロスフェア」という用語はさらに、クラスターが、マイクロメートルで測定された、例えば３５０μｍ未満の直径を有するスフェア状構造を形成する複数の細胞を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、「神経系」という用語は、神経システムを指す。本明細書で使用される場合、「神経系細胞」という用語は、細胞型を模倣する細胞を指し、それは、当然ながら外胚葉の胚葉、より詳細には、神経外胚葉の一部であり、神経幹細胞からニューロンに至るまで、すなわち神経系幹前駆体細胞段階および神経系芽細胞段階などの細胞段階など、この生殖層内の発達の任意の段階の細胞を包含することを意味する。したがって、神経系細胞に言及する特定の実施形態は、例えば、神経系幹前駆細胞のみ、または神経系芽細胞のみ、またはそれらの混合物を含む実施形態に等しく適用され得る。神経細胞は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞、ならびに他の多能性細胞（すなわち、単為生殖性幹細胞）に由来し、直接変換（分化転換とも呼ばれる）方法を介して誘導され得る。
本明細書で使用される場合、「神経系幹前駆体細胞」（ＮＳＰＣ）という用語は、１つ以上の細胞型に自己複製、増殖、および／または分化する能力を有する細胞を指す。したがって、神経系前駆体細胞は、単能性、二能性、または多能性であり得る。したがって、神経系幹前駆体細胞（ＮＳＰＣ）は有糸分裂であり、典型的には、最終的にニューロンおよびグリア細胞、ならびに髄膜細胞を含むＣＮＳ内に存在する他の細胞型に分化する。
本明細書で使用される場合、「神経系芽細胞」（ＮＢＣ）という用語は、神経系幹前駆体細胞（ＮＳＣＰ）よりもさらに分化し、典型的にはさらに分化する（すなわち、ニューロンに）能力を有し、自己複製せず、有糸分裂後の神経系細胞を指す。
「神経系幹前駆芽細胞」（ＮＳＰＢＣ）という用語は、本明細書では、典型的にＳＯＸ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＯＴＸ２、ＯＴＸ１、ＮＫＸ６．１、ＦＯＸＡ２、もしくはＬＭＸ１Ａなどの転写因子を発現するＮＳＣおよびＮＰＣ、または典型的にＴＢＲ２、もしくはＳＯＸ４、もしくはＡＳＣＬ１などの転写因子を発現する神経系芽細胞（ＮＢＣ）を含むＮＳＣ、神経系前駆細胞、または神経系前駆体細胞（集合的にＮＰＣと呼ばれる）のいずれかの純粋な集団、あるいはこれらの細胞型のいずれかの混合集団を集合的に記載するために使用される。
本明細書で使用される場合、「ニューロン」および「神経細胞」という用語は、有糸分裂後、典型的には多能性幹細胞から神経活動電位を伝達することができる特殊な細胞に完全に発達／最終的に分化した神経系細胞を指すために互換的に使用され得る。神経系細胞を「有糸分裂」と称する場合、分裂／増殖プロセスにある、またはそうすることができる増殖性細胞を意味する。したがって、神経系細胞を「有糸分裂後」と称する場合、分裂／増殖できない細胞を意味する。
本発明による神経系細胞は、前脳、中脳、後脳などに特異的な細胞などの特定の局所的同一性を有し得る。本明細書で使用される場合、「前脳」という用語は、皮質および線条体を含む構造を生じさせる神経系管およびＣＮＳの吻側領域を指す。本明細書で使用される場合、「中脳」という用語は、黒質を含む構造を生じさせる神経管およびＣＮＳ（吻側－尾側軸上）の内側領域を指す。本明細書で使用される場合、「後脳」および「脊髄」という用語は、峡部形成体に対して尾側にある神経系管の尾側領域を指す。
本発明による方法は、典型的には、一連の工程によって定義される。本明細書で使用される場合、方法に関する「工程」という用語は、何かが取り組んでいる、および／または動作が実施される段階として理解されるべきである。実施される工程および／または取り組んでいる工程が、同時および／または順次および／または連続的である場合が、当業者によって理解されるであろう。
幹細胞の神経系細胞への分化
ＰＳＣを培養する工程において、細胞は、上記で言及された任意の好適な供給源から得られてもよい。「培養」という用語は、ＰＳＣが細胞培養培地中で培養され、それらが現在の発達状態での生存に好適であることを意味する。幹細胞を培養することは、通常、幹細胞を、新しい基質上に播種すること、またはインキュベーター中で懸濁することなどによって、異なる環境へと移すことを暗示する。当業者は、幹細胞がかかる移動に対して脆弱であり、手順が注意を必要とすること、および幹細胞を元の細胞培養培地中で維持することが、細胞培養培地を分化プロセスにより適した別の細胞培養培地で置き換える前に、細胞のより持続可能な移動を促進し得ることを認識するであろう。
ＰＳＣを培養する工程において、細胞は、上記で言及された任意の好適な供給源から得られてもよい。「培養」という用語は、ＰＳＣが細胞培養培地中で培養され、それらが現在の発達状態での生存に好適であることを意味する。幹細胞を培養することは、通常、幹細胞を、新しい基質上に播種すること、またはインキュベーター中で懸濁することなどによって、異なる環境へと移すことを暗示する。当業者は、幹細胞がかかる移動に対して脆弱であり、手順が注意を必要とすること、および幹細胞を元の細胞培養培地中で維持することが、細胞培養培地を分化プロセスにより適した別の細胞培養培地で置き換える前に、細胞のより持続可能な移動を促進し得ることを認識するであろう。
多能性幹細胞を神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程は、多能性幹細胞を外胚葉胚葉の細胞に発達させるための任意の好適な方法によるものであり得る。当業者は、こうした分化プロセスに利用可能な適切な方法を認識するであろう。神経系幹前駆芽細胞は現在、２つの主要な方法によって得ることができ、１つ目が多能性幹細胞を追加の外因性化合物と接触することを介した多能性幹細胞の神経系幹前駆体細胞（ＮＳＰＣ）への従来の分化を介する、または直接的な変換（分化転換とも称される）もしくは順方向プログラミングを介して、同一性および主要制御因子遺伝子の過剰発現、または同一性および主要制御因子遺伝子をオンにする特定の小分子の送達を介して、任意の細胞型が神経系幹前駆体細胞（ＮＳＰＣ）に変換され、これらの方法の例は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｄｈｏｆ“Ｒａｐｉｄ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｅｐ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ”２０１３、およびＶｉｅｒｂｕｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｗｅｒｎｉｇ“Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ”２０１０に示される。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、例えば、未成熟状態から低い未成熟状態へ、または未成熟状態から成熟状態へ、細胞が未分化状態または意図された分化状態とは異なる状態から特定の分化状態に進行するプロセスを広く指し、これは、方法の実施中に継続的に生じ得る。多能性幹細胞に関する「分化」という用語は、細胞が未分化状態から特定の分化状態へ、すなわち、未成熟状態から低い未成熟状態または成熟状態へと進行するプロセスを指す。細胞相互作用および成熟における変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを失うまたは分化した細胞のマーカーを得るときに生じる。単一マーカーの損失または獲得は、細胞が「成熟または完全に分化」されたことを示し得る。効率的な二次元プロトコルが利用可能な細胞型の例は、（ａ）前脳皮質グルタミン酸作動性ニューロン（Ｓｈｉ，Ｋｉｒｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）、（ｂ）中脳ドーパミン作動性ニューロン（Ｎｉｃｌｉｓ，Ｇａｎｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７）、（ｃ）後脳セロトニン作動性ニューロン（Ｌｕ，Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１６）、および（ｄ）脊髄運動ニューロン（Ａｍｏｒｏｓｏ，Ｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．２０１３）を含む、ＣＮＳの４つの主要ドメインに及ぶ。ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程に必要な時間は、使用されるプロトコルに依存する。当業者は、分化の進行および神経系細胞がどの段階に発達したかを決定することができるであろう。分化の進行を決定することは、特定の発現マーカーの分析によって、または特定の段階で、これを視覚的に評価することができる。
一実施形態では、ＰＳＣは、二次元培養で分化される。さらなる実施形態では、ＰＳＣは、最初に基質上に播種される。一実施形態では、基質は、細胞外マトリックスを含む。さらなる実施形態では、基質は、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、および／またはコラーゲン、および／またはそれらの断片を含む。より詳細な実施形態では、ラミニンまたはその断片は、ラミニン－１１１、ラミニン５２１、およびラミニン５１１から成る群から選択される。
別の実施形態では、ＰＳＣは、浮遊培養で分化される。
一実施形態では、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程の前の神経系幹前駆芽細胞である。
一実施形態では、ＰＳＣは、初期の神経系前駆体細胞から若いニューロンに至るまでの段階で、神経系幹前駆芽細胞に分化される。詳細には、一実施形態では、ＰＳＣは、初期の神経系前駆体細胞、後期の神経系前駆体細胞、神経芽球、および若いニューロンを含む群から選択される段階で、神経系幹前駆芽細胞に分化される。一実施形態では、ＰＳＣは、約３日～約４０日、好ましくは約５日～３０日で、神経幹系前駆芽細胞に分化される。神経系幹前駆芽細胞を腹側中脳神経系幹前駆芽細胞に分化させるための実施形態では、多能性幹細胞は、約８日～約２２日、より好ましくは約１０日～約２０日、より好ましくは約１２日～約１８日、さらにより好ましくは約１４日～約１７日、なおさらにより好ましくは約１６日分化される。皮質神経系幹前駆芽細胞に分化させるための別の実施形態では、細胞は、約７日～約３５日、好ましくは１５日～約３０日、より好ましくは約２０日～約３０日、例えば、約２５日～約２８日分化される。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、ＳＯＸ２、ＮＥＳ、ＫＩ６７、およびＤＣＸを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現するように、一定期間分化される。特異的な局所的同一性を有する神経系幹前駆芽細胞は、典型的には１つ以上のマーカーを発現する。したがって、一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、ＳＯＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．１、ＬＭＸ１、ＩＳＬ１、ＥＢＦ１、ＯＬＩＧ２、ＦＯＸＡ２、ＥＯＭＥＳ、およびＰＤＧＦＲａを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現する。
多能性幹細胞が神経系幹前駆芽細胞に分化すると、それらは凝集の工程に供されて、神経系マイクロスフェアを形成する。好ましい実施形態では、神経系幹前駆芽細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、外胚葉系統、好ましくは神経外胚葉に沿っており、多能性ではなく、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程で最終的に分化しない。
一実施形態では、ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって神経系幹前駆芽細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、多能性ではなくなる。一実施形態では、ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって神経系幹前駆芽細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、マーカーＯＣＴ－３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ９、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、およびＴＲＡ１８０のうちの１つ以上を発現しない。「凝集の工程の前」とは、細胞がある段階まで発達し、それによって凝集時に所与の特性を有することを意味する。
単一細胞浮遊液への解離
さらなる実施形態では、方法は、神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、神経系幹前駆芽細胞を単一細胞浮遊液に解離する工程をさらに含む。当業者は、生存率を確保するために、神経系幹前駆芽細胞を解離するための好適な技法を認識するであろう。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、酵素的にまたはキレート化することによって解離される。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、神経系幹前駆芽細胞を解離剤と接触することによって解離される。解離剤の非限定的な例には、アキュターゼ、トリプシン、ｔｒｙｐｌｅＳｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ベルセン、ＥＤＴＡ、および／またはＲｅＬｅＳＲが含まれる。細胞の解離がストレスを引き起こし得ることはよく認識されており、したがって、一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、解離する工程の前に、神経幹前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤と接触する。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、神経系幹前駆芽細胞を解離する工程の後に、例えば、約１２時間～約７２時間、好ましくは約２４時間～約４８時間、ＲＯＣＫ阻害剤と接触する。ＲＯＣＫ阻害剤の使用は、解離誘導性アポトーシスを抑制することが示されている。したがって、特定の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、解離および／または凝集工程の間に添加される。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約３０μＭ、好ましくは約１μＭ～約１０μＭである。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。本明細書で使用される場合、「Ｙ－２７６３２」は、ＣＡＳ番号１２９８３０－３８－２を有するトランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）－シクロヘキサン－カルボキサミドジヒドロクロリドを指す。
さらなる実施形態では、方法は、神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、神経系幹前駆芽細胞を単一細胞浮遊液に解離する工程をさらに含む。当業者は、生存率を確保するために、神経系幹前駆芽細胞を解離するための好適な技法を認識するであろう。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、酵素的にまたはキレート化することによって解離される。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、神経系幹前駆芽細胞を解離剤と接触することによって解離される。解離剤の非限定的な例には、アキュターゼ、トリプシン、ｔｒｙｐｌｅＳｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ベルセン、ＥＤＴＡ、および／またはＲｅＬｅＳＲが含まれる。細胞の解離がストレスを引き起こし得ることはよく認識されており、したがって、一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、解離する工程の前に、神経幹前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤と接触する。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、神経系幹前駆芽細胞を解離する工程の後に、例えば、約１２時間～約７２時間、好ましくは約２４時間～約４８時間、ＲＯＣＫ阻害剤と接触する。ＲＯＣＫ阻害剤の使用は、解離誘導性アポトーシスを抑制することが示されている。したがって、特定の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、解離および／または凝集工程の間に添加される。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約３０μＭ、好ましくは約１μＭ～約１０μＭである。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。本明細書で使用される場合、「Ｙ－２７６３２」は、ＣＡＳ番号１２９８３０－３８－２を有するトランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）－シクロヘキサン－カルボキサミドジヒドロクロリドを指す。
一実施形態では、方法は、神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、静的非接着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに好適なウェル中に神経系幹前駆芽細胞を播種する追加の工程を含む。「播種」という用語は、単一細胞浮遊液などの細胞を、マイクロウェルなどの細胞凝集に適した容器に移すことを意味する。
一実施形態では、約１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２００個、または１５０個未満の神経系幹前駆芽細胞が各マイクロウェルに播種され、好ましくはマイクロウェル当たり約５００個未満の神経系幹前駆芽細胞がマイクロウェルに播種され、より好ましくは約２５０個未満の神経系幹前駆芽細胞がマイクロウェルに播種される。
さらなる実施形態では、約２個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、または１００個を超える神経系幹前駆芽細胞がマイクロウェルに播種され、好ましくは約５０個を超える神経系幹前駆芽細胞がマイクロウェルに播種され、さらにより好ましくは約１００個を超える神経系幹前駆芽細胞がマイクロウェルに播種される。
さらなる実施形態では、約１０個～約１０００個の神経系幹前駆芽細胞、好ましくは約５０個～約５００個の神経系幹前駆芽細胞、より好ましくは約５０～約２５０個の神経系幹前駆芽細胞、さらにより好ましくは約１００～約２５０個の神経系幹前駆芽細胞が、マイクロウェルに播種される。
細胞凝集およびマイクロスフェア形成
神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程は、細胞がクラスターを形成する限り、受動的または能動的に実施され得る。したがって、一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、単一細胞浮遊液中の神経系幹前駆芽細胞の重力沈降によって凝集させる。別の実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、単一細胞浮遊液中の神経系幹前駆芽細胞のスピン凝集によって凝集する。かかる実施形態では、スピン凝集は、神経系幹前駆芽細胞を神経系マイクロスフェアへと形成する。一実施形態では、スピン凝集は、遠心分離による。より詳細な実施形態では、遠心力は、約５ｇ～約８００ｇ、好ましくは約１００ｇ～約４００ｇである。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、細胞浮遊液として添加され、静止状態に置かれ、それにより、浮遊液中の細胞が重力によってマイクロウェルに沈降し、その後凝集体を形成することを可能にする。
神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程は、細胞がクラスターを形成する限り、受動的または能動的に実施され得る。したがって、一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、単一細胞浮遊液中の神経系幹前駆芽細胞の重力沈降によって凝集させる。別の実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、単一細胞浮遊液中の神経系幹前駆芽細胞のスピン凝集によって凝集する。かかる実施形態では、スピン凝集は、神経系幹前駆芽細胞を神経系マイクロスフェアへと形成する。一実施形態では、スピン凝集は、遠心分離による。より詳細な実施形態では、遠心力は、約５ｇ～約８００ｇ、好ましくは約１００ｇ～約４００ｇである。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、細胞浮遊液として添加され、静止状態に置かれ、それにより、浮遊液中の細胞が重力によってマイクロウェルに沈降し、その後凝集体を形成することを可能にする。
本発明による方法全体を通して、細胞は、適用される分化プロトコルに応じて細胞の二次元または三次元培養のいずれかを支持する任意の適切な細胞培養容器内で維持され得る。本明細書で使用される場合、「細胞培養容器」という用語は、培養中の細胞の成長および増殖を支持するように特別に設計された容器として定義される。容器は、サイズ、形状、コーティング、および蓋の有無で変動し得る。細胞培養容器の非限定的な例には、細胞培養皿、チューブ、ウェル、およびフラスコが含まれる。
神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程では、細胞培養容器は、神経系マイクロスフェアの形成に対応しなければならず、細胞はそれに移され得る。一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、解離後の神経系マイクロスフェアの形成に対応する細胞培養容器に播種される。一実施形態では、方法は、神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、神経系マイクロスフェアを維持するのに十分に好適な細胞培養に神経系幹前駆芽細胞を移す追加の工程を含む。さらなる実施形態では、細胞培養ウェルは、静的非接着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに好適である。本明細書で使用される場合、「ウェル」という用語は、静的非接着培養において維持される単一マイクロスフェアに好適な空間を意味する。「静的非接着培養」という用語は、細胞が表面に接着されず、培地溶液中に懸濁されるが、動きを使用しない状態に置かれ、重力が細胞を定位置に保持する唯一の手段であることを意味する。細胞培養容器は、親収容として機能するウェルを含み得、任意にマイクロウェルと呼ばれる１つ以上の追加の小さなウェルを含む。したがって、一実施形態では、細胞培養ウェルは、マイクロウェルである。本明細書で使用される場合、「マイクロウェル」という用語は、ＷＯ２００８／１０６７７１に記載されるウェルを指す。本出願全体を通して、細胞培養容器は「マイクロウェル」と呼ばれ得る。これは制限として解釈されるべきではない。マイクロウェルに言及する本明細書に提示される実施形態は、必要な変更を加えて、別の好適な細胞培養容器に等しく適用され得る。一実施形態では、静的非接着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに十分に好適な細胞培養は、低細胞付着特性を有する表面を有する。「低細胞付着特性」とは、材料が細胞との接着に対して低親和性を有し、該材料上でのそれらの直接的な結合および成長を妨げることを意味する。これに加えて、一実施形態では、低細胞付着特性を有する表面は、低接着プラスチックおよび／または低接着剤で処理されたプラスチックである。前述の特性を備えたマイクロウェルは、容易に入手可能である。好適なマイクロウェルは、ＥＰ２２３００１４およびＷＯ２００８／１０６７７１に記載される。
一実施形態では、複数の神経系マイクロスフェアは、例えば、浮遊培養で神経系幹前駆芽細胞を最初に分化および増殖させ、個々のマイクロウェルで複数の神経系マイクロスフェアの形成を可能にするマルチウェルに移すことによって、同時に取得される。
一実施形態では、方法は、神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、神経系幹前駆芽細胞を収集し、静的非接着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに好適なウェル中に神経系幹前駆芽細胞を播種する追加の工程を含む。
好ましい実施形態では、マイクロウェルなどの細胞培養容器は、低細胞付着特性を特徴とする。かかる特性は、プラズマガスに曝されていない未処理プラスチックに典型的であり、これは典型的には、ヒドロキシルおよびカルボキシルなどの酸素含有官能基を追加して、疎水性のプラスチック表面を修飾し、それによって表面をより親水性にする。本発明者らは、細胞培養容器の低付着特性は、それがプラスチックへのマイクロスフェアの付着および神経突起の成長を防止し、そうでなければ細胞を遊走するのを可能とし、成熟プロセスを促進すると考えている。好ましい実施形態では、１つの神経系マイクロスフェアのみが各ウェルで培養される。
さらに、一実施形態では、細胞培養容器は、細胞外マトリックス成分でコーティングされていない。したがって、好ましい実施形態では、細胞培養容器の表面は、細胞外マトリックスを含まない。
一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程は、約５個から約１０００個の神経系幹前駆芽細胞を凝集させることを含む。一実施形態では、約１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２５０個、または１５０個未満の神経系幹前駆芽細胞が凝集し、好ましくは約５００個未満の神経系幹前駆芽細胞が凝集する。一実施形態では、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、または１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が凝集し、好ましくは約５０個を超える神経系幹前駆芽細胞が凝集し、さらにより好ましくは約１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が凝集する。さらなる実施形態では、約１０個～約１０００個の神経系幹前駆芽細胞、好ましくは約５０個～約５００個の神経系幹前駆芽細胞、より好ましくは約１００個～約５００個の神経系幹前駆芽細胞が凝集して、神経系マイクロスフェアを形成する。
神経系マイクロスフェアの成熟
好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞は、神経系マイクロスフェアを収集する任意の工程の前に、さらなる成熟を可能とする。本明細書で使用される場合、「成熟する」という用語は、特定の胚葉に向かってすでに初期分化を経た幹細胞のさらなる発達を意味する。「成熟」および「成熟を可能にする」という用語はまた、細胞のさらなる分化とみなされ得る。成熟は典型的には、決定的な細胞型に対する前駆体細胞または前駆細胞のさらなる発達である。細胞型の成熟に応じて、細胞培養培地を交換する、および生存可能な状態を確保するなどによる、細胞の単純な維持を必要とする。細胞の成熟はまた、決定的な細胞型へのさらなる発達を促進するために、細胞をさらなる化合物または因子に曝露することを必要とし得る。本明細書で使用される場合、多能性段階から決定的な細胞型への細胞の細胞発達は、マイクロスフェアの形成前の「分化」、およびマイクロスフェアの形成後の「成熟」と称される。マイクロスフェアの形成のタイミングに応じて、決定的な細胞型に向けた細胞の発達は、マイクロスフェアの形成の前または後に起こり得る。
好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞は、神経系マイクロスフェアを収集する任意の工程の前に、さらなる成熟を可能とする。本明細書で使用される場合、「成熟する」という用語は、特定の胚葉に向かってすでに初期分化を経た幹細胞のさらなる発達を意味する。「成熟」および「成熟を可能にする」という用語はまた、細胞のさらなる分化とみなされ得る。成熟は典型的には、決定的な細胞型に対する前駆体細胞または前駆細胞のさらなる発達である。細胞型の成熟に応じて、細胞培養培地を交換する、および生存可能な状態を確保するなどによる、細胞の単純な維持を必要とする。細胞の成熟はまた、決定的な細胞型へのさらなる発達を促進するために、細胞をさらなる化合物または因子に曝露することを必要とし得る。本明細書で使用される場合、多能性段階から決定的な細胞型への細胞の細胞発達は、マイクロスフェアの形成前の「分化」、およびマイクロスフェアの形成後の「成熟」と称される。マイクロスフェアの形成のタイミングに応じて、決定的な細胞型に向けた細胞の発達は、マイクロスフェアの形成の前または後に起こり得る。
好ましい実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、静的非接着培養でさらに成熟する。したがって、神経系マイクロスフェアは、神経系幹前駆芽細胞のさらなる成熟のために、静的非接着培養で維持される。
一実施形態では、神経系幹前駆芽細胞は、ニューロンへのさらなる成熟を可能とする。一実施形態では、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞は、少なくとも約２．５日～約２００日、好ましくは約３日～約１８０日、より好ましくは約５日～約１５０日、より好ましくは約１０日～約１２０日、より好ましくは約１０日～約１００日、より好ましくは約１０日～約６０日、より好ましくは約１５日～約５０日、より好ましくは約１５日～約４０日で、さらなる成熟を可能とする。一実施形態では、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞は、約２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００日以内で、さらなる成熟を可能とする。一実施形態では、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞は、少なくとも約２．５、３、５、８、１０、または１５日、好ましくは少なくとも約１５日で、さらなる成熟を可能とする。当業者は、異なる神経系細胞型が、特に適用されるプロトコルに応じて、成熟のために異なる時間を必要とすることを認識するであろう。腹側中脳神経系幹前駆芽細胞を取得するための特定の実施形態では、細胞は、ニューロンに約１０日～約３０日、好ましくは約１６日～約１９日で、さらなる成熟を可能とする。皮質神経系幹前駆芽細胞を取得するための特定の別の実施形態では、細胞は、ニューロンに約２５日～約４０日、好ましくは約２５日～約３５日、より好ましくは約３２日で、さらなる成熟を可能とする。一実施形態では、ニューロンは、ＤＣＸ、ＮＥＵＮ、ＩＮＡ、ベータチューブリン、微小管関連タンパク質、ＴＨ、ＧＡＢＡ、ｖＧＬＵＴ、およびＣｈＡＴを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現する。一実施形態では、ニューロンは、ＳＯＸ２、ＫＩ６７、およびＮＥＳを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現しない。
分化法によるＮＳＰＢＣの生成は、これらの細胞の非常に均質な集団を、特定の領域同一性で産生することができる。
腹側中脳ＮＳＰＢＣへの分化の例は、Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｒｋｅｂｙ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”２０１７、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｕｄｅｒ“Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｎｇｒａｆｔ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ”２０１１、およびＤｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｂｙ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”２０１４による出版物に見出される。
背側前脳／脳外套ＮＳＰＢＣへの分化の例は、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｅｙ“Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｓｙｎａｐｓｅｓ”２０１１、およびＥｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｅｎ“Ｐｙｒａｍｉｄａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｔｏ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ”２０１２による出版物に見出される。
後脳／脊髄ＮＳＰＢＣへの分化の例は、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｚｈａｎｇ“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｅ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ”２０１４、Ａｍａｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ”Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｍｂ－Ｉｎｎｅｒｖａｔｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ”２０１３、Ｂｕｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＭｃＤｅｖｉｔｔ“Ｖ２ａ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ”２０１９による出版物に見出される。
一実施形態では、スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤は、スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の前述の阻害剤の組み合わせなどであるがこれらに限定されない２つ以上の化合物を含む。当業者は、スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の個々の阻害剤の濃度が、個々の阻害剤と類似の効果を得るためにそれに応じて調節される必要があり得ることを認識するであろう。
腹側中脳ドーパミン神経系幹前駆細胞の仕様の実施形態では、ＳＭＡＤ阻害剤に曝されたＰＳＣは、スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する。
一実施形態では、ＰＳＣは、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）作動薬、例えば、ＳＨＨまたはＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ８、ＦＧＦ２、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ｄｃＡＭＰ、ＤＡＰＴ、およびアスコルビン酸（ＡＡ）から成る群から選択される１つ以上の化合物と接触する。
一実施形態では、ＰＳＣは、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）作動薬、例えば、ＳＨＨまたはＳＡＧと接触する。一実施形態では、ＰＳＣは、ＷＮＴ活性化因子またはＧＳＫ３阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１と接触する。一実施形態では、ＰＳＣは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）８と接触する。
前脳外套／皮質神経系幹前駆芽細胞の仕様の実施形態では、ＰＳＣは、（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達経路の阻害剤と約０～１０日接触し、次にＦＧＦ２と約７～９日接触し、基礎神経系培地でさらに９～１２日培養される。
フィルタリング、収集、凍結保存
一実施形態では、神系マイクロスフェアは、凝集の工程の後に収集される。詳細には、神経系マイクロスフェアは、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程の後に収集される。「収集する」とは、神経系マイクロスフェアを、貯蔵またはその後の使用に好適な容器に移動または回収することを意味する。これは、凍結保存または投与のためであり得る。
一実施形態では、神系マイクロスフェアは、凝集の工程の後に収集される。詳細には、神経系マイクロスフェアは、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程の後に収集される。「収集する」とは、神経系マイクロスフェアを、貯蔵またはその後の使用に好適な容器に移動または回収することを意味する。これは、凍結保存または投与のためであり得る。
一実施形態では、方法は、収集した神経系マイクロスフェアを凍結保存する追加の工程を含む。いくつかの凍結保護剤が市販されており、任意の好適な凍結保護剤が使用され得る。
一実施形態では、方法は、取得された神経系マイクロスフェアをインビトロ二次元培養に移す追加の工程をさらに含む。さらなる実施形態では、方法は、神経系マイクロスフェアの神経突起を伸長させる追加の工程をさらに含む。
一実施形態では、方法は、取得された神経系マイクロスフェアを患者に移植する追加の工程をさらに含む。別の実施形態では、方法は、取得された神経系マイクロスフェアを齧歯動物などの動物に移植する追加の工程を含む。
一実施形態では、方法は、凝集前に単一細胞浮遊液をフィルタリングする追加の工程をさらに含む。例えば、細胞浮遊液の遠心分離の前にフィルタリングする工程を追加することにより、単一細胞または所望の寸法の凝集体のみがさらに成熟することを保証する。一実施形態では、方法は、神経系マイクロスフェアをフィルタリングする追加の工程をさらに含む。この工程は、神経系マイクロスフェアの形成後に行われ、所望のサイズよりも大きい任意の最適ではない神経系マイクロスフェアを除去する。
本発明の一実施形態では、神経系マイクロスフェアを取得するための方法は、ＰＳＣを培養する工程と、ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程と、任意に神経系幹前駆芽細胞をフィルタリングする工程と、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程と、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、任意に神経系マイクロスフェアをフィルタリング工程と、神経系マイクロスフェアを収集する工程と、任意に神経系マイクロスフェアを凍結保存する工程と、を含む。
神経系マイクロスフェアの特徴
本発明の別の態様は、神経系マイクロスフェアに関する。詳細には、神経系マイクロスフェアは、本明細書に記載される方法に従って取得可能である。より詳細には、神経系マイクロスフェアは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従って取得される。一実施形態では、神経系マイクロスフェアは、インビトロである。「インビトロ」という用語は、神経系マイクロスフェアがヒトまたは動物の身体の外側に提供され維持されることを意味する。一実施形態では、神経系細胞は、非天然である。「非天然」という用語は、多能性幹細胞に由来するが、ヒト起源であり得る神経系マイクロスフェアが、自然界には存在しない人工構築物であることを意味する。一般に、幹細胞療法の分野では、ヒト身体の細胞にできるだけ似た細胞を提供することが目的である。しかしながら、多能性幹細胞が胚性および胎児期に受ける発達を、成熟細胞がヒト身体の天然細胞と区別できない程度まで模倣することは、可能とならないかもしれない。本質的に、本発明の一実施形態では、神経系マイクロスフェアの神経細系胞は、人工である。本明細書で使用される場合、「人工」という用語は、自然界で天然に存在するが、天然に存在しない構築物に改変された材料を含み得る。これは、人体の細胞を模倣する非天然細胞に分化する、ヒト幹細胞を含む。好ましくは、神経系マイクロスフェアの神経系細胞は、幹細胞由来である。より好ましくは、神経系細胞は、多能性幹細胞に由来する幹細胞である。さらなる実施形態では、神経系細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および／またはヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する幹細胞である。
本発明の別の態様は、神経系マイクロスフェアに関する。詳細には、神経系マイクロスフェアは、本明細書に記載される方法に従って取得可能である。より詳細には、神経系マイクロスフェアは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従って取得される。一実施形態では、神経系マイクロスフェアは、インビトロである。「インビトロ」という用語は、神経系マイクロスフェアがヒトまたは動物の身体の外側に提供され維持されることを意味する。一実施形態では、神経系細胞は、非天然である。「非天然」という用語は、多能性幹細胞に由来するが、ヒト起源であり得る神経系マイクロスフェアが、自然界には存在しない人工構築物であることを意味する。一般に、幹細胞療法の分野では、ヒト身体の細胞にできるだけ似た細胞を提供することが目的である。しかしながら、多能性幹細胞が胚性および胎児期に受ける発達を、成熟細胞がヒト身体の天然細胞と区別できない程度まで模倣することは、可能とならないかもしれない。本質的に、本発明の一実施形態では、神経系マイクロスフェアの神経細系胞は、人工である。本明細書で使用される場合、「人工」という用語は、自然界で天然に存在するが、天然に存在しない構築物に改変された材料を含み得る。これは、人体の細胞を模倣する非天然細胞に分化する、ヒト幹細胞を含む。好ましくは、神経系マイクロスフェアの神経系細胞は、幹細胞由来である。より好ましくは、神経系細胞は、多能性幹細胞に由来する幹細胞である。さらなる実施形態では、神経系細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および／またはヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する幹細胞である。
以下では、神経系マイクロスフェアの特徴をより詳細に記載する。このように、神経系マイクロスフェアは、幹細胞由来神経系細胞の非天然構造を形成する人工構造物である。本発明の一般的な実施形態では、神経系マイクロスフェアは、外胚葉系統の細胞を含む。さらなる実施形態では、神経系マイクロスフェアは、外胚葉系統の有糸分裂後の細胞を含む。より詳細な実施形態では、外胚葉系統は、神経外胚葉系統である。
いかなる特定の理論に拘束されることなく、神経細胞は互いに自然な親和性を有し、低接着性の静止環境において、神経細胞がスフェア状形状を形成することを可能にする、緊密な網目様構造を形成すると考えられる。
一実施形態では、神経系マイクロスフェアの直径は、約３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、または３０μｍ未満、好ましくは２５０μｍ未満である。一実施形態では、神経系マイクロスフェアの直径は、約１．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５μｍよりも大きく、好ましくは１０μｍよりも大きい。さらに、一実施形態では、神経系マイクロスフェアの直径は、約１０μｍ～約３００μｍ、好ましくは約１０μｍ～約２５０μｍ、好ましくは約１０μｍ～約１５０μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約１００μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約５５μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約５０μｍ、より好ましくは約２０μｍ～約５０μｍ、より好ましくは約３０μｍ～約５０μｍである。当業者は、神経系マイクロスフェアが完全なスフェアを形成しないことを認識するであろう。しかしながら、前述の方法に従って取得可能なマイクロスフェアの性質は、顕微鏡を使用して容易に直径を確立できるスフェア状構造を自然に形成する。一実施形態では、マイクロスフェアは、形状がスフェア状である。当業者であれば、生細胞から構成されるマイクロスフェアは理想的なスフェア形状を形成しないが、細胞の凝集体は外観上スフェア状であることを認識するであろう。したがって、マイクロスフェアは、実質的にスフェア状の形状とみなされ得る。神経系マイクロスフェアが実質的にスフェア体を形成するので、直径および体積は、極軸を長軸および短軸の平均として決定することによって計算することができ、これは、可能な限り最も丸い形状を想定することにより、各集合体の不規則性を本質的に最小化する。
前述の方法を用いて、本発明者らは、マイクロスフェアの全体積が神経系細胞から成る神経系マイクロスフェアを提供することを目的としている。当業者は、本発明によるマイクロスフェアが生細胞を含み、これが産物に変動性を本質的に導入することを認識するであろう。特に、細胞は、異なる段階の間に増殖または収縮することによってサイズを変化させてもよく、マイクロスフェア内の細胞数は、増殖またはアポトーシスのために一定ではない場合がある。死細胞が分解され、細胞膜が破壊され、細胞が破裂し、細胞内容物が放出され得る。細胞はまた、発生の異なる段階の間に細胞物質を分泌し得る。したがって、神経系細胞を含むか、または神経系細胞から成るマイクロスフェアはまた、神経系細胞に由来する細胞材料を含み得ることが理解されるべきである。したがって、一実施形態では、マイクロスフェアの全体積が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成る神経系マイクロスフェアが提供される。本明細書で使用される場合、「神経系細胞に由来する細胞材料」という用語は、分泌タンパク質または他の分子を意味し、死細胞に由来する細胞破片を含む。生細胞を含むマイクロスフェアの前述の性質により、マイクロスフェア産物はまた、神経系マイクロスフェアとして定義されてもよく、マイクロスフェアの全体積は、実質的に神経系細胞から成る。これに加えて、一実施形態は、マイクロスフェアの全体積が、実質的に神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成る神経系マイクロスフェアに関する。
一実施形態では、神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％は、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の神経系細胞を含む。一実施形態では、神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料を含み、好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９０％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料を含み、より好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９５％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料を含む。好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアの体積は、実質的に神経系細胞から成る。一実施形態では、神経系マイクロスフェアの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％は、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の神経系細胞から成る。したがって、一実施形態では、神経系マイクロスフェアの体積は、実質的に神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成る。一実施形態では、神経系マイクロスフェアの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成り、好ましくは神経系マイクロスフェアの少なくとも９０％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成り、より好ましくは神経系ミマイクロスフェアの少なくとも９５％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成る。
一実施形態では、神経系マイクロスフェア全体の神経系細胞の分布は、均質である。一実施形態では、神経系マイクロスフェア全体の神経系細胞の分布は、同一である。再び、当業者は、生細胞を含む産物の固有変動性を認識するであろう。したがって、神経系マイクロスフェア全体の神経系細胞の分布は、実質的に均質であるとも呼ばれる場合があるか、または一実施形態では、神経系マイクロスフェア全体の神経系細胞の分布は、実質的に同一であると呼ばれ得、「実質的に」という用語は、マイクロスフェア内の細胞の分布を指す場合など、細胞材料に関連して使用される場合に、産物に固有のある程度の変動性を伴って理解されるべきである。好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアは、内腔を含まない。「内腔」という用語は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料によって占められていない、神経系マイクロスフェア内の中空空間を意味する。かかる内腔は、培養培地などの液体を含む水性であり得る。本明細書で使用される場合、「内腔」という用語は、３細胞以上のサイズを有する中空空間として定義される。
一実施形態では、神経系マイクロスフェアは、神経系細胞で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％飽和される。別の実施形態では、神経系マイクロスフェアは、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％飽和される。
一実施形態では、神経系マイクロスフェアは、約５個～約１０００個の神経系細胞、好ましくは約３０個～約５００個の神経細胞、より好ましくは約５０個～約２５０個の神経系細胞を含む。一実施形態では、神経系マイクロスフェアは、約１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２００個、１５０個、または１００個未満の神経系細胞、好ましくは約５００個未満の神経系細胞、より好ましくは約２５０個未満の神経系細胞を含む。一実施形態では、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個を超える神経系細胞、好ましくは約５０個を超える神経系細胞。
一実施形態では、神経系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％が生存可能であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも５０％が生存可能であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも７０％が生存可能であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも９０％が生存可能である。本明細書で使用される場合、細胞に関して「生存可能」という用語は、細胞がアポトーシスなどの細胞死を経たことがない、および／または経ていないことを意味する。当業者は、細胞死が、成長または発達の正常かつ制御された部分として生じることを認識するであろう。したがって、神経系マイクロスフェアの神経系細胞の一部が、細胞死を経験している可能性がある。本発明のマイクロスフェアの特徴は、より小さなサイズであり、これは、スフェアのコアでの細胞の実質的な壊死を防ぎ、典型的には、約１，０００ミクロンなどのより大きな直径を有するスフェアで顕著である。
好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアは、神経系細胞以外の細胞を約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満で含み、好ましくは神経系マイクロスフェアは、神経系細胞以外の細胞を約１０％未満、より好ましくは神経系細胞以外の細胞を５％未満、さらにより好ましくは神経系細胞以外の細胞を１％未満で含む。さらにより好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアは、神経系細胞以外の細胞を含まない。したがって、好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアは、神経系細胞から成る。
一実施形態では、神経系細胞の少なくとも１０％は、ニューロンである。一実施形態では、神経系細胞はニューロンであり、神経系細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％は、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のニューロンマーカーＮＥＵＮを発現する。
一実施形態では、神経系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％は、有糸分裂後神経系統細胞であり、好ましくは神経系統細胞の少なくとも７０％は、有糸分裂後神経系統細胞であり、より好ましくは神経系統細胞の８０％は、有糸分裂後であり、さらにより好ましくは神経系統細胞の９０％は、有糸分裂後である。一実施形態では、有糸分裂後神経系統細胞は、ニューロンである。
典型的には、本発明によれば、有糸分裂神経細胞の大部分を含む神経系マイクロスフェアは、中間産物となる。本発明者らは、主に有糸分裂後神経系統細胞を含む神経系マイクロスフェアの治療的適用性が、分裂能力を有し、最終的な成熟細胞になることからさらに遠い細胞を有する産物よりも好ましいと予想する。一実施形態では、ニューロンは、ＤＣＸ、ＮＥＵＮ、ＩＮＡ、ベータチューブリン、微小管関連タンパク質、ＴＨ、ＧＡＢＡ、ｖＧＬＵＴ、ＣｈＡＴから成る群から選択されるマーカーを発現する。詳細には、一実施形態では、神経系細胞は、ＴＨを発現する。一実施形態では、ニューロンは、ＳＯＸ２、ＫＩ６７またはＮＥＳを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現しない。一実施形態では、ニューロンは、後脳－脊髄ニューロンである。別の実施形態では、ニューロンは、前脳ニューロンである。別の実施形態では、ニューロンは、中脳ニューロンである。
一実施形態では、神経系細胞は、ＮＥＵＮを発現し、ＳＯＸ２を発現しない。一実施形態では、神経系細胞は、ＦＯＸＡ２およびＮＥＵＮを共発現する。一実施形態では、神経系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％のマーカーＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現する。さらなる実施形態では、マーカーＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現する神経系細胞の少なくとも５０％は、マーカーＰＩＴＸ３をさらに共発現する。かかる細胞は、パーキンソン病の治療に好適であると考えられる。一実施形態では、神経系細胞は、ドーパミン作動性前駆細胞である。一実施形態では、神経系細胞は、ＢＲＮ２およびＴＢＲ１を共発現する。好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアは、外因性細胞外マトリックスを実質的に含まない。より好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアは、外因性細胞外マトリックスを含まない。本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、神経系マイクロスフェアに追加された、すなわち細胞自体によって産生されない任意の物質を意味する。神経系細胞は、例えば、細胞外マトリックスを自然に産生し得、これは次に神経系マイクロスフェアの一部を形成し得る。しかしながら、好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアの神経系細胞は、外因性細胞外マトリックスと接触せず、外因性細胞外マトリックスは、神経系マイクロスフェアの一部を形成しない。同様に、好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアは、外因性ヒドロゲルを実質的に含まない。より好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアは、外因性ヒドロゲルを含まない。本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル」という用語は、コラーゲンおよびゼラチンなどのタンパク質、ならびにデンプン、アルギン酸塩、およびアガロースなどの多糖類を含み得る天然ポリマーを指す。したがって、一実施形態では、ヒドロゲルは、コラーゲン、ゼラチン、デンプン、アルギン酸塩、およびアガロースから成る群から選択される。一実施形態では、神経系マイクロスフェアは、外因性アルギン酸塩を実質的に含まない。好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアは、外因性アルギン酸塩を含まない。
一実施形態では、神経系マイクロスフェアは、囲まれていない。一実施形態では、神経系細胞は、囲まれていない。本明細書で使用される場合、「囲まれる」という用語は、神経系細胞および／または神経系マイクロスフェアが、細胞外マトリックスまたはヒドロゲルなどの外因性材料の層によって囲まれていないことを意味する。好ましい実施形態では、神経系細胞は、神経系マイクロスフェアの表面に直接曝される。「直接曝される」とは、神経系マイクロスフェアの神経系細胞の最も外側の層が、神経系マイクロスフェアの近くに来るものと直接接触し得ることを意味する。これは、外側の囲みが神経系マイクロスフェアの近くに来るであろう他の細胞または大きな分子との直接接触を防ぐであろう、囲まれた神経系マイクロスフェアとは異なると理解されるべきである。したがって、一実施形態では、神経系マイクロスフェアの表面は、神経系細胞を含む。一実施形態では、神経系マイクロスフェアの表面は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の神経系細胞、好ましくは少なくとも約５０％の神経系細胞、より好ましくは少なくとも約８０％の神経系細胞を含む。したがって、一実施形態では、神経系マイクロスフェアは、神経系細胞の外層を含む。一実施形態では、外層は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の神経系細胞、好ましくは少なくとも約５０％の神経系細胞、より好ましくは少なくとも約８０％の神経系細胞を含む。本明細書で使用される場合、神経系マイクロスフェアに関連する「外層」および「表面」という用語は、互換的に使用され得、神経系マイクロスフェアの表面を形成する神経系細胞、すなわち、他の神経系細胞によって完全に囲まれていないが、部分的に周囲に曝されている神経系細胞を指す。好ましい実施形態では、神経系マイクロスフェアの外層は、神経系細胞から成る。
一実施形態では、８０％、９０％、または９５％未満、またはいずれの神経系細胞も、神経系マイクロスフェアから放射状に１つを超えて神経系細胞直径に伸びる神経突起を形成していない。これは、マイクロウェル内の静止マイクロスフェアを顕微鏡で観察するか、または除去して別の容器に移動させることのいずれかによって決定され得る。本本明細書で使用される場合、「神経突起」という用語は、軸索または樹状突起などであるがこれらに限定されない、神経細胞（ニューロン）の本体からの任意の突起を意味する。「放射状に伸びる」という用語は、神経突起が神経系マイクロスフェアの表面から外向きに突出していること、例えば、周囲の培地に伸びていることを意味する。神経系マイクロスフェアの神経系細胞は、神経系マイクロスフェアの内側の網目で神経突起を形成すると考えられる。特定の理論に拘束されることなく、低接着表面を有する細胞培養容器内で神経系マイクロスフェアを静的状態に維持すると、神経系マイクロスフェアから放射状に伸びる神経突起の形成が制限されると考えられる。これはまた、マイクロスフェア内の神経突起を抑制し、表面への接着が起こらないため、マイクロスフェア新しい状態への容易な輸送および移動、すなわち、インビトロでの再播種または外科用装置を介したＣＮＳへの送達が可能になる。しかしながら、本発明者らは、神経系細胞が依然として神経突起の成長および伸長が可能であることを示した。本発明の一実施形態では、ニューロンの少なくとも５０％が、神経突起の付着および成長を支持するように作製された二次元培養システムにおいてインビトロで播種した後、約１２０分以内に神経系マイクロスフェアから放射状に伸びる神経突起を形成する；図３および４を参照されたい。
神経系マイクロスフェアは、神経突起の付着および成長を支持するヒトまたはマウスのラミニン、マトリゲル、または類似の他の細胞外マトリックスでコーティングされたプラスチックプレートまたはフラスコにマイクロスフェアを移すことにより、それらの神経突起の付着および成長の特性を試験することができる。マイクロスフェアは、この手順で細胞の生存率および神経系線維の成長を支持するために、適切な培地で培養する必要がある。
組成物および投与
本発明の別の態様は、神経系マイクロスフェアを含む組成物に関する。
本発明の別の態様は、神経系マイクロスフェアを含む組成物に関する。
一実施形態では、組成物は、医薬としての使用のためのものである。さらなる実施形態では、組成物は、パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態を含む群から選択される神経系状態の治療のためのものである。１つの特定の実施形態では、組成物は、神経系マイクロスフェアを含み、神経系マイクロスフェアの神経系細胞は、パーキンソン病の治療のためのニューロン、特にドーパミン作動性細胞である。一実施形態では、神経学的状態の治療のために投与される組成物は、患者当たりの治療当たり約１０００個のマイクロスフェア～約１００，０００個のマイクロスフェアを含む。パーキンソン病の治療のための実施形態では、組成物は、約１０００個のマイクロスフェアから約５０，０００個のマイクロスフェアを含み、各マイクロスフェアは、約５０個の細胞から約５００個の細胞を含む。
組成物の一実施形態では、神経系マイクロスフェアの平均直径は、３００、２５０、２００、１５０、１３０、１００、８０、７０、６５、６０、または５０μｍ未満、好ましくは２５０μｍ未満である。組成物の一実施形態では、神経系マイクロスフェアの直径は、３００、２５０、２００、１５０、１３０、１００、８０、７０、６５、６０、または５０μｍ未満、好ましくは２５０μｍ未満である。一実施形態では、神経系マイクロスフェアの平均直径は、５０μｍ～２５０μｍである。
別の態様は、本発明の以前の態様による組成物を含む容器に関する。
別の態様では、本発明は、前述の実施形態のいずれかによる神経系マイクロスフェアを含む凍結保存された組成物を提供する。
別の態様は、神経系マイクロスフェアまたはその組成物の投与を含む神経学的状態の治療のための方法に関する。特定の実施形態では、方法は、パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態の治療のためのものである。一実施形態では、神経学的状態の治療は、神経系マイクロスフェアの投与を含む。さらなる実施形態では、投与は、神経系マイクロスフェアのＣＮＳへの移植による。さらに別の実施形態では、ＣＮＳへの投与は、神経系マイクロスフェアを注射するための手段を含む送達装置を使用して実施される。一実施形態では、神経系マイクロスフェアを注射するための手段は、針であり、針の直径は、約０．１ｍｍ～約２ｍｍ、好ましくは約０．５ｍｍ～約１ｍｍである。
別の態様は、神経系マイクロスフェアの投与のための針の前処理の方法に関し、針は、抗接着溶液で予めコーティングされている。抗接着溶液の例は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ａｇｇｒｅｗｅｌｌ－ｒｉｎｓｉｎｇ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ＃ｓｅｃｔｉｏｎ－ｏｖｅｒｖｉｅｗ）によって提供される抗接着濯ぎ溶液である。一実施形態では、針は、抗接着溶液で充填される。さらなる実施形態では、針は、抗接着溶液のために空にされた後、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳで洗浄される。
マイクロスフェアプロトコルの一般的な適用
本発明による幹細胞系マイクロスフェアを提供するための方法は、他の胚葉の細胞にも適用可能である。本発明者らは、それぞれ心筋細胞および膵島様細胞を含む幹細胞系マイクロスフェアを首尾よく取得した。
本発明による幹細胞系マイクロスフェアを提供するための方法は、他の胚葉の細胞にも適用可能である。本発明者らは、それぞれ心筋細胞および膵島様細胞を含む幹細胞系マイクロスフェアを首尾よく取得した。
したがって、本発明の一態様は、本明細書に記載の方法、詳細には、ＰＳＣを分化させ、分化細胞を取得する工程と、分化細胞を凝集させて、細胞を含む幹細胞系マイクロスフェアを形成する工程と、幹細胞系マイクロスフェアの細胞がさらに成熟することを可能にする工程と、を含む、幹細胞系マイクロスフェアを取得するための方法の一般的な適用に関する。
「幹細胞系マイクロスフェア」という用語は、幹細胞に由来する細胞を含む、以前に定義されたマイクロスフェアと理解されるべきである。「分化細胞」という用語は、細胞が未分化状態から特定の分化状態へ、すなわち未成熟状態から低い未成熟状態へと進行するプロセスを経たか、または経ている細胞を意味する。典型的には、「分化細胞」はそれらの最終的な運命に完全に成熟しておらず、したがって、分化細胞は、かかる最終的な運命にさらに成熟するために、さらなる成熟工程を経ることができる。細胞は、内胚葉、外胚葉、中胚葉の３つの異なる胚葉を含む任意の型の細胞に分化され得る。前述の定義および実施形態は、同様に、準用され、この一般的な態様に適用され得る。これには、単一細胞浮遊液、凝集などに関する前述の詳細が含まれる。一実施形態では、方法は、凝集の工程の前に、分化細胞を単一細胞浮遊液に解離するさらなる工程を含む。以下の場合、一実施形態では、分化細胞は、スピン凝集によって凝集する。好ましい実施形態では、細胞は、凝集の工程の前に、静的非接着培養で維持される。好ましい実施形態では、細胞は、凝集の工程の前に、低細胞付着特性を有する表面を含むウェル内に維持される。
一実施形態では、１０個～１０００個の分化細胞が凝集させて、細胞系マイクロスフェアを形成する。一実施形態では、細胞系マイクロスフェアの細胞は、外胚葉系統の細胞であり、細胞系マイクロスフェアの直径は、５０～２５０マイクロメートルである。一実施形態では、細胞系マイクロスフェアの細胞は、内胚葉系統のものであり、細胞系マイクロスフェアの直径は、３０～３５０マイクロメートルである。
本方法の一実施形態では、ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって分化細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、多能性ではなくなる。一実施形態では、ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって分化細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、マーカーＯＣＴ－３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ９、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、およびＴＲＡ１８０のうちの１つ以上を発現しない。一実施形態では、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日、好ましくは少なくとも２日、より好ましくは少なくとも５日、さらにより好ましくは少なくとも１０日分化される。
神経系細胞を含むマイクロスフェア
特定の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、外胚葉細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に１０～３５日分化される。外胚葉細胞を含む幹細胞系マイクロスフェアは、前述のような神経系マイクロスフェアを含む。さらなる実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、背側前脳外套神経系細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に２０～３５日分化される。別の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、腹側中脳細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に１０～２５日分化される。別の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、腹側後脳および／または脊髄細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に５～２５日分化される。
特定の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、外胚葉細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に１０～３５日分化される。外胚葉細胞を含む幹細胞系マイクロスフェアは、前述のような神経系マイクロスフェアを含む。さらなる実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、背側前脳外套神経系細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に２０～３５日分化される。別の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、腹側中脳細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に１０～２５日分化される。別の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、腹側後脳および／または脊髄細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に５～２５日分化される。
一実施形態では、細胞系マイクロスフェアの細胞は、外胚葉であり、１０個～１０００個の分化細胞、好ましくは１００個～５００個の分化細胞、より好ましくは１００個～２５０個の分化細胞が凝集させて、細胞系マイクロスフェアを形成する。
神経系マイクロスフェアの意図される１つの用途は、パーキンソン病の治療である。かかる治療には、異所性移植の場合は線条体、同所性移植の場合は黒質と呼ばれる患者の脳の領域にドーパミン作動性細胞を投与する必要があることが広く認識されている。その領域の神経系細胞は、マーカーＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＰＩＴＸ３の共発現によって特徴付けられる。したがって、パーキンソン病の治療には、かかる細胞を用いたマイクロスフェアが予期される。一したがって、本発明の実施形態は、神経系マイクロスフェアに関し、神経系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％のマーカーＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現する。さらなる実施形態では、マーカーＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現する神経系細胞の少なくとも５０％は、マーカーＰＩＴＸ３をさらに共発現する。
特定の実施形態は、パーキンソン病の治療のための神経系マイクロスフェアに関し、神経系マイクロスフェアは、約１００個～約５００個の神経系細胞を含み、神経系細胞の少なくとも８０％は、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＴＨを共発現し、神経系マイクロスフェアの直径は、約５０～約２５０μｍの範囲であり、神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９０％は、神経系細胞から成り、神経系マイクロスフェア内の神経系細胞の分布は、同一であり、神経系マイクロスフェアは、外因性細胞外マトリックスおよび外因性ヒドロゲルを含まない。
心筋細胞を含むマイクロスフェア
特定の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、中胚葉細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に５～１０日分化される。さらなる実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、心筋細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に５～１０日分化される。「心筋細胞」とは、心臓器官の主要な構成要素である中胚葉系統の細胞であり、細胞は、ＮＫＸ２．５などのマーカーを発現すると理解される。
特定の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、中胚葉細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に５～１０日分化される。さらなる実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、心筋細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に５～１０日分化される。「心筋細胞」とは、心臓器官の主要な構成要素である中胚葉系統の細胞であり、細胞は、ＮＫＸ２．５などのマーカーを発現すると理解される。
一実施形態では、細胞系マイクロスフェアの細胞は、中胚葉であり、５０個～３０００個の分化細胞が凝集させて、細胞系マイクロスフェアを形成し、好ましくは５００個～１５００個の分化細胞が凝集する。
一実施形態では、細胞系マイクロスフェアは、３５０μｍ未満の直径である。
膵島様細胞を含むマイクロスフェア
特定の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、内胚葉細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に１０～２０日分化される。さらなる実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、膵島様細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に１０～２０日分化される。「膵島様細胞」とは、膵島の構成要素であり、典型的にはＣ－ペプチド、ＮＫＸ６．１、およびグルカゴンなどのマーカーを発現する内胚葉系統の細胞と理解される。
特定の実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、内胚葉細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に１０～２０日分化される。さらなる実施形態では、幹細胞系マイクロスフェアの細胞は、膵島様細胞であり、ＰＳＣは、分化細胞を凝集させる前に１０～２０日分化される。「膵島様細胞」とは、膵島の構成要素であり、典型的にはＣ－ペプチド、ＮＫＸ６．１、およびグルカゴンなどのマーカーを発現する内胚葉系統の細胞と理解される。
一実施形態では、細胞系マイクロスフェアの細胞は、内胚葉であり、５０個～３０００個の分化細胞が凝集して、細胞系マイクロスフェアを形成し、好ましくは５００個～１５００個の分化細胞が凝集する。
一実施形態では、細胞系マイクロスフェアは、３５０μｍ未満の直径である。
特定の実施形態
本発明の態様がここで、以下の非限定的な実施形態によってさらに記載される：
１．神経系マイクロスフェアを取得するための方法であって、
－神経系幹前駆芽細胞を提供する工程と、
－神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程と、
－神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、方法。
２．神経系マイクロスフェアが、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程後に収集される、先行する実施形態に記載の方法。
３．神経系幹前駆芽細胞を提供することが、
－ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４．神経系幹前駆芽細胞を提供することが、ＰＳＣを培養する最初の工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５．神経系幹細胞前駆芽細胞を、ニューロンにさらに成熟させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６．ＰＳＣが、約３日～約４０日、好ましくは約５日～約３０日で、神経系幹前駆芽細胞に分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７．ＰＳＣが、約８日～約２５日、好ましくは約１０日～約２０日、より好ましくは約１２日～約１８日、より好ましくは約１４日～約１７日、さらにより好ましくは約１６日で、腹側中脳神経系幹前駆芽細胞に分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８．ＰＳＣが、約２０日～約３５日、好ましくは約２５日～約３０日、より好ましくは約２８日間で、皮質神経系幹前駆芽細胞に分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９．ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって神経系幹前駆芽細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、多能性ではなくなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０．ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって神経系幹前駆芽細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、マーカーＯＣＴ－３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ９、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、およびＴＲＡ１８０のうちの１つ以上を発現しない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１１．神経系幹前駆芽細胞が、ＳＯＸ２、ＮＥＳ、ＫＩ６７、ＡＳＣＬ１、ＴＢＲ２、ＤＣＸ ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、ＳＯＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．１、ＩＳＬ１、ＥＢＦ１、ＯＬＩＧ２、ＬＭＸ１、ＦＯＸＡ２、ＥＯＭＥＳ、およびＰＤＧＦＲａを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２．神経系幹前駆芽細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、外胚葉系統、好ましくは神経外胚葉に沿っており、多能性ではなく、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程で最終的に分化しない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３．神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞を、約２．５日～約２００日、好ましくは約３日～約１８０日、より好ましくは約５日～約１５０日、より好ましくは約１０日～約１２０日、より好ましくは約１０日～約１００日、より好ましくは約１０日～約６０日、より好ましくは約１５日～約５０日、より好ましくは約１５日～約４０日で、さらに成熟させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４．神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞を、約２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００日以内で、さらに成熟させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５．神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞を、少なくとも約２．５、３、５、８、１０、または１５日、好ましくは少なくとも約１５日で、さらに成熟させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６．神経系幹前駆芽細胞を、腹側中脳神経幹前駆芽細胞に分化され、ニューロンへと約１０日～約３０日、好ましくは約１６日～約１９日で、さらに成熟させる、実施形態１～７および１１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．神経系幹前駆芽細胞を、皮質神経系幹前駆芽細胞に分化させ、ニューロンへと約２５日～約４０日、好ましくは約２５日～約３５日、より好ましくは約３２日で、さらに成熟させる、実施形態１～６および８～１５のいずれか１つに記載の方法。
１８．ニューロンが、ＤＣＸ、ＮＥＵＮ、ＩＮＡ、ベータチューブリン、微小管関連タンパク質、ＴＨ、ＧＡＢＡ、ｖＧＬＵＴ、およびＣｈＡＴを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１９．ニューロンが、ＳＯＸ２、ＫＩ６７、およびＮＥＳを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現しない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２０．ＰＳＣが、二次元培養物において分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２１．ＰＳＣが、最初に基質上に播種される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２２．基質が、細胞外マトリックスを含む、実施形態２１に記載の方法。
２３．基質が、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、および／またはコラーゲン、および／またはそれらの断片を含む、実施形態２２に記載の方法。
２４．ラミニンまたはその断片が、ラミニン－１１１、ラミニン－５２１、およびラミニン－５１１から成る群から選択される、実施形態２３に記載の方法。
２５．ＰＳＣが、浮遊培養で分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２６．神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、神経系幹前駆芽細胞を単一細胞浮遊液に解離する工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２７．神経系幹前駆芽細胞が、酵素的にまたはキレート化することによって解離される、実施形態２６に記載の方法。
２８．神経系幹前駆芽細胞が、神経系幹前駆芽細胞を解離剤と接触することによって解離される、実施形態２７に記載の方法。
２９．解離剤が、アキュターゼ、トリプシン、ｔｒｙｐｌｅＳｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ベルセン、ＥＤＴＡ、およびＲｅＬｅＳＲを含む群から選択される、実施形態２８に記載の方法。
３０．神経系幹前駆芽細胞が、神経系幹前駆芽細胞を解離する工程の後に、例えば、約１２時間～約７２時間、好ましくは約２４時間～約４８時間、ＲＯＣＫ阻害剤と接触する、実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．神経系幹前駆芽細胞が、神経系幹前駆芽細胞を解離する工程の前に、ＲＯＣＫ阻害剤と接触する、実施形態２６～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、実施形態３０および３１もいずれか１つに記載の方法。
３３．凝集前に単一細胞浮遊液をフィルタリングする追加の工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３４．神経系幹前駆芽細胞が、静的非接着培養でさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３５．神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、静的非接着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに好適なウェル中に神経系幹前駆芽細胞を播種する追加の工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３６．約１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２００個、または１５０個未満の神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種され、好ましくはマイクロウェル当たり約５００個未満の神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種され、より好ましくは約２５０個未満の神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種される、実施形態３５に記載の方法。
３７．約２個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、または１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種され、好ましくは約５０個を超える神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種され、より好ましくは約１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種される、実施形態３５および３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．約１０個～約１０００個の神経系幹前駆芽細胞、好ましくは約５０個～約５００個の神経系幹前駆芽細胞、より好ましくは約５０～約２５０個の神経系幹前駆芽細胞、さらにより好ましくは約１００～約２５０個の神経系幹前駆芽細胞が、マイクロウェルに播種される、実施形態３５～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．静的非接着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに好適なウェルは、マイクロウェルである、実施形態３５～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．静的非付着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに十分に好適な細胞培養は、低細胞付着特性を有する表面を有する、実施形態３５～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．低細胞付着特性を有する表面は、低接着プラスチックおよび／または低接着剤で処理されたプラスチックである、実施形態４０に記載の方法。
４２．ウェルの表面が、細胞外マトリックスを含まない、実施形態３５～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．神経系幹前駆芽細胞が、単一細胞浮遊液中の神経系幹前駆芽細胞の重力沈降によって凝集させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４４．神経系幹前駆芽細胞が、単一細胞浮遊液中の神経系幹前駆芽細胞のスピン凝集によって凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４５．スピン凝集が、神経系幹前駆芽細胞を神経系マイクロスフェアへと形成する、実施形態４４に記載の方法。
４６．スピン凝集が、遠心分離による、実施形態４４および４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．遠心力が、約５ｇ～約８００ｇ、好ましくは約１００ｇ～約４００ｇである、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．約１０個～約１０００個の神経系幹前駆芽細胞が、凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４９．約１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２５０個、または１５０個未満の神経系幹前駆芽細胞が凝集し、好ましくは約５００個未満の神経系幹前駆芽細胞が凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５０．約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、または１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が凝集し、好ましくは約５０個を超える神経系幹前駆芽細胞が凝集し、さらにより好ましくは約１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５１．約１０個～約１０００個の神経系幹前駆芽細胞、好ましくは約５０個～約５００個の神経系幹前駆芽細胞、より好ましくは約１００個～約５００個の神経系幹前駆芽細胞が凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５２．神経系マイクロスフェアが、神経系幹前駆芽細胞のさらなる成熟のために、静的非接着培養で維持される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５３．ＰＳＣが、スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５４．ＰＳＣが、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）作動薬、例えば、ＳＨＨまたはＳＡＧと接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５５．ＰＳＣが、ＷＮＴ活性化因子またはＧＳＫ３阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１と接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５６．ＰＳＣが、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）８と接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５７．ＰＳＣが、アスコルビン酸と接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５８．ＰＳＣが、ＢＤＮＦと接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５９．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がＧＤＮＦと接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６０．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がｄｃＡＭＰと接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６１．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がＤＡＰＴと接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６２．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がＦＧＦ２と接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６３．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がレチノイン酸と接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６４．神経系マイクロスフェアを凍結保存するための追加の工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６５．取得された神経系マイクロスフェアをインビトロ二次元培養に移す追加の工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６６．神経系マイクロスフェアの神経突起伸長をインビトロ二次元培養に移す追加の工程をさらに含む、実施形態６５に記載の方法。
６７．取得された神経系マイクロスフェアを患者に移植する追加の工程を含む、実施形態１～６４のいずれか１つに記載の方法。
６８．神経系マイクロスフェアを取得するための方法であって、
－ＰＳＣを培養する工程と、
－ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程と、
－任意に神経系幹前駆芽細胞をフィルタリングする工程と、
－神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程と、
－神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、
－任意に神経系マイクロスフェアをフィルタリング工程と、
－神経系マイクロスフェアを収集する工程と、
－任意に神経系マイクロスフェアを凍結保存する工程と、を含む、方法。
６９．神経系細胞を含む、神経系マイクロスフェア。
７０．神経系マイクロスフェアが、実施形態１～６４または６８のいずれかに記載の方法に従って取得可能である、実施形態６９に記載の神経系マイクロスフェア。
７１．神経系マイクロスフェアが、実施形態１～６４または６８のいずれかに記載の方法に従って取得される、実施形態６９に記載の神経系マイクロスフェア。
７２．神経系マイクロスフェアが、インビトロである、実施形態６９～７１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７３．神経系細胞が、非天然である、実施形態６９～７２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７４．神経系細胞が、人工である、実施形態６９～７３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７５．神経系細胞が、幹細胞由来である、実施形態６９～７４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７６．神経系細胞が、多能性幹細胞に由来する幹細胞である、実施形態６９～７５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７７．神経系細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する幹細胞である、実施形態６９～７６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７８．神経系マイクロスフェアの直径が、約３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、または３０μｍ未満、好ましくは約２５０μｍ未満である、実施形態６９～７７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７９．神経系マイクロスフェアの直径が、約１、５、１０、１５、２０、２５μｍより大きく、好ましくは１０μｍよりも大きい、実施形態６９～７８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８０．神経系マイクロスフェアの直径が、約１０μｍ～約３００μｍ、好ましくは約１０μｍ～約２５０μｍ、好ましくは約１０μｍから約１５０μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約１００μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約５５μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約５０μｍ、より好ましくは約２０μｍ～約５０μｍ、より好ましくは約３０μｍ～約５０μｍである、実施形態６９～７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．神経系マイクロスフェアが、実質的にスフェアの形状である、実施形態６９～８０のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８２．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％飽和される、実施形態６９～８１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８３．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％飽和される、実施形態６９～８１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８４．神経系マイクロスフェアが、約５個～約１０００個の神経系細胞、好ましくは約３０個～約５００個の神経細胞、より好ましくは約５０個～約２５０個の神経系細胞を含む、実施形態６９～８３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８５．神経系マイクロスフェアが、約１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２００個、１５０個、または１００個未満の神経系細胞、好ましくは約５００個未満の神経系細胞、より好ましくは約２５０個未満の神経系細胞を含む、実施形態６９～８４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８６．神経系マイクロスフェアが、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個を超える神経系細胞、好ましくは約５０個を超える神経系細胞を含む、実施形態６９～８５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８７．神経系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％が生存可能であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも５０％が生存可能であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも７０％が生存可能であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも９０％が生存可能である、実施形態６９～８６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８８．神経系マイクロスフェアの表面が、神経系細胞を含む、実施形態６９～８７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８９．神経系マイクロスフェアの表面が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の神経系細胞、好ましくは少なくとも約５０％の神経系細胞、より好ましくは少なくとも約８０％の神経系細胞を含む、実施形態８８に記載の神経系マイクロスフェア。
９０．神経系マイクロスフェアの表面が、神経系細胞から成る、実施形態６９～８９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９１．神経系細胞が、神経系マイクロスフェアの表面に直接曝される、実施形態６９～９０のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９２．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞の外層を含む、実施形態６９～９１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９３．神経系マイクロスフェアの外層が、神経系細胞を含む、実施形態６９～９２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９４．外層が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の神経系細胞、好ましくは少なくとも約５０％の神経系細胞、より好ましくは少なくとも約８０％の神経系細胞を含む、実施形態９２および９３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９５．神経系マイクロスフェアの外層が、神経系細胞から成る、実施形態６９～９４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９６．神経系細胞が、囲まれていない、実施形態６９～９５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９７．神経系マイクロスフェアが、囲まれていない、実施形態６９～９６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９８．神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％が、神経系細胞を含み、好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９０％が、神経系細胞を含み、より好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９５％が、神経系細胞を含む、実施形態６９～９７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９９．神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料を含み、好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９０％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料を含み、より好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９５％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料を含む、実施形態６９～９７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１００．少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の神経系マイクロスフェアが、神経系細胞から成り、好ましくは神経系マイクロスフェアの少なくとも９０％が、神経系細胞から成り、より好ましくは神経系マイクロスフェアの少なくとも９５％が、神経系細胞から成る、実施形態６９～９９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０１．神経系マイクロスフェアの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成り、好ましくは神経系マイクロスフェアの少なくとも９０％が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成り、より好ましくは神経系ミマイクロスフェアの少なくとも９５％が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成る、実施形態６９～９９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０２．神経系マイクロスフェア全体の神経系細胞が、実質的に均質である、実施形態６９～１０１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０３．神経系マイクロスフェアの体積が、神経系細胞から成る、実施形態６９～１０２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０４．神経系マイクロスフェアの体積が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成る、実施形態６９～１０２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０５．神経系マイクロスフェア内の神経系細胞の分布が、同一である、実施形態６９～１０４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０６．神経系マイクロスフェアが、内腔を含まない、実施形態６９～１０５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０７．神経系マイクロスフェアが、外因性細胞外マトリックスを含まない、実施形態６９～１０６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０８．マイクロスフェアが、外因性ヒドロゲル、実施形態６９～１０７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０９．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞以外の細胞を約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満で含み、好ましくは神経系マイクロスフェアは、神経系細胞以外の細胞を約１０％未満で含む、実施形態６９～１０８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１０．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞から成る、実施形態６９～１０９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１１．神経系細胞が、ＮＥＵＮを発現し、ＳＯＸ２を発現しない、実施形態６９～１１０のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１２．神経系細胞が、ＦＯＸＡ２およびＮＥＵＮを共発現する、実施形態６９～１１１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１３．神経系細胞が、ＴＨを発現する、実施形態６９～１１２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１４．神経系細胞が、ＢＲＮ２またはＴＢＲ１を発現する、実施形態６９～１１３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１５．少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の神経系細胞が、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％のマーカーＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現する、実施形態６９～１１４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１６．マーカーＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現する神経系細胞の少なくとも２０％が、マーカーＰＩＴＸ３をさらに共発現する、実施形態１１５に記載の神経系マイクロスフェア。
１１７．神経系細胞の少なくとも１０％が、ニューロンである、実施形態６９～１１６に記載の神経系マイクロスフェア。
１１８．神経系細胞が、ニューロンであり、神経系細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のニューロンマーカーＮＥＵＮを発現する、実施形態６９～１１７に記載の神経系マイクロスフェア。
１１９．ニューロンが、後脳－脊髄ニューロンである、実施形態１１７および１１８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２０．ニューロンが、前脳ニューロンである、実施形態１１７～１１９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２１．ニューロンが、中脳ニューロンである、実施形態１１７～１１９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２２．ニューロンが、ＤＣＸ、ＮＥＵＮ、ＩＮＡ、ベータチューブリン、微小管関連タンパク質、ＴＨ、ＧＡＢＡ、ｖＧＬＵＴ、およびＣｈＡＴから成る群から選択されるマーカーを発現する、実施形態１１７～１２１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２３．ニューロンが、ＳＯＸ２、ＫＩ６７、およびＮＥＳを含む群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現しない、実施形態６９～１２２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２４．神経系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％が、有糸分裂後神経系統細胞であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも７０％が、有糸分裂後神経系統細胞であり、好ましくは神経系細胞の８０％が、有糸分裂後であり、好ましくは神経系統細胞の９０％が、有糸分裂後である、実施形態６９～１２３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２５．神経系細胞が、ドーパミン作動性前駆細胞である、実施形態６９～１２４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２６．神経系細胞が、ＤＣＸ、ＮＥＵＮ、ＩＮＡ、ベータチューブリン、微小管関連タンパク質、ＴＨ、ＧＡＢＡ、ｖＧＬＵＴ、およびＣｈＡＴから成る群から選択されるマーカーを発現する、実施形態６９～１２５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２７．８０％、９０％、または９５％未満、またはいずれの神経系細胞も、神経系マイクロスフェアから放射状に１つを超えて神経系細胞直径に伸びる神経突起を形成していない、実施形態６９～１２６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２８．ニューロンの少なくとも５０％が、二次元培養システムにおいてインビトロで播種した後、約１２０分以内に神経系マイクロスフェアから放射状に伸びる神経突起を形成する、実施形態６９～１２７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２９．医薬として使用するための、実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１３０．パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態の治療のための、実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１３１．実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアの投与を含む、神経学的状態を治療するための方法。
１３２．パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態の治療のための、実施形態１３１に記載の方法。
１３３．投与が、神経系マイクロスフェアのＣＮＳへの移植による、実施形態１３１および１３２のいずれか１つに記載の方法。
１３４．ＣＮＳへの投与が、神経系マイクロスフェアを注射するための手段を含む送達装置を使用して実施される、実施形態１３３に記載の方法。
１３５．神経系マイクロスフェアを注射するための手段は、針であり、針の直径は、約０．１ｍｍ～約２ｍｍである、実施形態１３４に記載の方法。
１３６．実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアを含む、組成物。
１３７．神経系マイクロスフェアの平均直径が、３００、２５０、２００、１５０、１３０、１００、８０、７０、６５、６０、または５０μｍ未満、好ましくは２５０μｍ未満である、実施形態１３６に記載の組成物。
１３８．神経系マイクロスフェアの直径は、３００、２５０、２００、１５０、１３０、１００、８０、７０、６５、６０、または５０μｍ未満、好ましくは２５０μｍ未満である、実施形態１３６および１３７のいずれか１つに記載の組成物。
１３９．神経系マイクロスフェアの平均直径が、５０μｍ～２５０μｍである、実施形態１３６～１３８のいずれか１つに記載の組成物。
１４０．医薬として使用するための、実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアを含む、組成物。
１４１．パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態の治療のための、実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアを含む、組成物。
１４２．実施形態１３６～１４１のいずれか１つに記載の組成物を含む、容器。
１４３．実施形態１３６～１４１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアを含む、凍結保存された組成物。
１４４．幹細胞系マイクロスフェアを取得するための方法であって、
－ＰＳＣを分化させ、分化細胞を取得する工程と、
－分化細胞を凝集させて、幹細胞系マイクロスフェアを形成する工程と、
－幹細胞系マイクロスフェアの分化細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、方法。
１４５．ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって分化細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、多能性ではなくなる、実施形態１４４に記載の方法。
１４６．ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって分化細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、多能性ではなくなり、凝集の工程の前に、マーカーＯＣＴ－３／４、ＮＡＮＯＧ、ＣＤ９、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、およびＴＲＡ１８０のうちの１つ以上を表現しない、実施形態１４４～１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．凝集工程の前に、分化細胞を単一細胞浮遊液に解離するさらなる工程を含む、実施形態１４４～１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日、好ましくは少なくとも２日、より好ましくは少なくとも５日、さらにより好ましくは少なくとも１０日間分化される、実施形態１４４～１４７のいずれか１つに記載の方法。
１４９．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、外胚葉細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に１０～３５日間分化される、実施形態１４８に記載の方法。
１５０．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、背側前脳外套神経系細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に２０～３５日分化される、実施形態１４９に記載の方法。
１５１．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、腹側中脳細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に１０～２５日分化される、実施形態１４９に記載の方法。
１５２．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、腹側後脳および／または脊髄細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に５～２５日分化される、実施形態１４９に記載の方法。
１５３．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、中胚葉細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に５～１０日分化される、実施形態１４８に記載の方法。
１５４．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、心筋細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に５～１０日分化される、実施形態１５３に記載の方法。
１５５．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、内胚葉細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に１０～２０日分化される、実施形態１４８に記載の方法。
１５６．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、膵島様細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に１０～２０日分化される、実施形態１５５に記載の方法。
１５７．１０個～１０００個の分化細胞が凝集して、細胞系マイクロスフェアを形成する、実施形態１４４～１５６のいずれか１つに記載の方法。
１５８．細胞系マイクロスフェアの細胞が、外胚葉であり、５０個～１０００個の分化細胞、好ましくは１００個～５００個の分化細胞、より好ましくは１００個～２５０個の分化細胞が、凝集して、細胞系マイクロスフェアを形成する、実施形態１４９～１５２のいずれか１つに記載の方法。
１５９．細胞系マイクロスフェアの細胞が、中胚葉であり、５０個～３０００個の分化細胞が凝集して、細胞系マイクロスフェアを形成し、好ましくは５００個～１５００個の分化細胞が凝集する、実施形態１５３～１５４のいずれか１つに記載の方法。
１６０．細胞系マイクロスフェアの細胞が、内胚葉であり、５０個～３０００個の分化細胞が、凝集して、細胞系マイクロスフェアを形成し、好ましくは５００個～１５００個の分化細胞が、凝集する、実施形態１５５～１５６のいずれか１つに記載の方法。
１６１．細胞系マイクロスフェアの細胞が、外胚葉または内胚葉系統のものであり、細胞系マイクロスフェアの直径が、３０～３５０マイクロメートルである、実施形態１４４～１６０のいずれか１つに記載の方法。
１６２．分化細胞が、スピン凝集によって凝集する、実施形態１４４～１６１のいずれか１つに記載の方法。
１６３．細胞が、凝集の工程の前に、静的非接着培養で維持される、実施形態１４４～１６２のいずれか１つに記載の方法。
１６４．細胞が、凝集の工程の前に、低細胞付着特性を有する表面を含むウェル内に維持される、実施形態１４４～１６３のいずれか１つに記載の方法。
本発明の態様がここで、以下の非限定的な実施形態によってさらに記載される：
１．神経系マイクロスフェアを取得するための方法であって、
－神経系幹前駆芽細胞を提供する工程と、
－神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程と、
－神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、方法。
２．神経系マイクロスフェアが、神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程後に収集される、先行する実施形態に記載の方法。
３．神経系幹前駆芽細胞を提供することが、
－ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４．神経系幹前駆芽細胞を提供することが、ＰＳＣを培養する最初の工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５．神経系幹細胞前駆芽細胞を、ニューロンにさらに成熟させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６．ＰＳＣが、約３日～約４０日、好ましくは約５日～約３０日で、神経系幹前駆芽細胞に分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７．ＰＳＣが、約８日～約２５日、好ましくは約１０日～約２０日、より好ましくは約１２日～約１８日、より好ましくは約１４日～約１７日、さらにより好ましくは約１６日で、腹側中脳神経系幹前駆芽細胞に分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８．ＰＳＣが、約２０日～約３５日、好ましくは約２５日～約３０日、より好ましくは約２８日間で、皮質神経系幹前駆芽細胞に分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９．ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって神経系幹前駆芽細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、多能性ではなくなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０．ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって神経系幹前駆芽細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、マーカーＯＣＴ－３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ９、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、およびＴＲＡ１８０のうちの１つ以上を発現しない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１１．神経系幹前駆芽細胞が、ＳＯＸ２、ＮＥＳ、ＫＩ６７、ＡＳＣＬ１、ＴＢＲ２、ＤＣＸ ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、ＳＯＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．１、ＩＳＬ１、ＥＢＦ１、ＯＬＩＧ２、ＬＭＸ１、ＦＯＸＡ２、ＥＯＭＥＳ、およびＰＤＧＦＲａを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２．神経系幹前駆芽細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、外胚葉系統、好ましくは神経外胚葉に沿っており、多能性ではなく、神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程で最終的に分化しない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３．神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞を、約２．５日～約２００日、好ましくは約３日～約１８０日、より好ましくは約５日～約１５０日、より好ましくは約１０日～約１２０日、より好ましくは約１０日～約１００日、より好ましくは約１０日～約６０日、より好ましくは約１５日～約５０日、より好ましくは約１５日～約４０日で、さらに成熟させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４．神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞を、約２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００日以内で、さらに成熟させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５．神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞を、少なくとも約２．５、３、５、８、１０、または１５日、好ましくは少なくとも約１５日で、さらに成熟させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６．神経系幹前駆芽細胞を、腹側中脳神経幹前駆芽細胞に分化され、ニューロンへと約１０日～約３０日、好ましくは約１６日～約１９日で、さらに成熟させる、実施形態１～７および１１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．神経系幹前駆芽細胞を、皮質神経系幹前駆芽細胞に分化させ、ニューロンへと約２５日～約４０日、好ましくは約２５日～約３５日、より好ましくは約３２日で、さらに成熟させる、実施形態１～６および８～１５のいずれか１つに記載の方法。
１８．ニューロンが、ＤＣＸ、ＮＥＵＮ、ＩＮＡ、ベータチューブリン、微小管関連タンパク質、ＴＨ、ＧＡＢＡ、ｖＧＬＵＴ、およびＣｈＡＴを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１９．ニューロンが、ＳＯＸ２、ＫＩ６７、およびＮＥＳを含む群から選択される１つ以上のマーカーを発現しない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２０．ＰＳＣが、二次元培養物において分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２１．ＰＳＣが、最初に基質上に播種される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２２．基質が、細胞外マトリックスを含む、実施形態２１に記載の方法。
２３．基質が、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、および／またはコラーゲン、および／またはそれらの断片を含む、実施形態２２に記載の方法。
２４．ラミニンまたはその断片が、ラミニン－１１１、ラミニン－５２１、およびラミニン－５１１から成る群から選択される、実施形態２３に記載の方法。
２５．ＰＳＣが、浮遊培養で分化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２６．神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、神経系幹前駆芽細胞を単一細胞浮遊液に解離する工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２７．神経系幹前駆芽細胞が、酵素的にまたはキレート化することによって解離される、実施形態２６に記載の方法。
２８．神経系幹前駆芽細胞が、神経系幹前駆芽細胞を解離剤と接触することによって解離される、実施形態２７に記載の方法。
２９．解離剤が、アキュターゼ、トリプシン、ｔｒｙｐｌｅＳｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ベルセン、ＥＤＴＡ、およびＲｅＬｅＳＲを含む群から選択される、実施形態２８に記載の方法。
３０．神経系幹前駆芽細胞が、神経系幹前駆芽細胞を解離する工程の後に、例えば、約１２時間～約７２時間、好ましくは約２４時間～約４８時間、ＲＯＣＫ阻害剤と接触する、実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．神経系幹前駆芽細胞が、神経系幹前駆芽細胞を解離する工程の前に、ＲＯＣＫ阻害剤と接触する、実施形態２６～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、実施形態３０および３１もいずれか１つに記載の方法。
３３．凝集前に単一細胞浮遊液をフィルタリングする追加の工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３４．神経系幹前駆芽細胞が、静的非接着培養でさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３５．神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、静的非接着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに好適なウェル中に神経系幹前駆芽細胞を播種する追加の工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３６．約１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２００個、または１５０個未満の神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種され、好ましくはマイクロウェル当たり約５００個未満の神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種され、より好ましくは約２５０個未満の神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種される、実施形態３５に記載の方法。
３７．約２個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、または１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種され、好ましくは約５０個を超える神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種され、より好ましくは約１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が、ウェルに播種される、実施形態３５および３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．約１０個～約１０００個の神経系幹前駆芽細胞、好ましくは約５０個～約５００個の神経系幹前駆芽細胞、より好ましくは約５０～約２５０個の神経系幹前駆芽細胞、さらにより好ましくは約１００～約２５０個の神経系幹前駆芽細胞が、マイクロウェルに播種される、実施形態３５～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．静的非接着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに好適なウェルは、マイクロウェルである、実施形態３５～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．静的非付着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに十分に好適な細胞培養は、低細胞付着特性を有する表面を有する、実施形態３５～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．低細胞付着特性を有する表面は、低接着プラスチックおよび／または低接着剤で処理されたプラスチックである、実施形態４０に記載の方法。
４２．ウェルの表面が、細胞外マトリックスを含まない、実施形態３５～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．神経系幹前駆芽細胞が、単一細胞浮遊液中の神経系幹前駆芽細胞の重力沈降によって凝集させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４４．神経系幹前駆芽細胞が、単一細胞浮遊液中の神経系幹前駆芽細胞のスピン凝集によって凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４５．スピン凝集が、神経系幹前駆芽細胞を神経系マイクロスフェアへと形成する、実施形態４４に記載の方法。
４６．スピン凝集が、遠心分離による、実施形態４４および４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．遠心力が、約５ｇ～約８００ｇ、好ましくは約１００ｇ～約４００ｇである、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．約１０個～約１０００個の神経系幹前駆芽細胞が、凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４９．約１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２５０個、または１５０個未満の神経系幹前駆芽細胞が凝集し、好ましくは約５００個未満の神経系幹前駆芽細胞が凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５０．約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、または１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が凝集し、好ましくは約５０個を超える神経系幹前駆芽細胞が凝集し、さらにより好ましくは約１００個を超える神経系幹前駆芽細胞が凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５１．約１０個～約１０００個の神経系幹前駆芽細胞、好ましくは約５０個～約５００個の神経系幹前駆芽細胞、より好ましくは約１００個～約５００個の神経系幹前駆芽細胞が凝集する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５２．神経系マイクロスフェアが、神経系幹前駆芽細胞のさらなる成熟のために、静的非接着培養で維持される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５３．ＰＳＣが、スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５４．ＰＳＣが、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）作動薬、例えば、ＳＨＨまたはＳＡＧと接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５５．ＰＳＣが、ＷＮＴ活性化因子またはＧＳＫ３阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１と接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５６．ＰＳＣが、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）８と接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５７．ＰＳＣが、アスコルビン酸と接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５８．ＰＳＣが、ＢＤＮＦと接触する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５９．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がＧＤＮＦと接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６０．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がｄｃＡＭＰと接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６１．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がＤＡＰＴと接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６２．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がＦＧＦ２と接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６３．神経系幹前駆芽細胞が、細胞がレチノイン酸と接触することによってさらに成熟する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６４．神経系マイクロスフェアを凍結保存するための追加の工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６５．取得された神経系マイクロスフェアをインビトロ二次元培養に移す追加の工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６６．神経系マイクロスフェアの神経突起伸長をインビトロ二次元培養に移す追加の工程をさらに含む、実施形態６５に記載の方法。
６７．取得された神経系マイクロスフェアを患者に移植する追加の工程を含む、実施形態１～６４のいずれか１つに記載の方法。
６８．神経系マイクロスフェアを取得するための方法であって、
－ＰＳＣを培養する工程と、
－ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程と、
－任意に神経系幹前駆芽細胞をフィルタリングする工程と、
－神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程と、
－神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、
－任意に神経系マイクロスフェアをフィルタリング工程と、
－神経系マイクロスフェアを収集する工程と、
－任意に神経系マイクロスフェアを凍結保存する工程と、を含む、方法。
６９．神経系細胞を含む、神経系マイクロスフェア。
７０．神経系マイクロスフェアが、実施形態１～６４または６８のいずれかに記載の方法に従って取得可能である、実施形態６９に記載の神経系マイクロスフェア。
７１．神経系マイクロスフェアが、実施形態１～６４または６８のいずれかに記載の方法に従って取得される、実施形態６９に記載の神経系マイクロスフェア。
７２．神経系マイクロスフェアが、インビトロである、実施形態６９～７１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７３．神経系細胞が、非天然である、実施形態６９～７２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７４．神経系細胞が、人工である、実施形態６９～７３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７５．神経系細胞が、幹細胞由来である、実施形態６９～７４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７６．神経系細胞が、多能性幹細胞に由来する幹細胞である、実施形態６９～７５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７７．神経系細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する幹細胞である、実施形態６９～７６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７８．神経系マイクロスフェアの直径が、約３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、または３０μｍ未満、好ましくは約２５０μｍ未満である、実施形態６９～７７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
７９．神経系マイクロスフェアの直径が、約１、５、１０、１５、２０、２５μｍより大きく、好ましくは１０μｍよりも大きい、実施形態６９～７８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８０．神経系マイクロスフェアの直径が、約１０μｍ～約３００μｍ、好ましくは約１０μｍ～約２５０μｍ、好ましくは約１０μｍから約１５０μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約１００μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約５５μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約５０μｍ、より好ましくは約２０μｍ～約５０μｍ、より好ましくは約３０μｍ～約５０μｍである、実施形態６９～７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．神経系マイクロスフェアが、実質的にスフェアの形状である、実施形態６９～８０のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８２．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％飽和される、実施形態６９～８１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８３．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％飽和される、実施形態６９～８１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８４．神経系マイクロスフェアが、約５個～約１０００個の神経系細胞、好ましくは約３０個～約５００個の神経細胞、より好ましくは約５０個～約２５０個の神経系細胞を含む、実施形態６９～８３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８５．神経系マイクロスフェアが、約１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２００個、１５０個、または１００個未満の神経系細胞、好ましくは約５００個未満の神経系細胞、より好ましくは約２５０個未満の神経系細胞を含む、実施形態６９～８４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８６．神経系マイクロスフェアが、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個を超える神経系細胞、好ましくは約５０個を超える神経系細胞を含む、実施形態６９～８５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８７．神経系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％が生存可能であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも５０％が生存可能であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも７０％が生存可能であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも９０％が生存可能である、実施形態６９～８６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８８．神経系マイクロスフェアの表面が、神経系細胞を含む、実施形態６９～８７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
８９．神経系マイクロスフェアの表面が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の神経系細胞、好ましくは少なくとも約５０％の神経系細胞、より好ましくは少なくとも約８０％の神経系細胞を含む、実施形態８８に記載の神経系マイクロスフェア。
９０．神経系マイクロスフェアの表面が、神経系細胞から成る、実施形態６９～８９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９１．神経系細胞が、神経系マイクロスフェアの表面に直接曝される、実施形態６９～９０のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９２．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞の外層を含む、実施形態６９～９１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９３．神経系マイクロスフェアの外層が、神経系細胞を含む、実施形態６９～９２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９４．外層が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の神経系細胞、好ましくは少なくとも約５０％の神経系細胞、より好ましくは少なくとも約８０％の神経系細胞を含む、実施形態９２および９３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９５．神経系マイクロスフェアの外層が、神経系細胞から成る、実施形態６９～９４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９６．神経系細胞が、囲まれていない、実施形態６９～９５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９７．神経系マイクロスフェアが、囲まれていない、実施形態６９～９６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９８．神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％が、神経系細胞を含み、好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９０％が、神経系細胞を含み、より好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９５％が、神経系細胞を含む、実施形態６９～９７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
９９．神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料を含み、好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９０％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料を含み、より好ましくは神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９５％は、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料を含む、実施形態６９～９７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１００．少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の神経系マイクロスフェアが、神経系細胞から成り、好ましくは神経系マイクロスフェアの少なくとも９０％が、神経系細胞から成り、より好ましくは神経系マイクロスフェアの少なくとも９５％が、神経系細胞から成る、実施形態６９～９９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０１．神経系マイクロスフェアの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成り、好ましくは神経系マイクロスフェアの少なくとも９０％が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成り、より好ましくは神経系ミマイクロスフェアの少なくとも９５％が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成る、実施形態６９～９９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０２．神経系マイクロスフェア全体の神経系細胞が、実質的に均質である、実施形態６９～１０１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０３．神経系マイクロスフェアの体積が、神経系細胞から成る、実施形態６９～１０２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０４．神経系マイクロスフェアの体積が、神経系細胞および任意に神経系細胞に由来する細胞材料から成る、実施形態６９～１０２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０５．神経系マイクロスフェア内の神経系細胞の分布が、同一である、実施形態６９～１０４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０６．神経系マイクロスフェアが、内腔を含まない、実施形態６９～１０５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０７．神経系マイクロスフェアが、外因性細胞外マトリックスを含まない、実施形態６９～１０６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０８．マイクロスフェアが、外因性ヒドロゲル、実施形態６９～１０７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１０９．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞以外の細胞を約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満で含み、好ましくは神経系マイクロスフェアは、神経系細胞以外の細胞を約１０％未満で含む、実施形態６９～１０８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１０．神経系マイクロスフェアが、神経系細胞から成る、実施形態６９～１０９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１１．神経系細胞が、ＮＥＵＮを発現し、ＳＯＸ２を発現しない、実施形態６９～１１０のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１２．神経系細胞が、ＦＯＸＡ２およびＮＥＵＮを共発現する、実施形態６９～１１１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１３．神経系細胞が、ＴＨを発現する、実施形態６９～１１２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１４．神経系細胞が、ＢＲＮ２またはＴＢＲ１を発現する、実施形態６９～１１３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１５．少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の神経系細胞が、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％のマーカーＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現する、実施形態６９～１１４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１１６．マーカーＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現する神経系細胞の少なくとも２０％が、マーカーＰＩＴＸ３をさらに共発現する、実施形態１１５に記載の神経系マイクロスフェア。
１１７．神経系細胞の少なくとも１０％が、ニューロンである、実施形態６９～１１６に記載の神経系マイクロスフェア。
１１８．神経系細胞が、ニューロンであり、神経系細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のニューロンマーカーＮＥＵＮを発現する、実施形態６９～１１７に記載の神経系マイクロスフェア。
１１９．ニューロンが、後脳－脊髄ニューロンである、実施形態１１７および１１８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２０．ニューロンが、前脳ニューロンである、実施形態１１７～１１９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２１．ニューロンが、中脳ニューロンである、実施形態１１７～１１９のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２２．ニューロンが、ＤＣＸ、ＮＥＵＮ、ＩＮＡ、ベータチューブリン、微小管関連タンパク質、ＴＨ、ＧＡＢＡ、ｖＧＬＵＴ、およびＣｈＡＴから成る群から選択されるマーカーを発現する、実施形態１１７～１２１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２３．ニューロンが、ＳＯＸ２、ＫＩ６７、およびＮＥＳを含む群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現しない、実施形態６９～１２２のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２４．神経系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％が、有糸分裂後神経系統細胞であり、好ましくは神経系細胞の少なくとも７０％が、有糸分裂後神経系統細胞であり、好ましくは神経系細胞の８０％が、有糸分裂後であり、好ましくは神経系統細胞の９０％が、有糸分裂後である、実施形態６９～１２３のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２５．神経系細胞が、ドーパミン作動性前駆細胞である、実施形態６９～１２４のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２６．神経系細胞が、ＤＣＸ、ＮＥＵＮ、ＩＮＡ、ベータチューブリン、微小管関連タンパク質、ＴＨ、ＧＡＢＡ、ｖＧＬＵＴ、およびＣｈＡＴから成る群から選択されるマーカーを発現する、実施形態６９～１２５のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２７．８０％、９０％、または９５％未満、またはいずれの神経系細胞も、神経系マイクロスフェアから放射状に１つを超えて神経系細胞直径に伸びる神経突起を形成していない、実施形態６９～１２６のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２８．ニューロンの少なくとも５０％が、二次元培養システムにおいてインビトロで播種した後、約１２０分以内に神経系マイクロスフェアから放射状に伸びる神経突起を形成する、実施形態６９～１２７のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１２９．医薬として使用するための、実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１３０．パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態の治療のための、実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェア。
１３１．実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアの投与を含む、神経学的状態を治療するための方法。
１３２．パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態の治療のための、実施形態１３１に記載の方法。
１３３．投与が、神経系マイクロスフェアのＣＮＳへの移植による、実施形態１３１および１３２のいずれか１つに記載の方法。
１３４．ＣＮＳへの投与が、神経系マイクロスフェアを注射するための手段を含む送達装置を使用して実施される、実施形態１３３に記載の方法。
１３５．神経系マイクロスフェアを注射するための手段は、針であり、針の直径は、約０．１ｍｍ～約２ｍｍである、実施形態１３４に記載の方法。
１３６．実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアを含む、組成物。
１３７．神経系マイクロスフェアの平均直径が、３００、２５０、２００、１５０、１３０、１００、８０、７０、６５、６０、または５０μｍ未満、好ましくは２５０μｍ未満である、実施形態１３６に記載の組成物。
１３８．神経系マイクロスフェアの直径は、３００、２５０、２００、１５０、１３０、１００、８０、７０、６５、６０、または５０μｍ未満、好ましくは２５０μｍ未満である、実施形態１３６および１３７のいずれか１つに記載の組成物。
１３９．神経系マイクロスフェアの平均直径が、５０μｍ～２５０μｍである、実施形態１３６～１３８のいずれか１つに記載の組成物。
１４０．医薬として使用するための、実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアを含む、組成物。
１４１．パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態の治療のための、実施形態６９～１２８のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアを含む、組成物。
１４２．実施形態１３６～１４１のいずれか１つに記載の組成物を含む、容器。
１４３．実施形態１３６～１４１のいずれか１つに記載の神経系マイクロスフェアを含む、凍結保存された組成物。
１４４．幹細胞系マイクロスフェアを取得するための方法であって、
－ＰＳＣを分化させ、分化細胞を取得する工程と、
－分化細胞を凝集させて、幹細胞系マイクロスフェアを形成する工程と、
－幹細胞系マイクロスフェアの分化細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、方法。
１４５．ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって分化細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、凝集の工程の前に、多能性ではなくなる、実施形態１４４に記載の方法。
１４６．ＰＳＣが、一定期間分化され、それによって分化細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、多能性ではなくなり、凝集の工程の前に、マーカーＯＣＴ－３／４、ＮＡＮＯＧ、ＣＤ９、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、およびＴＲＡ１８０のうちの１つ以上を表現しない、実施形態１４４～１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．凝集工程の前に、分化細胞を単一細胞浮遊液に解離するさらなる工程を含む、実施形態１４４～１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日、好ましくは少なくとも２日、より好ましくは少なくとも５日、さらにより好ましくは少なくとも１０日間分化される、実施形態１４４～１４７のいずれか１つに記載の方法。
１４９．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、外胚葉細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に１０～３５日間分化される、実施形態１４８に記載の方法。
１５０．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、背側前脳外套神経系細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に２０～３５日分化される、実施形態１４９に記載の方法。
１５１．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、腹側中脳細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に１０～２５日分化される、実施形態１４９に記載の方法。
１５２．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、腹側後脳および／または脊髄細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に５～２５日分化される、実施形態１４９に記載の方法。
１５３．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、中胚葉細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に５～１０日分化される、実施形態１４８に記載の方法。
１５４．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、心筋細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に５～１０日分化される、実施形態１５３に記載の方法。
１５５．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、内胚葉細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に１０～２０日分化される、実施形態１４８に記載の方法。
１５６．幹細胞系マイクロスフェアの細胞が、膵島様細胞であり、ＰＳＣが、分化細胞を凝集させる前に１０～２０日分化される、実施形態１５５に記載の方法。
１５７．１０個～１０００個の分化細胞が凝集して、細胞系マイクロスフェアを形成する、実施形態１４４～１５６のいずれか１つに記載の方法。
１５８．細胞系マイクロスフェアの細胞が、外胚葉であり、５０個～１０００個の分化細胞、好ましくは１００個～５００個の分化細胞、より好ましくは１００個～２５０個の分化細胞が、凝集して、細胞系マイクロスフェアを形成する、実施形態１４９～１５２のいずれか１つに記載の方法。
１５９．細胞系マイクロスフェアの細胞が、中胚葉であり、５０個～３０００個の分化細胞が凝集して、細胞系マイクロスフェアを形成し、好ましくは５００個～１５００個の分化細胞が凝集する、実施形態１５３～１５４のいずれか１つに記載の方法。
１６０．細胞系マイクロスフェアの細胞が、内胚葉であり、５０個～３０００個の分化細胞が、凝集して、細胞系マイクロスフェアを形成し、好ましくは５００個～１５００個の分化細胞が、凝集する、実施形態１５５～１５６のいずれか１つに記載の方法。
１６１．細胞系マイクロスフェアの細胞が、外胚葉または内胚葉系統のものであり、細胞系マイクロスフェアの直径が、３０～３５０マイクロメートルである、実施形態１４４～１６０のいずれか１つに記載の方法。
１６２．分化細胞が、スピン凝集によって凝集する、実施形態１４４～１６１のいずれか１つに記載の方法。
１６３．細胞が、凝集の工程の前に、静的非接着培養で維持される、実施形態１４４～１６２のいずれか１つに記載の方法。
１６４．細胞が、凝集の工程の前に、低細胞付着特性を有する表面を含むウェル内に維持される、実施形態１４４～１６３のいずれか１つに記載の方法。
以下は、本発明を実施するための非限定的な実施例である。
実施例１：神経系マイクロスフェア方法
第一に、細胞外マトリックスまたは他の添加剤を含まない、前分化したが最終的な分化をしていない細胞（すなわち、神経系幹細胞）から成る神経系マイクロスフェアの形成、およびそれらの最終的な細胞運命（すなわち、ニューロン）への成熟について簡単に記載し、以下の通りである：
１．２Ｄまたは３Ｄ形式のいずれかでｈＰＳＣを分化することによって取得されたＮＳＰＢＣの培養物を、酵素、キレート剤、または類似の分子を使用して単一細胞浮遊液に解離する。細胞浮遊液は、凍結保存されたＮＳＰＢＣを解凍することによっても取得することができる。
２．ＮＳＰＢＣ浮遊液は、受動的な重力または遠心力による沈降後、各マイクロウェルが、発生した細胞死を考慮して調整された数で、５個～１０００個の細胞の範囲の細胞の総数を含むように、十分な濃度および細胞の総数でマイクロウェル付きのプラスチック製品に移した。
３．ＮＳＰＢＣ懸濁液およびプレートは、遠心力によって細胞がマイクロウェルの中央底、典型的には５０～４００ｇで収集されるのを確実にするのに十分な速度で遠心分離することが好ましい。
４．静的非接訳状態でのマイクロスフェアプレートの培養により、細胞浮遊液が単一クラスターまたはマイクロスフェアに接着することを可能にする。
５．マイクロウェル内の細胞濃縮物は、マイクロウェル当たり、接着した生細胞のクラスターが、中枢神経系（ＣＮＳ）送達装置への積載および脳への移植のために実現可能であるため、≦２５０μｍの直径である、十分な数の細胞を含む必要がある。
６．有糸分裂ＮＳＰＢＣの大部分が有糸分裂後ニューロンなどの最終的な分化細胞型に成熟するまでの長期間（２～２００日）の静的非接着条件での培養によるマイクロスフェア細胞の最終的な成熟
７．付着および神経突起伸長のためのインビトロ２Ｄ培養への最終的な成熟マイクロスフェアの移行、または生着のためのインビボ（すなわち、ＣＮＳへの）移植
８．移植装置および細胞培養プラスチック製品を付着防止溶液で予めコーティングし、マイクロスフェアがガラス、プラスチック、または他の表面に接着するのを防止する。
第一に、細胞外マトリックスまたは他の添加剤を含まない、前分化したが最終的な分化をしていない細胞（すなわち、神経系幹細胞）から成る神経系マイクロスフェアの形成、およびそれらの最終的な細胞運命（すなわち、ニューロン）への成熟について簡単に記載し、以下の通りである：
１．２Ｄまたは３Ｄ形式のいずれかでｈＰＳＣを分化することによって取得されたＮＳＰＢＣの培養物を、酵素、キレート剤、または類似の分子を使用して単一細胞浮遊液に解離する。細胞浮遊液は、凍結保存されたＮＳＰＢＣを解凍することによっても取得することができる。
２．ＮＳＰＢＣ浮遊液は、受動的な重力または遠心力による沈降後、各マイクロウェルが、発生した細胞死を考慮して調整された数で、５個～１０００個の細胞の範囲の細胞の総数を含むように、十分な濃度および細胞の総数でマイクロウェル付きのプラスチック製品に移した。
３．ＮＳＰＢＣ懸濁液およびプレートは、遠心力によって細胞がマイクロウェルの中央底、典型的には５０～４００ｇで収集されるのを確実にするのに十分な速度で遠心分離することが好ましい。
４．静的非接訳状態でのマイクロスフェアプレートの培養により、細胞浮遊液が単一クラスターまたはマイクロスフェアに接着することを可能にする。
５．マイクロウェル内の細胞濃縮物は、マイクロウェル当たり、接着した生細胞のクラスターが、中枢神経系（ＣＮＳ）送達装置への積載および脳への移植のために実現可能であるため、≦２５０μｍの直径である、十分な数の細胞を含む必要がある。
６．有糸分裂ＮＳＰＢＣの大部分が有糸分裂後ニューロンなどの最終的な分化細胞型に成熟するまでの長期間（２～２００日）の静的非接着条件での培養によるマイクロスフェア細胞の最終的な成熟
７．付着および神経突起伸長のためのインビトロ２Ｄ培養への最終的な成熟マイクロスフェアの移行、または生着のためのインビボ（すなわち、ＣＮＳへの）移植
８．移植装置および細胞培養プラスチック製品を付着防止溶液で予めコーティングし、マイクロスフェアがガラス、プラスチック、または他の表面に接着するのを防止する。
第二に、細胞外マトリックスまたは他の添加剤を含まない神経系マイクロスフェアの形成を、本発明に含まれるデータを生成するために使用したアッセイおよび技法を支持するための方法論とともに、拡張してより詳細に記載した。これは以下の通りである：
ヒト多能性幹細胞の維持：ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株ＲＣ１７（Ｒｏｓｌｉｎ）および３０５３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ株）を、ヒトラミニン－５２１マトリックス（０．７～１．２μｇ／ｃｍ２；Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングされた培養器具上でペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したｉＰＳ Ｂｒｅｗ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で培養した。ＲＣ１７細胞株は、＜３２継代に維持し、３０５３細胞株は、それぞれ１２および１４継代のストックから＜３０継代で使用した。培地は毎日交換し、細胞は４～６日ごとにＥＤＴＡ ０．５ｍＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で継代した。培養物を３７℃、湿度９５％、および５％ ＣＯ２レベルで維持した。すべての細胞培養物は、慣例的な試験によりマイコプラズマ陰性を確認した。
ヒト多能性幹細胞の維持：ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株ＲＣ１７（Ｒｏｓｌｉｎ）および３０５３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ株）を、ヒトラミニン－５２１マトリックス（０．７～１．２μｇ／ｃｍ２；Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングされた培養器具上でペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したｉＰＳ Ｂｒｅｗ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で培養した。ＲＣ１７細胞株は、＜３２継代に維持し、３０５３細胞株は、それぞれ１２および１４継代のストックから＜３０継代で使用した。培地は毎日交換し、細胞は４～６日ごとにＥＤＴＡ ０．５ｍＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で継代した。培養物を３７℃、湿度９５％、および５％ ＣＯ２レベルで維持した。すべての細胞培養物は、慣例的な試験によりマイコプラズマ陰性を確認した。
腹側中脳ドーパミン作動性ニューロン分化：細胞を、確立されたプロトコル（Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）に従って分化させた。簡潔に述べると、ｈＥＳＣを７０～９０％のコンフルエントまで増殖させ、次いで０．５ｍＭのＥＤＴＡを用いて解離して、約２個～１０個の細胞の小さな凝集体を生成した。細胞を、ヒトラミニン－１１１（１．２μｇ／ｃｍ２；ＢｉｏＬａｍｉｎａ）でコーティングした細胞培養フラスコまたはプレートに１×１０４個の細胞／ｃｍ２で播種し、直ちに分化培地と接触させた。細胞を、インビトロ（ＤＩＶ）で０～８日Ｎ２系培地；ＳＭＡＤ阻害剤ＳＢ４３１５４２（１０μＭ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、神経誘導のためのＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、腹側運命のためＳｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｃ２４ＩＩ（ＳＨＨ；５００ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、尾状化を促進するためＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；３０５３については０．５μＭおよび０．６μＭ ＲＣ１７；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充した、５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）５０％ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ Ｎ２補充ＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、５％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．２％ペニシリンストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に曝露した。Ｎ２系培地は、ＤＩＶ９～１１の線維芽細胞増殖因子８ｂ（ＦＧＦ８ｂ；１００ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充した。ＤＩＶ１１で細胞をアキュターゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解離し、１０μＭのｒｏｃｋ阻害剤Ｙ２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ）を補充したＤＩＶ１１～１６培地（ＦＧＦ８ｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－アスコルビン酸（ＡＡ；２００μＭ；Ｓｉｇｍａ）、ヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；２０ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、２％ Ｂ２７補充ビタミンＡなしＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、５％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．２％ Ｐ／Ｓ）でヒトラミニン－１１１（１０ １．２μｇ／ｃｍ２）をコーティングした細胞培養フラスコまたはプレートに０．８×１０６個の細胞／ｍ２を播種した。ＤＩＶ１６で細胞をアキュターゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解離し、マイクロスフェア形成に使用するか、凍結保存するか、または長期接着培養のために、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ）を含むＤＩＶ１６培地でヒトラミニン－１１１（１．２μｇ／ｃｍ２）でコーティングした細胞培養フラスコ／プレートに０．１５５×１０６個の細胞／ｃｍ２で再播種し、ＮＳＰＢＣがニューロンに成熟することを可能した。ＤＩＶ１６以降から、細胞を、ＡＡ（２００μＭ）、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ヒトグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ；２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ジブチリル－ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ；５００μＭ；Ｓｉｇｍａ）、およびｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ（１０μＭ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＢ２７－系培地で培養した。
背側前脳皮質グルタミン酸作動性ニューロン分化：細胞を、確立されたプロトコル（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ ２０１２）に従って分化させた。ｈＥＳＣを播種し、ラミニン－５２１（１．２μｇ／ｃｍ２）、ＢｉｏＬａｍｉｎａ）でコーティングした培養器具で培養し、９５～１００％コンフルエントな単層を形成させ、分化培地に曝露した。ＤＩＶ０－１０から、細胞を、Ｎ２／Ｂ２７系培地：ＳＭＡＤ阻害剤ＳＢ４３１５４２（１０μＭ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、およびＬＤＮ－１９３１８９（１００ｎＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を補充した、５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）５０％ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）、２％ Ｂ２７補充ビタミンＡ ＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ Ｎ２補充ＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、５％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．２％ペニシリンストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、０，０８９％ β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＤＩＶ１０で、細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡで解離し、１：２比率で継代した。Ｎ２／Ｂ２７系培地を、ＤＩＶ１１～１８の線維芽細胞成長因子ｂ（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ）で補充した。ＤＩＶ１８で、細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡで解離し、凍結保存または１：２比率で継代した。ＤＩＶ１９以降から、細胞を、Ｎ２／Ｂ２７系培地で培養した。マイクロスフェアを、ＤＩＶ２７および３４で生成した。
神経系マイクロスフェア形成および静的非接着培養および分化：ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）２４ウェルプレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、各ウェルが４００μｍ×４００μｍの１２００マイクロウェルを含むものであり、マイクロスフェア形成および静的非接着培養に使用した。まず、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌｓを、プラスチックへの細胞接着を防止するために、製造元の指示に従って抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で前処理した。マイクロスフェアを、マイクロスフェアの所望するサイズ（例えば、１００個の細胞から成るマイクロスフェアを生成するための１．２ｘ１０＾６個の細胞／ウェル）に応じて、１ｍＬの好適な濃度のＮＳＰＢＣ単一細胞（または２個～１０個の細胞の小さなクラスター）浮遊液をＡｇｇｒｅＷｅｌｌｓに移すことによって生成した。次に、細胞を、２００～４００ｇで５分間の遠心分離による遠心力によってマイクロウェルに沈降させるか、または通常の重力で受動的に沈降させた。プレートを、標準的な細胞培養インキュベーター内で、３７℃、５％ ＣＯ２、９５％湿度で維持した。播種後２４～４８時間以内に、細胞は、均一なスフェア状マイクロスフェアに自発的に凝集した。培地交換を、２～３日ごとに培地の半分を手動で除去し、新しい培地を追加することによって実施した。マイクロスフェアを、形成後最大＞５０日間、マイクロウェル内の静的非接着培養で維持した。マイクロスフェアの収穫／採取を、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌの培養培地を上下に静かにピペッティングしてマイクロスフェアを浮遊させ、抗接着溶液で予めコーティングしたチューブに浮遊液を収集することによって実施した。マイクロスフェアの組成、成熟、および繊維成長能力を評価するために、マイクロスフェアを、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン－５２１でコーティングしたプレートに播種し、接着培養で４８～７２時間維持した。
免疫細胞化学：細胞を、４％パラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で１０分間固定した。非特異的抗体結合は、細胞をＰＡＤＴ緩衝液；Ｃａ２＋およびＭｇ２＋（Ｇｉｂｃｏ）を含まず０．０２％アジ化ナトリウム溶液（Ａｍｐｌｉｑｏｎ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）、および５％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）と３０分インキュベートすることによって遮断し、その後室温で一次抗体と一晩インキュベートした。細胞を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳで３回洗浄し、ＰＡＤＴ緩衝液で１０分遮断し、光から保護して、フルオロフォア標識二次抗体と室温で２時間インキュベートした。次に、細胞をＤＡＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）で、室温で５分対比染色し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳで３回洗浄し、０．０２％アジ化ナトリウムを補充したＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳ中で４℃で貯蔵した。画像を、ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ－８１またはＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ２－ＵＣＢ顕微鏡で捕捉した。一次抗体：ＦＯＸＡ２（１：１００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ＯＴＸ２（１：５００、Ｒ＆Ｄ）、ＳＯＸ２（１：３００、Ｒ＆Ｄ）、Ｋｉ－６７（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、チロシンヒドロキシラーゼ（１：５００、Ｐｅｌ－Ｆｒｅｅｚ）、ＮＥＵＮ（１：５００、Ａｂｃａｍ）、ＢＲＮ２（１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＴＢＲ１（１：２００、Ａｂｃａｍ）、ＰＡＸ６（１：５００、Ａｂｃａｍ）、ベータ－ＩＩＩチューブリン（１：１５００、Ｐｒｏｍｅｇａ ａｎｄ Ａｂｃａｍ）。二次抗体：ロバ抗マウスＩｇＧ ＡＦ４８８／ＡＦ５５５（１：８００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ロバ抗ヤギＩｇＧ ＡＦ４８８／ＡＦ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ロバ抗－ウサギＩｇＧ ＡＦ５５５／ＡＦ４８８／ＡＦ６４７（１：８００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。
神経系マイクロスフェア組成の定量分析：免疫細胞化学（ＩＣＣ）の定量的分析を、２つの複製ウェルから無作為に選択した画像野、各ウェルの３つの異なる視野（ｎ＝３～６実験）で実施した。各視野について、関連するチャネルの画像（４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５５５ｎｍ、６４７ｎｍ）を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ－８１またはＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ２－ＵＣＢ顕微鏡およびＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して１０倍の倍率で取得した。核マーカー（ＳＯＸ２、ＮＥＵＮ、Ｋｉ－６７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２）の定量化を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ）で手動でカウントすることによって行い、ＤＡＰＩとオーバーラップする明確な核シグナルを示す細胞は、特定のマーカーに対して陽性であるとみなした。
マイクロスフェア直径測定：マイクロウェル内のマイクロスフェアの画像は、マイクロスフェア形成の４８～７２時間後に、静的成熟培養物に沿った追加の時点で、４倍および１０倍対物レンズを使用して取得した。マイクロスフェア直径を、ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）の水平測定ツールを使用して４倍画像で測定した。バイオリンプロットを生成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８で平均および標準偏差（ＳＤ）を計算した。
ＮＳＰＢＣおよび神経系マイクロスフェアの凍結保存：ＮＳＰＢＣ接着培養物を、アキュターゼまたはＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）で単一細胞浮遊液に解離させ、遠心分離によりペレット化し、凍結保護溶液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、Ｚｅｎｏａｑ）中に再浮遊させ、冷結保存バイアルに移し、ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で－８０℃の冷凍庫に一晩入れ、翌日に気相液体窒素貯蔵に移した。マイクロスフェアの凍結保存のために、マイクロスフェアを培養培地を上下に穏やかにピペッティングすることによって浮遊状態にし、抗接着溶液で予めコーティングしたチューブに浮遊液を収集することにより、マイクロスフェアをマイクロウェルから収集した。次に、マイクロスフェアを、４０～１００ｇで１分遠心分離することによりチューブの底に穏やかに沈降させ、Ｂ２７（１０％）、Ｎ２（２％）、ＢＤＮＦ（８０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（８０ｎｇ／ｍＬ）、およびＤＭＳＯ（１０％）を補充した神経基礎培地から成る凍結保護溶液、または市販の凍結保護剤のいずれかで、約４８００個のマイクロスフェア／ｍＬ（１００個の細胞／マイクロスフェア）または１２００個のマイクロスフェア／ｍＬ（５００個の細胞／マイクロスフェア）の濃度に再懸濁した。次いで、マイクロスフェア懸濁液を冷結保存バイアル（０．５ｍＬ／バイアル）に移し、－８０℃の冷凍庫内のＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に一晩入れ、翌日気相液体窒素貯蔵に移した。
ＮＳＰＣおよび神経系マイクロスフェアの移植のためのガラス毛細管引：ＰＣ－１００プラー（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ ｇｒｏｕｐ）を毛細管引に使用した。マイクロスフェアの移植では、通常ＮＳＰＣで使用されるよりも広い内径の毛細管を、６０℃でガラスをゆっくりと引くことによって生成した。これらの毛細管の内径は＜２５０μｍであった。
成体ヌードラットへのＮＳＰＣおよび神経系マイクロスフェアの脳内移植：すべての動物を、欧州連合の指令による制限の下で実施した。ラットは、ｈＰＳＣ由来腹側中脳ＮＳＰＣ（ＤＩＶ１６）または中脳ＮＳＰＣの同じバッチから生成し、静的非接着培養でさらに１４～１６日成熟させた神経系マイクロスフェア（ＤＩＶ３０～３２）のいずれかの定位手術によって線条体への片側注射を受けた。合計４匹のラットに、１００，０００個の腹側中脳ＮＳＰＣを移植し、移植後４週で犠牲にした。合計で１３匹のラットが、Ｋｉｒｋｅｂｙら（Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１７）によって記載された座標を使用して、１μＬ／沈着物の２つの沈着物で送達された１００，０００個の細胞に対応する片側用量のマイクロスフェア（１００個の細胞／マイクロスフェア）を受けた。マイクロスフェアを移植したラットを、移植後４週（ｎ＝６）または移植後８週（ｎ＝７）で犠牲にした。移植のために、マイクロスフェアを、抗接着溶液で予め処理した０．５ｍＬチューブに採集し、２００ｇで１分遠心分離してペレット化し、約５００個のマイクロスフェア／μＬ（すなわち、約５０，０００個の細胞／μＬ）の濃度でＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＨａｎｋの緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）中に再浮遊させ、氷上に置いた。任意の細胞調製または移植手順の前に、ガラス毛細管、ピペットチップ、および他のプラスチック製品を、抗接着溶液で予めコーティングした。
免疫組織化学および組織学：ラットを灌流固定し、脳を収集し、４％ＰＦＡで２４時間固定し、３０％のスクロース溶液中で凍結保存した。次に、脳を、１：１０または１：１２の連続で３５μｍの厚さの凍結スレッジミクロトームで冠状に切片化した。免疫組織化学を、遊離浮遊切片で実施し、すべての洗浄工程を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで行った。非特異的抗体の結合を遮断するために、切片を３回洗浄した、次にＰＡＤＴ緩衝液中で、室温で３０分インキュベートした。次に切片を、ＰＡＤＴ中で希釈した一次抗体とともに室温で一晩インキュベートした。切片を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＰＡＤＴ遮断溶液で３０分インキュベートし、次に光から保護して、フルオロフォア複合二次抗体と室温で２時間インキュベートした。最後に、切片をＤＡＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）で、室温で１５分対比染色し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳで３回洗浄した。次に、染色した切片をゼラチンコーティングしたスライドガラスに乗せ、カバーをＰＶＡ－ＤＡＢＣＯでスリップさせ、透明なネイルポリッシュで密封し、光から保護して４℃で貯蔵した。一次抗体：ＦＯＸＡ２（１：１００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ＯＴＸ２（１：４００、Ｒ＆Ｄ）、ＳＯＸ２（１：２００、Ｒ＆Ｄ）、Ｋｉ－６７（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、チロシンヒドロキシラーゼ（１：５００、Ｐｅｌ－Ｆｒｅｅｚ）、ＮＥＵＮ（１：４００、Ａｂｃａｍ）、ＮＣＡＭ（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、およびヒト核抗原（ＨＮＡ）（１：１００、Ａｂｃａｍ）。二次抗体：ロバ抗マウスＩｇＧ ＡＦ４８８／ＡＦ５５５（１：６００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ロバ抗ヤギＩｇＧ ＡＦ４８８／ＡＦ５５５（１：６００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ロバ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ５５５／ＡＦ４８８／ＡＦ６４７（１：６００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。
フローサイトメトリーおよび統計分析：凍結保存したＮＳＰＣを解凍し、０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＨＢＳＳ－／－に再懸濁し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００でカウントし、光から保護された室温で１５分間、固定可能なバイオレット生存率色素（１０６個の細胞当たり１μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、次にＢＤ転写因子緩衝液セット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造元の指示に従って固定および透過処理を行った。次に、固定細胞を蛍光性複合抗体で染色し、試料をＢＤ ＬＳＲ ＦｏｒｔｅｓｓａまたはＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。ｆｃｓファイルをエクスポートし、ＦｌｏｗＪｏ １０．５．０３で分析した。ゲートは、未染色対照、蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照、または生物学的陰性対照試料に基づいて設定した。抗体：ＦＯＸＡ２（１：３２０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＯＴＸ２（１：３２０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＳＯＸ２（１：４０、ＢＤ）、ＳＯＸ１（１：３２０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＮＫＸ６．１（１：６４０、ＢＤ）、ＯＣＴ３／４（１：１０、ＢＤ）、Ｎａｎｏｇ（１：１９２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
転写アッセイ：単一細胞ＲＮＡシークエンシングでは、ＮＳＰＢＣ培養物をアキュターゼで単一細胞浮遊液に解離し、３０００個～１００００個の細胞を１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して処理し、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０でシークエンシングした。バルクＲＮＡ評価のために、ＲＮＡを、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによって分析された急速凍結細胞ペレットから抽出した。
統計分析：統計分析を、Ｐｒｉｓｍ ８．０．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。バイオリンプロットを除くすべてのグラフを、平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。
参考資料：
Ｋｉｒｋｅｂｙ Ａ，Ｎｏｌｂｒａｎｔ Ｓ，Ｔｉｋｌｏｖａ Ｋ，Ｈｅｕｅｒ Ａ，Ｋｅｅ Ｎ，Ｃａｒｄｏｓｏ Ｔ，Ｏｔｔｏｓｓｏｎ ＤＲ，Ｌｅｌｏｓ ＭＪ，Ｒｉｆｅｓ Ｐ，Ｄｕｎｎｅｔｔ ＳＢ，Ｇｒｅａｌｉｓｈ Ｓ，Ｐｅｒｌｍａｎｎ Ｔ，Ｐａｒｍａｒ Ｍ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｇｒａｆｔ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＥＳＣ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｊａｎ ５；２０（１）：１３５－１４８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．０９．００４．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｏｃｔ ２７．
参考資料：
Ｋｉｒｋｅｂｙ Ａ，Ｎｏｌｂｒａｎｔ Ｓ，Ｔｉｋｌｏｖａ Ｋ，Ｈｅｕｅｒ Ａ，Ｋｅｅ Ｎ，Ｃａｒｄｏｓｏ Ｔ，Ｏｔｔｏｓｓｏｎ ＤＲ，Ｌｅｌｏｓ ＭＪ，Ｒｉｆｅｓ Ｐ，Ｄｕｎｎｅｔｔ ＳＢ，Ｇｒｅａｌｉｓｈ Ｓ，Ｐｅｒｌｍａｎｎ Ｔ，Ｐａｒｍａｒ Ｍ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｇｒａｆｔ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＥＳＣ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｊａｎ ５；２０（１）：１３５－１４８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．０９．００４．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｏｃｔ ２７．
実施例２：神経系マイクロスフェア生成の入力細胞として使用するための前脳、中脳、および脊髄ＮＳＰＢＣへのｈＰＳＣの分化および特性評価
発生中の胚は、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の３つの主要な胚葉系統に分けられる。中枢神経系（ＣＮＳ）は外胚葉内で形成され、このプロセスにおいて細胞は神経同一性を獲得する。神経分化は、すべての系統と同様に、細胞は通常、増殖、有糸分裂、自己複製、および多能性を特徴とする未成熟な表現型を最初に獲得するという連続的な方法で進行し、発生時間の経過とともに、細胞は通常、これらの特性を失い、有糸分裂後となり、自己複製が不能となり、潜在的ではなくなり、この時点で最終的に分化しているとみなされる。このプロセスは神経系統においてよく観察され、初期の発達段階では、細胞は非常に多能性の神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）として分類され、自己複製して、細胞自体だけでなく細胞の多数の亜系統（すなわち、多くのクラスのニューロン、異なる型の星状細胞および希突起膠細胞）を生じさせることができる。発生および分化において、インビトロＮＳＰＣは減少し、典型的には神経芽細胞（ＮＢＣ）または放射状グリア細胞または中間前駆細胞と呼ばれ、通常は単能性であり、限られた範囲でのみ自己複製することができる、子孫中間細胞型によって置換される。ＮＢＣは最終的に、ニューロンまたは星状細胞などの最終的な分化細胞型を生じさるが、これはさらに分化することはできず、ニューロンの場合は増殖または自己再生することができない。
発生中の胚は、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の３つの主要な胚葉系統に分けられる。中枢神経系（ＣＮＳ）は外胚葉内で形成され、このプロセスにおいて細胞は神経同一性を獲得する。神経分化は、すべての系統と同様に、細胞は通常、増殖、有糸分裂、自己複製、および多能性を特徴とする未成熟な表現型を最初に獲得するという連続的な方法で進行し、発生時間の経過とともに、細胞は通常、これらの特性を失い、有糸分裂後となり、自己複製が不能となり、潜在的ではなくなり、この時点で最終的に分化しているとみなされる。このプロセスは神経系統においてよく観察され、初期の発達段階では、細胞は非常に多能性の神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）として分類され、自己複製して、細胞自体だけでなく細胞の多数の亜系統（すなわち、多くのクラスのニューロン、異なる型の星状細胞および希突起膠細胞）を生じさせることができる。発生および分化において、インビトロＮＳＰＣは減少し、典型的には神経芽細胞（ＮＢＣ）または放射状グリア細胞または中間前駆細胞と呼ばれ、通常は単能性であり、限られた範囲でのみ自己複製することができる、子孫中間細胞型によって置換される。ＮＢＣは最終的に、ニューロンまたは星状細胞などの最終的な分化細胞型を生じさるが、これはさらに分化することはできず、ニューロンの場合は増殖または自己再生することができない。
神経系細胞のこれらの段階への分化は、インビトロで達成され、観察された哺乳動物神経発達を複製し、ＣＮＳの３つの主要領域すべてで観察されている。ｈＰＳＣは、ＣＮＳの３つの主要領域すべて、前脳、中脳、および後脳／脊髄に分化することができ、これらのプロトコルでは、ｈＰＳＣからＮＳＰＣ、ＮＢＣ、ニューロンの段階へ広範囲に記録されている。例えば、高純度プロトコルは、皮質グルタミン酸作動性ニューロン系統の背側前脳細胞（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ ２０１１；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ ２０１２）、ドーパミン作動性ニューロン系統の腹側中脳細胞（Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ ２０１２，Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｍａｒ ２０１７）、および運動ニューロン系統の腹側脊髄細胞（Ａｍａｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ ２０１３；Ｄｕ ｅｔ ａｌ ２０１５）を明示するために記載されている。
図１～４および１３は、前脳マイクロスフェアの形成に使用したｈＰＳＣ由来背側前脳皮質ＮＳＰＢＣのインビトロ特性評価を示す。皮質ＮＳＰＢＣへの分化は、広範なＮＳＰＣマーカーＳＯＸ２（図１Ｄ～Ｅ）、ならびに皮質特異的ＮＳＰＣマーカーＰＡＸ６およびＯＴＸ２（図１Ａ～Ｃ）の免疫細胞化学的発現によって示される。細胞は、皮質ＮＳＰＣマーカーＳＯＸ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＳＯＸ１を発現することを示したフローサイトメトリーによって、細胞が背側前脳皮質系統であることをさらに確認し（図２、３）、細胞は、＞９０％ ＳＯＸ２＋／ＯＴＸ２＋（図２Ａ、３）、＞９０％ ＰＡＸ６＋／ＯＴＸ２＋（図２Ｂ、３）、＞９０％ ＰＡＸ６＋／ＳＯＸ１＋（図２Ｃ、３）であり、予想通り、ＯＣＴ３／４およびＮＡＮＯＧなどの多能性のマーカーは発現していなかった（図２Ｄ、３）。皮質ＮＳＰＣは典型的なロゼット形態を有し、そこでは、細胞は円形の配向に配置され（図４Ａ）、これは、前述のＳＯＸ２／ＰＡＸ６／ＯＴＸ２のマーカーに加えて、継代またはＣＮＳへの移植のために単一細胞浮遊液に解離できる細胞の増殖状態および表現型を示す（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ ２０１１；Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ ２０１３；Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ ２０１８）。ｍＲＮＡ転写産物の測定値は、この分化から産生されたＮＳＰＣにおける局所ＣＮＳ同一性の獲得をさらに示し、詳細には、ＥＮ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＮＫＸ６．１の非存在を伴うＰＡＸ６およびＯＴＸ２の転写物の上方制御は、背側前脳ＣＮＳの局所関与を示す（図１３）。前脳ＮＳＰＣは、このプロトコルおよび系統で、背側前脳皮質中間前駆細胞／放射状グリア細胞型を示す遺伝子ＴＢＲ２でＮＢＣにさらに分化することができ、これはＤＩＶ２５以降で最高レベルで発現され（参照のＳｈｉ ｅｔ ａｌ ２０１１の図１Ｂ）、さらにニューロンに成熟される（図４Ｂ）。
図５～１０および１３は、中間脳マイクロスフェアの形成に使用される腹側中脳ＮＳＰＢＣへのｈＰＳＣのインビトロでの分化を示す。腹側中脳ＮＳＰＢＣへの分化は、広範なＮＳＰＣマーカーＳＯＸ２を９６．５％（図６Ａ）で発現することによって示され、腹側中脳特異的ＮＳＰＣマーカーＦＯＸＡ２およびＯＴＸ２は、それぞれ９６．７％および９３．６％であり、非腹中脳マーカーＰＡＸ６は同時に非存在であった（図６Ｂ、Ｃ）。腹側中脳ＮＳＰＣは、このマーカー群ＦＯＸＡ２／ＯＴＸ２／ ＳＯＸ２に基づく増殖状態を示し（図５～６）、これらのＤＩＶ１６細胞の単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）によって明確に例示され、それらはかなりの程度、ＮＥＳ、ＤＣＸ、増殖マーカーＭＫＩ６７などの他のＮＳＰＣマーカーから成っていることを示す（図８Ａ）。腹側中脳の局所的同一性および増殖状態のこれらのＮＳＰＣマーカーは、広く報告されている継代またはＣＮＳへの移植のために単一細胞浮遊液に分離できる細胞型を定義する（Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ ２０１１；Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ ２０１２；Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｇａｎｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ ２０２０）。中脳ＮＳＰＢＣは多能性マーカーを発現すべきではなく、フローサイトメトリーを用いたタンパク質レベルでの分析は、ＤＩＶ１６でこれらの中脳ＮＳＰＣは、重要なマーカーＯＣＴ３／４またはＮＡＮＯＧを発現せず、重要なことに共発現が陽性対照ｈＰＳＣとは対照的に（図７Ａ）、検出されなかったことを示した（図７Ｂ）。これは、腹側中脳ＮＳＰＣが主要な多能性マーカーＰＯＵ５Ｆ１（別名ＯＣＴ３／４）、ＮＡＮＯＧ、ＣＤ９、およびＰＯＤＸＬを共発現しなかったことを示すｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって転写レベルで確認された（図８Ｂ）。ｍＲＮＡ転写産物の測定値は、この分化から産生されたＤＩＶ１６ ＮＳＰＣにおける局所腹側中脳ＣＮＳ同一性の獲得、特にＰＡＸ６の非存在を伴うＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、およびＬＭＸ１Ａの転写物の上方制御を示す（図１３）。分化のＤＩＶ１６では、腹側中脳培養物はＮＳＰＣから成り、ＮＳＰＣマーカーＳＯＸ２のほぼ完全な発現および腹側中脳ＮＢＣマーカーＡＳＣＬ１の非存在によって見られるように、ＮＢＣを含有しなかった（図９Ａ；Ａｒｅｎａｓ ｅｔ ａｌ ２０１５）。重要なことに、これらのＮＳＰＣは、ＤＩＶ２６で＞３０％の細胞が、ＮＢＣマーカーＡＳＣＬ１を発現することが観察されたように、ＮＢＣ段階にさらに分化させることができた（図９Ｂ）。
図１１～１３は、後脳／脊髄マイクロスフェアの形成に使用されるｈＰＳＣの腹側後脳／脊髄ＮＳＰＢＣへのインビトロでの分化を示す。腹側後脳／脊髄ＮＳＰＢＣへの分化は、細胞の＞８０％での広範なＮＳＰＣマーカーＳＯＸ２の発現（図１２Ａ）および細胞の＞７２．５％での腹側脊髄ＮＳＰＣマーカーＮＫＸ６．１の発現によって示された（図１１Ａ～Ｂ、１２Ｂ）。ＮＳＰＢＣが尾側神経管同一性であり、したがって後脳／脊髄系統であるためには、それらは、免疫細胞化学およびフローサイトメトリーによって示されたように、前脳－中脳ＮＳＰＣマーカーＯＴＸ２の非存在を同時有さなければならない（図１１Ｃ～Ｄ、１２Ａ～Ｂ）。腹側後脳／脊髄ＮＳＰＣは、増殖状態を特徴とし、継代またはＣＮＳへの移植のために単一細胞浮遊液に解離することができる（Ａｍｏｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ｍＲＮＡ転写産物の測定値は、この分化から産生されたＮＳＰＣにおける局所ＣＮＳ同一性の獲得をさらに示し、詳細には、ＰＡＸ６、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２、およびＥＮ１の非存在を伴うＦＯＸＡ２およびＮＫＸ６．１の転写産物の上方制御は、腹側後脳／脊髄ＣＮＳの局所関与を示す（図１３）。
参考資料：
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｅｙ．Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｓｙｎａｐｓｅｓ
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ．Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ Ｓｔｕｄｅｒ．Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｎｇｒａｆｔ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ
２０１２．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｌｉｖｅｓｅｙ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ
２０１２．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｍａｒ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
２０１３．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ．Ｐｙｒａｍｉｄａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｔｏ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ
２０１３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ Ｗ．Ａｍｏｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｎｅｋ Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｍｂ－Ｉｎｎｅｒｖａｔｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ
２０１５．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｚｈａｎｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｅ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．
２０１６．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｉｓｈ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｖｅｎｔｒａｌ Ｍｉｄｂｒａｉｎ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｎｄｅｒ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｍｏｔｏｒ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ Ｒｏｄｅｎｔｓ
２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｒｋｅｂｙ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．
２０１５．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｒｅｎａｓ，Ｄｅｎｈａｍ Ｖｉｌｌａｅｓｃｕｓａ．Ｈｏｗ ｔｏ ｍａｋｅ ａ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎ．
２０１８．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ．Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ－Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｌｅｓｉｏｎｅｄ Ａｄｕｌｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｖｉｓｕａｌ Ｃｏｒｔｅｘ ｉｎ ａｎ Ａｒｅａ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗａｙ
２０２０．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．Ｇａｎｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｉｓｈ．Ｖｉｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＧＤＮＦ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ
参考資料：
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｅｙ．Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｓｙｎａｐｓｅｓ
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ．Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ Ｓｔｕｄｅｒ．Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｎｇｒａｆｔ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ
２０１２．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｌｉｖｅｓｅｙ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ
２０１２．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｍａｒ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
２０１３．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ．Ｐｙｒａｍｉｄａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｔｏ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ
２０１３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ Ｗ．Ａｍｏｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｎｅｋ Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｍｂ－Ｉｎｎｅｒｖａｔｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ
２０１５．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｚｈａｎｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｅ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．
２０１６．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｉｓｈ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｖｅｎｔｒａｌ Ｍｉｄｂｒａｉｎ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｎｄｅｒ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｍｏｔｏｒ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ Ｒｏｄｅｎｔｓ
２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｒｋｅｂｙ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．
２０１５．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｒｅｎａｓ，Ｄｅｎｈａｍ Ｖｉｌｌａｅｓｃｕｓａ．Ｈｏｗ ｔｏ ｍａｋｅ ａ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎ．
２０１８．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ．Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ－Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｌｅｓｉｏｎｅｄ Ａｄｕｌｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｖｉｓｕａｌ Ｃｏｒｔｅｘ ｉｎ ａｎ Ａｒｅａ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗａｙ
２０２０．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．Ｇａｎｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｉｓｈ．Ｖｉｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＧＤＮＦ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ
実施例３：標準的な２Ｄ手順でＮＳＰＢＣをニューロンに分化させると、分離または輸送できない脆弱な培養物が産生される
ＮＳＰＢＣをある状態から別の状態に移す一般な方法は、接着または浮遊ＮＳＰＢＣを単一細胞浮遊液に解離させることである。これを行うために、実施例２に記載のインビトロＮＳＰＢＣを、接着／結合タンパク質を破壊するか、または細胞間および／またはそれらが接着している表面間の分子結合を破壊する、キレート剤または酵素的解離剤で処理し、それらを単一細胞浮遊液または少数の細胞のクラスターに解離させた。分離剤の例には、アキュターゼ、トリプシン、ＥＤＴＡ、コラゲナーゼ、ディスパーゼなどが含まれる。このプロセスは、ＮＳＰＢＣに対して、最終的な運命への継続的な分化またはＣＮＳへの移植のために定期的に行われており、背側前脳細胞（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、腹側中脳（Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ ２０１１；Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ ２０１２；Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｇａｎｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ ２０２０）、および腹側脊髄（Ａｍａｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を含むすべてのＣＮＳ系統について報告されている
ＮＳＰＢＣをある状態から別の状態に移す一般な方法は、接着または浮遊ＮＳＰＢＣを単一細胞浮遊液に解離させることである。これを行うために、実施例２に記載のインビトロＮＳＰＢＣを、接着／結合タンパク質を破壊するか、または細胞間および／またはそれらが接着している表面間の分子結合を破壊する、キレート剤または酵素的解離剤で処理し、それらを単一細胞浮遊液または少数の細胞のクラスターに解離させた。分離剤の例には、アキュターゼ、トリプシン、ＥＤＴＡ、コラゲナーゼ、ディスパーゼなどが含まれる。このプロセスは、ＮＳＰＢＣに対して、最終的な運命への継続的な分化またはＣＮＳへの移植のために定期的に行われており、背側前脳細胞（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、腹側中脳（Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ ２０１１；Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ ２０１２；Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｇａｎｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ ２０２０）、および腹側脊髄（Ａｍａｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を含むすべてのＣＮＳ系統について報告されている
この最終的な継代および最終的な細胞型への分化は、前述のプロトコルによって前脳、中脳、および脊髄からのニューロンについて記載されており、マイクロスフェアの生成に使用されるＮＳＰＢＣが、標準的な条件下でニューロンを生成する能力を有することを本発明者らが示している。詳細には、前脳ＮＳＰＢＣは、グルタミン酸作動性ニューロン同一性のニューロンに２Ｄ接着培養でさらに分化することができ、脆弱で密接に絡み合う、酵素的に解離することができないすべてのニューロンに典型的な広範な神経突起線維を発達させ（図４Ｂ）、ＴＢＲ１およびＢＲＮ２などの皮質グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーを発現する（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。さらに、腹側中脳ＮＳＰＢＣは、前述した標準的な２Ｄ培養方法論（Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７）に従って、最終的なニューロンの運命にさらに分化することができ、細胞は、脆弱で密接に絡み合う、ベータ－ＩＩＩ－チューブリンなどの汎ニューロンマーカーを発現する広範な神経突起線維を発達させ（図１０Ｃ、Ｄ）、そのうちのいくつかは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の染色によって示されるように、腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンである（図１０Ｅ、Ｆ）。さらに、腹側脊髄ＮＳＰＢＣは、腹側脊髄運動ニューロン同一性のニューロンにさらに分化することができ、脆弱で密接に絡み合う、酵素的に解離することができないすべてのニューロンに典型的な広範な神経突起線維を発達させ（図１１Ｅ）、ＨＢ９およびＩＳＬ１などの腹側運動ニューロンのマーカーを発現する（Ａｍａｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
これらのプロトコルから、および分野全体に由来するニューロンは、逆に解離せず、これは、ＮＳＰＢＣに非存在のニューロンの細胞体から伸びる神経突起の構造上の脆弱性によるものであり、図４（前脳）および図１０（中脳）および図１１（脊髄）は、形態学的および免疫細胞化学的レベルでこれらの明確な対比を示す。有糸分裂後ニューロンを、成長する状態（２Ｄ接着単層または３Ｄ神経系スフェアまたは３Ｄオルガノイドのいずれであっても）から採取したときに、その生存能力を維持する化合物または特殊な機器を追加せずに有糸分裂後のニューロンを「小型で輸送可能な」形式にパッケージ化する方法を記述した文献報告または発明はない。ニューロン自体を解離して小型で輸送可能な様式を生成しようとする本発明者らの試みは、この細胞型の顕著な脆弱性および喪失を観察した。ニューロンおよび他の最終的な細胞型（すなわち、星状細胞および髄膜細胞）に対して濃縮された最終的な分化腹側中脳培養物は、記載される２Ｄ接着培養条件で公開されるプロトコルの約ＤＩＶ３５～４０で取得される（図１０Ｃ～Ｆ、Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これらの培養物を、３７℃で解離酵素アキュターゼとともにインキュベートし、単一細胞浮遊液または少数の細胞の小さなクラスターを作製しようと試みた。標準的な持続時間（２５分）の間、アキュターゼで処理したニューロンに富む培養物は、ニューロンに対して有害であることが示された単一細胞および小さなクラスターの混合物をもたらした（図４６Ａ、Ａ’）。これは、生存する培養物がほとんどの神経突起、すなわちニューロン（解離中のそれらの死および喪失を示す）が枯渇し、神経突起を有しない非ニューロン細胞型に濃縮された、再播種によって示された（図４６Ａ、Ａ’）。観察されたどの神経突起も、その体細胞から遠くまで放射しない短い長さのために、ＮＢＣまたは新しく生まれた若いニューロンから発散するようであった（図４６Ａ、Ａ’）。２５分インキュベートしても、これらの伸長した接着２Ｄ培養物の多数の厚く多層の領域を破壊するには不十分であり、再播種後に増殖する細胞数の増加から明らかなように、神経系細胞培養物全体を単一細胞浮遊液または小さなクラスターに処理するには、より長いアキュターゼインキュベーション手順（９０分）が必要であった（図４６Ｂ）。しかしながら、９０分のインキュベーションは、ニューロンに対しても有害であることが示された。これは、生存する培養物がほとんどの神経突起、すなわちニューロン（解離中のそれらの死および喪失を示す）が枯渇し、神経突起を有さない非ニューロン細胞型に濃縮された、再播種によって示された（図４６Ｂ、Ｂ’）。観察されたどの神経突起も、その体細胞から遠くまで放射しない短い長さのために、ＮＢＣまたは新しく生まれた若いニューロンから発散するようであった（図４６Ｂ、Ｂ’）。これらの観察結果は、ＤＩＶ３５解離培養物中の有糸分裂後神経核マーカーＮＥＵＮに対する免疫染色によってさらに明らかであり、これは、短い期間（２５分、図４７Ａ、Ｂ）または長い期間（９０分、図４７Ｃ、Ｄ）の間、アキュターゼインキュベーションに供されたかどうかにかかわらず、再播種時にＮＥＵＮ＋核をほぼ完全に欠いていた。これは、マトリックスなしでの静的非接着培養によって最終的な神経系細胞の運命に分化することができる神経系マイクロスフェア（実施例４～６に記載）とは全く対照的である（図４６Ｃ、Ｃ’）。マイクロスフェアは、解離を必要とせずに２Ｄ接着状態に戻るように再播種することができ、表面に迅速にコロニー形成し、増殖性ＮＳＰＢＣの兆候を示さず（図４６Ｃ、Ｃ’）、ニューロンマーカーＮＥＵＮに富む（図４７Ｅ～Ｆ）膨大な数の神経突起を産生することが見られた。
参考資料：
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ．Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ Ｓｔｕｄｅｒ．Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｎｇｒａｆｔ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｅｙ．Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｓｙｎａｐｓｅｓ
２０１２．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｌｉｖｅｓｅｙ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ
２０１２．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｍａｒ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
２０１３．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ．Ｐｙｒａｍｉｄａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｔｏ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ
２０１３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ Ｗ．Ａｍｏｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｎｅｋ Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｍｂ－Ｉｎｎｅｒｖａｔｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ
２０１５．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｚｈａｎｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｅ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．
２０１６．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｉｓｈ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｖｅｎｔｒａｌ Ｍｉｄｂｒａｉｎ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｎｄｅｒ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｍｏｔｏｒ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ Ｒｏｄｅｎｔｓ
２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｒｋｅｂｙ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．
２０１８．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ．Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ－Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｌｅｓｉｏｎｅｄ Ａｄｕｌｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｖｉｓｕａｌ Ｃｏｒｔｅｘ ｉｎ ａｎ Ａｒｅａ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗａｙ
参考資料：
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ．Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ Ｓｔｕｄｅｒ．Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｎｇｒａｆｔ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｅｙ．Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｓｙｎａｐｓｅｓ
２０１２．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｌｉｖｅｓｅｙ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ
２０１２．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｍａｒ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
２０１３．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ．Ｐｙｒａｍｉｄａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｔｏ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ
２０１３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ Ｗ．Ａｍｏｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｎｅｋ Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｍｂ－Ｉｎｎｅｒｖａｔｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ
２０１５．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｚｈａｎｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｅ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．
２０１６．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｉｓｈ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｖｅｎｔｒａｌ Ｍｉｄｂｒａｉｎ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｎｄｅｒ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｍｏｔｏｒ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ Ｒｏｄｅｎｔｓ
２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｒｋｅｂｙ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．
２０１８．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｅｓｐｕｎｙ－Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ．Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ－Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｌｅｓｉｏｎｅｄ Ａｄｕｌｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｖｉｓｕａｌ Ｃｏｒｔｅｘ ｉｎ ａｎ Ａｒｅａ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗａｙ
実施例４：再現性のある形態およびサイズを有する神経系マイクロスフェアの形成
ニューロンを小さな小型の様式で物理的に動かす能力を提供し、それらの生存能力を維持する発明は、生物医学研究に大きな利点を提供する。かかる発明の利点は、ＮＳＰＢＣ移植とは対照的にニューロン移植がいくつかの利点を提供し得る細胞置換療法のためのＣＮＳへの移植の文脈で最もよく見られる。例えば、ニューロン移植は、有糸分裂後の細胞集団を患者に送達し、これは、有糸分裂およびしばしば高度に増殖するＮＳＰＢＣの表現型と比較して、腫瘍形成および癌様増殖特性のリスクが低い。移植ニューロンはまた、移植されたニューロンがすでに神経突起を有しており、単に機能回復のために宿主標的を神経支配しなければならないため、神経回路回復が目標である場合、より速い生体内回復を促進するために理論化されており、ＮＳＰＢＣは、宿主標的を神経支配し始める前に、ニューロンにさらに分化し、神経突起を発達させる必要がある。さらに、ニューロンの移植は、ｈＰＳＣから最終的な細胞型（すなわち、ニューロン）への完全な分化プロトコルをインビトロで実施することが可能であり、ヒトオペレーターによる分化手順の完全なプロセス制御が可能となる。対照的に、ＮＳＰＢＣの移植は、最終的な細胞運命への分化手順の最終段階がインビボで発生し、ヒトオペレーターによって制御されないことを意味し、これは、インビトロ由来ニューロンと比較して移植由来のニューロンの貧弱で可変的なインビボ純度の根底にあると考えられる（Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ，２０１１；ｄｅ Ｌｕｚｙ ｅｔ ａｌ，２０１９；Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ，２０１７）。
ニューロンを小さな小型の様式で物理的に動かす能力を提供し、それらの生存能力を維持する発明は、生物医学研究に大きな利点を提供する。かかる発明の利点は、ＮＳＰＢＣ移植とは対照的にニューロン移植がいくつかの利点を提供し得る細胞置換療法のためのＣＮＳへの移植の文脈で最もよく見られる。例えば、ニューロン移植は、有糸分裂後の細胞集団を患者に送達し、これは、有糸分裂およびしばしば高度に増殖するＮＳＰＢＣの表現型と比較して、腫瘍形成および癌様増殖特性のリスクが低い。移植ニューロンはまた、移植されたニューロンがすでに神経突起を有しており、単に機能回復のために宿主標的を神経支配しなければならないため、神経回路回復が目標である場合、より速い生体内回復を促進するために理論化されており、ＮＳＰＢＣは、宿主標的を神経支配し始める前に、ニューロンにさらに分化し、神経突起を発達させる必要がある。さらに、ニューロンの移植は、ｈＰＳＣから最終的な細胞型（すなわち、ニューロン）への完全な分化プロトコルをインビトロで実施することが可能であり、ヒトオペレーターによる分化手順の完全なプロセス制御が可能となる。対照的に、ＮＳＰＢＣの移植は、最終的な細胞運命への分化手順の最終段階がインビボで発生し、ヒトオペレーターによって制御されないことを意味し、これは、インビトロ由来ニューロンと比較して移植由来のニューロンの貧弱で可変的なインビボ純度の根底にあると考えられる（Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ，２０１１；ｄｅ Ｌｕｚｙ ｅｔ ａｌ，２０１９；Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ，２０１７）。
本明細書に記載の本発明は、多能性または単能性ＮＳＰＢＣをマイクロスフェアと称される様式にパッケージ化する方法を詳述し、これは、それらの最終的な細胞運命（すなわち、ニューロン）への分化が可能となるが、これらのニューロンを小型で輸送可能な形式にして、新しい条件、例えば、２Ｄ接着培養条件（図２６～２７、３１～３３）、脳神経外科用の移植装置を通過するか（図４６Ｃ、Ｃ’、４７Ｅ～Ｆ）、またはかかる装置を使用してＣＮＳに移植（図４７）することへ移行することが可能である特性も有する。神経系マイクロスフェアを生成するためのプロセスは以下の通りであり、概略図（図１４）に要約されている。まず、ｈＰＳＣに由来する予め分化させたＮＳＰＢＣを単一細胞に解離し、定量化した。マイクロスフェア形成に使用される入力ＮＳＰＢＣは、実施例２に記載したように、ＣＮＳの主要な領域に及んだ。正確な量のＮＳＰＢＣを、細胞付着を防止するために抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングしたウェル当たり１２００個のマイクロウェルを含有するＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００マイクロウェル２４ウェルプレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移し、製造元の指示に従って調製した。遠心力を適用して、細胞をマイクロウェルの底の中心点に、およびマイクロスフェアを形成する目的で互いに近接して駆動するようにした（図１５～２２）。遠心力の代わりに、受動的な環境重力が、類似の神経系マイクロスフェアを生成した凝集の目的で、細胞をマイクロウェルの底に向けるより単純な方法として、代わりに使用され得る（図１８Ｄ）。
ＮＳＰＣから形成された神経系マイクロスフェアは、前脳、中脳、後脳／脊髄のＣＮＳ系統全体で、形成直後に形態が一貫していることが見られた。特に、すべてのマイクロウェルは、すべての場合において、使用したＣＮＳ系統全体でそれらの中心に位置し、最小限の細胞死（死は細胞および物質であり、マイクロスフェア内になく、破片の雲を形成する）を伴うスフェア状形態の個々のマイクロスフェアを含むことが見られた（図１５～２２）。さらに、マイクロスフェアの外周部を画定する、しっかりと圧縮された健康な神経外胚葉を示す明確で鋭い境界が、前脳マイクロスフェア（図１５～図１７）、中脳マイクロスフェア（図１８～２１）、および後脳／脊髄マイクロスフェア（図２２）で見られた。ウェル当たりの個々のマイクロスフェア形成の同じ特性、最小限の細胞死、および鋭い境界は、５０個の細胞（図１８Ａ）、１００個の細胞（図１５Ａ、１８Ｂ、２２）、または５００個の細胞（図１５Ｂ、１７Ｂ、１８Ｃ）を含む様々な数の細胞でマイクロウェルを播種することによって形成された、異なるサイズのマイクロスフェアの範囲にわたる群内で観察された。
ＮＳＰＣ神経系マイクロスフェアの一貫したかつ再現性のある物理的様式は、形成直後の直径で測定し、ＣＮＳの系統全体で観察された一貫したサイズに反映された。詳細には、ＤＩＶ２７前脳ＮＳＰＣは、播種後４８～７２時間で、変動がほとんどなく、直径が５２．１９±３．９５μｍ（平均±標準偏差）（１００個の細胞／マイクロスフェア）および９０．２３±６．２４μｍ（５００個の細胞／マイクロスフェア）の狭い範囲のミマイクロスフェアを生成した（図２３）。ＤＩＶ１６中脳ＮＳＰＣも同様に、播種後４８時間で、形態学的変化がほとんどなく、直径が３７．６１±４．５１μｍ（５０個の細胞／マイクロスフェア）、４８．６７±４．１１μｍ（１００個の細胞／マイクロスフェア）、および９１．２４±５．６５μｍ（５００個の細胞／マイクロスフェア）の狭い範囲のマイクロスフェアを生成し（図２４）、後脳／脊髄同一性のＤＩＶ２０ ＮＳＰＣは、播種後４８時間で、変動がほとんどなく、直径が７１．８１±２．４７μｍ（１００個の細胞／マイクロスフェア）の狭い範囲のマイクロスフェアを生成した（図２５）。
ＮＳＰＣ、特にＮＢＣよりもさらに分化した細胞型は、プロセシングおよび神経系マイクロスフェアの生成にも適合することが示された。これは、マイクロスフェア生成の入力細胞として、実施例２で記載したＤＩＶ３４前脳ＴＢＲ２濃縮皮質ＮＢＣおよびＤＩＶ２６中脳ＡＳＬＣ１濃縮ＮＢＣを含む一連のＣＮＳ系統ＮＢＣを使用することによって示された。これらのＮＢＣマイクロスフェアはまた、形成直後（図１７、２０）および静的非接着培養期間後（図２１）、明確な輪郭を描写する外周／境界および一貫した寸法を有する、小さくて一貫した寸法の個々のスフェロイドクラスターを生成することも見られた。さらに、マイクロスフェア調製のためのそれらの従順性を示すＮＢＣ神経系マイクロスフェア形成後にほとんど細胞死／破片が観察され、ＤＩＶ３４で、ＮＢＣで前脳系統で示され、ＤＩＶ４０で１００個の細胞（図１７Ａ）および５００個の細胞サイズ（図１７Ｂ）で観察された。これは、ＤＩＶ２６で形成され、１００個の細胞サイズ（図２０Ａ）および５００個の細胞サイズ（図２０Ｂ）のマイクロスフェアでＤＩＶ３０で観察された中脳系統ＮＢＣでも示された。
参考資料：
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ．Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ Ｓｔｕｄｅｒ．Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｎｇｒａｆｔ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ
２０１９．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｄｅ Ｌｕｚｙ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｉｓｈ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＭＸ１ａ Ｖｅｎｔｒａｌ Ｍｉｄｂｒａｉｎ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｋｉｒｋｅｂｙ Ａ，Ｎｏｌｂｒａｎｔ Ｓ，Ｔｉｋｌｏｖａ Ｋ，Ｈｅｕｅｒ Ａ，Ｋｅｅ Ｎ，Ｃａｒｄｏｓｏ Ｔ，Ｏｔｔｏｓｓｏｎ ＤＲ，Ｌｅｌｏｓ ＭＪ，Ｒｉｆｅｓ Ｐ，Ｄｕｎｎｅｔｔ ＳＢ，Ｇｒｅａｌｉｓｈ Ｓ，Ｐｅｒｌｍａｎｎ Ｔ，Ｐａｒｍａｒ Ｍ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｇｒａｆｔ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＥＳＣ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｊａｎ ５；２０（１）：１３５－１４８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．０９．００４．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｏｃｔ ２７．
参考資料：
２０１１．Ｎａｔｕｒｅ．Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ Ｓｔｕｄｅｒ．Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｎｇｒａｆｔ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ
２０１９．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｄｅ Ｌｕｚｙ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｉｓｈ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＭＸ１ａ Ｖｅｎｔｒａｌ Ｍｉｄｂｒａｉｎ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｋｉｒｋｅｂｙ Ａ，Ｎｏｌｂｒａｎｔ Ｓ，Ｔｉｋｌｏｖａ Ｋ，Ｈｅｕｅｒ Ａ，Ｋｅｅ Ｎ，Ｃａｒｄｏｓｏ Ｔ，Ｏｔｔｏｓｓｏｎ ＤＲ，Ｌｅｌｏｓ ＭＪ，Ｒｉｆｅｓ Ｐ，Ｄｕｎｎｅｔｔ ＳＢ，Ｇｒｅａｌｉｓｈ Ｓ，Ｐｅｒｌｍａｎｎ Ｔ，Ｐａｒｍａｒ Ｍ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｇｒａｆｔ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＥＳＣ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｊａｎ ５；２０（１）：１３５－１４８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．０９．００４．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｏｃｔ ２７．
実施例５：神経系マイクロスフェアの静的非接着培養は、ＮＳＰＢＣを最終的なニューロン運命に分化させ、ニューロンの物理的移動を促進する
ＣＮＳの主要な領域に及ぶ実施例２および４に記載したＮＳＰＢＣから形成された神経系マイクロスフェアは、直ちに除去されなかったが、数日から数週間の間、最終的な細胞運命（主にニューロン）にさらに分化するために、静的非接着条件でマイクロウェルで培養した。皮質前脳および腹側中脳系統のさらなる分化について選択したインビトロ（ＤＩＶ）での日数の間隔は異なり、前脳についてはインビトロで５３日（ＤＩＶ２７～８０）、腹側中脳系統についてはインビトロで２４日（ＤＩＶ１６～４０）であり、これは、インビトロ２Ｄ分化プロトコルに記載され（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、本発明者らによって確認されたこれらの系統の成熟速度の違いを補正するためである（図４、１０）。これらの差異は、様々な神経系統の異なる発達時間枠を反映し、実施例５および実施例６の成功結果は、神経新生の異なる速度および特性を有するＣＮＳの明らかに異なる領域にわたるマイクロスフェア発明の多様性を実証するであろう。
ＣＮＳの主要な領域に及ぶ実施例２および４に記載したＮＳＰＢＣから形成された神経系マイクロスフェアは、直ちに除去されなかったが、数日から数週間の間、最終的な細胞運命（主にニューロン）にさらに分化するために、静的非接着条件でマイクロウェルで培養した。皮質前脳および腹側中脳系統のさらなる分化について選択したインビトロ（ＤＩＶ）での日数の間隔は異なり、前脳についてはインビトロで５３日（ＤＩＶ２７～８０）、腹側中脳系統についてはインビトロで２４日（ＤＩＶ１６～４０）であり、これは、インビトロ２Ｄ分化プロトコルに記載され（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、本発明者らによって確認されたこれらの系統の成熟速度の違いを補正するためである（図４、１０）。これらの差異は、様々な神経系統の異なる発達時間枠を反映し、実施例５および実施例６の成功結果は、神経新生の異なる速度および特性を有するＣＮＳの明らかに異なる領域にわたるマイクロスフェア発明の多様性を実証するであろう。
神経系マイクロスフェアを分化するための非接着静的培養の期間にわたって、明らかな形態学的差異は観察されず、１００個の細胞サイズ（図１５Ａ、１６Ａ）および５００個の細胞サイズ（図１５Ｂ、１６Ｂ）の両方でＤＩＶ２７～ＤＩＶ６０に分化した前脳皮質マイクロスフェア、ならびに５０個の細胞サイズ（図１８Ａ、１９Ａ）、１００個の細胞サイズ（図１８Ｂ、１９Ｂ）および５００個の細胞サイズ（図１８Ｃ、１９Ｃ）の両方でＤＩＶ１６～ＤＩＶ４０に分化した腹側中脳マイクロスフェアで観察したように、一貫した寸法の各マイクロウェル内に個々のスフェア状の細胞クラスターを維持し、外周／境界を明確に描写し、細胞死を最小限に抑えながら、小さいままであった。加えて、ＮＢＣが、１００個の細胞サイズ（図２１Ａ）および５００個の細胞サイズ（図２１Ｂ）の両方のサイズで、ＤＩＶ２６（図１７）でマイクロスフェア形成に使用され、ＤＩＶ３６で静的非接着培養条件で最終的な運命にさらに分化した場合に、マイクロスフェアの形態は一貫したままであり、したがって、入力ＮＢＣおよびＮＳＰＣで使用するためのマイクロスフェア発明の堅牢性が示された。
マイクロスフェアの形態およびサイズに明らかな変化がないことは、典型的には未分化ｈＰＳＣで開始される他の報告された３Ｄ培養および分化の方法論とは対照的に、本発明の重要な態様である最終的な細胞運命（すなわち、ニューロン）を獲得するためにさらに分化する関与された前分化細胞型（すなわち、ＮＳＰＢＣ）を示す。ｈＰＳＣを用いて開始されたかかる報告された手順は、劇的に増殖し、多くの場合、数千もしくは数万の細胞から成る神経系スフェアまたはオルガノイドと称される大きなスフェアを生成する。これらは、その広範な成長およびサイズのために継代を必要とすることが多く、これらの大きな構造を介した栄養素の拡散が困難なため、不健康な壊死性コアを含むことが多く、それらは、本発明とは異なり、それらが解離されない限り、細胞補充療法に使用される狭い外科用装置を通してインタクトに移植することができないような大きなサイズである（Ｄｅｎｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｊｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
静的非接着培養期間にわたる最小限の形態学的変化の観察を、経時的なマイクロスフェア直径の測定によって確認した。前脳ＮＳＰＣマイクロスフェアは、ＤＩＶ３０での形成直後の直径５２．１９±３．９５μｍ（平均±標準偏差）および９０．２３±６．２４μｍから、ＤＩＶ６０での５３．４９±３．２６μｍ（１００個の細胞／マイクロスフェア）および９９．０３±５．９５μｍ（５００個の細胞／マイクロスフェア）までわずかに、最小限に増加した（図２３）。同様に、中脳ＮＳＰＣマイクロスフェアは、ＤＩＶ１８での形成直後の直径３７．６１±４．５１μｍ（平均±標準偏差）（５０個の細胞／マイクロスフェア）および４８．６７±４．１１μｍ（１００個の細胞／マイクロスフェア）および９１．２４±５．６５μｍ（５００個の細胞／マイクロスフェア）から、ＤＩＶ４０での４１．７９±３．５３μｍ（５０個の細胞／マイクロスフェア）および５７．５５±４．７３μｍ（１００個の細胞／マイクロスフェア）および１１１．６２±６．１８μｍ（５００個の細胞／マイクロスフェア）までわずかに、最小限に増加した（図２４）。静的非付着培養および成熟の期間にわたるマイクロスフェアのサイズにおけるわずかな差異は、入力細胞が予め分化され、特定の神経領域同一性に関与し、それらが最終的に分化される点に近いという事実を反映し、これは、本発明の好ましい設定であり、高度に増殖性で完全に未分化／多能性ｈＰＳＣで開始される、前述のスフェア状分化プロトコルと比較してかなりの差がある。静的非付着培養の期間にわたるマイクロスフェアサイズのわずかな変化はまた、発生する成長を相殺するために他のプロトコルで使用される、スフェアの解離および継代の追加の労力および複雑さの必要性を排除する（Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
静的非接着培養条件での一貫した形態およびマイクロスフェアのサイズの前述の観察は、実際には、最終的な細胞の運命（すなわち、ニューロン）を獲得する関与する前分化系統細胞（すなわち、ＮＳＰＢＣ）を提示するという本発明者らの仮説をより理解および確認するために、マイクロスフェアを収集し、評価のために神経系細胞が存在するインビボ環境に類似する２Ｄインビトロに長期的に移行させ、詳細には、マイクロスフェアを、ポリ－Ｌ－オルニチンおよびラミニン－５２１でコーティングされた培養器具に播種した。マイクロスフェアは、標準的な手持ち式ピペットを用いた単純な手動ピペッティングによってマイクロウェルから収集し、静的非接着培養条件は、解離剤の必要がなく、マイクロスフェアがマイクロウェル表面領域に付着または神経支配されていないことを意味する。
静的非接着培養期間（ＤＩＶ２７～８０）の期間にわたる前脳神経系マイクロスフェアの２Ｄシステムへの長期的な播種は（およびこれらの条件下での４８～７２時間の培養後）、本発明の利点を強調する収集および輸送にもかかわらず、細胞がＮＳＰＢＣ状態から最終的な分化ニューロン状態に進行したことを形態学的に明らかにし、これは、播種されたマイクロスフェアからの遊走による段階的な喪失、および神経突起伸長の増加などの特徴によって証明された（図２６、２７）。１００個の細胞前脳ＮＳＰＣマイクロスフェアがＤＩＶ２７で形成された直後に、それらをＤＩＶ３０で播種し、マイクロスフェア構造の喪失につながるマイクロスフェアからの細胞の遊走を特徴とするように、ほとんどがＮＳＰＢＣから成ることが見られた（図２６Ａ）。さらに、観察された細胞は、小さな切断繊維、単極性構造、およびそれらが播種された点から遠く離れた遊走を伴うＮＢＣを想起させた（図２６Ａ’）。前脳マイクロスフェアをＤＩＶ４０へさらに分化させると、細胞が成熟し、スフェア状の特異なマイクロスフェア構造がより良好に保持され、マイクロスフェアの中心から長い神経突起が放射状に広がることが明らかになったが（図２６Ｂ）、より近接な倍率では、いくつかの遊走性ＮＢＣ細胞が観察可能であり、マイクロスフェアが、明確に描写された外周および構造を有しない（図２６Ｂ’）。前脳マイクロスフェアをＤＩＶ６０へさらに分化させると、スフェア状の特異なマイクロスフェア構造がより良好に保持され、マイクロスフェアの中心から長い神経突起が放射状に広がることから、マイクロスフェア内の細胞は大部分が最終的な分化ニューロンであることが明らかになった（図２６Ｃ）。より綿密な検討により、遊走性ＮＢＣ細胞はほとんどないことが明らかになった（図２６Ｃ’）。前脳マイクロスフェアをＤＩＶ８０へさらに分化させると、スフェア状の特異なマイクロスフェア構造が完全に保持され、マイクロスフェアの中心から長い神経突起が放射状に広がることから、マイクロスフェア内の細胞は外見的に完全に最終的な分化ニューロンであることが明らかになった（図２６Ｄ）。より綿密な検討により、マイクロスフェアから発散する遊走性ＮＢＣ細胞は示されなかった（図２６Ｄ’）。ＤＩＶ３４で形成され、ＤＩＶ４０で播種した前脳ＮＢＣマイクロスフェアは、１００個の細胞サイズ（図２７Ａ、Ａ’）および５００個の細胞サイズ（図２７Ｂ、Ｂ’）の両方のマイクロスフェアでのマイクロスフェアコアから放出された、明らかな神経突起の生成によって見られるように、細胞完全性およびニューロンの能力を損なうことなく、収集および移動の能力も保持することが観察された。
静的非接着培養期間（ＤＩＶ１６～４０）の期間にわたる中脳神経系マイクロスフェアの２Ｄ培養の長期的な播種は（およびこれらの条件下での４８～７２時間の培養後）、本発明の利点を強調する収集および移動にもかかわらず、細胞がＮＳＰＢＣ状態から最終的な分化ニューロン状態に進行したことを形態学的に明らかにし、これは、５０個の細胞サイズ（図３１）、１００個の細胞サイズ（図３２）、および５００個の細胞サイズのマイクロスフェア（図３３）の播種されたマイクロスフェアからの遊走による段階的な喪失、および神経突起伸長の増加などの特徴によって証明された。中脳ＮＳＰＣマイクロスフェアがＤＩＶ１６で形成された直後に、それらをＤＩＶ１８で播種し、マイクロスフェア構造の完全な喪失および完全に平坦な単層をもたらすマイクロスフェアからの細胞の遊走を特徴とするように、ほとんどがＮＳＰＢＣから成ることが見られた（図２６Ａ）。さらに、観察された細胞は、大きな細胞体および平坦な形態を有するＮＳＰＢＣを想起させ、存在する場合、線維は繊維が小さく、切断されており、稀な単極性細胞からであり、播種された点から離れた細胞の遊走であった（図３１Ａ、３２Ａ、３３Ａ）。中脳マイクロスフェアをＤＩＶ２５およびＤＩＶ３０へさらに分化させると、細胞が成熟し、スフェア状の特異なマイクロスフェア構造がいくらか保持され、マイクロスフェアの中心から長い神経突起が放射状に広がることが明らかになったが、遊走性ＮＢＣ細胞が観察可能であり、マイクロスフェアが、明確に描写された外周および構造を有しない（図３１Ｂ～Ｃ、３２Ｂ～Ｃ、３３Ｂ～Ｃ）。中脳マイクロスフェアをＤＩＶ３５へさらに分化させると、スフェア状の特異なマイクロスフェア構造がより良好に保持され、マイクロスフェアの中心から放射状に広がる多くの長い神経突起が観察され、遊走性ＮＢＣ細胞がほとんど見られなかったことから、マイクロスフェア内の細胞は外見的に主に最終的な分化ニューロンであることが明らかになった（図３１Ｄ、３２Ｄ、３３Ｄ）。中脳マイクロスフェアをＤＩＶ４０へさらに分化させると、スフェア状の特異なマイクロスフェア構造がより強く保持され、マイクロスフェアの中心から長い神経突起が放射状に広がることから、マイクロスフェア内の細胞はほぼ完全に最終的な分化ニューロンであることが明らかになった（図３１Ｅ、３２Ｅ、３３Ｅ）。より綿密な検討により、マイクロスフェアから発散する遊走性ＮＢＣ細胞があった場合でもごくわずかであることが示された（図３１Ｅ’、３２Ｅ’、３３Ｅ’）。
静的非接着培養条件において、マイクロウェルへの付着の証拠を示さなかったこと、例えば、これらの培養条件のかなりの期間にもかかわらず、時間の経過とともに前脳マイクロスフェア（図１５～１６）および時間の経過とともに中脳マイクロスフェア（図１８～１９）で見られる、マイクロスフェアからマイクロウェル表面へ、および／または互いに神経突起の成長が存在しないことに留意すべきである。これは、明細書の実施例５で上述した接着２Ｄ条件への解離剤なしでの物理的移動後の神経突起の容易な産生によって示されるように、マイクロスフェア内のニューロンの欠如によるものではなく、以下の実施例６の免疫細胞化学的評価からもたらされる。
参考資料：
２０１２．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｄｅｎｈａｍ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｈ．（２０１２）．Ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｘｔｅｎｄ ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ ａｘｏｎａｌ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｒｏｗｔｈ ａｌｏｎｇ ｈｏｓｔ ｗｈｉｔｅ ｍａｔｔｅｒ ｔｒａｃｔｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａ－ｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．
２０１３．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒａｍ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ
２０１３．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ．ＥＺ ｓｐｈｅｒｅｓ Ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ－ｒｏｓｅｔｔｅ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳＣｓ ａｎｄ ｉＰＳＣｓ．
２０１３．Ｎａｔｕｒｅ．Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｋｎｏｂｌｉｃｈ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｍｏｄｅｌ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ
２０１６．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．Ｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｇ．Ｍｉｄｂｒａｉｎ－ｌｉｋｅ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｃｏｎｔａｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｍｅｌａｎｉｎ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｎｓ
参考資料：
２０１２．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｄｅｎｈａｍ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｈ．（２０１２）．Ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｘｔｅｎｄ ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ ａｘｏｎａｌ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｒｏｗｔｈ ａｌｏｎｇ ｈｏｓｔ ｗｈｉｔｅ ｍａｔｔｅｒ ｔｒａｃｔｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａ－ｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．
２０１３．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｎｉｃｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒａｍ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ
２０１３．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ．ＥＺ ｓｐｈｅｒｅｓ Ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ－ｒｏｓｅｔｔｅ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳＣｓ ａｎｄ ｉＰＳＣｓ．
２０１３．Ｎａｔｕｒｅ．Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｋｎｏｂｌｉｃｈ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｍｏｄｅｌ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ
２０１６．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．Ｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｇ．Ｍｉｄｂｒａｉｎ－ｌｉｋｅ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｃｏｎｔａｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｍｅｌａｎｉｎ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｎｓ
実施例６：神経系マイクロスフェア組成および成熟の長期的特性評価
ＮＳＰＢＣから作製された神経系マイクロスフェアを、神経系細胞の維持および成熟に好適な培地中で、長期間（最大＞５０日）マイクロウェルプレート内の静的非接着培養で保持し、マイクロスフェアを含む細胞が、ニューロンに分化することが判明した。このプロセスは、ＳＯＸ２およびＫｉ－６７などの主要な汎ＣＮＳ ＮＳＰＣマーカーの下方制御と関連し、後者は特に増殖中の細胞を標識する。これらのマーカーを、ＤＩＶ１８、２５、３０、３５、および４０でポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン－５２１でコーティングしたプレートにマイクロスフェアを播種し、４８時間後に免疫細胞化学分析を実施することによって、経時的にモニターした。マイクロスフェア形成（ＤＩＶ３０）の直後に、ＤＩＶ２７で前脳ＮＳＰＢＣから作製されたマイクロスフェアの構成細胞は、ＮＳＰＣマーカーＳＯＸ２を高度に発現することが示されたが（図２８Ｂ、２９Ｂ）、この発現は、前脳ニューロンの成熟のための静的非接着培養条件において経時的に減少し、ＤＩＶ６０ではほとんど検出されなかった（図２８Ｅ、２９Ｅ）。この傾向は、マイクロスフェアが１００個または５００個のＮＳＰＢＣから作製されたかとは無関係に観察された。さらに、前脳マイクロスフェアは、背側前脳グルタミン酸作動性ニューロンで選択的に発現されるマーカーＴＢＲ１およびＢＲＮ２を発現することが観察された（図３０）。
ＮＳＰＢＣから作製された神経系マイクロスフェアを、神経系細胞の維持および成熟に好適な培地中で、長期間（最大＞５０日）マイクロウェルプレート内の静的非接着培養で保持し、マイクロスフェアを含む細胞が、ニューロンに分化することが判明した。このプロセスは、ＳＯＸ２およびＫｉ－６７などの主要な汎ＣＮＳ ＮＳＰＣマーカーの下方制御と関連し、後者は特に増殖中の細胞を標識する。これらのマーカーを、ＤＩＶ１８、２５、３０、３５、および４０でポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン－５２１でコーティングしたプレートにマイクロスフェアを播種し、４８時間後に免疫細胞化学分析を実施することによって、経時的にモニターした。マイクロスフェア形成（ＤＩＶ３０）の直後に、ＤＩＶ２７で前脳ＮＳＰＢＣから作製されたマイクロスフェアの構成細胞は、ＮＳＰＣマーカーＳＯＸ２を高度に発現することが示されたが（図２８Ｂ、２９Ｂ）、この発現は、前脳ニューロンの成熟のための静的非接着培養条件において経時的に減少し、ＤＩＶ６０ではほとんど検出されなかった（図２８Ｅ、２９Ｅ）。この傾向は、マイクロスフェアが１００個または５００個のＮＳＰＢＣから作製されたかとは無関係に観察された。さらに、前脳マイクロスフェアは、背側前脳グルタミン酸作動性ニューロンで選択的に発現されるマーカーＴＢＲ１およびＢＲＮ２を発現することが観察された（図３０）。
同様に、形成４８時間後（ＤＩＶ１８）、腹側中脳マイクロスフェアは、マイクロスフェアが５０個、１００個、または５００個の細胞から作製されたかに関係なく、主にマーカーＳＯＸ２（図３４～３７）およびＫｉ－６７（図３８、３９）を発現する細胞から成ることが示された。前脳神経マイクロスフェアで観察されたように、これらのマーカーを発現する細胞の割合は経時的に減少した。詳細には、ＤＩＶ１８で腹側中脳マイクロスフェアは、６９．３１±１６．４３％（平均±標準偏差）（５０個の細胞／マイクロスフェア）および７４．４７±１０．９１％（１００個の細胞／マイクロスフェア）ＳＯＸ２（図３７）および４１．３２±１６．６％（５０個の細胞／マイクロスフェア）および２８．９４±１１．１２％（１００個の細胞／マイクロスフェア）Ｋｉ－６７（図３９）が発現された。予想通り、これらのレベルは時間の経過とともに徐々に低下し、ＤＩＶ４０では、細胞の１２．４０±６．５７％（５０個の細胞／マイクロスフェア）および１２．７３±５．０３％（１００個の細胞／マイクロスフェア）がＳＯＸ２を発現し（図３７）、細胞の４．１９±８．００％（５０個の細胞／マイクロスフェア）および０．７８±０．９５％（１００個の細胞／マイクロスフェア）がＫｉ－６７を発現した（図３９）。腹側中脳系統特異的ＮＳＰＣマーカーＯＴＸ２は、ＤＩＶ１８で細胞の６９．０２±１０．４７％（５０個の細胞／マイクロスフェア）および７２．７０±１２．７２％（１００個の細胞／マイクロスフェア）から、ＤＩＶ４０で４．３８±３．８３％（５０個の細胞／マイクロスフェア）および４．６１±４．３６％（１００個の細胞／マイクロスフェア）に減少することも見られた（図４２、４３）。この傾向は、ＮＳＰＢＣおよびドーパミンニューロンの両方で一貫して発現されると予想された腹側中脳系統特異的マーカーＦＯＸＡ２は観察されず（図４０）、ＦＯＸＡ２は、ＤＩＶ１８で７３．２２±１．００％（５０個の細胞／マイクロスフェア）および８２．７１±７．３７％（１００個の細胞／マイクロスフェア）、ならびにＤＩＶ４０で６２．２１±１２．２５％（５０個の細胞／マイクロスフェア）および６３．８９±３．５４％（１００個の細胞／マイクロスフェア）で発現された（図４１）。ＮＳＰＣ関連マーカーを発現する神経系マイクロスフェアにおける細胞の割合は経時的に減少したが、すべてのニューロン（例えば、ベータ－ＩＩＩチューブリンおよびＮＥＵＮ）（図３４～３６、４２、４４）または腹側中脳ドーパミン作動性ニューロン（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ）（図４０）などのニューロンの特定のサブタイプを標識することが公知であるマーカーを発現する細胞の割合は徐々に増加した。例えば、形成後４８時間（ＤＩＶ１８）の中脳マイクロスフェアには、汎ニューロンマーカーＮＥＵＮを発現する０．５４±０．４３％（５０個の細胞／マイクロスフェア）および０．２１±０．２９％（１００個の細胞／マイクロスフェア）の細胞しか含まれていないことが示されたが、ＤＩＶ４０では、この数は６４．９５±１０．６２％（５０個の細胞／マイクロスフェア）および５４．７６±９．０９％（１００個の細胞／マイクロスフェア）に増加し、マイクロスフェアを構成する細胞が実際にＮＳＰＢＣからニューロンに成熟していることを示す。
実施例７：神経系マイクロスフェアの凍結保存
ｈＰＳＣ由来細胞療法産物の本質的特性は、細胞を凍結保存して長期貯蔵し、臨床現場への配布を可能にする能力である。したがって、静的非接着培養で最終的な神経系細胞型に部分的または完全に成熟した後の神経系マイクロスフェアを凍結保存することができることが非常に望ましい。スフェア／クラスターを凍結保存しようとする場合の典型的な課題は、おそらくスフェア／クラスターのコアへの凍結保護溶液の浸透が不十分なための解凍時の不良な生存および分解である。この問題は、サイズが均一で、凍結防止剤が構造全体に浸透できるほど十分に小さいマイクロスフェアを生成することによって克服され得る。これを実験的に試験するために、１００個の細胞／マイクロスフェアおよび５００個の細胞／マイクロスフェアの神経系マイクロスフェアを、分化を開始した後１６日のインビトロ（ＤＩＶ）で中脳ＮＳＰＢＣから生成し、実施例５に記載されるようにマイクロウェル内でさらに１９日成熟させた。ＤＩＶ３５で、マイクロスフェアを培養培地を上下に穏やかにピペッティングし、マイクロスフェアを浮遊液にし、マイクロスフェアがプラスチックに固着するのを防止するために、マイクロウェルを予めコーティングするのに使用される抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で予め被覆したチューブに浮遊液を収集することにより、マイクロスフェアをマイクロウェルから収集した。次いで、マイクロスフェアを、４０ｇで１分間遠心分離することによってチューブの底に穏やかに沈降させ、Ｂ２７（１０％）、Ｎ２（２％）、ＢＤＮＦ（８０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（８０ｎｇ／ｍＬ）、およびＤＭＳＯ（１０％）を補充した神経基礎培地から成る凍結保護溶液、または市販の凍結保護剤（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、Ｚｅｎｏａｑ）のいずれかで、約４８００個のマイクロスフェア／ｍＬ（１００個の細胞／マイクロスフェア）または１２００個のマイクロスフェア／ｍＬ（５００個の細胞／マイクロスフェア）の濃度に再浮遊させた。次に、マイクロスフェア浮遊液を冷結保存バイアル（０．５ｍＬ／バイアル）に移し、－８０℃の冷凍庫内のＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に一晩置き、翌日、気相液体窒素貯蔵に移した。凍結保存したマイクロスフェアを神経系成熟培地に解凍し、４０ｇで１分間遠心分離することによってチューブの底に穏やかに沈降させ、神経系成熟培地に再浮遊させ、ポリＬ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）／ラミニン－５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングした９６ウェルプレートに播種し、４８時間培養した。凍結保存したマイクロスフェアは、同じバッチから新鮮に播種されたマイクロスフェア（図４５Ａ、Ａ’）と比較して、そのサイズおよびスフェア状形態（図４５Ｂ、Ｂ’）を維持することが示された。同様に、新鮮および凍結保存したスフェアの両方が、播種後４８時間以内に神経突起を伸長した（図４５）。観察された効果は、使用した凍結保護剤とは無関係であった。これらの結果をまとめると、マイクロスフェアを構成する神経系細胞が凍結保存プロセスを生き延び、神経系細胞療法としてのそれらの適用に不可欠である神経突起を伸長する能力を保持したことを示す。
ｈＰＳＣ由来細胞療法産物の本質的特性は、細胞を凍結保存して長期貯蔵し、臨床現場への配布を可能にする能力である。したがって、静的非接着培養で最終的な神経系細胞型に部分的または完全に成熟した後の神経系マイクロスフェアを凍結保存することができることが非常に望ましい。スフェア／クラスターを凍結保存しようとする場合の典型的な課題は、おそらくスフェア／クラスターのコアへの凍結保護溶液の浸透が不十分なための解凍時の不良な生存および分解である。この問題は、サイズが均一で、凍結防止剤が構造全体に浸透できるほど十分に小さいマイクロスフェアを生成することによって克服され得る。これを実験的に試験するために、１００個の細胞／マイクロスフェアおよび５００個の細胞／マイクロスフェアの神経系マイクロスフェアを、分化を開始した後１６日のインビトロ（ＤＩＶ）で中脳ＮＳＰＢＣから生成し、実施例５に記載されるようにマイクロウェル内でさらに１９日成熟させた。ＤＩＶ３５で、マイクロスフェアを培養培地を上下に穏やかにピペッティングし、マイクロスフェアを浮遊液にし、マイクロスフェアがプラスチックに固着するのを防止するために、マイクロウェルを予めコーティングするのに使用される抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で予め被覆したチューブに浮遊液を収集することにより、マイクロスフェアをマイクロウェルから収集した。次いで、マイクロスフェアを、４０ｇで１分間遠心分離することによってチューブの底に穏やかに沈降させ、Ｂ２７（１０％）、Ｎ２（２％）、ＢＤＮＦ（８０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（８０ｎｇ／ｍＬ）、およびＤＭＳＯ（１０％）を補充した神経基礎培地から成る凍結保護溶液、または市販の凍結保護剤（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、Ｚｅｎｏａｑ）のいずれかで、約４８００個のマイクロスフェア／ｍＬ（１００個の細胞／マイクロスフェア）または１２００個のマイクロスフェア／ｍＬ（５００個の細胞／マイクロスフェア）の濃度に再浮遊させた。次に、マイクロスフェア浮遊液を冷結保存バイアル（０．５ｍＬ／バイアル）に移し、－８０℃の冷凍庫内のＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に一晩置き、翌日、気相液体窒素貯蔵に移した。凍結保存したマイクロスフェアを神経系成熟培地に解凍し、４０ｇで１分間遠心分離することによってチューブの底に穏やかに沈降させ、神経系成熟培地に再浮遊させ、ポリＬ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）／ラミニン－５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングした９６ウェルプレートに播種し、４８時間培養した。凍結保存したマイクロスフェアは、同じバッチから新鮮に播種されたマイクロスフェア（図４５Ａ、Ａ’）と比較して、そのサイズおよびスフェア状形態（図４５Ｂ、Ｂ’）を維持することが示された。同様に、新鮮および凍結保存したスフェアの両方が、播種後４８時間以内に神経突起を伸長した（図４５）。観察された効果は、使用した凍結保護剤とは無関係であった。これらの結果をまとめると、マイクロスフェアを構成する神経系細胞が凍結保存プロセスを生き延び、神経系細胞療法としてのそれらの適用に不可欠である神経突起を伸長する能力を保持したことを示す。
実施例８：神経系マイクロスフェアの移植
神経系マイクロスフェアの１つの用途は、脳内移植を介した細胞補充療法である。主に有糸分裂後のニューロンから成るｈＰＳＣ由来の神経マイクロスフェアが移植を生き延び、宿主脳組織内の移植片を形成することができることを示す概念実証を、齧歯動物で取得した。まず、インビトロ実験を実施して、剪断力によって損傷されることなく、また毛細管を詰まらせることなく、移植に使用される薄いガラス毛細管を通過する神経系マイクロスフェアの能力を試験した。まず、ガラス毛細管およびプラスチックチューブを、ガラスまたはプラスチック表面にマイクロスフェアが固着するのを防止するために、抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で予めコーティングした。毛細管およびチューブを、抗接着溶液で充填し、空にし、使用前にＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないでＨＢＳＳで洗浄した。１００個の細胞のマイクロスフェアを、分化を開始した後１６日のインビトロ（ＤＩＶ）でｈＰＳＣ由来の中脳ＮＳＰＢＣから生成し、実施例５に記載されるようにマイクロウェル内でさらに１９日成熟させた。ＤＩＶ３５で、培養培地を上下に穏やかにピペッティングしてマイクロスフェアを浮遊状態にし、予めコーティングしたチューブに浮遊液を収集することにより、マイクロスフェアをマイクロウェルから収集した。マイクロスフェアを、４０～２００ｇで１分遠心分離することにより、チューブの底に穏やかに沈降させ、神経成熟培地に５００個のマイクロスフェア／μＬ（すなわち、５０，０００個の細胞／μＬ）の濃度に再懸濁した。次に、濃縮マイクロスフェア溶液を、移植設定を模倣する毛細管に通し、その後、実施例５に記載されるように、ポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）／ラミニン－５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングした９６ウェルプレートに播種した。神経系マイクロスフェアの真の価値および適用性を証明するために、中脳ＮＳＰＢＣの同じバッチからの接着成熟培養によって生成された同齢の２Ｄ神経培養物を、同じ手順で行った。２Ｄニューロンを、接着培養で成長したＮＳＰＢＣを移植する際の典型的な手順である、まず培養プレートから剥離し、アキュターゼとのインキュベーションによって単一細胞浮遊液に解離した。２Ｄニューロンを、ＮＳＰＢＣを解離するために通常必要な最大時間である２５分、またはこれらの繊維密度の高いニューロン培養物を単一浮遊液に適切に解離するために必要な時間である９０分のいずれかでアキュターゼに曝露し、４００ｇで１０分スピンダウンし、５０，０００個の細胞／μＬの濃度で神経成熟培地に再懸濁した。次いで、ニューロン単一細胞浮遊液を毛細管に通し、マイクロスフェアに沿って９６ウェルプレートに播種した。播種後４８時間で、マイクロスフェアは実質的な神経突起の伸長を示し（図４６Ｃ、Ｃ’）、免疫細胞化学分析により、ニューロンマーカーＮＥＵＮを発現することを示し（図４７Ｅ、Ｆ）、マイクロスフェア内のニューロンの大きな生存、および剪断力によって誘導されたわずかな害を示した。比較すると、２Ｄニューロン培養から取得された細胞は、繊維の増殖が著しく少なく（図Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’）、かつわずかなＮＥＵＮ発現しか示さず（図４７Ａ～Ｄ）、ニューロンのごく一部だけが手順を生き延びたが、大部分のニューロンは解離のプロセス中または剪断力のために失われたことを示唆している。結果として、典型的な２Ｄ神経培養物（図４Ｂ、１０、１１Ｅ）とは著しく異なる形態を示した播種した細胞の大部分は、おそらく残存ＮＳＰＢＣまたは潜在的グリア前駆細胞の可能性が高い。インビトロ実験に続いて、中脳同一性の神経系マイクロスフェアを、インビボでの概念の最初の証明を生成するために、成体ヌードラットの線条体の片側に移植した。１００個の中脳ＮＳＰＢＣ細胞から作製されたマイクロスフェアを上述のようにＤＩＶ３０で収集し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳ中に、約５００個のマイクロスフェア／μＬ（すなわち、約５０，０００個の細胞／μＬ）の溶液に濃縮し、氷上に置いた。マイクロスフェアは、インビトロ試験に使用したものと同一の引かれたガラス毛細管を備えたハミルトンシリンジを使用して、２μＬ／沈着物の２つの沈着物で脳内に送達した。外科手術の前に、ガラス毛細管を、マイクロスフェアがガラス表面に接着するのを防止し、収率を最大化するために、上述のように抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で予めコーティングした。移植したラットを犠牲にし、それらの脳を移植後４週および８週で免疫細胞化学によって分析し（図４８）、両方の時点で、線条体に生存可能な移植片が観察された。さらに、マイクロスフェア移植片は、ＮＣＡＭに対するヒト特異的抗体で染色した場合、強力で特異的なシグナルを示し、ｈＰＳＣ由来ニューロンから成ることを示した（図４８ Ｂ’、Ｂ’、Ｄ、Ｄ’）。
神経系マイクロスフェアの１つの用途は、脳内移植を介した細胞補充療法である。主に有糸分裂後のニューロンから成るｈＰＳＣ由来の神経マイクロスフェアが移植を生き延び、宿主脳組織内の移植片を形成することができることを示す概念実証を、齧歯動物で取得した。まず、インビトロ実験を実施して、剪断力によって損傷されることなく、また毛細管を詰まらせることなく、移植に使用される薄いガラス毛細管を通過する神経系マイクロスフェアの能力を試験した。まず、ガラス毛細管およびプラスチックチューブを、ガラスまたはプラスチック表面にマイクロスフェアが固着するのを防止するために、抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で予めコーティングした。毛細管およびチューブを、抗接着溶液で充填し、空にし、使用前にＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないでＨＢＳＳで洗浄した。１００個の細胞のマイクロスフェアを、分化を開始した後１６日のインビトロ（ＤＩＶ）でｈＰＳＣ由来の中脳ＮＳＰＢＣから生成し、実施例５に記載されるようにマイクロウェル内でさらに１９日成熟させた。ＤＩＶ３５で、培養培地を上下に穏やかにピペッティングしてマイクロスフェアを浮遊状態にし、予めコーティングしたチューブに浮遊液を収集することにより、マイクロスフェアをマイクロウェルから収集した。マイクロスフェアを、４０～２００ｇで１分遠心分離することにより、チューブの底に穏やかに沈降させ、神経成熟培地に５００個のマイクロスフェア／μＬ（すなわち、５０，０００個の細胞／μＬ）の濃度に再懸濁した。次に、濃縮マイクロスフェア溶液を、移植設定を模倣する毛細管に通し、その後、実施例５に記載されるように、ポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）／ラミニン－５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングした９６ウェルプレートに播種した。神経系マイクロスフェアの真の価値および適用性を証明するために、中脳ＮＳＰＢＣの同じバッチからの接着成熟培養によって生成された同齢の２Ｄ神経培養物を、同じ手順で行った。２Ｄニューロンを、接着培養で成長したＮＳＰＢＣを移植する際の典型的な手順である、まず培養プレートから剥離し、アキュターゼとのインキュベーションによって単一細胞浮遊液に解離した。２Ｄニューロンを、ＮＳＰＢＣを解離するために通常必要な最大時間である２５分、またはこれらの繊維密度の高いニューロン培養物を単一浮遊液に適切に解離するために必要な時間である９０分のいずれかでアキュターゼに曝露し、４００ｇで１０分スピンダウンし、５０，０００個の細胞／μＬの濃度で神経成熟培地に再懸濁した。次いで、ニューロン単一細胞浮遊液を毛細管に通し、マイクロスフェアに沿って９６ウェルプレートに播種した。播種後４８時間で、マイクロスフェアは実質的な神経突起の伸長を示し（図４６Ｃ、Ｃ’）、免疫細胞化学分析により、ニューロンマーカーＮＥＵＮを発現することを示し（図４７Ｅ、Ｆ）、マイクロスフェア内のニューロンの大きな生存、および剪断力によって誘導されたわずかな害を示した。比較すると、２Ｄニューロン培養から取得された細胞は、繊維の増殖が著しく少なく（図Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’）、かつわずかなＮＥＵＮ発現しか示さず（図４７Ａ～Ｄ）、ニューロンのごく一部だけが手順を生き延びたが、大部分のニューロンは解離のプロセス中または剪断力のために失われたことを示唆している。結果として、典型的な２Ｄ神経培養物（図４Ｂ、１０、１１Ｅ）とは著しく異なる形態を示した播種した細胞の大部分は、おそらく残存ＮＳＰＢＣまたは潜在的グリア前駆細胞の可能性が高い。インビトロ実験に続いて、中脳同一性の神経系マイクロスフェアを、インビボでの概念の最初の証明を生成するために、成体ヌードラットの線条体の片側に移植した。１００個の中脳ＮＳＰＢＣ細胞から作製されたマイクロスフェアを上述のようにＤＩＶ３０で収集し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳ中に、約５００個のマイクロスフェア／μＬ（すなわち、約５０，０００個の細胞／μＬ）の溶液に濃縮し、氷上に置いた。マイクロスフェアは、インビトロ試験に使用したものと同一の引かれたガラス毛細管を備えたハミルトンシリンジを使用して、２μＬ／沈着物の２つの沈着物で脳内に送達した。外科手術の前に、ガラス毛細管を、マイクロスフェアがガラス表面に接着するのを防止し、収率を最大化するために、上述のように抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で予めコーティングした。移植したラットを犠牲にし、それらの脳を移植後４週および８週で免疫細胞化学によって分析し（図４８）、両方の時点で、線条体に生存可能な移植片が観察された。さらに、マイクロスフェア移植片は、ＮＣＡＭに対するヒト特異的抗体で染色した場合、強力で特異的なシグナルを示し、ｈＰＳＣ由来ニューロンから成ることを示した（図４８ Ｂ’、Ｂ’、Ｄ、Ｄ’）。
実施例９：ｈＰＳＣ由来膵島様細胞から成るマイクロスフェア
インスリン産生ベータ細胞および他の内分泌細胞型を含むｈＰＳＣ由来膵島様細胞クラスターを使用した細胞置換は、糖尿病患者のための有望な療法である。かかる細胞を生成するプロセスにおける現在の課題の中には、再現性、スケール、および細胞を凍結保存する能力がある。膵島様細胞は、典型的には、３Ｄ培養システムのｈＰＳＣから生成され、膵島様クラスターの大きなスケールの生成を可能にするが、クラスターの凍結保存は、比較的大きく、サイズが不均一である可能性があり、凍結保護溶液がクラスターに適切に浸透してコアの細胞を保護することができないため、課題である。これは、クラスターを単一細胞に解離することによって現在解決され、その後、凍結保存され、解凍時に自発的クラスター形成によって再凝集され得る。しかしながら、この手順では収率が低下し、一方で、代替として、クラスターの代わりに単一細胞の移植は、典型的には細胞の生存不良をもたらし、したがってインビボでの転帰不良をもたらす。本発明は、これらの課題に対処するものであり、分化細胞を均一なサイズ制御されたマイクロスフェアに形成することによって、細胞のインタクトなクラスターの凍結保存を可能にするほど十分に小さく、収率および再現性が著しく改善される。これを実験的に試験するために、専有３Ｄ浮遊培養プロトコル（ＵＳ２０１４／２３４９６３、ＵＳ２０１２／１３５５１９、ＵＳ２０１５／２４７１２３、ＷＯ２０２０／７９９８、ＵＳ２０１９／０８５２９５、ＷＯ２００４／３２９２、ＵＳ２０２０／１９９５４０、Ｆｕｎａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１５）を使用してｈＰＳＣを分化させることにより、膵島様細胞を取得した。膵島様細胞同一性は、分化開始後インビトロで（ＤＩＶ）２９日目にフローサイトメトリー分析によって確認し、ＤＩＶ２９は、ｃ－ペプチドおよびＮＫＸ６．１を共発現する推定上ベータ様細胞（５６．８％、図４９Ａ）、ならびにｃ－ペプチドおよびグルカゴンを共発現する推定上アルファ様細胞の少ない割合を示す（４．６９％、図４９Ｅ）。多能性マーカーＯＣＴ３／４およびＮａｎｏｇは、この段階ではもはや検出されなかった（図５０）。分化のこの段階で、ｈＰＳＣ由来膵島様細胞クラスターは、典型的には、単一細胞浮遊液に解離され、凍結保存され、その後解凍され、移植などの下流用途のために再凝集される。新鮮または凍結保存された単一細胞のいずれかの再凝集は、標準的なアプローチである懸濁液中の自発的凝集によって、または５００個もしくは１０００個の細胞から成るマイクロスフェアへの単一細胞のスピン凝集によって実施した。マイクロスフェアを形成するために、正確な量のｈＰＳＣ由来膵島様細胞を、細胞付着を防止するために抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングしたウェル当たり１２００個のマイクロウェルを含有するＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００ ２４ウェルプレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移し、製造元の指示に従って調製した。遠心力を適用して、細胞をマイクロウェルの底の中心点に、およびマイクロスフェアを形成する目的で互いに近接して駆動するようにした。細胞は、膵島様細胞の維持および成熟に適した培地中でマイクロウェルで培養し、播種のみ１０μＭでＹ２７６３２を添加した。４８時間のインキュベーション後、細胞は、明確に描写された外周／境界を有する、小さくて一貫した寸法の個々のスフェロイドクラスターに凝集することが示された（図５１、５２）。マイクロスフェアの直径を、マイクロスフェア形成の４８時間後にマイクロウェル内のマイクロスフェアの位相差画像およびＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを使用して測定し（図５１）、直径が、５００個および１０００個の細胞から作製されたマイクロスフェアについて、それぞれ８０．１０±４．５１μｍ（平均±標準偏差）および１０３．８９±３．７４μｍであることを示した（図５５）。これらの測定値は、再凝集の４８時間後にマイクロウェルから収集したマイクロスフェアのＢｉｏｒｅｐ分析によって確認し（図５３、５４、５５）、マイクロスフェアは、形状およびサイズが均一であることが示され、５００個の細胞から作製されたマイクロスフェアの大部分（８４．６％）が、５０～１００μｍの範囲の直径を有し、一方、１０００個の細胞から作製されたマイクロスフェアの大部分（９１．３％）が、１０１～１５０μｍの範囲の直径を有していた（図５４）。同時に実施したフローサイトメトリー分析は、浮遊培養における標準的な自発的再凝集ではなく、マイクロスフェア形成による再凝集が、主要な系統マーカーｃ－ペプチド、ＮＫＸ６．１、およびグルカゴンの発現に実質的な影響を及ぼさなかったことを示し（図４９Ｂ～Ｄ、Ｆ－Ｈ）、マイクロスフェアが実際にアルファおよびベータ様細胞の相対的な比率を維持することができたことを示す。さらに、マイクロスフェアは凍結保存が可能であることが証明された。１０００個のｈＰＳＣ由来膵島様細胞のマイクロスフェアを、ＤＩＶ３１でマイクロウェルから収集し、凍結保護溶液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、Ｚｅｎｏａｑ）中で凍結させた。解凍時に、マイクロスフェアを浮遊培養で２４時間維持し、一定のサイズのスフェアとしてインタクトなままであった（図５６）。ｈＰＳＣ由来膵島様細胞の再凝集過程の課題の１つは、典型的には、実質的な細胞損失および低い収率と関連していることであり、しかしながら、細胞をスピン凝集マイクロスフェアに再凝集することによって、収量は、浮遊培養での自発的クラスター形成後の２９．６％から、それぞれ５００個および１０００個の細胞から成るマイクロスフェアの形成後の６３．９％および７２．２％に増加した（図５７）。
参考資料：
Ｆｕｎａ ＮＳ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ ＫＡ，Ｌｅｒｄｒｕｐ Ｍ，Ｅｋｂｅｒｇ Ｊ，Ｈｅｓｓ Ｋ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ Ｎ，Ｈｏｎｏｒｅ Ｃ，Ｈａｎｓｅｎ Ｋ，Ｓｅｍｂ Ｈ．β－Ｃａｔｅｎｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｓｔｒｅａｋ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＳＭＡＤ２／ＳＭＡＤ３ ａｎｄ ＯＣＴ４．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｊｕｎ ４；１６（６）：６３９－５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０３．００８．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ａｐｒ ２３．
ＵＳ２０１４２３４９６３ ＥＦＦＩＣＩＥＮＴ ＩＮＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＦＲＯＭ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ
ＵＳ２０１２１３５５１９ ＩＮＤＵＣＥＤ ＤＥＲＩＶＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＦＲＯＭ ＨＰＳ ＣＥＬＬ－ＤＥＲＩＶＥＤ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ
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インスリン産生ベータ細胞および他の内分泌細胞型を含むｈＰＳＣ由来膵島様細胞クラスターを使用した細胞置換は、糖尿病患者のための有望な療法である。かかる細胞を生成するプロセスにおける現在の課題の中には、再現性、スケール、および細胞を凍結保存する能力がある。膵島様細胞は、典型的には、３Ｄ培養システムのｈＰＳＣから生成され、膵島様クラスターの大きなスケールの生成を可能にするが、クラスターの凍結保存は、比較的大きく、サイズが不均一である可能性があり、凍結保護溶液がクラスターに適切に浸透してコアの細胞を保護することができないため、課題である。これは、クラスターを単一細胞に解離することによって現在解決され、その後、凍結保存され、解凍時に自発的クラスター形成によって再凝集され得る。しかしながら、この手順では収率が低下し、一方で、代替として、クラスターの代わりに単一細胞の移植は、典型的には細胞の生存不良をもたらし、したがってインビボでの転帰不良をもたらす。本発明は、これらの課題に対処するものであり、分化細胞を均一なサイズ制御されたマイクロスフェアに形成することによって、細胞のインタクトなクラスターの凍結保存を可能にするほど十分に小さく、収率および再現性が著しく改善される。これを実験的に試験するために、専有３Ｄ浮遊培養プロトコル（ＵＳ２０１４／２３４９６３、ＵＳ２０１２／１３５５１９、ＵＳ２０１５／２４７１２３、ＷＯ２０２０／７９９８、ＵＳ２０１９／０８５２９５、ＷＯ２００４／３２９２、ＵＳ２０２０／１９９５４０、Ｆｕｎａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１５）を使用してｈＰＳＣを分化させることにより、膵島様細胞を取得した。膵島様細胞同一性は、分化開始後インビトロで（ＤＩＶ）２９日目にフローサイトメトリー分析によって確認し、ＤＩＶ２９は、ｃ－ペプチドおよびＮＫＸ６．１を共発現する推定上ベータ様細胞（５６．８％、図４９Ａ）、ならびにｃ－ペプチドおよびグルカゴンを共発現する推定上アルファ様細胞の少ない割合を示す（４．６９％、図４９Ｅ）。多能性マーカーＯＣＴ３／４およびＮａｎｏｇは、この段階ではもはや検出されなかった（図５０）。分化のこの段階で、ｈＰＳＣ由来膵島様細胞クラスターは、典型的には、単一細胞浮遊液に解離され、凍結保存され、その後解凍され、移植などの下流用途のために再凝集される。新鮮または凍結保存された単一細胞のいずれかの再凝集は、標準的なアプローチである懸濁液中の自発的凝集によって、または５００個もしくは１０００個の細胞から成るマイクロスフェアへの単一細胞のスピン凝集によって実施した。マイクロスフェアを形成するために、正確な量のｈＰＳＣ由来膵島様細胞を、細胞付着を防止するために抗接着溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングしたウェル当たり１２００個のマイクロウェルを含有するＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００ ２４ウェルプレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移し、製造元の指示に従って調製した。遠心力を適用して、細胞をマイクロウェルの底の中心点に、およびマイクロスフェアを形成する目的で互いに近接して駆動するようにした。細胞は、膵島様細胞の維持および成熟に適した培地中でマイクロウェルで培養し、播種のみ１０μＭでＹ２７６３２を添加した。４８時間のインキュベーション後、細胞は、明確に描写された外周／境界を有する、小さくて一貫した寸法の個々のスフェロイドクラスターに凝集することが示された（図５１、５２）。マイクロスフェアの直径を、マイクロスフェア形成の４８時間後にマイクロウェル内のマイクロスフェアの位相差画像およびＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを使用して測定し（図５１）、直径が、５００個および１０００個の細胞から作製されたマイクロスフェアについて、それぞれ８０．１０±４．５１μｍ（平均±標準偏差）および１０３．８９±３．７４μｍであることを示した（図５５）。これらの測定値は、再凝集の４８時間後にマイクロウェルから収集したマイクロスフェアのＢｉｏｒｅｐ分析によって確認し（図５３、５４、５５）、マイクロスフェアは、形状およびサイズが均一であることが示され、５００個の細胞から作製されたマイクロスフェアの大部分（８４．６％）が、５０～１００μｍの範囲の直径を有し、一方、１０００個の細胞から作製されたマイクロスフェアの大部分（９１．３％）が、１０１～１５０μｍの範囲の直径を有していた（図５４）。同時に実施したフローサイトメトリー分析は、浮遊培養における標準的な自発的再凝集ではなく、マイクロスフェア形成による再凝集が、主要な系統マーカーｃ－ペプチド、ＮＫＸ６．１、およびグルカゴンの発現に実質的な影響を及ぼさなかったことを示し（図４９Ｂ～Ｄ、Ｆ－Ｈ）、マイクロスフェアが実際にアルファおよびベータ様細胞の相対的な比率を維持することができたことを示す。さらに、マイクロスフェアは凍結保存が可能であることが証明された。１０００個のｈＰＳＣ由来膵島様細胞のマイクロスフェアを、ＤＩＶ３１でマイクロウェルから収集し、凍結保護溶液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、Ｚｅｎｏａｑ）中で凍結させた。解凍時に、マイクロスフェアを浮遊培養で２４時間維持し、一定のサイズのスフェアとしてインタクトなままであった（図５６）。ｈＰＳＣ由来膵島様細胞の再凝集過程の課題の１つは、典型的には、実質的な細胞損失および低い収率と関連していることであり、しかしながら、細胞をスピン凝集マイクロスフェアに再凝集することによって、収量は、浮遊培養での自発的クラスター形成後の２９．６％から、それぞれ５００個および１０００個の細胞から成るマイクロスフェアの形成後の６３．９％および７２．２％に増加した（図５７）。
参考資料：
Ｆｕｎａ ＮＳ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ ＫＡ，Ｌｅｒｄｒｕｐ Ｍ，Ｅｋｂｅｒｇ Ｊ，Ｈｅｓｓ Ｋ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ Ｎ，Ｈｏｎｏｒｅ Ｃ，Ｈａｎｓｅｎ Ｋ，Ｓｅｍｂ Ｈ．β－Ｃａｔｅｎｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｓｔｒｅａｋ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＳＭＡＤ２／ＳＭＡＤ３ ａｎｄ ＯＣＴ４．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｊｕｎ ４；１６（６）：６３９－５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０３．００８．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ａｐｒ ２３．
ＵＳ２０１４２３４９６３ ＥＦＦＩＣＩＥＮＴ ＩＮＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＦＲＯＭ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ
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実施例１０：中胚葉（心筋細胞）マイクロスフェア生成の方法
ヒト多能性幹細胞由来の心筋様細胞および他の中胚葉誘導体は、細胞療法、薬物および毒性試験、ならびに疾患および発生を研究するための適切なモデルのための有望な細胞源を表す。ｈＰＳＣ由来心筋細胞を使用する補充療法によって心筋組織を再生することを目的とする現在の細胞療法アプローチは、心臓への移植後の細胞の不十分な送達、保持および生着によって妨げられている（Ｈａｓｔｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ，２０１５；Ｆｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ，２０１６）。心臓マイクロスフェアの適用は、初代心臓スフェアおよび心臓前駆細胞に関する研究から示されるように、心筋におけるマイクロスフェアの保持能力の改善により、これらの課題を克服し得る（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１２；Ｔｒａｃ ｅｔ ａｌ，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，２０１９）。ここでは、生体材料および／または細胞外マトリックス成分の使用がなく、任意にインビトロでの長期成熟とそれに続くスフェアの採取および細胞剥離および／または解離試薬の使用とは独立した、スフェア融合のリスクを最小限に抑えた、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞様細胞からサイズ制御された心臓マイクロスフェアを生成および維持するための代替方法を開示する。
ヒト多能性幹細胞由来の心筋様細胞および他の中胚葉誘導体は、細胞療法、薬物および毒性試験、ならびに疾患および発生を研究するための適切なモデルのための有望な細胞源を表す。ｈＰＳＣ由来心筋細胞を使用する補充療法によって心筋組織を再生することを目的とする現在の細胞療法アプローチは、心臓への移植後の細胞の不十分な送達、保持および生着によって妨げられている（Ｈａｓｔｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ，２０１５；Ｆｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ，２０１６）。心臓マイクロスフェアの適用は、初代心臓スフェアおよび心臓前駆細胞に関する研究から示されるように、心筋におけるマイクロスフェアの保持能力の改善により、これらの課題を克服し得る（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１２；Ｔｒａｃ ｅｔ ａｌ，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，２０１９）。ここでは、生体材料および／または細胞外マトリックス成分の使用がなく、任意にインビトロでの長期成熟とそれに続くスフェアの採取および細胞剥離および／または解離試薬の使用とは独立した、スフェア融合のリスクを最小限に抑えた、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞様細胞からサイズ制御された心臓マイクロスフェアを生成および維持するための代替方法を開示する。
インビトロで心筋細胞を生成するために、ヒト胚性幹細胞株ＸＦ３０５３を、それぞれの製造元の指示に従ってＬＮ５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ）でのＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ ＸＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中のフィーダーフリー条件下で維持した。細胞を、アキュターゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して３～４日ごとに継代し、Ｔフラスコ（Ｎｕｎｃ）に１．６～２．４ｘ１０４個の細胞／ｃｍ２で１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ）を添加したＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｉＰＳ－ＢｒｅｗＸＦに播種した。細胞株は、本研究全体を通してマイコプラズマ汚染および核型異常について陰性であるとして試験した。心筋細胞を、修正３Ｄ分化プロトコルを適用して生成した（Ｋｅｍｐｆ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１５；Ｈａｌｌｏｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２１０９）。簡潔に述べると、細胞を６ウェル浮遊プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）または１２５ｍｌシェーカーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種し、１０μＭ Ｙ－２７６３２を補充したＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ ＸＦ中で０．１６ｘ１０６個の細胞／ｍＬで凝集体を形成し、軌道振盪装置（Ｉｎｆｏｒｓ Ｃｅｌｌｔｒｏｎ）で７０ｒｐｍに維持した。４８時間後、４～６μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ）を２４時間、続いて２μＭ Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｔｏｃｒｉｓ）を２４時間、インスリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含まない２％ Ｂ２７を補充したＲＰＭＩ１６４０培地または０．２ｍｇ／ｍＬ Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（Ｓｉｇｍａ）およびＡｌｂｉｘ（Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を使用して、分化を誘導した（０日目、ＤＩＶ０と称される）。細胞を、５日目（ＤＩＶ５）以降、２％ Ｂ２７および０．２ｍｇ／ｍＬ Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０に保持した。細胞を、８日目（ＤＩＶ８）にＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞支持培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはアキュターゼを使用して８分解離させ、さらなる特性評価および再凝集実験を行った。いくつかの実験では、解離した心筋細胞を凍結保護溶液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、Ｚｅｎｏａｑ）を使用して凍結保存し、その後の再凝集のために液体窒素に貯蔵した。
心筋細胞の再凝集のために、ウェル当たり１２００個の空洞を含むＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００マイクロウェル２４プレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造元の指示に従って調整し、分化の８日後（ＤＩＶ８）に取得した心筋細胞を播種し、２％ Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１７５０４）、０．２ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸－２－リン酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ８９６０）および１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｙ２７６３２－Ｙ０５０３）を補充した２ｍｌ ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１８７５－０３４）中の空洞当たりの細胞数を示す。凝集体は、培地を３～４日ごとに交換して、最終的な採取までマイクロウェル内で維持した。
０日目（ＤＩＶ０）および８日目（ＤＩＶ８）での試料を、ＡＦ６４７複合ＯＣＴ３／４（ＢＤ、カタログ番号５６０３２９；希釈率１：１００）およびＰＥ複合心臓トロポニンＴ（ＢＤ、カタログ番号５６４７６７；１：２００）についてフローサイトメトリー分析に供した。簡潔に述べると、アキュターゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した解離により取得された単一細胞を、４％ホルムアルデヒド（ＶＷＲ）中で３０～４５分間固定し、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）および５％ロバ血清（ＮｏｖｕｓＢｉｏ）を補充したＰＢＳを使用して、室温で３０分間透過処理および染色した。１％ ＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充したＰＢＳ中で各工程間で細胞を洗浄し、８００ｇで３分間遠心分離した。試料をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ）で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．７）を使用して処理した。
クラスターサイズ分析は、自動膵島細胞カウンター（ｂｉｏｒｅｐ）で２００μｌの試料を使用して実施し、各サンプルは技術的な繰り返しとして少なくとも２回測定した。ｐＩＥＱは、デジタル画像分析法に基づく細胞質量の測定値を表す（Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１６）。ＩＰＮは、２００μｌの試料で示されたサイズの絶対スフェア数を示す。平均凝集体直径は、ウェルの表面積をスフェア凝集体形状をとる粒子の数で割って計算された直径に基づいて計算した。
参考資料：
Ｂｕｃｈｗａｌｄ Ｐ，Ｂｅｒｎａｌ Ａ，Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ Ｆ，Ｔａｍａｙｏ－Ｇａｒｃｉａ Ａ，Ｌｉｎｅｔｓｋｙ Ｅ，Ｒｉｃｏｒｄｉ Ｃ．Ｆｕｌｌｙ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｓｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＩＣＣ）ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｓｌｅｔ Ｍａｓｓ，Ｐｕｒｉｔｙ，ａｎｄ Ｓｉｚｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１６ Ｏｃｔ；２５（１０）：１７４７－１７６１．
Ｃｈｏ ＨＪ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｙｏｕｎ ＳＷ，Ｋｏｈ ＳＪ，Ｗｏｎ ＪＹ，Ｃｈｕｎｇ ＹＪ，Ｃｈｏ ＨＪ，Ｙｏｏｎ ＣＨ，Ｌｅｅ ＳＷ，Ｌｅｅ ＥＪ，Ｋｗｏｎ ＹＷ，Ｌｅｅ ＨＹ，Ｌｅｅ ＳＨ，Ｈｏ ＷＫ，Ｐａｒｋ ＹＢ，Ｋｉｍ ＨＳ．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｐｈｅｒｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｓｅｐ；２０（９）：１７５０－６６．
Ｆｅｙｅｎ ＤＡＭ，Ｇａｅｔａｎｉ Ｒ，Ｄｏｅｖｅｎｄａｎｓ ＰＡ，Ｓｌｕｉｊｔｅｒ ＪＰＧ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１６ Ｎｏｖ １５；１０６（Ｐｔ Ａ）：１０４－１１５．
Ｈａｌｌｏｉｎ Ｃ，Ｓｃｈｗａｎｋｅ Ｋ，Ｌｏｂｅｌ Ｗ，Ｆｒａｎｋｅ Ａ，Ｓｚｅｐｅｓ Ｍ，Ｂｉｓｗａｎａｔｈ Ｓ，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ Ｓ，Ｍｅｒｋｅｒｔ Ｓ，Ｗｅｂｅｒ Ｎ，Ｏｓｔｅｎ Ｆ，ｄｅ ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｊ，Ｐｏｌｔｅｎ Ｆ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｗｏｌｌｅｒｔ Ｋ，Ｋｒａｆｔ Ｔ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ Ｕ，Ｇｒｕｈ Ｉ，Ｋｅｍｐｆ Ｈ，Ｚｗｅｉｇｅｒｄｔ Ｒ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ＷＮＴ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｅｎａｂｌｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｈＰＳＣ Ｃａｒｄｉａｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１９ Ｏｃｔ ８；１３（４）：７７５．
Ｈａｓｔｉｎｇｓ ＣＬ，Ｒｏｃｈｅ ＥＴ，Ｒｕｉｚ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｅ，Ｓｃｈｅｎｋｅ－Ｌａｙｌａｎｄ Ｋ，Ｗａｌｓｈ ＣＪ，Ｄｕｆｆｙ ＧＰ．Ｄｒｕｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１５ Ａｐｒ；８４：８５－１０６．
Ｋｅｍｐｆ Ｈ，Ｋｒｏｐｐ Ｃ，Ｏｌｍｅｒ Ｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｕ，Ｚｗｅｉｇｅｒｄｔ Ｒ．Ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｃａｌａｂｌｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１５ Ｓｅｐ；１０（９）：１３４５－６１．
Ｔｒａｃ Ｄ，Ｍａｘｗｅｌｌ ＪＴ，Ｂｒｏｗｎ ＭＥ，Ｘｕ Ｃ，Ｄａｖｉｓ ＭＥ．Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｃａｒｄｉａｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｏ Ｓｐｈｅｒｅｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｎｏｔｃｈ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｉｇｈｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２０１９ Ｆｅｂ １５；１２４（４）：５２６－５３８．
参考資料：
Ｂｕｃｈｗａｌｄ Ｐ，Ｂｅｒｎａｌ Ａ，Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ Ｆ，Ｔａｍａｙｏ－Ｇａｒｃｉａ Ａ，Ｌｉｎｅｔｓｋｙ Ｅ，Ｒｉｃｏｒｄｉ Ｃ．Ｆｕｌｌｙ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｓｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＩＣＣ）ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｓｌｅｔ Ｍａｓｓ，Ｐｕｒｉｔｙ，ａｎｄ Ｓｉｚｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１６ Ｏｃｔ；２５（１０）：１７４７－１７６１．
Ｃｈｏ ＨＪ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｙｏｕｎ ＳＷ，Ｋｏｈ ＳＪ，Ｗｏｎ ＪＹ，Ｃｈｕｎｇ ＹＪ，Ｃｈｏ ＨＪ，Ｙｏｏｎ ＣＨ，Ｌｅｅ ＳＷ，Ｌｅｅ ＥＪ，Ｋｗｏｎ ＹＷ，Ｌｅｅ ＨＹ，Ｌｅｅ ＳＨ，Ｈｏ ＷＫ，Ｐａｒｋ ＹＢ，Ｋｉｍ ＨＳ．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｐｈｅｒｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｓｅｐ；２０（９）：１７５０－６６．
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Ｈａｓｔｉｎｇｓ ＣＬ，Ｒｏｃｈｅ ＥＴ，Ｒｕｉｚ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｅ，Ｓｃｈｅｎｋｅ－Ｌａｙｌａｎｄ Ｋ，Ｗａｌｓｈ ＣＪ，Ｄｕｆｆｙ ＧＰ．Ｄｒｕｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１５ Ａｐｒ；８４：８５－１０６．
Ｋｅｍｐｆ Ｈ，Ｋｒｏｐｐ Ｃ，Ｏｌｍｅｒ Ｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｕ，Ｚｗｅｉｇｅｒｄｔ Ｒ．Ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｃａｌａｂｌｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１５ Ｓｅｐ；１０（９）：１３４５－６１．
Ｔｒａｃ Ｄ，Ｍａｘｗｅｌｌ ＪＴ，Ｂｒｏｗｎ ＭＥ，Ｘｕ Ｃ，Ｄａｖｉｓ ＭＥ．Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｃａｒｄｉａｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｏ Ｓｐｈｅｒｅｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｎｏｔｃｈ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｉｇｈｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２０１９ Ｆｅｂ １５；１２４（４）：５２６－５３８．
実施例１１：幹細胞由来心筋細胞から成るマイクロスフェア
心筋細胞分化効率は、図５８に示すように、純度が概して９０％ ｃＴＮＴ＋を上回る、８日間の分化（ＤＩＶ８）後の心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）に対するフローサイトメトリーによって確認した。この段階では、フローサイトメトリーにより同日に分析した＜０．１％ ＯＣＴ３／４＋によって示されるように、細胞は本質的に残された未分化細胞がなかった（図５９）。浮動３Ｄ凝集体は、比較的広範なサイズ分布を示し、凝集体の６０％が２００～４００μｍの直径を有し、５．８％が４００μｍを上回った（図６０）。
心筋細胞分化効率は、図５８に示すように、純度が概して９０％ ｃＴＮＴ＋を上回る、８日間の分化（ＤＩＶ８）後の心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）に対するフローサイトメトリーによって確認した。この段階では、フローサイトメトリーにより同日に分析した＜０．１％ ＯＣＴ３／４＋によって示されるように、細胞は本質的に残された未分化細胞がなかった（図５９）。浮動３Ｄ凝集体は、比較的広範なサイズ分布を示し、凝集体の６０％が２００～４００μｍの直径を有し、５．８％が４００μｍを上回った（図６０）。
凝集体は、実施例１０に記載されるように解離し、空洞当たり５０個、１５０個、５００個、１０００個、または１５００個の細胞（図６１－１および図６１－２）、または空洞当たり２５個、５０個、１００個、または５００個の細胞（図６２）のマイクロスフェア形成に供された。スフェアの自動クラスター分析は、空洞当たりに播種された細胞数の増加に伴い、ｍＬ当たりの細胞質量の明らかな増加（図６３Ａ）、および１００個の細胞で＜８０μｍから１５００個の細胞で＞１６０μｍの範囲のスフェア直径の予想される増加（図６３Ｂ）を示した。特に、個々の条件のサイズ分布により、均一なサイズのクラスターが確認され、１００個の細胞では１００μｍを下回る直径を有する９０．７％のクラスターをもたらし、２５０個の細胞では５１～２００μｍの範囲の９７％のスフェア、１０００個の細胞では１５１～２００μｍの範囲の７５％のスフェアであった（図６４および図６５）。対照凝集体（３Ｄ分化からのデフォルトのＤＩＶ８凝集体）と比較したサイズの減少および均一性は、図６６に示すバイオレップ分析から取得した画像から確認した。
形成されたマイクロスフェアの心筋細胞の同一性および純度を確認するために、スフェアの代表的な条件（１００個および５００個の細胞／マイクロスフェア）を、２％ Ｂ２７を補充したＲＰＭＩ培地中で２４時間ラミニン５２１上に播種し、続いて、心筋細胞特異的マーカーＮＫＸ２．５およびサルコメアアクチニンの免疫蛍光染色に供した（図６７）。
まとめると、データは、マイクロ空洞ごとに播種されたわずか２５個の細胞～１５００個の細胞までの範囲の細胞数の広範な範囲で、心臓マイクロスフェアのサイズ制御された形成、およびマイクロスフェアの融合を伴わずに長期間維持できる個々のスフェアの形成を示す。特に、各条件は、スフェアサイズにおいて非常に狭い分布をもたらし、それによって、凝集体系３Ｄ分化プロセスから取得されるスフェアの定義および制御されたサイズ変更を可能にする。マイクロスフェアは、さらなる成熟目的およびその後の移植研究のために、融合することなく、長期間維持することができる。
実施例１２：心臓マイクロスフェアの凍結保存および送達
細胞系療法におけるさらなる制限は、製造プロセスにおける長期貯蔵および適切な保持工程の欠如である。部分的にまたは完全に成熟した心筋細胞マイクロスフェアの凍結保存は、最終的なマイクロスフェア医薬品の適切な保持工程を提供する。ここでは、ヒト幹細胞由来心筋マイクロスフェアの凍結保存を可能にする方法を開示する。このために、１０００個のｈＥＳＣ由来心筋細胞様細胞のマイクロスフェアを、Ｂ２７（２％）、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（０．２１ｍｇ／ｍＬ）、および１０μＭ Ｙ－２７６３２（１０μＭ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地から成る再凝集培地中にＤＩＶ８心筋細胞の凍結保存された単一細胞からＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）マイクロウェルに播種することによって生成した。３日間の再凝集後、マイクロスフェアを、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ内の周囲の浮遊液中に穏やかにピペッティングすることにより、マイクロスフェアを再浮遊させた。マイクロスフェア浮遊液をチューブに移し、スフェアを素早く沈降させ、培地を除去した。マイクロスフェアを、凍結保護溶液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、Ｚｅｎｏａｑ）中に約１２００個のマイクロスフェア／ｍＬの濃度に再浮遊させ、冷結保存バイアルに移した。バイアルをＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）容器に移し、２４時間－８０℃に置き、長期貯蔵のために液体窒素中に移した。
細胞系療法におけるさらなる制限は、製造プロセスにおける長期貯蔵および適切な保持工程の欠如である。部分的にまたは完全に成熟した心筋細胞マイクロスフェアの凍結保存は、最終的なマイクロスフェア医薬品の適切な保持工程を提供する。ここでは、ヒト幹細胞由来心筋マイクロスフェアの凍結保存を可能にする方法を開示する。このために、１０００個のｈＥＳＣ由来心筋細胞様細胞のマイクロスフェアを、Ｂ２７（２％）、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（０．２１ｍｇ／ｍＬ）、および１０μＭ Ｙ－２７６３２（１０μＭ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地から成る再凝集培地中にＤＩＶ８心筋細胞の凍結保存された単一細胞からＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）マイクロウェルに播種することによって生成した。３日間の再凝集後、マイクロスフェアを、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ内の周囲の浮遊液中に穏やかにピペッティングすることにより、マイクロスフェアを再浮遊させた。マイクロスフェア浮遊液をチューブに移し、スフェアを素早く沈降させ、培地を除去した。マイクロスフェアを、凍結保護溶液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、Ｚｅｎｏａｑ）中に約１２００個のマイクロスフェア／ｍＬの濃度に再浮遊させ、冷結保存バイアルに移した。バイアルをＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）容器に移し、２４時間－８０℃に置き、長期貯蔵のために液体窒素中に移した。
凍結保存されたマイクロスフェアを、ＤＮＡｓｅ Ｉ（５０μｇ／ｍＬ）を補充した再凝集培地中で解凍した。マイクロスフェアを、２５０ｇで３分間スピンダウンし、ＤＮＡｓｅ Ｉ（５０μｇ／ｍＬ）を補充した再凝集培地中に再浮遊させた。マイクロスフェアを６ウェル浮遊プレートに播種し、軌道振盪装置（Ｉｎｆｏｒｓ Ｃｅｌｌｔｒｏｎ）で７０ｒｐｍに維持した。解凍されたマイクロスフェアは、凍結保存の４日後に同様の細胞形態およびスフェア形態を示した（図６８）。特に、解凍後２４時間以内に定期的な鼓動が観察された。
本発明は、スフェア融合のリスクを最小限に抑えながら、数週間および数ヶ月の長期間にわたる個々の心臓マイクロスフェアの維持を可能にする。これにより、マイクロスフェアが、遊離浮遊培養（Ｃｏｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｂｉｏｅｎｇ，２０１８）で維持され、融合しやすい以前のアプローチと比較して、マイクロスフェアの完全性に影響を与えることなく、細いシリンジ針（例えば、典型的な内径がそれぞれ２１０μｍおよび１５９μｍのＧ２７またはＧ３０針）を適用する制御された細胞注射に特に好適である。さらに、本明細書に記載の連続的なマイクロスフェア培養の方法は、注射可能であるという利点を伴って、操作された心臓組織（Ｔｉｂｕｒｃｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１７）と同様の３Ｄ環境で心筋細胞の連続的な成熟を可能にする。これにより、サイズ制御された成熟心臓組織の制御された細胞送達が、注射前の細胞間相互作用を破壊する必要性なしに、実行可能となる。その結果、マイクロスフェアでのＧ３０シリンジ針を介した細胞押出の実現可能性を確認した。特に、５０個および１００個の多能性幹細胞由来心筋細胞様細胞から形成された心臓マイクロスフェアに対して、凝固または抵抗の変化の兆候のない十分に制御された押出を行い（図６９）、インビボ適用のためのマイクロスフェア送達のための最適な特性が確認された。
参考資料：
Ｃｏｒｒｅｉａ Ｃ，Ｋｏｓｈｋｉｎ Ａ，Ｄｕａｒｔｅ Ｐ，Ｈｕ Ｄ，Ｃａｒｉｄｏ Ｍ，Ｓｅｂａｓｔｉａｏ ＭＪ，Ｇｏｍｅｓ－Ａｌｖｅｓ Ｐ，Ｅｌｌｉｏｔｔ ＤＡ，Ｄｏｍｉａｎ ＩＪ，Ｔｅｉｘｅｉｒａ ＡＰ，Ａｌｖｅｓ ＰＭ，Ｓｅｒｒａ Ｍ．３Ｄ ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１８ Ｍａｒ；１１５（３）：６３０－６４４．
Ｔｉｂｕｒｃｙ Ｍ，Ｈｕｄｓｏｎ ＪＥ，Ｂａｌｆａｎｚ Ｐ，Ｓｃｈｌｉｃｋ Ｓ，Ｍｅｙｅｒ Ｔ，Ｃｈａｎｇ Ｌｉａｏ ＭＬ，Ｌｅｖｅｎｔ Ｅ，Ｒａａｄ Ｆ，Ｚｅｉｄｌｅｒ Ｓ，Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ Ｅ，Ｒｉｅｇｌｅｒ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｍ，Ｇｏｌｄ ＪＤ，Ｋｅｈａｔ Ｉ，Ｗｅｔｔｗｅｒ Ｅ，Ｒａｖｅｎｓ Ｕ，Ｄｉｅｒｉｃｋｘ Ｐ，ｖａｎ Ｌａａｋｅ ＬＷ，Ｇｏｕｍａｎｓ ＭＪ，Ｋｈａｄｊｅｈ Ｓ，Ｔｏｉｓｃｈｅｒ Ｋ，Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ Ｇ，Ｃｏｕｔｕｒｅ ＬＡ，Ｕｎｇｅｒ Ａ，Ｌｉｎｋｅ ＷＡ，Ａｒａｋｉ Ｔ，Ｎｅｅｌ Ｂ，Ｋｅｌｌｅｒ Ｇ，Ｇｅｐｓｔｅｉｎ Ｌ，Ｗｕ ＪＣ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ＷＨ．Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１７ Ｍａｙ ９；１３５（１９）：１８３２－１８４７．
参考資料：
Ｃｏｒｒｅｉａ Ｃ，Ｋｏｓｈｋｉｎ Ａ，Ｄｕａｒｔｅ Ｐ，Ｈｕ Ｄ，Ｃａｒｉｄｏ Ｍ，Ｓｅｂａｓｔｉａｏ ＭＪ，Ｇｏｍｅｓ－Ａｌｖｅｓ Ｐ，Ｅｌｌｉｏｔｔ ＤＡ，Ｄｏｍｉａｎ ＩＪ，Ｔｅｉｘｅｉｒａ ＡＰ，Ａｌｖｅｓ ＰＭ，Ｓｅｒｒａ Ｍ．３Ｄ ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１８ Ｍａｒ；１１５（３）：６３０－６４４．
Ｔｉｂｕｒｃｙ Ｍ，Ｈｕｄｓｏｎ ＪＥ，Ｂａｌｆａｎｚ Ｐ，Ｓｃｈｌｉｃｋ Ｓ，Ｍｅｙｅｒ Ｔ，Ｃｈａｎｇ Ｌｉａｏ ＭＬ，Ｌｅｖｅｎｔ Ｅ，Ｒａａｄ Ｆ，Ｚｅｉｄｌｅｒ Ｓ，Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ Ｅ，Ｒｉｅｇｌｅｒ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｍ，Ｇｏｌｄ ＪＤ，Ｋｅｈａｔ Ｉ，Ｗｅｔｔｗｅｒ Ｅ，Ｒａｖｅｎｓ Ｕ，Ｄｉｅｒｉｃｋｘ Ｐ，ｖａｎ Ｌａａｋｅ ＬＷ，Ｇｏｕｍａｎｓ ＭＪ，Ｋｈａｄｊｅｈ Ｓ，Ｔｏｉｓｃｈｅｒ Ｋ，Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ Ｇ，Ｃｏｕｔｕｒｅ ＬＡ，Ｕｎｇｅｒ Ａ，Ｌｉｎｋｅ ＷＡ，Ａｒａｋｉ Ｔ，Ｎｅｅｌ Ｂ，Ｋｅｌｌｅｒ Ｇ，Ｇｅｐｓｔｅｉｎ Ｌ，Ｗｕ ＪＣ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ＷＨ．Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１７ Ｍａｙ ９；１３５（１９）：１８３２－１８４７．
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示および記載されているが、ここで、多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるこうしたすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
Claims (15)
- 幹細胞系マイクロスフェアを取得するための方法であって、
－ＰＳＣを分化させて、分化細胞を取得する工程と、
－前記分化細胞を凝集させて、幹細胞系マイクロスフェアを形成する工程と、
－前記幹細胞系マイクロスフェアの分化細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、方法。 - 前記ＰＳＣを、前記分化細胞を凝集させる前に少なくとも２日間分化させる、請求項１に記載の方法。
- 前記凝集の工程の前に、前記ＰＳＣを、一定期間分化し、それによって前記分化細胞の少なくとも５０％が多能性ではなくなるようにする、請求項１または２に記載の方法。
- 前記分化細胞を、スピン凝集によって凝集させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞系マイクロスフェアを、低細胞付着特性の環境で成熟させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 神経系マイクロスフェアを取得するための方法であって、
－ＰＳＣを神経系幹前駆芽細胞に分化させる工程と、
－前記神経系幹前駆芽細胞を凝集させて、神経系マイクロスフェアを形成する工程と、
－前記神経系マイクロスフェアの神経系幹前駆芽細胞をさらに成熟させる工程と、を含む、方法。 - 前記神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、静的非接着培養において神経系マイクロスフェアを維持するのに好適なウェル中に前記神経系幹前駆芽細胞を播種する追加の工程を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記ウェルが、低細胞付着特性を有するマイクロウェルである、請求項７に記載の方法。
- 約５個～約１０００個の神経系幹前駆芽細胞を、凝集させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記神経系幹前駆芽細胞を凝集させる工程の前に、前記ＰＳＣを、一定期間分化し、それによって前記神経系幹前駆芽細胞の少なくとも５０％が多能性ではなくなるようにする、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 幹細胞由来神経系細胞を含む神経系マイクロスフェアであって、前記神経系マイクロスフェアの直径が、約２５０μｍ未満であり、前記神経系マイクロスフェアの体積の少なくとも９０％が、神経系細胞を含む、神経系マイクロスフェア。
- 約５個～約１０００個の神経系細胞を含む、請求項１１に記載の神経系マイクロスフェア。
- 前記神経系マイクロスフェアの表面が、神経系細胞から成る、請求項１１または１２に記載の神経系マイクロスフェア。
- 前記神経系マイクロスフェアが、外因性細胞外マトリックスを含まず、および／または外因性ヒドロゲルを含まない、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の神経系マイクロスフェア。
- 神経学的状態の治療に使用するための、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の神経系マイクロスフェア。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| EP19210844 | 2019-11-22 | ||
| EP19210844.7 | 2019-11-22 | ||
| PCT/EP2020/082810 WO2021099532A1 (en) | 2019-11-22 | 2020-11-20 | Spin-aggregated neural microspheres and the application thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=68654346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022529668A Pending JP2023503302A (ja) | 2019-11-22 | 2020-11-20 | スピン凝集した神経系マイクロスフェアおよびその応用 |
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|---|---|
| US (1) | US20220389378A1 (ja) |
| EP (1) | EP4061929A1 (ja) |
| JP (1) | JP2023503302A (ja) |
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