BR112020004428A2

BR112020004428A2 - métodos de criopreservação de agregados de células endócrinas pancreáticas e de enriquecimento de agregados de células endócrinas, células endócrinas, composição contendo células endócrinas, medicamento, e, dispositivo.

Info

Publication number: BR112020004428A2
Application number: BR112020004428-8A
Authority: BR
Inventors: Jeannette Schlichting Kirkegaard
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 2017-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2020-09-08
Also published as: WO2019048690A1; CA3074910A1; IL272734A; MX2020002421A; CO2020003122A2; JP2020532978A; CN111108190A; MA50279A; RU2020111055A; AU2018330499A1; KR20200051664A; SG11202001906PA; US20200199540A1; JP7389020B2; EP3681992A1; RU2020111055A3

Abstract

A presente invenção refere-se a um método de enriquecimento de agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C derivados in vitro de células-tronco, com o referido método compreendendo as etapas de dissociar os agregados de células endócrinas em células individuais, tratar as células individuais com meio de criopreservação e diminuir a temperatura para obter células criopreservadas, descongelar as células criopreservadas; e reagregar as células obtidas após o descongelamento em células endócrinas.

Description

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MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO DE AGREGADOS DE CÉLULAS ENDÓCRINAS PANCREÁTICAS E DE ENRIQUECIMENTO DE AGREGADOS DE CÉLULAS ENDÓCRINAS, CÉLULAS ENDÓCRINAS, COMPOSIÇÃO CONTENDO CÉLULAS ENDÓCRINAS, MEDICAMENTO, E, DISPOSITIVO CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a métodos de enriquecimento e criopreservação de células endócrinas, NKX2.2 e NKX6.1 ou NKX6.1 e células que expressam peptídeo C que foram derivadas in vitro de células- tronco.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Embora a terapia com insulina salve vidas, pode ser difícil obter glicemia estável com insulina exógena e o controle deficiente está associado a complicações graves no estado tardio (Nathan, D.M., 2014. The diabetes control and complications trial/epidemiology of diabetes interventions and complications study at 30 years: overview. Diabetes care, 37(1), pp.9–16). O transplante de ilhotas pancreáticas isoladas de doadores humanos para pacientes com diabetes Tipo 1 mostrou bom resultado com alguns pacientes tornando-se completamente independentes de insulina (Barton F.B. et al., 2012. Improvement in Outcomes of Clinical Islet Transplantation: 1999-2010. Diabetes Care, 35(7), pp.1436–1445). Apesar de tais avanços, um dos maiores desafios para o transplante de ilhota é a disponibilidade limitada de ilhotas doadoras. Esta escassez do material doador pode ser superada pela geração de células secretoras de insulina funcionais in vitro pela diferenciação de células-tronco embrionárias humanas. Os protocolos para geração de células secretoras de insulina funcionais in vitro de células-tronco estão continuamente em desenvolvimento (Pagliuca F.W. et al., 2014. Generation of Functional Human Pancreatic β Cells In vitro. Cell, 159(2), pp.428–439; Rezania A et al. Reversal of diabetes with insulin-

2 / 47 producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology, 32(11), pp.1121–1133); WO2012175633; WO2014033322; WO2015028614).

[003] Embora esses protocolos sejam impressionantes, eles geram múltiplas populações de células e a razão entre essas populações varia de lote a lote. Um método em grande escala para criopreservar as células permite que os estudos de controle de qualidade sejam realizados em cada lote de célula antes do transplante e simplifica ainda mais a logística do transplante. Além disso, acredita-se que qualquer método que enriqueça as populações endócrinas no produto final melhora a eficácia e a segurança do transplante.

[004] Portanto, há uma necessidade de um método em grande escala para enriquecer e preservar as populações endócrinas obtidas in vitro por células-tronco que não apenas possibilitem uma melhoria do fenótipo e na função, mas também permitam o armazenamento e a manutenção das células, enquanto estudos de liberação em lote são realizados antes do transplante dessas células em um sujeito.

[005] Os inventores constataram que o método que compreende as etapas de dissociação, criopreservação e reagregação de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1, permite: - enriquecer agregados de células com células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C; - reduzir as células não endócrinas (isto é, células negativas para NKX6.1/C-pep/Glu) nos agregados de células; - reduzir a heterogeneidade do agrupamento e o tamanho do agrupamento, o que reduz a variação in vivo; - reduzir e controlar a variação lote a lote; - armazenar e manter células endócrinas e progenitoras endócrinas;

3 / 47 - separar as etapas de produção celular do transplante, permitindo que testes de lotes sejam realizados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção fornece métodos em grande escala para enriquecer agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C derivadas in vitro de células-tronco. O presente método permite enriquecer agregados de células derivados in vitro de células-tronco com células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[007] A presente invenção fornece métodos para criopreservar células progenitoras endócrinas pancreáticas derivadas in vitro de células- tronco que compreendem as etapas de (i) dissociar os agregados de célula em células individuais; e (ii) criopreservar as células individuais. A presente invenção é direcionada a métodos para células progenitoras endócrinas individuais criopreservadas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 ou células endócrinas individuais que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C derivadas in vitro de células-tronco.

[008] A presente invenção se refere ainda ao uso médico das células endócrinas criopreservadas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C e/ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 e pós- criopreservação inter alia no tratamento do diabetes tipo I.

[009] A presente invenção se refere ainda ao descongelamento e reagregação de células criopreservadas em agregados de células enriquecidos com células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[0010] A presente invenção se refere ainda ao uso médico das células endócrinas reagregadas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C e/ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 e pós- criopreservação inter alia no tratamento do diabetes tipo I.

[0011] A presente invenção fornece métodos para enriquecer

4 / 47 agregados de células derivados in vitro de células-tronco com células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C, reduzindo a heterogeneidade, o tamanho do agrupamento e a variação de lote para lote.

[0012] A invenção também pode resolver outros problemas que estarão evidentes a partir da divulgação das modalidades exemplares.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Visão Geral do Processo: Enriquecimento de agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C

[0013] Células-tronco embrionárias humanas (hESC) são diferenciadas in vitro em células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 ou células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C usando protocolos publicados (WO2015/028614 e WO2017/144695, respectivamente). Em ambos os estágios, os agregados de células são dissociados usando digestão enzimática ou não enzimática. Após a dissociação, as células são criopreservadas, por exemplo, pela submersão das células em meio de criopreservação e diminuindo lentamente a temperatura para -80ºC para obter células criopreservadas. Essas células criopreservadas são rapidamente descongeladas e reagregadas em células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C. Figura 2: Dissociação, criopreservação e reagregação de células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1: Efeitos sobre o fenótipo endócrino in vitro A) Enriquecimento de células endócrinas após criopreservação, descongelamento e reagregação no estágio do progenitor endócrino.

[0014] hESC foi diferenciada em células similares a beta e analisadas quanto à distribuição de populações de células endócrinas e não endócrinas. Para cada experimento, as células do mesmo lote foram diferenciadas usando um protocolo sem (controles) ou com uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação.

5 / 47 B) Painel superior: a população endócrina é medida pela presença de coexpressão de NKX6.1 e peptídeo C usando citometria de fluxo. Os resultados são apresentados como % de alteração em comparação aos controles.

[0015] Painel inferior: o desenriquecimento de células não endócrinas é mostrado por uma diminuição transcricional nos marcadores não endócrinos: AFP, GHRL, KRT18 e KRT 8 quando as células foram geradas usando um protocolo com uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação. O enriquecimento de células endócrinas funcionais é caracterizado por um aumento transcricional em marcadores endócrinos: GIPR, GLP1R e IAPP quando as células foram geradas usando um protocolo com uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação. C) Diminuição no tamanho e heterogeneidade após descongelamento e reagregação

[0016] O painel superior esquerdo mostra agregados de células endócrinas geradas usando um protocolo sem uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação.

[0017] O painel inferior esquerdo mostra agregados de células endócrinas geradas com uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação.

[0018] Os painéis superior direito e inferior direito (diagramas de barra) mostram a distribuição de tamanho do agrupamento medida usando um contador de ilhotas Biorep®. Figura 3: Dissociação, criopreservação e reagregação de células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1: Funcionalidade in vivo A) Células endócrinas geradas após criopreservação no estágio do progenitor endócrino secretam peptídeo C quando expostas após transplante em camundongos não diabéticos

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[0019] hESC do mesmo lote foram diferenciadas sem (controles) ou com etapas de dissociação, criopreservação e reagregação e transplantada em cápsula renal de camundongos não diabéticos, ou não transplantadas (controle). Para induzir a secreção de peptídeo C a partir dos enxertos, a resistência à insulina aguda foi induzida pelo antagonista do receptor de insulina S961 duas semanas após o transplante ou por um teste de tolerância à glicose oral sete semanas após o transplante. O peptídeo C humano foi medido 60 e 120 minutos ou 20 e 60 minutos após a exposição. O agrupamento formado usando um protocolo com etapas de dissociação, criopreservação e reagregação secretou níveis mais elevados de peptídeo C do que aqueles gerados usando um protocolo sem uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação. Os dados são apresentados como +/- SEM médio. B) O enriquecimento de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C reduz a variação in vivo.

[0020] O aumento de vezes no peptídeo C durante a exposição com S961 foi plotado para animais que recebem células geradas usando um protocolo com ou sem uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação. A eficácia da expressão do peptídeo C foi aprimorada usando o protocolo com dissociação, criopreservação e reagregação e a variação entre os animais foi reduzida. C) O enriquecimento de agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C elimina células não endócrinas 8 semanas após o transplante e resulta em um enxerto in vivo mais homogêneo.

[0021] 8 semanas após o transplante, os camundongos foram sacrificados e os rins com enxertos foram coletados e analisados por imunocitoquímica. As células foram marcadas para peptídeo C, NKX6.1 e glucagon. Conforme indicado pelas setas brancas, áreas de células não endócrinas (NKX6.1-/Glucagon-/peptídeo C-) estavam presentes em enxertos

7 / 47 de controle contendo células geradas sem uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação (4 de 4 enxertos). Isso não foi observado para enxerto com células geradas usando um protocolo com uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação (0 de 4 enxertos). Figura 4: Dissociação, criopreservação e reagregação de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C: Efeitos sobre o fenótipo das células endócrinas in vitro A) Enriquecimento de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C após dissociação, criopreservação, descongelamento e reagregação no estágio de célula endócrina (ou seja, BC03).

[0022] hESC foi diferenciada em células similares a beta e analisadas quanto à distribuição de populações de células endócrinas e não endócrinas. Para cada experimento, as células do mesmo lote foram diferenciadas usando um protocolo sem (controles) ou com uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação.

[0023] Painel direito: a população de células endócrinas é medida pela presença de coexpressão de NKX6.1 e peptídeo C usando citometria de fluxo. Os resultados são apresentados como % de alteração em comparação aos controles.

[0024] Painel esquerdo: o desenriquecimento de células não endócrinas é mostrado por uma diminuição transcricional nos marcadores não endócrinos: AFP, GHRL, KRT18 e KRT 8 quando as células foram geradas usando um protocolo com uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação. B) Diminuição no tamanho e heterogeneidade após descongelamento e reagregação

[0025] O painel superior esquerdo mostra agregados de células endócrinas geradas usando um protocolo sem uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação.

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[0026] O painel inferior esquerdo mostra agregados de células endócrinas geradas usando um protocolo com uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação.

[0027] Os cantos superior direito e inferior direito (diagramas de barra) mostram a distribuição de tamanho do agrupamento medida usando um contador de ilhotas Biorep®. Figura 5: Dissociação, criopreservação e reagregação de agregados de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C: Funcionalidade in vivo A) Células dissociadas, criopreservadas e reagregadas no estágio de células endócrinas (células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C (BC03)) glicose no sangue menor após transplante em camundongos Scid-beige diabéticos

[0028] hESC foram diferenciadas sem etapas de dissociação, criopreservação e reagregação e transplantadas sob cápsula renal de camundongos diabéticos. Após o transplante, é observada uma rápida redução da glicose no sangue. B) Células dissociadas, criopreservadas e reagregadas no estágio de células endócrinas (células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C (BC03)) secretam peptídeo C após transplante em camundongos diabéticos

[0029] A secreção do peptídeo C humano basal 20 dias após o transplante mostra que a diminuição da glicose no sangue está correlacionada com a secreção do peptídeo C humano. C) O enriquecimento de agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C reduz células não endócrinas 10 semanas após o transplante.

[0030] 10 semanas após o transplante, os camundongos foram sacrificados e os rins com enxertos foram coletados e analisados por imunocitoquímica. As células foram marcadas para peptídeo C, NKX6.1 e glucagon. Conforme indicado pelas setas brancas, áreas de células não endócrinas (NKX6.1-/Glucagon-/peptídeo C-) estavam presentes em enxertos

9 / 47 de controle contendo células geradas sem uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação (9 de 11 enxertos). Isso não foi observado para enxerto com células geradas usando um protocolo com uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação (1 de 3 enxertos). Fig.6. Dissociação, criopreservação e reagregação de células endócrinas logo antes e logo após a expressão do peptídeo C: Efeito sobre a resposta à glicose. A) Visão geral dos pontos de tempo de diferenciação testados antes e depois da expressão do peptídeo C e efeito sobre a resposta à glicose.

[0031] Dissociação, criopreservação e reagregação de células criopreservadas em diferentes pontos no tempo durante a diferenciação celular. As células foram criopreservadas no estágio do endoderma pancreático (PE), 1 dia antes do início da expressão do peptídeo C (BC00), 2 dias após o início da expressão do peptídeo C (BC03), 5 dias após o início da expressão do peptídeo C (BC06) e 8 dias após o início da expressão do peptídeo C (BC09) e todas eram do mesmo lote de células. As células foram descongeladas, diferenciadas e testadas quanto à funcionalidade em 13 dias após o início da expressão do peptídeo C (BC14) na mesma configuração. B) Enriquecimento de células com NKX6.1 e peptídeo C por dissociação, criopreservação e reagregação de células criopreservadas em BC00, BC03, BC06 e BC09, que estão no intervalo de cerca de 1 dia antes e cerca de 1 a 8 dias após o início da expressão do peptídeo C.

[0032] A expressão de NKX6.1 e do peptídeo C foi medida em BC14 usando citometria de fluxo. Os dados são expressos em % em comparação com células do mesmo lote usando um protocolo sem etapa de dissociação, criopreservação e reagregação. Os resultados mostram que o enriquecimento de células com NKX6.1 e peptídeo C é mais eficiente para células criopreservadas em BC00 e BC03. C) Resposta dinâmica à glicose quando as células são criopreservadas em

10 / 47 BC00, BC03, BC06 e BC09.

[0033] No final do experimento, a funcionalidade foi testada usando um sistema de perfusão dinâmica. Todas as células responderam a uma exposição com 20 mM de glicose e exendina-4, mas a resposta mais elevada foi observada quando as células foram criopreservadas em BC00 e BC03, respectivamente cerca de 1 dia antes e 2 dias após o início da expressão do peptídeo C.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0034] No sentido mais amplo, a presente invenção refere-se a métodos de enriquecimento e criopreservação de células endócrinas pancreáticas derivadas in vitro de células-tronco.

[0035] A presente invenção refere-se ao método para enriquecer agregados de células pancreáticas com células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e NKX2.2 ou NKX6.1 e peptídeo C derivadas in vitro de células- tronco, ou seja, células-tronco embrionárias ou células-tronco embrionárias humanas.

[0036] A presente invenção refere-se ao método para enriquecer agregados de células com células endócrinas após dissociação, criopreservação e reagregação de células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX6.1 e NKX2.2 ou células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C obtidas in vitro de células-tronco.

[0037] A presente invenção diz refere-se ainda ao enriquecimento de células progenitoras endócrinas e células secretoras de insulina sensíveis à glicose derivadas in vitro de células-tronco.

[0038] Em um aspecto, descreve-se, neste documento, um método para seleção de células endócrinas de uma população de células contendo células endócrinas e não endócrinas.

[0039] Em outro aspecto, o presente método permite separar a produção de células endócrinas do transplante. Por exemplo, isto permite

11 / 47 transportar as células ou executar estudos de qualidade e segurança para controlar a variação de lote para lote antes do transplante. Em particular, células endócrinas pancreáticas criopreservadas obtidas de acordo com o método descrito neste documento podem ser armazenadas entre as etapas de produção e transplante, permitindo coletar e descongelar amostras para executar testes de pureza (por exemplo, citometria de fluxo) e/ou testes de funcionalidade (por exemplo, por perfusão de GSIS estático).

[0040] Em outro aspecto, os presentes métodos permitem obter células endócrinas criopreservadas ou reagregadas homogêneas coexpressando NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 para uso em transplante em um sujeito humano e para uso no tratamento de diabetes.

[0041] Em um aspecto, descreve-se um método para criopreservar agregados de células endócrinas pancreáticas derivadas in vitro de células- tronco compreendendo as seguintes etapas: (i) dissociar os referidos agregados de células endócrinas em células individuais; (ii) tratar as referidas células individuais com meio de criopreservação e diminuição da temperatura, por exemplo, até pelo menos - 80°C, para obter células individuais criopreservadas.

[0042] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de enriquecimento dos agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C derivadas in vitro de células-tronco, o referido método compreendendo as seguintes etapas: (i) dissociar os agregados de células em células individuais; (ii) tratar as células individuais com meio de criopreservação e diminuição da temperatura, por exemplo, até -80°C, para obter células individuais criopreservadas; (iii) descongelar as células criopreservadas; e

12 / 47 (iv) enriquecer células obtidas após descongelamento e reagregação para células que expressam NKX6.1 e peptídeo C.

[0043] Em um aspecto, o presente método refere-se a um método de enriquecimento de agregados de células endócrinas derivadas in vitro de células-tronco com células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou agregados de células progenitoras endócrinas coexpressam NKX2.2 e NKX6.1, o referido método compreendendo as seguintes etapas: (i) dissociar os referidos agregados de células endócrinas em células individuais; (ii) criopreservar as referidas células individuais, tratando as referidas células individuais com meio de criopreservação e diminuição da temperatura, por exemplo, até pelo menos -80°C, para obter células individuais criopreservadas, (iii) descongelar as referidas células endócrinas criopreservadas; e (iv) reagregar as referidas células endócrinas obtidas após descongelamento.

[0044] Em uma modalidade particular, as referidas células endócrinas da etapa (i) dos métodos descritos neste documento são células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas coexpressando NKX2.2 e NKX6.1. Em uma modalidade preferencial, as referidas células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C, são células endócrinas em que a expressão do peptídeo C foi iniciada em até 7 dias, até 6 dias, até 5 dias, até 4 dias, até 3 dias ou até 2 dias, preferencialmente até 2 dias.

[0045] Em uma modalidade preferencial, quando as células endócrinas da etapa (i) são agregados de células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1, o referido método compreende ainda uma etapa (v) de diferenciação das referidas células progenitoras endócrinas que

13 / 47 coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 em agregados de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[0046] Em particular, a etapa de dissociação (1) permite enriquecer agregados de células com células endócrinas, pois as células não endócrinas individuais parecem ser menos resistentes à criopreservação. Além disso, os presentes métodos permitem reduzir a variação no desempenho in vivo, reduzindo a heterogeneidade do agrupamento e o tamanho do agrupamento.

[0047] Outro objeto da presente invenção se refere às células endócrinas reagregadas (isto é, agregados de células obtidos após dissociação, criopreservação e reagregação) compreendendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[0048] As populações de células das células reagregadas podem ser detectadas e medidas com técnicas conhecidas pelos versados na técnica pela detecção dos marcadores NKX2.2, NKX6.1 e peptídeo C usando técnicas como FACS.

[0049] Conforme usado neste documento, “células endócrinas” ou “células endócrinas pancreáticas” se referem, neste documento, a “células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C” ou “células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1”, ou a células endócrinas selecionadas entre 3 dias antes e até 7 dias após o início da expressão do peptídeo C. Vantajosamente, as células endócrinas descritas neste documento são tomadas 2 dias antes e até 5 dias após o início da expressão do peptídeo C, ou de 1 dia antes até 2 dias após o início da expressão do peptídeo C.

[0050] Conforme usado neste documento, "células ou agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C" refere-se a células endócrinas secretoras de insulina sensíveis à glicose ou a células endócrinas tendo expressão de peptídeo C iniciada por até 7 dias, até 6 dias, até 5 dias, até 4 dias, até 3 dias ou até 2 dias, preferencialmente por até 2 dias.

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[0051] "Células secretoras de insulina sensíveis à glicose" ou "células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C" refere-se a células que residem em pequenos agrupamentos de células ou agregados de células chamados ilhotas de Langerhans no pâncreas. As células beta respondem a altos níveis de glicose no sangue pela secreção do hormônio peptídico insulina, que age em outros tecidos para promover a absorção de glicose do sangue, por exemplo, no fígado, onde promove o armazenamento de energia pela síntese de glicogênio. Conforme usado neste documento, "agregado de células" refere-se a agregados de células similares à ilhota obtidos após dissociação, criopreservação e reagregação de células endócrinas. Conforme usado neste documento, “células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1” refere-se a células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1, mas que não expressam peptídeo C nem insulina. Vantajosamente, "células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1" refere-se a células tomadas até 3 dias da expressão do peptídeo C, preferencialmente até 2 dias antes da expressão do peptídeo C, mais preferencialmente até 1 dia antes da expressão do peptídeo C.

[0052] Conforme usado neste documento, "células ou agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C" refere-se a células endócrinas secretoras de insulina sensíveis à glicose ou a células endócrinas tendo expressão de peptídeo C iniciada por até 7 dias, até 6 dias, até 5 dias, até 4 dias, até 3 dias ou até 2 dias, preferencialmente por até 2 dias.

[0053] Em um aspecto, a população de células que compreende célula que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou NKX2.2 e NKX6.1 é obtida de uma população de células somáticas.

[0054] Em outro aspecto, a população de células somáticas foi induzida para se desdiferenciar em uma célula-tronco embrionária (ES, por exemplo, uma pluripotente). Tais células desdiferenciadas também são denominadas células-tronco pluripotentes (iPSC).

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[0055] Em uma modalidade, os agregados de células são dissociados por enzimas ou reagentes não enzimáticos.

[0056] Conforme usado neste documento, "enzima" refere-se à enzima adequada para dissociar agregados de células endócrinas derivadas in vitro de células-tronco.

[0057] Em uma modalidade preferencial, enzimas ou mistura de enzima são selecionadas de um grupo consistindo em protease, misturas de protease, tripsina, colagenase e elastase ou suas misturas. Preferencialmente, a enzima do presente método é selecionada a partir da mistura de enzima; preferencialmente, a mistura de enzima é Accutase.

[0058] Em uma modalidade preferencial, os agregados de células são dissociados por reagentes não-enzimáticos, tais como Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido etilenoglicol-bis(éter-β- aminoetílico)-N,N,N',N'-tetra-acético (EGTA), preferencialmente, os reagentes não-enzimáticos são EDTA.

[0059] Em outro aspecto, a população de células que compreende células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou NKX2.2 e NKX6.1 é obtida a partir de células-tronco embrionárias (ES, por exemplo, pluripotentes). Em alguns aspectos, a população de células que compreende células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou NKX2.2 e NKX6.1 são células pluripotentes, tais como células tipo ES.

[0060] Em outro aspecto, a população de células que compreende NKX6.1 e peptídeo C ou NKX2.2 e NKX6.1 é diferenciada de células-tronco embrionárias (ES ou pluripotentes), preferencialmente a partir de células- tronco embrionárias humanas.

[0061] Em outro aspecto, a população de células é uma população de células-tronco. Em alguns aspectos, a população de células é uma população de células-tronco diferenciadas para a linhagem progenitora endócrina. Em alguns aspectos, a população de células é uma população de células-tronco

16 / 47 diferenciadas para células secretoras de insulina sensíveis à glicose.

[0062] A diferenciação de protocolos de células-tronco diferenciadoras em células progenitoras endócrinas e células secretoras de insulina sensíveis à glicose é conhecida na técnica (WO2015/028614 e WO/2017/144695, respectivamente).

[0063] Um objeto da presente invenção se refere a células individuais criopreservadas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 ou que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C, obtidas a partir da dissociação de agregados de células endócrinas. Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a células endócrinas pancreáticas criopreservadas obtidas de acordo com o método que compreendem as etapas de: (i) dissociar agregados de células endócrinas em células individuais; (ii) tratar as referidas células individuais com meio de criopreservação e diminuição da temperatura, por exemplo, até pelo menos - 80°C, para obter células individuais criopreservadas.

[0064] Conforme usado neste documento, "diminuição da temperatura para obter células endócrinas criopreservadas" refere-se a uma etapa de resfriamento de células até temperaturas muito baixas por um determinado período, isto é, entre -70°C e -196°C, preferencialmente até pelo menos - 80°C, para impedir qualquer atividade enzimática ou química que possa causar danos às células individuais endócrinas de interesse.

[0065] Em uma modalidade, a temperatura da etapa (ii) consiste em entre -70°C a -196°C, entre -80°C a -160°C ou entre -80°C a -120°C, preferencialmente a temperatura da etapa (ii) é pelo menos -80°C. Em uma modalidade, a temperatura é reduzida em uma etapa ou em etapas para obter células criopreservadas, preferencialmente a temperatura é reduzida em uma etapa.

[0066] Conforme usado neste documento, “células criopreservadas”

17 / 47 ou “células individuais criopreservadas” se referem a células que foram obtidas após os agregados de células terem sido dissociados em células individuais, tratados com um meio de criopreservação e criopreservados pela diminuição da temperatura até uma temperatura muito baixa, por exemplo, entre -70°C e -196°C.

[0067] Conforme usado neste documento, "meio de criopreservação" refere-se a um meio que é adequado para manter a integridade das células endócrinas ou células progenitoras endócrinas durante a etapa de criopreservação. A maioria dos meios de criopreservação contêm DMSO, soro ou substitutos de soro sintético e são tamponados para pH usando, por exemplo, HEPES de bicarbonato de sódio.

[0068] Em uma modalidade, o meio de criopreservação compreende compostos selecionados dentre Dimetilsulfóxido (DMSO), soro, substitutos de soro sintético ou glicerol.

[0069] De acordo com a presente invenção, as células criopreservadas descritas neste documento podem ser armazenadas por pelo menos uma hora, pelo menos um dia, pelo menos uma semana, pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos um ano ou qualquer período entre qualquer tempo fornecido neste intervalo.

[0070] Em uma modalidade, células criopreservadas ou células endócrinas reagregadas descritas neste documento podem ser usadas no tratamento de diabetes, por exemplo, pela implantação em um paciente em necessidade de tal tratamento.

[0071] Células-tronco são células não diferenciadas definidas pela sua capacidade no nível de célula individual de se autorrenovar e se diferenciar para produzir células de progênie, incluindo células progenitoras de autorrenovação, progenitoras de não-renovação e terminalmente diferenciadas. As células-tronco também são caracterizadas por sua capacidade de se diferenciar in vitro em células funcionais de várias linhagens

18 / 47 celulares de múltiplas camadas germinativas (endoderma, mesoderma e ectoderma), bem como de dar origem a tecidos de múltiplas camadas germinativas após o transplante.

[0072] As células-tronco são classificadas por seu potencial de desenvolvimento como: (1) totipotentes, se referindo à capacidade de dar origem a todos os tipos de células embrionárias e extraembrionárias; (2) pluripotentes, se referindo à capacidade de dar origem a todos os tipos de células embrionárias; (3) multipotentes, se referendo à capacidade de dar origem a um subconjunto de linhagens celulares, mas todas dentro de um tecido, órgão ou sistema fisiológico específico (por exemplo, as células- tronco hematopoiéticas (HSC) podem produzir progênie que inclui HSC (autorrenovação) progenitoras oligopotentes restritas às células sanguíneas e tipos e elementos celulares (por exemplo, plaquetas) que sejam componentes normais do sangue); (4) oligopotentes, se referindo à capacidade de dar origem a um subconjunto mais restrito de linhagens celulares do que as células-tronco multipotentes; e (5) unipotentes, se referindo à capacidade de dar origem a uma linhagem celular individual (por exemplo, células-tronco espermatogênicas).

[0073] Conforme usado neste documento, "diferenciar" ou "diferenciação" refere-se a um processo em que as células progridem de um estado não diferenciado para um estado diferenciado, de um estado imaturo para um estado menos imaturo ou de um estado imaturo para um estado maduro. Por exemplo, células pancreáticas embrionárias não diferenciadas precoces são capazes de se proliferar e expressar marcadores de características, como PDX1, NKX6.1 e PTF1a. Células pancreáticas maduras ou diferenciadas não se proliferam e secretam altos níveis de hormônios endócrinos pancreáticos ou enzimas digestivas, por exemplo, células beta totalmente diferenciadas secretam insulina em altos níveis em resposta à glicose. Alterações na interação celular e maturação ocorrem à medida que as

19 / 47 células perdem marcadores de células não diferenciadas ou ganham marcadores de células diferenciadas. A perda ou ganho de um único marcador pode indicar que uma célula "amadureceu ou se diferenciou totalmente". O termo "fator de diferenciação" refere-se a um composto adicionado às células pancreáticas para aumentar sua diferenciação em células endócrinas maduras contendo também células beta produtoras de insulina. Os fatores de diferenciação exemplares incluem fator de crescimento de hepatócitos, fator de crescimento de queratinócitos, exendina-4, fator de crescimento de fibroblastos básicos, fator de crescimento tipo insulina 1, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento derivado de plaquetas do fator de crescimento epidérmico e peptídeo 1 tipo glucagon. Em alguns aspectos, a diferenciação das células compreende o cultivo das células em um meio compreendendo um ou mais fatores de diferenciação.

[0074] Células pancreáticas maduras ou diferenciadas não se proliferam e secretam altos níveis de hormônios endócrinos pancreáticos ou enzimas digestivas, por exemplo, células beta totalmente diferenciadas secretam insulina em altos níveis em resposta à glicose. Alterações na interação celular e maturação ocorrem à medida que as células perdem marcadores de células não diferenciadas ou ganham marcadores de células diferenciadas. A perda ou ganho de um único marcador pode indicar que uma célula "amadureceu ou se diferenciou totalmente".

[0075] O termo "fator de diferenciação" refere-se a um composto adicionado a células ES ou precursoras pancreáticas para potencializar sua diferenciação em células EP. Os fatores de diferenciação também podem induzir mais diferenciação em células beta maduras.

[0076] Os fatores de diferenciação exemplares incluem fator de crescimento de hepatócitos, fator de crescimento de queratinócitos, exendina- 4, fator de crescimento de fibroblastos básicos, fator de crescimento tipo insulina 1, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento derivado de

20 / 47 plaquetas do fator de crescimento epidérmico peptídeo 1 tipo glucagon, indolactam V, IDE1&2 e ácido retinoico.

[0077] Em alguns aspectos, a diferenciação das células compreende o cultivo das células em um meio compreendendo um ou mais fatores de diferenciação.

[0078] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de fornecimento de função endócrina pancreática a um mamífero deficiente em sua produção de pelo menos um hormônio pancreático, o método compreendendo as etapas de implantar células endócrinas obtidas por qualquer um dos métodos da invenção em uma quantidade suficiente para produzir uma quantidade mensurável do referido pelo menos um hormônio pancreático no referido mamífero.

[0079] Conforme usado neste documento, o termo "células-tronco pluripotentes humanas (hPS)" refere-se a células que podem ser derivadas de qualquer fonte e que são capazes, em condições apropriadas, de produzir progênie humana de tipos de células diferentes que são derivados de todas as 3 camadas germinativas (endoderma, mesoderma e ectoderma). As células hPS têm a capacidade de formar teratoma em camundongos SCID de 8-12 semanas e/ou a capacidade de formar células identificáveis de todas as três camadas germinativas na cultura de tecido. As células embrionárias de vários tipos, incluindo células-tronco derivadas de blastocisto humano (hBS) na literatura frequentemente denotadas como células-tronco embrionárias humanas (hES) estão incluídas na definição de células-tronco pluripotentes humanas.

[0080] Em um aspecto, descreve-se neste documento um método para criopreservar agregados de células endócrinas derivadas in vitro de células- tronco compreendendo as seguintes etapas: (i) dissociar os referidos agregados de células endócrinas em células individuais;

21 / 47 (ii) criopreservar as referidas células individuais, em que as células endócrinas são células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX6.1 e NKX2.2 ou células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C, em que a expressão do peptídeo C foi iniciada por até 7 dias, até 6 dias, até 5 dias, até 4 dias, até 3 dias ou até 2 dias, preferencialmente por até 2 dias.

[0081] Em outro aspecto, descreve-se neste documento método de enriquecimento de agregados de células com células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 derivadas in vitro de células-tronco, o referido método compreendendo as seguintes etapas: (i) dissociar os referidos agregados de células em células individuais; (ii) criopreservar as referidas células individuais; (iii) descongelar as referidas células individuais criopreservadas; e (iv) enriquecer células obtidas após descongelamento e reagregação para células que expressam NKX6.1 e peptídeo C; em que as células endócrinas são células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 ou células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C, em que a expressão do peptídeo C de células endócrinas foi iniciada por até 7 dias, até 6 dias, até 5 dias, até 4 dias, até 3 dias ou até 2 dias, preferencialmente por até 2 dias.

[0082] Em um aspecto, descreve-se neste documento células endócrinas reagregadas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou NKX2.2 e NKX6.1 obtidas de acordo com o método da invenção.

[0083] Em um aspecto, descreve-se neste documento células endócrinas reagregadas que compreendem pelo menos 50% de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C e/ou células progenitoras

22 / 47 endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[0084] Em uma modalidade, descreve-se neste documento células endócrinas reagregadas que compreendem pelo menos 60% de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[0085] Em uma modalidade, descreve-se neste documento células endócrinas reagregadas que compreendem pelo menos 70% de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[0086] Em uma modalidade, descreve-se neste documento células endócrinas reagregadas que compreendem pelo menos 80% de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[0087] Em um aspecto, células endócrinas reagregadas descritas neste documento são usadas como um medicamento.

[0088] Em um aspecto, células endócrinas reagregadas descritas neste documento são usadas no tratamento de diabetes.

[0089] Além disso, a composição que compreende células endócrinas reagregadas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 descrita neste documento é usada no tratamento de diabetes.

[0090] Em outro aspecto, descreve-se neste documento um medicamento que compreende agregados de células enriquecidos com células endócrinas, de acordo com a presente descrição. Em uma modalidade preferencial, o medicamento descrito neste documento compreende células endócrinas reagregadas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C e/ou que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1, conforme descrito neste documento.

[0091] Em outro aspecto, é descrito neste documento um dispositivo que compreende células endócrinas criopreservadas, ou células endócrinas

23 / 47 reagregadas, ou uma composição contendo células endócrinas reagregadas, ou um agregados de células, ou um medicamento conforme descrito neste documento.

[0092] Os diversos métodos e outras modalidades descritas neste documento podem exigir ou utilizar células hPS a partir de uma variedade de fontes. Por exemplo, as células hPS adequadas para uso podem ser obtidas de embriões em desenvolvimento. Adicional ou alternativamente, células hPS adequadas podem ser obtidas a partir de linhagens celulares estabelecidas e/ou células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPS).

[0093] Conforme usado neste documento, o termo "células hiPS" refere-se a células-tronco pluripotentes induzidas humanas.

[0094] Conforme usado neste documento, o termo "células-tronco derivadas de blastocisto" é denotado célula BS, e a forma humana é denominada "células hBS". Na literatura, essas células são frequentemente referidas como células-tronco embrionárias e, mais especificamente, células- tronco embrionárias humanas (hESC). As células-tronco pluripotentes, por sua vez, usadas na presente invenção, podem assim ser células-tronco embrionárias preparadas a partir de blastocistos, conforme descrito em, por exemplo, WO 03/055992 e WO 2007/042225, ou células ou linhagens celulares hBS comercialmente disponíveis. No entanto, prevê-se ainda que qualquer célula-tronco pluripotente humana, por sua vez, possa ser usada na presente invenção, incluindo células adultas diferenciadas que são reprogramadas para células pluripotentes, por exemplo, o tratamento de células adultas com certos fatores de transcrição, tais como OCT4, SOX2, NANOG e LIN28.

[0095] Conforme usado neste documento, "viabilidade" de uma célula ou "célula viável" refere-se à capacidade de crescimento e desenvolvimento normais após ter sido criopreservada, descongelada e/ou reagregada. Em um aspecto, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de

24 / 47 células endócrinas reagregadas são viáveis.

[0096] A presente invenção também pode resolver outros problemas que estarão evidentes a partir da divulgação das modalidades exemplares.

[0097] Salvo indicação em contrário no relatório descritivo, os termos apresentados na forma singular também incluem a situação no plural.

[0098] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, citadas neste documento estão incorporadas neste documento por referência integralmente e na mesma medida como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada por referência e fosse estabelecida integralmente neste documento (na medida máxima permitida por lei).

[0099] Todos os títulos e subtítulos são usados neste documento por conveniência apenas e não devem ser interpretados como limitantes da invenção de nenhuma forma.

[00100] O uso de todo e qualquer exemplo, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") apresentada neste documento é meramente para iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, salvo reivindicado em contrário. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial à prática da invenção.

[00101] Embora certas características da invenção tenham sido ilustradas e descritas neste documento, muitas modificações, substituições, alterações e equivalentes ocorrerão aos versados na técnica. Deve-se entender, portanto, que as reivindicações anexas se destinam a cobrir todas essas modificações e alterações que estejam dentro do verdadeiro espírito da invenção. Outras modalidades da invenção:

[00102] Modalidade 1: Um método para enriquecer os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C derivados in vitro das células-

25 / 47 tronco, com o referido método compreendendo as seguintes etapas: (i) dissociar os agregados de células em células individuais; (ii) tratar as células individuais com meio de criopreservação e diminuir a temperatura, por exemplo, até -80°C, para obter células criopreservadas; (iii) descongelar as células criopreservadas; e (iv) as células obtidas após o descongelamento e reagregação são enriquecidas para células que expressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00103] Modalidade 2: O método da modalidade 1, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C são células progenitoras endócrinas ou células secretoras de insulina sensíveis à glicose, preferencialmente os referidos agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C são células endócrinas que expressaram o peptídeo C por até 7 dias, até 6 dias, até 5 dias, até 4 dias, até 3 dias, até 2 dias, preferencialmente por até 2 dias.

[00104] Modalidade 3: O método da modalidade 2, em que células progenitoras endócrinas coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00105] Modalidade 4: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que as células-tronco são células-tronco pluripotentes induzidas.

[00106] Modalidade 5: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que as células-tronco são células-tronco embrionárias.

[00107] Modalidade 6: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que as células-tronco são células-tronco embrionárias humanas.

[00108] Modalidade 7: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 6, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C derivaram in vitro de células-tronco que foram diferenciadas em endoderma definitivo.

[00109] Modalidade 8: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 6, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C

26 / 47 derivaram in vitro de células-tronco que foram diferenciadas em endoderma pancreático.

[00110] Modalidade 9: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 6, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C derivaram in vitro de células-tronco que foram diferenciadas em células progenitoras endócrinas.

[00111] Modalidade 10: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 6, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C derivaram in vitro de células-tronco que foram diferenciadas em células progenitoras endócrinas que expressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00112] Modalidade 11: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 6, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C derivaram in vitro de células-tronco que foram diferenciadas em células secretoras de insulina sensíveis à glicose.

[00113] Modalidade 12: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 11, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C são dissociados por enzimas.

[00114] Modalidade 13: O método da modalidade 12, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C são dissociados por enzimas selecionadas de um grupo que consiste em protease ou mistura de proteases.

[00115] Modalidade 14: O método da modalidade 12, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C são dissociados por enzimas selecionadas de um grupo que consiste em tripsina, colagenase e elastase ou misturas destas.

[00116] Modalidade 15: O método da modalidade 12, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C são dissociados pela enzima Accutase.

[00117] Modalidade 16: O método da modalidade 15, em que a

27 / 47 Accutase é uma mistura de protease e colagenase.

[00118] Modalidade 17: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 11, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C são dissociados por reagentes não enzimáticos.

[00119] Modalidade 18: O método da modalidade 17, em que os agregados de células que expressam NKX6.1 e peptídeo C são dissociados por reagentes não enzimáticos, tais como ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) ou ácido etileno glicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetra-acético (EGTA).

[00120] Modalidade 19: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 18, em que o meio de criopreservação tem um crioprotetor.

[00121] Modalidade 20: O método da modalidade 19, em que o criprotetor é dimetilsulfóxido (DMSO).

[00122] Modalidade 21: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 18, em que o meio de criopreservação não tem um crioprotetor.

[00123] Modalidade 22: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 21, em que, após o tratamento das células individuais com o meio de criopreservação, a temperatura é reduzida entre -70°C e -196°C, entre -80°C e -160°C, ou entre -80°C e -120°C, ou -80ºC, em uma etapa para obter células criopreservadas.

[00124] Modalidade 23: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 21, em que, após o tratamento das células individuais com o meio de criopreservação, a temperatura é reduzida entre -70°C e -196°C, entre -80°C e -160°C, ou entre -80°C e -120°C, ou -80ºC, em etapas para obter células criopreservadas.

[00125] Modalidade 24: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 21, em que, após o tratamento das células individuais com o meio de criopreservação, a temperatura é reduzida para -80ºC em uma etapa para obter células criopreservadas.

28 / 47

[00126] Modalidade 25: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que as células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00127] Modalidade 26: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que pelo menos 20% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 expressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00128] Modalidade 27: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que pelo menos 40% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 expressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00129] Modalidade 28: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que pelo menos 60% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 expressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00130] Modalidade 29: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que pelo menos 80% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 expressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00131] Modalidade 30: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que as células criopreservadas coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00132] Modalidade 31: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que pelo menos 20% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 expressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00133] Modalidade 32: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que pelo menos 40% ou 50% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 expressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00134] Modalidade 33: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que pelo menos 60% ou 70% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 expressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00135] Modalidade 34: O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que pelo menos 80% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 expressam NKX6.1 e peptídeo C.

29 / 47

[00136] Modalidade 35: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 34, em que as células criopreservadas são viáveis.

[00137] Modalidade 36: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 34, em que pelo menos 20% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 são viáveis.

[00138] Modalidade 37: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 34, em que pelo menos 40% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 são viáveis.

[00139] Modalidade 38: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 34, em que pelo menos 60% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 são viáveis.

[00140] Modalidade 39: O método de qualquer uma das modalidades de 1 a 34, em que pelo menos 80% das células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) da modalidade 1 são viáveis.

[00141] Modalidade 40: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39.

[00142] Modalidade 41: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 são armazenadas por pelo menos 7 dias, preferencialmente por pelo menos 14 dias.

[00143] Modalidade 42: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 são armazenadas por pelo menos 21 dias.

[00144] Modalidade 43: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 são armazenadas por pelo menos 1 mês.

[00145] Modalidade 44: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 são armazenadas por pelo menos 2 meses.

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[00146] Modalidade 45: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 são armazenadas por pelo menos 3 meses.

[00147] Modalidade 46: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 são armazenadas por pelo menos 1 ano.

[00148] Modalidade 47: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 para uso para diferenciação posterior.

[00149] Modalidade 48: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 para uso para encapsulação.

[00150] Modalidade 49: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 para uso para encapsulação em um dispositivo.

[00151] Modalidade 50: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 para uso para transplante em um sujeito.

[00152] Modalidade 51: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 para uso para transplante em um mamífero.

[00153] Modalidade 52: Células criopreservadas obtidas pelas etapas (i) e (ii) do método de qualquer uma das modalidades de 1 a 39 para uso para transplante em um humano.

[00154] Modalidade 53: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, em que as células criopreservadas são descongeladas na presença do inibidor da Rock.

[00155] Modalidade 54: O método de acordo com a modalidade 53, em que as células criopreservadas são descongeladas na presença de 10 μM do

31 / 47 inibidor da Rock.

[00156] Modalidade 55: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, em que as células criopreservadas são descongeladas na ausência do inibidor da Rock.

[00157] Modalidade 56: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39 e 53 a 55, em que as células obtidas após o descongelamento são reagregadas.

[00158] Modalidade 57: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39 e 53 a 55, em que as células obtidas após o descongelamento são reagregadas por pelo menos 2 dias.

[00159] Modalidade 58: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39 e 53 a 57.

[00160] Modalidade 59: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39 e 53 a 57, em que as referidas células reagregadas coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00161] Modalidade 60: O método de acordo com a modalidade 59, em que pelo menos 20% das células reagregadas coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00162] Modalidade 61: O método de acordo com a modalidade 59, em que pelo menos 40% das células reagregadas coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00163] Modalidade 62: O método de acordo com a modalidade 59, em que pelo menos 60% das células reagregadas coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00164] Modalidade 63: O método de acordo com a modalidade 59, em que pelo menos 80% das células reagregadas coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00165] Modalidade 64: O método de acordo com a modalidade 59, em que pelo menos 20% das células reagregadas são células secretoras de

32 / 47 insulina sensíveis à glicose.

[00166] Modalidade 65: O método de acordo com a modalidade 59, em que pelo menos 40% das células reagregadas são células secretoras de insulina sensíveis à glicose.

[00167] Modalidade 66: O método de acordo com a modalidade 59, em que pelo menos 60% das células reagregadas são células secretoras de insulina sensíveis à glicose.

[00168] Modalidade 67: O método de acordo com a modalidade 59, em que pelo menos 80% das células reagregadas são células secretoras de insulina sensíveis à glicose.

[00169] Modalidade 68: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 53 a 57 e 59 a 66, para uso para diferenciação posterior.

[00170] Modalidade 69: Células reagregadas obtidas pelo método, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 53 a 57 e 59 a 66, para uso para encapsulação.

[00171] Modalidade 70: Células reagregadas obtidas pelo método, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 53 a 57 e 59 a 66, para uso para encapsulação em um dispositivo.

[00172] Modalidade 71: Células reagregadas obtidas pelo método, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 53 a 57 e 59 a 66, para uso para transplante em um sujeito.

[00173] Modalidade 72: Células reagregadas obtidas pelo método, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 53 a 57 e 59 a 66, para uso para transplante em um mamífero.

[00174] Modalidade 73: Células reagregadas obtidas pelo método, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 53 a 57 e 59 a 66, para uso para transplante em um humano.

[00175] Modalidade 74: Um método para criopreservação de

33 / 47 agregados de células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 ou NKX6.1 e peptídeo C derivado in vitro de células-tronco, com o referido método compreendendo as seguintes etapas: (i) dissociar os agregados de células em células individuais; (ii) tratar as células individuais com meio de criopreservação e diminuir a temperatura, por exemplo, para pelo menos -80°C, para obter células criopreservadas.

[00176] Modalidade 75: O método de acordo com a modalidade 74, em que as células criopreservadas são descongeladas.

[00177] Modalidade 76: O método de acordo com a modalidade 75, em que as células criopreservadas que foram descongeladas são reagregadas.

[00178] Modalidade 77: O método de acordo com a modalidade 76, em que as células criopreservadas que foram reagregadas coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00179] Modalidade 78: O método de acordo com a modalidade 74, em que os agregados de células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 são células progenitoras endócrinas.

[00180] Modalidade 79: O método de acordo com qualquer uma das modalidades 74 a 78, em que as células-tronco são células-tronco pluripotentes induzidas.

[00181] Modalidade 80: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 74 a 78, em que as células-tronco são células-tronco embrionárias.

[00182] Modalidade 81: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 74 a 78, em que as células-tronco são células-tronco embrionárias humanas.

[00183] Modalidade 82: O método de acordo com qualquer uma das modalidades 74 a 81, em que os agregados de células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 derivaram in vitro de células-tronco que foram

34 / 47 diferenciadas em endoderma definitivo.

[00184] Modalidade 83: O método de acordo com qualquer uma das modalidades 74 a 81, em que os agregados de células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 derivaram in vitro de células-tronco que foram diferenciadas em endoderma pancreático, isto é, coexpressando PDX- 1/NKX6.1.

[00185] Modalidade 84: O método de qualquer uma das modalidades 74 a 81, em que os agregados de células que expressam NKX2.2 e NKX6.1 derivaram in vitro de células-tronco que foram diferenciadas em progenitores endócrinos.

[00186] Modalidade 85: O método de qualquer uma das modalidades 74 a 84, em que os agregados de células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 são dissociados por enzimas.

[00187] Modalidade 86: O método da modalidade 85, em que as referidas enzimas são selecionadas de um grupo que consiste em protease ou misturas de protease ou misturas de protease e colagenase.

[00188] Modalidade 87: O método da modalidade 85, em que as referidas enzimas são selecionadas de um grupo que consiste em tripsina, colagenase e elastase ou misturas destas.

[00189] Modalidade 88: O método da modalidade 85, em que as referidas enzimas são a enzima Accutase.

[00190] Modalidade 89: O método da modalidade 88, em que a Accutase é uma mistura de protease e colagenase.

[00191] Modalidade 90: O método de qualquer uma das modalidades de 74 a 84, em que os agregados de células que expressam NKX2.2 e NKX6.1 são dissociados por reagentes não enzimáticos.

[00192] Modalidade 91: O método da modalidade 90, em que os referidos reagentes não enzimáticos são selecionados dentre ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) ou ácido etileno glicol-bis(β-aminoetil

35 / 47 éter)-N,N,N',N'-tetra-acético (EGTA).

[00193] Modalidade 92: O método de qualquer uma das modalidades de 74 a 91, em que o meio de criopreservação tem um crioprotetor.

[00194] Modalidade 93: O método da modalidade 92, em que o criprotetor é dimetilsulfóxido (DMSO).

[00195] Modalidade 94: O método de qualquer uma das modalidades de 74 a 91, em que o meio de criopreservação não tem um crioprotetor.

[00196] Modalidade 95: O método de qualquer uma das modalidades de 74 a 94, em que, após o tratamento das células individuais com o meio de criopreservação, a temperatura é reduzida entre -70°C e -196°C, entre -80°C e -160°C, ou entre -80°C e -120°C, ou para -80ºC, em uma etapa para obter células criopreservadas.

[00197] Modalidade 96: O método de qualquer uma das modalidades de 74 a 94, em que, após o tratamento das células individuais com o meio de criopreservação, a temperatura é reduzida entre -70°C e -196°C, entre -80°C e -160°C, ou entre -80°C e -120°C, ou -80ºC, em etapas para obter células criopreservadas.

[00198] Modalidade 97: Células criopreservadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 74 a 96.

[00199] Modalidade 98: Células criopreservadas de acordo com a modalidade 97, em que as células criopreservadas coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00200] Modalidade 99: Células criopreservadas de acordo com a modalidade 97, em que pelo menos 20% das células criopreservadas coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00201] Modalidade 100: Células criopreservadas de acordo com a modalidade 97, em que pelo menos 40% das células criopreservadas coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00202] Modalidade 101: Células criopreservadas de acordo com a

36 / 47 modalidade 97, em que pelo menos 60% das células criopreservadas coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00203] Modalidade 102: Células criopreservadas de acordo com a modalidade 97, em que pelo menos 80% das células criopreservadas coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00204] Modalidade 103: Células criopreservadas obtidas de acordo com a modalidade 97 podem ser armazenadas por pelo menos 7 dias.

[00205] Modalidade 104: Células criopreservadas obtidas de acordo com a modalidade 97 podem ser armazenadas por pelo menos 14 dias.

[00206] Modalidade 105: Células criopreservadas obtidas de acordo com a modalidade 97 podem ser armazenadas por pelo menos 21 dias.

[00207] Modalidade 106: Células criopreservadas obtidas de acordo com a modalidade 97 podem ser armazenadas por pelo menos 1 mês.

[00208] Modalidade 107: Células criopreservadas obtidas de acordo com a modalidade 97 podem ser armazenadas por pelo menos 2 meses.

[00209] Modalidade 108: Células criopreservadas obtidas de acordo com a modalidade 97 podem ser armazenadas por pelo menos 3 meses.

[00210] Modalidade 109: Células criopreservadas obtidas de acordo com a modalidade 97 podem ser armazenadas por pelo menos 6 meses.

[00211] Modalidade 110: Células criopreservadas obtidas de acordo com qualquer uma das modalidades 97-109 para uso para diferenciação posterior.

[00212] Modalidade 111: Células criopreservadas obtidas de acordo com qualquer uma das modalidades 97-109 para uso para encapsulação.

[00213] Modalidade 112: Células criopreservadas obtidas de acordo com qualquer uma das modalidades de 97 a 109 para uso para encapsulação em um dispositivo.

[00214] Modalidade 113: Células criopreservadas obtidas de acordo com qualquer uma das modalidades de 97 a 109 para uso para transplante em

37 / 47 um sujeito.

[00215] Modalidade 114: Células criopreservadas obtidas de acordo com qualquer uma das modalidades de 97 a 109 para uso para transplante em um mamífero.

[00216] Modalidade 115: Células criopreservadas obtidas de acordo com qualquer uma das modalidades de 97 a 109 para uso para transplante em um humano.

[00217] Modalidade 116: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 74 a 96, em que as células criopreservadas são descongeladas na presença do inibidor da Rock.

[00218] Modalidade 117: O método da modalidade 116, em que as células criopreservadas são descongeladas na presença de 10 μM do inibidor da Rock.

[00219] Modalidade 118: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 74 a 96, em que as células criopreservadas são descongeladas na ausência do inibidor da Rock.

[00220] Modalidade 119: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 74 a 96, em que as células obtidas após o descongelamento são reagregadas.

[00221] Modalidade 120: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 74 a 96, em que as células obtidas após o descongelamento são reagregadas por 2 dias.

[00222] Modalidade 121: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades 76 a 96 e 116-120.

[00223] Modalidade 122: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120, em que as células reagregadas coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00224] Modalidade 123: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120, em que pelo menos 20% das células

38 / 47 reagregadas expressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00225] Modalidade 124: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120, em que pelo menos 40% das células reagregadas expressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00226] Modalidade 125: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120, em que pelo menos 60% das células reagregadas expressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00227] Modalidade 126: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120, em que pelo menos 80% das células reagregadas expressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00228] Modalidade 127: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120, em que pelo menos 20% das células reagregadas são células secretoras de insulina sensíveis à glicose.

[00229] Modalidade 128: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120, em que pelo menos 40% das células reagregadas são células secretoras de insulina sensíveis à glicose.

[00230] Modalidade 129: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120, em que pelo menos 60% das células reagregadas são células secretoras de insulina sensíveis à glicose.

[00231] Modalidade 130: O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120, em que pelo menos 80% das células reagregadas são células secretoras de insulina sensíveis à glicose.

[00232] Modalidade 131: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120 para uso para diferenciação posterior.

[00233] Modalidade 132: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120 para uso para encapsulação.

[00234] Modalidade 133: Células reagregadas obtidas pelo método de

39 / 47 acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120 para uso para encapsulação em um dispositivo.

[00235] Modalidade 134: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120 para uso para transplante em um sujeito.

[00236] Modalidade 135: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120 para uso para transplante em um mamífero.

[00237] Modalidade 136: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120 para uso para transplante em humano.

[00238] Modalidade 137: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120 para uso como um medicamento.

[00239] Modalidade 138: Células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 76 a 96 e 116 a 120 para uso no tratamento do diabetes.

[00240] Modalidade 139: Células endócrinas reagregadas compreendendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00241] Modalidade 140: Células endócrinas reagregadas compreendendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% de células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

[00242] Modalidade 141: Células endócrinas reagregadas obtidas de acordo com o método de enriquecimento de agregados de células endócrinas de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 76 a 96 e 116 a 120.

[00243] Modalidade 142: Células endócrinas reagregadas de acordo com qualquer uma das modalidades 138 a 140 para uso como um

40 / 47 medicamento.

[00244] Modalidade 143: Células endócrinas reagregadas de acordo com qualquer uma das modalidades 138 a 140 para uso no tratamento do diabetes.

[00245] Modalidade 144: Processo para a preparação de um medicamento para tratamento do diabetes usando células reagregadas de acordo com qualquer uma das modalidades 68 a 73 e 131 a 143.

[00246] Modalidade 145: Células endócrinas individuais criopreservadas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 ou células endócrinas individuais que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

[00247] Modalidade 146: Células endócrinas individuais criopreservadas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 ou que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C obtidas de acordo com o método de criopreservação de acordo com qualquer uma das modalidades 74 a 96 e 116 a 120.

[00248] Modalidade 147: Células endócrinas individuais criopreservadas de acordo com qualquer uma das modalidades 145 ou 146 para uso no transplante em um sujeito.

[00249] Modalidade 148: Células endócrinas individuais criopreservadas de acordo com qualquer uma das modalidades 145 ou 146 para uso no tratamento do diabetes.

[00250] Modalidade 149: Células endócrinas individuais criopreservadas de acordo com qualquer uma das modalidades 145 ou 146 para uso no transplante em um sujeito.

[00251] Modalidade 150: Células endócrinas individuais criopreservadas de acordo com qualquer uma das modalidades 145 ou 146 para uso como um medicamento.

[00252] Modalidade 151: Composição contendo células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 76 a 96, 116 a 120 e 122 a 130 para uso como medicamento.

41 / 47

[00253] Modalidade 152: Composição contendo células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 76 a 96, 116 a 120 e 122 a 130 para uso no tratamento do diabetes.

[00254] Modalidade 153: Composição contendo células endócrinas reagregadas de acordo com a modalidade de 131 a 143 para uso como um medicamento ou para uso no tratamento do diabetes, por exemplo, diabetes tipo I.

[00255] Modalidade 154: Medicamento contendo células reagregadas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39, 76 a 96, 116 a 120 e 122 a 130.

[00256] Modalidade 155: Medicamento compreendendo células endócrinas reagregadas de acordo com qualquer uma das modalidades 131 a

143.

[00257] Modalidade 156: Um dispositivo compreendendo células endócrinas criopreservadas de acordo com qualquer uma das modalidades de 40 a 52, 97 a 115 e 145 a 150, ou células endócrinas reagregadas de acordo com qualquer uma das modalidades 58, 68 a 73, 131 a 143, ou 149 a 153, ou uma composição de acordo com as modalidades de 151 a 153, ou um medicamento de acordo com a modalidade 154 ou 155.

[00258] Surpreendentemente, uma população enriquecida de células endócrinas é obtida realizando-se o processo da presente invenção. As células endócrinas enriquecidas têm um tamanho de grupo homogêneo e pequeno que as torna adequadas para transplante em um sujeito.

EXEMPLOS

LISTA DE ABREVIAÇÕES Alk5i II: TGFβ quinase/quinase semelhante a receptor de activina DAPT: Difluorofenilacetil)-alanil-fenilglicina-t-butil-éster DMBI: (Z)-3-[4-(Dimetilamino)benzilidenil]indolin-2-ona DZNEP: 3-Deazanoplanocina A

42 / 47 BC: Célula beta DE: Endoderma definitivo DNA-Pki: Inibidor V de DNA-PK EP: Progenitor endócrino GABA: Ácido Gama-Aminobutírico hBS: célula-tronco derivada de blastocisto humano hES: linhagem embrionária humana hESC: célula-tronco embrionária humana hiPS: célula-tronco pluripotente induzida humana HSC: célula-tronco hematopoiética iPS: linhagem pluripotente induzida iPSC: célula-tronco pluripotente induzida KOSR: Reposição de Soro KnockOut™ PE: endoderma pancreático Rocki: inibidor da Rho quinase SC: célula-tronco Exemplos

[00259] Em geral, o processo de enriquecimento das células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C passa através de vários estágios. Um método exemplar para o enriquecimento é descrito na Figura 1. Exemplo 1: Preparação da população de células endócrinas

[00260] Protocolos para obtenção de células progenitoras endócrinas e células secretoras de insulina sensíveis à glicose foram fornecidos nos pedidos de patente WO2015/028614 e WO2017/144695, respectivamente. Exemplo 2: Enriquecimento de agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C por criopreservação das células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1

[00261] Agregados de células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 que foram obtidos in vitro a partir de células-tronco são submetidas às

43 / 47 seguintes etapas: (i) Dissociação

[00262] Os agregados de células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 obtidos a partir de células-tronco são dissociados em células individuais usando Accutase (célula-tronco#07920). A digestão é interrompida pela adição de meio RPMI1640 (Gibco#61870-044) suplementado com 12% KOSR (Gibco#10828-0280) e a suspensão é filtrada através de um filtro de 40 μm para remover quaisquer aglomerados residuais. (ii) Criopreservação

[00263] Após centrifugação, as células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 são ressuspensas em meios de criopreservação e preservadas por uma diminuição sequencial de temperatura para -80ºC. (ii) Descongelamento das células individuais criopreservadas

[00264] Para trazer as células de volta em cultura, as células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 são rapidamente postas em 37ºC e lavadas uma vez em meio RPMI1640 previamente aquecido (Gibco#61870-044) suplementado com 12% KOSR (Gibco#10828-0280). Após a contagem, as células são ressuspensas em meio de estágio específico suplementado com 50 μg/mL de DNaseI (Sigma#11284932001) e 10 μM de Rocki (Sigma#Y27632- Y0503). (iii) Reagregação das células obtidas após descongelamento

[00265] As células que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 são obtidas após o descongelamento e são reagregadas em frascos de Erlenmeyer em um volume reduzido com uma densidade de 0,5-2 milhões de células viáveis/mL. A reagregação é realizada em 37ºC com agitação horizontal a 70 rpm por dois dias e é seguido por uma mudança de meios.

[00266] Meio de progenitor endócrino: Meio RPMI1640 (Gibco#61870-044) suplementado com 12% KOSR (Gibco#10828-0280), 0,1% P/S (Gibco#15140-122), 10 mM Nicotinamida (Sigma#N0636), 10 µM

44 / 47 Alk5i II (Enzo#ALX-270-445), 1 µM DZNEP (Tocris#4703), 10 µg/mL Heparina (Applichem #A3004,0250), 2,5 µM DAPT (Calbiochem#565784) e 1 µM T3 (Sigma#T6397).

[00267] Após criopreservação, as células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 com viabilidade acima de 60% são recuperadas. Após a reagregação e diferenciação em células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C, as referidas células endócrinas formam aglomerados, resultando em agregados pequenos e mais homogêneos que podem contribuir para enxertos mais homogêneos in vivo (tamanho ~100 μm, <50% de redução de células negativas para NKX6.1/C-PEP/GLU, aumento de >50% de células positivas para NKX6.1). Efeitos sobre células progenitoras endócrinas que coexpressam o fenótipo NKX2.2 e NKX6.1 in vitro são fornecidas na Figura 2A e 2B, respectivamente.

[00268] Após o transplante em camundongos não diabéticos, as células progenitoras endócrinas dissociadas, criopreservadas e reagregadas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 são funcionais e secretam o peptídeo C humano quando expostas à glicose ou têm resistência à insulina aguda induzida por S961 (Figura 3A).

[00269] Os animais que recebem células geradas usando um protocolo com ou sem uma etapa de dissociação, criopreservação e reagregação mostraram um aumento no peptídeo C durante a exposição a S961. Esses resultados mostram que a eficácia foi melhorada usando o protocolo com dissociação, criopreservação e reagregação e a variação entre os animais foi reduzida (Figura 3B).

[00270] A análise imuno-histoquímica nos enxertos renais mostrou que as etapas de dissociação, criopreservação e reagregação levam a um enriquecimento dos tipos de células endócrinas (insulina, glucagon, NKX6.1) e uma redução dos tipos de células não endócrinas (Figura 3C). Esses dados também podem explicar a redução de não respondentes duas semanas após o

45 / 47 transplante. Exemplo 3: Enriquecimento de agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C por criopreservação das células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C

[00271] Os agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C que foram obtidos in vitro a partir de células-tronco são submetidos às seguintes etapas: (i) Dissociação

[00272] Os agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C obtidos a partir de células-tronco são dissociados em células individuais usando Accutase (célula-tronco#07920). A digestão é interrompida pela adição de meio RPMI1640 (Gibco#61870-044) suplementado com 12% KOSR (Gibco#10828-0280) e a suspensão é filtrada através de um filtro de 40 μm para remover quaisquer aglomerados residuais. (ii) Criopreservação

[00273] Após centrifugação, as células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C são ressuspensas em meios de criopreservação e preservadas por uma diminuição sequencial de temperatura para -80ºC. (iii) Descongelamento de células individuais criopreservadas

[00274] Para trazer as células de volta em cultura, as células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C são rapidamente postas em 37ºC e lavadas uma vez em meio RPMI1640 previamente aquecido (Gibco#61870-044) suplementado com 12% KOSR (Gibco#10828-0280). Após a contagem, as células são ressuspensas em meio de estágio específico suplementado com 50 μg/mL de DNaseI (Sigma#11284932001) e 10 μM de Rocki (Sigma#Y27632- Y0503). (iv) Reagregação das células obtidas após descongelamento

[00275] Células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C obtidas após o descongelamento são reagregadas em frascos de Erlenmeyer em um volume

46 / 47 reduzido com uma densidade de 0,5-2 milhões de células viáveis/ml. A reagregação é realizada em 37ºC com agitação horizontal a 70 rpm por dois dias e é seguido por uma mudança de meios.

[00276] Meios: Meio RPMI1640 (Gibco#61870-044) suplementado com 12% KOSR (Gibco#10828-0280), 0,1% P/S (Gibco#15140-122), 50 µM GABA (TOCRIS#0344), 10 µM Alk5i II (Enzo#ALX-270-445), 1 µM DZNEP (Tocris#4703) e 1 µM T3 (Sigma#T6397).

[00277] Após criopreservação, as células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C com viabilidade acima de 90% são recuperadas. Após a reagregação de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C, o fenótipo secretor de insulina sensível à glicose é melhorado (tamanho ~150um, <25% de redução de células negativas para NKX6.1/C-PEP/GLU, aumento de >25% de célula positivas para NKX6.1)(Figuras 4A e 4B).

[00278] In vivo, as células endócrinas, dissociadas, criopreservadas e reagregadas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C mostraram diminuir eficientemente a glicose sanguínea, o que se correlacionou com a secreção de peptídeo C humano elevada (Figuras 5A e 5B). Exemplo 4: Perfil de expressão gênica após criopreservação de agregados de células que coexpressam NKX6.1 e NKX2.2 ou agregados de células que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C

[00279] Dissociação, criopreservação e reagregação de células que foram criopreservadas em diferentes pontos no tempo durante a diferenciação celular. As células foram criopreservadas no estágio de endoderma pancreático (PE), 1 dia antes do início da expressão do peptídeo C (BC00), 2 dias após o início da expressão do peptídeo C (BC03), 5 dias após o início da expressão do peptídeo C (BC06) e 8 dias após o início da expressão do peptídeo C (BC09) e foram todas do mesmo lote de células. As células foram descongeladas e diferenciadas e testadas para a funcionalidade em 13 dias após o início da expressão do peptídeo C (BC14) na mesma configuração. Os

47 / 47 resultados mostram que a resposta de glicose e a expressão de NKX6.1 e peptídeo C são maiores quando as células são criopreservadas no estágio BC00 e BC03 (Figura 6A).

[00280] A expressão de NKX6.1 e do peptídeo C foi medida em BC14 usando citometria de fluxo. Os dados são expressos em % em comparação com células do mesmo lote usando um protocolo sem etapa de dissociação, criopreservação e reagregação. Os resultados mostram que o enriquecimento de células com NKX6.1 e peptídeo C é mais eficiente para células criopreservadas em BC00 e BC03 (Figura 6B).

[00281] No final do experimento, a funcionalidade foi testada usando um sistema de perfusão dinâmica. Todas as células responderam a uma exposição com 20 mM de glicose e exendina-4, mas a resposta mais elevada foi observada quando as células foram criopreservadas em BC00 e BC03, respectivamente 1 dia antes e 2 dias após o início da expressão do peptídeo C (Figura 6C).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de criopreservação de agregados de células endócrinas pancreáticas derivados in vitro de células-tronco, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (i) dissociar os referidos agregados de células endócrinas pancreáticas em células individuais; (ii) tratar as referidas células individuais com meio de criopreservação e diminuir a temperatura para obter células individuais criopreservadas.

2. Método de criopreservação de agregados de células endócrinas pancreáticas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas células endócrinas são células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas, que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

3. Método de enriquecimento de agregados de células endócrinas derivados in vitro de células-tronco com células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou com células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1, sendo o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (i) dissociar os referidos agregados de células endócrinas em células individuais; (ii) tratar as referidas células individuais com meio de criopreservação e diminuir a temperatura para obter células endócrinas criopreservadas, (iii) descongelar as referidas células endócrinas criopreservadas; e (iv) reagregar as referidas células endócrinas obtidas após o descongelamento;

4. Método de enriquecimento de agregados de células endócrinas de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as referidas células endócrinas da etapa (i) são células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

5. Método de enriquecimento de agregados de células endócrinas de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que, quando as referidas células endócrinas da etapa (i) são células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1, o referido método compreende ainda uma etapa (v) de diferenciação das referidas células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 em agregados de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as referidas células-tronco são células-tronco embrionárias, preferencialmente células-tronco embrionárias humanas.

7. Células endócrinas individuais criopreservadas, caracterizadas pelo fato de que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1 ou coexpressam NKX6.1 e peptídeo C.

8. Células endócrinas individuais criopreservadas, caracterizadas pelo fato de serem obtidas conforme o método de criopreservação como definido na reivindicação 1 ou 2.

9. Células endócrinas individuais criopreservadas de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizadas pelo fato de serem para uso no transplante em um sujeito ou para uso no tratamento do diabetes.

10. Células endócrinas reagregadas, caracterizadas pelo fato de que compreendem pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 80% de células endócrinas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C ou células progenitoras endócrinas que coexpressam NKX2.2 e NKX6.1.

11. Células endócrinas reagregadas, caracterizadas pelo fato de serem obtidas conforme o método de enriquecimento de agregados de células endócrinas como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 6.

12. Células endócrinas reagregadas de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizadas pelo fato de serem para uso no transplante em um sujeito ou para uso no tratamento do diabetes ou para uso como um medicamento.

13. Composição contendo células endócrinas reagregadas como definidas na reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de ser para uso no transplante em um sujeito ou para uso no tratamento do diabetes ou para uso como um medicamento.

14. Medicamento, caracterizado pelo fato de que contém células endócrinas reagregadas como definidas na reivindicação 12 ou 13.

15. Dispositivo, caracterizado pelo fato de que compreende células endócrinas individuais criopreservadas como definidas em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, ou células endócrinas reagregadas que coexpressam NKX6.1 e peptídeo C como definidas em qualquer uma das reivindicações 10 a 12, ou uma composição como definida na reivindicação 13, ou um medicamento como definido na reivindicação 14.