CN112074281A - 增强干细胞向β细胞分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了使用一种或多种表观遗传修饰化合物增强干细胞向β细胞分化的组合物和方法。本公开内容还涉及分选和富集分化的β细胞的组合物和方法。本公开内容还涉及辐照细胞群体以减少增殖的组合物和方法。

Description

增强干细胞向β细胞分化的方法
交叉引用
本申请要求于2018年3月2日提交的美国临时申请号62/637,923的权益，该临时申请通过引用全文并入本文。
背景技术
破译指导胰岛细胞再生、适应性和功能的分子机制可改善和拓展治疗糖尿病的β细胞替代策略。干细胞衍生的β细胞的生成可以为胰岛和胰腺器官的生成提供可能有用的步骤。可以由干细胞衍生组织治疗的快速生长的疾病之一是糖尿病。1型糖尿病由胰岛中β细胞的自身免疫破坏而导致。2型糖尿病由外周组织胰岛素抗性和β细胞功能障碍而导致。糖尿病患者，尤其是患有1型糖尿病的患者，可以通过移植新的β细胞而治愈。通过这一举措，可以使移植了尸体的人胰岛的患者在5年或更长时间内不依赖于胰岛素，但是由于供体胰岛的缺乏和质量问题，这种方法是有限的。从干细胞生成无限的人β细胞供应可以将这种疗法扩展到数百万新患者，并且可以成为将干细胞生物学转化到临床中的重要测试案例。
援引并入
说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地和个别地指出要通过引用来并入每一个出版物、专利或专利申请。除非另有说明，否则本说明书中提及的出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。
发明内容
在一些方面，本文提供了一种方法，其包括：将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中嗜铬粒蛋白A阳性(CHGA+)细胞或C肽阳性和NKX6.1阳性(C-PEP+、NKX6.1+)细胞的比例增加。
在一些方面，本文提供了一种方法，其包括：将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中表达VMAT或Cdx2的细胞比例降低。
在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括一种或多种DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些情况下，与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触的所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。在一些情况下，DZNep的浓度为至少约0.5μM。在一些情况下，DZNep的浓度为约1μM。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。在一些情况下，所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一些情况下，所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。在一些情况下，HDAC抑制剂是KD5170。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包含HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括DZNep和KD5170。在一些情况下，所述方法在体外进行。
在一些情况下，所述方法进一步包括使所述胰腺祖细胞或其前体的群体与选自以下的试剂接触：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。在一些情况下，(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。在一些情况下，所述方法包括使所述胰腺祖细胞或其前体的群体与选自以下的试剂接触：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。在一些情况下，接触为至少三天。在一些情况下，所述接触包括将所述胰腺祖细胞或其前体的群体与所述表观遗传修饰化合物接触超过三天的时间段，并且在所述时间段的前三天与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触之后，从所述EGF家族中去除所述SHH途径抑制剂、所述RA信号传导途径激活剂或所述生长因子。在一些情况下，接触为至少五天。在一些情况下，接触为约七天。在一些情况下，所述胰腺祖细胞群体中的至少一个细胞表达PDX1和NKX6-1中的至少一个。在一些情况下，所述胰腺祖细胞群体中的至少一个细胞表达PDX1和NKX6-1中的至少一个。在一些情况下，所述内分泌细胞群体中的至少一个细胞表达CHGA。在一些情况下，所述内分泌细胞群体中的至少一个细胞表达C肽和NKX6.1。在一些情况下，所述内分泌细胞群体包含的CHGA+细胞比例比未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％、400％、420％、450％、480％或500％，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，所述内分泌细胞群体包含的C-PEP+、NKX6.1+细胞的比例比未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％、400％、420％、450％、480％或500％，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，所述内分泌细胞群体包含表达VMAT或Cdx2的细胞的比例比未接触所述至少一种表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％或400％，如通过流式细胞术测量。
在一些方面，本文提供通过本文提供的任何方法产生的细胞。
在一些方面，本文提供了包含细胞群体的组合物，其中所述细胞群体包含：(a)至少约20％的表达C肽和NKX6.1的细胞；(b)至少约60％的表达CHGA的细胞；(c)至多约20％的表达Cdx2的细胞；或者(d)至多约45％的表达VMAT1的细胞，如通过流式细胞术测量。
在一些方面，本文提供的组合物包含细胞群体，所述细胞群体包含至少约30％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞和至多约20％的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞，如通过流式细胞术测量。
在一些情况下，细胞群体包含至少约35％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞。在一些情况下，细胞群体包含至少约40％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞。在一些情况下，细胞群体包含至多约15％的ISL1阳性、NKX6.1阴性细胞。在一些情况下，组合物包含：(a)至少约20％的表达C肽和NKX6.1的细胞；(b)至少约60％的表达CHGA的细胞；以及(c)至多约20％的表达Cdx2的细胞，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，组合物包含至多约45％的表达VMAT1的细胞，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，组合物还包含表观遗传修饰化合物。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括一种或多种DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些情况下，与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触的所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。在一些情况下，DZNep的浓度为至少约0.5μM。在一些情况下，DZNep的浓度为约1μM。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。在一些情况下，所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一些情况下，所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。在一些情况下，HDAC抑制剂是KD5170。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包含HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括DZNep和KD5170。在一些情况下，所述组合物还包含选自以下的试剂：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。在组合物的一些情况下，(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。在一些情况下，所述组合物包含选自以下的试剂：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。
在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含胰腺祖细胞和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂或组蛋白甲基转移酶抑制剂中的至少一种。
在一些情况下，所述组合物进一步包含内分泌细胞。在所述组合物的一些情况下，所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一些情况下，所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。在一些情况下，HDAC抑制剂是KD5170。在一些情况下，组合物中KD5170的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。在一些情况下，KD5170的浓度为至少0.5μM。在一些情况下，KD5170的浓度为约1μM。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些情况下，组合物中DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。在一些情况下，DZNep的浓度为至少0.5μM。在一些情况下，DZNep的浓度为约1μM。在一些情况下，所述HDAC抑制剂是KD5170，且所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些情况下，所述组合物是体外组合物。在一些情况下，所述组合物还包含选自以下的试剂：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。在一些情况下，(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。在一些情况下，所述组合物进一步包含选自以下的试剂：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。
在一些方面，本文提供了一种方法，其包括：使包含胰腺祖细胞或其前体的细胞群体与组蛋白甲基转移酶抑制剂接触，并产生包含内分泌细胞的细胞群体；以及使包含内分泌细胞的所述细胞群体成熟，以获得至少一种胰腺β细胞，所述胰腺β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
在一些情况下，所述方法包括使所述细胞群体与选自以下的试剂接触：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。在一些情况下，(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。在一些情况下，所述方法包括使所述细胞群体与选自以下的试剂接触：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。在一些情况下，所述方法进一步包括使所述细胞群体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂接触。在一些情况下，HDAC抑制剂是KD5170。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些情况下，与未接触所述组蛋白甲基转移酶抑制剂的相应内分泌细胞群体相比，与所述组蛋白甲基转移酶抑制剂的所述接触得到包含所述内分泌细胞的群体，并且所述群体具有增加比例的嗜铬粒蛋白A阳性(CHGA+)细胞或增加比例的C肽阳性和NKX6.1阳性(C-PEP、NKX6.1+)细胞。在一些情况下，与未接触所述组蛋白甲基转移酶抑制剂的相应内分泌细胞群体相比，与所述组蛋白甲基转移酶抑制剂的所述接触得到包含所述内分泌细胞的群体，并且所述群体具有降低比例的表达VMAT或Cdx2的细胞。在一些情况下，所述胰腺祖细胞或其前体中的所述至少一个细胞表达Pdx1和NKX6.1。在一些情况下，所述方法进一步包括在体外分化多个干细胞以获得包含所述胰腺祖细胞或其前体的所述细胞群体。
在一些方面，本文提供根据本文提供的任何方法产生的胰腺β细胞。
在一些方面，本文提供了一种方法，其包括：(a)使Pdx1阴性、NKX6.1阴性的原始肠管细胞的群体与骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子接触，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体；以及(b)使包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞群体与表观遗传修饰化合物接触，并产生包含内分泌细胞的细胞群体。
在一些情况下，BMP信号传导途径抑制剂包括DMH-1、其衍生物、类似物或变体。在一些情况下，与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述DMH-1的浓度为约0.01μM至约10μM、约0.05μM至约5μM、约0.1μM至约1μM或约0.15μM至约0.5μM。在一些情况下，与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述DMH-1的浓度为约0.25μMDMH-1。在一些情况下，来自TGF-β超家族的生长因子包含激活素A。在一些情况下，与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述激活素A的浓度为约0.5ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约2ng/mL至约50ng/mL或约5ng/mL至约30ng/mL。在一些情况下，与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述激活素A的浓度为至少约5ng/mL或至少约10ng/mL激活素A。在一些情况下，与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述激活素A的浓度为约20ng/mL激活素A。在一些情况下，使Pdx1阴性、NKX6.1阴性的原始肠管细胞的所述群体的所述接触还包括与选自以下的试剂接触：来自FGF家族的生长因子、SHH途径抑制剂、RA信号传导途径激活剂、蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括选自以下的化合物：DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂和溴结构域抑制剂。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些情况下，与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触的所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。在一些情况下，DZNep的浓度为至少约0.5μM。在一些情况下，DZNep的浓度为约1μM。在一些情况下，所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。在一些情况下，所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一些情况下，所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。在一些情况下，HDAC抑制剂是KD5170。在一些情况下，所述方法在体外进行。在一些情况下，所述方法进一步包括使包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞的所述群体与选自以下的试剂接触：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。在一些情况下，(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。在一些情况下，所述方法包括使包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述群体与选自以下的试剂接触：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。在一些情况下，接触为至少三天。在一些情况下，所述接触包括使包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述群体与所述表观遗传修饰化合物接触超过三天的时间段，并且在所述时间段的前三天与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触之后，从所述EGF家族中去除所述SHH途径抑制剂、所述RA信号传导途径激活剂或所述生长因子。在一些情况下，接触为至少五天。在一些情况下，接触为约七天。在一些情况下，包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞的所述细胞群体包含至多约10％的表达Cdx2的细胞，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，与未接触所述骨骼形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的所述生长因子相应细胞群体相比，包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞群体包含较少比例的表达Cdx2的细胞。在一些情况下，包含内分泌细胞的所述细胞群体包含至少约40％的表达ISL1和NKX6.1的细胞，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，与所述骨骼形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的所述生长因子未进行所述接触的相应细胞群体相比，包含内分泌细胞的所述细胞群体包含更高比例的表达ISL1和NKX6.1的细胞。在一些情况下，包含内分泌细胞的细胞群体包含至多约15％的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，与未所述接触所述骨骼形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的所述生长因子未进行所述接触的相应细胞群体相比，包含内分泌细胞的所述细胞群体包含较少比例的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞。在一些情况下，所述方法进一步包括冷冻保存包含内分泌细胞的所述细胞群体。在一些情况下，包含内分泌细胞的所述细胞群体是细胞簇，并且所述方法进一步包括：(a)从所述细胞簇解离多个细胞；以及(b)在重聚培养基中培养来自(a)的所述多个细胞，并使得所述多个细胞的至少部分形成第二细胞簇。在一些情况下，解离不包括使多个细胞经历流式细胞术。在一些情况下，重聚培养基是无血清的。在一些情况下，重聚培养基不包含外源性分化因子。在一些情况下，该方法还包括在体外使内分泌细胞成熟，以获得至少一种胰腺β细胞，所述胰腺β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，所述成熟在无血清培养基中进行。在一些情况下，所述成熟在无异种培养基中进行。在一些情况下，所述成熟在不包含外源性分化因子的培养基中进行。在一些情况下，所述成熟在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行。在一些情况下，所述HSA以约0.1％至约5％、约0.5％至约2％的浓度存在。在一些情况下，所述HSA以约1％的浓度存在。
在一些情况下，本文提供的方法包括一种方法，其包括：(a)通过使所述多能干细胞与来自TGF-β超家族的生长因子和WNT信号传导途径激活剂接触，将群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；(b)通过使所述定形内胚层细胞与来自FGF家族的生长因子接触，将至少一些所述定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；(c)通过使所述原始肠管细胞与ROCK抑制剂、来自FGF家族的生长因子、BMP信号传导途径抑制剂、PKC激活剂、视黄酸信号传导途径激活剂、SHH传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子接触，将至少一些所述原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞；(d)通过使所述Pdx1阳性胰腺祖细胞与ROCK抑制剂、来自TGFβ超家族的生长因子、来自FGF家族的生长因子、RA信号传导途径激活剂和SHH传导途径抑制剂接触，将至少一些所述Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdxl阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞；以及(e)通过使所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞与TGF-β信号传导途径抑制剂、来自EGF家族的生长因子、RA信号传导途径激活剂、SHH传导途径抑制剂、TH信号传导途径激活剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、ROCK抑制剂、BMP信号传导途径抑制剂和表观遗传修饰化合物接触，将至少一些所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞分化为包含至少一种NKX6.1+和C肽+细胞的细胞群体。
在一些方面，本文提供了包含根据本文提供的任何方法产生的内分泌细胞的细胞群体。在一些方面，本文提供了包含根据本文提供的任何方法产生的SC-β细胞的细胞群体。
在一些方面，本文提供了一种方法，其包括：将包含内分泌细胞的体外细胞群体暴露于约100rads至约100,000rads的剂量下的辐照约1min至约60min的时间段。
在一些方面，本文提供了一种减少细胞增殖的方法，其包括将包括干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、胰腺祖细胞或内分泌细胞的细胞群体暴露于辐照下，其中所述辐照导致细胞群体与未受辐照的相应细胞群体相比具有降低的增殖能力。
在一些情况下，将所述细胞群体暴露于约100rads至约50,000rads、约100rads至约25,000rads、约100rads至约10,000rads、约250rads至约25,000rads、约500rads至约25,000rads、约1,000rads至约25,000rads、约2,500rads至约25,000rads、约5,000rads至约25,000rads或约10,000rads至约15,000rads的辐照下。在一些情况下，将所述细胞群体暴露于约10,000rads的辐照下。在一些情况下，将所述细胞群体暴露于辐照约1分钟至约55分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约45分钟、约1分钟至约40分钟、约1分钟至约35分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约25分钟、约1分钟至约20分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约5分钟、约10分钟至约55分钟、约15分钟至约55分钟、约20分钟至约55分钟、约25分钟至约55分钟、约30分钟至约55分钟、约20分钟至约40分钟或约25分钟到约35分钟。在一些情况下，将所述细胞群体暴露于辐照约30分钟。在一些情况下，所述辐照包括电离辐照。在一些情况下，所述电离辐照包括γ射线、x射线、紫外线辐照、α射线、β射线或中子射线。在一些情况下，与没有经受所述辐照的相应细胞簇相比，所述辐照导致细胞群体具有降低的增殖。在一些情况下，所述细胞群体包括直径为约50μM至约500μM、约50μM至约300μM、约50μM至约200μM、约50μM至约150μM、约600μM至约150μM、约700μM至约150μM、约80μM至约150μM或约60μM至约100μM的第二细胞簇。在一些情况下，所述方法进一步包括：(a)从所述第一细胞簇解离多个细胞；以及(b)在重聚培养基中培养来自(a)的所述多个细胞，并使得所述多个细胞的至少部分形成第二细胞簇。在一些情况下，解离不包括使多个细胞经历流式细胞术。在一些情况下，所述第一细胞簇是通过解离第三细胞簇并培养从所述第三细胞簇解离的细胞以形成所述第一细胞簇而获得的。在一些情况下，使所述细胞簇在所述辐照之前冷冻保存，其中所述方法还包括在所述辐照之前解冻所述冷冻保存的细胞簇。在一些情况下，使所述细胞簇在经受所述辐照的同时冷冻保存。在一些情况下，方法进一步包括在辐照后解冻所述冷冻保存的细胞簇并分化至少一些所述内分泌细胞。在一些情况下，所述方法进一步包括通过在体外分化胰腺祖细胞或其前体来获得包含所述内分泌细胞的所述细胞群体。在一些情况下，所述方法进一步包括在体外分化干细胞，从而产生包含所述内分泌细胞的所述细胞群体。在一些情况下，所述方法进一步包括在体外使至少一些所述内分泌细胞成熟为胰腺β细胞，从而产生细胞群体comp。在一些情况下，所述方法进一步包括将所述胰腺β细胞植入需要其的受试者中。在一些情况下，所述植入的胰腺β细胞经配置用于在至少约50天、60天、70天、80天、90天或更长时间内控制所述受试者的血糖水平。
在一些方面，本文提供的细胞群体包括根据本文所述的任何辐照方法产生的内分泌细胞。在一些方面，本文提供了包含根据本文所述的任何辐照方法产生的胰腺β细胞的细胞群体。
在一些方面，本文提供了一种方法，其包括：将胰腺祖细胞或其前体的群体与包含至少一种表观遗传修饰化合物的组合物接触，其中与未接触至少一种表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中表达VMAT或Cdx2的细胞比例降低。
在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包括一种或多种DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些实施方案中，组合物中DZNep的浓度大于0.1μM。在一些实施方案中，DZNep的浓度为至少0.5μM。在一些实施方案中，DZNep的浓度为约1μM。在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是KD5170、MC1568或TMP195中的至少一种。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是KD5170。在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包含HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包含DZNep和KD5170。
在一些实施方案中，在本文提供的方法中，表达VMAT的细胞中的至少一个是INS-。在一些实施方案中，胰腺祖细胞群体中的至少一些细胞分化为PH细胞群体。在一些实施方案中，与未接触至少一种表观遗传修饰化合物的内分泌细胞的相应群体相比，内分泌细胞群体中增加比例的细胞是NKX6.1-或ChromA+。在一些实施方案中，增加比例的细胞中的至少一个细胞是NKX6.1-和ChromA+。在一些实施方案中，胰腺祖细胞群体中的至少一些细胞分化为β细胞群体。在一些实施方案中，β细胞是干细胞衍生的β(SC-β)细胞。在一些实施方案中，β细胞表达C-PEP和NKX6-1。在一些实施方案中，β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
在一些实施方案中，本文所述的方法的组合物包含β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN或星形孢菌素中的至少一种。在一些实施方案中，接触为至少三天。在一些实施方案中，接触为至少五天。在一些实施方案中，接触为约七天。
在一些实施方案中，胰腺祖细胞群体中的至少一个胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1中的至少一个。在一些实施方案中，内分泌细胞群体中的至少一个内分泌细胞表达CHGA。
本文提供了通过本文所述的任何方法产生的内分泌细胞。
本文提供了包含胰腺祖细胞、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂和任选地内分泌细胞的组合物。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是KD5170、MC1568或TMP195中的至少一种。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是KD5170。在一些实施方案中，组合物中KD5170的浓度为至少0.1μM。在一些实施方案中，KD5170的浓度为至少0.5μM。在一些实施方案中，KD5170的浓度为约1μM。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些实施方案中，DZNep的浓度为至少0.1μM。在一些实施方案中，DZNep的浓度为至少0.5μM。在一些实施方案中，DZNep的浓度为约1μM。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是KD5170，且所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些实施方案中，所述组合物是体外组合物。在一些实施方案中，组合物还包含β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN或星形孢菌素中的至少一种。
本文提供了一种方法，其包括使胰腺祖细胞或其前体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂和组蛋白甲基转移酶抑制剂接触，其中所述接触诱导胰腺祖细胞的分化。在一些实施方案中，胰腺祖细胞分化为β细胞。在一些实施方案中，β细胞是干细胞衍生的β(SC-β)细胞。在一些实施方案中，C-PEP和NKX6-1。在一些实施方案中，β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是KD5170、MC1568或TMP195中的至少一种。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是KD5170。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是KD5170，且所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些实施方案中，所述方法在体外进行。
本文提供了一种方法，其包括使胰腺祖细胞或其前体与足以导致细胞分化的量的KD5170接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用组蛋白甲基转移酶抑制剂使胰腺祖细胞收缩。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些实施方案中，胰腺祖细胞分化为内分泌细胞。在一些实施方案中，胰腺祖细胞分化为β细胞。在一些实施方案中，β细胞是干细胞衍生的β(SC-β)细胞。在一些实施方案中，β细胞表达C-PEP和NKX6-1。在一些实施方案中，β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
本文提供了一种方法，其包括：(a)在体外分化多个干细胞以获得包含胰腺祖细胞或其前体的细胞群体；(b)使细胞群体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂体外接触以产生至少一个内分泌细胞；以及(c)在体外使内分泌细胞成熟以获得至少一个SC-β细胞。在一些实施方案中，干细胞是人多能干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使细胞群体与β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN或星形孢菌素中的至少一种接触。在一些实施方案中，SC-β细胞表达C-PEP和NKX6-1。在一些实施方案中，SC-β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用组蛋白甲基转移酶抑制剂使细胞群体收缩。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是KD5170。
本文提供了一种方法，其包括在体外使包含胰腺祖细胞或其前体的细胞群体与足以产生内分泌细胞的量的组蛋白甲基转移酶抑制剂接触；以及在体外使所述内分泌细胞成熟，以获得至少一种SC-β细胞，所述胰腺β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在体外分化多个干细胞以获得包含所述胰腺祖细胞或其前体的细胞群体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使细胞群体与β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN或星形孢菌素中的至少一种接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述细胞群体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂接触。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是KD5170。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
本文提供了一种用于从细胞群体中选择靶细胞的方法，其包括(i)使靶细胞与刺激性化合物接触，其中所述接触诱导靶细胞的可选择的标志物定位于靶细胞的细胞表面；以及(ii)基于可选择的标志物在细胞表面的定位来选择靶细胞。在一些实施方案中，可选择的标志物包括PSA-NCAM。在一些实施方案中，通过细胞分选来选择靶细胞。在一些实施方案中，所述选择包括当所述可选择的标志物位于靶细胞的表面上时使所述靶细胞的可选择的标志物与抗原结合多肽接触。在一些实施方案中，抗原结合多肽包含抗体。在一些实施方案中，抗原结合多肽结合PSA-NCAM。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用从细胞群体中至少一个细胞的细胞表面去除可选择的标志物的化合物处理细胞群体。在一些实施方案中，在使靶细胞与刺激性化合物接触之前，用化合物处理细胞群体。在一些实施方案中，化合物从至少一个细胞的细胞表面切割可选择的标志物。在一些实施方案中，化合物是酶。在一些实施方案中，化合物是内唾液酸酶。在一些实施方案中，内唾液酸酶是内神经氨酸苷酶(Endo-N)。在一些实施方案中，靶细胞是内分泌细胞。在一些实施方案中，刺激性化合物包含精氨酸或葡萄糖中的至少一种。在一些实施方案中，内分泌细胞是β细胞。在一些实施方案中，β细胞是SC-β细胞。在一些实施方案中，刺激性化合物包括异丙肾上腺素。在一些实施方案中，内分泌细胞是EC细胞。在一些实施方案中，当与刺激性化合物接触时，细胞群体中的一个或多个细胞不能将可选择的标志物定位于细胞表面。在一些实施方案中，刺激性化合物是葡萄糖或精氨酸中的至少一种，并且一个或多个细胞是EC细胞。在一些实施方案中，刺激性化合物是异丙肾上腺素，并且一个或多个细胞是β细胞。在一些实施方案中，选择靶细胞将靶细胞与细胞群体中的一个或多个细胞分离。
本文提供了一种方法，其包括：使胰腺祖细胞或其前体的群体与包含至少一种表观遗传修饰化合物的组合物接触，其中与未接触至少一种表观遗传修饰化合物的相应的胰腺祖细胞群体相比，所述接触导致胰岛细胞的比例增加。在一些实施方案中，胰岛细胞包含至少一个β细胞。在一些实施方案中，β细胞包括SC-β细胞。在一些实施方案中，SC-β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，胰岛细胞包含至少一个α细胞。在一些实施方案中，胰岛细胞包含δ细胞。在一些实施方案中，胰岛细胞包含多激素(PH)细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在体外分化多个干细胞以获得胰腺祖细胞或其前体的群体。在一些实施方案中，干细胞是人多能干细胞。在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包括一种或多种DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。在一些实施方案中，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一些实施方案中，组合物中DZNep的浓度大于0.1μM。在一些实施方案中，DZNep的浓度为至少0.5μM。在一些实施方案中，DZNep的浓度为约1μM。在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是KD5170、MC1568或TMP195中的至少一种。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是KD5170。在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包含HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种表观遗传修饰化合物包含DZNep和KD5170。
附图说明
本公开内容的特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1示出了3-去氮腺嘌呤A盐酸盐(DZNep)、GSK126、EPZ6438的化学结构。
图2示出了KD5170和MC1568的化学结构。
图3示出了甲基转移酶抑制剂的化学结构。
图4示出了DZNep类似物的化学结构。
图5是本文所述的分化阶段的总结。
图6是从hPSC定向分化为INS+细胞的示意图，包括如本文所述抑制第5阶段的组蛋白甲基化和脱乙酰化。DE：定形内胚层；PGT；原始肠管；PPT1；早期胰腺祖细胞；PPT2；PDX1+/NKX6.1+胰腺祖细胞；EN：NKX6.1/C肽+细胞；SC-β：干细胞衍生的β细胞。
图7示出了第5阶段细胞表达NGN3以引发干细胞(SC)胰岛细胞分化。
图8示出了在第5阶段中EZH2或HDAC的抑制增加了内分泌细胞和SC-β细胞。
图9示出了在第5阶段中EZH2和HDAC的组合抑制显著增加内分泌细胞。
图10示出了在第5阶段中EZH2和HDAC的组合抑制显著增加内分泌细胞。
图11示出了在第5阶段中EZH2和HDAC的组合抑制显著增加SCβ细胞。
图12示出了在第5阶段(n＝2)中增加的内分泌细胞。
图13示出了在第5阶段中，结合的EZH2和HDAC抑制增加了神经元素(neurogenin)3+祖细胞。
图14示出了DZNep优于其他EZH2抑制剂。
图15示出了KD5170优于其他HDAC抑制剂。
图16示出了在第5阶段中EZH2和HDAC的组合抑制增加了NKX6-1+祖细胞。
图17是在第5阶段中测试EZH2和HDAC抑制剂的实验概述。
图18是候选筛查设置的示意图。
图19示出了(VMAT1+INS-)EC群体的特异性减少。
图20示出了(NKX6.1-ChromA+)PH细胞的伴随增加。PH：多激素细胞。
图21示出了(NKX6.1+INS+)SC-β群体百分比不受影响。
图22示出了细胞表面标志物发现筛查的不同板。
图23示出了第5阶段的MACS标志物筛查。
图24示出了SC-β细胞标志物和MACS标志物筛查的示意图。
图25示出了基于PSA-NCAM微珠的分选富集靶细胞并减少SOX9+细胞。
图26示出了在PSA-NCAM分选之后剩余EC细胞(VMAT1+)。
图27示出了在Endo-N酶处理后，PSA-NCAM表达显著降低。Endo-N是一种内唾液酸酶，可快速地且特异性地降解具有α-2,8-键的线性唾液酸聚合物，其最小长度为7-9个残基，所述残基的特征是与NCAM相关的唾液酸残基。在生理条件下切割在NCAM上的PSA。
图28是使用PSA-NCAM微珠分选去除EC细胞的示意图。
图29示出了EC细胞可以来自分化过程早期指定的肠祖细胞。
图30示出了在第0阶段完成时的低OCT4百分比导致在随后阶段中较高的CDX2百分比。强大的分化需要高Oct4％。Sox17诱导的可变性即使在高Oct4％下也仍然存在。
图31是用于识别EC细胞分化抑制剂的基于化合物筛查的方法的示意图。
图32是在第5阶段细胞上筛查化合物的示意图。
图33示出了增殖细胞的辐照剂量依赖性减少。
图34示出了高剂量γ辐照对SC-胰岛的组成和功能没有显著影响。
图35示出了冷冻保存的SC-胰岛在经辐照60天后失去了控制BG的能力。
图36示出了与对照样品相比，经辐照样品中的β细胞数量。
图37示出了由植入的经辐照的mRA胰岛细胞维持的血糖对照。
图38示出了在所有具有辐照的SC-胰岛的动物中的血糖对照。
图39示出了根据本公开内容的用于将人多能干细胞分化为源自干细胞的胰腺β细胞的两个示例性方案(v11和v12)的示意图。
图40示出了与v11方案相比，v12方案在第5阶段生成了较高比例的表达ISL1和NKX6.1的细胞(ISL1阳性、NKX6.1阳性)和较低比例的ISL阴性、NKX6.1阴性细胞，在第4阶段生成了较低比例的CDX2阳性细胞。
图41示出了与v11方案相比，冷冻保存后通过v12方案产生的细胞簇具有更高的回收率。
图42示出了v11和v12方案生成了相当比例的SC-β细胞。
图43示出了v11和v12方案生成的细胞簇具有相当的GSIS应答和胰岛素含量。
图44总结了根据本文提供的方法在生物反应器中产生的示例性细胞群体分别响应于低葡萄糖(LG)、高葡萄糖(HG)和氯化钾(KCl)负荷的胰岛素释放性能，以及细胞群体的胰岛素含量。
具体实施方式
以下描述和实例详细阐述了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文所述的特定实施方案，因此可以有所变化。本领域技术人员将意识到，本公开内容存在许多变化和修改，这些变化和修改均包含在本发明的范围内。
所有术语旨在被理解为本领域技术人员将理解的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应当解释为限制所描述的主题。
尽管可以在单个实施方案的上下文中描述本公开内容的各种特征，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的上下文中描述本公开内容，但是本公开内容也可以在单个实施方案中实现。
以下定义是对本领域定义的补充，并且针对于本申请，并且不应归于任何相关或不相关的情况，例如，归于任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是任何与本文描述的那些相似或等价的方法和材料也可用于实践以测试公开内容。因此，本文所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的，而并非旨在限制。
定义
在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数。应当注意，如在说明书中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。
在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。本文所使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同形式可互换使用。这些术语可表示任何组合都是特别考虑的。仅出于说明性目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可表示“单独的A；单独的B；单独的C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。术语“或”可结合使用或分别使用，除非上下文明确地指示分别使用。
此外，术语“包括(including)”及其他形式(诸如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用是非限制性的。
说明书中提及的“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”是指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。
如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”(和任何形式的包含，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有”(和任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括”(和任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有”(和任何形式的含有，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包含性或开放性的，并且不排除其他未提及的元素或方法步骤。考虑到本说明书中讨论的任何实施方案可以关于本公开内容的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本公开内容的组合物可用于实现本公开内容的方法。
如本文所用，涉及参考数值的术语“约”及其语法等同物可包括该数值自身和该数值正或负10％的值的范围。
术语“约”或“近似”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，例如，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个标准偏差内或者大于1个标准偏差。或者，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。在另一实例中，量“约10”包括10和从9到11的任何量。在又一实例中，关于参考数值的术语“约”还可包括该数值正负10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。或者，特别是对于生物系统或过程而言，该术语“约”可以意指在值的一个数量级以内，优选在值的5倍以内，并且更优选在值的2倍以内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意指在该特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，术语“糖尿病”及其语法等同物可以指特征在于长时间高血糖水平的疾病。例如，如本文所用，术语“糖尿病”及其语法等同物可以指糖尿病的所有或任何类型，包括但不限于，1型糖尿病、2型糖尿病、囊性纤维化相关糖尿病、外科手术性糖尿病、妊娠糖尿病和线粒体糖尿病。在一些情况下，糖尿病可以是遗传性糖尿病的形式。
如果没有特别说明，术语“内分泌细胞”可以指存在于生物体胰腺中的激素产生细胞，诸如“胰岛(islet)”、“胰岛细胞”、“胰岛等同物”、“胰岛样细胞”、“胰岛(pancreaticislet)”及其语法等同物。在实施方案中，可以将内分泌细胞与胰腺祖细胞或前体区分。胰岛细胞可以包括不同类型的细胞，包括但不限于，胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺F细胞和/或胰腺ε细胞。胰岛细胞还可以指一组细胞、细胞簇等。
术语“祖细胞”和“前体”细胞在本文中互换使用，并且指相对于可以通过分化产生的细胞具有更原始的细胞表型的细胞(例如，与完全分化的细胞相比，其处于发育途径或进展的较早步骤)。通常，祖细胞也可以具有显著的或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生多种不同的分化细胞类型或单一分化的细胞类型，这取决于发育途径和细胞在其中发育和分化的环境。
与胰岛素阳性内分泌细胞相关的术语“其前体”可以指当在适合于将前体细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的条件下培养时能够分化为胰岛素阳性内分泌细胞的任何细胞，包括例如多能(pluripotent)干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、胰腺祖细胞或内分泌祖细胞。
如本文所用，术语“外分泌细胞”可以指外分泌腺的细胞，所述外分泌腺即通过管道释放其分泌物的腺。在特定的实施方案中，外分泌细胞可以指胰腺外分泌细胞，其是可以产生分泌到小肠中的酶的胰腺细胞。这些酶可帮助消化通过胃肠道的食物。胰腺外分泌细胞也被称为Langerhans胰岛，其可以分泌两种激素、胰岛素和胰高血糖素。胰腺外分泌细胞可以是几种细胞类型中的一种；α-2细胞(可产生激素胰高血糖素)；或β细胞(可产生激素胰岛素)；以及α-1细胞(可产生调节剂促生长素抑制素)。如本文所用，术语非胰岛素产生的外分泌细胞可以指α-2细胞或α-1细胞。术语胰腺外分泌细胞包括“胰腺内分泌细胞”，其可以指产生分泌到血流中的激素(例如，胰岛素(由β细胞产生)、胰高血糖素(由α-2细胞产生)、促生长素抑制素(由δ细胞产生)和胰腺多肽(由F细胞产生)的胰腺细胞。
术语“干细胞衍生的β细胞”、“SC-β细胞”、“功能性β细胞”、“功能性胰腺β细胞”、“成熟SC-β细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺β细胞的标志物(例如，PDX-1或NKX6.1)、表达胰岛素并显示内源性成熟β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)应答特性的细胞(例如，非天然胰腺β细胞)。在一些实施方案中，本文使用的术语“SC-β细胞”和“非天然β细胞”是可互换的。在一些实施方案中，“SC-β细胞”包括成熟的胰腺细胞。应当理解，SC-β细胞不需要衍生自干细胞(例如，直接地)，因为本公开内容的方法能够使用任何细胞作为起点(例如，可以使用胚胎干细胞、诱导多能干细胞、祖细胞、部分重编程的体细胞(例如，已被部分重编程为诱导多能干细胞与其衍生自的体细胞之间的中间状态的体细胞)、专能(multipotent)细胞、全能细胞、任何前述细胞的转分化形式，等等，因此本发明并非旨在以这种方式进行限制)从任何胰岛素阳性内分泌细胞或其前体衍生出SC-β细胞。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出对多种葡萄糖负荷(例如，至少一次、至少两次或至少三次或更多次顺序的葡萄糖负荷)的应答。在一些实施方案中，该应答类似于内源性胰岛(例如，人胰岛)对多次葡萄糖负荷的应答。在一些实施方案中，SC-β细胞的形态类似于内源性β细胞的形态。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出类似于内源性β细胞的GSIS应答的体外GSIS应答。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出类似于内源性β细胞的GSIS应答的体内GSIS应答。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出类似于内源性β细胞的GSIS应答的体外GSIS应答和体内GSIS应答。可以在将SC-β细胞移植到宿主(例如，人或动物)的两周内观察到SC-β细胞的GSIS应答。在一些实施方案中，SC-β细胞将胰岛素包装在分泌颗粒内。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出封装的结晶胰岛素颗粒。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于1.1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于2的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞响应于细胞因子表现出细胞因子诱导的凋亡。在一些实施方案中，响应于已知的抗糖尿病药物(例如，促分泌素)增强SC-β细胞的胰岛素分泌。在一些实施方案中，SC-β细胞是单激素的。在一些实施方案中，SC-β细胞不异常地共表达其他激素，诸如胰高血糖素、促生长素抑制素或胰多肽。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出低复制速率。在一些实施方案中，SC-β细胞响应于葡萄糖而增加细胞内Ca2+。
如本文所用，术语“胰岛素产生细胞”及其语法等同物指从分泌胰岛素的胰腺祖细胞或其前体分化的细胞。胰岛素产生细胞可以包括如本文所述的术语胰腺β细胞，以及以组成型或诱导型方式合成(例如，转录胰岛素基因、翻译胰岛素原mRNA和将胰岛素原mRNA修饰为胰岛素蛋白)、表达(例如，表现出胰岛素基因携带的表型性状)或分泌(将胰岛素释放到细胞外间隙中)胰岛素的胰腺β样细胞。胰岛素产生细胞群体，例如根据本公开内容的方法通过将胰岛素阳性内分泌细胞或其前体分化为SC-β细胞而产生的胰岛素产生细胞群体可以是胰腺β细胞或β样细胞(例如，具有内源性β细胞特征的至少一种或至少两种)并且表现出类似于内源性成体β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)应答的细胞)。通过例如本文公开的方法产生的胰岛素产生细胞群体可以包含成熟胰腺β细胞或SC-β细胞，并且还可以包含非胰岛素产生细胞(例如，具有细胞样表型的细胞，但它们不产生或分泌胰岛素)。
术语“胰岛素阳性β样细胞”、“胰岛素阳性内分泌细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺β细胞的标志物并且也表达胰岛素，但缺乏内源性β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)应答特性的细胞(例如，胰腺内分泌细胞)。
术语“β细胞标志物”是指但不限于在胰腺β细胞中特异性地表达或存在的蛋白质、肽、核酸、蛋白质和核酸的多态性、剪接变体、蛋白质或核酸的片段、元素和其他分析物。示例性的β细胞标志物包括但不限于胰腺和十二指肠同源异型框1(Pdx1)多肽、胰岛素、c肽、糊精、E-钙粘着蛋白、Hnf3β、PCI/3、B2、Nkx2.2、GLUT2、PC2、ZnT-8、ISL1、Pax6、Pax4、NeuroD、1Inf1b、Hnf-6、Hnf-3β和MafA，以及在Zhang等人，Diabetes.50(10):2231-6(2001)中描述的那些。在一些实施方案中，β细胞标志物是核3细胞标志物。在一些实施方案中，β细胞标志物是Pdx1或PH3。
术语“胰腺内分泌标志物”可以指但不限于在胰腺内分泌细胞中特异性表达或存在的蛋白质、肽、核酸、蛋白质和核酸的多态性、剪接变体、蛋白质或核酸的片段、元素和其他分析物。示例性的胰腺内分泌细胞标志物包括但不限于Ngn-3、NeuroD和Islet-1。
术语“胰腺祖细胞”、“胰腺内分泌祖细胞”、“胰腺前体”、“胰腺内分泌前体”及其语法等同物在本文中可互换使用，并且可以指能够成为能够形成胰腺内分泌细胞、胰腺外分泌细胞或胰管细胞的胰腺激素表达细胞的干细胞。这些细胞定型于分化为至少一种类型的胰腺细胞，例如产生胰岛素的β细胞；产生胰高血糖素的α细胞；产生促生长素抑制素的δ细胞(或D细胞)；和/或产生胰多肽的F细胞。这样的细胞可以表达以下标志物中的至少一种：NGN3、NKX2.2、NeuroD、ISL-1、Pax4、Pax6或ARX。
如本文所用，术语“Pdx1阳性胰腺祖细胞”可以指这样的细胞，其为具有分化为SC-β细胞(诸如胰腺β细胞)的能力的胰腺内胚层(PE)细胞。Pdx1阳性胰腺祖细胞表达标志物Pdx1。其他标志物包括但不限于Cdcp1或Ptf1a或HNF6或NRx2.2。可以通过技术人员已知的任何方法，如使用抗Pdx1抗体的免疫化学或定量RT-PCR来评估Pdx1的表达。在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞缺乏NKX6.1的表达。在一些情况下，由于Pdx1阳性胰腺祖细胞缺乏NKX6.1的表达，因此也可以称为Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞。在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞也可称为“胰腺前肠内胚层细胞”。
如本文所用，术语“Pdx1阳性、NKX6-1阳性胰腺祖细胞”可以指这样的细胞，其为具有分化为胰岛素产生细胞(诸如胰腺β细胞)的能力的胰腺内胚层(PE)细胞。Pdx1阳性、NKX6-1阳性胰腺祖细胞表达标志物Pdx1和NKX6-1。其他标志物包括但不限于Cdcp1或Ptf1a或HNF6或NRx2.2。可以通过技术人员已知的任何方法，如使用抗NKX6-1抗体的免疫化学或定量RT-PCR来评估NKX6-1的表达。如本文所用，术语“NKX6.1”和“NKX6-1”是等同的并且可互换。在一些情况下，Pdx1阳性、NKX6-1阳性的胰腺祖细胞也可以称为“胰腺前肠前体细胞”。
如本文所用，术语“Ngn3阳性内分泌祖细胞”可以指表达转录因子Neurogenin-3(Ngn3)的胰腺内分泌细胞的前体。祖细胞比专能干细胞分化程度更高，并且仅能分化为几种细胞类型。特别地，Ngn3阳性内分泌祖细胞具有分化为五种胰腺内分泌细胞类型(α、β、δ、ε和PP)的能力。可以通过技术人员已知的任何方法，如使用抗Ngn3抗体的免疫化学或定量RT-PCR来评估Ngn3的表达。
术语“NeuroD”和“NeuroD1”可互换使用，并且确定在胰腺内分泌祖细胞中表达的蛋白质以及编码该蛋白质的基因。
术语“可选择的标记物”是指基因、RNA或蛋白质，当其表达时，赋予细胞可选择的表型，例如对细胞毒性剂或细胞抑制剂的抗性(例如，抗生素抗性)、营养原型或特定蛋白质的表达，其可用作区分表达该蛋白质的细胞和不表达该蛋白质的细胞的基础。本文所用的术语“可选择的标志物”可以指基因或基因的表达产物，例如编码的蛋白质。在一些实施方案中，相对于不表达或以显著较低水平表达的细胞，可选择的标志物赋予表达它的细胞增殖和/或存活优势。当细胞维持在某些条件下，即“选择性条件”时，通常发生这种增殖和/或存活优势。为了确保有效的选择，细胞群体可以在一定条件下保持足够长的时间，使得不表达标志物的细胞不增殖和/或不存活，并从群体中消除，或者它们的数量减少到仅占群体的非常小的一部分。通过将细胞群体保持在选择性条件下，从而大量或完全消除不表达标志物的细胞，来选择表达赋予增殖和/或存活优势的标志物的细胞的过程在本文中被称为“阳性选择”，并且该标志物被称为“对阳性选择有用”。阴性选择和可用于阴性选择的标志物在本文所述的某些方法中也令人感兴趣。相对于不表达标志物或以显著较低水平表达标记物的细胞，这种标志物的表达对表达标志物的细胞赋予增殖和/或存活劣势(或者，换句话说，不表达标志物的细胞相对于表达标志物的细胞具有增殖和/或存活优势)。因此，当在选择条件下维持足够长的时间时，可以从细胞群体中很大程度上或完全消除表达标志物的细胞。
术语“表观遗传学”是指不涉及DNA序列改变的基因功能的可遗传改变。表观遗传学最常表示影响基因活性和表达的染色体变化，但也可用于描述并非源自基因组修饰的任何可遗传表型变化。这种对细胞和生理表型性状的影响可能是由外部或环境因素引起的，或者是正常发育程序的一部分。表观遗传学也可以指基因组在功能上的相关改变，而不涉及核苷酸序列的改变。产生这种变化的机制的实例是DNA甲基化和组蛋白修饰，每一种都改变基因的表达方式而不会改变基础的DNA序列。基因表达可通过附着于DNA沉默区的阻遏蛋白的作用来控制。这些表观遗传变化可通过细胞分裂持续到细胞生命的整个过程，也可持续多代，即使它们不涉及生物体基础DNA序列的变化。真核生物学中表观遗传学变化的一个实例是细胞分化过程。在形态发生过程中，全能干细胞成为各种多能细胞，继而又可以变成完全分化的细胞。
术语“表观遗传修饰化合物”是指可以使表观遗传改变基因的化合物，即改变基因表达而不改变DNA序列。表观遗传学变化可以帮助确定基因是打开还是关闭，并可以影响某些细胞(例如β细胞)中蛋白质的产生。表观遗传修饰(例如DNA甲基化和组蛋白修饰)改变DNA的可及性和染色质结构，从而调节基因表达的模式。这些过程对于成年生物体中不同细胞谱系的正常发育和分化至关重要。它们可以通过外源性影响进行修饰，因此，可以促进或导致表型或病理表型的环境改变。重要的是，表观遗传修饰在多能性基因的调节中起着至关重要的作用，多能性基因在分化过程中失活。非限制性的示例性表观遗传修饰化合物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、溴结构域抑制剂或其任何组合。
术语“分化的细胞”或其语法等同物是指在其天然形式下并非多能(如该术语在本文所定义的)的任何原始细胞。换句话说，术语“分化的细胞”可以指在细胞分化过程中衍生自特化程度较低的细胞类型的细胞(例如，干细胞，如诱导多能干细胞)的特化程度较高的细胞类型的细胞。不希望受限于理论，多能干细胞在正常个体发育过程中可以首先分化为能够形成胰腺细胞的内胚层细胞和其他内胚层细胞类型。内胚层细胞的进一步分化导致胰腺途径，其中约98％的细胞变为外分泌、导管或基质细胞，而约2％的细胞变为内分泌细胞。早期内分泌细胞是胰岛祖细胞，其可随后进一步分化为分泌胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素或胰多肽的胰岛素产生细胞(例如，功能性内分泌细胞)。内胚层细胞也可以分化为其他内胚层起源的细胞，例如，肺、肝、肠、胸腺等等起源的细胞。
如本文所用，术语“体细胞”可以指形成生物体的身体的任何细胞，与种系细胞相反。在哺乳动物中，种系细胞(也称为“配子”)是精子和卵子，它们在受精过程中融合以产生称为合子的细胞，整个哺乳动物的胚胎都由其发育而来。哺乳动物体内的所有其他细胞类型(除了精子和卵子、形成它们的细胞(配子体)和未分化的干细胞)都是体细胞：内部器官、皮肤、骨骼、血液和结缔组织均由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎体细胞”，是指不存在于胚胎中或不从胚胎中获得并且不由这样的细胞在体外增殖引起的体细胞。在一些实施方案中，体细胞是“成体体细胞”，是指存在于除胚胎或胎儿以外的生物体中或从中获得的细胞，或者从这样的细胞在体外增殖获得的细胞。除非另有说明，否则用于将至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体转化为胰岛素产生、葡萄糖响应性细胞的方法可以在体内和体外进行(其中当至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体存在于受试者体内时在体内实践，并且使用维持在培养物中的分离的至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体在体外实践)。
如本文所用，术语“成体细胞”可以指在胚胎发育后在整个身体中发现的细胞。
如本文所用，术语“内胚层细胞”可以指在非常早期的胚胎中来自三个主要生殖细胞层之一的细胞(其他两个生殖细胞层是中胚层和外胚层)。内胚层是这三层的最内层。内胚层细胞首先分化产生胚胎肠，然后再分化产生呼吸道和消化道(例如肠)的内衬、肝和胰腺。
如本文所用，术语“内胚层起源的细胞”可以指从内胚层细胞发育或分化的任何细胞。例如，内胚层起源的细胞包括肝、肺、胰腺、胸腺、肠、胃和甲状腺的细胞。不希望受理论的束缚，肝和胰腺祖细胞(也称为胰祖细胞)是由胚胎前肠中的内胚层细胞发育而来的。特化后不久，肝和胰腺祖细胞迅速获得明显不同的细胞功能和再生能力。这些变化由在脊椎动物中高度保守的诱导信号和遗传调节因子所引起。在肝衰竭和I型糖尿病的治疗中对肝细胞和胰腺β细胞的强烈需求激起了人们对器官发育和再生的兴趣。在多种模式生物和人类中的研究表明，进化上保守的诱导信号和转录因子网络引发肝和胰腺细胞的分化，并为如何促进肝细胞和β细胞从多种干细胞和祖细胞类型的分化提供指导。
如本文所用，术语“定形内胚层”可以指从内胚层细胞分化并且可以分化为SC-β细胞(例如，胰腺β细胞)的细胞。定形内胚层细胞表达标志物Sox17。定形内胚层细胞特征性的其他标志物包括但不限于：MIXL2、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CXCR4、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99、CMKOR1和CRIP1。特别地，本文的定形内胚层细胞表达Sox17，并且在一些实施方案中表达Sox17和HNF3B，并且不表达显著水平的GATA4、SPARC、APF或DAB。定形内胚层细胞对标志物Pdx1不呈阳性(例如，它们为Pdx1阴性)。定形内胚层细胞具有分化为细胞(包括肝、肺、胰腺、胸腺、肠、胃和甲状腺的细胞)的能力。可以通过技术人员已知的任何方法，如使用抗Sox17抗体的免疫化学或定量RT-PCR来评估Sox17和定形内胚层的其他标志物的表达。
术语“胰腺内胚层”可以指能够分化为多种胰腺谱系(包括胰腺β细胞)但不再具有分化为非胰腺谱系的能力的内胚层起源的细胞。
如本文所用，术语“原始肠管细胞”或“肠管细胞”可以指从内胚层细胞分化并且可以分化为SC-β细胞(例如，胰腺β细胞)的细胞。原始肠管细胞表达以下标志物中的至少一种：HNP1-β、HNF3-β或HNF4-α。原始肠管细胞具有分化为细胞(包括肺、肝、胰腺、胃和肠的细胞)的能力。可以通过技术人员已知的任何方法，如使用例如抗HNF1-β抗体的免疫化学来评估HNF1-β和原始肠管的其他标志物的表达。
如本文所用，术语“干细胞”可以指能够增殖并产生更多的具有产生大量母细胞的能力的祖细胞的未分化的细胞，这些母细胞又可以产生分化的或可分化的子细胞。子细胞本身可以被诱导增殖并产生子代，该子代随后分化为一种或多种成熟细胞类型，同时还保留一种或多种具有亲本发育潜力的细胞。术语“干细胞”可以指祖细胞的子集，其在特定情况下具有分化为特化或分化程度更高的表型的能力或潜力，并且在某些情况下保留增殖但基本不分化的能力。在一个实施方案中，术语干细胞通常是指天然存在的母细胞，其后代(子代)通常在不同的方向上通过分化(例如，通过获得完全独立的特征)而进行特化，这发生在胚胎细胞和组织的逐步多样化中。细胞分化是通常通过许多细胞分裂而发生的复杂过程。分化的细胞可以衍生自专能细胞，该专能细胞本身也衍生自专能细胞，等等。虽然这些多能细胞中的每一种都可以被认为是干细胞，但是每种细胞所能产生的细胞类型的范围可能相差很大。一些分化的细胞也具有产生更大发展潜力的细胞的能力。这样的能力可以是天然的，也可以在用各种因子治疗时由人工诱导。在许多生物学情况下，干细胞也是“专能的”，因为它们可以产生不止一种不同细胞类型的子代，但这不是“干性(stemness)”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分，在本文中的使用是必不可少的。从理论上讲，自我更新可以通过两种主要机制之一发生。干细胞可以不对称分裂，一个子代保持干细胞状态，另一个子代表现出一些不同的其他特定功能和表型。或者，群体中的一些干细胞可以对称地分为两个干细胞，从而整体上维持群体中的一些干细胞，而群体中的其他细胞仅产生分化的子代。从形式上讲，开始于干细胞的细胞可能会走向分化的表型，然后“逆转”并重新表达干细胞表型，这在术语上通常被本领域普通技术人员称为“去分化”或“重编程”或“反分化”。如本文所用，术语“多能干细胞”包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞，等等。
如本文所用，术语“多能”可以指在不同条件下具有分化为一种以上的分化的细胞类型，并且优选地分化为所有三个生殖细胞层特征性的细胞类型的能力的细胞。多能细胞的特征主要在于其分化为一种以上的细胞类型，优选分化为所有三个胚层的能力，例如使用裸鼠畸胎瘤形成测定。多能性还可以通过胚胎干(ES)细胞标志物的表达来证明，尽管多能性的优选测试是证明分化为三个胚层中的每一个的细胞的能力。应当注意，简单地培养这样的细胞本身并不能使其具有多能性。相对于原始细胞亲代，重编程的多能细胞(例如，iPS细胞，如该术语在本文所定义的)也具有延长传代而不丧失生长潜力的能力的特征，而原始细胞亲代在培养中通常仅具有有限的分裂数。
如本文所用，术语“iPS细胞”和“诱导多能干细胞”可互换使用，并且可以指从非多能细胞，通常是成体体细胞人工衍生(例如，诱导或通过完全逆转)的多能干细胞，例如，通过诱导一个或多个基因的强制表达而人工衍生。
术语“表型”可以指在特定的一组环境条件和因素下定义细胞或生物体的一个或多个总生物学特性，而与实际基因型无关。
术语“受试者”、“患者”或“个体”在本文可互换使用，并且可以指动物，例如，可以从其获得细胞的人类和/或向其提供使用本文所述的细胞的治疗(包括预防性治疗)的人类。对于特定动物如人类受试者特定的那些感染、状况或疾病状态的治疗，术语受试者可以指该特定动物。在本文可互换使用的“非人类动物”和“非人类哺乳动物”包括哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、奶牛、猪和非人类灵长类动物。术语“受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受试者是哺乳动物，诸如人类，或其他哺乳动物，诸如家养的哺乳动物例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物例如奶牛、绵羊、猪等。“有需要的患者”或“有需要的受试者”在本文被称为被诊断患有或怀疑患有疾病或病症的患者，该疾病或病症例如但不限于糖尿病。
本文所用的“施用”可以指向患者或受试者提供本文所述的一种或多种组合物。举例而言而非限制，组合物施用(例如，注射)可通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌肉内(i.m.)注射进行。可以使用一种或多种这样的途径。肠胃外施用可以是例如通过团注或通过随时间逐渐灌注。备选地或同时地，可以通过口服途径施用。另外，还可以通过手术沉积细胞的丸剂或团剂或者定位医疗装置而施用。在实施方案中，本公开内容的组合物可包含表达本文所述的核酸序列的工程化细胞或宿主细胞，或包含至少一种本文所述的核酸序列的载体，其量有效治疗或预防增殖性病症。药物组合物可包含如本文所述的细胞群体，组合一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。
应用于分离的细胞的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”及其语法等同物包括使细胞经历任何种类的过程或条件，或者对细胞进行任何种类的操作或程序。在应用于受试者时，这些术语指向个体提供医学或手术关注、护理或管理。个体通常生病或受伤，或者相对于普通人群而言患病的风险增加，并且需要这样的关注、护理或管理。
如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”可以指向受试者施用有效量的组合物，使得受试者的疾病的至少一种症状减少或疾病改善，例如，有益或理想的临床结果。为了本公开内容的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减少、疾病的状态稳定(例如，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻、以及缓解(例如，局部的或总体的)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。因此，本领域技术人员意识到，治疗可以改善疾病状况，但可能不完全治愈所述疾病。如本文所用，术语“治疗”包括预防。或者，如果疾病进展减少或停止，则治疗是“有效的”。“治疗”还意在与不接受治疗的情况下预期的生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括已经被诊断患有心脏病况的人，以及由于遗传易感性或其他因素(诸如体重、饮食和健康)而可能发展出心脏病况的人。
术语“治疗有效量”、“治疗量”或其语法等同物可以指在必要的剂量和时间段内有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及本文所述组合物在一个或多个受试者中引发期望的反应的能力而变化。待施用的本公开内容的组合物的精确量可以由医师在考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异的情况下确定。
或者，将本文所述的一种或多种组合物向患者或受试者施用的药理学和/或生理学作用可以是“预防性的”，即该作用完全或部分地防止疾病或其症状。“预防有效量”可以指在必要的剂量和时间段内有效实现期望的预防结果(例如，防止疾病发作)的量。
[01]全文公开的一些数值被称为例如“X为至少或至少约100；或200[或任何数目]。”该数值包括该数目自身和下列所有：
i)X为至少100；
ii)X为至少200；
iii)X为至少约100；以及
iv)X为至少约200。
[02]通过全文公开的数值考虑到所有这些不同组合。除非另有明确相反指示，否则所有公开的数值均应以此方式进行解释，无论该数值是指施用治疗剂还是指天、月、年、重量、剂量等。
[03]全文公开的范围有时被称为例如“X在或在约第1天至第2天；或第2天至第3天[或任何数值范围]施用。”该范围包括该数目自身(例如，该范围的端点)和下列所有：
i)X在第1天与第2天之间施用；
ii)X在第2天与第3天之间施用；
iii)X在约第1天与第2天之间施用；
iv)X在约第2天与第3天之间施用；
v)X在第1天与约第2天之间施用；
vi)X在第2天与约第3天之间施用；
vii)X在约第1天与约第2天之间施用；以及
viii)X在约第2天与约第3天之间施用。
通过全文公开的范围考虑到所有这些不同组合。除非另有明确相反指示，否则所有公开的范围均应以此方式进行解释，无论该数值是指施用治疗剂还是指天、月、年、重量、剂量等。
I.概述
在各方面，本公开内容提供了分化胰腺祖细胞的组合物和方法。本文提供的组合物和方法可提供具有高纯度的胰腺β细胞、高胰岛素含量和可类似于天然胰腺β细胞或天然胰岛的优异葡萄糖依赖性胰岛素分泌应答的胰腺β细胞、细胞群体或细胞簇。
在一些方面，本文提供了一种方法，其包括：将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中嗜铬粒蛋白A阳性(CHGA+)细胞或C肽阳性和NKX6.1阳性(C-PEP+、NKX6.1+)细胞的比例增加。
在一些方面，本公开内容提供了一种方法，其包括：将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中表达VMAT或Cdx2的细胞比例降低。
在一些方面，本公开内容提供了包含细胞群体的组合物，其中所述细胞群体包含：(a)至少约20％的表达C肽和NKX6.1的细胞；(b)至少约60％的表达CHGA的细胞；(c)至多约20％的表达Cdx2的细胞；或者(d)至多约45％的表达VMAT1的细胞，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，组合物包含：(a)至少约20％的表达C肽和NKX6.1的细胞；(b)至少约60％的表达CHGA的细胞；以及(c)至多约20％的表达Cdx2的细胞，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，组合物还包含至多约45％表达VMAT1的细胞，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，组合物还包含表观遗传修饰化合物。
在一些方面，本公开内容提供了包含细胞群体的组合物，所述细胞群体包含至少约30％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞和至多约20％的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞，如通过流式细胞术测量。根据权利要求34所述的组合物，其中所述细胞群体包含至少约35％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞。在一些情况下，细胞群体包含至少约40％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞。在一些情况下，细胞群体包含至多约15％的ISL1阳性、NKX6.1阴性细胞。在一些情况下，组合物还包含表观遗传修饰化合物。
在一些方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含胰腺祖细胞和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂或组蛋白甲基转移酶抑制剂中的至少一种。在一些方面，本公开内容提供了一种方法，其包括：使包含胰腺祖细胞或其前体的细胞群体与组蛋白甲基转移酶抑制剂接触，并产生包含内分泌细胞的细胞群体；以及使包含内分泌细胞的细胞群体成熟，以获得至少一种胰腺β细胞，所述胰腺β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，成熟步骤在将包含内分泌细胞的细胞群体植入受试者体内后进行。在一些情况下，成熟步骤在体外进行。
在一些方面，本公开内容提供了一种方法，其包括：(a)使Pdx1阴性、NKX6.1阴性的原始肠管细胞的群体与骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子接触，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体；以及(b)使包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞群体与表观遗传修饰化合物接触，并产生包含内分泌细胞的细胞群体。
在一些情况下，本文提供的方法包括一种方法，其包括：(a)通过使所述多能干细胞与来自TGF-β超家族的生长因子和WNT信号传导途径激活剂接触，将群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；(b)通过使所述定形内胚层细胞与来自FGF家族的生长因子接触，将至少一些所述定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；(c)通过使所述原始肠管细胞与ROCK抑制剂、来自FGF家族的生长因子、BMP信号传导途径抑制剂、PKC激活剂、视黄酸信号传导途径激活剂、SHH传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子接触，将至少一些所述原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞；(d)通过使所述Pdx1阳性胰腺祖细胞与ROCK抑制剂、来自TGFβ超家族的生长因子、来自FGF家族的生长因子、RA信号传导途径激活剂和SHH传导途径抑制剂接触，将至少一些所述Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdxl阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞；以及(e)通过使所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞与TGF-β信号传导途径抑制剂、来自EGF家族的生长因子、RA信号传导途径激活剂、SHH传导途径抑制剂、TH信号传导途径激活剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、ROCK抑制剂、BMP信号传导途径抑制剂和表观遗传修饰化合物接触，将至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞分化为包含至少一种NKX6.1+和C肽+细胞的细胞群体。
在一些方面，本公开内容提供了经辐照细胞以减少增殖的方法。在一些情况下，所述方法包括将包含内分泌细胞的体外细胞群体暴露于约100rads至约100,000rads的剂量下的辐照约1min至约60min的时间段。
在一些情况下，减少细胞增殖的方法包括将包括干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、胰腺祖细胞或内分泌细胞的细胞群体暴露于辐照下，其中所述辐照产生与未受辐射的相应细胞群体相比具有降低的增殖能力的细胞群体。
II.生成内分泌细胞的方法
在各方面，本公开内容涉及从胰腺祖细胞或前体产生内分泌细胞的组合物和方法。在美国专利申请公开号US20150240212和US20150218522中记载了产生内分泌细胞和干细胞以提供至少一种SC-β细胞的某些示例性详细方案，该专利申请各自通过引用整体并入本文。
在一些情况下，一种用于产生第一内分泌细胞群体的方法包括将胰腺祖细胞或其前体的群体与包含至少一种表观遗传修饰化合物的第一组合物接触，以产生第一内分泌细胞群体，其中与使用缺少至少一种表观遗传修饰化合物的第二组合物产生的第二内分泌细胞群体相比，第一内分泌细胞群体中表达VMAT+或Cdx2+的细胞比例降低。在一些实施方案中，在第5阶段添加表观遗传修饰化合物(图5-6)，其可通过以下方式诱导内分泌细胞改变内分泌细胞的比例：(1)减少由VMAT1标志物(图19)或Cdx2标记的内分泌群体；(2)增加向α细胞和其他非β细胞胰岛细胞赋予命运的细胞比例(图20)；以及(3)增加β细胞在组合物中的比例(图8)。
在一些实施方案中，内分泌细胞的第一群体是VMAT+和INS-。在一些实施方案中，胰腺祖细胞群体分化为PH细胞群体。在一些实施方案中，与使用缺少表观遗传修饰化合物的第二组合物产生的第二内分泌细胞群体相比，第一内分泌细胞群体中增加比例的细胞是NKX6.1-或ChromA+。在一些实施方案中，增加比例的细胞是NKX6.1-和ChromA+。在一些实施方案中，胰腺祖细胞的第一群体分化为β细胞群体。在一些实施方案中，β细胞是干细胞衍生的β(SC-β)细胞。在一些实施方案中，β细胞表达C-PEP和NKX6-1。在一些实施方案中，β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，本文所述的方法在体外进行。
在一些情况下，第一组合物和第二组合物包含以下至少一种：i)SHH途径抑制剂，ii)RA信号传导途径激活剂，iii)γ-分泌酶抑制剂，iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，v)蛋白激酶抑制剂，vi)BMP信号传导途径抑制剂，vii)TGF-β信号传导途径抑制剂，viii)甲状腺激素信号传导途径激动剂，或ix)ROCK抑制剂。在一些实施方案中，第一组合物和第二组合物包含β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、星形孢菌素或其任何组合中的至少一种。在一些情况下，第一组合物和第二组合物均包含β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。
本文提供了一种产生内分泌细胞的方法，其包括使胰腺祖细胞或其前体与组蛋白甲基转移酶抑制剂接触，其中所述接触诱导胰腺祖细胞分化为内分泌细胞。在一些情况下，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂包含DZNep。在一些情况下，所述方法进一步包括使胰腺祖细胞或其前体与以下至少一种接触：i)SHH途径抑制剂，ii)RA信号传导途径激活剂，iii)γ-分泌酶抑制剂，iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，v)蛋白激酶抑制剂，vi)BMP信号传导途径抑制剂，vii)TGF-β信号传导途径抑制剂，viii)甲状腺激素信号传导途径激动剂，或ix)ROCK抑制剂。
本文提供了一种产生内分泌细胞的方法，其包括使胰腺祖细胞或其前体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂和组蛋白甲基转移酶抑制剂接触，其中所述接触诱导胰腺祖细胞分化为内分泌细胞。在一些情况下，所述方法进一步包括使胰腺祖细胞或其前体与以下至少一种接触：i)SHH途径抑制剂，ii)RA信号传导途径激活剂，iii)γ-分泌酶抑制剂，iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，v)蛋白激酶抑制剂，vi)BMP信号传导途径抑制剂，vii)TGF-β信号传导途径抑制剂，viii)甲状腺激素信号传导途径激动剂，或ix)ROCK抑制剂。
在一些实施方案中，内分泌细胞分化为β细胞。在一些实施方案中，β细胞是干细胞衍生的β(SC-β)细胞。在一些实施方案中，β细胞表达C-PEP和NKX6-1。在一些实施方案中，β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
本文提供了产生内分泌细胞的方法，其包括使胰腺祖细胞或其前体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂接触，其中所述HDAC抑制剂为KD5170。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用组蛋白甲基转移酶抑制剂使胰腺祖细胞收缩。在一些实施方案中，内分泌细胞表达CHGA。在一些实施方案中，内分泌细胞分化为β细胞。在一些实施方案中，β细胞是干细胞衍生的β(SC-β)细胞。在一些实施方案中，β细胞表达C-PEP和NKX6-1。在一些实施方案中，β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
本文还提供了包含细胞群体和培养基的组合物，其中所述细胞包含胰腺祖细胞，并且其中所述培养基包含组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂和组蛋白甲基转移酶抑制剂。在一些实施方案中，当与培养基接触时，胰腺祖细胞被诱导分化为内分泌细胞。
非限制性示例性表观遗传修饰化合物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、溴结构域抑制剂或其任何组合。
在一个实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是zeste同源物2(EZH2)的增强子的抑制剂。EZH2是一种组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶。EZH2抑制剂的非限制性实例包括3-去氮腺嘌呤A(DZNep)、EPZ6438、EPZ005687(S-腺苷甲硫氨酸(SAM)竞争性抑制剂)、EI1、GSK126和UNC1999。DZNep抑制S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的水解，SAH是所有蛋白质甲基转移酶的一种基于产物的抑制剂，导致SAH的细胞浓度升高，进而抑制EZH2。DZNep对EZH2没有特异性，也抑制其他DNA甲基转移酶。GSK126是一种SAM竞争性的EZH2抑制剂，其选择性是EZH1的150倍。UNC1999是GSK126的类似物，其选择性低于其对应物GSK126。
在一个实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一个实施方案中，HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一个实施方案中，HDAC抑制剂是KD5170(基于巯基酮的HDAC抑制剂)、MC1568(IIa类HDAC抑制剂)、TMP195(IIa类HDAC抑制剂)或其任何组合。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是伏林司他(vorinostat)、罗米地新(romidepsin)(Istodax)、西达本胺、帕比司他(panobinostat)(farydak)、贝林司他(belinostat)(PXD101)、帕比司他(LBH589)、丙戊酸、莫塞替诺特(MGCD0103)、艾贝司他(PCI-24781)、恩替诺特(MS-275)、SB939、瑞诺司他(4SC-201)、吉维诺特(ITF2357)、quisinostat(JNJ-26481585)、HBI-8000、(苯甲酰胺HDI)、kevetrin、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、莱菔硫烷或其任何变体。
在一些情况下，组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如DZNep)的浓度可以为0.01至10μM或约0.01至10μM。例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如，DZNep)的浓度可以为约0.01至1、0.1至1、0.25至1、0.5至1、1至5；或1至10μM。组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如DZNep)的浓度可小于约：5、4、3、2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01μM。
在一些实施方案中，所述方法包括使胰腺祖细胞或前体与第一组合物或第二组合物接触至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天或至少20天。在一些实施方案中，所述方法包括使胰腺祖细胞或前体与第一组合物或第二组合物接触约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或约20天。
在一些实施方案中，胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6.1中的至少一个。在一些实施方案中，胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6.1。在一些实施方案中，内分泌细胞表达CHGA。
表观遗传修饰
表观遗传学可以指不是由于DNA序列改变而引起的可遗传改变。相反，表观遗传修饰(例如DNA甲基化和组蛋白修饰)可改变DNA的可及性和染色质结构，从而调节基因表达的模式。这些过程对于成年生物体中不同细胞谱系的正常发育和分化至关重要。它们可以通过外源性影响进行修饰，因此，可以促进或导致表型或病理表型的环境改变。重要的是，表观遗传程序设计在多能性基因的调节中起着至关重要的作用，多能性基因在分化过程中失活。
染色质是与细胞核中蛋白质相关的染色体DNA的复合物。染色质中的DNA组装在组蛋白周围，以称为核小体的单位计。核小体可具有与组蛋白的八聚体核相关的147个碱基对的DNA，由两个被两个H2A-H2B二聚体包围的H3-H4组蛋白二聚体组成。N末端组蛋白尾部可以从核小体突出到核内腔。H1组蛋白可以与位于核小体之间的接头DNA缔合。核小体的间距决定了染色质的结构，该染色质的结构大致可分为异染色质和常染色质。染色质的结构和对转录机制的基因可及性可以通过修饰DNA和组蛋白尾部来调节。
在分化的哺乳动物细胞中，DNA中发现的主要表观遗传修饰可以是甲基基团共价连接到CpG二核苷酸序列中胞嘧啶残基的C5位置(DNA甲基化)的表观遗传修饰。在未分化的干细胞中，除了CpG中的胞嘧啶外，胞嘧啶也可以被甲基化，并且特别是非CpG胞嘧啶的甲基化对于胚胎干细胞的基因调控至关重要。然而，CpG甲基化可能是确定抑制重复元件和转座子转录的重要机制，并且在印迹和X染色体失活中也可以发挥关键作用。通过CpG甲基化使转录基因沉默还可以通过在非表达细胞中抑制一些组织特异性基因的表达来限制其在发育和分化过程中的表达。
CpG甲基化可以通过多种机制抑制转录。特定CpG处甲基的存在可能会直接阻止DNA的识别和某些转录因子的结合。或者，其他因子可以优先结合甲基化的DNA，从而阻止转录因子的进入。例如，MeCP2和其他家族成员可以与甲基CpG结合，并通过募集组蛋白修饰蛋白(例如组蛋白脱乙酰基酶(HDAC))来促进转录抑制。随后，组蛋白去乙酰化可促进染色质凝聚，进一步抑制转录。这一系列事件说明了DNA甲基化和某些组蛋白修饰如何共同起作用，以促进转录打开或关闭状态的基因经受表观遗传修饰。
在全新DNA甲基化及其维持中涉及DNA甲基转移酶(DNMT)家族。在胚胎发生过程中，可以通过DNMT3A和DNMT3B 15进行全新甲基化。普通表达的DNMT1可主要负责维持CpG甲基化的细胞水平。DNMT1可以在复合物中起作用，以识别半甲基化的DNA，并向复制过程中形成的非甲基化的子链上添加甲基基团。CpG的碱基配对可允许在随后的复制周期中相互保持甲基化。以这种方式，可以在细胞之间传递非遗传性状(DNA甲基化)，并由此影响基因表达。因此，甲基化可以被认为是长期的，相对稳定的表观遗传性状，其作用可以有助于维持细胞表型。
DNA甲基化可以促进某些组蛋白状态(例如脱乙酰化)的持久性，因此提供了一种使翻译后组蛋白修饰永久化的机制。可以通过多种方式(包括磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化)对组蛋白进行转录后修饰，以重组染色质。在这些组蛋白修饰中，H3和H4尾部赖氨酸残基的ε-氨基处的组蛋白乙酰化与促进转录高度一致。乙酰化的开放染色质结构还可以允许转录阻遏物的进入。例如，某些含溴结构域的因子(例如BRG1和Brd4)以乙酰化组蛋白为靶标，它们可以介导阻遏物(或激活剂)复合物的形成。乙酰化可通过识别和结合DNA序列特异性转录因子而靶向染色质区域，所述DNA序列特异性转录因子募集组蛋白乙酰转移酶(HAT)辅助因子的一个不断增长的家族，如CREB结合蛋白(CBP)和p300、MYST和GNAT。
组蛋白的去乙酰化可能与CpG甲基化和染色质的失活状态相关。有4类组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)，其成员能够使组蛋白和/或其他蛋白质靶标脱乙酰化。这些调节蛋白本身可以收到乙酰化、磷酸化和糖基化的调节，这可能会影响它们的功能、亚细胞分布以及蛋白-蛋白缔合。与序列特异性DNA结合蛋白和共阻遏物复合物的相互作用可以以基因特异性方式将某些HDAC蛋白靶向组蛋白。
大多数组蛋白赖氨酸甲基转移酶可以具有SET同源结构域，这是一个庞大的蛋白质家族，可以根据其结构相似性分为7个亚家族。SET1家族成员可以通过甲基化H3K4特异性地培养活性染色质。其他组蛋白赖氨酸甲基转移酶家族可以甲基化几个组蛋白靶标。此外，这些甲基转移酶中的一些可以具有其他结构域，所述结构域指定与甲基化DNA或与其他蛋白质(例如CBP 39)结合。HDAC蛋白在人类中可包含18个成员的家族，并根据其大小、细胞定位、催化活性位点的数量以及与酵母HDAC蛋白的同源性分为四类。I类包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8。II类由六个HDAC蛋白组成，该蛋白进一步分为两个亚类。IIa类包括HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9，每个都包含一个催化活性位点。IIb类包括HDAC6和HDAC10，每个都包含两个活性位点，尽管只有HDAC6具有两个在催化上有活性的活性位点。基于系统发育分析，HDAC11是IV类的唯一成员。晶体学分析表明，I、II和IV类HDAC蛋白可以通过金属离子依赖性机制起作用。相比之下，称为乙酰化酶(sirtuins)(SIRT1-7)的III类HDAC蛋白可以通过与其他HDAC蛋白无关的NAD+依赖性机制起作用。在一个实施方案中，HDAC蛋白的HDAC抑制剂诱导细胞分化。在一个实施方案中，HDAC抑制剂上调与细胞分化相关的关键基因。
表观遗传修饰化合物
术语“表观遗传修饰化合物”可指可以使表观遗传改变基因的化合物，即改变基因表达而不改变DNA序列。表观遗传学变化可以帮助确定基因是打开还是关闭，并可以影响某些细胞(例如β细胞)中蛋白质的产生。表观遗传修饰(例如DNA甲基化和组蛋白修饰)可改变DNA的可及性和染色质结构，从而调节基因表达的模式。这些过程对于成年生物体中不同细胞谱系的正常发育和分化至关重要。它们可以通过外源性影响进行修饰，因此，可以促进或导致表型或病理表型的环境改变。重要的是，表观遗传修饰在多能性基因的调节中起着至关重要的作用，多能性基因在分化过程中失活。非限制性示例性表观遗传修饰化合物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、溴结构域抑制剂或其任何组合。
在一个实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是zeste同源物2(EZH2)的增强子的抑制剂。EZH2是一种组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶。可在本文提供的方法中使用的EZH2抑制剂的非限制性实例包括3-去氮腺嘌呤A(DZNep)、EPZ6438、EPZ005687(S-腺苷甲硫氨酸(SAM)竞争性抑制剂)、EI1、GSK126和UNC1999。DZNep可抑制S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的水解，SAH是所有蛋白质甲基转移酶的一种基于产物的抑制剂，导致SAH的细胞浓度升高，进而抑制EZH2。DZNep对EZH2可能没有特异性，并且还可抑制其他DNA甲基转移酶。GSK126是一种SAM竞争性的EZH2抑制剂，其选择性是EZH1的150倍。UNC1999是GSK126的类似物，其选择性低于其对应物GSK126。
在一个实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一个实施方案中，HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一个实施方案中，HDAC抑制剂是KD5170(基于巯基酮的HDAC抑制剂)、MC1568(IIa类HDAC抑制剂)、TMP195(IIa类HDAC抑制剂)或其任何组合。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是伏林司他、罗米地新(Istodax)、西达本胺、帕比司他(farydak)、贝林司他(PXD101)、帕比司他(LBH589)、丙戊酸、莫塞替诺特(MGCD0103)、艾贝司他(PCI-24781)、恩替诺特(MS-275)、SB939、瑞诺司他(4SC-201)、吉维司他(ITF2357)、quisinostat(JNJ-26481585)、HBI-8000、(苯甲酰胺HDI)、kevetrin、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、莱菔硫烷或其任何变体。
III.生成胰腺祖细胞的方法
一方面，本公开内容涉及将原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺β细胞的组合物和方法。在一些情况下，所述方法包括使原始肠管细胞与包含骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子的组合物接触。在一些情况下，组合物进一步包含一种或多种附加的分化因子，包括但不限于来自成纤维细胞生长因子(FGF)家族的生长因子、音猬(SHH)途径抑制剂、视黄酸(RA)信号传导途径激活剂、蛋白激酶C(PKC)激活剂和Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂。
在一些情况下，本文提供的方法包括通过使包含原始肠管细胞的细胞群体与包含BMP信号传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子的第一组合物接触，生成包含Pdx1阳性胰腺祖细胞的细胞群体或细胞簇，其中原始肠管细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些情况下，接触发生约1天、2天或3天。在一些情况下，接触发生约1天。在一些情况下，通过与包含BMP信号传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子的组合物接触，使原始肠管细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞。在一些情况下，生成步骤还包括通过使Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺细胞与包含一种或多种分化因子的第二组合物接触，使Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，所述分化因子包括但不限于来自TGF-β超家族的生长因子、来自FGF家族的生长因子、SHH途径抑制剂、RA信号传导途径激活剂和ROCK抑制剂。在一些情况下，第二组合物不包含BMP信号传导途径抑制剂。
在一些情况下，本文提供的方法可以通过使包含原始肠管细胞的细胞群体分化为包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体或细胞簇，获得包含至多约30％、至多约25％、至多约20％、至多约15％、至多约10％、至多约5％、至多约4％、至多约3％、至多约2％或至多约1％的CHGA阳性细胞的细胞群体或细胞簇。在一些情况下，本文提供的方法可以通过使包含原始肠管细胞的细胞群体分化为包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体或细胞簇，获得包含至多约25％、至多约20％、至多约15％或至多约10％的CDX2阳性细胞的细胞群体或细胞簇，如通过流式细胞术测量。在一些情况下，本文提供的方法可以通过使包含原始肠管细胞的细胞群体分化为包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体或细胞簇，获得包含至多约30％的CHGA阳性细胞和至多约30％的CDX2阳性细胞的细胞群体或细胞簇。在一些情况下，本文提供的方法可以通过使包含原始肠管细胞的细胞群体分化为包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体或细胞簇，获得包含至多约20％的CHGA阳性细胞和至多约5％的CDX2阳性细胞的细胞群体或细胞簇。在一些情况下，本文提供的方法可以通过使包含原始肠管细胞的细胞群体分化为包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体或细胞簇，获得包含至多约15％的CHGA阳性细胞和至多约3％的CDX2阳性细胞的细胞群体或细胞簇。
在一些情况下，本文提供的BMP信号传导途径抑制剂包括DMH-1、其衍生物、类似物或变体。在一些实施方案中，本文提供的BMP信号传导途径包括DMH-1。在一些实施方案中，所述方法包括使原始肠管细胞与约0.01μM至约10μM、约0.05μM至约5μM、约0.1μM至约1μM或约0.15μM至约0.5μM的DMH-1接触。在一些实施方案中，所述方法包括使原始肠管细胞与约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.42、0.45、0.48、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1、1.2、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2.0、4.0、6.0、8.0或10μM接触。在一些实施方案中，所述方法包括使原始肠管细胞与约0.25μM接触。在一些情况下，用于使原始肠管细胞分化的BMP信号传导途径抑制剂不包括LDN193189(本文也称为“LDN”)。
在一些情况下，本文提供的方法包括通过使包含原始肠管细胞的细胞群体与DMH-1或其衍生物、类似物或变体接触，生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体或细胞簇。
不希望受特定理论的束缚，在本文公开的方法的一些实施方案中，在使原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞的过程中，对BMP信号传导途径的抑制可有助于减少脱靶细胞，例如肠道谱系细胞或对CDX2基因表达呈阳性的细胞的生成。另一方面，在一些情况下，在使原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞或Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的过程中，II型受体介导的TGF-β信号传导途径的激活可有助于减少神经元素(Neurogenin)3(Ngn3)或嗜铬粒蛋白A(CHGA)的早期诱导，这在一些情况下可导致多激素细胞的生成，而不是成熟SC-β细胞的生成，在一些情况下，SC-β细胞是单激素的，例如仅分泌胰岛素，而不分泌其他胰激素如促生长激素抑制素或胰高血糖素。BMP信号传导途径和TGF-β信号传导途径之间可能存在串扰。在一些情况下，BMP信号传导途径的抑制剂可能具有副作用，例如，另外阻断II型受体介导的TGF-β信号传导途径。如图15所示，II型受体介导的TGF-β信号传导途径的抑制，例如通过选择性相对较低的BMP信号传导途径抑制剂LDN193189的抑制，可以导致早期NGN3/CHGA诱导，从而生成多激素细胞。不希望受某种理论的束缚，在一些情况下，高度选择性的BMP信号传导途径抑制剂例如DMH-1或其衍生物、类似物或变体的使用对II型受体介导的TGF-β信号传导途径可具有较小的抑制作用。在一些其他情况下，不希望受特定理论的束缚，与来自TGF-β超家族的生长因子和BMP信号传导途径抑制剂一起共同温育可以导致BMP信号传导途径的选择性抑制，同时维持II型受体介导的TGF-β信号传导途径的相对较高的激活水平。在一些情况下，例如，由于从原始肠管细胞分化的细胞中NGN3或CHGA的早期诱导，与来自TGF-β超家族的生长因子和BMP信号传导途径抑制剂一起共同温育导致脱靶细胞(例如，CDX2阳性细胞)的生成减少，以及多激素细胞的生成减少。
在一些方面，本公开内容提供了一种从Pdx1阳性胰腺祖细胞产生NKX6-1阳性胰腺祖细胞的方法，包括在促进细胞簇集的条件下，使包含Pdx1阳性胰腺祖细胞或前体的细胞群体与至少两种β细胞成熟因子接触至少五天，以诱导群体中至少一个Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为NKX6-1阳性胰腺祖细胞，其中NKX6-1阳性胰腺祖细胞表达NKX6-1，所述β细胞成熟因子包括：a)至少一种来自成纤维细胞生长因子(FGF)家族的生长因子，b)音猬途径抑制剂，和任选地c)低浓度的视黄酸(RA)信号传导途径激活剂。
在一些实施方案中，群体中至少10％的Pdx1阳性胰腺祖细胞经诱导分化为NKX6-1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，群体中至少95％的Pdx1阳性胰腺祖细胞经诱导分化为NKX6-1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，NKX6-1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1、NKX6-1和FoxA2。在一些实施方案中，Pdx1阳性胰腺祖细胞由选自胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的多能干细胞群体产生。
IV.干细胞和重编程
本文提供了干细胞用于产生SC-β细胞(例如，成熟胰腺β细胞或β样细胞)或其前体的用途。在实施方案中，可以使用与美国专利申请公开号US20150240212和US20150218522中描述的类似方案，用生殖细胞代替干细胞或与干细胞一起使用以提供至少一种SC-β细胞，该专利申请各自通过引用整体并入本文。合适的生殖细胞可以由例如末次月经期后约8-11周获取的人类胎儿物质中存在的原始生殖细胞制备。例如，示例性的生殖细胞制备方法描述于例如Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998和美国专利号6,090,622中。
本文提供了生成SC-β细胞(例如，胰腺β细胞)的组合物和方法。通常，至少一种SC-β细胞或其前体，例如根据本文公开的方法产生的胰腺祖细胞可以包含不同细胞的混合物或组合，例如，细胞如原始肠管细胞、Pdx1阳性胰腺祖细胞、Pdx1阳性、NKX6-1阳性胰腺祖细胞、Ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞(例如，β样细胞)和/或其他多能或干细胞等的混合物。
可以根据任何合适的培养方案来产生至少一种SC-β细胞或其前体，以使干细胞或多能细胞分化为期望的分化阶段。在一些实施方案中，通过在适于使至少一种多能细胞分化为至少一种SC-β细胞或其前体的条件下将至少一种多能细胞培养一段时间来产生至少一种SC-β细胞或其前体。
在一些实施方案中，至少一种SC-β细胞或其前体是基本上纯的SC-β细胞或其前体的群体。在一些实施方案中，SC-β细胞或其前体的群体包含多能细胞或分化的细胞的混合物。在一些实施方案中，SC-β细胞或其前体的群体基本上没有或缺少胚胎干细胞或多能细胞或iPS细胞。
在一些实施方案中，可以例如以组织活检例如皮肤活检从受试者分离体细胞，例如成纤维细胞，并重编程为诱导多能干细胞，以进一步分化从而产生用于本文所述的组合物和方法中的至少一种SC-β细胞或其前体。在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将体细胞例如成纤维细胞维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为SC-β细胞之前进行繁殖。
在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将至少一种SC-β细胞或其前体维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为SC-β细胞之前进行繁殖。
此外，至少一种SC-β细胞或其前体如胰腺祖细胞可以来自任何哺乳动物物种，其非限制性实例包括鼠、牛、猿、猪、马、绵羊或人细胞。为了清楚和简单起见，本文方法的描述是指哺乳动物的至少一种SC-β细胞或其前体，但是应当理解，本文所述的所有方法可以容易地应用于至少一种SC-β细胞或其前体的其他细胞类型。在一些实施方案中，至少一种SC-β细胞或其前体衍生自人类个体。
干细胞
本公开内容的实施方案可以涉及干细胞用于生成胰腺β细胞或其前体的用途。如本文所用，术语“干细胞”可以指具有自我更新和生成分化细胞类型的能力的细胞(例如，植物干细胞、脊椎动物干细胞)(Morrison等人，(1997)Cell 88:287-298)。在细胞个体发育的上下文中，形容词“分化的(differentiated)”或“分化的(differentiating)”是相对术语。“分化的细胞”可以是相对于与之相比的细胞，沿着发育途径进一步向下发展的细胞。因此，多能干细胞可以分化为谱系限制性祖细胞(例如，中胚层干细胞)，继而可以分化为进一步限制性的细胞(例如，神经元祖细胞)，这些细胞可以分化为终末阶段细胞(例如，终末分化的细胞，例如神经元、心肌细胞，等等)，它们在某些组织类型中具有特征性作用，并且可以保留或不保留进一步增殖的能力。干细胞可以通过特异性标志物(例如，蛋白质、RNA，等等)的存在和特异性标志物的不存在来表征。干细胞也可以通过体外功能测定和体内功能测定来鉴别，特别是与干细胞产生多种分化的后代的能力相关的测定。在实施方案中，宿主细胞是成体干细胞、体细胞干细胞、非胚胎干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、包括多能干细胞和滋养层干细胞。
感兴趣的干细胞，例如可以在本文提供的方法中使用的干细胞可以包括多能干细胞(PSC)。如本文所用，术语“多能干细胞”或“PSC”可以指能够产生生物体的所有细胞类型的干细胞。因此，PSC可以产生生物体所有胚层的细胞(例如，脊椎动物的内胚层、中胚层和外胚层)。多能细胞可以能够形成畸胎瘤并有助于活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织。植物的多能干细胞可以能够产生植物的所有细胞类型(例如，根、茎、叶等的细胞)。
本公开内容的实施方案可以涉及PSC用于生成胰腺β细胞或其前体的用途。动物的PSC可以通过多种不同方式获得。例如，胚胎干细胞(ESC)可以衍生自胚胎的内部细胞团(Thomson等人，Science.1998年11月6日；282(5391):1145-7)，而诱导多能干细胞(iPSC)可以衍生自体细胞(Takahashi等人，Cell.2007年11月30日；131(5):861-72；Takahashi等人，Nat Protoc.2007；2(12):3081-9；Yu等人，Science.2007年12月21日；318(5858):1917-20.Epub 2007年11月20日)。因为术语PSC可以指多能干细胞而不考虑它们的起源，所以术语PSC可以包括术语ESC和iPSC，以及术语胚胎生殖干细胞(EGSC)，其是PSC的另一个实例。PSC可以是已建立的细胞系的形式，它们可以直接从原始胚胎组织获得，或者可以衍生自体细胞。
本公开内容的实施方案可以涉及ESC用于生成胰腺β细胞或其前体的用途。“胚胎干细胞”(ESC)可以意指从胚胎，通常从胚泡的内细胞团分离的PSC。ESC细胞系在NIH人胚胎干细胞注册表中列出，例如hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03、hESBGN-04(BresaGen,Inc.)；HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(ES Cell International)；Miz-hES1(首尔大学MizMedi医院)；HSF-1、HSF-6(加州大学旧金山分校)；以及H1、H7、H9、H13、H14(威斯康辛校友研究基金会(WiCell研究所))。感兴趣的干细胞还包括来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，诸如恒河猴干细胞和狨猴干细胞。所述干细胞可以从任何哺乳动物物种获得，例如人、马、牛、猪、犬、猫、啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、灵长类动物，等等(Thomson等人，(1998)Science 282:1145；Thomson等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:7844；Thomson等人，(1996)Biol.Reprod.55:254；Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998))。在培养物，ESC可以作为具有大核质比、明确边界和突出核仁的扁平集落生长。此外，ESC可以表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和碱性磷酸酶，但不表达SSEA-1。生成和表征ESC细胞的方法的实例可见于，例如，美国专利号7,029,913、美国专利号5,843,780和美国专利号6,200,806，其各自整体并入本文。用于使未分化形式的hESC增殖的方法描述于WO 99/20741、WO 01/51616和WO 03/020920中，其各自整体并入本文。
“胚胎生殖干细胞”(EGSC)或“胚胎生殖细胞”或“EG细胞”可以意指衍生自生殖细胞和/或生殖细胞祖细胞的PSC，例如原始生殖细胞，例如可以变成精子和卵子的那些细胞。胚胎生殖细胞(EG细胞)被认为具有与上述胚胎干细胞相似的性质。生成和表征EG细胞的方法的实例可见于例如，美国专利号7,153,684；Matsui,Y.等人，(1992)Cell70:841；Shamblott,M.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:113；Shamblott,M.等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:13726；和Koshimizu,U.等人，(1996)Development,122:1235，其各自整体并入本文。
本公开内容的实施方案可以涉及iPSC用于生成胰腺β细胞或其前体的用途。“诱导多能干细胞”或“iPSC”可以意指衍生自非PSC的细胞的PSC(例如，衍生自相对于PSC分化了的细胞)。iPSC可以衍生自多种不同的细胞类型，包括终末分化的细胞。iPSC可以具有ES细胞样的形态，生长为具有大核质比、明确边界和突出核仁的扁平集落。此外，iPSC可以表达一种或多种本领域普通技术人员已知的关键多能性标志物，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42。生成和表征iPSC的方法的实例可见于例如美国专利公开号US20090047263、US20090068742、US20090191159、US20090227032、US20090246875和US20090304646，其各自整体并入本文。通常，为了生成iPSC，向体细胞提供本领域已知的重编程因子(例如，Oct4、SOX2、KLF4、MYC、Nanog、Lin28，等等)，以将体细胞重编程成为多能干细胞。
本公开内容的实施方案可以涉及体细胞用于生成胰腺β细胞或其前体的用途。“体细胞”可以意指在没有实验操作的情况下通常不产生生物体中所有类型的细胞的生物体中的任何细胞。换句话说，体细胞可以是已经充分分化的细胞，它们可能不天然地生成身体的所有三个胚层，例如外胚层、中胚层和内胚层的细胞。例如，体细胞可以包括神经元细胞和神经祖细胞，后者能够天然产生中枢神经系统的所有或一些细胞类型，但无法产生中胚层或内胚层谱系的细胞
在某些实例中，根据本文公开的方法，在暴露于至少一种分化因子或组合物之前，干细胞可以是未分化的(例如，细胞未定向至特定谱系)，而在其他实例中，可能期望在暴露于本文所述的至少一种分化因子或组合物之前，使干细胞分化为一种或多种中间细胞类型。例如，干细胞可显示未分化细胞的形态、生物学或物理特性，可用于将它们与胚胎或成体来源的分化细胞区分开。在一些实例中，未分化的细胞可以出现在具有高核/细胞质比率和突出核仁的细胞集落的二维显微镜视图中。干细胞可以是自身(例如，基本上不存在任何未分化的细胞)，也可以在分化的细胞存在下使用。在某些实例中，可以在合适的营养物和任选地其他细胞的存在下培养干细胞，使得该干细胞可以生长并任选地分化。例如，在培养物中可以存在胚胎成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，以帮助干细胞的生长。成纤维细胞可以存在于干细胞生长的一个阶段，但不一定存在于所有阶段。例如，可以在第一培养阶段将成纤维细胞添加到干细胞培养物，而在一个或多个随后的培养阶段不添加到干细胞培养物。
在本发明的所有方面中使用的干细胞可以是衍生自任何种类的组织(例如胚胎组织，诸如胎儿或胎儿前组织或成体组织)的任何细胞，该干细胞可以具有在适当条件下能够产生不同细胞类型的后代，例如所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)中的所有或至少一种的衍生物的特性。这些细胞类型可以以已建立的细胞系的形式提供，或者可以直接从原始胚胎组织获得并直接用于分化。包括在NIH人胚胎干细胞注册表中列出的细胞，例如hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03、hESBGN-04(BresaGen,Inc.)；HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(ES Cell International)；Miz-hES1(首尔大学MizMedi医院)；HSF-1、FISF-6(加州大学旧金山分校)；以及H1、H7、H9、H13、H14(威斯康辛校友研究基金会(WiCell研究所))。在一些实施方案中，用于化学诱导分化为成熟胰岛素阳性细胞的人干细胞或多能干细胞的来源不涉及破坏人胚胎。在一些实施方案中，用于化学诱导分化为成熟胰岛素阳性细胞的人干细胞或多能干细胞的来源不涉及破坏人胚胎。
在另一个实例中，可以从包括实体组织在内的组织分离干细胞。在一些实施方案中，该组织是皮肤、脂肪组织(例如，脂肪体)、肌肉组织、心脏组织。在其他实施方案中，组织是例如但不限于脐带血、胎盘、骨髓或软骨。
可以在本文提供的方法中使用的干细胞还可以包括各种类型的胚胎细胞，例如人胚胎干(hES)细胞，如Thomson等人,(1998)Science282:1145所述；来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，诸如恒河猴干细胞(Thomson等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844)；狨猴干细胞(Thomson等人(1996)Biol.Reprod.55:254)；和人胚胎生殖(hEG)细胞(Shambloft等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998))。谱系定型干细胞也可适用于本文提供的方法，该细胞诸如中胚层干细胞和其他早期生心细胞(参见Reyes等人，(2001)Blood 98:2615-2625；Eisenberg和Bader(1996)Circ Res.78(2):205-16；等等)。所述干细胞可以从任何哺乳动物物种获得，例如人、马、牛、猪、犬、猫、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、灵长类动物，等等。在一些实施方案中，对于用于本文公开的方法和组合物的多能细胞来源，人胚胎没有被破坏。在一些实施方案中，对于用于本文公开的方法和组合物的多能细胞来源，人胚胎没有被破坏。
为了本公开内容的目的，可以从哺乳动物供体收获来自内皮、肌肉和/或神经干细胞的合适来源的细胞的混合物。合适的来源是造血微环境。例如，可以从受试者中移取循环外周血，优选动员的(例如，募集的)。在实施方案中，干细胞可以是重编程干细胞，诸如衍生自体细胞或分化细胞的干细胞。在这样的实施方案中，去分化的干细胞可以是例如但不限于赘生性细胞、肿瘤细胞和癌细胞，或者备选地为诱导重编程细胞，诸如诱导多能干细胞或iPS细胞。
在一些实施方案中，本文所述的胰腺β细胞可以衍生自刺丝胞(trichocyte)、角质形成细胞、促性腺细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促甲状腺激素细胞、生长激素细胞、催乳素细胞、嗜铬细胞、滤泡旁细胞、球细胞、黑素细胞、痣细胞、梅克尔细胞、成牙本质细胞、成牙骨质细胞、角膜细胞、视网膜Muller细胞、视网膜色素上皮细胞、神经元、神经胶质(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞)、室管膜细胞、松果体细胞、肺细胞(例如，I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯形细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、胃主细胞、壁细胞、小凹细胞(foveolar cell)、K细胞、D细胞、I细胞、杯形细胞、帕内特细胞、肠细胞、微褶细胞、肝细胞、肝星状细胞(例如，来自中胚层的枯否细胞(Kupffer cell))、胆囊细胞、泡心细胞、胰腺星状细胞、胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺F细胞(例如，PP细胞)、胰腺ε细胞、甲状腺(例如，滤泡细胞)、甲状旁腺(例如，甲状旁腺主细胞)、嗜酸性细胞、尿道上皮细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、纤维细胞、成肌细胞、肌细胞、肌卫星细胞、腱细胞、心肌细胞、成脂肪细胞、脂肪细胞、cajal间质细胞、成血管细胞、内皮细胞、系膜细胞(例如，肾小球内系膜细胞和肾小球外系膜细胞)、肾小球旁细胞、致密斑细胞、基质细胞、间质细胞、特络细胞(telocyte)、简单上皮细胞、足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、塞托利细胞、莱迪希细胞、颗粒细胞、胚栓细胞、生殖细胞、精子、卵子、淋巴细胞、骨髓细胞、内皮祖细胞、内皮干细胞、成血管细胞、中胚层成血管细胞(mesoangioblast)、周细胞、壁细胞、脾细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突细胞、小噬细胞、白细胞)、滋养层干细胞或其任何组合中的一种或多种。
重编程
如本文所用，术语“重编程”可以指改变或逆转体细胞的分化状态的过程。在重编程之前，该细胞可以是部分分化的或是终末分化的。重编程可以包括将体细胞的分化状态完全逆转为多能细胞。分化的这种完全逆转可以产生诱导多能(iPS)细胞。如本文所用，重编程还可以包括细胞分化状态的部分逆转，例如逆转至专能状态，或者逆转至这样的体细胞，其既不多能也不专能，而是失去了其来源的分化细胞特征性的一个或多个特性的细胞，例如分化细胞直接重编程为不同的体细胞类型。重编程可以涉及在随着合子发育为成体的细胞分化过程中发生的核酸修饰(例如，甲基化)、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印记等可遗传模式中至少一些的改变(例如，逆转)。
如本文所用，术语“重编程因子”可以指与细胞“重编程”(即分化和/或去分化和/或转分化)相关的分子，使得细胞转化为不同的细胞类型或表型。重编程因子通常影响与细胞分化、去分化和/或转分化相关的基因的表达。转录因子是重编程因子的实例。
如本文所用，术语“分化”及其语法等同物可以指这样的过程，通过该过程，特化程度较低的细胞(例如，具有较高细胞潜能的较幼稚的细胞)变为特化程度较高的细胞类型(例如，具有较低细胞潜能的较不幼稚的细胞)；并且术语“去分化”可以指特化程度较高的细胞变为特化程度较低的细胞类型(例如，具有较高细胞潜能的较幼稚的细胞)的过程；术语“转分化”是指特定细胞类型的细胞在不显著改变其“细胞效能”或“幼稚”水平的情况下转化为另一种细胞类型的过程。不希望受理论的束缚，认为细胞在从一种谱系定向的细胞类型或终末分化的细胞类型转化为另一种谱系定向的细胞类型或终末分化的细胞类型时“转分化”，而没有显著改变其“细胞效能”或“幼稚”水平。
如本文所用，术语“细胞效能”应理解为是指细胞分化为不同谱系的细胞的能力。例如，多能细胞(例如干细胞)具有分化为三种胚层(即内胚层(胃内壁、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖道)或外胚层(表皮组织和神经系统))中任何一层的潜能，因此具有高细胞效能；专能细胞(例如某种类型的干细胞或诱导型干细胞)具有从多种但数量有限的谱系(例如造血干细胞、心脏干细胞或神经细胞)中产生细胞的能力，相比多能细胞具有更低的细胞潜能。致力于特定谱系或终末分化的细胞可能具有较低的细胞效能。本领域已知的转分化的具体实例包括例如成纤维细胞β细胞的转化或从胰腺外分泌细胞到β细胞的转化等。
因此，可以使细胞分化为更幼稚的细胞(例如，可以将终末分化的细胞分化为专能或多能的)；或者可以使该细胞去分化为较幼稚的细胞(例如，可以将专能或多能细胞分化为谱系定向细胞或终末分化细胞)。然而，在一个实施方案中，可以使细胞从一种细胞类型(或表型)转化或转分化为例如具有相似的细胞效能水平的另一种细胞类型(或表型)。因此，在本公开内容的一个实施方案中，本公开内容的诱导步骤可以重编程本公开内容的细胞以分化、去分化和/或转分化。在本公开内容一个实施方案中，本公开内容的诱导步骤可以重编程细胞以进行转分化。
重编程或诱导特定类型的细胞成为另一种类型细胞的方法，例如，使用一种或多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子通过分化、去分化和/或转分化，是本领域技术人员所熟知的。这种方法可依赖于编码与细胞重编程相关的一种或多种转录因子或其他多肽的遗传物质的引入。例如，已知Pdx1、Ngn3和MafA或其功能片段编码可以诱导本公开内容细胞的细胞分化、去分化和/或转分化的肽。在本领域技术人员已知的一些方法中，将由重编程基因(例如上述基因)编码的外源多肽(例如重组多肽)与细胞接触，以诱导例如本公开内容的细胞。本领域技术人员将理解，其他基因可以与细胞的重编程有关，并且编码这些基因(或其功能片段)和经编码的多肽的外源分子也被认为是多核苷酸或多肽重编程因子(例如多核苷酸或多肽会反过来影响与细胞重编程相关的另一个基因的表达水平)。例如，有研究表明，减少p53失活的外源性多核苷酸或多肽表观遗传基因沉默子的引入提高了诱导多能干细胞(iPSC)的效率。因此，编码表观遗传沉默子和可以直接或间接参与细胞重编程或提高细胞编程效率的其他基因或蛋白质的外源性多核苷酸或多肽将被认为构成外源性多核苷酸或多肽重编程因子。本领域技术人员将理解，存在其他影响细胞重编程的方法，如引入RNAi分子(或编码RNAi分子的遗传物质)，可以降低参与抑制细胞重编程的基因的表达。因此，任何与细胞重编程有关或增强细胞重编程的外源性多核苷酸分子或多肽分子应理解为本文所述的外源性多核苷酸或多肽重编程因子。
在本公开内容的一些实施方案中，该方法排除了非小分子的重编程因子的使用。但是，应当理解，所述方法可以利用“常规”组织培养组分，如培养基、血清、血清替代品、补充剂、抗生素等，诸如RPMI、肾上皮基础培养基(REBM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、MCDB131培养基、CMRL 1066培养基、F12、小牛血清(FCS)、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、GlutaMAXTM-1(二肽，L-丙氨酸-L-谷氨酰胺)、B27、肝素、黄体酮、腐胺、层粘连蛋白、烟酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、硒、乙醇胺、人表皮生长因子(hEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、氢化可的松、肾上腺素、normacin、青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素，等等。应当理解，这些典型的组织培养组分(以及组织培养中常规使用的其他类似组织培养成分)并不是用于本公开内容的目的的小分子重编程分子。这些组分不是本文定义的小分子和/或不是本文定义的重编程因子。
因此，在实施方案中，本公开内容不涉及具有一种或多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子的细胞的培养步骤。因此，在实施方案中，本公开内容的方法不涉及例如通过引入转座子、病毒转基因载体(诸如逆转录病毒载体)、质粒、mRNA、miRNA、肽或任何这些分子的片段(其涉及产生诱导β细胞，或诱导本公开内容的细胞分化、去分化和/或转分化)而引入一种或多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子。
即，在一个实施方案中，所述方法在不存在一种或多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子的情况下发生。因此，应当理解，在实施方案中，本公开内容的方法利用小分子(例如，HDAC抑制剂)来重编程细胞，而不添加多肽转录因子；与诱导分化、去分化和/或转分化具体相关的其他多肽因子；编码多肽转录因子的多核苷酸序列，编码与诱导分化、去分化和/或转分化具体相关的其他多肽因子的多核苷酸序列；mRNA；干扰RNA；微小RNA及其片段。
V.无异源培养基
在各方面，本公开内容涉及生成胰腺β细胞，例如SC-β细胞的方法，其包括在无异源培养基中使祖细胞(例如，干细胞，如iPSC细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、Pdx1阳性胰腺祖细胞、NKX6.1阳性胰腺祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞)分化。用于培养源自动物的细胞和/或细胞簇的无异源培养基可不具有来自其他动物的产物。在一些情况下，用于培养人细胞和/或细胞簇的无异源培养基可不具有来自任何非人动物的产物。例如，用于培养人细胞和/或细胞簇的无异源培养基可包含人血清白蛋白(HSA)或人血小板裂解物(PLT)，而不是胎牛血清(FBS)或牛血清白蛋白(BSA)。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过使祖细胞(例如，干细胞如iPSC细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、Pdx1阳性胰腺祖细胞、NKX6.1阳性胰腺祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞)在缺少血清白蛋白的培养基中分化，生成胰腺β细胞，例如SC-β细胞。在一些情况下，与通过其他相同的方法但替代地使用BSA生成的包含胰腺β细胞的细胞群体或细胞簇相比，通过本文提供的在培养基中不使用血清白蛋白或使用HSA的方法生成的包含胰腺β细胞的细胞群体或细胞簇可以具有显著的改善。改善可以包括获得的最终细胞群体中更高百分比的胰腺β细胞、更高GSIS应答(例如，响应于葡萄糖负荷释放更多胰岛素)、更高GSIS刺激指数、生成的细胞簇中胰腺β细胞分布的更高均匀性或其任何组合。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含干细胞例如hES细胞或iPS细胞的细胞群体在包含人血清白蛋白(HSA)的培养基中分化。在一些情况下，干细胞分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含定形内胚层细胞的细胞群体在包含人血清白蛋白(HSA)的培养基中分化。在一些情况下，定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含原始肠管细胞的细胞群体在包含人血清白蛋白(HSA)的培养基中分化。在一些情况下，原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞(例如，Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞或Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的细胞群体在包含人血清白蛋白(HSA)的培养基中分化。在一些情况下，Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体在包含人血清白蛋白(HSA)的培养基中分化。在一些情况下，Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体在包含人血清白蛋白(HSA)的培养基中分化。在一些情况下，胰岛素阳性内分泌细胞分化为胰腺β细胞，例如SC-β细胞。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使用包含约0.001％(w/v)至约5％(w/v)、约0.005％(w/v)至约4％(w/v)、约0.01％(w/v)至约3％(w/v)、约0.02％(w/v)至约2.5％(w/v)、约0.03％(w/v)至约2％(w/v)、约0.04％(w/v)至约1％(w/v)、约0.045％(w/v)至约0.5％(w/v)或约0.05％(w/v)至约0.1％(w/v)的HSA的培养基。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使用包含约0.001％、0.002％、0.0025％、0.005％、0.0075％、0.01％、0.0125％、0.015％、0.0175％、0.02％、0.0225％、0.025％、0.0275％、0.03％、0.0325％、0.035％、0.0375％、0.04％、0.0425％、0.045％、0.0475％、0.05％、0.0525％、0.055％、0.575％、0.06％、0.0625％、0.065％、0.0675％、0.07％、0.0725％、0.075％、0.0775％、0.08％、0.085％、0.09％、0.1％、0.12％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％或4％、5％(w/v)的HSA的培养基。术语“w/v”是重量/体积百分比或每体积重量的缩写。例如，100mL的培养基中1mg的HSA具有1％(w/v)的浓度。
在一些情况下，本文提供的方法可以通过使包含原始肠管细胞的细胞群体分化为包含Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的细胞群体或细胞簇，获得包含至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％或至少约95％的Pdx1阳性细胞的细胞群体或细胞簇。在一些情况下，本文提供的方法可以通过使包含原始肠管细胞的细胞群体分化为包含Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的细胞群体或细胞簇，获得包含至多约60％、至多约50％、至多约40％、至多约35％、至多约30％、至多约25％、至多约22％、至多约20％、至多约18％、至多约15％、至多约14％、至多约13％、至多约11％、至多约12％、至多约10％或至多约5％的CDX2阳性细胞的细胞群体或细胞簇。
VI.产生干细胞衍生的β细胞的方法
本文提供了产生SC-β细胞(例如，胰腺β细胞)的方法。在美国专利申请公开号US20150240212和US20150218522中记载了产生干细胞和内分泌细胞以提供至少一种SC-β细胞的详细方案，其各自通过引用整体并入本文。
内胚层可以形成消化道和呼吸道、甲状腺、肝脏和胰腺。内胚层谱系的代表性疾病是由破坏产生胰岛素的β细胞引起的1型糖尿病。由人多能干细胞(hPSC)体外产生功能性β细胞可能是实用的、可再生细胞来源，用于替代1型糖尿病的细胞治疗。由胚泡期胚胎的内部细胞团产生的胚胎干(ES)细胞代表了用于任何受损细胞的移植或基于细胞的治疗的有希望的细胞来源。它们可以在培养中保持、自我更新、并作为未分化的ES细胞无限增殖。ES细胞能够分化为体内的所有细胞类型，如外胚层、中胚层和内胚层谱系细胞或组织。ES细胞的主要益处是在培养中稳定的自我更新和分化潜力。
可以通过胚胎发生的原肠胚过程从内部细胞团体内产生定形内胚层，其中外胚层细胞被指示形成三个胚层。定形内胚层可以产生不同的细胞和组织，这些细胞和组织对重要器官如胰腺β细胞、肝细胞、肺泡细胞、甲状腺、胸腺以及消化道和呼吸道的上皮内膜有贡献。它不同于胚外组织的原始内胚层，后者可以形成内脏和顶叶内胚层。源自ES细胞的定形内胚层理论上能够成为任何内胚层衍生物，并且将ES细胞导入内胚层谱系是产生治疗性内胚层衍生物的先决条件。
定形内胚层的前后轴的精确模式最终可以形成原始肠管。定形内胚层来源的原始肠管沿前后轴诱导咽、食道、胃、十二指肠、小肠和大肠，包括胰腺、肺、甲状腺、胸腺、甲状旁腺和肝脏在内的相关器官。原始肠管前肠的前部变为肺、甲状腺、食道和胃。胰腺、肝脏和十二指肠起源于前肠的后部。原始肠管的中肠和后肠产生小肠和大肠。前肠前部表达发育标记物、NK2同源盒1(NKX2-1)和SRY(性别决定区Y)盒2(SOX2)；前肠后部表达造血表达的同源盒(HHEX)、胰腺和十二指肠同源盒1(PDX1)、一个切开的同源盒1(ONECUT1，称为HNF6)和肝细胞核因子4α(HNF4A)；以及中肠/后肠表达尾型同源盒1(CDX1)、尾型同源盒2(CDX2)以及运动神经元和胰腺同源盒1(MNX1)(3、19、20)。
成功分化成胰腺β细胞需要分化细胞合成并分泌生理上适当量的胰岛素。已开发出指导hPSC细胞分化的示例性分步方案，其需要概括正常胰腺内分泌发育主要阶段的分化过程(图5)。hPSC细胞向表达激素的胰腺内分泌细胞的分化是通过使hPSC细胞通过胚胎发育的主要阶段进行的；分化为中胚层和定形内胚层，建立原始肠内胚层、前肠后部模式，以及胰腺内胚层和内分泌前体的规格和成熟度。通过这些阶段，hPSC细胞可以在体外获得胰腺内分泌表型和葡萄糖反应性胰岛素分泌能力。
通常，至少一种SC-β细胞或其前体，例如根据本文公开的方法产生的胰腺祖细胞可以包含不同细胞的混合物或组合，例如，细胞如Pdx1阳性胰腺祖细胞、共表达Pdx1和NKX6-1的胰腺祖细胞、Ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞(例如，β样细胞)和胰岛素阳性内分泌细胞和/或其他多能细胞或干细胞等的混合物。
可以根据任何合适的培养方案来产生至少一种SC-β细胞或其前体，以使干细胞或多能细胞分化为期望的分化阶段。在一些实施方案中，通过在适合于使至少一种多能细胞分化为至少一种SC-β细胞或其前体的条件下将至少一种多能细胞培养一段时间来产生至少一种SC-β细胞或其前体。
在一些实施方案中，至少一种SC-β细胞或其前体是基本上纯的SC-β细胞或其前体的群体。在一些实施方案中，SC-β细胞或其前体的群体包含多能细胞或分化的细胞的混合物。在一些实施方案中，SC-β细胞或其前体的群体基本上没有或缺乏胚胎干细胞或多能细胞或iPS细胞。
在一些实施方案中，可以例如以组织活检例如皮肤活检从受试者分离体细胞，例如成纤维细胞，并重编程为诱导多能干细胞，以进一步分化从而产生用于本文所述的组合物和方法中的至少一种SC-β细胞或其前体。在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将体细胞例如成纤维细胞维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为SC-β细胞之前进行繁殖。
在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将至少一种SC-β细胞或其前体维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为SC-β细胞之前进行繁殖。
此外，至少一种SC-β细胞或其前体如胰腺祖细胞可以来自任何哺乳动物物种，非限制性实例包括鼠、牛、猿、猪、马、绵羊或人细胞。为了清楚和简单起见，本文方法的描述是指哺乳动物的至少一种SC-β细胞或其前体，但是应当理解，本文所述的所有方法可以容易地应用于至少一种SC-β细胞或其前体的其他细胞类型。在一些实施方案中，至少一种SC-β细胞或其前体衍生自人类个体。
本文提供了一种用于产生干细胞衍生的β(SC-β)细胞的方法，该方法包括使包括胰腺祖细胞或其前体的细胞群体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂接触，以产生SC-β细胞，其中细胞群体从体外衍生自干细胞。在一些实施方案中，干细胞是人多能干细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括使细胞群体与β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、星形孢菌素或其任何组合中的至少一种接触。在一些实施方案中，SC-β细胞表达C-PEP和NKX6-1。在一些实施方案中，SC-β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，该方法进一步包括用组蛋白甲基转移酶抑制剂收缩细胞群体。
本文提供了一种用于产生干细胞衍生的β(SC-β)细胞的方法，该方法包括使包括胰腺祖细胞或其前体的细胞群体与组蛋白甲基转移酶抑制剂接触，以产生SC-β细胞，其中细胞群体从体外衍生自干细胞，并且其中SC-β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，干细胞是人多能干细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括使细胞群体与β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、星形孢菌素或其任何组合中的至少一种接触。在一些实施方案中，该方法进一步包括使细胞群体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂接触。
非限制性示例性表观遗传修饰化合物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、溴结构域抑制剂或其任何组合。
在一个实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是zeste同源物2(EZH2)的增强子的抑制剂。EZH2是一种组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶。EZH2抑制剂的非限制性实例包括3-去氮腺嘌呤A(DZNep)、EPZ6438、EPZ005687(S-腺苷甲硫氨酸(SAM)竞争性抑制剂)、EI1、GSK126和UNC1999。DZNep抑制S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的水解，SAH是所有蛋白质甲基转移酶的一种基于产物的抑制剂，导致SAH的细胞浓度升高，进而抑制EZH2。DZNep对EZH2没有特异性，并且还抑制其他DNA甲基转移酶。GSK126是一种具有SAM竞争性的EZH2抑制剂，其选择性是EZH1的150倍。UNC1999是GSK126的类似物，它的选择性比其对应物GSK126小。
在一个实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在一个实施方案中，HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在一个实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是KD5170(基于巯基酮的HDAC抑制剂)、MC1568(IIa类HDAC抑制剂)、TMP195(IIa类HDAC抑制剂)或其任何组合。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是伏林司他、罗米地新(Istodax)、西达本胺、帕比司他(farydak)、贝林司他(PXD101)、帕比司他(LBH589)、丙戊酸、莫塞替诺特(MGCD0103)、艾贝司他(PCI-24781)、恩提诺特(MS-275)、SB939、瑞诺司他(4SC-201)、吉维司他(ITF2357)、quisinostat(JNJ-26481585)、HBI-8000、(苯甲酰胺HDI)、kevetrin、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、莱菔硫烷或其任何变体。
在一些情况下，组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如，DZNep)的浓度可以为0.01或约0.01至10μM。例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如，DZNep)的浓度可以为约0.01至1、0.1至1、0.25至1、0.5至1、1至5；或1至10μM。组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如，DZNep)的浓度可以小于约：5、4、3、2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01μM。
本公开内容的方面涉及定形内胚层细胞。本文中使用的定形内胚层细胞可以衍生自任何来源或根据任何合适的方案生成。在一些方面，多能干细胞(例如，iPSC或hESC)分化为内胚层细胞。在一些方面，内胚层细胞(第1阶段)进一步分化为例如，原始肠管细胞(第2阶段)、Pdx1阳性胰腺祖细胞(第3阶段)、NKX6.1阳性胰腺祖细胞(第4阶段)或者Ngn3阳性内分泌祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞(第5阶段)，随后诱导或成熟为SC-β细胞(第6阶段)。
在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞来获得定形内胚层细胞，例如，通过使多能细胞群体与i)至少一种来自TGF-β超家族的生长因子和ii)WNT信号传导途径激活剂接触，以诱导至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞，其中定形内胚层细胞表达至少一种定形内胚层特征性的标志物。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导多能干细胞分化为定形内胚层细胞的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，单独地或与WNT信号传导途径激活剂组合)。在一些情况下，来自TGF-β超家族的生长因子包括激活素A。在一些情况下，来自TGF-β超家族的生长因子包括生长分化因子8(GDF8)。可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导多能干细胞分化为定形内胚层细胞的WNT信号传导途径激活剂(例如，单独地或与来自TGF-β超家族的生长因子组合)。在一些情况下，WNT信号传导途径激活剂包括CHIR99Q21。在一些情况下，WNT信号传导途径激活剂包括Wnt3a重组蛋白。
在一些情况下，通过使多能细胞群体与i)激活素A和ii)CHIR99021接触合适的时间，例如约2天、约3天、约4天或约5天以诱导所述群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞的过程，从而使群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞，其中定形内胚层细胞表达至少一种定形内胚层特征性的标志物。
在一些实例中，该方法包括通过使多能细胞群体与合适浓度，如约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约110ng/mL、约120ng/mL、约130ng/mL、约140ng/mL、约150ng/mL、约175ng/mL、约180ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)接触，使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约100ng/mL的激活素A使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约200ng/mL的激活素A使多能细胞分化为定形内胚层细胞。
在一些实例中，该方法包括通过使多能细胞群体与合适浓度，如约0.01μM、约0.05μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.5μM、约0.8μM、约1μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约5μM、约8μM、约10μM、约12μM、约15μM、约20μM、约30μM、约50μM、约100μM或约200μM的WNT信号传导途径激活剂(例如，CHIR99021)接触，使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约2μM的CHIR99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约5μM的CHIR99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。
在一些情况下，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞表达选自下组的至少一种标志物：Nodal、Tmprss2、Tmem30b、St14、Spink3、Sh3gl2、Ripk4、Rab1S、Npnt、Clic6、Cldn5、Cacna1b、Bnip1、Anxa4、Emb、FoxA1、Sox17和Rbm35a，其中相对于其衍生自的多能干细胞，定形内胚层细胞中至少一种标志物的表达上调了统计上显著的量。在一些情况下，相对于其衍生自的多能干细胞，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞不表达统计上显著量的选自下组的至少一种标志物：Gata4、SPARC、AFP和Dab2。在一些情况下，相对于其衍生自的多能干细胞，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞不表达统计上显著量的选自下组的至少一种标志物：Zic1、Pax6、Flk1和CD31。在一些情况下，相对于其衍生自的多能干细胞，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞具有统计上显著量的较高水平的Smad2磷酸化。在一些情况下，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞具有在体内形成肠管的能力。在一些情况下，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞可以分化为具有肠细胞特征性的形态的细胞，并且其中具有肠细胞特征性的形态的细胞表达FoxA2和/或Claudin6。在一些情况下，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞可以进一步分化为内胚层起源的细胞。
在一些情况下，在任何分化之前或在分化的第一阶段期间，在至少一种β细胞分化因子的存在下培养多能干细胞群体。可以使用任何多能干细胞，诸如人多能干细胞，或人iPS细胞或本文讨论的任何多能干细胞或其他合适的多能干细胞。在一些情况下，如本文所述的β细胞分化因子可以存在于多能干细胞群体的培养基中，或者可以在多能干细胞群体的生长(例如，复制或繁殖)期间以单次剂量或定期添加。在某些实例中，多能干细胞群体可以在任何分化之前暴露于至少一种β细胞分化因子。在其他实例中，多能干细胞群体可以在分化的第一阶段期间暴露于至少一种β细胞分化因子。
本公开内容的方面涉及原始肠管细胞。本文使用的原始肠管细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些方面，原始肠管细胞进一步分化为例如Pdx1阳性胰腺祖细胞、NKX6.1阳性胰腺祖细胞、Ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为SC-β细胞。
在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞来获得原始肠管细胞，例如，通过使定形内胚层细胞与至少一种来自成纤维细胞生长因子(FGF)家族的生长因子接触，以诱导至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞，其中原始肠管细胞表达至少一种原始肠管细胞特征性的标志物。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞的来自FGF家族的生长因子(例如，单独地或与其他因子组合)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF2。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF8B。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF10。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF21。
在一些情况下，原始肠管细胞可以通过使群体中的至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞来获得，例如，通过使定形内胚层细胞与KGF接触一段时间，例如约1天、约2天、约3天或约4天，以诱导至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。
在一些情况下，该方法包括通过使定形内胚层细胞与合适浓度，如约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约110ng/mL、约120ng/mL、约130ng/mL、约140ng/mL、约150ng/mL、约175ng/mL、约180ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)接触，使定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些情况下，该方法包括使用约50ng/mL的KGF使定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些情况下，该方法包括使用约100ng/mL的KGF使定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。
本公开内容的方面涉及Pdx1阳性胰腺祖细胞。本文使用的Pdx1阳性胰腺祖细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞。在一些方面，Pdx1阳性胰腺祖细胞进一步分化为例如NKX6.1阳性胰腺祖细胞、Ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为SC-β细胞，
在一些方面，Pdx1阳性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种BMP信号传导途径抑制剂，ii)来自TGF-β超家族的生长因子，iii)至少一种来自FGF家族的生长因子，iv)至少一种SHH途径抑制剂，v)至少一种视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，vi)至少一种蛋白激酶C激活剂，以及vii)ROCK抑制剂接触，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞，其中该Pdx1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1。
在一些方面，Pdx1阳性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种BMP信号传导途径抑制剂，ii)来自TGF-β超家族的生长因子，iii)至少一种来自FGF家族的生长因子，iv)至少一种SHH途径抑制剂，v)至少一种视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，以及vi)至少一种蛋白激酶C激活剂接触，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞，其中该Pdx1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1。
在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种BMP信号传导途径抑制剂，ii)至少一种来自FGF家族的生长因子，iii)至少一种SHH途径抑制剂，iv)至少一种视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，以及v)至少一种蛋白激酶C激活剂接触，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞，其中该Pdx1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1。
在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种SHH途径抑制剂，ii)至少一种视黄酸(RA)信号传导途径激活剂；以及iii)至少一种蛋白激酶C激活剂接触，其中该Pdx1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1。
在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种来自FGF家族的生长因子和ii)至少一种视黄酸(RA)信号传导途径激活剂接触，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞，其中该Pdx1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞的BMP信号传导途径抑制剂(例如，单独地，或与来自TGF-β超家族的生长因子、至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH途径抑制剂、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，BMP信号传导途径抑制剂包括LDN193189或DMH-1。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，如约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约170nM、约180nM、约190nM、约200nM、约210nM、约220nM、约230nM、约240nM、约250nM、约280nM、约300nM、约400nM、约500nM或约1μM的BMP信号传导途径抑制剂(例如，LDN1931189)接触。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，如约0.01μM、约0.02μM、约0.05μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.5μM、约0.8μM、约1μM、约1.2μM、约1.5μM、约1.75μM、约2μM、约2.2μM、约2.5μM、约2.75μM、约3μM、约3.25μM、约3.5μM、约3.75μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约8μM、约10μM、约15μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM或约100μM的BMP信号传导途径抑制剂(例如，DMH-1)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种BMP信号传导途径抑制剂、来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH途径抑制剂、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，来自TGF-β家族的生长因子包括激活素A。在一些情况下，来自TGF-β家族的生长因子包括激活素A或GDF8。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，如约5ng/mL、约7.5ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL、约20ng/mL、约21ng/mL、约22ng/mL、约23ng/mL、约24ng/mL、约25ng/mL、约26ng/mL、约27ng/mL、约28ng/mL、约29ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL或约100ng/mL的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞的来自FGF家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种BMP信号传导途径抑制剂、来自TGF-β超家族的生长因子、至少一种SHH途径抑制剂、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子选自FGF2、FGF8B、FGF 10和FGF21。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，如约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约110ng/mL、约120ng/mL、约130ng/mL、约140ng/mL、约150ng/mL、约175ng/mL、约180ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞的SHH途径抑制剂(例如，单独地，或与至少一种BMP信号传导途径抑制剂、至少一种来自FGF家族的生长因子、来自TGF-β超家族的生长因子、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，SHH途径抑制剂包括Sant1。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，如约0.001μM、约0.002μM、约0.005μM、约0.01μM、约0.02μM、约0.03μM、约0.05μM、约0.08μM、约0.1μM、约0.12μM、约0.13μM、约0.14μM、约0.15μM、约0.16μM、约0.17μM、约0.18μM、约0.19μM、约0.2μM、约0.21μM、约0.22μM、约0.23μM、约0.24μM、约0.25μM、约0.26μM、约0.27μM、约0.28μM、约0.29μM、约0.3μM、约0.31μM、约0.32μM、约0.33μM、约0.34μM、约0.35μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.8μM、约1μM、约2μM或约5μM的SHH途径抑制剂(例如，Sant1)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞的RA信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与至少一种BMP信号传导途径抑制剂、至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH途径抑制剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，RA信号传导途径激活剂包括视黄酸。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，如约0.02μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.25μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.55μM、约0.6μM、约0.65μM、约0.7μM、约0.75μM、约0.8μM、约0.85μM、约0.9μM、约1μM、约1.1μM、约1.2μM、约1.3μM、约1.4μM、约1.5μM、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.1μM、约2.2μM、约2.3μM、约2.4μM、约2.5μM、约2.6μM、约2.7μM、约2.8μM、约3μM、约3.2μM、约3.4μM、约3.6μM、约3.8μM、约4μM、约4.2μM、约4.4μM、约4.6μM、约4.8μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM、约10μM、约12μM、约14μM、约15μM、约16μM、约18μM、约20μM、约50μM或约100μM的RA信号传导途径激活剂(例如，视黄酸)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞的PKC激活剂(例如，单独地，或与至少一种BMP信号传导途径抑制剂、至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH途径抑制剂、至少一种RA信号传导途径激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，PKC激活剂包括PdBU。在一些情况下，PKC激活剂包括TPB。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，如约10μM、约20μM、约50μM、约75μM、约80μM、约100μM、约120μM、约140μM、约150μM、约175μM、约180μM、约200μM、约210μM、约220μM、约240μM、约250μM、约260μM、约280μM、约300μM、约320μM、约340μM、约360μM、约380μM、约400μM、约420μM、约440μM、约460μM、约480μM、约500μM、约520μM、约540μM、约560μM、约580μM、约600μM、约620μM、约640μM、约660μM、约680μM、约700μM、约750μM、约800μM、约850μM、约900μM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM或约5mM的PKC激活剂(例如，PdBU)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞的ROCK抑制剂(例如，单独地，或与至少一种BMP信号传导途径抑制剂、至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH途径抑制剂、PKC激活剂和至少一种RA信号传导途径激活剂进行任何组合)。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔/HA1077或H-1152。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Y-27632。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，如约0.2μM、约0.5μM、约0.75μM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约9μM、约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM、约15μM、约16μM、约17μM、约18μM、约19μM、约20μM、约21μM、约22μM、约23μM、约24μM、约25μM、约26μM、约27μM、约28μM、约29μM、约30μM、约35μM、约40μM、约50μM或约100μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。
在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与视黄酸、KGF、Sant1、LDN193189、PdBU、Y-27632和激活素A接触合适的一段时间，例如约1天，约2天，约3天或约4天。在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与视黄酸、KGF、Sant1、LDN193189、PdBU、Y-27632和激活素A接触约2天。在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞可以通过在S3培养基中使至少一些原始肠管细胞分化来获得。
本公开内容的方面涉及NKX6.1阳性胰腺祖细胞。本文使用的NKX6.1阳性胰腺祖细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些方面，NKX6.1阳性胰腺祖细胞进一步分化为例如Ngn3阳性内分泌祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为SC-β细胞。
在一些方面，由Pdx1阳性胰腺祖细胞产生NKX6.1阳性胰腺祖细胞的方法包括使包含Pdx1阳性胰腺祖细胞的细胞群体(例如，在促进细胞簇集和/或促进细胞存活的条件下)与包含以下的至少两种β细胞分化因子接触：a)至少一种来自成纤维细胞生长因子(FGF)家族的生长因子，b)音猬途径抑制剂，和任选的c)低浓度的视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，以诱导群体中至少一种Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为NKX6.1阳性胰腺祖细胞，其中该NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达NKX6.1。
在一些情况下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与以下接触：i)至少一种来自FGF家族的生长因子，ii)至少一种SHH途径抑制剂，以及任选的iii)低浓度的RA信号传导途径激活剂，以诱导至少一些Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，从而获得Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，其中该Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1和NKX6.1。
在一些情况下，通过使Pdx1阳性胰腺祖细胞与以下接触：i)至少一种来自FGF家族的生长因子；ii)至少一种SHH途径抑制剂，以及任选的iii)低浓度的RA信号传导途径激活剂，iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGF-β超家族的生长因子接触，以诱导至少一些Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，从而获得Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与至少一种来自FGF家族的生长因子接触，从而获得Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。
在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞由多能细胞群体产生。在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞由iPS细胞群体产生。在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞由ESC细胞群体产生。在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞由定形内胚层细胞群体产生。在一些情况下，Pdx1阳性胰腺祖细胞由原始肠管细胞群体产生。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为NKX6.1阳性胰腺祖细胞的来自FGF家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种SHH途径抑制剂或ROCK抑制剂、来自TGF-β超家族的生长因子和至少一种视黄酸信号传导途径激活剂进行任何组合)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子选自FGF2、FGF8B、FGF 10和FGF21。在一些实例中，该方法包括使Pdx1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约110ng/mL、约120ng/mL、约130ng/mL、约140ng/mL、约150ng/mL、约175ng/mL、约180ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)接触。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为NKX6.1阳性胰腺祖细胞的SHH途径抑制剂(例如，单独地，或与至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、ROCK抑制剂和至少一种来自TGF-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，SHH途径抑制剂包括Sant1。在一些实例中，该方法包括使Pdx1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约0.001μM、约0.002μM、约0.005μM、约0.01μM、约0.02μM、约0.03μM、约0.05μM、约0.08μM、约0.1μM、约0.12μM、约0.13μM、约0.14μM、约0.15μM、约0.16μM、约0.17μM、约0.18μM、约0.19μM、约0.2μM、约0.21μM、约0.22μM、约0.23μM、约0.24μM、约0.25μM、约0.26μM、约0.27μM、约0.28μM、约0.29μM、约0.3μM、约0.31μM、约0.32μM、约0.33μM、约0.34μM、约0.35μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.8μM、约1μM、约2μM或约5μM的SHH途径抑制剂(例如，Sant1)接触。
可以使用任何能够诱导Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为NKX6.1阳性胰腺祖细胞的RA信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH途径抑制剂、ROCK抑制剂和至少一种来自TGF-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，RA信号传导途径激活剂包括视黄酸。在一些实例中，该方法包括使Pdx1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约0.02μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.25μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.55μM、约0.6μM、约0.65μM、约0.7μM、约0.75μM、约0.8μM、约0.85μM、约0.9μM、约1μM、约1.1μM、约1.2μM、约1.3μM、约1.4μM、约1.5μM、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.1μM、约2.2μM、约2.3μM、约2.4μM、约2.5μM、约2.6μM、约2.7μM、约2.8μM、约3μM、约3.2μM、约3.4μM、约3.6μM、约3.8μM、约4μM、约4.2μM、约4.4μM、约4.6μM、约4.8μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM、约10μM、约12μM、约14μM、约15μM、约16μM、约18μM、约20μM、约50μM或约100μM的RA信号传导途径激活剂(例如，视黄酸)接触。
可以使用任何能够诱导Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为NKX6.1阳性胰腺祖细胞的ROCK抑制剂(例如，单独地，或与至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH途径抑制剂、RA信号传导途径激活剂和至少一种来自TGF-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔/HA1077或14-1152。在一些实例中，该方法包括使Pdx1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约0.2μM、约0.5μM、约0.75μM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约9μM、约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM、约15μM、约16μM、约17μM、约18μM、约19μM、约20μM、约21μM、约22μM、约23μM、约24μM、约25μM、约26μM、约27μM、约28μM、约29μM、约30μM、约35μM、约40μM、约50μM或约100μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。
可以使用任何能够诱导Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为NKX6.1阳性胰腺祖细胞的来自TGF-β超家族的激活剂(例如，单独地，或与至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH途径抑制剂、RA信号传导途径激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，来自TGF-β超家族的激活剂包括激活素A或GDF8。在一些实例中，该方法包括使Pdx1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约0.1ng/mL、约0.2ng/mL、约0.3ng/mL、约0.4ng/mL、约0.5ng/mL、约0.6ng/mL、约0.7ng/mL、约0.8ng/mL、约1ng/mL、约1.2ng/mL、约1.4ng/mL、约1.6ng/mL、约1.8ng/mL、约2ng/mL、约2.2ng/mL、约2.4ng/mL、约2.6ng/mL、约2.8ng/mL、约3ng/mL、约3.2ng/mL、约3.4ng/mL、约3.6ng/mL、约3.8ng/mL、约4ng/mL、约4.2ng/mL、约4.4ng/mL、约4.6ng/mL、约4.8ng/mL、约5ng/mL、约5.2ng/mL、约5.4ng/mL、约5.6ng/mL、约5.8ng/mL、约6ng/mL、约6.2ng/mL、约6.4ng/mL、约6.6ng/mL、约6.8ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约20ng/mL、约30ng/mL或约50ng/mL的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)接触。在一些实例中，该方法包括使Pdx1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约5ng/mL的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)接触。
在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与KGF、Sant1和RA接触5天的时间来获得Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与KGF、Sant1、RA、Y27632和激活素A接触5天的时间来获得Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与KGF接触5天的时间来获得Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些情况下，通过使Pdx1阳性胰腺祖细胞在S3培养基中接触来获得Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。
本公开内容的方面涉及胰岛素阳性内分泌细胞。本文使用的胰岛素阳性内分泌细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，在一些方面，胰岛素阳性内分泌细胞进一步分化，例如，通过诱导或成熟为SC-β细胞。
在一些方面，从NKX6.1阳性胰腺祖细胞产生胰岛素阳性内分泌细胞的方法包括使包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群体(例如，在促进细胞簇集的条件下)与a)TGF-β信号传导途径抑制剂，和b)甲状腺激素信号传导途径激活剂接触，以诱导群体中的至少一种NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些情况下，该胰岛素阳性内分泌细胞表达Pdx1、NKX6.1、NKX2.2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3和/或胰岛素。
可以使用任何能够诱导NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的TGF-β信号传导途径抑制剂(例如，单独地，或与其他β细胞分化因子例如甲状腺激素信号传导途径激活剂进行组合)。在一些情况下，TGF-β信号传导途径包括TGF-β受体I型激酶信号传导。在一些情况下，TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5抑制剂II。
可以使用任何能够诱导NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的甲状腺激素信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与其他β细胞分化因子例如TGF-β信号传导途径抑制剂进行组合)。在一些情况下，甲状腺激素信号传导途径激活剂包括三碘甲腺原氨酸(T3)。在一些情况下，甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1。
在一些情况下，所述方法包括使细胞群体(例如，NKX6.1阳性胰腺祖细胞)与至少一种另外的因子接触。在一些情况下，所述方法包括使Pdx1阳性NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下至少一种接触：i)SHH途径抑制剂，ii)RA信号传导途径激活剂，iii)γ-分泌酶抑制剂，iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，v)蛋白激酶抑制剂，vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，或vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂。
在一些情况下，所述方法包括使Pdx1阳性NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下至少一种接触：i)SHH途径抑制剂，ii)RA信号传导途径激活剂，iii)γ-分泌酶抑制剂，iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，viii)蛋白激酶抑制剂，或ix)ROCK抑制剂。
在一些情况下，所述方法包括使Pdx1阳性NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下至少一种接触：i)SHH途径抑制剂，ii)RA信号传导途径激活剂，iii)γ-分泌酶抑制剂，iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，viii)表观遗传修饰化合物，ix)蛋白激酶抑制剂，或x)ROCK抑制剂。
在一些实施方案中，在从Pdx1阳性NKX6.1阳性胰腺祖细胞产生胰岛素阳性内分泌细胞的方法中，一些分化因子仅存在于分化步骤的前1、2、3、4，或5天。在一些情况下，在温育的前三天后，从培养基中去除了一些分化因子，如SHH途径抑制剂、RA信号传导途径激活剂和EGF家族的至少一种生长因子。
任何能够诱导群体中的NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的γ-分泌酶抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，γ-分泌酶抑制剂包括XXI。在一些情况下，γ-分泌酶抑制剂包括DAPT。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约0.01μM、约0.02μM、约0.05μM、约0.075μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约1μM、约1.1μM、约1.2μM、约1.3μM、约1.4μM、约1.5μM、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.1μM、约2.2μM、约2.3μM、约2.4μM、约2.5μM、约2.6μM、约2.7μM、约2.8μM、约2.9μM、约3μM、约3.2μM、约3.4μM、约3.6μM、约3.8μM、约4μM、约4.2μM、约4.4μM、约4.6μM、约4.8μM、约5μM、约5.2μM、约5.4μM、约5.6μM、约5.8μM、约6μM、约6.2μM、约6.4μM、约6.6μM、约6.8μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约20μM、约30μM或约50μM的γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)接触。
可以使用任何能够诱导群体中的NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的来自EGF家族的生长因子(例如，单独地，或与TGF-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，至少一种来自EGF家族的生长因子包括β细胞素。在一些情况下，至少一种来自EGF家族的生长因子包括EGF。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约1ng/mL、约2ng/mL、约4ng/mL、约6ng/mL、约8ng/mL、约10ng/mL、约12ng/mL、约14ng/mL、约16ng/mL、约18ng/mL、约20ng/mL、约22ng/mL、约24ng/mL、约26ng/mL、约28ng/mL、约30ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约150ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自EGF家族的生长因子(例如，β细胞素)接触。
可以使用任何能够诱导NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的RA信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与TGF-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，RA信号传导途径激活剂包括RA。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约0.02μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.25μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.55μM、约0.6μM、约0.65μM、约0.7μM、约0.75μM、约0.8μM、约0.85μM、约0.9μM、约1μM、约1.1μM、约1.2μM、约1.3μM、约1.4μM、约1.5μM、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.1μM、约2.2μM、约2.3μM、约2.4μM、约2.5μM、约2.6μM、约2.7μM、约2.8μM、约3μM、约3.2μM、约3.4μM、约3.6μM、约3.8μM、约4μM、约4.2μM、约4.4μM、约4.6μM、约4.8μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM、约10μM、约12μM、约14μM、约15μM、约16μM、约18μM、约20μM、约50μM或约100μM的RA信号传导途径激活剂(例如，视黄酸)接触。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的SHH途径抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，SHH途径抑制剂包括Sant1。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约0.001μM、约0.002μM、约0.005μM、约0.01μM、约0.02μM、约0.03μM、约0.05μM、约0.08μM、约0.1μM、约0.12μM、约0.13μM、约0.14μM、约0.15μM、约0.16μM、约0.17μM、约0.18μM、约0.19μM、约0.2μM、约0.21μM、约0.22μM、约0.23μM、约0.24μM、约0.25μM、约0.26μM、约0.27μM、约0.28μM、约0.29μM、约0.3μM、约0.31μM、约0.32μM、约0.33μM、约0.34μM、约0.35μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.8μM、约1μM、约2μM或约5μM的SHH途径抑制剂(例如，Sant1)接触。
可以使用任何能够诱导NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的BMP信号传导途径抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，BMP信号传导途径抑制剂包括LDN193189或DMH-1。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约170nM、约180nM、约190nM、约200nM、约210nM、约220nM、约230nM、约240nM、约250nM、约280nM、约300nM、约400nM、约500nM或约1μM的BMP信号传导途径抑制剂(例如，LDN1931189)接触。
可以使用任何能够诱导群体中的NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的ROCK抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔/HA1077或H-1152。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Y-27632。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin。在一些实例中，该方法包括使Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约0.2μM、约0.5μM、约0.75μM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约9μM、约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM、约15μM、约16μM、约17μM、约18μM、约19μM、约20μM、约21μM、约22μM、约23μM、约24μM、约25μM、约26μM、约27μM、约28μM、约29μM、约30μM、约35μM、约40μM、约50μM或约100μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。
可以使用任何能够诱导群体中的NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的表观遗传修饰化合物(例如，单独地，或与TGF-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂或HDAC抑制剂。在一些情况下，表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，DZNep。在一些情况下，表观遗传修饰化合物包括HDAC抑制剂，例如，KD5170。在一些实例中，该方法包括使Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，如约0.01μM、约0.025μM、约0.05μM、约0.075μM、约0.1μM、约0.15μM、约0.2μM、约0.5μM、约0.75μM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约9μM、约10μM、约15μM、约20μM、约25μM、约30μM、约35μM、约40μM、约50μM或约100μM的表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)接触。
在一些情况下，细胞群体任选地与蛋白激酶抑制剂接触。在一些情况下，细胞群体不与蛋白激酶抑制剂接触。在一些情况下，细胞群体与蛋白激酶抑制剂接触。任何能够诱导群体中的NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的蛋白激酶抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素。
在一些情况下，所述方法包括使细胞群体(例如，NKX6.1阳性胰腺祖细胞)与XXI、Alk5i、T3或GC-1、RA、Sant1和β细胞素接触7天的时间，以诱导群体中的至少一种NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些情况下，所述方法包括使细胞群体(例如，NKX6.1阳性胰腺祖细胞)与XXI、Alk5i、T3或GC-1、RA、Sant1、β细胞素和LDN193189接触7天的时间，以诱导群体中的至少一种NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些实施方案中，在第5阶段的一部分中，例如，仅在第5阶段的时间段的前1、2、3、4、5或6天或在第5阶段的时间段的最后1、2、3、4、5或6天添加一种或多种分化因子。在一个实例中，仅在第5阶段期间的前2、3、4或5天使细胞与SHH信号传导途径抑制剂接触，随后将SHH信号传导途径抑制剂从培养基去除。在另一个实例中，仅在第5阶段期间的前1、2或3天使细胞与BMP信号传导途径抑制剂接触，随后将BMP信号传导途径抑制剂从培养基去除。
在一些情况下，所述方法包括在BE5培养基中培养细胞群体(例如，NKX6.1阳性胰腺祖细胞)，以诱导群体中的至少一种NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。
本公开内容的方面涉及生成胰腺β细胞(例如，非天然胰腺β细胞)。在一些情况下，非天然胰腺β细胞在形式和功能上类似于内源性成熟β细胞，但与天然β细胞截然不同。
在一些情况下，使用本文提供的方法生成的胰岛素阳性胰腺内分泌细胞可以单独地或与其他类型的细胞(例如，其前体，例如干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、Pdx1阳性胰腺祖细胞或NKX6.1阳性胰腺祖细胞)一起形成细胞簇。
在一些情况下，包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体可以被直接诱导成熟为SC-β细胞，而不添加任何外源性分化因子(如TGF-β信号传导途径的抑制剂、甲状腺激素信号传导途径激活剂、PKC激活剂、来自TGF-β超家族、FGF家族或EGF家族的生长因子、SHH信号传导途径抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、ROCK抑制剂或BMP信号传导途径抑制剂)。
在一些情况下，通过使胰岛素阳性内分泌细胞与分化因子接触，可以使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体直接诱导成熟为SC-β细胞。分化因子可包括如本文所述的至少一种TGF-β信号传导途径抑制剂和甲状腺激素信号传导途径激活剂。在一些情况下，可以通过使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体与Alk5i和T3或GC-1接触来获得SC-β细胞。
在一些实例中，可以在NS-GFs培养基、MCDB131培养基、DMEM培养基或CMRL培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在一些情况下，可以在补充有10％FBS的CMRL培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在一些情况下，可以在补充有1％HSA的DMEM培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在其他情况下，可以通过在可补充2％BSA的MCDB131培养基中培养含有胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体来获得SC-β细胞。在一些情况下，用于使胰岛素阳性内分泌细胞成熟为SC-β细胞的具有2％BSA的MCDB131培养基可以不包含如本文所述的小分子因子。在一些情况下，用于使胰岛素阳性内分泌细胞成熟为SC-β细胞的具有2％BSA的MCDB131培养基可以不包含血清(例如，无FBS)。
在一些方面，本公开内容提供了从多能细胞生成SC-β细胞的方法，所述方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号传导途径激活剂接触3天的时间，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间的过程，使至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂，ii)至少一种来自FGF家族的因子，iii)SHH途径抑制剂，iv)BMP信号传导途径抑制剂(例如，DMH-1或LDN193189)，v)PKC激活剂，和vi)ROCK抑制剂接触的过程，使至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞；d)通过在促进细胞簇集的条件下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与i)至少一种来自FGF家族的生长因子，ii)至少一种SHH途径抑制剂，和任选的iii)RA信号传导途径激活剂，和任选的iv)ROCK抑制剂，和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子每隔一天接触一次，持续5天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，其中该NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1和NKX6.1；e)通过使Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与i)TGF-β信号传导途径抑制剂，ii)TH信号传导途径激活剂，iii)至少一种SHH途径抑制剂，iv)RA信号传导途径激活剂，v)γ-分泌酶抑制剂，任选的vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，和任选的vii)BMP信号传导途径抑制剂每隔一天接触一次，持续五至七天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞；以及f)通过在无异源分化因子的培养基(例如，NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞，每隔一天进行一次，持续7至14天的时间，以诱导至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞在体外成熟为SC-β细胞的过程，从而使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS应答。在一些情况下，GSIS应答类似于内源性成熟β细胞的GSIS应答。
在一些方面，本公开内容提供了从多能细胞生成SC-β细胞的方法，所述方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号传导途径激活剂接触3天的时间，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间的过程，使至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂，ii)至少一种来自FGF家族的因子，iii)SHH途径抑制剂，iv)BMP信号传导途径抑制剂，v)PKC激活剂，vi)ROCK抑制剂，和vii)来自TGFβ超家族的生长因子接触2天的时间的过程，使至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞；d)通过在促进细胞簇集的条件下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与i)至少一种来自FGF家族的生长因子，ii)至少一种SHH途径抑制剂，和任选的iii)RA信号传导途径激活剂，和任选的iv)ROCK抑制剂，和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子每隔一天接触一次，持续5天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，其中该NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1和NKX6.1；e)通过使Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与i)TGF-β信号传导途径抑制剂，ii)TH信号传导途径激活剂，iii)至少一种SHH途径抑制剂，iv)RA信号传导途径激活剂，v)γ-分泌酶抑制剂，任选的vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，和任选的vii)BMP信号传导途径抑制剂每隔一天接触一次，持续五至七天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞；以及f)通过在无异源分化因子的培养基(例如，NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞，每隔一天进行一次，持续7至14天的时间，以诱导至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞在体外成熟为SC-β细胞的过程，从而使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS应答。在一些情况下，GSIS应答类似于内源性成熟β细胞的GSIS应答。
在一些方面，本公开内容提供了从多能细胞生成SC-β细胞的方法，所述方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号传导途径激活剂接触3天的时间，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间的过程，使至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂，ii)至少一种来自FGF家族的因子，iii)SHH途径抑制剂，iv)PKC激活剂，和v)ROCK抑制剂接触的过程，使至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞；d)通过在促进细胞簇集的条件下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与i)至少一种来自FGF家族的生长因子，ii)至少一种SHH途径抑制剂，和任选的iii)RA信号传导途径激活剂，和任选的iv)ROCK抑制剂，和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子每隔一天接触一次，持续5天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，其中该NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1和NKX6.1；e)通过使Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与i)TGF-β信号传导途径抑制剂，ii)TH信号传导途径激活剂，iii)至少一种SHH途径抑制剂，iv)RA信号传导途径激活剂，v)γ-分泌酶抑制剂，和任选的vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子每隔一天接触一次，持续五至七天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞；以及f)通过在无异源分化因子的培养基(例如，NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞，每隔一天进行一次，持续7至14天的时间，以诱导至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞在体外成熟为SC-β细胞的过程，从而使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS应答。在一些情况下，GSIS应答类似于内源性成熟β细胞的GSIS应答。
在一些方面，本公开内容提供了从多能细胞生成SC-β细胞的方法，所述方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号传导途径激活剂接触3天的时间，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间的过程，使至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂，ii)至少一种来自FGF家族的因子，iii)SHH途径抑制剂，iv)BMP信号传导途径抑制剂(例如，DMH-1或LDN193189)，v)PKC激活剂，以及vi)ROCK抑制剂接触的过程，使至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞；d)通过在促进细胞簇集的条件下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与i)至少一种来自FGF家族的生长因子，ii)至少一种SHH途径抑制剂，和任选的iii)RA信号传导途径激活剂，和任选的iv)ROCK抑制剂，和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子每隔一天接触一次，持续5或6天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，其中该NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1和NKX6.1；e)通过使Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与i)SHH途径抑制剂，ii)RA信号传导途径激活剂，iii)γ-分泌酶抑制剂，iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，viii)表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)，ix)蛋白激酶抑制剂，以及x)ROCK抑制剂每隔一天接触一次，持续五至七天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞；以及f)通过在无异源分化因子的培养基(例如，NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞，每隔一天进行一次，持续7至14天的时间，以诱导至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞在体外成熟为SC-β细胞的过程，从而使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS应答。在一些情况下，GSIS应答类似于内源性成熟β细胞的GSIS应答。
在一些方面，本公开内容提供了从多能细胞生成SC-β细胞的方法，所述方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号传导途径激活剂接触3天的时间，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间的过程，使至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂，ii)至少一种来自FGF家族的因子，iii)SHH途径抑制剂，iv)BMP信号传导途径抑制剂(例如，DMH-1或LDN193189)，v)PKC激活剂，以及vi)ROCK抑制剂接触的过程，使至少一些原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞；d)通过在促进细胞簇集的条件下，使Pdx1阳性胰腺祖细胞与i)至少一种来自FGF家族的生长因子，ii)至少一种SHH途径抑制剂，和任选的iii)RA信号传导途径激活剂，和任选的iv)ROCK抑制剂，和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子每隔一天接触一次，持续5或6天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，其中该NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1和NKX6.1；e)通过使Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与i)γ-分泌酶抑制剂，ii)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，iii)TGF-β信号传导途径抑制剂，iv)甲状腺激素信号传导途径激活剂，v)表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)，vi)蛋白激酶抑制剂，以及vii)ROCK抑制剂每隔一天接触一次，持续五至七天的时间的过程，使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞；并在五至七天的前三天内，使Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与SHH途径抑制剂、RA信号传导途径和至少一种来自EGF家族的生长因子接触，然后从Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞中将其去除；以及f)通过在无异源分化因子的培养基(例如，NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞，每隔一天进行一次，持续7至14天的时间，以诱导至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞在体外成熟为SC-β细胞的过程，从而使至少一些Pdx1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS应答。在一些情况下，GSIS应答类似于内源性成熟β细胞的GSIS应答。
用于培养从第一细胞簇解离的细胞的培养基可以是无异源物质的(xeno-free)。用于培养源自动物的细胞和/或细胞簇的无异源物质培养基可以不具有来自其他动物的产物。在一些情况下，用于培养人细胞和/或细胞簇的无异源物质培养基可以不具有来自任何非人动物的产物。例如，用于培养人细胞和/或细胞簇的无异源物质培养基可以包含人血小板裂解物(PLT)而不是胎牛血清(FBS)。例如，培养基可以包含约1％至约20％、约5％至约15％、约8％至约12％、约9％至约11％的血清。在一些情况下，培养基可以包含约10％的血清。在一些情况下，培养基可能没有小分子和/或FBS。例如，培养基可以包括补充有2％BSA的MCDB131基础培养基。在一些情况下，所述培养基是无血清的。在一些实例中，培养基可以不包含外源性小分子或者信号传导途径激动剂或拮抗剂，诸如来自成纤维细胞生长因子家族(FGF，诸如FGF2、FGF8B、FGF 10或FGF21)的生长因子、音猬拮抗剂(诸如Sant1、Sant2、Sant4、Sant4、Cur61414、毛喉素、番茄碱、AY9944、曲帕拉醇、环巴胺或其衍生物)、视黄酸信号传导激动剂(例如，视黄酸、CD1530、AM580、ΤΤHΡΒ、CD437、Ch55、BMS961、AC261066、AC55649、AM80、BMS753、他扎罗汀、阿达帕林或CD2314)、Rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)的抑制剂(例如，Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔/HA1077或14-1152)、蛋白激酶C(PKC)的激活剂(例如，佛波醇12,13-二丁酯(PDBU)、TPB、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯、苔藓抑制素1或其衍生物)、TGFβ超家族的拮抗剂(例如，Alk5抑制剂II(CAS 446859-33-2)、A83-01、SB431542、D4476、GW788388、LY364947、LY580276、SB505124、GW6604、SB-525334、SD-208、SB-505124或其衍生物)、骨形态发生蛋白(BMP)1型受体的抑制剂(例如，LDN193189或其衍生物)、甲状腺激素信号传导途径激活剂(例如，T3、GC-1或其衍生物)、γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI、DAPT或其衍生物)、TGF-β信号传导途径的激活剂(例如，WNT3a或激活素A)来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素或EGF)、广泛激酶(例如，星形孢菌素或其衍生物)、非必需氨基酸、维生素或抗氧化剂(例如，环巴胺、维生素D、维生素C、维生素A或其衍生物)、或者其他添加剂，如N-乙酰半胱氨酸、硫酸锌或肝素。在一些情况下，重聚培养基可以不包含外源细胞外基质分子。在一些情况下，重聚培养基不包含MatrigelTM。在一些情况下，重聚培养基不包含其他细胞外基质分子或物质，诸如胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、PLO层粘连蛋白、纤维蛋白、凝血酶和RetroNectin及其混合物，例如，裂解的细胞膜制剂。
本领域普通技术人员将理解，补充到培养基的血清白蛋白浓度可以有所变化。例如，培养基(例如，MCDB131)可以包含约0.01％、0.05％、0.1％、1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％或约15％的BSA。在其他情况下，培养基可以包含约0.01％、0.05％、0.1％、1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％或约15％的HSA。所使用的培养基(例如，MCDB131培养基)可以包含传统基础培养基中未发现的组分，诸如微量元素、腐胺、腺嘌呤、胸苷以及更高水平的一些氨基酸和维生素。这些添加物可以允许培养基补充非常低水平的血清或确定的组分。培养基可以不含蛋白质和/或生长因子，并且可以补充EGF、氢化可的松和/或谷氨酰胺。培养基可以包含一种或多种细胞外基质分子(例如，细胞外蛋白)。培养基中使用的非限制性示例性细胞外基质分子可以包括胶原蛋白、胎盘基质、纤连蛋白、层粘连蛋白、分区蛋白、生腱蛋白、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、聚集蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、血小板反应蛋白、玻连蛋白和饰胶蛋白聚糖。在一些情况下，培养基包含层粘连蛋白，诸如LN-332。在一些情况下，培养基包含肝素。
培养基可以在培养中定期更换，例如，以向培养基中的细胞提供最佳环境。当培养从第一细胞簇解离的细胞以进行重聚时，培养基可以至少或约每4小时、12小时、24小时、48小时、3天或4天更换。例如，培养基可以约每48小时更换。
在一些情况下，细胞可以在动态条件下(例如，在其中细胞在悬浮培养的同时经历持续的移动或搅拌的条件下)培养。对于细胞的动态培养，细胞可以在容器(例如，非粘附性容器，诸如转瓶(例如，200ml至3000ml，例如250ml的转瓶；100ml的转瓶；或125ml锥形瓶)中培养，该容器可以连接至控制单元，从而呈现受控的培养系统。在一些情况下，可以在非动态条件(例如，静态培养)下培养细胞，同时保持其增殖能力。对于细胞的非动态培养，细胞可以在粘附培养器皿中培养。粘附培养器皿可以涂覆有任何用于细胞粘附的基底如细胞外基质(ECM)以改善器皿表面与细胞的粘附性。用于细胞粘附的基底可以是任何旨在粘附干细胞或饲养细胞(若使用)的物质。用于细胞粘附的基底包括胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、PLO层粘连蛋白、纤维蛋白、凝血酶和RetroNectin及其混合物，例如，MatrigelTM和裂解的细胞膜制剂。
可以搅拌动态细胞培养器皿(例如，转瓶)中的培养基(例如，通过搅拌器)。旋转速度可以与重聚的第二细胞簇的大小相关。可以控制旋转速度以使得第二细胞簇的大小可以类似于内源性胰岛。在一些情况下，控制旋转速度以使得第二细胞簇的大小可以为约75μm至约250μm。动态细胞培养器皿(例如，转瓶)的旋转速度可以是约20转/分钟(rpm)至约100rpm，例如，约30rpm至约90rpm、约40rpm至约60rpm、约45rpm至约50rpm。在一些情况下，旋转速度可以为约50rpm。
本文提供的第6阶段细胞可以经历或可以不经历本文所述的解离和重聚过程。在一些情况下，可以使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞簇重聚。细胞簇重聚可以富集胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，细胞簇中的胰岛素阳性内分泌细胞可以进一步成熟为胰腺β细胞。例如，在重聚后，第二细胞簇可以表现出类似于天然胰岛的体外GSIS。例如，在重聚后，第二细胞簇可以包含表现出体外GSIS的非天然胰腺β细胞。在一些实施方案中，可以根据PCT申请PCT/US2018/043179的公开内容执行重聚过程，该申请通过引用整体并入本文。
根据本文提供的方法获得的第6阶段细胞在冷冻保存和重新聚集程序后可以具有高的回收率。在一些情况下，在分化过程中获得的第6阶段细胞，该分化过程涉及在第3阶段处理BMP信号传导途径抑制剂(例如，DMH-1或LDN)和来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)，以及在第5阶段处理表观遗传修饰化合物(例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，EZH2抑制剂，例如，DZNep)，与未进行这种处理的相应细胞群体相比，在第5阶段后的冷冻保存后，可以具有更高的回收率。在一些情况下，在分化过程中获得的第6阶段细胞，该分化过程涉及在第3阶段处理BMP信号传导途径抑制剂(例如，DMH-1或LDN)和来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)，以及在第5阶段处理表观遗传修饰化合物(例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，EZH2抑制剂，例如，DZNep)，与未经第3阶段处理BMP信号传导途径抑制剂(例如，DMH-1或LDN)和来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)的相应细胞群体相比，在第5阶段后的冷冻保存后，可以具有更高的回收率。在一些情况下，在分化过程中获得的第6阶段细胞，该分化过程涉及在第3阶段处理BMP信号传导途径抑制剂(例如，DMH-1或LDN)和来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)，以及在第5阶段处理表观遗传修饰化合物(例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，EZH2抑制剂，例如，DZNep)，在第5阶段后的冷冻保存后，可以具有的回收率至少为约35％、37.5％、40％、42.5％、45％、47.5％、48％、49％或50％。与冷冻保存前的细胞相比，回收率可以计算为在冷冻保存、解冻和恢复以及重新聚集程序后存活并形成重新聚集的细胞簇的细胞百分比。
在一些实施方案中，本公开内容涉及使用本文提供的方法获得的非天然胰腺β细胞或其前体的冷冻保存。在一些实施方案中，包含非天然胰腺β细胞的细胞群体可以经由冷冻保存来储存。例如，包含非天然胰腺β细胞(例如，在一些情况下为第6阶段细胞)的细胞群体可以解离到细胞悬浮液，例如单细胞悬浮液中，并可以将细胞悬浮液冷冻保存，例如，冷冻在冷冻保存溶液中。细胞的解离可以通过本文所提供的任何技术进行，例如，通过酶处理。细胞可以在最高-20℃、最高-30℃、最高-40℃、最高-50℃、最高-60℃、最高-70℃、最高-80℃、最高-90℃、最高-100℃、最高-110℃、最高-120℃、最高-130℃、最高-140℃、最高-150℃、最高-160℃、最高-170℃、最高-180℃、最高-190℃或最高-200℃的温度下冷冻。在一些情况下，细胞在约-80℃的温度下冷冻。在一些情况下，细胞在约-195℃的温度下冷冻。可以使用任何冷却方法来提供冷冻保存所需的低温，诸如但不限于，电冰冻器、固体二氧化碳和液氮。在一些情况下，可以使用本领域技术人员可获得的任何冷冻保存溶液来温育用于在低温下储存的细胞，包括定制和商用溶液。例如，可以使用含有冷冻保护剂的溶液。冷冻保护剂可以是被配置为保护细胞免受冷冻伤害的试剂。例如，冷冻保护剂可以是能够降低冷冻保存溶液的玻璃化转变温度的物质。可以使用的示例性冷冻保护剂包括DMSO(二甲基亚砜)、二醇(例如，乙二醇、丙二醇和甘油)、右旋糖酐(例如，右旋糖酐-40)和海藻糖。可以将其他试剂添加至冷冻保存溶液用于其他效果。在一些情况下，可以在本文提供的方法中使用市售的冷冻保存溶液，例如，FrostaLifeTM、pZerveTM、
Figure BDA0002756558730000961
GibcoSynth-a-Freeze冷冻保存培养基、
Figure BDA0002756558730000971
冷冻培养基、
Figure BDA0002756558730000972
FRS保存培养基和
Figure BDA0002756558730000973
干细胞培养基。
在分化过程中，可以对细胞进行如本文所提供的辐照处理。在一些情况下，第6阶段的细胞群体，例如具有从胰岛素阳性内分泌细胞分化为胰腺β细胞的细胞群体或细胞簇，被辐照一段时间。在一些情况下，第6阶段的细胞群体从冷冻保存中恢复后，重新聚集后被辐照一段时间。在一些情况下，冷冻保存的细胞(例如，在第5阶段结束时冷冻保存的细胞)在解冻和恢复之前需要辐照一定的时间，以便进行随后的分化过程。
V.分化因子
本公开内容的方面涉及使祖细胞(例如，干细胞、例如iPS细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、Pdx1阳性胰腺祖细胞、NKX6.1阳性胰腺祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞)与β细胞分化因子接触，例如，以诱导胰岛素阳性内分泌细胞成熟或诱导其他祖细胞分化为SC-β细胞(例如，成熟胰腺β细胞)。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文所述的方法诱导多能细胞(例如，iPSC或hESC)分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文所述的方法诱导定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文所述的方法诱导原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文所述的方法诱导Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为NKX6-1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文所述的方法诱导NKX6-1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如根据本文所述的方法诱导胰岛素阳性内分泌细胞成熟为SC-β细胞。
根据本文公开的方法，本文所述的至少一种分化因子可以单独使用或与其他分化因子组合使用，以生成SC-β细胞。在一些实施方案中，在生成SC-β细胞的方法中使用至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种本文所述的分化因子。
生长因子-β(TGF)超家族的转化
本公开内容的方面涉及来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子作为分化因子的用途。“TGF-β超家族”是指具有已知TGFβ家族成员的结构和功能特性的蛋白质。TGFβ蛋白质家族可以包括TGFβ系列蛋白、抑制素(包括抑制素A和抑制素B)、激活素(包括激活素A、激活素B和激活素AB)、MIS(缪氏抑制物质)、BMP(骨形态发生蛋白)、dpp(decapentaplegic)、Vg-1、MNSF(单克隆非特异性抑制因子)等等。该蛋白质家族的活性可以基于与各种细胞类型上的某些受体的特异性结合。该家族的成员可以共享与其功能相关的序列同一性区域，尤其是在C末端。TGFβ家族可以包括一百多种不同的蛋白质，全部共享至少一个氨基酸序列同一性的区域。可以在本文公开的方法中使用的该家族成员可以包括但不限于由其GenBank登录号标识的以下蛋白：P07995、P18331、P08476、Q04998、P03970、P43032、P55102、P27092、P42917、P09529、P27093、P04088、Q04999、P17491、P55104、Q9WUK5、P55103、O88959、O08717、P58166、O61643、P35621、P09534、P48970、Q9NR23、P25703、P30884、P12643、P49001、P21274、O46564、O19006、P22004、P20722、Q04906、Q07104、P30886、P18075、P23359、P22003、P34821、P49003、Q90751、P21275、Q06826、P30885、P34820、Q29607、P12644、Q90752、O46576、P27539、P48969、Q26974、P07713、P91706、P91699、P27091、O42222、Q24735、P20863、O18828、P55106、Q9PTQ2、O14793、O08689、O42221、O18830、O18831、O18836、O35312、O42220、P43026、P43027、P43029、O95390、Q9R229、O93449、Q9Z1W4、Q9BDW8、P43028、Q7Z4P5、P50414、P17246、P54831、P04202、P01137、P09533、P18341、O19011、Q9Z1Y6、P07200、Q9Z217、O95393、P55105、P30371、Q9MZE2、Q07258、Q96S42、P97737、AAA97415.1、NP-776788.1、NP-058824.1、EAL24001.1、1S4Y、NP-001009856.1、NP-1-032406.1、NP-999193.1、XP-519063.1、AAG17260.1、CAA40806.1、NP-1-001009458.1、AAQ55808.1、AAK40341.1、AAP33019.1、AAK21265.1、AAC59738.1、CAI46003.1、B40905、AAQ55811.1、AAK40342.1、XP-540364.1、P55102、AAQ55810.1、NP-990727.1、CAA51163.1、AAD50448.1、JC4862、PN0504、BAB17600.1、AAH56742.1、BAB17596.1、CAG06183.1、CAG05339.1、BAB17601.1、CAB43091.1、A36192、AAA49162.1、AAT42200.1、NP-789822.1、AAA59451.1、AAA59169.1、XP-541000.1、NP-990537.1、NP-1-002184.1、AAC14187.1、AAP83319.1、AAA59170.1、BAB16973.1、AAM66766.1、WFPGBB、1201278C、AAH30029.1、CAA49326.1、XP-344131.1、AA-148845.1、XP-1-148966.3、148235、B41398、AAH77857.1、AAB26863.1、1706327A、BAA83804.1、NP-571143.1、CAG00858.1、BAB17599.1、BAB17602.1、AAB61468.1、PN0505、PN0506、CAB43092.1、BAB17598.1、BAA22570.1、BAB16972.1、BAC81672.1、BAA12694.1、BAA08494.1、B36192、C36192、BAB16971.1、NP-034695.1、AAA49160.1、CAA62347.1、AAA49161.1、AAD30132.1、CAA58290.1、NP-005529.1、XP-522443.1、AAM27448.1、XP-538247.1、AAD30133.I、AAC36741.1、AAH10404.1、NP-032408.1、AAN03682.1、XP-509161.1、AAC32311.1、NP-651942.2、AAL51005.1、AAC39083.1、AAH85547.1、NP-571023.1、CAF94113.1、EAL29247.1、AAW30007.1、AAH90232.1、A29619、NP-001007905.1、AAH73508.1、AADO2201.1、NP-999793.1、NP-990542.1、AAF19841.1、AAC97488.1、AAC60038.1、NP989197.1、NP-571434.1、EAL41229.1、AAT07302.1、CAI19472.1、NP-031582.1、AAA40548.1、XP-535880.1、NP-1-037239.1、AAT72007.1、XP-418956.1、CAA41634.1、BAC30864.1、CAA38850.1、CAB81657.2、CAA45018.1、CAA45019.1、BAC28247.1、NP-031581.1、NP-990479.1、NP-999820.1、AAB27335.1、S45355、CAB82007.1、XP-534351.1、NP-058874.1、NP-031579.1、1REW、AAB96785.1、AAB46367.1、CAA05033.1、BAA89012.1、IES7、AAP20870.1、BAC24087.1、AAG09784.1、BAC06352.1、AAQ89234.1、AAM27000.1、AAH30959.1、CAGO1491.1、NP-571435.1、1REU、AAC60286.1、BAA24406.1、A36193、AAH55959.1、AAH54647.1、AAH90689.1、CAG09422.1、BAD16743.1、NP-032134.1、XP-532179.1、AAB24876.1、AAH57702.1、AAA82616.1、CAA40222.1、CAB90273.2、XP-342592.1、XP-534896.1、XP-534462.1、1LXI、XP-417496.1、AAF34179.1、AAL73188.1、CAF96266.1、AAB34226.1、AAB33846.1、AAT12415.1、AA033819.1、AAT72008.1、AAD38402.1、BAB68396.1、CAA45021.1、AAB27337.1、AAP69917.1、AATI2416.1、NP-571396.1、CAA53513.1、AA033820.1、AAA48568.1、BAC02605.1、BAC02604.1、BAC02603.1、BAC02602.1、BAC02601.1、BAC02599.1、BAC02598.1、BAC02597.1、BAC02595.1、BAC02593.1、BAC02592.1、BAC02590.1、AAD28039.1、AAP74560.1、AAB94786.1、NP-001483.2、XP-528195.1、NP-571417.1、NP-001001557.I、AAH43222.1、AAM33143.1、CAG10381.1、BAA31132.1、EAL39680.1、EAA12482.2、P34820、AAP88972.1、AAP74559.1、CAI16418.1、AAD30538.1、XP-345502.1、NP-1-038554.1、CAG04089.1、CAD60936.2、NP-031584.1、B55452、AAC60285.1、BAA06410.1、AAH52846.1、NP-031580.1、NP-1-036959.1、CAA45836.1、CAA45020.1、Q29607、AAB27336.1、XP-547817.1、AAT12414.1、AAM54049.1、AAH78901.1、AA025745.1、NP-570912.1、XP-392194.1、AAD20829.1、AAC97113.1、AAC61694.1、AAH60340.1、AAR97906.1、BAA32227.1、BAB68395.1、BAC02895.1、AAWS 1451.1、AAF82188.1、XP-544189.1、NP-990568.1、BAC80211.1、AAW82620.1、AAF99597.1、NP-571062.1、CAC44179.1、AAB97467.1、AAT99303.1、AAD28038.1、AAH52168.1、NP-001004122.1、CAA72733.1、NP-032133.2、XP-394252.1、XP-224733.2、JH0801、AAP97721.1、NP-989669.1、S43296、P43029、A55452、AAH32495.1、XP-542974.1、NP-032135.1、AAK30842.1、AAK27794.1、BAC30847.1、EAA12064.2、AAP97720.1、XP-525704.1、AAT07301.1、BAD07014.1、CAF94356.1、AAR27581.1、AAG13400.1、AAC60127.1、CAF92055.1、XP-540103.1、AA020895.1、CAF97447.1、AAS01764.1、BAD08319.1、CAA10268.1、NP-998140.1、AAR03824.1、AAS48405.1、AAS48403.1、AAK53545.1、AAK84666.1、XP-395420.1、AAK56941.1、AAC47555.1、AAR88255.1、EAL33036.1、AAW47740.1、AAW29442.1、NP-722813.1、AARO8901.1、AAO 15420.2、CAC59700.1、AAL26886.1、AAK71708.1、AAK71707.1、CAC51427.2、AAK67984.1、AAK67983.1、AAK28706.1、P07713、P91706、P91699、CAG02450.1、AAC47552.1、NP-005802.1、XP-343149.1、AW34055.1、XP-538221.1、AAR27580.1、XP-125935.3、AAF21633.1、AAF21630.1、AAD05267.1、Q9Z1 W4、NP-1-031585.2、NP-571094.1、CAD43439.1、CAF99217.1、CAB63584.1、NP-722840.1、CAE46407.1、XP-1-417667.1、BAC53989.1、BAB19659.1、AAM46922.1、AAA81169.1、AAK28707.1、AAL05943.1、AAB17573.1、CAH25443.1、CAG10269.1、BAD16731.1、EAA00276.2、AAT07320.1、AAT07300.1、AAN15037.1、CAH25442.1、AAK08152.2、2009388A、AAR12161.1、CAGO1961.1、CAB63656.1、CAD67714.1、CAF94162.1、NP-477340.1、EAL24792.1、NP-1-001009428.1、AAB86686.1、AAT40572.1、AAT40571.1、AAT40569.1、NP-033886.1、AAB49985.1、AAG39266.1、Q26974、AAC77461.1、AAC47262.1、BAC05509.1、NP-055297.1、XP-546146.1、XP-525772.1、NP-060525.2、AAH33585.1、AAH69080.1、CAG12751.1、AAH74757.2、NP-034964.1、NP-038639.1、042221、AAF02773.1、NP-062024.1、AAR18244.1、AAR14343.1、XP-228285.2、AAT40573.1、AAT94456.1、AAL35278.1、AAL35277.1、AAL17640.1、AAC08035.1、AAB86692.1、CAB40844.1、BAC38637.1、BAB16046.1、AAN63522.1、NP-571041.1、AAB04986.2、AAC26791.1、AAB95254.1、BAA11835.1、AAR18246.1、XP-538528.1、BAA31853.1、AAK18000.1、XP-1-420540.1、AAL35276.1、AAQ98602.1、CAE71944.1、AAW50585.1、AAV63982.1、AAW29941.1、AAN87890.1、AAT40568.1、CAD57730.1、AAB81508.1、AAS00534.1、AAC59736.1、BAB79498.1、AAA97392.1、AAP85526.1、NP-999600.2、NP-878293.1、BAC82629.1、CAC60268.1、CAG04919.1、AAN10123.1、CAA07707.1、AAK20912.1、AAR88254.1、CAC34629.1、AAL35275.1、AAD46997.I、AAN03842.1、NP-571951.2、CAC50881.1、AAL99367.1、AAL49502.1、AAB71839.1、AAB65415.1、NP-624359.1、NP-990153.1、AAF78069.1、AAK49790.1、NP-919367.2、NP-001192.1、XP-544948.1、AAQ18013.1、AAV38739.1、NP-851298.1、CAA67685.1、AAT67171.1、AAT37502.1、AAD27804.1、AAN76665.1、BAC11909.1、XP-1-421648.1、CAB63704.1、NP-037306.1、A55706、AAF02780.1、CAG09623.1、NP-067589.1、NP-035707.1、AAV30547.1、AAP49817.1、BAC77407.1、AAL87199.1、CAG07172.1、B36193、CAA33024.1、NP-1-001009400.1、AAP36538.1、XP-512687.1、XP-510080.1、AAH05513.1、1KTZ、AAH14690.1、AAA31526.1。
本文提供的方法和组合物中的来自TGF-β超家族的生长因子可以是天然获得的或重组的。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包括激活素A。术语“激活素A”可以包括激活素A的片段和衍生物。示例性激活素A的序列如美国公开号2009/0155218('218出版物)的SEQ ID NO：1中所公开的。在'218出版物的SEQ ID NO:2-16中提供了激活素A的其他非限制性实例，并且在'218出版物的SEQ ID NO:33-34中提供了编码激活素A的核酸的非限制性实例。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子可以包括具有与'218出版物的SEQ ID NO：1至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包括生长分化因子8(GDF8)。术语“GDF8”可以包括GDF8的片段和衍生物。GDF8多肽的序列是本领域技术人员可获得取的。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包括具有与人GDF8多肽序列(GenBank登录号EAX10880)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包括与GDF8密切相关的生长因子，例如生长分化因子11(GDF11)。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包括具有与人GDF8多肽序列(GenBank登录号AAF21630)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，可以用模拟至少一种来自TGF-β超家族的生长因子的试剂代替来自TGF-β超家族的生长因子。示例性的模拟至少一种来自TGF-β超家族的生长因子的试剂包括但不限于IDE1和IDE2。
骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂
本公开内容的方面涉及BMP信号传导途径抑制剂作为β细胞分化因子的用途。BMP信号传导家族是TGF-β超家族的不同亚型(Sebald等人，Biol.Chem.385:697-710,2004)。超过二十种已知的BMP配体被三种不同的II型受体(BMPRII、ActRIIa和ActRIIb)和至少三种I型受体(ALK2、ALK3和ALK6)鉴别。二聚体配体促进受体异聚体的组装，从而允许组成型活性的II型受体丝氨酸/苏氨酸激酶使I型受体丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化。活化的I型受体使BMP响应性(BR-)SMAD效应子(SMAD 1、SMAD 5和SMAD 8)磷酸化，以促进核易位与SMAD4复合，SMAD4是同样促进TGF信号传导的co-SMAD。另外，BMP信号可以以独立于SMAD的方式激活细胞内效应子，如MAPK p38(Nohe等人，Cell Signal 16:291-299,2004)。可溶性BMP拮抗剂(如头蛋白、腱蛋白、gremlin和滤泡素抑制素)通过配体螯合来限制BMP信号传导。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号传导途径抑制剂包括DMH-1或其衍生物、类似物或变体。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号传导途径抑制剂包括以下化合物或以下化合物的衍生物、类似物或变体：
Figure BDA0002756558730001041
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号传导途径抑制剂包括LDN193189(也称为LDN193189、1062368-24-4、LDN-193189、DM 3189、DM-3189，IUPAC名：4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹诺酮)。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号传导途径抑制剂包括以下化合物或以下化合物的衍生物、类似物或变体：
Figure BDA0002756558730001042
在一些情况下，与LDN193189相比，DMH-1更具选择性。在本公开内容的一些实施方案中，DMH-1对于本文提供的方法可能特别有用。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物不包括LDN193189的使用。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物不包括LDN193189或其衍生物、类似物或变体用于从原始肠管细胞生成Pdx1阳性胰腺祖细胞的使用。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物涉及DMH-1或其衍生物、类似物或变体用于从原始肠管细胞生成Pdx1阳性胰腺祖细胞的使用。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号传导途径抑制剂包括LDN193189的类似物或衍生物，例如LDN193189的盐、水合物、溶剂、酯或前药。在一些实施方案中，LDN193189的衍生物(例如，盐)包括LDN193189盐酸盐。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号传导途径抑制剂包括来自美国专利公开号2011/0053930的式I化合物。
TGF-β信号传导途径抑制剂
本公开内容的方面涉及TGF-β信号传导途径抑制剂作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，TGF-β信号传导途径包括TGF-β受体I型激酶(TGF-βRI)信号传导。在一些实施方案中，TGF-β信号传导途径抑制剂包括ALK5抑制剂II(CAS 446859-33-2，一种TGF-B RI激酶的ATP竞争性抑制剂，也称为RepSox，IUPAC名：2-[5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶。在一些实施方案中，TGF-β信号传导途径抑制剂是ALK5抑制剂II的类似物或衍生物。
在一些实施方案中，ALK5抑制剂II的类似物或衍生物(也称为“ALK5i”)是如美国专利公开号2012/0021519中所述的式I化合物，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是在美国专利公开号2010/0267731中描述的TGF-β受体抑制剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂包括在美国专利公开号2009/0186076和2007/0142376中描述的ALK5抑制剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是A 83-01。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂不是A 83-01。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括A 83-01。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是SB 431542。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导途径抑制剂不是SB 431542。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括SB 431542。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是D 4476。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导途径抑制剂不是D 4476。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括D4476。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是GW788388。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导途径抑制剂不是GW 788388。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括GW 788388。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是LY 364947。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导途径抑制剂不是LY 364947。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括LY364947。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是LY580276。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导途径抑制剂不是LY 580276。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括LY 580276。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是SB 525334。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导途径抑制剂不是SB 525334。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括SB525334。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是SB505124。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导途径抑制剂不是SB 505124。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括SB 505124。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是SD 208。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导途径抑制剂不是SD 208。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括SD 208。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是GW 6604。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导途径抑制剂不是GW 6604。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括GW 6604。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂是GW 788388。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号传导途径抑制剂不是GW 788388。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法不包括GW 788388。
从上述化合物的集合中，以下可以从各种来源获得：LY-364947、SB-525334、SD-208和SB-505124可以从Sigma，P.O.Box 14508，St.Louis，Mo.，63178-9916获得；616452和616453可以从Calbiochem(EMD Chemicals，Inc.)，480S.Democrat Road，Gibbstown，N.J.，08027获得；GW788388和GW6604可以从GlaxoSmithKline，980Great West Road，Brentford，Middlesex，TW8 9GS，United Kingdom获得；LY580276可以从Lilly Research，Indianapolis，Ind.46285获得；并且SM16可以从Biogen Idec，P.O.Box 14627，5000DavisDrive，Research Triangle Park，N.C.，27709-4627获得。
WNT信号传导途径
本公开内容的方面涉及WNT信号传导途径的激活剂作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的WNT信号传导途径激活剂包括CHIR99021。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的WNT信号传导途径激活剂包括CHIR99021的衍生物，例如CHIR99021的盐，例如CHIR99021的三盐酸盐、盐酸盐。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的WNT信号传导途径激活剂包括Wnt3a重组蛋白。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的WNT信号传导途径激活剂包括糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂。示例性的GSK3抑制剂包括但不限于3F8、A 1070722、AR-A 014418、BIO、BIO-丙酮肟、FRATide、10Z-Hymenialdisine、靛玉红-3’-肟、kenpaullone、L803、L803-mts、碳酸锂、NSC 693868、SB 216763、SB 415286、TC-G 24、TCS 2002、TCS 21311、TWS 119和这些中任一种的类似物或衍生物。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括WNT信号传导途径激活剂。
成纤维细胞生长因子(FGF)家族
本公开内容的方面涉及来自FGF家族的生长因子作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自FGF家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(KGF)。KGF的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人KGF多肽序列(GenBank登录号AAB21431)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自FGF家族的生长因子包括FGF2。FGF2的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人FGF2多肽序列(GenBank登录号NP—001997)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF8B。FGF8B的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人FGF8B多肽序列(GenBank登录号AAB40954)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF10。FGF10的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人FGF10多肽序列(GenBank登录号CAG46489)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF21。FGF21的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人FGF21多肽序列(GenBank登录号AAQ89444.1)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
音猬(SHH)信号传导途径
本公开内容的方面涉及SHH信号传导途径抑制剂作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括Sant1。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括SANT2。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括SANT3。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括SANT4。在一些实施方案中，所述SHH信号传导途径抑制剂包括Cur61414。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括毛喉素。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括番茄碱。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括AY9944。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括曲帕拉醇。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括化合物A或化合物B(如美国公开号2004/0060568中所公开的)。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号传导途径抑制剂包括如美国公开号2006/0276391中所公开的拮抗刺猬信号传导的甾体生物碱(例如，环巴胺或其衍生物)。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括SHH信号传导途径抑制剂。
Rho激酶(ROCK)信号传导途径
本公开内容的方面涉及ROCK传导途径抑制剂(ROCK抑制剂)作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包括Y-27632或Thiazovivin。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包括Thiazovivin。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包括Y-27632。在一些情况下，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包含以下化合物或其衍生物：
Figure BDA0002756558730001101
在一些情况下，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包括以下化合物或其衍生物：
Figure BDA0002756558730001102
可以用于本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂的非限制性实例包括Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔(Fasudil)/HA1077、H-1152、瑞舒地尔(Ripasudil)、Y39983、Wf-536、SLx-2119、4-氮杂苯并咪唑-氨基呋咱、DE-104、烯烃、异喹啉、吲唑和吡啶烯烃衍生物、ROKα抑制剂、XD-4000、HMN-1152、4-(1-氨基烷基)-N-(4-吡啶基)环己烷-羧酰胺、Rhostatin、BA-210、BA-207、BA-215、BA-285、BA-1037、Ki-23095、VAS-012和喹唑啉。
视黄酸信号传导途径
本公开内容的方面涉及视黄酸信号传导的调节剂作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸信号传导的调节剂包括视黄酸信号传导的激活剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的RA信号传导途径激活剂包括视黄酸。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的RA信号传导途径激活剂包括视黄酸受体激动剂。本文提供的方法和组合物中的示例性视黄酸受体激动剂包括但不限于CD 1530、AM 580、TTNPB、CD 437、Ch 55、BMS 961、AC 261066、AC 55649、AM80、BMS 753、他扎罗汀、阿达帕林和CD 2314。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸信号传导的调节剂包括视黄酸信号传导的抑制剂。在一些实施方案中，视黄酸信号传导途径抑制剂包括DEAB(IUPAC名：2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]-3-丙-2-烯基苯甲醛)。在一些实施方案中，视黄酸信号传导途径抑制剂包括DEAB的类似物或衍生物。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸信号传导途径抑制剂包括视黄酸受体拮抗剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸受体拮抗剂包括(E)-4-[2-(5,6-二氢-5,5-二甲基-8-苯基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸、(E)-4-[[(5,6-二氢-5,5-二甲基-8-苯基乙炔基)-2-萘基]乙烯基]苯甲酸、(E)-4-[2-[5,6-二氢-5,5-二甲基-8-(2-萘基)-2-萘基]乙烯基]-苯甲酸和(E)-4-[2-[5,6-二氢-5,5-二甲基-8-(4-甲氧基苯基)-2-萘基]乙烯基]苯甲酸。在一些实施方案中，视黄酸受体拮抗剂包括BMS195614(CAS#253310-42-8)、ER 50891(CAS#187400-85-7)、BMS 493(CAS#170355-78-9)、CD2665(CAS#170355-78-9)、LE 135(CAS#155877-83-1)、BMS 453(CAS#166977-43-1)或MM11253(CAS#345952-44-5)。
在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括视黄酸信号传导的调节剂。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括视黄酸信号传导途径激活剂。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括视黄酸信号传导途径抑制剂。
蛋白激酶C
本公开内容的方面涉及蛋白激酶激活剂作为β细胞分化因子的用途。蛋白激酶C是蛋白激酶最大的家族之一，由多种同种型组成。传统的同种型包括α、βI、βII、γ；新的同种型包括δ、ε、η、Θ；非典型的同种型包括ξ和ι/λ。PKC酶主要是胞质的，但在激活时会转运到膜上。在细胞质中，PKC被其他激酶磷酸化或自身磷酸化。为了被激活，一些PKC同种型(例如，PKC-ε)需要分子结合至二酰基甘油(“DAG”)结合位点或磷脂酰丝氨酸(“PS”)结合位点。其他同种型能够在完全不需要任何二次结合信使的情况下被激活。与DAG位点结合的PKC激活剂包括但不限于苔藓抑制素、picologue、佛波酯、海兔毒素(aplysiatoxin)和格尼迪木灵(gnidimacrin)。与PS位点结合的PKC激活剂包括但不限于多不饱和脂肪酸及其衍生物。考虑到可以在本文所述的方法、组合物和试剂盒中使用能够单独地或与一种或多种其他β细胞分化因子组合地诱导至少一种胰岛素产生的内分泌细胞或其前体分化为SC-β细胞的任何蛋白激酶C激活剂。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC激活剂包括PdbU。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC激活剂包括TPB。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC激活剂包括如WIPO公开号WO/2013/071282中所述的环丙烷化多不饱和脂肪酸、环丙烷化单不饱和脂肪酸、环丙烷化多不饱和脂肪醇、环丙烷化单不饱和脂肪醇、环丙烷化多不饱和脂肪酸酯、环丙烷化单不饱和脂肪酸酯、环丙烷化多不饱和脂肪酸硫酸酯、环丙烷化单不饱和脂肪酸硫酸酯、环丙烷化多不饱和脂肪酸磷酸酯、环丙烷化单不饱和脂肪酸磷酸酯、大环内酯、DAG衍生物、类异戊二烯、辛基吲哚内酰胺V、格尼迪木灵、iripallidal、巨大戟二萜醇、萘磺酰胺(napthalenesulfonamide)、二酰甘油激酶抑制剂、成纤维细胞生长因子18(FGF-18)、胰岛素生长因子、激素和生长因子激活剂。在一些实施方案中，苔藓抑制素包括苔藓抑制素-1、苔藓抑制素-2、苔藓抑制素-3、苔藓抑制素-4、苔藓抑制素-5、苔藓抑制素-6、苔藓抑制素-7、苔藓抑制素-8、苔藓抑制素-9、苔藓抑制素-10、苔藓抑制素-11、苔藓抑制素-12、苔藓抑制素-13、苔藓抑制素-14、苔藓抑制素-15、苔藓抑制素-16、苔藓抑制素-17或苔藓抑制素-18。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括蛋白激酶C激活剂。
γ-分泌酶抑制剂
本公开内容的方面涉及γ-分泌酶抑制剂作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的γ-分泌酶抑制剂包括XXI。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的γ-分泌酶抑制剂包括DAPT。本文提供的方法和组合物中的其他示例性γ-分泌酶抑制剂包括但不限于美国专利号7,049,296、8,481,499、8,501,813和WIPO公开号WO/2013/052700所述的γ-分泌酶抑制剂。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括蛋白激酶抑制剂。
甲状腺激素信号传导途径激活剂
本公开内容的方面涉及甲状腺激素信号传导途径激活剂作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂包括三碘甲腺原氨酸(T3)。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂包括T3或GC-1的类似物或衍生物。本文提供的方法和组合物中的T3的示例性类似物包括但不限于选择性和非选择性的拟甲状腺素药(thyromimetic)、TRβ选择性激动剂-GC-1、GC-24、4-羟基-PCB 106、MB07811、MB07344、3,5-二碘甲腺丙酸(DITPA)；选择性TR-β激动剂GC-1；3-碘类甲腺质(3-Iodothyronamine)(T(1)AM)和3,3’,5-三碘甲腺乙酸(Triac)(激素甲状腺素的生物活性代谢物(T(4))；KB-2115和KB-141；类甲腺质；SKF L-94901；DIBIT；3’-AC-T2；四碘甲腺乙酸(Tetrac)和三碘甲腺乙酸(Triac)(通过甲状腺素[T4]和三碘甲腺原氨酸[T3]丙氨酸链的氧化脱氨和脱羧)、3,3’,5’-三碘甲腺原氨酸(rT3)(通过T4和T3脱碘)、3,3’-二碘甲腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘甲腺原氨酸(T2)(通过T4、T3和rT3脱碘)以及3-碘类甲腺质(T1AM)和类甲腺质(T0AM)(通过T4和T3脱碘和氨基酸脱羧)，以及TH结构类似物，如3,5,3’-三碘甲腺丙酸(Triprop)、3,5-二溴-3-哒嗪酮-1-甲腺原氨酸(L-940901)、N-[3,5-二甲基-4-(4’-羟基-3’-异丙基苯氧基)-苯基]-草氨酸(CGS 23425)、3,5-二甲基-4-[(4’-羟基-3’-异丙基苄基)-苯氧基]乙酸(GC-1)、3,5-二氯-4-[(4-羟基-3-异丙基苯氧基)苯基]乙酸(KB-141)和3,5-二碘甲腺丙酸(DITPA)。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂包括T3的前药或激素原，诸如T4甲状腺激素(例如，甲状腺素或L-3,5,3’,5’-四碘甲腺原氨酸)。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号传导途径激活剂是美国专利号7,163,918中所述的碘甲腺原氨酸组合物。
表皮生长因子(EGF)家族
本公开内容的方面涉及来自EGF家族的生长因子作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自EGF家族的生长因子包括β细胞素。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自EGF家族的生长因子包括EGF。表皮生长因子(EGF)是一种53个氨基酸的细胞因子，可以从大的膜内在蛋白质前体进行蛋白水解切割。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自EGF家族的生长因子包括变体EGF多肽，例如在美国专利号7,084,246中所公开的与人野生型EGF多肽序列具有至少90％氨基酸同一性的分离的表皮生长因子多肽。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自EGF家族的生长因子包括在美国专利号8,247,531中所公开的结合并拮抗(agonize)EGF受体的工程化EGF突变体。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自EGF家族的至少一种生长因子被激活EGF家族中的信号传导途径的试剂替代。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自EGF家族的生长因子包括模拟EGF的化合物。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括来自EGF家族的生长因子。
蛋白激酶抑制剂
本公开内容的方面涉及蛋白激酶抑制剂作为β细胞分化因子的用途。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素的类似物。本文提供的方法和组合物中的星形孢菌素的示例性类似物包括但不限于Ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(Bis)化合物、10’-{5”-[(甲氧羰基)氨基]-2”-甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素、staralog(参见，例如Lopez等人，“Staurosporine-derived inhibitorsbroaden the scope of analog-sensitive kinase technology”，J.Am.Chem.Soc.2013；135(48)：18153-18159)和cgp41251。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂是PKCβ的抑制剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂是具有以下化结构的PKCβ抑制剂或如下化合物的衍生物、类似物或变体：
Figure BDA0002756558730001151
在一些实施方案中，PKCβ的抑制剂是具有以下结构的GSK-2化合物或如下化合物的衍生物、类似物或变体：
Figure BDA0002756558730001161
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC抑制剂是双吲哚基马来酰亚胺。示例性的双吲哚基马来酰亚胺包括但不限于：双吲哚基马来酰亚胺I、双吲哚基马来酰亚胺II、双吲哚基马来酰亚胺III、盐酸盐或其衍生物、类似物或变体。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC抑制剂是伪金丝桃素或其衍生物、类似物或变体。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC抑制剂是indorublin-3-单肟、5-Iodo或其衍生物、类似物或变体。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和试剂盒不包括蛋白激酶抑制剂。
VII.SC-β细胞
本公开内容的SC-β细胞共享β细胞的许多特有的特征，这些特征对于正常β细胞功能是重要的。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)应答。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出体内GSIS应答。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出体外GSIS应答和体内GSIS应答。在一些实施方案中，GSIS应答类似于内源性成熟胰腺β细胞的GSIS应答。在一些实施方案中，SC-β细胞对至少一次葡萄糖负荷表现出GSIS应答。在一些实施方案中，SC-β细胞对至少两次顺序的葡萄糖负荷表现出GSIS应答。在一些实施方案中，SC-β细胞对至少三次顺序的葡萄糖负荷表现出GSIS应答。在一些实施方案中，GSIS应答类似于内源性人胰岛对多次葡萄糖负荷的GSIS应答。在一些实施方案中，在将细胞移植到人或动物中后立即观察到GSIS应答。在一些实施方案中，在将细胞移植到人或动物中后约24小时内观察到GSIS应答。在一些实施方案中，在将细胞移植到人或动物中后约一周内观察到GSIS应答。在一些实施方案中，在将细胞移植到人或动物中后约两周内观察到GSIS应答。在一些实施方案中，以响应于高葡萄糖浓度而分泌的胰岛素与低葡萄糖浓度相比的比例为特征的细胞刺激指数类似于内源性成熟胰腺β细胞的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于或等于1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于1.1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于或等于1.1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于2的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于或等于1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出至少2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0或更大的刺激指数。
本公开内容的一些实施方案涉及包含SC-β细胞的细胞组合物，诸如细胞培养物或细胞群体，其中SC-β细胞衍生自至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体。在一些实施方案中，细胞组合物包含胰岛素阳性内分泌细胞。在一些实施方案中，细胞组合物包含NKX6.1胰腺祖细胞。在一些实施方案中，细胞组合物包含PDX1胰腺祖细胞。在一些实施方案中，细胞组合物包含原始肠管细胞。在一些实施方案中，细胞组合物包含定形内胚层细胞。
根据某些实施方案，化学诱导的SC-β细胞是哺乳动物细胞，并且在优选的实施方案中，这样的SC-β细胞是人SC-β细胞。在一些实施方案中，胰岛素阳性内分泌细胞衍生自定形内胚层细胞，例如，人定形内胚层干细胞。根据某些实施方案，化学诱导的PDX1阳性胰腺祖细胞是哺乳动物细胞，并且在优选的实施方案中，这样的PDX1阳性胰腺祖细胞是人PDX1阳性胰腺祖细胞。
本公开内容的其他实施方案涉及包含通过本文公开的方法产生的SC-β细胞的组合物，诸如分离的细胞群体或细胞培养物。在本公开内容的一些实施方案中，涉及包含通过本文公开的方法产生的化学诱导的SC-β细胞的组合物，诸如分离的细胞群体或细胞培养物。在这样的实施方案中，SC-β细胞构成SC-β细胞群体中总细胞的少于约90％、少于约85％、少于约80％、少于约75％、少于约70％、少于约65％、少于约60％、少于约55％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约12％、少于约10％、少于约8％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％。在一些实施方案中，组合物包含SC-β细胞的群体，其占细胞群体中总细胞的多于约90％，例如，细胞群体中总细胞的约至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少约99％、或约至少100％是SC-β细胞。
本公开内容的某些其他实施方案涉及组合物，诸如分离的细胞群体体或细胞培养物，其包含SC-β细胞和SC-β细胞所衍生自的胰岛素阳性内分泌细胞或其前体的组合。在一些实施方案中，SC-β细胞所衍生自的胰岛素阳性内分泌细胞构成分离的细胞群体或培养物中总细胞的少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％。
本公开内容的附加实施方案涉及通过本文所述的过程产生的组合物，诸如分离的细胞群体或细胞培养物，其包含化学诱导的SC-β细胞作为主要细胞类型。在一些实施方案中，本文所述的方法和过程产生分离的细胞培养物和/或细胞群体，其包含至少约99％、至少约98％、至少约97％、至少约96％、至少约95％、至少约94％、至少约93％、至少约92％、至少约91％、至少约90％、至少约89％、至少约88％、至少约87％、至少约86％、至少约85％、至少约84％、至少约83％、至少约82％、至少约81％、至少约80％、至少约79％、至少约78％、至少约77％、至少约76％、至少约75％、至少约74％、至少约73％、至少约72％、至少约71％、至少约70％、至少约69％、至少约68％、至少约67％、至少约66％、至少约65％、至少约64％、至少约63％、至少约62％、至少约61％、至少约60％、至少约59％、至少约58％、至少约57％、至少约56％、至少约55％、至少约54％、至少约53％、至少约52％、至少约51％或至少约50％的SC-β细胞。
在另一个实施方案中，分离的细胞群体或细胞组合物(或细胞培养物)包含人SC-β细胞。在其他实施方案中，本文所述的方法和过程可产生分离的细胞群体，其包含至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％的SC-β细胞。在优选的实施方案中，分离的细胞群体可包含人SC-β细胞。在一些实施方案中，计算细胞培养物或群体中SC-β细胞的百分比而不考虑培养物中剩余的饲养细胞。
本公开内容的又一方面涉及细胞群体或细胞组合物(或细胞培养物)，其包含至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％的NKX6.1+/C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约20％的NKX6.1+/C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约40％的NKX6.1+/C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约50％的NKX6.1+/C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约17.9％的NKX6.1+/C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约41.5％的NKX6.1+/C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约50.6％的NKX6.1+/C肽+细胞。
在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约90％、至少约89％、至少约88％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％的NKX6.1+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约40％的NKX6.1+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约60％的NKX6.1+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约85％的NKX6.1+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约36.9％的NKX6.1+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约63.4％的NKX6.1+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约89.5％的NKX6.1+细胞。
在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％的C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约30％的C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约55％的C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约26.8％的C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约57.7％的C肽+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约55.2％的C肽+细胞。
在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约99％、至少约98％、至少约95％、至少约90％、至少约89％、至少约88％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％的嗜铬粒蛋白A(CHGA)+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约40％的CHGA+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约85％的CHGA+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含至少约95％的CHGA+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约37.7％的CHGA+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约87.5％的CHGA+细胞。在一些实施方案中，如本文所提供的细胞群体或细胞组合物包含约96.4％的CHGA+细胞。
本公开内容的其他实施方案涉及组合物，诸如分离的细胞群体或细胞培养物，其包含SC-β细胞和SC-β细胞从其分化的胰岛素阳性内分泌细胞或其前体的混合物。例如，可以产生对于约每95个胰岛素阳性内分泌细胞或其前体包含至少约5个SC-β细胞的细胞培养物或细胞群体。在其他实施方案中，可以产生对于约每5个胰岛素阳性内分泌细胞或其前体包含至少约95个SC-β细胞的细胞培养物或细胞群体。另外，考虑到包含SC-β细胞与胰岛素阳性内分泌细胞或其前体的其他比例的细胞培养物或细胞群体。例如，可以产生对于约每1,000,000个或至少100,000个细胞，或至少10,000个细胞、或至少1000个细胞、或500个、或至少250个、或至少100个、或至少10个胰岛素阳性内分泌细胞或其前体包含至少约1个SC-β细胞的组合物。
在一些方面，本公开内容提供了细胞簇，其包含至少约50％的Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，至多约30％、28％、26％、25％、24％、22％、20％、18％、16％、14％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的嗜铬粒蛋白A(CHGA)阳性细胞，以及至多约30％、28％、26％、25％、24％、22％、20％、18％、16％或15％的CDX2阳性细胞。在一些情况下，细胞簇包含至多约20％的CDX2阳性、NKX6.1阳性细胞。在一些实施方案中，细胞簇包含至多约5％的CHGA阳性细胞。在一些实施方案中，细胞簇包含至多约20％的CDX2阳性、NKX6.1阳性细胞和至多约5％的CHGA阳性细胞。在一些实施方案中，细胞簇包含至少约60％、62％、64％、65％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％或95％的Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，细胞簇包含至少约65％的Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。
在一些实施方案中，与具有多于约30％的嗜铬粒蛋白A(CHGA)阳性细胞或大于约30％的CDX2阳性细胞的可比的细胞簇相比，包含至少约50％的Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞、至多约30％的嗜铬粒蛋白A(CHGA)阳性细胞和至多约30％的CDX2阳性细胞的细胞簇具有特定的功能特征。例如，在一些情况下，包含至少约50％的Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞、至多约30％的嗜铬粒蛋白A(CHGA)阳性细胞和至多约30％的CDX2阳性细胞的细胞簇的进一步分化产生包含非天然胰腺β细胞的第一细胞簇，与包含从包含至少约50％的Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞和多于30％的嗜铬粒蛋白A(CHGA)阳性细胞或多于30％的CDX2阳性细胞的可比的细胞簇分化的非天然胰腺β细胞的第二细胞簇相比，该第一细胞簇具有更高的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)刺激指数，如通过流式细胞术测量。
在一些方面，本公开内容提供了包含至少约60％、62％、64％、65％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％或90％的Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞和至多约40％、38％、36％、34％、32％、30％、28％、26％、25％、24％、22％、20％、18％、16％、15％、14％、12％或10％的CDX2阳性细胞的细胞簇。在一些实施方案中，细胞簇包含至少约85％的Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，细胞簇包含至多约15％的CDX2阳性细胞。在一些实施方案中，细胞簇包含至少约85％的Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞和至多约15％的CDX2阳性细胞。
在一些实施方案中，与具有多于约40％的CDX2阳性细胞的可比的细胞簇相比，包含至少约60％的Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞和至多约40％的CDX2阳性细胞的细胞簇具有特定的功能特征。例如，在一些情况下，包含至少约60％的Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞和至多约40％的CDX2阳性细胞的细胞簇的进一步分化产生包含非天然胰腺β细胞的第一细胞簇，与包含从包含至少约60％的Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞和多于40％的CDX2阳性细胞的可比的细胞簇分化的非天然胰腺β细胞的第二细胞簇相比，该第一细胞簇具有更高的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)刺激指数，如通过流式细胞术测量。
在一些方面，本公开内容提供了包含非天然胰腺β细胞的细胞簇。在一些实施方案中，通过使原始肠管细胞与骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子接触，从原始肠管细胞的分化获得本文公开的细胞簇。在一些实施方案中，与没有经过接触而从原始肠管细胞的分化获得的可比的第二细胞簇相比，细胞簇具有每立方微米更高数目的非天然胰腺β细胞。在一些实施方案中，与可比的第二细胞簇相比，细胞簇具有每立方微米高至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或1.6倍数目的非天然胰腺β细胞。
在一些情况下，与不接触BMP信号传导途径抑制剂或来自TGF-β家族的生长因子而从原始肠管细胞的分化获得的可比的细胞簇相比，本文公开的包含非天然胰腺β细胞的细胞簇响应于葡萄糖负荷表现出更高的胰岛素分泌。在一些实施方案中，与可比的第二细胞簇相比，细胞簇表现出高至少约1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍的胰岛素分泌。在一些实施方案中，与可比的第二细胞簇相比，细胞簇表现更高的GSIS刺激指数。在一些实施方案中，细胞簇的GSIS刺激指数比第二细胞簇高至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.2倍、至少约2.4倍、至少约2.8倍或至少约3倍。在一些实施方案中，细胞簇的GSIS刺激指数比第二细胞群体高至少约3倍。在一些实施方案中，GSIS刺激指数计算为响应于20mM葡萄糖负荷的胰岛素分泌与响应于2mM葡萄糖负荷的胰岛素分泌之比。在一些实施方案中，当暴露于葡萄糖负荷时，非天然胰腺β细胞表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，非天然胰腺β细胞响应于K+的第一浓度表现出胰岛素分泌。在一些实施方案中，与可比的第二细胞簇相比，细胞簇响应于K+的第一浓度表现出更高的胰岛素分泌。在一些实施方案中，与可比的第二细胞簇相比，细胞簇响应于K+的第一浓度表现出高至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.2倍、至少约2.4倍、至少约2.8倍、至少约3倍、至少约3.2倍、至少约3.4倍、至少约3.6倍、至少约3.8倍、至少约4倍的胰岛素分泌。
在一些情况下，本文公开的细胞群体或细胞簇是未分选的，例如，尚未经过细胞分选过程的分离的细胞群体或细胞簇。在一些实施方案中，本文公开的细胞簇可以指通过在给定环境中(例如，在3D悬浮培养中)培养的细胞的自聚集而形成的细胞簇。在一些实施方案中，本文公开的细胞簇是在本文所述的分化过程期间形成的中间细胞簇。在一些情况下，中间细胞簇，例如包含Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的细胞簇(例如，第3阶段细胞簇)或包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇(例如，第4阶段细胞簇)不经历细胞分选。在一些情况下，经历细胞分选的细胞群体可能无法形成本文公开的中间细胞簇。例如，Pdx1阳性胰腺祖细胞在经历细胞分选后可能无法形成本文公开的细胞簇。
如本文所述的细胞分选可以指通过依赖于细胞大小、形状(形态)、表面蛋白质表达、内源性信号蛋白表达或其任何组合的差异，从多个细胞分离一组细胞的过程。在一些情况下，细胞分选包括使细胞经历流式细胞术。流式细胞术可以是基于激光或阻抗的生物物理学技术。在流式细胞术中，可以将细胞悬浮在流体流中，并使它们通过电子检测设备。在一种类型的流式细胞术，即基于细胞光学性质(例如，激光激发后的发射波长)的一个或多个参数的荧光激活细胞分选(FACS)中，可以使用流式细胞术物理分离并由此纯化感兴趣的细胞。如本文所述，未分选的细胞簇可以是由尚未经历活性细胞分选过程例如流式细胞术的多个细胞形成的细胞簇。在一些情况下，本文讨论的流式细胞术可以基于细胞中表达的一种或多种信号肽。例如，细胞簇可以包含表达信号肽(例如，荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)或tdTomato)的细胞。在一些情况下，信号肽作为细胞中胰岛素表达的指示物被表达。例如，细胞簇可以包含携带在胰岛素启动子的控制下的编码GFP的外源性核酸序列的细胞。胰岛素启动子可以是内源性或外源性启动子。在一些情况下，这些细胞中GFP的表达可以指示所述细胞中胰岛素的表达。因此，GFP信号可以是胰腺β细胞的标志物。在一些情况下，如本文所述的细胞分选可以包括磁激活流式细胞术，其中使用磁性抗体或其他配体来标记不同类型的细胞，并且磁性性质的差异可以用于细胞分选。
本文所述的表达一种或多种特定标志物如Pdx1、NKX6.1、胰岛素、NGN3或CHGA的细胞的百分比可以是使用诸如流式细胞术测定等技术检测到的百分比值。在一些情况下，在流式细胞术测定期间，通过在消化酶如胰蛋白酶或TrypLETM Express中温育，将本文所讨论的细胞群体或细胞簇分散为单细胞悬浮液。分散的细胞可以在合适的缓冲液如PBS中洗涤、离心，然后重悬于固定缓冲液如4％PFA中。然后可以用抗感兴趣的细胞标志物的第一抗体温育，然后可以用第二抗体温育。在抗体温育后，可以洗涤细胞，并通过流式细胞术进行分离。还可以使用除流式细胞术以外的技术来表征本文所述的细胞，例如确定细胞百分比。细胞表征方法的非限制性实例包括基因测序、显微镜技术(荧光显微镜、原子力显微镜)、核型分析、同工酶分析、DNA性质、病毒易感性。
在一些方面，本公开内容涉及包含葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞群体的组合物，其中与用葡萄糖诱导后分泌的胰岛素量相比，所述细胞在用KCl(例如，约20至约50mM，例如约30mM)诱导后分泌更高的胰岛素量。在一些实施方案中，与用葡萄糖诱导后分泌的胰岛素量相比，所述葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞群体在用KCl诱导后分泌高至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍的胰岛素量。
在一些方面，本公开内容涉及包含葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞群体的组合物，其中与没有信号传导因子的情况下可比的细胞相比，在存在信号传导因子的情况下，细胞在用KCl和/或葡萄糖诱导后分泌更高的胰岛素量。在一些实施方案中，细胞在高葡萄糖存在的情况下分泌更高的胰岛素量，但在低葡萄糖存在的情况下不分泌。在一些实施方案中，高葡萄糖浓度为约10-20mM。在一些实施方案中，低葡萄糖浓度为约2-5mM。
在一些方面，本公开内容涉及包含分化的胰腺祖细胞群体的组合物，其中所述群体包含至少60％的胰腺β细胞，如通过流式细胞术所确定的。在一些实施方案中，群体包含至少65％、70％、75％、80％、85％或90％的胰腺β细胞。在一些实施方案中，与不接触基础培养基组分的可比的群体相比，该群体在与预定的基础培养基组分接触后包含更高百分比的胰腺β细胞。
根据本文所述的公开方法生成的体外成熟的SC-β细胞(例如，胰腺β细胞)显示出许多优点，例如，它们进行体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌，在基因表达和超微结构方面类似于人胰岛β细胞，当移植到小鼠中时分泌人胰岛素并改善高血糖，为细胞疗法(例如，移植到需要附加的和/或功能性β细胞的受试者中)、药物筛选(例如，用于胰岛素产生/分泌、存活、去分化，等等)、研究(例如，确定正常β细胞和糖尿病β细胞之间的功能差异)和组织工程化(例如，使用SC-β细胞作为重构胰岛中的第一细胞类型)提供新平台。
VIII.减少增殖的方法
本文提供减少根据本文所述的方法产生的SC-β细胞的细胞群体增殖的方法。方法可以包括辐照包括内分泌细胞的体外细胞群体。在一些情况下，以约100rad至约100,000rad的剂量辐照包括内分泌细胞的细胞群体约1分钟至约60分钟的时间段。
在一些情况下，对包括内分泌细胞的细胞群体的辐照剂量为约100rad至约50,000rad、约100rad至约25,000rad、约100rad至约10,000rad、约250rad至约25,000rad、约500rad至约25,000rad、约1,000rad至约25,000rad、约2,500rad至约25,000rad、约5,000rad至约25,000rad或约10,000rad至约15,000rad。在一些情况下，对包括内分泌细胞的细胞群体的辐照剂量为约10,000rad。在一些情况下，对包括内分泌细胞的细胞群体的辐照进行约1分钟至约55分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约45分钟、约1分钟至约40分钟、约1分钟至约35分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约25分钟、约1分钟至约20分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约5分钟、约10分钟至约55分钟、约15分钟至约55分钟、约20分钟至约55分钟、约25分钟至约55分钟、约30分钟至约55分钟、约20分钟至约40分钟或约25分钟至约35分钟。在一些情况下，对包括内分泌细胞的细胞群体的辐照持续约30分钟。
如本文所用，辐照可以指电离辐照。可以通过将细胞群体暴露于γ射线、X射线、紫外线、α射线、β射线(电子束)或中子射线来进行。不希望受到某种理论的约束，电离辐照可以通过破坏细胞DNA，例如，增殖细胞，并从而导致细胞死亡来控制细胞生长。在一些情况下，与未进行辐照的相应细胞群体相比，包括已如本文所述进行辐照的内分泌细胞的细胞群体具有较低比例的能够增殖或增殖细胞的细胞。在一些情况下，与未暴露于辐照的相应细胞群体相比，包括已暴露于辐照的内分泌细胞的细胞群体中能够增殖或增殖细胞的细胞比例至少低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％、400％、420％、450％、480％或500％。
在一些情况下，本文提供的方法可以包括在胰腺分化期间将包括干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、胰腺祖细胞或内分泌细胞的细胞群体暴露于辐照下。在一些情况下，与未受到辐照的相应细胞群体相比，辐照导致细胞群体的增殖能力降低。
在一些情况下，包括内分泌细胞的细胞群体是通过本文提供的任何分化方法获得的细胞群体。在一些情况下，包括内分泌细胞的细胞群体是通过本文提供的逐步分化方法获得的细胞群体。在一些情况下，包括内分泌细胞的细胞群体是在分化方案第6阶段的细胞群体。在一些情况下，包括内分泌细胞的细胞群体是第1阶段第6天(S6d1)、S6d2、S6d3、S6d4、S6d5、S6d6或S6d7的细胞群体。在一些情况下，包括内分泌细胞的细胞群体是从冷冻保存中解冻并恢复的细胞群体。在一些情况下，将包括内分泌细胞的细胞群体在暴露于辐照的同时进行冷冻保存。在暴露于辐照后，包括内分泌细胞的细胞群体可以被解冻并恢复，以进一步分化为胰腺β细胞，如本文所述。
在一些情况下，包括内分泌细胞的细胞群体可以进一步分化/成熟为包括胰腺β细胞的细胞群体，与相应的细胞群体相比，在未暴露于相同辐照的情况下，其具有更低比例的能够增殖的细胞或增殖细胞。在一些情况下，与未暴露于辐照的相应细胞群体相比，从包括内分泌的经辐照细胞群体获得的包括胰腺β细胞的细胞群体中能够增殖的细胞或增殖细胞的比例至少低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％、400％、420％、450％、480％或500％。
在一些情况下，从包括内分泌的经辐照的细胞群体中获得的包括胰腺β细胞的细胞群体被植入需要其的受试者体内。包括胰腺β细胞的细胞群体可以帮助控制受试者的血糖水平。在一些情况下，从包括内分泌的经辐照的细胞群体中获得的包括胰腺β细胞的细胞群体可以维持受试者的血糖控制至少约50天、60天、70天、80天、90天或甚至更长。在一些情况下，从包括内分泌的经辐照的细胞群体中获得的包括胰腺β细胞的细胞群体可以维持受试者的血糖控制60天。在一些情况下，从包括内分泌的经辐照的细胞群体中获得的包括胰腺β细胞的细胞群体可以维持受试者的血糖控制90天。
IX.富集干细胞衍生的β细胞的方法
本文提供了从异质细胞群体中分离出SC-β细胞群体的方法，这种混合的细胞群体包括SC-β细胞和衍生SC-β细胞的胰岛素阳性内分泌细胞或其前体。可以使用存在于SC-β细胞上的任何细胞表面标志物，例如，多唾液酸化神经细胞粘附分子(PSA-NCAM)，富集、分离和/或纯化通过上述任何一种方法产生的SC-β细胞群体，所述细胞表面标志物不存在于胰岛素阳性内分泌细胞或其来源的前体上。这种细胞表面标志物也称为对SC-β细胞具有特异性的亲和标签。
在一些实施方案中，细胞表面标志物是可诱导的细胞表面标志物。例如，可以通过某些信号将PSA-NCAM诱导到表面。不同类型的内分泌细胞可以响应不同的信号。在一些实施方案中，PSA-NCAM可以被酶，例如，内神经氨酸苷酶或Endo-N选择性地从表面切割掉。Endo-N是一种内唾液酸酶，可快速并且特异性地降解具有α-2,8-键的唾液酸线性聚合物，其最小长度为7-9个残基，所述残基的特征是与NCAM相关的唾液酸残基。
细胞分选
本文提供的方法涉及包括第一内分泌细胞群体和第二内分泌细胞群体的细胞组合物，其中与第二内分泌细胞群体相比，第一内分泌细胞群体中内分泌细胞表达VMAT+或Cdx2+的细胞比例降低。在一些实施方案中，第一内分泌细胞群体和第二内分泌细胞群体包括可以被葡萄糖和干细胞(例如，hPSC或EC)诱导的β细胞。在一些实施方案中，干细胞由异丙肾上腺素诱导。在一些实施方案中，细胞群体包括被诱导产生胰岛素的β细胞和不产生胰岛素的细胞的混合物。在一些实施方案中，PSA-NCAM可以从所有细胞上切割下来，形成“空白”，可以使用细胞类型特异性刺激剂诱导到细胞表面，从而导致仅有一种细胞类型在表面上具有大量PSA-NCAM，并且可以使用亲和标签，例如，抗PSA-NCAM抗体，对诱导的SC-β细胞进行选择性分选。以这种方式，可以从内分泌细胞群体中的其他内分泌细胞中分选并富集分化的SC-β细胞。SC-β细胞。在一些实施方案中，当与刺激性化合物接触时，细胞群体中的一个或多个细胞不能将可选择的标记物定位于细胞表面。
特异于SC-β细胞的亲和标签的实例是抗体(例如，抗PSA-NCAM抗体)、对标志物分子(如多肽)具有特异性的配体或其他结合剂，其存在于SC-β细胞的细胞表面上，但基本不存在于其他细胞类型(例如，胰岛素阳性内分泌细胞或其前体)上。在一些方法中，与SC-β细胞(例如人SC-β细胞)上的细胞表面抗原结合的抗体被用作亲和标签，以富集、分离或纯化化学诱导的(例如，通过与至少一种本文所述的β细胞成熟因子接触)通过本文所述的方法产生的SC-β细胞。这种抗体是已知且可商购的。
本领域技术人员将容易理解使用抗体富集、分离和/或纯化SC-β细胞的方法。例如，在一些实施方案中，将试剂如抗体，与包括SC-β细胞的细胞群体温育，其中该细胞群体经过处理以减少细胞间和底物的粘附。然后细胞群体被洗涤、离心并重悬。在一些实施方案中，如果抗体尚未被标志物标记，则将细胞悬浮液与第二抗体，如能够结合第一抗体的FACS缀合的抗体温育。然后SC-β细胞被洗涤、离心并重悬于缓冲液中。然后使用荧光激活的细胞分选仪(FACS)分析和分选SC-β细胞悬浮液。将抗体结合的、荧光重编程细胞与非结合的、非荧光细胞(例如未成熟的产生胰岛素的细胞)分开收集，从而将SC-β细胞与细胞悬液中存在的其他细胞分离，例如，胰岛素阳性内分泌细胞或其前体，或未成熟的产生胰岛素的细胞(例如其他分化的细胞类型)。
在本文所述的方法的另一个实施方案中，可以通过使用备选的基于亲和力的方法或通过使用对SC-β细胞特异的相同或不同标志物的附加的几轮分选进一步纯化包括SC-β细胞的分离细胞组合物。例如，在一些实施方案中，FACS分选用于从细胞群体中不表达那些标志物(例如阴性细胞)之一的细胞中首先分离表达NKX6-1、单独表达或伴随表达C肽，或可替代地伴随表达本文公开的β细胞标志物的SC-β细胞。第二次FAC分选，例如使用FACS再次对阳性细胞进行分选，以分离出与第一次分选不同的标志物的阳性细胞，从而丰富了重编程细胞的细胞群体。在替代的实施方案中，FACS分选用于通过对存在于大多数胰岛素阳性内分泌细胞或其前体上，但不存在于SC-β细胞上的标志物进行负分选来分离细胞。
在本文所述的方法的一些实施方案中，在不使用抗体的情况下对SC-β细胞进行荧光标记，然后通过使用荧光激活细胞分选仪(FACS)从非标记的细胞中分离出。在这些实施方案中，使用上述方法，使用编码GFP、YFP的核酸或编码可表达的荧光标志物基因的另一种核酸，如编码荧光素酶的基因，来标记重编程细胞。例如，在一些实施方案中，将编码GFP的核酸或其生物活性片段的至少一个拷贝引入至少一个胰岛素阳性内分泌细胞中，该细胞首先被化学诱导到SC-β细胞中，其中在SC-β细胞中表达下游的启动子，如胰岛素启动子，使得GFP基因产物或其生物活性片段的表达处于胰岛素启动子的控制下。
除了上述过程外，化学诱导的SC-β细胞也可以通过其他细胞分离技术分离。此外，SC-β细胞也可以通过连续传代培养的方法，在促进SC-β细胞选择性存活或选择性扩增的生长条件下富集或分离。这些方法是本领域普通技术人员已知的，并且可以包括使用试剂，例如，胰岛素、TGF-β家族的成员，包括激活素A、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和成纤维细胞生长因子-2，血小板衍生生长因子-AA和-BB、富含血小板血浆、胰岛素样生长因子(IGF-1、II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-10、GDF-11、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、多效生长因子、内皮素、表皮生长因子(EGF)、β-纤维素等。其他药物化合物可以包括，例如，烟酰胺、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和II、GLP-1和2拟抗体、Exendin-4、视黄酸、甲状旁腺激素。
使用本文所述的方法，可以从胰岛素阳性内分泌细胞或其前体(通过本文所述的方法由多能干细胞分化)体外产生富集、分离和/或纯化的SC-β细胞群体。在一些实施方案中，优选的富集、分离和/或纯化方法涉及由人胰岛素阳性内分泌细胞或其前体体外产生人SC-β细胞，所述人胰岛素阳性内分泌细胞或其前体由人多能干细胞或人诱导性多能干(iPS)细胞分化。在这样的实施方案中，SC-β细胞从胰岛素阳性内分泌细胞分化，所述胰岛素阳性内分泌细胞先前源自定形内胚层细胞，先前源自iPS细胞，SC-β细胞可以与获得细胞以产生iPS细胞的受试者自体。
使用本文所述的方法，与化学诱导胰岛素阳性内分泌细胞或前体群体之前的细胞群体相比，分离的SC-β细胞群体的SC-β细胞含量被富集至少约2至约1000倍。在一些实施方案中，与化学诱导胰岛素阳性内分泌细胞或前体群体之前的群体相比，SC-β细胞可以被富集至少约5至约500倍。在其他实施方案中，与化学诱导胰岛素阳性内分泌细胞或前体群体之前的群体相比，SC-β细胞可以被富集至少约10倍至约200倍。在其他实施方案中，与化学诱导胰岛素阳性内分泌细胞或前体群体之前的群体相比，SC-β细胞可以被富集至少约20-至约100倍。在其他实施方案中，与化学诱导胰岛素阳性内分泌细胞或前体群体之前的群体相比，SC-β细胞可以被富集至少约40倍至约80倍。在某些实施方案中，与化学诱导胰岛素阳性内分泌细胞或前体群体之前的群体相比，SC-β细胞可以被富集至少约2至约20倍。
本文提供了从细胞群体中选择靶细胞(例如，SC-β细胞)的方法，包括使靶细胞与刺激性化合物接触，其中所述接触诱导靶细胞的可选择的标志物(例如，PSA-NCAM)定位到靶细胞的细胞表面，并基于可选择的标志物(例如，PSA-NCAM)在细胞表面的定位来选择靶细胞(例如，SC-β细胞)。在一些实施方案中，可选择的标志物包括PSA-NCAM。在一些实施方案中，通过细胞分选来选择靶细胞。在一些实施方案中，所述选择包括当可选择的标志物位于靶细胞表面时，使靶细胞的可选择的标志物与抗原结合多肽接触。在一些实施方案中，抗原结合多肽包括抗体。在一些实施方案中，抗原结合多肽结合PSA-NCAM。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用化合物(例如，酶)处理细胞群体，所述化合物从靶细胞群体的至少一个细胞的细胞表面去除可选择的标志物。在一些实施方案中，在靶细胞与刺激性化合物接触之前，用化合物处理靶细胞群体。在一些实施方案中，化合物从至少一个细胞的细胞表面切割可选择的标志物。在一些实施方案中，靶细胞是内分泌细胞。在一些实施方案中，刺激性化合物包括葡萄糖。在一些实施方案中，内分泌细胞是β细胞。在一些实施方案中，β细胞是SC-β细胞。在一些实施方案中，刺激性化合物包括异丙肾上腺素。在一些实施方案中，内分泌细胞是EC细胞。根据权利要求102所述的方法，其中所述刺激性化合物是葡萄糖，并且所述一个或多个细胞是EC细胞。在一些实施方案中，刺激性化合物是异丙肾上腺素，并且一个或多个细胞是β细胞。在一些实施方案中，选择靶细胞使靶细胞与细胞群体中的一个或多个细胞分离。
辐照
在一些实施方案中，可以在细胞饲养层的存在下培养产生胰岛素的内分泌细胞(例如，干细胞衍生的β细胞)。这种细胞可以是，例如，鼠源或人源的。产生胰岛素的内分泌细胞(例如，干细胞衍生的β细胞)也可以被辐照，通过用化学灭活剂(如丝裂霉素c)化学灭活，或者如果需要可以进行其他处理以抑制其增殖。在其他实施方案中，在没有饲养细胞的情况下培养产生胰岛素的内分泌细胞(例如，干细胞衍生的β细胞)。
即使没有饲养细胞，多能干细胞也可以维持在未分化状态。无饲养层培养的环境包括合适的培养基质，特别是细胞外基质，如
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或层粘连蛋白。通常，在细胞完全分散之前(胶原酶IV约5mM)，停止酶消化。然后将约10至2,000个细胞团块直接铺在基质上，而不进一步的分散。无饲养层培养由营养培养基支持，该培养基含有支持细胞增殖而不分化的因子。可通过用分泌这些因子的细胞如经辐照(约4,000rad)的原代小鼠胚胎成纤维细胞、端粒化的小鼠成纤维细胞或源自pPS细胞的成纤维样细胞来培养培养基，以将这些因子引入培养基。可通过在无血清培养基中，如补充有20％血清替代品和4ng/mL bFGF的KODMEM，以约5-6×104cm-2的密度铺满饲养层来调节培养基。调节培养1-2天的培养基进一步补充bFGF，并用于支持多能干细胞培养1-2天。在国际专利公开WO 01/51616和Xu等人，Nat.Biotechnol.19:971，2001中进一步讨论了无饲养层培养方法的特征。
X.药物组合物
本公开内容涉及包括通过任何前述方法产生的细胞或包括任何前述细胞群体的治疗组合物。所述治疗组合物可以进一步包括生理相容溶液，其包括例如人工脑脊髓液或磷酸盐缓冲盐水。所述治疗组合物可用于治疗、预防或稳定糖尿病。例如，体细胞或干细胞可以获自需要治疗的个体或健康个体，并通过本公开内容的方法重编程为源自干细胞的β细胞。在本公开内容的一个实施方案中，将干细胞衍生的β细胞分选并富集并引入个体中以治疗该病症。在另一个实施方案中，干细胞在引入个体之前在适于分化为β细胞的条件下培养，并且可以用于替代或辅助患病或受损组织的正常功能。本公开内容的巨大优势在于，其提供了本质上无限量的患者特异性人类β细胞或来自健康个体的相容干细胞衍生的β细胞，这些个体具有适合移植的相同HLA类型。在细胞治疗中使用自体和/或相容细胞提供了优于使用非自体细胞的主要优势，非自体细胞可能会受到免疫排斥。相反，自体细胞不太可能引起显著的免疫反应。
在一些情况下，本公开内容提供了可以在用于治疗疾病(例如，糖尿病)的各种方法中利用非天然胰腺β细胞(β细胞)群体以及细胞组分和产物的药物组合物。某些情况包括包含活细胞(例如，单独的非天然胰腺β细胞或与其他细胞类型混合)的药物组合物。其他情况包括包含非天然胰腺β细胞组分(例如，细胞裂解物、可溶性细胞级分、条件培养基、ECM或上述任一种的组分)或产物(例如，通过非天然胰腺β细胞或通过遗传修饰产生的营养因子和其他生物因子、来自非天然胰腺β细胞培养的条件培养基)的药物组合物。在任一种情况下，药物组合物可进一步包含本领域技术人员已知的其他活性剂，诸如抗炎剂、外源性小分子激动剂、外源性小分子拮抗剂、抗凋亡剂、抗氧化剂和/或生长因子。
本公开内容的药物组合物可以包含与药学上可接受的载体(例如，介质或赋形剂)一起配制的非天然胰腺β细胞或其组分或产物。术语药学上可接受的载体(或介质)可以与术语生物相容性载体或介质互换使用，可以指这样的试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，其不仅与待治疗性施用的细胞和其他药剂相容，而且还适合于与人类和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激、变态反应或其他并发症。合适的药学上可接受的载体可以包括水、盐溶液(如林格氏液)、醇、油、明胶和碳水化合物，诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷。这样的制剂可以是灭菌的，并且在期望的情况下可以与诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液和着色剂等辅助剂混合。包含细胞组分或产物但不包含活细胞的药物组合物可以配制成液体。包含活的非天然胰腺β细胞的药物组合物可以配制成液体、半固体(例如，凝胶、凝胶胶囊或脂质体)或固体(例如，基质、支架等)。
如此处所用，术语“药学上可接受的”可以指在合理的医学判断范围内，适合于与人类和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激、变态反应或者其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如此处所用，术语“药学上可接受的载体”可以指涉及将主题化合物从一个器官或身体部分携带或运输到另一器官或身体部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌，或硬脂酸)或溶剂封装材料。在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二元醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)膨胀剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，如乙醇；以及(23)在药物制剂中使用的其他无毒的相容性物质。制剂中还可存在润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。
如本文所用，关于细胞群体的短语“治疗有效量”意味着以适用于任何医学治疗的合理的获益/风险比在动物中细胞的至少亚群体中有效地产生一些期望的治疗效果的细胞群体中的相关细胞(例如，本公开内容的SC-β细胞或成熟的胰腺β细胞，或包含SC-β细胞的组合物)的量。例如，向受试者施用的足以在1型、1.5型或2型糖尿病的至少一种症状(诸如糖化血红蛋白水平、空腹血糖水平、低胰岛素血症，等等)中产生统计上显著的、可测量的变化的SC-β细胞群体的量。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。通常，治疗有效量可以随受试者的病史、年龄、病况、性别以及受试者的医学状况的严重程度和类型以及其他药物活性剂的施用而变化。
在一些情况下，干细胞衍生的β细胞的药物组合物以常规的方式使用一种或多种生理上可接受的载体进行配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径。本文所述的药物组合物的概述可见于，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第十九版(Easton,Pa.：Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，伊斯顿，宾夕法尼亚州1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.，Eds.，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，纽约，纽约州，1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第七版(LippincottWilliams&
Wilkins1999)。
药物组合物任选地以常规方式制造，仅通过实例方式如通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制作、悬浮、乳化、包囊、包埋或压制过程。
在某些实施方案中，组合物还可以包括一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲液，如柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠和氯化铵。这些酸、碱和缓冲剂以所需的量包括其中，以使组合物的pH维持在可接受的范围内。
在其他实施方案中，组合物还可以包括所需量的一种或多种盐，以使组合物的重量摩尔渗透压浓度在可接受的范围内。这些盐包括含有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
本文所述的药物组合物通过任何合适的施用途径施用，包括但不限于，口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、口腔、舌下或直肠施用途径。在一些情况下，将药物组合物配制成用于肠外(例如，静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)施用。
本文所述的药物组合物被配制为任何合适的剂型，包括但不限于，水性口服分散液、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液等，以供待治疗的个体口服摄取；固体口服剂型、气雾剂、控释制剂、速溶制剂、泡腾剂制剂、冻干制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、缓释剂、延迟释放剂、搏动释放制剂、多颗粒制剂，以及混合即时释放和控释制剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制为胶囊。在一些实施方案中，药物组合物被配制为溶液(例如，用于IV施用)。在一些情况下，药物组合物被配制为输注液。在一些情况下，药物组合物被配制为注射剂。
本文所述的药物固体剂型任选地包括本文所述的化合物和一种或多种药学上可接受的添加剂，如相容性载体、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。
在其他方面，使用标准包衣程序，如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第20版(2000)中描述的包衣程序，在组合物周围提供薄膜包衣。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如以供通过胶囊施用)，并且部分或全部颗粒被包衣。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如以供通过胶囊施用)，并且部分或全部颗粒被微囊化。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如以供通过胶囊施用)，并且部分或全部颗粒未被微囊化且未被包衣。
在某些实施方案中，本文提供的组合物还可包含一种或多种防腐剂，以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，如硼酸苯汞和硫柳汞；稳定的二氧化氯；以及季铵化合物，如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵和氯化十六烷基吡啶。
在一些实施方案中，本公开内容的组合物可以以有效治疗或预防例如糖尿病的量包括干细胞衍生的β细胞。药物组合物可以包括本文所述的干细胞衍生的β细胞，结合一种或多种药学或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这种组合物可以包括缓冲剂，如中性缓冲盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。
药物组合物可以包含本领域技术人员将会熟悉的辅助组分。例如，它们可以包含抗氧化剂，其范围取决于所使用的抗氧化剂的种类而改变。常用抗氧化剂的合理范围是约0.01％至约0.15％体积重量的EDTA、约0.01％至约2.0％体积重量的亚硫酸钠和约0.01％至约2.0％体积重量的焦亚硫酸钠。对于上述每一种，本领域技术人员可以使用约0.1％体积重量的浓度。其他代表性的化合物包括巯基丙酰甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸、β-巯基乙胺、谷胱甘肽和类似物质，但还可以使用其他适合于肾脏施用的抗氧化剂，例如，抗坏血酸及其盐或亚硫酸盐或焦亚硫酸钠。
缓冲剂可用于将制剂的pH维持在约4.0至约8.0的范围内；以使对靶组织的刺激最小化。对于直接腹膜内注射，制剂应在pH 7.2-7.5，优选在pH 7.35-7.45。所述组合物还可以包含适合于向肾脏施用的张度剂。其中合适的是氯化钠以使制剂与血液近似等渗。
在某些情况下，药物组合物与粘度增强剂一起配制。示例性试剂是羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。在必要时，药物组合物可以添加助溶剂。合适的助溶剂可以包括甘油、聚乙二醇(PEG)、聚山梨酯、丙二醇和聚乙烯醇。还可以包含防腐剂，例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、乙酸苯汞或硝酸苯汞、硫柳汞或者对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
包含细胞、细胞组分或细胞产物的药物组合物可以以本领域已知的几种递送方法中的一种或多种递送至患者肾脏。在一些情况下，将组合物递送至肾脏(例如，肾小囊上和/或肾小囊下)。在另一个实施方案中，可以通过周期性的腹膜内或肾内注射将组合物递送至肾脏内的各个位置。或者，所述组合物可以以本领域技术人员已知的其他剂型如预成形或原位成形的凝胶或脂质体来施加。
在半固体或固体载体中包含活细胞的药物组合物可以被配制用于在肾小囊上或肾小囊下方进行手术植入。应当理解，液体组合物还可以通过手术程序来施用。在特定情况下，半固体或固体药物组合物可以包含半渗透性凝胶、晶格、细胞支架等，其可以是不可生物降解或可生物降解的。例如，在某些情况下，将外源性细胞与其周围环境隔绝，但仍使细胞能够分泌生物分子(例如，胰岛素)并将其递送至周围细胞或血流可以是期望的或适当的。在这些情况下，细胞可以配制成包含活的非天然胰腺β细胞或细胞群体的自主植入物，该细胞或细胞群体包含被非降解的选择性渗透屏障包围的非天然胰腺β细胞，所述渗透屏障将移植细胞与宿主组织物理分离。这样的植入物有时被称为“免疫保护性的”，因为它们具有在没有药理学诱导的免疫抑制的情况下防止免疫细胞和大分子杀死移植细胞的能力。
在其他情况下，可以将各种可降解的凝胶和网络用于本公开内容的药物组合物。例如，特别适合于缓释制剂的可降解材料包括生物相容性聚合物，诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等。
在其他情况下，将细胞递送到可生物降解的，优选可生物再吸收的或可生物吸收的支架或基质之上或之内可能是期望的或适当的。这些典型的三维生物材料包含附着于支架、分散在支架内或并入在支架中截留的细胞外基质中的活细胞。一旦植入身体的靶区域，这些植入物就会与宿主组织整合，其中移植的细胞逐渐确立。
可以在本公开内容中使用的支架或基质(有时统称为“框架”)材料的实例包括非织造垫、多孔泡沫或自组装肽。例如，非织造垫可以使用包含乙醇酸和乳酸(PGA/PLA)的合成可吸收共聚物、泡沫以及/或者聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物的纤维来形成。
在另一个实施方案中，框架是毡，其可以由通过可生物吸收的材料，例如，PGA、PLA、PCL共聚物或共混物或者透明质酸制成的复丝纱线组成。使用由卷曲、切割、梳理和针刺组成的标准纺织加工技术将纱线制成毡。在另一个实施方案中，将细胞接种到泡沫支架上，该泡沫支架可以是复合结构。在上述许多情况下，框架可以模塑成有用的形状。此外，应当理解，非天然胰腺β细胞可以在预先成形的不可降解的手术或植入装置上培养。
基质、支架或装置可以在细胞接种前进行处理，以增强细胞附着。例如，在接种前，可以用0.1摩尔乙酸处理尼龙基质，并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中温育以包覆尼龙。可以用硫酸对聚苯乙烯进行类似处理。框架的外表面也可以进行修饰，以改善细胞的附着或生长以及组织的分化，诸如通过等离子包覆框架或者添加一种或多种蛋白质(例如，胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白)、细胞基质和/或其他材料，诸如但不限于，明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶等。
在一方面，本公开内容提供了包含细胞簇的装置，所述细胞簇包含至少一种胰腺β细胞。本文提供的装置可以被配置为当植入受试者体内时产生和释放胰岛素。装置可以包含细胞簇，所述细胞簇包含至少一种胰腺β细胞，例如，非天然胰腺β细胞。装置中的细胞簇可以表现出体外GSIS。装置可以进一步包含半透膜。半透膜可以被配置用于将细胞簇保留在装置中，并允许细胞簇分泌的胰岛素通过。在装置的一些情况下，细胞簇可以被半透膜封装。封装可以通过本领域技术人员可用的任何技术进行。半透膜也可以由本领域技术人员将理解和验证的任何合适的材料制成。例如，半透膜可以由多糖或聚阳离子制成。在一些情况下，半透膜可以由聚(丙交酯)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和其他聚羟基酸、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯、白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、聚氨基酸、谷醇溶蛋白、藻酸盐、琼脂糖、琼脂糖与明胶、右旋糖酐、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物及其他酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯或其任何组合。在一些情况下，半透膜包含藻酸盐。在一些情况下，细胞簇被封装在微胶囊中，所述微胶囊包含被半透膜包围的藻酸盐核心。在一些情况下，对藻酸盐核心进行修饰，例如以产生包含藻酸盐核心的支架，所述藻酸盐核心具有与RGD序列(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)共价缀合的寡肽。在一些情况下，对藻酸盐核心进行修饰，例如，以产生具有稳定性增强的化学酶促工程化的藻酸盐的共价加强的微胶囊。在一些情况下，对藻酸盐核心进行修饰，例如以产生通过丙烯酸酯官能化磷脂的原位聚合而组装的模拟膜的薄层。在一些情况下，微胶囊使用差向异构酶由酶促修饰的藻酸盐组成。在一些情况下，微胶囊包含微胶囊膜的相邻层之间的共价连接。在一些实施方案中，微胶囊包含亚筛粒度的胶囊，其包含与酚部分偶联的藻酸盐。在一些情况下，微胶囊包含支架，所述支架包含藻酸盐-琼脂糖。在一些情况下，SC-β细胞被PEG修饰，然后封装在藻酸盐中。在一些情况下，分离的细胞群，例如，SC-β细胞被封装在光反应性脂质体和藻酸盐中。应当理解，微胶囊中使用的藻酸盐可以用其他合适的生物材料代替，包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、壳聚糖、聚酯中空纤维、胶原蛋白、透明质酸、右旋糖酐与ROD、BHD和聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEGDA)、聚(MPC-共-甲基丙烯酸正丁酯-共-4-乙烯基苯基硼酸)(PMBV)和聚(乙烯醇)(PVA)、琼脂糖、琼脂糖与明胶以及这些的多层情况。在一些情况下，本文提供的装置包括体外区段，例如，当将装置植入到受试者体内时，装置的一部分可以在受试者体外。体外区段可以包括具有或不具有本文提供的细胞或细胞簇的装置的任何功能组件。
XI.治疗方法
本文进一步提供了用于治疗或预防受试者中的疾病的方法。可以将包含本文提供的或根据本文提供的方法生成的细胞簇或细胞的组合物施用于受试者以恢复受试者中的胰腺功能程度。例如，可以将类似于内源性胰岛的细胞簇或类似于内源性胰腺β细胞的细胞(例如，非天然胰腺β细胞或SC-β细胞)或其前体移植到受试者以治疗糖尿病。
所述方法可以包括将本申请中公开的细胞簇或细胞移植到受试者，例如，有需要的受试者。术语“移植”可以指通过导致引入的细胞或细胞簇至少部分地定位在期望部位的方法或途径，将细胞或细胞簇、细胞或其细胞簇的任何部分、或者包含细胞、细胞簇或其任何部分的任何组合物置于受试者体内。细胞或细胞簇可以直接植入胰腺，或替代地通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者体内的期望位置，在该处至少一部分植入的细胞保持存活。在施用于受试者后，细胞或细胞簇具有活力的时间可以短至几小时(例如，二十四小时)至几天，至长达数年。在一些情况下，细胞或细胞簇，或者其细胞或细胞簇的任何部分，还可以在非胰腺位置诸如在肝脏中或皮下横跨施用(transadminister)，例如，在胶囊(例如，微胶囊)中施用以使植入的细胞或细胞簇维持在植入位置，并避免迁移。
如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”可以指向受试者施用有效量的组合物(例如，细胞簇或其部分)，从而使受试者的具有疾病的至少一种症状的减少或疾病改善，例如，有益或期望的临床结果。为了本公开内容的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓和、疾病程度的缩减、疾病的稳定状态(例如，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻、以及缓解(例如，部分的或完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与不接受治疗的情况下预期的生存期相比延长生存期。因此，本领域技术人员将意识到治疗可以改善疾病状况，但是可能不完全治愈该疾病。如本文所用，术语“治疗”包括预防。
示例性的施用模式包括但不限于注射、输注、滴注、吸入或摄取。“注射”包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下(suhcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在优选的实施方案中，组合物通过静脉内输注或注射施用。
疾病或病症的“治疗”、“预防”或“改善”是指延迟或预防此类疾病或病症的发作，逆转、缓和、改善、抑制、减慢或停止与这样的疾病或病症相关的状况的进展的前进、加重或恶化。在一个实施方案中，疾病或病症的症状缓和了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
糖尿病的治疗通过标准医学方法来确定。糖尿病治疗的目标是使糖水平尽可能安全地降至接近正常水平。通常设定的目标是饭前80-120毫克每分升(mg/dl)，睡前100-140mg/dl。具体的医师可能会根据其他因素，如患者多久一次发生低血糖反应为患者设置不同的目标。有用的医学检查包括对患者血液和尿液的测试以确定血糖水平、对糖化血红蛋白水平(HbA1c；过去2-3个月中的平均血糖水平的量度，正常范围为4％-6％)的测试、对胆固醇和脂肪水平的测试和对尿蛋白水平的测试。这样的测试是本领域技术人员已知的标准测试(参见例如，美国糖尿病协会，1998)。也可以通过在程序中减少具有与糖尿病相关的并发症(诸如眼病、肾病或神经疾病)的患者来确定成功的治疗方案。
延迟受试者中糖尿病的发作是指使糖尿病的至少一种症状，例如高血糖症、低胰岛素血症、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病、失明、记忆丧失、肾衰竭、心血管疾病(包括冠状动脉疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病、动脉粥样硬化和高血压)、神经病、自主神经功能障碍、高血糖高渗性昏迷或其组合的发作延迟至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少1年、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年、至少30年、至少40年或更久，并且可以包括受试者的整个生命期间。
在一些方面，本公开内容涉及这样的方法，其包括在受试者中植入包含本文提供的细胞或细胞簇(例如，胰岛素产生细胞)的装置，其中所述装置以足以降低受试者中的血糖水平的量释放胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素产生细胞是葡萄糖响应性胰岛素产生细胞。
在一些实施方案中，由细胞或细胞簇或本文提供的装置的移植诱导的受试者中血糖水平的降低导致葡萄糖的量低于糖尿病阈值。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，该哺乳动物受试者是人。在一些实施方案中，在植入后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，葡萄糖的量减少至低于糖尿病阈值。
如上详述的，本公开内容的药物组合物可以被特别地配制用于以固体或液体形式使施用，包括适用于以下的那些：(1)口服施用，例如兽用顿服药(水性或非水性溶液或悬浮液)、锭剂、糖衣丸，胶囊、丸剂、片剂(例如，针对颊、舌下和全身吸收的片剂)、大丸剂、粉末、颗粒、用于施加于舌头的糊剂；(2)肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射例如无菌溶液或悬浮液或缓释制剂；(3)局部施加，例如作为乳膏、软膏或者施加于皮肤的控释贴剂或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如阴道栓、乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)眼；(7)经皮；(8)经粘膜；或(9)鼻。另外，可以将化合物植入到患者体内或使用药物递送系统注射。参见，例如Urquhart等人，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199-236(1984)；Lewis编著“Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals”(Plenum Press，New York，1981)；美国专利号3,773,919；以及美国专利号353,270,960。
可以通过本文的方法治疗的受试者可以是人类或非人类动物。在一些情况下，受试者可以是哺乳动物。受试者的实例包括但不限于灵长类动物，例如，猴子、黑猩猩、狒狒或人类。在一些情况下，受试者是人类。受试者可以是非灵长类动物，包括但不限于狗、猫、马、奶牛、猪、绵羊、山羊、兔等。在一些情况下，接受治疗的受试者是有需要的受试者，例如，有需要的人类。
在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”和“受试者”在本文可互换使用。优选地，受试者是哺乳动物。该哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。非人的哺乳动物可以有利地用作代表1型糖尿病、2型糖尿病或前驱糖尿病状况的动物模型的受试者。另外，本文所述的方法可以用于治疗家养动物和/或宠物。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是先前已被诊断或被鉴别为患有糖尿病(例如1型或2型)、糖尿病相关的一种或多种并发症或前驱糖尿病状况的个体，并且任选地但不必需已经经历了针对糖尿病、糖尿病相关的一种或多种并发症或前驱糖尿病状况的治疗。受试者还可以是未患有糖尿病或前驱糖尿病状况的受试者。受试者还可以是已经被诊断或被鉴别为患有糖尿病、糖尿病相关的一种或多种并发症或前驱糖尿病状况，但是由于接受针对糖尿病、糖尿病相关的一种或多种并发症或前驱糖尿病状况的一种或多种治疗而显示出已知糖尿病风险因素的改善的个体。替代地，受试者还可以是先前未被诊断患有糖尿病、糖尿病相关的一种或多种并发症或前驱糖尿病状况的受试者。例如，受试者可以是表现出一种或多种糖尿病、糖尿病相关的并发症或前驱糖尿病状况的风险因素的受试者，或者未表现出糖尿病风险因素的受试者，或者是对糖尿病、糖尿病相关的一种或多种并发症或前驱糖尿病状况的无症状的受试者。受试者还可以是患有或有风险发展糖尿病或前驱糖尿病状况的受试者。受试者还可以是已被诊断或鉴别为患有与本文所定义的糖尿病或前驱糖尿病状况相关的一种或多种并发症的受试者，或者备选地，受试者可以是先前未被诊断或鉴别为患有与糖尿病或前驱糖尿病状况相关的一种或多种并发症的受试者。
所述方法可以包括使用本领域中的任何手段将细胞簇移植到受试者。例如，所述方法可以包括经由腹膜内间隙、肾小囊下、肾小囊、网膜、皮下间隙或经由胰床输注来移植细胞簇。例如，移植可以是囊下移植、肌肉内移植或门静脉内移植，例如，门静脉内输注。可以实施免疫保护性封装以对细胞簇提供免疫保护。在一些情况下，本文提供的治疗方法可以包括施用免疫反应调节剂，以调节或减少针对植入物(例如，细胞或装置)的移植排斥反应或其他免疫反应。可以在该方法中使用的免疫反应调节剂的实例可包括嘌呤合成抑制剂，如硫唑嘌呤和霉酚酸；嘧啶合成抑制剂，如来氟米特和特立氟胺；抗叶酸剂，如甲氨蝶呤、他克莫司、环孢素、吡美莫司、阿贝莫司、胍立莫司、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺，PDE4抑制剂，阿普斯特、阿那白滞素、西罗莫司、依维莫司、地磷莫司、坦罗莫司、咗他莫司(Umirolimus)、佐他莫司，抗胸腺细胞球蛋白抗体，抗淋巴细胞球蛋白抗体CTLA-4、其片段及其融合蛋白，如阿巴西普和贝拉西普，TNF抑制剂如依那西普和培那西普(Pegsunercept)、阿柏西普、阿法西普、利纳西普；针对补体成分5的抗体如依库珠单抗；抗TNF抗体如阿达木单抗、阿非莫单抗、培化舍珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗和奈瑞莫单抗；针对白介素5的抗体如美泊利单抗；抗IgE抗体如奥马珠单抗；抗干扰素抗体如法拉莫单抗；抗IL-6抗体如伊斯利莫；针对IL-12和IL-23的抗体如来金珠单抗(Lebrikizumab)和乌司奴单抗；抗IL-17A抗体如苏金单抗；抗CD3抗体如莫罗单抗-CD3、奥昔珠单抗、替利珠单抗和维西珠单抗；抗CD4抗体如克立昔单抗(Clenoliximab)、凯利昔单抗(Keliximab)和扎木单抗(Zanolimumab)；抗CD11a抗体如依法珠单抗；抗CD18抗体如厄利珠单抗(Erlizumab)；抗CD20抗体如奥槟尤妥珠单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)和帕考珠单抗(Pascolizumab)；抗CD23抗体如Gomiliximab和鲁昔单抗；抗CD40抗体如替奈昔单抗和托利珠单抗(Toralizumab)；针对CD62L/L-选择素的抗体如阿塞珠单抗；抗CD80抗体如加利昔单抗；抗CD147/基础免疫球蛋白(Basigin)抗体如加维莫单抗(Gavilimomab)；抗CD154抗体如芦利珠单抗(Ruplizumab)；抗BLyS抗体如贝利木单抗和Blisibimod；抗CTLA-4抗体如伊匹木单抗和曲美木单抗；抗CAT抗体如柏替木单抗、乐德木单抗(Lerdelimumab)和美替木单抗(Metelimumab)；抗整合素抗体如那他珠单抗；针对白介素-6受体的抗体如托珠单抗；抗LFA-1抗体如奥度莫单抗；针对IL-2受体/CD25的抗体如巴利昔单抗、达克珠单抗和伊诺莫单抗；针对T-淋巴细胞的抗体(阿佐莫单抗)如阿托木单抗(Atorolimumab)、西地珠单抗(Cedelizumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、马司莫单抗、莫罗木单抗(Morolimumab)、培克珠单抗、瑞利珠单抗、罗维珠单抗(Rovelizumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、他利珠单抗、阿替莫单抗、伐利昔单抗和维帕莫单抗。
“消泡剂”减少加工过程中的起泡，这可能导致水性分散体的凝结、成品薄膜中的气泡或通常损害加工过程。示例性消泡剂包括硅乳液或山梨醇酐倍半油酸酯。
“抗氧化剂”包括例如丁基羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸钠、抗坏血酸、焦亚硫酸钠和生育酚。在某些实施方案中，抗氧化剂在需要时增强化学稳定性。
本文所述的制剂可以受益于抗氧化剂、金属螯合剂、含硫醇化合物和其他一般稳定剂。这些稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油，(b)约0.1％至约1％w/v蛋氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v硫代甘油，(d)约1mM至约10mM EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸右旋糖酐，(k)环糊精，(l)戊聚糖多硫酸盐和其他类肝素，(m)二价阳离子，如镁和锌；或(n)其组合。
“粘合剂”赋予粘性特征并且包括例如海藻酸及其盐；纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如，
Figure BDA0002756558730001481
)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如，
Figure BDA0002756558730001482
)、乙基纤维素(例如，
Figure BDA0002756558730001491
)和微晶纤维素(例如，
Figure BDA0002756558730001492
)；微晶葡萄糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；交聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖如蔗糖(例如，
Figure BDA0002756558730001493
)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨醇、木糖醇(例如，
Figure BDA0002756558730001494
)和乳糖；天然胶或合成胶，如阿拉伯胶、黄蓍胶、加蒂胶、车前子壳胶、聚乙烯吡咯烷酮(例如，
Figure BDA0002756558730001495
CL、
Figure BDA0002756558730001496
CL、
Figure BDA0002756558730001497
XL-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、
Figure BDA0002756558730001498
聚乙二醇、蜡、海藻酸钠等。
“载体”或“载体材料”包括药剂学中任何常用的赋形剂，并且应基于与本文公开的化合物(如依鲁替尼和抗癌剂的化合物)的相容性以及所需剂型的释放特性来选择。示例性的载体材料包括，例如，粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、湿润剂、稀释剂等。“药学上相容的载体材料”可以包括但不限于，阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、卡拉胶、单酸甘油酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第十九版(Easton，Pa.:Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington’s PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.，伊斯顿，宾夕法尼亚州1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.，Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，纽约，纽约州，1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第七版(LippincottWilliams&Wilkins1999)。
“分散剂”和/或“粘度调节剂”包括通过液体介质或造粒法或混合法控制药物扩散和均匀性的材料。在一些实施方案中，这些试剂还促进涂层或可侵蚀性骨架制剂的有效性。示例性的扩散促进剂/分散剂包括例如亲水性聚合物、电解质、
Figure BDA0002756558730001499
或80、PEG、聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商业上称为
Figure BDA0002756558730001501
)和基于碳水化合物的分散剂例如羟丙基纤维素(例如，HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMCK15M和HPMC K100M)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、硬脂酸乙酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)、非晶态纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、带有环氧乙烷和甲醛的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，Pluronics
Figure BDA0002756558730001502
和
Figure BDA0002756558730001503
其是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；以及泊洛沙明(poloxamine)(例如，
Figure BDA0002756558730001504
也称为Poloxamine
Figure BDA0002756558730001505
它是将环氧丙烷和环氧乙烷依次加成到乙二胺中的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation，Parsippany，NJ))、聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇(例如聚乙二醇的分子量可为约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨酯80、海藻酸钠、树胶(如西黄蓍胶和阿拉伯胶)、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原胶)、糖、纤维素(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、聚山梨酯80、海藻酸钠、聚乙氧基脱水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基脱水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂如纤维素或三乙基纤维素也可以用作分散剂。在脂质体分散体和自乳化分散体中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、鸡蛋中的天然磷脂酰胆碱、鸡蛋中的天然磷脂酰甘油、胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯。
一种或多种腐蚀促进剂与一种或多种扩散促进剂的组合也可以用于本发明的组合物中。
术语“稀释剂”是指在递送前用于稀释目标化合物的化合物。稀释剂还可以用于稳定化合物，因为它们可以提供更稳定的环境。溶解在缓冲溶液中的盐(其也可以提供pH控制或维持)在本领域中用作稀释剂，其包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积，以促进压缩或为胶囊填充的均匀混合产生足够的体积。这些化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素如
Figure BDA0002756558730001511
磷酸氢钙、二水合磷酸氢钙；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖如
Figure BDA0002756558730001512
(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸乙酸羟丙基甲基纤维素、蔗糖基稀释剂、糖粉；一水合硫酸钙、二水合硫酸钙；三水合乳酸钙、葡萄糖结合剂；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇，膨润土等。
“填充剂”包括诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、葡萄糖、葡萄糖结合剂、右旋糖酐、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等化合物。
“润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料粘附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸、氢氧化钙、滑石粉、硬脂富马酸钠、烃(如矿物油或氢化植物油如氢化大豆油
Figure BDA0002756558730001513
)、高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐(如铝、钙、镁、锌)、硬脂酸、硬脂酸钠、甘油、滑石粉、蜡、
Figure BDA0002756558730001514
硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇(如CarbowaxTM)、油酸钠、苯甲酸钠、山萮酸甘油酯、聚乙二醇、十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠、胶体二氧化硅(如SyloidTM、
Figure BDA0002756558730001515
)、淀粉(如玉米淀粉)、硅油、表面活性剂等。
“增塑剂”是用于软化微囊化材料或薄膜涂层，以使其不那么脆的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇(如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800)、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三乙酸甘油酯。在一些实施方案中，增塑剂还可以作为分散剂或湿润剂。
“增溶剂”包括诸如三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠(sodium doccusate)、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆盐、聚乙二醇200-600、三缩四乙二醇、二乙二醇单乙基醚、丙二醇和二甲基异山梨醇等化合物。
“稳定剂”包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等化合物。
“悬浮剂”包括诸如聚乙烯吡咯烷酮(例如，聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630))、聚乙二醇(例如，聚乙二醇可以具有分子量约300至约6000，或约3350至约4000或约7000至约5400)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸乙酸羟甲基纤维素、聚山梨酯80、羟乙基纤维素、海藻酸钠、树胶(如西黄蓍胶和阿拉伯胶)、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原胶)、糖、纤维素(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素)、聚山梨酯80、海藻酸钠、聚乙氧基脱水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基脱水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。
“表面活性剂”包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三乙酸甘油酯、维生素E TPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨酸酯、polaxomer、胆盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物例如
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(BASF)等化合物。其他一些表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如，聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如，辛苯昔醇10、辛苯昔醇40。在一些实施方案中，可以包括表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
“增粘剂”包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸乙酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、海藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
“润湿剂”包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三乙酸甘油酯、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
本公开内容不限于以上描述和示例的实施方案，而是能够在所附权利要求的范围内进行变更和修改。
示例性实施方案
[1]一种方法，包括：
使胰腺祖细胞或其前体的群体与包括至少一种表观遗传修饰化合物的组合物接触，其中与未接触所述至少一种表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中表达VMAT或Cdx2的细胞比例降低。
[2]根据段[1]所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂中的一种或多种。
[3]根据段[2]所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。
[4]根据段[3]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
[5]根据段[3]或[4]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。
[6]根据段[5]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
[7]根据段[6]所述的方法，其中所述DZNep在所述组合物中的浓度大于0.1μM。
[8]根据段[7]所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为至少0.5μM。
[9]根据段[7]所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为约1μM。
[10]根据段[1]至[9]中任一项所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。
[11]根据段[10]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
[12]根据段[11]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170、MC1568或TMP195中的至少一种。
[13]根据段[12]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
[14]根据段[1]所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。
[15]根据段[1]所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括DZNep和KD5170。
[16]根据段[1]-[15]中任一项所述的方法，其中表达VMAT的所述细胞中的至少一种是INS-。
[17]根据段[1]-[16]中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群体中的至少一些细胞分化为PH细胞群体。
[18]根据段[17]所述的方法，其中与未接触所述至少一种表观遗传修饰化合物的所述相应的内分泌细胞群体相比，所述内分泌细胞群体中增加比例的细胞为NKX6.1-或ChromA+。
[19]根据段[18]所述的方法，其中所述增加比例的细胞中的至少一个细胞为NKX6.1-和ChromA+。
[20]根据段[1]-[19]中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群体中的至少一些细胞分化为β细胞群体。
[21]根据段[20]所述的方法，其中所述β细胞是干细胞衍生的β(SC-β)细胞。
[22]根据段[20]或[21]所述的方法，其中所述β细胞表达C-PEP和NKX6-1。
[23]根据段[20]-[22]中任一项所述的方法，其中所述β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
[24]根据段[1]-[23]中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
[25]根据段[24]所述的方法，其中所述组合物包括β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN或星形孢菌素中的至少一种。
[26]根据段[24]或[25]所述的方法，其中所述接触为至少三天。
[27]根据段[24]或[25]所述的方法，其中所述接触为至少五天。
[28]根据段[24]或[25]所述的方法，其中所述接触为约7天。
[29]根据段[1]-[28]中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群体中的至少一种胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1中的至少一种。
[30]根据段[1]-[29]中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体中的至少一种内分泌细胞表达CHGA。
[31]根据段[1]-[30]中任一项所述的方法产生的细胞。
[32]一种组合物，其包括胰腺祖细胞、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂和任选的内分泌细胞。
[33]根据段[32]所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
[34]根据段[33]所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是KD5170、MC1568或TMP195中的至少一种。
[35]根据段[34]所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
[36]根据段[35]所述的组合物，其中所述KD5170在所述组合物中的浓度为至少0.1μM。
[37]根据段[36]所述的组合物，其中所述KD5170的所述浓度为至少0.5μM。
[38]根据段[37]所述的组合物，其中所述KD5170的所述浓度为约[1μM。
[39]根据段[32]-[38]中任一项所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
[40]根据段[39]所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。
[41]根据段[40]所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
[42]根据段[41]所述的组合物，其中所述DZNep的浓度为至少0.1μM。
[43]根据段[42]所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为至少0.5μM。
[44]根据段[42]所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为约[1μM。
[45]根据段[32]所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是KD5170，并且所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
[46]根据段[32]-[45]中任一项所述的组合物，其中所述组合物是体外组合物。
[47]根据段[46]所述的组合物，其中所述组合物进一步包括β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN或星形孢菌素中的至少一种。
[48]一种方法，其包括使胰腺祖细胞或其前体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂和组蛋白甲基转移酶抑制剂接触，其中所述接触诱导所述胰腺祖细胞的分化。
[49]根据段[48]所述的方法，其中所述胰腺祖细胞分化为β细胞。
[50]根据段[49]所述的方法，其中所述β细胞是干细胞衍生的β(SC-β)细胞。
[51]根据段[49]或[50]所述的方法，其中所述β细胞表达C-PEP和NKX6-1。
[52]根据段[49]-[51]中任一项所述的方法，其中所述β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
[53]根据段[48]-[52]中任一项所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
[54]根据段[53]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170、MC1568或TMP195中的至少一种。
[55]根据段[54]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
[56]根据段[48]-[55]中任一项所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
[57]根据段[56]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。
[58]根据段[57]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
[59]根据段[48]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170，并且所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
[60]根据段[48]-[59]中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
[61]一种方法，其包括使胰腺祖细胞或其前体与足以导致所述细胞分化的量的KD5170接触。
[62]根据段[61]所述的方法，其进一步包括用组蛋白甲基转移酶抑制剂收缩所述胰腺祖细胞。
[63]根据段[62]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。
[64]根据段[63]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
[65]根据段[61]-[64]中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞分化为内分泌细胞。
[66]根据段[61]-[65]中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞分化为β细胞。
[67]根据段[66]所述的方法，其中所述β细胞是干细胞衍生的β(SC-β)细胞。
[68]根据段[66]或[67]所述的方法，其中所述β细胞表达C-PEP和NKX6-1。
[69]根据段[66]-[68]中任一项所述的方法，其中所述β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
[70]一种方法，其包括：
a)在体外分化多个干细胞，以获得包括胰腺祖细胞或其前体的细胞群体；
b)在体外使所述细胞群体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂接触，以产生至少一种内分泌细胞；以及
c)在体外使所述内分泌细胞成熟，以获得至少一种SC-β细胞。
[71]根据段[70]所述的方法，其中所述干细胞是人多能干细胞。
[72]根据段[70]或[71]所述的方法，所述方法进一步包括使所述细胞群体与β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN或星形孢菌素中的至少一种接触。
[73]根据段[70]-[72]中任一项所述的方法，其中所述SC-β细胞表达C-PEP和NKX6-1。
[74]根据段[70]-[73]中任一项所述的方法，其中所述SC-β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
[75]根据段[70]-[74]中任一项所述的方法，其进一步包括用组蛋白甲基转移酶抑制剂收缩所述细胞群体。
[76]根据段[75]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。
[77]根据段[76]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
[78]根据段[70]-[77]中任一项所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
[79]一种方法，其包括在体外使包括胰腺祖细胞或其前体的细胞群体与足以产生内分泌细胞的量的组蛋白甲基转移酶抑制剂接触；以及
在体外使所述内分泌细胞成熟，以获得至少一种SC-β细胞，所述SC-β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
[80]根据段[79]所述的方法，其进一步包括在体外分化多个干细胞，以获得包括所述胰腺祖细胞或其前体的所述细胞群体。
[81]根据段[79]或[80]所述的方法，所述方法进一步包括使所述细胞群体与β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN或星形孢菌素中的至少一种接触。
[82]根据段[79]-[81]中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞群体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂接触。
[83]根据段[82]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
[84]根据段[79]-[83]中任一项所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。
[85]根据段[84]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
[86]一种用于从细胞群体中选择靶细胞的方法，包括：
(i)使所述靶细胞与刺激性化合物接触，其中所述接触诱导所述靶细胞的可选择的标志物定位于所述靶细胞的细胞表面；以及
(ii)基于所述可选择的标志物在所述细胞表面的所述定位选择所述靶细胞。
[87]根据段[86]所述的方法，其中所述可选择的标志物包括PSA-NCAM。
[88]根据段[87]所述的方法，其中所述选择所述靶细胞是通过细胞分选来进行。
[89]根据段[88]所述的方法，其中所述选择包括当所述可选择的标志物位于所述靶细胞的所述表面时，使所述靶细胞的所述可选择的标志物与抗原结合多肽接触。
[90]根据段[89]所述的方法，其中所述抗原结合多肽包括抗体。
[91]根据段[90]所述的方法，其中所述抗原结合多肽结合所述PSA-NCAM。
[92]根据段[86]-[91]中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括用化合物处理所述细胞群体，所述化合物从所述细胞群体的至少一种细胞的细胞表面去除所述可选择的标志物。
[93]根据段[92]所述的方法，其中在所述靶细胞与所述刺激性化合物接触之前，用所述化合物处理所述细胞群体。
[94]根据段[92]或[93]所述的方法，其中所述化合物从所述至少一种细胞的所述细胞表面切割所述可选择的标志物。
[95]根据段[94]所述的方法，其中所述化合物是酶。
[96]根据段[95]所述的方法，其中所述化合物是内内唾液酸酶。
[97]根据段[96]所述的方法，其中所述内唾液酸酶是内神经氨酸苷酶(Endo-N)。
[98]根据段[86]-[97]中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是内分泌细胞。
[99]根据段[86]-[98]中任一项所述的方法，其中所述刺激性化合物包括精氨酸或葡萄糖中的至少一种。
[100]根据段[98]所述的方法，其中所述内分泌细胞是β细胞。
[101]根据段[101]所述的方法，其中所述β细胞是SC-β细胞。
[102]根据段[98]所述的方法，其中所述刺激性化合物包括异丙肾上腺素。
[103]根据段[98]所述的方法，其中所述内分泌细胞是EC细胞。
[104]根据段[86]-[103]中任一项所述的方法，其中当与所述刺激性化合物接触时，所述细胞群体中的一种或多种细胞不能将所述可选择的标志物定位于细胞表面。
[105]根据段[104]所述的方法，其中所述刺激性化合物是葡萄糖或精氨酸中的至少一种，并且所述一种或多种细胞是EC细胞。
[106]根据段[104]所述的方法，其中所述刺激性化合物是异丙肾上腺素，并且所述一种或多种细胞是β细胞。
[107]根据段[104]-[106]中任一项所述的方法，其中所述选择所述靶细胞将所述靶细胞与所述细胞群体的所述一种或多种细胞分离。
[108]一种方法，包括：
使胰腺祖细胞或其前体的群体与包括至少一种表观遗传修饰化合物的组合物接触，其中与未接触所述至少一种表观遗传修饰化合物的相应的胰腺祖细胞群体相比，所述接触导致胰岛细胞比例增加。
[109]根据段[108]所述的方法，其中所述胰岛细胞包括至少一种β细胞。
[110]根据段[109]所述的方法，其中所述β细胞包括SC-β细胞。
[111]根据段[110]所述的方法，其中所述SC-β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
[112]根据段[108]所述的方法，其中所述胰岛细胞包括至少一种α细胞。
[113]根据段[108]所述的方法，其中所述胰岛细胞包括δ细胞。
[114]根据段[108]所述的方法，其中所述胰岛细胞包括多激素(PH)细胞。
[115]根据段[108]-[114]中任一项所述的方法，其进一步包括在体外分化多个干细胞，以获得所述胰腺祖细胞或其前体的群体。
[116]根据段[115]所述的方法，其中所述干细胞是人多能干细胞。
[117]根据段[108]-[116]中任一项所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂中的一种或多种。
[118]根据段[117]所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。
[119]根据段[118]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
[120]根据段[118]或[119]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep、GSK126或EPZ6438中的至少一种。
[121]根据段[120]所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
[122]根据段[121]所述的方法，其中所述DZNep在所述组合物中的浓度大于0.1μM。
[123]根据段[122]所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为至少0.5μM。
[124]根据段[123]所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为约1μM。
[125]根据段[108]至[124]中任一项所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。
[126]根据段[125]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
[127]根据段[126]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170、MC1568或TMP195中的至少一种。
[128]根据段[127]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
[129]根据段[108]所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。
[130]根据段[108]所述的方法，其中所述至少一种表观遗传修饰化合物包括DZNep和KD5170。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明的目的而非限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1.hPSC衍生的β细胞中的组蛋白乙酰化
使用系统方法(例如Arda等人(Cell Metabolism 23：909-920，2016))鉴定人胰岛细胞中年龄相关性基因表达程序，该程序包括(1)获得儿童和成人的胰腺组织；(2)开发强大且可靠的细胞纯化方法；(3)生成完整的转录组和组蛋白修饰图谱；以及(4)胰岛生理和功能的系统分析。在所述的全基因组组蛋白图谱上揭示了少年和成年人类胰岛细胞中组蛋白介导的年龄相关性基因调节的不同模式。Xu等人(EMBO J 2014)描述了内分泌祖细胞中NGN3、NKX6.1和NKX2.2基因的组蛋白甲基化降低。在NGN3细胞中，H3K27me3从NGN3、NeuroD1和NKX6.1元件中缺失，这与各个基因的激活一致。Haumaitre等人(MCB 2013)报告了胰腺分化过程中HDAC表达和活性的总体下降。Xie(Cell Stem Cell，2013)报告了染色质结构在体外分化过程中被不适当地重构。EZH2抑制和HDAC抑制增加NGN3的表达，并产生更多的干细胞衍生的β细胞，这表明NGN3对β细胞的发育很重要。
实施例2.组蛋白甲基化和脱乙酰基的抑制
在本文所述的定向分化的每个步骤中研究了NGN3的mRNA表达(图5)，并且观察到细胞表达NGN3，以引发SC-β细胞分化(图7)。研究了组蛋白甲基化和脱乙酰基的抑制对SC-β细胞分化的影响(图6)。用EZH2抑制剂(DZNep)、HDAC抑制剂(KD5170)及其组合(图6)处理hESC系(D97、D114和D241 HUES8)的本文所述的定向分化的第5阶段(图5-图6)。
如图18所示进行候选抑制剂筛选。在第5阶段中EZH2或HDAC的抑制(D97 HUES8)增加了内分泌细胞和SC-β细胞(图8)。在第5阶段(D114 HUES8)中EZH2和HDAC的组合抑制显著增加了内分泌细胞(图9-图11)。在第5阶段结束时，使用DZNep和KD5170，包括35.4％的SC-β细胞。C肽阳性细胞的总百分比为39.6％，这表明存在最多4％的C肽阳性NKX6.1多激素细胞(图11)。如图17所示测试了第5阶段中EZH2和HDAC的组合抑制。在第5阶段中EZH2和HDAC的组合抑制(D241 HUES8)在第5阶段中增加了神经元素(neorogenin)3+祖细胞(图12-图13)。在第5阶段中EZH2和HDAC的组合抑制增加了NKX6.1+祖细胞(图16)。
DZNep的抑制显示VMAT1+INS-EC群体的特异性减少(图19)，NKX6.1-ChromA+PH细胞的伴随增加(图20)，以及未受影响的NKX6.1+INS+SC-β细胞群体(图21)。在整个第5阶段中用DZNep(1μM)抑制去除一半以上的(VMAT1+INS-)EC群体，而不影响存活率(图19-图21)。
总之，组蛋白甲基转移酶和脱乙酰基酶抑制剂增加了NGN3表达和β细胞分化，并且在第5阶段通过DZNep的EZH2抑制增加了内分泌细胞(CHGA+)、祖细胞(NKX6-1+)和前-SC-b细胞(C-PEP+、NKX6-1+)的比例。其他EZH2抑制剂(UNC1999，GSK126)没有增加所有3种细胞类型的比例(图14)。在第5阶段中，通过KD5170的HDAC抑制增加了前-SC-β细胞(C-PEP+、NKX6-1+)的百分比。其他HDAC抑制剂(丁酸钠、TSA、SAHA)没有增加前-SC-β细胞的百分比(图15)。在第5阶段(HUES8)中，通过DZNep和KD5170的组合的EZH2和HDAC抑制协同且显著增强了内分泌细胞(CHGA+)、祖细胞(NKX6-1+)和前-SC-b细胞(C-PEP+，NKX6.1+)的分化。
实施例3.干细胞向胰腺β细胞(SC-β细胞)的分化
如图39所示，测试了两个示例性分化方案v11和v12。这两个方案都是共享相似试剂的6阶段逐步方案，它们的前5个阶段的分化步骤主要基于如图5所示的分化方案，并且它们的差异如下：(a)在v12方案中，第3阶段第1天(S3d1)的培养基中存在0.25μM DMH-1，并且在第3阶段的第1天和第2天(S3d1-S3d2)的培养基中存在20ng/mL的激活素A；(b)在v11方案中，第3阶段未添加DMH-1或激活素A；(c)在v11和v12方案中，在第5阶段的第1、3、5、7天，DZNep在培养基中以100nM存在。v11和v12方案的第6阶段都是通过在DMEM/F12培养基中培养第5阶段的产物细胞进行的，DMEM/F12培养基中添加1％HAS，无外源分化因子。在整个第6阶段中，培养基每隔一天更换一次。
在一个实验中，在不同阶段检测了衍生自两种不同方案的干细胞系D705的细胞培养物。图40示出了当分别在第4阶段(S4)和第5阶段(S5)的分化细胞中检查了NKX6.1、Pdx1、Cdx2、ISL1和CHGA的表面表达水平时的流式细胞术结果。如图所示，v12方案降低了S4的Cdx2+细胞的百分比以及S5的ISL1-/NKX6.1-细胞的百分比，并增加了S5的分化ISL+/NKX6.1+细胞的百分比。
在第5阶段的冷冻保存和重新聚集程序(CryoRA细胞)之后，以及在恢复细胞进行第6阶段(S6)分化之前，也检测细胞培养物。在该实验中，如图41的曲线图所示，在第6阶段的第11天(S6d11)对CryoRA细胞簇的细胞计数显示，与通过v11方案获得的细胞相比，通过v12方案获得的细胞的细胞收率高得多。通过两种方案获得的S6d11细胞的流式细胞术分析(图42)表明，Sc-β细胞组成构成相当的百分比，约40％。还进行了体外GSIS测定，以检测通过两种方案获得的S6d14细胞的葡萄糖应答，这表明两种方案之间的结果是相当的。胰岛素含量也显示是相当的(图43)。
在一个实验中，根据示例性方案在生物反应器中产生了包括胰腺β细胞的细胞簇。在葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)测定中(图44A)，将SC-胰岛细胞簇依次暴露于低(LG，2.8mM)或高(HG，20mM)葡萄糖条件或2.8mM葡萄糖和30mM KCl(KCl)的组合下。示出了6个独立批次的平均值。作为分析活性的另一种方法，裂解SC-胰岛细胞簇并分析总胰岛素含量(图44B)。数据为平均值+/-SEM。
实施例4.SC-β细胞表面标志物识别筛选和分选
用371个APC缀合的单克隆抗体进行识别选择性SC-β细胞表面标志物的细胞表面标志物文库筛选(Miltenyi MACS标志物筛选)(图22-图23)。筛选示出52.3％(371个中的194个)的孔含有足够的细胞用于分析。可以如图24所示进行用Newport green或fluozin-3标记活体SC-β细胞和MACS标志物筛选。
如图28所述，通过PSA-NCAM微珠分选进行SC-β细胞的纯化。基于PSA-NCAM微珠的分选富集了靶细胞，并且减少了SOX9+细胞(图25)。PSA-NCAM分选后保留EC细胞(VMAT1+)(图26)。分选后将细胞培养14天。Endo-N酶处理后，PSA-NCAM表达显著降低(图27)。Endo-N是一种内唾液酸酶，可快速且特异性地降解具有α-2,8-键的唾液酸线性聚合物，其最小长度为7-9个残基，所述残基的特征是与NCAM相关的唾液酸残基。在生理条件下切割NCAM上的PSA。
为了使用PSA-NCAM去除EC细胞，可以用Endo-N酶去除预退出的PSA-NCAM，并且可以通过用精氨酸刺激在SC-β细胞上选择性表达PSA-NCAM。可以使用微珠分选表达PSA-NCAM的SC-β细胞，如图28所示。
实施例5.提高hESC质量和DE诱导
在分化的早期指定肠谱系，并且EC细胞可以从指定的肠祖细胞产生(图29)。第0阶段的低Oct4％导致稍后阶段的CDX2百分比升高。强分化需要高Oct4％。即使在高Oct4％的情况下，仍然保持Sox17诱导的可变性(图30)。CDX2+肠道群由第1阶段因子浓度决定。微调Chir/AA的浓度和时间可以降低CDX2群体并提高SC-β细胞分化。
实施例6.EC细胞分化抑制剂的筛选
在图31-图32示出了在5阶段细胞上的鉴定EC细胞分化抑制剂的进一步化合物筛选策略。基质胶涂覆的96孔板用于播种分化的细胞。将细胞以0.1-0.3×106个细胞/孔铺板。为了对照，仅使用DMSO。在0.1％DMSO中以0.1μM、1.0μM和10μM的浓度筛选Wnt途径文库、表观遗传学文库、GPCR化合物文库和干细胞信号传导化合物激素文库。通过以CDX2+作为早期标志物和VMAT+作为晚期标志物的高含量图像分析来确定EC细胞定量。
实施例7.干细胞衍生的胰岛细胞的γ-辐照
用不同的辐照剂量(8,000rads和10,000rads)抑制干细胞衍生的胰岛细胞群体的增殖。当无辐照进行时，观察到细胞的增殖和植入物的增大(图33)。高剂量γ辐照(10,000rads)对干细胞衍生的胰岛细胞的组成和功能无显著影响(图34)。研究了辐照冷冻保存的干细胞衍生的胰岛细胞控制血糖的能力。冷冻保存的细胞在辐照后立即解冻、辐照并植入，没有恢复。冷冻保存的干细胞衍生的胰岛细胞在辐照后60天失去了控制血糖的能力(图35)。在辐照样品中观察到增加的β细胞数量(图35-图36)。在一个实验中，在解冻冷冻保存的干细胞衍生的胰岛细胞之前进行了γ-辐照，然后从冷冻保存恢复这些细胞，并在将其植入动物模型之前重新聚集(解冻前辐照)。如图37所示，与接受从冷冻保存恢复后辐照的干细胞衍生的胰岛细胞植入的动物(解冻后辐照)相比，植入了接受解冻前辐照的干细胞衍生的胰岛细胞的动物表现出在更长时间内的血糖控制。植入了经辐照的干细胞衍生的胰岛细胞的所有动物均显示出血糖控制，直到植入物被移出(图38)。
总之，增殖细胞的数量取决于γ-辐照的剂量。当干细胞衍生的胰岛细胞用较高的照射量辐照时，增殖细胞的数量较少。γ-辐照对干细胞来源的胰岛细胞的组成和功能无明显影响。在冷冻细胞的同时进行γ-辐照时，所得的干细胞来源的胰岛细胞植入物在植入的动物模型中具有更长的血糖控制作用。
虽然本文已经示出和描述了本公开内容的优选实施方案，但这样的实施方案仅以示例的方式提供。在不偏离本公开内容的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本公开内容实施方案的各种替代方案可用于实施本公开内容。以下权利要求旨在限定本公开内容的范围，并且由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (162)

1.一种方法，其包括：
将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中嗜铬粒蛋白A阳性(CHGA+)细胞或C肽阳性和NKX6.1阳性(C-PEP+、NKX6.1+)细胞的比例增加。
2.一种方法，其包括：
将胰腺祖细胞或其前体的群体与表观遗传修饰化合物接触，其中与未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体相比，所述接触导致内分泌细胞群体中表达VMAT或Cdx2的细胞比例降低。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括一种或多种DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
8.根据权利要求7所述的方法，其中与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触的所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为至少约0.5μM。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为约1μM。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括DZNep和KD5170。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其进一步包括使所述胰腺祖细胞或其前体的群体与选自以下的试剂接触：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中：
(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；
(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；
(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；
(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。
(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；
(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；
(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；
(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或者
(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其包括使所述胰腺祖细胞或其前体的群体与选自以下的试剂接触：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述接触为至少三天。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述接触包括将所述胰腺祖细胞或其前体的群体与所述表观遗传修饰化合物接触超过三天的时间段，并且在所述时间段的前三天与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触之后，从所述EGF家族中去除所述SHH途径抑制剂、所述RA信号传导途径激活剂或所述生长因子。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述接触为至少五天。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述接触为约七天。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群体中的至少一个细胞表达PDX1和NKX6-1中的至少一个。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群体中的至少一个细胞表达PDX1和NKX6-1。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体中的至少一个细胞表达CHGA。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体中的至少一个细胞表达C肽和NKX6.1。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体包含的CHGA+细胞的比例比未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％、400％、420％、450％、480％或500％，如通过流式细胞术测量。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体包含的C-PEP+、NKX6.1+细胞的比例比未接触所述表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％、400％、420％、450％、480％或500％，如通过流式细胞术测量。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述内分泌细胞群体包含表达VMAT或Cdx2的细胞的比例比未接触所述至少一种表观遗传修饰化合物的相应内分泌细胞群体低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、320％、350％、380％或400％，如通过流式细胞术测量。
32.通过权利要求1-31中任一项所述的方法产生的细胞。
33.一种包含细胞群体的组合物，其中所述细胞群体包含：
(a)至少约20％的表达C肽和NKX6.1的细胞；
(b)至少约60％的表达CHGA的细胞；
(c)至多约20％的表达Cdx2的细胞；或者
(d)至多约45％的表达VMAT1的细胞，如通过流式细胞术测量。
34.一种组合物，其包含细胞群体，所述细胞群体包含至少约30％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞和至多约20％的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞，如通过流式细胞术测量。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述细胞群体包含至少约35％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞。
36.根据权利要求34所述的组合物，其中所述细胞群体包含至少约40％的ISL1阳性、NKX6.1阳性细胞。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的组合物，其中所述细胞群体包含至多约15％的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞。
38.根据权利要求33-37中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含：
(a)至少约20％的表达C肽和NKX6.1的细胞；
(b)至少约60％的表达CHGA的细胞；以及
(c)至多约20％的表达Cdx2的细胞，如通过流式细胞术测量。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述组合物包含至多约45％的表达VMAT1的细胞，如通过流式细胞术测量。
40.根据权利要求33-39中任一项所述的组合物，其进一步包含表观遗传修饰化合物。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包括一种或多种DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂或溴结构域抑制剂。
42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
44.根据权利要求42或43所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触的所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为至少约0.5μM。
48.根据权利要求46所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为约1μM。
49.根据权利要求40-48中任一项所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。
52.根据权利要求50所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
53.根据权利要求40所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包含HDAC抑制剂和EZH2抑制剂。
54.根据权利要求40所述的组合物，其中所述表观遗传修饰化合物包括DZNep和KD5170。
55.根据权利要求33-54中任一项所述的组合物，其还包含选自以下的试剂：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中：
(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；
(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；
(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；
(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。
(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；
(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；
(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；
(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或者
(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。
57.根据权利要求55或56所述的组合物，其包含选自以下的试剂：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。
58.一种组合物，其包含胰腺祖细胞和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂或组蛋白甲基转移酶抑制剂中的至少一种。
59.根据权利要求58所述的组合物，其进一步包含内分泌细胞。
60.根据权利要求58或59所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
63.根据权利要求62所述的组合物，其中所述组合物中所述KD5170的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述KD5170的所述浓度为至少0.5μM。
65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述KD5170的所述浓度为约1μM。
66.根据权利要求58-65中任一项所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述组合物中所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为至少0.5μM。
71.根据权利要求69所述的组合物，其中所述DZNep的所述浓度为约1μM。
72.根据权利要求58所述的组合物，其中所述HDAC抑制剂是KD5170，且所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
73.根据权利要求58-72中任一项所述的组合物，其中所述组合物是体外组合物。
74.根据权利要求58-73中任一项所述的组合物，其还包含选自以下的试剂：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中：
(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；
(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；
(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；
(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。
(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；
(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；
(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；
(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或者
(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。
76.根据权利要求74或75所述的组合物，其还包含选自以下的试剂：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。
77.一种方法，其包括：
使包含胰腺祖细胞或其前体的细胞群体与组蛋白甲基转移酶抑制剂接触，并产生包含内分泌细胞的细胞群体；以及
使包含内分泌细胞的所述细胞群体成熟，以获得至少一种胰腺β细胞，所述胰腺β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
78.根据权利要求77所述的方法，其进一步包括使所述细胞群体与选自以下的试剂接触：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。
79.根据权利要求78所述的方法，其中：
(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；
(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；
(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；
(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。
(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；
(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；
(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；
(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或者
(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其包括使所述细胞群体与选自以下的试剂接触：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。
81.根据权利要求77-80中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞群体与组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂接触。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
83.根据权利要求77-82中任一项所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
85.根据权利要求77-84中任一项所述的方法，其中与未接触所述组蛋白甲基转移酶抑制剂的相应内分泌细胞群体相比，与所述组蛋白甲基转移酶抑制剂的所述接触得到包含所述内分泌细胞的群体，并且所述群体具有增加比例的嗜铬粒蛋白A阳性(CHGA+)细胞或增加比例的C肽阳性和NKX6.1阳性(C-PEP、NKX6.1+)细胞。
86.根据权利要求77-85中任一项所述的方法，其中与未接触所述组蛋白甲基转移酶抑制剂的相应内分泌细胞群体相比，与所述组蛋白甲基转移酶抑制剂的所述接触得到包含所述内分泌细胞的群体，并且所述群体具有降低比例的表达VMAT或Cdx2的细胞。
87.根据权利要求77-86中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞或其前体中的所述至少一个细胞表达Pdx1和NKX6.1。
88.根据权利要求77-87中任一项所述的方法，其进一步包括在体外分化多个干细胞以获得包含所述胰腺祖细胞或其前体的所述细胞群体。
89.根据权利要求77-88中任一项所述的方法产生的胰腺β细胞。
90.一种方法，其包括：
(a)使Pdx1阴性、NKX6.1阴性的原始肠管细胞的群体与骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子接触，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体；以及
(b)使包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞群体与表观遗传修饰化合物接触，并产生包含内分泌细胞的细胞群体。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述BMP信号传导途径抑制剂包括DMH-1、其衍生物、类似物或变体。
92.根据权利要求91所述的方法，其中与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述DMH-1的浓度为约0.01μM至约10μM、约0.05μM至约5μM、约0.1μM至约1μM或约0.15μM至约0.5μM。
93.根据权利要求91所述的方法，其中与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述DMH-1的浓度为约0.25μM DMH-1。
94.根据权利要求91-93中任一项所述的方法，其中所述来自TGF-β超家族的生长因子包括激活素A。
95.根据权利要求94所述的方法，其中与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述激活素A的浓度为约0.5ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约2ng/mL至约50ng/mL或约5ng/mL至约30ng/mL。
96.根据权利要求94所述的方法，其中与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述激活素A的浓度为至少约5ng/mL或至少约10ng/mL激活素A。
97.根据权利要求94所述的方法，其中与Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的所述群体接触的所述激活素A的浓度为约20ng/mL激活素A。
98.根据权利要求90-97中任一项所述的方法，其中使Pdx1阴性、NKX6.1阴性的原始肠管细胞的所述群体的所述接触还包括与选自以下的试剂接触：来自FGF家族的生长因子、SHH途径抑制剂、RA信号传导途径激活剂、蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂。
99.根据权利要求90-98中任一项所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括选自以下的化合物：DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂和溴结构域抑制剂。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是EZH2抑制剂。
102.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂选自DZNep、GSK126和EPZ6438。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。
104.根据权利要求103所述的方法，其中与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触的所述DZNep的浓度为约0.05μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.75μM至约2.5μM或约1μM至约2μM。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为至少约0.5μM。
106.根据权利要求104所述的方法，其中所述DZNep的所述浓度为约1μM。
107.根据权利要求90-106中任一项所述的方法，其中所述表观遗传修饰化合物包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述HDAC抑制剂选自KD5170、MC1568和TMP195。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是KD5170。
111.根据权利要求90-110中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
112.根据权利要求90-111中任一项所述的方法，其进一步包括使包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞的所述群体与选自以下的试剂接触：(i)SHH途径抑制剂，(ii)视黄酸(RA)信号传导途径激活剂，(iii)γ-分泌酶抑制剂，(iv)表皮生长因子(EGF)家族的生长因子，(v)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂，(vi)TGF-β信号传导途径抑制剂，(vii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，(viii)蛋白激酶抑制剂，以及(ix)ROCK抑制剂。
113.根据权利要求112所述的方法，其中：
(A)所述SHH途径抑制剂包括SANT1；
(B)所述RA信号传导途径激活剂包括视黄酸；
(C)所述γ-分泌酶抑制剂包括XXI；
(D)来自EGF家族的所述生长因子包括β-细胞素。
(E)所述BMP信号传导途径抑制剂包括LDN；
(F)所述TGF-β信号传导途径抑制剂包括Alk5i II；
(G)所述甲状腺激素信号传导途径激活剂包括GC-1；
(H)所述蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素；或者
(I)所述ROCK抑制剂包括thiazovinin。
114.根据权利要求112或113所述的方法，其包括使包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述群体与选自以下的试剂接触：β-细胞素、thiazovinin、视黄酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN和星形孢菌素。
115.根据权利要求112-114中任一项所述的方法，其中所述接触为至少三天。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述接触包括使包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述群体与所述表观遗传修饰化合物接触超过三天的时间段，并且在所述时间段的前三天与所述胰腺祖细胞或其前体的群体接触之后，从所述EGF家族中去除所述SHH途径抑制剂、所述RA信号传导途径激活剂或所述生长因子。
117.根据权利要求112-116中任一项所述的方法，其中所述接触为至少五天。
118.根据权利要求112-116中任一项所述的方法，其中所述接触为约七天。
119.根据权利要求90-118中任一项所述的方法，其中包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞的所述细胞群体包含至多约10％的表达Cdx2的细胞，如通过流式细胞术测量。
120.根据权利要求90-119中任一项所述的方法，其中与未接触所述骨骼形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的所述生长因子相应细胞群体相比，包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞群体包含较少比例的表达Cdx2的细胞。
121.根据权利要求90-120中任一项所述的方法，其中包含内分泌细胞的所述细胞群体包含至少约40％的表达ISL1和NKX6.1的细胞，如通过流式细胞术测量。
122.根据权利要求90-121中任一项所述的方法，其中与所述骨骼形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的所述生长因子未进行所述接触的相应细胞群体相比，包含内分泌细胞的所述细胞群体包含更高比例的表达ISL1和NKX6.1的细胞。
123.根据权利要求90-122中任一项所述的方法，其中包含内分泌细胞的所述细胞群体包含至多约15％的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞，如通过流式细胞术测量。
124.根据权利要求90-122中任一项所述的方法，其中与所述骨骼形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的所述生长因子未进行所述接触的相应细胞群体相比，包含内分泌细胞的所述细胞群体包含较少比例的ISL1阴性、NKX6.1阴性细胞。
125.根据权利要求90-124中任一项所述的方法，其进一步包括冷冻保存包含内分泌细胞的所述细胞群体。
126.根据权利要求90-125中任一项所述的方法，其中包含内分泌细胞的所述细胞群体是细胞簇，并且其中所述方法进一步包括：
(a)从所述细胞簇解离多个细胞；以及
(b)在重聚培养基中培养来自(a)的所述多个细胞，并使得所述多个细胞的至少部分形成第二细胞簇。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述解离不包括使所述多个细胞经受流式细胞术。
128.根据权利要求126或127所述的方法，其中所述重聚培养基是无血清的。
129.根据权利要求126-128中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含外源性分化因子。
130.根据权利要求90-129中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在体外使所述内分泌细胞成熟，以获得至少一种胰腺β细胞，所述胰腺β细胞对葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述成熟在无血清培养基中进行。
132.根据权利要求130或131所述的方法，其中所述成熟在无异种培养基中进行。
133.根据权利要求130-132中任一项所述的方法，其中所述成熟在不包含外源性分化因子的培养基中进行。
134.根据权利要求130-133中任一项所述的方法，其中所述成熟在人血清白蛋白(HSA)的存在下进行。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述HSA以约0.1％至约5％、约0.5％至约2％的浓度存在。
136.根据权利要求134所述的方法，其中所述HSA以约1％的浓度存在。
137.一种方法，其包括：
(a)通过使所述多能干细胞与来自TGF-β超家族的生长因子和WNT信号传导途径激活剂接触，将群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；
(b)通过使所述定形内胚层细胞与来自FGF家族的生长因子接触，将至少一些所述定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；
(c)通过使所述原始肠管细胞与ROCK抑制剂、来自FGF家族的生长因子、BMP信号传导途径抑制剂、PKC激活剂、视黄酸信号传导途径激活剂、SHH传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子接触，将至少一些所述原始肠管细胞分化为Pdx1阳性胰腺祖细胞；
(d)通过使所述Pdx1阳性胰腺祖细胞与ROCK抑制剂、来自TGFβ超家族的生长因子、来自FGF家族的生长因子、RA信号传导途径激活剂和SHH传导途径抑制剂接触，将至少一些所述Pdx1阳性胰腺祖细胞分化为Pdxl阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞；以及
(e)通过使所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞与TGF-β信号传导途径抑制剂、来自EGF家族的生长因子、RA信号传导途径激活剂、SHH传导途径抑制剂、TH信号传导途径激活剂、γ-分泌酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、ROCK抑制剂、BMP信号传导途径抑制剂和表观遗传修饰化合物接触，将至少一些所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞分化为包含至少一种NKX6.1+和C肽+细胞的细胞群体。
138.一种细胞群体，其包含根据权利要求90-129或137中任一项所述的方法产生的内分泌细胞。
139.一种细胞群体，其包含根据权利要求130-136中任一项所述的方法产生的SC-β细胞。
140.一种方法，其包括：将包含内分泌细胞的体外细胞群体暴露于约100rads至约100,000rads的剂量下的辐照约1min至约60min的时间段。
141.一种减少细胞增殖的方法，其包括将包括干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、胰腺祖细胞或内分泌细胞的细胞群体暴露于辐照下，其中所述辐照导致细胞群体与未受辐照的相应细胞群体相比具有降低的增殖能力。
142.根据权利要求140或141所述的方法，其中将所述细胞群体暴露于约100rads至约50,000rads、约100rads至约25,000rads、约100rads至约10,000rads、约250rads至约25,000rads、约500rads至约25,000rads、约1,000rads至约25,000rads、约2,500rads至约25,000rads、约5,000rads至约25,000rads或约10,000rads至约15,000rads的辐照下。
143.根据权利要求140或141所述的方法，其中将所述细胞群体暴露于约10,000rads的辐照下。
144.根据权利要求140-143中任一项所述的方法，其中将所述细胞群体暴露于辐照约1分钟至约55分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约45分钟、约1分钟至约40分钟、约1分钟至约35分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约25分钟、约1分钟至约20分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约5分钟、约10分钟至约55分钟、约15分钟至约55分钟、约20分钟至约55分钟、约25分钟至约55分钟、约30分钟至约55分钟、约20分钟至约40分钟或约25分钟到约35分钟。
145.根据权利要求140-143中任一项所述的方法，其中将所述细胞群体暴露于辐照约30分钟。
146.根据权利要求140-145中任一项所述的方法，其中所述辐照包括电离辐照。
147.根据权利要求140-146中任一项所述的方法，其中所述电离辐照包括γ射线、x射线、紫外线辐照、α射线、β射线或中子射线。
148.根据权利要求140-147中任一项所述的方法，其中与没有经受所述辐照的相应细胞簇相比，所述辐照导致细胞群体具有降低的增殖。
149.根据权利要求140-148中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包括直径为约50μM至约500μM、约50μM至约300μM、约50μM至约200μM、约50μM至约150μM、约600μM至约150μM、约700μM至约150μM、约80μM至约150μM或约60μM至约100μM的第二细胞簇。
150.根据权利要求149所述的方法，进一步包括：
(a)从所述第一细胞簇解离多个细胞；以及
(b)在重聚培养基中培养来自(a)的所述多个细胞，并使得所述多个细胞的至少部分形成所述第二细胞簇。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述解离不包括使所述多个细胞经受流式细胞术。
152.根据权利要求150或151所述的方法，其中所述第一细胞簇是通过解离第三细胞簇并培养从所述第三细胞簇解离的细胞以形成所述第一细胞簇而获得的。
153.根据权利要求149所述的方法，其中使所述细胞簇在所述辐照之前冷冻保存，其中所述方法还包括在所述辐照之前解冻所述冷冻保存的细胞簇。
154.根据权利要求149所述的方法，其中使所述细胞簇在经受所述辐照的同时冷冻保存。
155.根据权利要求154所述的方法，其进一步包括在辐照后解冻所述冷冻保存的细胞簇并分化至少一些所述内分泌细胞。
156.根据权利要求140-155中任一项所述的方法，其进一步包括通过在体外分化胰腺祖细胞或其前体来获得包含所述内分泌细胞的所述细胞群体。
157.根据权利要求140-156中任一项所述的方法，其进一步包括在体外分化干细胞，从而产生包含所述内分泌细胞的所述细胞群体。
158.根据权利要求140-157中任一项所述的方法，其进一步包括在体外使至少一些所述内分泌细胞成熟为胰腺β细胞，从而产生细胞群体comp。
159.根据权利要求158所述的方法，其进一步包括将所述胰腺β细胞植入需要其的受试者中。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述植入的胰腺β细胞经配置用于在至少约50天、60天、70天、80天、90天或更长时间内控制所述受试者的血糖水平。
161.一种细胞群体，其包含根据权利要求140至157中任一项所述的方法产生的内分泌细胞。
162.一种细胞群体，其包含根据权利要求158-160中任一项所述的方法产生的胰腺β细胞。
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