KR101588423B1

KR101588423B1 - 중간엽 줄기세포 스페로이드로부터 분화된 인슐린 분비세포의 제조방법 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101588423B1
Application number: KR1020140040102A
Authority: KR
Inventors: 안종성; 유민주; 정미영; 신혜진
Original assignee: 주식회사 녹십자랩셀
Priority date: 2014-04-03
Filing date: 2014-04-03
Publication date: 2016-01-25
Also published as: KR20150115304A

Abstract

본 발명은 사람의 성체 줄기세포를 역사각뿔 형태의 마이크로웰로 이루어진 웰 플레이트(well plate) 세포 배양기에서 스페로이드 상태로 배양 후 인슐린 분비세포로 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 스페로이드 형태로 배양한 당뇨병 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 스페로이드로부터 분화된 인슐린 분비세포는 이식 시술에 가장 효율적인 크기로 제조될 수 있어, 세포치료제의 효능이 증대된 제1형 당뇨병 치료를 위한 이식용 세포치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포 스페로이드로부터 분화된 인슐린 분비세포의 제조방법 및 그의 용도 {Method for preparation of insulin secreting cells differentiated from mesenchymal stem cells speroid and use thereof}

본 발명은 사람의 성체 줄기세포를 역사각뿔 형태의 마이크로웰로 이루어진 웰 플레이트(well plate) 세포 배양기에서 스페로이드 상태로 배양 후 인슐린 분비세포로 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 스페로이드 형태로 배양한 당뇨병 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

현재 당뇨병은 약 2억 명의 환자들이 겪고 있는 질병이며, 이들의 수는 매년 증가하여 2025년에는 환자의 수가 약 3억 명에 달할 것으로 예견되고 있다. 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌장 베타 세포의 문제에 의한 제 1형 당뇨병과 인슐린은 정상적으로 분비되나 인슐린에 대한 민감성의 감소로 인한 제 2형 당뇨병으로 분류된다. 이중 제1형 당뇨병은 인슐린 의존적(Insulin-dependent) 당뇨병으로서, 인슐린을 분비하는 췌장의 베타세포가 자가면역 반응에 의해 파괴되어 유래되는 질병(Autoimmune disease)이다.

췌장 조직의 약 1%를 차지하는 내분비 조직세포 가운데 약 60~80%는 인슐린을 분비하는 베타세포로서 여기서 생산된 인슐린은 우리 몸에서 혈액 내에 있는 당의 항상성을 유지시켜 주는 작용을 한다. 만일 인슐린이 생산되지 못할 경우, 혈액 내 당의 농도가 높아지게 되고 신장 등과 같은 여러 장기의 기능을 손상시키는 증세는 물론 때로는 생명에 위협을 주는 합병증을 유발할 수 있다.

제1형 당뇨병의 치료는 지속적으로 인슐린 주사를 맞거나 다른 사람의 췌장을 이식받는 등의 방법이 있으나, 전자의 경우 근본적인 치료방법이 될 수 없고 평생 주사를 맞아야 하는 고통이 따르며, 그 효과 역시 지속적이지 않다. 또한, 후자의 경우도 타인의 췌장을 이식 받고자 하는 환자의 수가 기증자 수에 비해 너무 많고 면역학적인 조직적합성 여부를 고려할 때 혜택을 받을 수 있는 환자의 수는 극히 제한이다. 따라서, 이러한 제한점을 극복할 수 있는 새로운 시술 방법의 개발이 매우 절실하다.

최근 많은 연구들이 줄기세포를 이용한 당뇨질환의 치료법 개발에 중점을 두고 있으며, 지금까지 보고된 연구 결과들은 배아 줄기세포를 이용하거나 성체 줄기세포 중에서 골수 유래 줄기세포 등을 이용하는 경우가 대부분이다.

이 중 사람의 배아 줄기세포를 이용하여 인슐린을 분비하는 세포로 분화를 시킨 예로는 Soria et al., Diabetes 49:157-162, 2000; Assady et al ., Diabetes 50:1691-1707, 2001; Fujikawa et al ., Am J Pathol 166:1781-1791, 2005. 이 있으며, 이렇게 체외에서 분화시킨 세포를 당뇨를 유발한 동물 모델에 이식하면 혈당이 정상으로 회복된다(Soria et al ., Diabetes 49:157-162, 2000; Fujikawa et al ., Am J Pathol 166:1781-1791, 2005). 그러나, 배아 줄기세포는 윤리적 문제와 암 발생 문제 및 원치 않는 조직으로 분화가 된다는 문제점이 있다. 이와는 달리 성체 줄기세포는 발암의 가능성이 없으며 윤리적 문제를 일으키지 않으므로 가장 적절한 세포 치료제라 할 수 있다.

제1형 당뇨병 치료를 위한 세포치료제의 후보로 사람의 중간엽 줄기세포는 그 이용이 널리 연구되고 있다. 골수 중간엽줄기세포, 복부 지방줄기세포(Hwang et al., TERM 8(5):482-488, 2011), 제대혈 줄기세포(Tasi et al ., J Biomed Sci 19:47, 2012)에 대한 연구가 진행되어 오고 있으며, 고혈당을 유도한 쥐에서 혈당강하효과를 보인다고 보고되고 있다.

그러나, 그 효과는 제한적이고 많은 수의 세포를 필요로 하며, 쥐의 경우 단일형태의 줄기세포를 주입했을 때, 이식된 단일세포는 면역체계 또는 순환계에 의해 소실될 수 있다(Tasi et al ., J Biomed Sci 19:47, 2012). 또한, 인간의 췌장이식 시술시에 산소와 영양을 공급받을 수 있는 췌도(pancreatic islet)의 크기는 직경 50-150㎛이며, 이식 성공율에 있어 췌도(pancreatic islet)의 크기가 성공을 위한 조건이 된다고 보고된 바 있다(Lehmann et al ., Diabetes 56(3):594-603, 2007).

이에, 본 발명자들은 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 균일한 크기의 세포 스페로이드 형태로 분화를 유도하여, 분화된 인슐린 분비세포가 줄기세포능 및 분화효율이 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 성체 줄기세포로부터 50 내지 150㎛ 크기의 세포 스페로이드 형태 인슐린 분비세포의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된, 스페로이드 형태 인슐린 분비세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 성체 줄기세포로부터 50 내지 150㎛ 크기의 세포 스페로이드 형태 인슐린 분비세포를 제조하는 방법을 제공한다.

(a) 성체 줄기세포를 B27 첨가제, N2 첨가제, 액티빈A(activinA) 및 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1)을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양하여 인슐린 분비세포로 분화시키는 제1단계; 및

(b) 상기 제1단계의 분화된 세포를 B27 첨가제, N2 첨가제, 액티빈A(activinA), 니코틴아미드(Nicotinamide), 간세포성장인자(HGF), 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1) 및 HDAC 저해제를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양하여 인슐린 분비세포로 분화시키는 제2단계.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된, 스페로이드 형태 인슐린 분비세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 성체 줄기세포 스페로이드로부터 분화된 인슐린 분비세포는 이식 시술에 가장 효율적인 크기로 제조될 수 있어, 세포치료제의 효능이 증대된 제1형 당뇨병 치료를 위한 이식용 세포치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1의 (A)는 Ultra low attachment dish 및 AggreWell^TM에서 분화 배양한 제대혈줄기세포의 스페로이드 크기를 비교한 것이다(scale bar=200㎛). (B)는 스페로이드 분화 배양시 췌장 관련 유전자 발현을 보여준다(DF-A: 평판배양 분화, DF-S: 스페로이드 분화)
도 2의 (A)는 AggreWell^TM의 폭 400㎛의 마이크로웰에서 배양한 제대혈 줄기세포이다(a: 125개 세포, b: 250개 세포, c: 500개 세포, scale bar=200㎛). (B)는 스페로이드 세포수에 따른 췌장 관련 전사인자의 발현비율을 나타낸다. (C)는 스페로이드 세포수에 따른 인슐린 분비량을 나타낸다.
도 3의 (A)는 각각의 원형 웰(well) 안의 4,700개 마이크로웰의 모습 및 세포 스페로이드를 나타낸 것이다. (B)는 폭이 400㎛ 역사각뿔 또는 폭이 150㎛ 둥근 돔 형태의 마이크로웰 단면을 보여준 것이다.
도 4는 250개 스페로이드의 분화유도시 췌장 분화 관련 유전자의 발현을 나타낸다(con: 대조군 스페로이드, DF: 분화군 스페로이드).
도 5는 AggreWell^TM에서 분화 배양한 제대혈줄기세포의 스페로이드 크기별 줄기세포능 및 분화능을 분석한 것이다. (A) 3일 배양(1: 100개 세포, 2: 300개 세포, 3: 600개 세포). (B) 4일 배양.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 종래의 줄기세포치료제의 문제점을 해결하기 위해, 종래 사용되던 방법인 2차원적인 세포배양 결과물을 이식하는 방법 대신, 3차원적 배양을 통하여 세포 스페로이드 형태를 제조하여 이식 성공률을 높일 수 있는 인슐린 분비세포 및 그의 제조방법을 완성하였다. 기존의 스페로이드 배양 방법으로는 진탕배양 또는 ultra low attachment dish 배양 등이 있으나, 균일한 크기 및 작은 크기의 스페로이드를 만들기에는 적합하지 않으며, 본 발명의 방법인 폭 400㎛ 내외의 역사각뿔형 마이크로웰로 이루어진 웰 플레이트(well plate) 세포 배양기를 사용한 방법으로 균일한 크기의 스페로이드를 제조할 수 있다. 바람직하게는 폭이 400㎛ 역사각뿔 형태 또는 폭이 150㎛ 둥근 돔 형태의 마이크로웰을 사용할 수 있다. 직경 50 내지 150㎛의 균일한 크기의 스페로이드를 제조할 수 있으며, 바람직하게는 70 내지 120㎛ 크기이며, 더욱 바람직하게는 90 내지 110㎛ 크기의 스페로이드를 제조할 수 있다. 또한, 역사각뿔 형태 또는 둥근 돔 형태의 마이크로웰은 폭이 50 내지 600㎛일 수 있으며, 바람직하게는 폭 100 내지 500㎛ 크기이며, 폭 150 내지 400㎛ 크기인 것이 가장 바람직하다.

기존의 단독세포로 구성된 세포치료제는 근육, 말초혈관 또는 간문맥을 통한 이식에도 불구하고, 혈관을 통해 빠르게 폐에서 걸러지는 문제점이 있어 실제로 원하는 조직으로의 생착율이 매우 낮다. 또한 3차 구조 형태로 분화된 일부 세포치료제는 다양한 크기를 가지므로, 큰 세포 덩어리의 경우 혈관을 막을 수 있다.

본 발명의 세포치료제는 췌도의 크기를 기준으로 균일한 크기로 개발되어, 간문맥을 통한 이식에서 생착율이 높으며, 생착되지 않고 혈관을 흐르는 경우에도 혈류를 방해하지 않는다. 또한 근육으로 이식한 경우에, 단독세포와는 달리 혈관 흡수율이 낮아 장시간 생착이 가능하다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 성체 줄기세포를 B27 첨가제, N2 첨가제, 액티빈 A(activinA) 및 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1)을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양하여 인슐린 분비세포로 분화시키는 제1단계; 및 (b) 상기 1단계의 분화된 세포를 B27 첨가제, N2 첨가제, 액티빈 A(activinA), 니코틴아미드(Nicotinamide), 간세포성장인자(HGF), 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1) 및 HDAC 저해제를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양하여 인슐린 분비세포로 분화시키는 제2단계를 포함하는 성체 줄기세포로부터 50 내지 150㎛ 크기의 세포 스페로이드 형태 인슐린 분비세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 스페로이드는 100 내지 300개의 성체 줄기세포를 폭 150 내지 400㎛의 역사각뿔 형태 또는 원형 돔 형태의 마이크로웰에 접종하여 형성된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 스페로이드는 폭이 50 내지 600㎛의 역사각뿔 형태 또는 원형 돔 형태의 마이크로웰로 이루어진 웰 플레이트(well plate) 세포 배양기에서 배양되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 폭 100 내지 500㎛ 크기이며, 폭 150 내지 400㎛ 크기의 마이크로웰 플레이트에서 배양되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 성체 줄기세포는 제대혈 유래 줄기세포인 것이 바람직하나, 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제1단계는 1~2% B27, 1~2% N2, 10~50ng/ml 액티빈A(activinA) 및 10~100nM 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1)을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 5일 내지 10일간 배양하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1% B27 첨가제, 1% N2 첨가제, 50ng/ml 액티빈A(activinA) 및 100nM 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1)을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 7일간 배양하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 제2단계는 1~2% B27, 1~2% N2, 10~50ng/ml 액티빈A(activinA), 10mM 니코틴아미드(Nicotinamide), 10~50ng/ml 간세포성장인자(HGF), 10nM~100nM 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1) 및 1~10mM 발프로익산 또는 100~200nM 트리코스타틴 A를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 5일 내지 10일간 배양하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 B27 첨가제, 1% N2 첨가제, 50ng/ml 액티빈A(activinA), 10mM 니코틴아미드(Nicotinamide), 50ng/ml 간세포성장인자(HGF), 10nM 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1) 및 HDAC 저해제인 10mM 발프로익산 또는 다른 HDAC 저해제인 100nM 트리코스타틴 A를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 7일간 배양하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 2단계 배양인 것을 특징으로 하며, 각각의 단계는 무혈청 배지인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 스페로이드 형태 인슐린 분비세포는 neuroD, pdx1, nkx6.1 및 인슐린으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 췌장 분화 관련 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하며, Oct4, Sox2 및 Nanog으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 줄기세포능 마커 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된, 스페로이드 형태 인슐린 분비세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 제대혈 유래 줄기세포의 인슐린 분비세포로의 분화 유도

제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 (Bieback et al., Stem Cells 22:625-634, 2004)의 방법으로 분리하여, 인슐린 분비세포로 분화를 유도하기 위하여 2단계 분화 방법을 사용하였다.

본 실시예에서는 분화 배지로 DMEM/F12를 기본 분화 배지로 사용하였으며, 각 단계별로 순차적인 분화 유도 방법을 사용하여 인슐린 분비세포로 분화를 유도하였다.

구체적으로, 제1단계의 경우는 DMEM/F12(Dulbeco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 medium, Gibco, USA)를 기본배지로 하여, 1% B27 첨가제(Invitrogen, USA), 1% N2 첨가제(Invitrogen, USA), 50ng/ml 액티빈A(Peprotech, USA) 및 100nM 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1)를 7일간 처리하였다. 이후 기본배지에 1% B27 첨가제(Invitrogen, USA), 1% N2 첨가제(Invitrogen, USA), 50ng/ml 액티빈A(Peprotech, USA), 10mM 니코틴아미드(Sigma, USA), 50ng/ml 간세포성장인자(Peprotech, USA), 10nM 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1) 및 10mM 발프로익산(VAP, Sigma, USA) 또는 100nM 트리코스타틴 A(TSA, Sigma, USA)를 첨가한 분화배지로 교체하여 7일간 분화를 유도하였다. 상기 제1단계 내지 제2단계의 각 단계는 배지 자체를 교환하는 것으로, 상기 간 단계의 배지는 혈청을 첨가하지 않은 무혈청 배지이다.

실시예 2: 인슐린 분비세포로의 세포 스페로이드 형태로의 분화 유도

실시예 1의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 실시예 1의 분화방법을 사용하여 인슐린 분비세포로 분화 유도시, 균일한 크기의 세포 스페로이드 형태로 제조하였다.

본 실시예에서는 AggreWell^TM400Ex(Stem Cell Tech. Inc., Canada)를 사용하여 균일한 크기의 세포 스페로이드 형태의 인슐린 분비세포를 제조하였다. 400㎛ 폭의 역사각뿔 4,700개 각각의 마이크로웰에 약 125개, 250개, 500개의 세포가 들어가게 하여 스페로이드를 제조하였다(도 2).

그 결과, 기존의 세포 스페로이드 보다 훨씬 작은 크기의 스페로이드를 제조할 수 있었으며(도 1A), 인슐린 분비세포로의 분화 효율도 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 1B).

또한, 스페로이드 세포수에 따른 췌장 관련 유전자의 발현율(도 2B) 및 인슐린 분비량(도 2C)을 비교한 결과, 마이크로웰당 250개의 세포로 제조된 스페로이드의 인슐린 분비세포로의 효율이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 세포 스페로이드 크기에 따른 줄기세포능

실시예 1의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 실시예 2의 방법으로 세포 스페로이드 형태로 제조하여, 스페로이드 크기에 따른 줄기세포능을 분석하였다.

본 실시예에서는 AggreWell^TM400Ex(Stem Cell Tech. Inc., Canada)를 사용하여 400㎛ 폭의 역사각뿔 각각의 마이크로웰에, 각각 약 100개, 300개, 600개의 세포가 들어가게 하여 스페로이드를 제조하였다.

그 결과, 3일간 배양한 제대혈 줄기세포 스페로이드는 100개, 300개 세포가 가장 우수한 줄기세포능을 나타냈다(도 5A). 또한, 4일간 배양한 250개 세포 스페로이드에서는 인슐린 분화에 있어 가장 중요한 전사인자인 NeuroD와 Pdx1의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 5B).

24시간 배양시에 세포수 100개로 만들어진 세포 스페로이드는 직경이 70㎛ 내외였으며, 세포수 300개로 만들어진 세포 스페로이드는 직경이 100㎛ 내외였다. 4일간 배양시에는 세포수 100개로 만들어진 세포 스페로이드는 직경이 60㎛ 내외였으며, 세포수 300개로 만들어진 세포 스페로이드는 직경이 80㎛ 내외였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 성체 줄기세포로부터 50 내지 150㎛ 크기의 인슐린 분비세포를 포함하는 세포 스페로이드를 제조하는 방법:
(a) 성체 줄기세포를 50 내지 600㎛ 폭의 마이크로웰 상에서 B27 첨가제, N2 첨가제, 액티빈A(activinA) 및 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1)을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 배양된 세포를 50 내지 600㎛ 폭의 마이크로웰 상에서 B27 첨가제, N2 첨가제, 액티빈A(activinA), 니코틴아미드(Nicotinamide), 간세포성장인자(HGF), 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1) 및 HDAC 저해제를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양하여 인슐린 분비세포로 분화시키는 단계.
제1항에 있어서, 상기 스페로이드는 100 내지 300개의 성체 줄기세포를 접종하여 형성된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 마이크로웰은 역사각뿔 형태 또는 둥근 돔 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 제대혈 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 배지는 각각 무혈청 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 1~2% B27 첨가제, 1~2% N2 첨가제, 10~50ng/ml 액티빈A(activinA) 및 10~100nM 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1)을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 5일 내지 10일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 HDAC 저해제로 발프로익산 또는 트리코스타틴 A를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 (b) 단계는 1~2% B27 첨가제, 1~2% N2 첨가제, 10~50ng/ml 액티빈A(activinA), 10mM 니코틴아미드(Nicotinamide), 10~50ng/ml 간세포성장인자(HGF), 10nM~100nM 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1) 및 1~10mM 발프로익산 또는 100~200nM 트리코스타틴 A를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 5일 내지 10일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 스페로이드에 포함된 인슐린 분비세포는 neuroD, pdx1, nkx6.1 및 인슐린으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 스페로이드에 포함된 인슐린 분비세포는 Oct4, Sox2 및 Nanog으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
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