JP4147306B2 - 唾液腺由来の内胚葉系細胞および外胚葉系細胞の双方に分化可能な未分化な多分化能を有する新規細胞およびその細胞の調製方法 - Google Patents
唾液腺由来の内胚葉系細胞および外胚葉系細胞の双方に分化可能な未分化な多分化能を有する新規細胞およびその細胞の調製方法 Download PDFInfo
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Description
好ましくは、哺乳動物はブタまたはヒトである。
好ましくは、本発明の細胞は、哺乳動物の唾液腺に由来する細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養することにより得られる有突起浮遊細胞である。
好ましくは、本発明の細胞は、内胚葉系細胞である膵臓内分泌細胞及び/又は肝臓細胞へ分化する能力と、外胚葉系細胞である神経系細胞へ分化する能力とを有している。
好ましくは、本発明の細胞は、哺乳動物の唾液腺から細胞浮遊液を調製し、該細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレートに1x106 〜3x106cells/ 100mm dish の細胞密度で播種して培養を行い、10〜14日目以降に出現する突起を有する細胞を単離することにより製造される。
好ましくは、内胚葉系細胞に分化させる条件は、哺乳動物の唾液腺に由来する細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養した細胞をU字型の底面を有する容器にて培養を行うことを含む。
好ましくは、インスリンの発現及び/又は膵臓特異的転写調節因子の発現の有無を指標として膵臓内分泌細胞に分化した細胞を取得することができる、
好ましくは、アルブミンの発現の有無を指標として肝臓細胞に分化した細胞を取得することができる。
好ましくは、外胚葉系細胞に分化させる条件は、哺乳動物の唾液腺に由来する細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養した細胞をニューロスフェア(neurosphere)法で培養し、形成した細胞球状塊をlaminin / poly-D lysineコードディッシュに播種することを含む。
好ましくは、Tuj-I及び/又はGFAPの発現の有無を指標として神経系細胞に分化した細胞を取得することができる。
好ましくは、所望の細胞に特異的な蛋白質の発現を指標として、誘導された細胞の機能を評価することができる。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の細胞を、上記したスクリーニング方法により選抜された物質の存在下で培養することを含む、内胚葉系細胞又は外胚葉系細胞又は該細胞に由来する組織を製造する方法が提供される。
ブタ唾液腺由来の初代培養細胞を、I型コラーゲンコート培養皿を用いて従来法と比べて高密度培養することで、10日目以降から運動性を有する有突起浮遊細胞が出現する。
この有突起浮遊細胞は、浮遊状態のまま新しい培地に移すと増殖能を失い死滅するが、conditioned mediumを30%含んだ維持培地を用いてI型コラーゲンコート培養皿に移すと付着して増殖し、継代培養可能となる。
即ち、本発明の細胞は、内胚葉系細胞及び外胚葉系細胞の双方に分化可能な未分化な多分化能を有する有突起浮遊細胞である。
外胚葉系細胞としては、神経系細胞、感覚器細胞(水晶体、網膜、内耳など)、皮膚表皮細胞、毛包などが挙げられ、好ましくは神経系細胞である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
離乳後約2週間目のブタ(LWD(ランドレス・デュロック種)ブタ、生後4〜5 週の雄、7-10 kg)を、硫酸アトロピン、ストレスニル、ケタラール麻酔下に大腿動脈を切断して脱血し、仰臥位に固定した。下顎から頚部を正中切開し、顎下腺を摘出した。採取した顎下腺は氷冷したWilliams' E培養液(FCS無添加)へ保存し、培養フードにて直径約1.5 cm、約2-4gの大きさに細切した。滅菌はさみで唾液腺を1〜2 mm大に細切した。50 ml遠心管に入れたEGTA buffer 20mlに懸濁して、37℃で20分間、10回/分の速度で回転震盪した。組織細片液は遠心 (100 xg、5分、室温)し、上清は捨てた。ペレットをcollagenase/hyaluronidase bufferに懸濁し、37℃で40分間、回転震盪した。100 xg、5分、室温にて遠心分離し、ペレットをdispase solutionに懸濁し、37℃、60分間、回転震盪した。懸濁液を細胞濾過器にかけ、遠心分離(100 xg、5分、室温)した。細胞ペレットをWilliams' E medium (serum free) に懸濁し、同培養液で3回洗浄した。
EGTA buffer
NaCl 36.9mM, KCl 5.4mM, NaH2PO4 0.7mM, Na2HPO4 1.1mM, HEPES 10mM, EGTA 0.5mM, NaHCO3 0.035%, glucose 0.1%, phenol red 0.006%
Collagenase / hyaluronidase buffer
DMEN/F12 (GIBCO) 40ml, Collagenase(GIBCO) 40mg, Hyaluronidase (Nakarai) 40mg
Dispase buffer
DMEN/F12 (GIBCO) 40ml, Dispase (GIBCO) 40mg
維持培養液
Williams' E medium (GIBCO) supplmented with 10%FBS (GIBCO), insulin (GIBCO) 1x10-6 M, dexamethasone 1x10-5 M (Sigma), penicilline-streptmycin-fungizone 1x (GIBCO), recombinant human EGF (Sigma) 20ng/ml
本発明では、細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレート (IWAKI)に5x104 cells/ 100mm dish の細胞密度で播種し初代培養を開始する、という従来の方法に改良を加え、更に高密度で培養することで浮遊系細胞が出現することが見出された。すなわち、分散唾液腺細胞をI型コラーゲンコートプレート (IWAKI)に1x106 〜3x106cells/ 100mm dishの細胞密度で播種し、初代培養を開始すると、主に2種類の浮遊細胞が出現する。浮遊細胞の出現時期と経過を図1に示す。一つ目は、初代培養開始後、3〜7日目に出現する大型顆粒細胞であり、二つ目は10〜14日目以降に出現する突起を有するToge細胞である。大型顆粒細胞は、7日目以降は出現せず、増殖もしないことがわかった。Toge 細胞は、14日目以降から約20日間上清中に存在し、この浮遊細胞をI型コラーゲンコートプレートに播種すると、付着細胞として増殖し、かつ継代できることが判明した。この付着細胞を以下の分化誘導に使用した。
(1)方法
実施例1及び2と同様に、浮遊細胞を採取し、I型コラーゲンコートプレートに播種し継代培養を行った。継代培養3代目以降の細胞を用いて、以下の分化誘導を行った。5x105の浮遊細胞由来細胞を分化誘導培養液(Williams' E medium supplimented with 10%FCS(GIBCO), insulin(GIBCO) 1x10-6 M, Dexamethasone (Sigma) 1x10-5 M, penicilline-streptmycin-fungizone 1x (GIBCO), recombinant humanEGF(Sigma)20ng/ml, GLP-1 (Sigma) 20ng/ml)に懸濁し、96 well U-plate(住友ベークライト)に5x102 〜2x103個 / wellずつ分注した。この細胞は5%CO2存在下、37℃にてインキュベートし、各wellの培養液交換は3日毎に行った。この状態で7-14日間培養し、この間の細胞の分化について、免疫蛍光染色、RT-PCRを用いて検討した。
浮遊細胞をI型コラーゲンコートプレートに付着させ培養した細胞をU字型の底面を有する容器(96 well 96U-plate)にて培養した場合、細胞は底辺の中央部に集合する。更に、その細胞は球状細胞塊(spheroid body)を形成した。500〜2000cells/wellにて播き込みを行い、形成されたspheroid bodyには、最外層(mantle zone)に於いてはグルカゴン陽性細胞が存在した。グルカゴン陽性細胞は球状細胞塊の最外層の1〜2細胞層にのみ存在していた。また中央部分に於いてはインスリン陽性細胞が存在した。また同様の条件にて誘導された球状細胞塊に於いては、インスリン陽性細胞の細胞核に一致して膵臓特異的転写調節因子pdx-1に対する抗体染色において陽性反応が認められた。すなわちこれらの細胞は膵臓内分泌細胞へ分化したことを示している。
Claims (16)
- 哺乳動物の唾液腺から単離される、内胚葉系細胞および外胚葉系細胞の双方に分化可能な多分化能を有する細胞であって、哺乳動物の唾液腺に由来する細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養することにより得られる有突起浮遊細胞である上記細胞。
- 哺乳動物がブタまたはヒトである、請求項1に記載の細胞。
- 内胚葉系細胞である膵臓内分泌細胞及び/又は肝臓細胞へ分化する能力と、外胚葉系細胞である神経系細胞へ分化する能力とを有している、請求項1又は2に記載の細胞。
- 哺乳動物の唾液腺から細胞浮遊液を調製し、該細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレートに1x106 〜3x106cells/ 100mm dish の細胞密度で播種して培養を行い、10〜14日目以降に出現する突起を有する細胞を単離することにより製造される、請求項1から3の何れかに記載の細胞。
- 哺乳動物の唾液腺から細胞浮遊液を調製し、該細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレートに1x106 〜3x106cells/ 100mm dish の細胞密度で播種して培養を行い、10〜14日目以降に出現する突起を有する細胞を単離することを含む、請求項1から4の何れかに記載の細胞の製造方法。
- 請求項1から4の何れかに記載の細胞を、内胚葉系細胞に分化させる条件下で培養することを含む、内胚葉系細胞又は該細胞に由来する組織の製造方法。
- 内胚葉系細胞が、膵臓内分泌細胞又は肝臓細胞である、請求項6に記載の方法。
- 内胚葉系細胞に分化させる条件が、哺乳動物の唾液腺に由来する細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養した細胞をU字型の底面を有する容器にて培養を行うことを含む、請求項6又は7に記載の方法。
- インスリンの発現及び/又は膵臓特異的転写調節因子の発現の有無を指標として膵臓内分泌細胞に分化した細胞を取得する、請求項6から8の何れかに記載の方法。
- アルブミンの発現の有無を指標として肝臓細胞に分化した細胞を取得する、請求項6から8の何れかに記載の方法。
- 請求項1から4の何れかに記載の細胞を、外胚葉系細胞に分化させる条件下で培養することを含む、外胚葉系細胞又は該細胞に由来する組織の製造方法。
- 外胚葉系細胞が神経系細胞である、請求項11に記載の方法。
- 外胚葉系細胞に分化させる条件が、哺乳動物の唾液腺に由来する細胞浮遊液をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養した細胞をニューロスフェア(neurosphere)法で培養し、形成した細胞球状塊をlaminin / poly-D lysineコードディッシュに播種することを含む、請求項11又は12に記載の方法。
- Tuj-I及び/又はGFAPの発現の有無を指標として神経系細胞に分化した細胞を取得する、請求項11から13の何れかに記載の方法。
- 請求項1から4の何れかに記載の細胞に、被検物質を投与し、誘導された細胞の機能を評価することを含む、細胞の分化に影響を与える物質のスクリーニング方法。
- 所望の細胞に特異的な蛋白質の発現を指標として、誘導された細胞の機能を評価する、請求項15に記載のスクリーニング方法。
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