JP4147307B2 - 唾液腺由来の浮遊系細胞の生存と増殖を支持する因子を分泌する支持細胞 - Google Patents
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Description
本発明では、唾液腺由来の浮遊細胞の生存と増殖を支持する因子を分泌する支持細胞を分離した。支持細胞は、インスリンやアルブミンなどに分化する能力を持つ未分化細胞であるが神経細胞などの外胚葉への分可能は認められなかった。この点で、神経細胞にも分化可能な浮遊細胞とは異なる細胞であった。別々に分離した支持細胞と浮遊細胞を共培養することにより、安定して浮遊細胞を培養可能であった。これにより、不安定な唾液腺由来の浮遊細胞の培養を安定して供給可能である。
本発明の細胞は、哺乳動物の唾液腺に由来する多分化能を有する細胞の浮遊状態での生存と増殖を支持する因子を分泌する支持細胞であって、哺乳動物の唾液腺の初代培養開始後3〜7日目に培養上清中に現れる大型顆粒細胞を含む細胞群をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養することにより得られる細胞である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
(1)材料
LWD(ランドレス・デュロック種)ブタ 生後4〜5 週 雄 7〜10 kg
(2)方法
離乳後約2週間目のブタを、硫酸アトロピン、ストレスニル、ケタラール麻酔下に大腿動脈を切断して脱血し、仰臥位に固定した。下顎から頚部を正中切開し、顎下腺を摘出した。採取した顎下腺は氷冷したWilliams' E培養液(FCS無添加)へ保存し、培養フードにて直径約1.5 cm、約2〜4gの大きさに細切した。
滅菌はさみで唾液腺を1-2 mm大に細切した。50 ml遠心管に入れたEGTA buffer 20mlに懸濁して、37℃で20分間、10回/分の速度で回転震盪した。組織細片液は遠心 (100 xg、5分、室温)し、上清は捨てた。ペレットをcollagenase/hyaluronidase bufferに懸濁し、37℃で40分間、回転震盪した。100 xg、5分、室温にて遠心分離し、ペレットをdispase solutionに懸濁し、37℃、60分間、回転震盪した。懸濁液を細胞濾過器にかけ、遠心分離(100 xg、5分、室温)した。細胞ペレットをWilliams' E medium (serum free) に懸濁し、同培養液で3回洗浄したのち、以下に記した各々の培養法にて初代培養を開始した。
実施例1の方法で分散した細胞分散液を血清入り維持培地に懸濁しI型コラーゲンコートdish (IWAKI)に5x105 〜3x106cells/ 100mm dishの細胞密度で播種し初代培養を開始する。初代培養開始後、36時間に初回培地交換を行い、以降3日毎に70%培地交換を行った。14日目以降の上清を回収し、100xg、15分、4℃遠心し、上清を回収し、-80℃で冷凍保存し、血清入りコンディションドメディウムとし、以下の実験に使用した。細胞ペレットは細胞数を算定した後、以下の実験に使用した。
培養液に添加する血清中の増殖因子の関与を除去する目的で無血清培養条件下で培養を行う方法を開発した。すなわち、上記の方法で分散した唾液腺細胞をType Iコラーゲンコートdish (IWAKI)に3〜6x106 cells/ 100mm dish の細胞密度で播種し初代培養を開始する。初代培養開始後、48時間後に初回培地交換を行い、以降3〜5日おきに半培地交換を行った。2回目以降の培地交換時の上清を回収し、150xg、20分、4℃で遠心した。上清にBSAが最終濃度0.1%となるように加えた後、無血清コンディションドメディウムとして-80℃冷凍保存した。
初代培養開始36時間後の培地交換後から上記の血清入りコンディションドメディウムを30%含んだ維持培地を用いで培養する場合、通常の維持培地で上記の半培地交換を続ける場合、全培地交換を行う場合のそれぞれにおいて回収された浮遊細胞の経時的変化を算定した。結果を図1に示す。
初代培養開始後14日目以降の浮遊細胞を含んだ培地上清を50ml遠心管に集め100xg、15分、4℃で遠心し、cell pelletとする。Cell pelletを調整培地に懸濁し、96well u-plate(IWAKI)の各wellに3〜5x103cell/wellとなるように分注する。ここでいう調整培地とは、増殖因子を含んだ上清の希釈系列培地や熱処理を行った培地のことをいう。各試験での培地活性が異なっていることから、判定は目視で確認後に24時間〜48時間後に行った。判定方法は、MTT法(CHEMICON)を用いておこなった。
ブタ唾液腺由来浮遊細胞を含んだ培地上清を50ml遠心管に集め100xg、15分、4℃で遠心し、cell pelletとする。96well ELISA plateの各wellに500cell/well、1000cell/well、5000cell/well、10000cell/well、20000cell/wellになるように無血清維持培地に懸濁し、分注した。分注後、MTT法に従い、マイクロプレートリーダーを用いて各wellの吸光度を測定した。結果を図2に示す。MTT assay法による吸光度と細胞数の関係には細胞数500個から10000個までの間に正の相関が認められた。以下の実験ではこの標準化直線を用いて細胞数を算定した。
ブタ唾液腺由来浮遊細胞を含んだ培地上清を50ml遠心管に集め100xg、15分、4℃で遠心し、cell pelletとする。96well ELISA plateの各wellに3〜5x103cell/wellとなるように分注する。Conditioned mediumの希釈は、原液を1として、0.5、0.25、0.125、0.062、0.031、0.016、0.007、0とした。各々の濃度のサンプル数はn=12とした。効果判定はMTT法により、24時間後に行った。結果を図3に示す。
conditined mediumを37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃で10分間熱処理を行った。熱処理したconditioned mediumを用いてconditioned mediumと無血清維持培地を1:1で混ぜた培地にブタ唾液腺由来浮遊細胞を懸濁し、96well ELISA plateの各wellに3〜5x103cell/wellとなるように分注した。各系列のn=12とした。効果判定はMTT法により、24時間後に行った。結果を図4に示す。
無血清維持培地に、既存の増殖因子(human recombinant FGF-2、human recombinant EGF、human recombinant HGF、human recombinant PDGF-AA)を下記の濃度で添加したものを調整培地とした。この調整培地に上記の方法にて回収された浮遊細胞を懸濁し、1000〜3000 cell/wellとなるように96well U-plate (住友ベークライト)に分注した。効果判定はMTT法により24時間後に行い、conditioned mediumを100%としてその活性を示した。結果を図5に示す。
初代培養開始、3〜7日目に上清中に現れる大型顆粒細胞を含んだ細胞群をType Iコラーゲンコートプレートに播種すると、高率に浮遊細胞を産生する浮遊細胞産生系が得られることを見出した。培地は、維持培地と10%FBS含有conditioned mediumを1:1でmixedしたものを使用する。この培養プレート上ではToge細胞が高率に増殖、生存していることがわかった。すなわち、このdish中の細胞にtoge細胞を産生、増殖、維持の全て、あるいはいずれかを行う作用を持つ物質を産生する、あるいは支持する細胞がいることが推察されたため、次の方法で支持細胞を分離した。
この血清加conditioned mediumを用いてブタの肝細胞、骨髄細胞を培養した場合にのみ得られる細胞が存在することがわかった。すなわち、培地中の因子に依存して生存する細胞の存在が示唆された。
離乳後約2週間目のブタを、硫酸アトロピン、ストレスニル、ケタラール麻酔下に大腿動脈を切断して脱血し、仰臥位に固定した。腹部を正中切開し、肝臓を露出した。
ブタ肝臓を辺縁から5g切離した。切離された肝臓は、無血清Williams' E medium中で4℃へ保存した。遊離肝は、フード内にてcollagenase A(20mg/ml)液を経胆管的に注入し、分散した。分散された細胞を50mlコーニングチューブに移し、無血清Williams'E mediumにて50xg、1min、4℃遠心した。この場合、細胞ペレットに肝細胞、上清にnon-parenchymal cellが残ることとなる。この、上清を回収し、50xg、1 minの遠心を3回施行した。得られた上清を150gx15min、4℃にて遠心分離した。得られた細胞ペレットを回収し、血清加維持培地および50%conditioned medium含有血清加維持培地を用いて1x104cell/10cm collagen coated dishにplatingし、初代培養を開始した。
離乳後約2週間目のブタを、硫酸アトロピン、ストレスニル、ケタラール麻酔下に大腿動脈を切断して脱血し、仰臥位に固定した。腹部を正中切開し、大網を反転し、腸管を脾臓を含んだまま右側に展開し、膵臓を露出した。露出した膵臓を皮膜を剥離した後、膵頭部を5g遊離し、EGTA bufferに保存した。EGTA bufferに保存した後、直ちに激しく攪拌し、5回洗浄した。フードに移し、滅菌はさみで膵臓を1〜2 mm大に細切した。50 ml遠心管に入れたEGTA buffer 20mlに懸濁して、37℃で20分間、10回/分の速度で回転震盪した。組織細片液は遠心 (100 xg、5分、室温)し、上清は捨てた。ペレットをcollagenase/hyaluronidase bufferに懸濁し、37℃で20分間、回転震盪した。100 xg、5分、室温にて遠心分離し、ペレットをdispase solutionに懸濁し、37℃、10分間、回転震盪した。懸濁液を細胞濾過器にかけ、遠心分離(100 xg、5分、室温)した。細胞ペレットをWilliams' E medium (serum free) に懸濁し、細胞数をカウントした。血清加維持培地および50%conditioned medium含有血清加維持培地に懸濁後、1x103cell/10cm collagen coated dishに播種し、初代培養を開始した。
浮遊細胞を上述の方法で分離した。またこれとは別に唾液腺細胞を調整し初代培養プレートを作成し経時的に上清を採取した。新鮮に分離した浮遊細胞を経時的に採取した上清液と混合し、培養を開始した。その後経時的に生存細胞数をMTT法でカウントした。その結果、唾液腺細胞初代培養プレートの上清には浮遊細胞の生存と増殖を可能にする因子が存在することが判明した。
Claims (4)
- 哺乳動物の唾液腺から得られる細胞懸濁液を用いて初代培養開始後3〜7日目に培養上清中に現れる大型顆粒細胞を含む細胞群をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養することにより得られる前記プレートに付着した細胞の、哺乳動物の唾液腺に由来する多分化能を有する細胞の浮遊状態での生存及び増殖を維持させるための使用。
- 哺乳動物がブタまたはヒトである、請求項1に記載の使用。
- 哺乳動物の唾液腺から得られる細胞懸濁液を用いて初代培養開始後3〜7日目に培養上清中に現れる大型顆粒細胞を含む細胞群をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養することにより得られる前記プレートに付着した細胞を培地中で培養することにより得られる培養液の、哺乳動物の唾液腺に由来する多分化能を有する細胞の浮遊状態での生存及び増殖を維持させるための使用。
- 哺乳動物の唾液腺から得られる細胞懸濁液を用いて初代培養開始後3〜7日目に培養上清中に現れる大型顆粒細胞を含む細胞群をI型コラーゲンコートプレートに付着させて培養することにより得られる前記プレートに付着した細胞の非存在下において、該細胞を培地中で培養することにより得られる培養液を用いることを特徴とする、哺乳動物の唾液腺に由来する多分化能を有する細胞を浮遊状態で培養する方法。
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