CN1632108A - 用于生产人工肝细胞的试剂 - Google Patents

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李兰娟
李君�
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Abstract

一种用于生产人工肝细胞的试剂，包括用于肝细胞分离的灌流液，肝细胞洗涤液和肝细胞培养剂，本发明的试剂适用于为肝细胞研究、肝细胞移植、生物型人工肝和混合型人工肝的治疗而制备较大量的肝细胞，如适用于分离各种大动物如猪、狗和人的肝细胞。

Description

用于生产人工肝细胞的试剂
技术领域
本发明属于医学生物技术领域，具体涉及一种生物医学上使用的试剂，即用于生产人工肝细胞所需使用的试剂。
背景技术
随着细胞分离、培养技术发展，分离肝细胞在悬液中能维持数小时的代谢活力，它们能执行许多代谢功能，并且能保留对激素的敏感性。用原代培养肝细胞进行细胞移植和构建BALS来替代和治疗急慢性肝功能衰竭患者正日益受到关注。然而，由于供肝的广泛短缺，极大地限制了人源性肝细胞在细胞移植和BALS治疗等方面的应用。最近国内外学者研究表明，在形态学和生物功能等方面相比其他动物供肝，猪肝细胞与人肝细胞更具有相似性，可以成为BALS合适的异种肝细胞源。如Nelson和Samuel等用分离的猪肝细胞构建BALS对暴发性肝衰竭模型动物和急性肝衰竭患者进行治疗获满意效果。
为此制备大量、高活性的猪肝细胞成了发展BALS的关键技术，自Howard和Pesch等于30年前，首次分离到无损伤大鼠肝细胞并进行肝细胞生理学研究以来，肝细胞的分离技术不断改进，尤其是Seglen的二步灌流法，被证明对分离多种动物肝细胞均非常有效。近年来本发明人对大鼠和乳猪肝细胞进行了大量的分离实验研究，发现Seglen的二步灌流法对猪肝细胞消化分离不甚满意。而猪肝细胞是最合适的异种肝细胞源，为BALS治疗提供大量、优质的猪肝细胞，就必须改进对猪肝细胞的分离培养技术，并研制对猪肝细胞分离培养所需使用的专用试剂，本发明的目的就是提供一套用于生产人工肝细胞的试剂。
发明内容
本发明提供的用于生产人工肝细胞的试剂，包括用于肝细胞分离的灌流液，肝细胞洗涤液和肝细胞培养剂，所述灌流液的组分按重量百分比计为：氯化钠0.9％，氯化钾0.042％，碳酸氢钠0.21％，葡萄糖0.09％，Hepes 0.3％～0.6％，余量为去离子水；在使用前每100毫升中加入0.02～0.05克EDTA，调节pH至7.4，4℃保存；或在使用前每100毫升灌流液中加入0.5～1.0克Dispase，调节pH至7.5，4℃保存；或在使用前每100毫升灌流液中加入0.03～0.1克胶原酶和0.055克2水氯化钙(CaCl2·2H2O)，调节pH至7.5，4℃保存。
所述肝细胞洗涤液的组分按重量百分比计为氯化钠0.7％，氯化钾0.0461％，2水氯化钙(CaCl2·ZH2O)0.013％，Hepes 0.3％～0.6％，牛血清白蛋白0.05～0.15％，余量为去离子水，该洗涤液pH应调至7.4。所述肝细胞洗涤液的组分按重量百分比计为6水氯化镁(MgCl2·6H2O)0.01％，7水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.01％，DNase 0.01％～0.03％，余量为去离子水，该洗涤液pH应调至7.4。所述肝细胞培养剂的组分按重量百分比计为：FBS 10％，胰岛素1～0.7摩尔，表皮生长因子2.5微克，地塞米松1～0.6摩尔，余量为William`s Medium E培养基，该培养剂pH为7.4。
具体实施方式
为进一步说明本发明的内容，以下通过具体方案进一步描述。本方案的配制均以100毫升试剂为例。
1、灌流液(PB)100毫升中含：
氯化钠  0.9克
氯化钾  0.042克
碳酸氢钠  0.21克
葡萄糖  0.09克
Hepes  0.478克
余量为去离子水。
根据猪肝或人肝细胞分离操作灌流的需要，在使用灌流液前每100毫升灌流液(PB)中加入EDTA 0.037克，制成含EDTA的灌流液(PBE)；调节pH至7.4，4℃保存。
根据多次灌流分离猪肝或人肝细胞的需要，在使用前在每100毫升灌流液(PB)中加入0.84克Dispase，制成含Dispase的灌流液(PBD)调节pH至7.5，4℃保存。
根据多次灌流分离猪肝或人肝细胞的需要，灌流操作前，在100毫升灌流液(PB)中加入0.05克胶原酶和0.055克2水氯化钙(CaCl2·2H2O)，制成含胶原酶和氯化钙的灌流液(PBC)，调节pH至7.5，4℃保存。
2、①肝细胞洗涤液(WB)：每100毫升肝细胞洗涤液含：
氯化钠  0.7克
氯化钾  0.0461克
2水氯化钙(CaCl2·2H2O)  0.013克
Hepes  0.238克
牛血清白蛋白  0.1克
余量为去离子水，调节pH至7.4
②含DNese的肝细胞洗涤液(WBD)：每100毫升中含：
6水氯化镁(MgCl2·6H2O)  0.01克
7水硫酸镁(MgSO4·7H2O)  0.01克
DNase  0.01克
余量为去离子水，调节pH至7.4
3、肝细胞培养剂：每100毫升Willian`s Medium E培养基中含：
FBS                10毫升
胰岛素             1～0.7摩尔
表皮生长因子       2.5微克
地塞米松           1～0.6摩尔
本实例中的这套试剂用于生产人工肝细胞获得较为满意的效果。适合于分离各种大动物如猪、狗和人肝细胞用于细胞移植、生物型人工肝和混合型人工肝治疗。

Claims (7)

1、用于生产人工肝细胞的试剂，包括用于肝细胞分离的灌流液，肝细胞洗涤液和肝细胞培养剂，其特征在于：所述灌流液的组分按重量百分比计为：氯化钠0.9％，氯化钾0.042％，碳酸氢钠0.21％，葡萄糖0.09％，Hepes 0.3％-0.6％，余量为去离子水。
2、按权利要求1所述用于生产人工肝细胞的试剂，其特征在于：所述灌流液在使用前每100毫升中加入0.02-0.05克EDTA，调节PH至7.4，4℃保存。
3、按权利要求1所述用于生产人工肝细胞的试剂，其特征在于：所述灌流液在使用前每100毫升中加入0.5-1.0克Dispase，调节PH至7.5，4℃保存。
4、按权利要求1所述用于生产人工肝细胞的试剂，其特征在于：所述灌流液在使用前每100毫升中加入0.03-0.1克胶原酶和0.055克2水氯化钙，调节PH至7.5，4℃保存。
5、按权利要求1所述用于生产人工肝细胞的试剂，其特征在于：所述肝细胞洗涤液的组分按重量百分比计为：氯化钠0.7％，氯化钾0.0461％，2水氯化钙0.013％，Hepes 0.3％-0.6％，牛血清白蛋白0.05％-0.15％余量为去离子水；该洗涤液PH应调至7.4。
6、按权利要求1所述用于生产人工肝细胞的试剂，其特征在于：所述肝细胞洗涤液的组分按重量百分比计为6水氯化镁0.01％，7水硫酸镁0.01％，DNase 0.01％-0.03％，余量为去离子水；该洗涤液PH应调至7.4。
7、按权利要求1所述用于生产人工肝细胞的试剂，其特征在于：所述肝细胞培养剂的组分按重量百分比计为：FBS 10％，胰岛素0.7-1摩尔，表皮生长因子2.5微克，地塞米松0.6-1摩尔，余量为William’s Medium E，该培养剂pH为7.4。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102061284A (zh) * 2010-06-13 2011-05-18 南方医科大学珠江医院 人原代肝细胞分离培养方法
CN102220278A (zh) * 2011-04-29 2011-10-19 南方医科大学 一种分离原代成人肝细胞的方法及其专用无菌器械盒

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