CN105420181A

CN105420181A - 一种体外肝间质细胞的分离方法

Info

Publication number: CN105420181A
Application number: CN201510899041.3A
Authority: CN
Inventors: 刘思德; 庄康敏; 罗晓蓓; 李爱民; 余严军; 张菊嫦; 孟琰
Original assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Current assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明公开了一种体外肝间质细胞的分离方法，包括以下步骤：（1）采用多点穿刺灌流法，在正常肝组织表面进行多点穿刺，将前灌流液及消化液依次灌注入正常肝组织标本中；（2）步骤（1）处理后所得的肝组织标本经过充分消化、初步过滤、重悬再过滤、取得间充质细胞后，得到原代肝间质细胞；（3）将步骤（2）培养得到的肝间质细胞进行扩增传代，获得肝间质细胞群。本发明的方法能够快速获得大量高纯度且具有增殖分化能力的肝间质细胞。

Description

一种体外肝间质细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及一种细胞分离方法，尤其涉及一种体外肝间质细胞的分离方法。

背景技术

生物人工肝是一种借助体外的机械、化学或生物反应装置，维持肝脏功能的支持系统；其可通过暂时辅助或部分代替严重病变的肝脏功能，维持肝衰竭患者生命，具有广阔的发展前景。目前，生物人工肝的研究重点主要集中在反应器及细胞材料的构建上，其中细胞材料作为人工肝系统不可或缺的“种子”，一直受到广泛的研究和关注。

区别于其它已经建立的肿瘤源性人工肝细胞株，间质干细胞是一种可塑性强、具有定向分化能力，且不易发生致瘤隐患的细胞。目前，已有学者研究探讨了其定向分化为类肝样细胞的能力，如Za.goura等在妊娠中期的羊水中提取出间质干细胞(AF-MSCs)，体外利用肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(bFGF)诱导分化成肝祖细胞样细胞(HPL)和肝细胞样细胞(HL)，植入由CCl4诱导的急性肝衰竭小鼠，发现能够明显改善其肝功能。

肝脏间质干细胞作为一种新近发现的细胞群，已有研究表明其能够定向分化为类肝样细胞，且具有较好的肝脏代谢及排毒功能。而且，肝间质细胞的安全性亦得到了认可，为生物人工肝提供了新型的细胞材料来源。然而，如何分离并获得大规模肝间质细胞是首先需要解决的问题。目前，肝脏间质细胞的分离及获取均未有统一，规范的方法学探讨，亦未有报道过大规模获取肝间质细胞群的研究技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体外肝间质细胞的分离方法，该方法能够快速获得大量高纯度且具有增殖分化能力的肝间质细胞。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种体外肝间质细胞的分离方法，包括以下步骤：

（1）采用多点穿刺灌流法，在正常肝组织表面进行多点穿刺，将前灌流液及消化液依次灌注入正常肝组织标本中；

（2）步骤（1）处理后所得的肝组织标本经过充分消化、初步过滤、重悬再过滤、取得间充质细胞后，得到原代肝间质细胞；

（3）将步骤（2）培养得到的肝间质细胞进行扩增传代，获得肝间质细胞群；

所述的步骤（3）中所述的充分消化、初步过滤、重悬再过滤和取得间充质细胞包括以下具体步骤：

充分消化：将步骤（2）所得的充分灌注后的肝组织切碎后，在37℃摇床中以 30~50rpm/s的转速摇晃20~30min；本步骤的目的在于充分消化肝组织碎片间的胶原纤维，以释放出肝脏间间充质细胞；37℃是为了保证胶原酶消化的最适温度，在50rpm/s下摇晃30min是为了保证充分消化；

初步过滤：将充分消化步骤后所得的液体经100目过滤网过滤，收集滤液，并将所得的滤液50g离心5min；本步骤的目的在于充分过滤掉未能充分消化掉的肝组织碎片；

重悬再过滤：收集初步过滤步骤中离心后所得的沉淀，并将其重悬；使用200目滤网过滤；50g离心5min；本步骤的目的在于去除第一次离心后可能剩余的纤维组织，保证细所得到的胞的纯度；

取得间充质细胞：取离心后的上清液，50g离心5min，取沉淀。离心后的上清液富含肝脏间充质细胞，故将其进一步离心后得到沉淀即为高纯度的间充质细胞。

优选地，所述的正常肝组织样本为肝脏切除术后所得的肝组织标本，大小为1.5~2cm³。

优选地，所述的前灌流液由以下组分组成：8g/L NaCl、0.4g/L KCl、0.12g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.06g/L KH₂PO₄、0.35g/L NaHCO₃、1.0g/L 葡萄糖,、2.38g/L 浓度为10mmol/L的HEPES溶液、0.74g/L浓度为2.5mmol/L的EDTA溶液。

优选地，所述的消化液为含有0.05%IV型胶原酶的DMEM培养基。

优选地，所述的前灌流液在配制完成后首先经高压灭菌消毒处理，然后进行过滤除菌；所述的消化液在配制完成后进行过滤除菌。

更优选地，所述的过滤除菌步骤使用0.22μm过滤器进行过滤。

与现有技术比，本发明的技术优点在于：

1.在采用多点穿刺灌流法，取得肝组织标本后，进行充分消化、初步过滤、重悬再过滤、取得间充质细胞四个步骤，得到高纯度的体外肝间质细胞；这四个步骤的操作简单、器械准备方便，分离体外肝间质细胞的速度快，细胞分离效果好，细胞的存活率高；

2.所需的正常肝组织标准的量较小，仅为1.5cm³~2cm³。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明。

在下文的实施例中，所使用的DMEM培养基为赛默飞世尔科技有限公司生产的Gibco® 培养基（货号：8115316）；所使用的0.05%IV型胶原酶的DMEM培养基为将IV型胶原酶溶解在前述的DMEM培养基中而得，IV型胶原酶为Sigma公司生产的IV胶原酶（货号：V900896）；所使用的含20%胎牛血清的DMEM培养基为将胎牛血清溶解在前述的DMEM培养基中而得，胎牛血清为GE Healthcare Life Sciences公司生产的HyClone胎牛血清（货号：SH30809.01B）；所使用的PBS为吉诺生物医药技术有限公司生产的PBS缓冲液（货号：GNM20012)；所使用的小牛血清白蛋白为Sigma公司生产的小牛血清白蛋白（货号：Al933）。除上述列举的之外，本领域技术人员根据常规选择，也可以选择其它具有与本发明列举的上述产品具有相似性能的产品，均可以实现本发明的目的。

在一个优选的实施例中，本发明的体外肝间质细胞分离方法包括以下步骤：

1. 手术室获取2cm³经肝脏切除手术切除的正常肝组织标本，置于无菌DMEM培养基中运输；

2.在超净台中将步骤1所得的正常肝组织标本用4℃预冷的前灌流液冲洗干净，清除表面血迹，并去除组织表明包膜；

3.采用5ml注射器，抽取前灌流液，将其缓慢灌注入标本中；灌注时间为10min，直至洗出液清澈透亮；所述的前灌流液由以下组分组成：8g/L NaCl、0.4g/L KCl、0.12g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.06g/L KH₂PO₄、0.35g/L NaHCO₃、1.0g/L 葡萄糖,、2.38g/L 浓度为10mmol/L的HEPES溶液、0.74g/L浓度为2.5mmol/L的EDTA溶液;

4.将事先预热好的热水袋裹上干净无菌纱布，将分离皿置于其上，并将于37℃预热10min的消化液取出，继续缓慢灌注于标本中；灌注时间为15min，至标本疏松呈油豆腐样形态后停止，保留该消化液；消化液为含有0.05%IV型胶原酶的DMEM培养基；

5.将灌注后的标本用眼科剪剪成大小约为1.5mm³的碎片，用巴氏吸管缓慢吹匀后，置于37℃摇床中以 50rpm/s的转速与步骤4中的消化液一起缓慢摇晃30min，充分消化；

6.将含有充分消化后所得的液体经100目滤网过滤，收集滤液，并将所得的滤液50g离心5min；过滤过程中需用巴氏吸管缓慢吹匀；

7.收集初步过滤步骤中离心后所得的沉淀，并将其用无菌DMEM培养基重悬；使用200目滤网过滤；50g离心5min，

8.取离心后的上清液，50g离心5min，弃上清液，取沉淀；

9.用富含20%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，以5×10⁶/ml细胞数接种于25cm²培养瓶中，进行培养，得到肝间质细胞群；

10.对所得的细胞群肝间质细胞群是否表达干细胞标志物CD90进行检测;具体的检测步骤如下：

（1）将细胞培养传至P2代、细胞密度达到85%左右时，弃掉旧培养基；用1ml无菌磷酸盐溶液(PBS)清洗培养基，弃掉PBS，加入1ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶溶液，37℃消化2分钟；加入1ml含10%胎牛血清DMEM培养基；将细胞吹打成单细胞悬液后，1100rpm离心5min，收集总数为约8×10⁶的细胞；

（2）用PBS配置5%小牛血清蛋白（BSA）液1ml，过滤除菌后，将细胞沉淀重悬，并平均分为两个EP，每管0.5ml，4℃封闭20min；

（3）用1100rpm离心5min,去掉上清液，剩下100ul的封闭液；加入CD90染液，4℃下封闭30min。向空白组（即不加入CD90的细胞）中直接加入100ul PBS溶液；

（4）PBS重悬至1ml, 1100rpm离心5min,弃上清，200ul PBS重悬；

（5)在流式细胞仪（BD FACSCalibur 342975）上，对P2代肝间质细胞干细胞标志物CD90表达量进行检测。使用本实施例得到的P2代肝间质细胞干细胞标志物CD90表达量高达99.2%,显示出所得的肝间质细胞群充分表达干细胞标志物，具有增殖分化能力。所得的肝间质细胞的纯度为99.2%。

Claims

1.一种体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：

所述的步骤（3）中所述的充分消化、初步过滤、重悬再过滤、取得间充质细胞包括以下具体步骤：

充分消化：将步骤（2）所得的充分灌注后的肝组织切碎后，在37℃摇床中以 30~50rpm/s的转速摇晃20~30min；用于充分消化肝组织碎片间的胶原纤维，以释放出肝脏间间充质细胞；

初步过滤：将充分消化步骤后所得的液体经100目过滤网过滤，收集滤液，并将所得的滤液50g离心5min；用于充分过滤掉未能充分消化掉的肝组织碎片；

重悬再过滤：收集初步过滤步骤中离心后所得的沉淀，并将其重悬；使用200目滤网过滤；50g离心5min；用于去除第一次离心后可能剩余的纤维组织，保证细所得到的胞的纯度；

获得间间充质细胞：取离心后的上清液，50g离心5min，取沉淀。

2.根据权利要求1所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的前灌流液由以下组分组成：8g/L NaCl、0.4g/L KCl、0.12g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.06g/L KH₂PO₄、0.35g/L NaHCO₃、1.0g/L 葡萄糖,、2.38g/L 浓度为10mmol/L的HEPES溶液、0.74g/L浓度为2.5mmol/L的EDTA溶液。

3.根据权利要求1所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的消化液为含有0.05%IV型胶原酶的DMEM培养基。

4.根据权利要求1所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的前灌流液在配制完成后首先经高压灭菌消毒处理，然后进行过滤除菌；所述的消化液在配制完成后进行过滤除菌。

5.根据权利要求4所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的过滤除菌包括使用0.22μm过滤器进行过滤。

6.根据权利要求1所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的正常肝组织样本为肝脏切除术后所得的肝组织标本，大小为1.5~2cm³。