CN108048389A - 用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法 - Google Patents

用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法 Download PDF

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李阳
高毅
潘明新
彭青
徐小平
蒋泽生
程远
张斌斌
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Abstract

本发明公开了用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法，其包括：在肝组织块的表面选出多个穿刺区，每个所述穿刺区内选取至少三个穿刺点用于灌注灌流液；在所述穿刺点的位置将注射器的注射口刺入所述肝组织块，并匀速灌注前灌流液，直至所述肝组织块由暗红色逐渐变为灰白色且流出的前灌流液变清亮；再用注射器在所述穿刺区刺入所述肝组织块，并匀速灌流后灌流液，直至所述肝组织块变疏松、失去弹性，且表面呈龟背状裂隙；停止灌流，至此灌注完成。本发明提供的灌流液灌注方法，通过在肝组织块表面选取多个穿刺区上灌注灌流液，一方面其操作简单，另一方面，还使肝细胞分离实验不再受肝组织块大小和肝组织块内的血管完整度的限制。

Description

用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法
【技术领域】
本发明涉及细胞分离培养领域，尤其涉及一种用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法。
【背景技术】
以培养肝细胞为生物成分的生物人工肝成为治疗急性肝衰竭的有效手段。随着该研究的深入，迫切需要理想的肝细胞来源与分离、培养技术，尤其是人原代肝细胞。
目前，肝细胞的分离多采用离体两步胶原酶灌注法，并且通常是从肝脏的门静脉灌入灌流液，灌注结束后剪短下腔静脉，使灌流液从下腔静脉流出，或是通过残存在肝组织块中的小血管进行灌流分离肝细胞，使这种方法的应用需要的肝组织块较大。但人肝组织块的获取途径较少，血管保留较完整的肝组织块很难获取，人肝组织块通常是在手术中切除病变的周围正常肝组织而获得，所能获取的肝组织块较小，且形状极不规则，很难找到可供灌流的血管，即便找到，其灌流效果也很不理想。
【发明内容】
本发明为解决上述问题，提供便于对尺寸较小的肝组织块进行灌流的灌流液灌注方法。
为实现该目的，本发明采用如下技术方案：
用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法，其包括：
在肝组织块的表面选出多个穿刺区，每个所述穿刺区内选取至少三个穿刺点用于灌注灌流液；
在所述穿刺点的位置将注射器的注射口刺入所述肝组织块，并匀速灌注前灌流液，直至所述肝组织块由暗红色逐渐变为灰白色且流出的前灌流液变清亮，以去除所述肝组织块的血窦内的血细胞及非实质细胞；
再用注射器在所述穿刺区刺入所述肝组织块，并匀速灌流后灌流液，直至所述肝组织块变疏松、失去弹性，且表面呈龟背状裂隙；
停止灌流，至此灌注完成。
进一步的，所述穿刺区选取在所述肝组织块上带有包膜的包膜区。
可选的，所述穿刺区均匀的分布于所述肝组织块的表面。
具体的，在所述肝组织块的表面选出多个穿刺区之前，还包括：用清洗液清洗待灌流的肝组织块表面的血污。
进一步的，同一所述穿刺区内的多个所述穿刺点以不同的深度刺入所述肝组织块。
可选的，所述前灌流液的灌流速度为20ml/min。
具体的，所述肝组织块放置于恒温环境中，以保持所述前灌流液和所述后灌流液灌流过程中的温度恒定。
优选的，其特征在于，所述清洗液为D-Hank’s液。
可选的，所述前灌流液为预热的无钙平衡盐溶液。
可选的，所述后灌流液为预热的Ⅱ型胶原酶溶液。
与现有技术相比，本发明通过在肝组织块的表面选取多个穿刺区，并灌注灌流液的方式对肝组织块进行灌流，解除了肝组织块的大小和肝组织块内的血管完整度对肝细胞分离实验中灌注灌流液的限制。
在进一步优化的技术方案中，在同一穿刺区内选取至少三个穿刺点，并分别灌注灌流液，使灌流液具有多个灌流起点，从而使灌流液通过不同的毛细血管和细胞间隙路径灌流肝组织块，保证灌流效果。
【具体实施方式】
下面结合示例性实施例对本发明作进一步地描述。此外，如果已知技术的详细描述对于示出本发明的特征是不必要的，则将其省略。
针对以手术切除获得的人肝组织来进行的人原代肝细胞的分离培养方法其中一种具体步骤：
S11.经知情同意，从肝组织保存液DMEM(高糖)+1％双抗(100U/mL青霉素、100mg/L链霉素)的无菌离心管中取肝切除手术病人切除的正常肝组织块，约8-10g，平均大小为3cm×2cm×1cm，移至玻璃皿中，用D-Hank’s液清洗血污，并用无菌剪刀去除不需要的结蹄组织，并修剪组织块至合适大小。
S12.在肝组织块的表面上选取出多个穿刺区，所述穿刺区优先选取在具有包膜的包膜区上，若所述包膜区较分散的分布在所述肝组织块上，而致使划分的所述穿刺区在所述肝组织块的表面分布不均时，可适当的选取一些没有包膜的区域作为穿刺区，其中每个所述穿刺区的面积优选1cm2。
S13.将载有肝组织块的玻璃皿放于50℃热水袋上，将5ml的针头注射器的注射口刺入穿刺区位置上的肝组织块表面，每个穿刺区选取三个穿刺点，分别灌注37℃的前灌流液，灌注时压力、流速要恒定，不能有气泡，所述灌流液为去离子水配制的溶液；优选的，灌注速度为20ml/min；其中，三个所述穿刺点采用不同的深度刺入所述肝组织块表面。当肝组织块由暗红色逐渐变为灰白色且流出的前灌流液变清亮时，停止灌注，此过程10-15min；
其中，在每个穿刺区选取三个穿刺点并以均不超过所述肝组织块厚度三分之一的不同的深度刺入，能够使灌流液从穿刺区的不同位置分别灌注到肝组织块中，并从不同的灌注起点注入进肝组织块，使灌流液能够从不同毛细血管和细胞间隙的路径流过肝组织块，保证灌流效果。
S14.将肝组织取出放入另一无菌的玻璃皿中，更换5mL针头注射器，吸取5mL 37℃预温的后灌流液，将5ml的针头注射器的注射口刺入所述穿刺区位置上的肝组织块表面，每个穿刺区选取三个穿刺点，分别灌注，所述后灌流液为Ⅱ型胶原酶溶液，灌注时压力、流速要恒定，不能有气泡；优选的，灌注速度为20ml/min；其中，三个所述穿刺点采用不同的深度刺入所述肝组织块表面；当组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙时，灌注结束，此过程需8-12min；
S15.将肝组织块取出，用无菌眼科剪刀和眼科镊钝性分离肝组织，并去除残存的包膜和纤维结缔组织，分离完毕将消化物吹打为细胞悬液，加入胎牛血清终止消化。
S16.消化完毕，用粗口吸管将消化物吹打为细胞悬液，在冰浴条件下，先用200目不锈钢滤网过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，再用400目滤网过滤，将滤液移至离心管中；第1次离心40g，离心3min，去上清，加入适量DMEM液，吹打混匀；第2次离心30g，3min，去上清，加入适量DMEM液，吹打混匀；第3次离心30g，离心3min，去上清，加入适量DMEM液，吹打混匀；第4次离心30g，离心3min，去上清，加含Williams’Medium E完全培养基5mL，吹散，取细胞悬液进行计数；
S17.调整悬浮在Williams’Medium E完全培养基中的肝细胞浓度为1×108L-1，接种于培养瓶中，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，2小时贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养，并用台盼蓝拒染法计数细胞活率。
上述步骤前灌流液为去离子水配制的溶液，其配方为：HBSS9.500g/L，NaHCO30.350g/L，HEPES 2.380g/L，EDTA 0.0208g/L，本实施例以1000ml前灌流液的量配制，调pH7.4-7.5。
Ⅱ型胶原酶溶液为去离子水配制的溶液，其配方为为：100U/mL青霉素，100mg/L链霉素，collagenase TypeⅡ500mg/L，本实施例以30ml高糖DMEM配制,调pH7.4-7.5。
Williams’Medium E完全培养基为Williams’Medium E中加入青霉素100KU/L，链霉素100mg/L，Gibco南美胎牛血清10％配置而成，培养基PH值为7.2。Williams’Medium E来自美国品牌Invitrogen。DMEM来自美国品牌Gibco，为高糖型。
实验检测结果如下：
通过显微镜观察，分离后的人肝细胞一般接种2h就可贴壁生长，细胞呈圆形或类圆形，24h后，细胞完全伸展，呈铺路石样，光镜下可见肝细胞呈六边形、三角形或不规则形，排列整齐，细胞界限清晰，胞浆丰富透亮，细胞核有单核、双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。电镜观察可见原代肝细胞呈典型细胞核大，泡质少，细胞表面有突起。
实验中肝组织块，除去电刀切割引起的损伤，经细胞计数板计数可获得约1×106-1×107个肝细胞，刚分离的肝细胞台盼蓝拒染实验计数，细胞存活率为76％±5％。
上述实验结果显示，本发明所提供的灌流液灌注方法的肝细胞分离试验所得到的人肝细胞，不仅数量多，且成活率高，采用本发明所提供的灌流液灌注方法分离肝细胞，在不受肝组织块的大小、形状限制的情况下，能够有效的去除所述肝组织块的血窦内的血细胞及非实质细胞，并使胶原酶溶液能够充分的灌入肝组织块内，从而消化组织并分离细胞，灌注效果好。
虽然上面已经示出了本发明的一些示例性实施例，但是本领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的原理或精神的情况下，可以对这些示例性实施例做出改变，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法，其特征在于，包括：在肝组织块的表面选出多个穿刺区，每个所述穿刺区内选取至少三个穿刺点用于灌注灌流液；
在所述穿刺点的位置将注射器的注射口刺入所述肝组织块，并匀速灌注前灌流液，直至所述肝组织块由暗红色逐渐变为灰白色且流出的前灌流液变清亮，以去除所述肝组织块的血窦内的血细胞及非实质细胞；
再用注射器在所述穿刺区刺入所述肝组织块，并匀速灌流后灌流液，直至所述肝组织块变疏松、失去弹性，且表面呈龟背状裂隙；
停止灌流，至此灌注完成。
2.根据权利要求1所述的灌流液灌注方法，其特征在于，所述穿刺区选取在所述肝组织块上带有包膜的包膜区。
3.根据权利要求1所述的灌流液灌注方法，其特征在于，所述穿刺区均匀的分布于所述肝组织块的表面。
4.根据权利要求1所述的灌流液灌注方法，其特征在于，在所述肝组织块的表面选出多个穿刺区之前，还包括：用清洗液清洗待灌流的肝组织块表面的血污。
5.根据权利要求1所述的灌流液灌注方法，其特征在于，同一所述穿刺区内的多个所述穿刺点以不同的深度刺入所述肝组织块。
6.根据权利要求1所述的灌流液灌注方法，其特征在于，所述前灌流液的灌流速度为20ml/min。
7.根据权利要求1所述的灌流液灌注方法，其特征在于，所述肝组织块放置于恒温环境中，以保持所述前灌流液和所述后灌流液灌流过程中的温度恒定。
8.根据权利要求4所述的灌流液灌注方法，其特征在于，所述清洗液为D-Hank’s液。
9.根据权利要求1所述的灌流液灌注方法，其特征在于，所述前灌流液为预热的无钙平衡盐溶液。
10.根据权利要求1所述的灌流液灌注方法，其特征在于，所述后灌流液为预热的Ⅱ型胶原酶溶液。
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龚祖元: "肝细胞癌细胞膜表面唾液酸含量变化的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

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