JP2022547806A - 酸化/還元反応による迅速な細胞溶解 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は全体として分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、増幅可能な核酸を得るために酸化還元反応を用いる迅速な細胞溶解のための方法に関係する。
PCRおよびRT-PCR反応には核酸の投入が必要であり、それは固相表面からDNA/RNAを精製することによって得られる場合が多い。これらの方法は、核酸の結合、洗浄、および表面からの溶出が必要であるため、時間を要し得る。増幅可能な核酸を短時間で提供する方法が必要である。
したがって、迅速な細胞溶解および核酸調製のための方法が、本明細書において提供される。本方法は自動化されてもよいし、または手動で行われてもよい。いくつかの局面において、これらの方法は、DNAまたはRNA増幅を行う前に洗い流す必要がある阻害性試薬(例えば、ある特定の変性剤、カオトロピック剤、有機溶媒)を使用しない。しかしながら、増幅反応において、ある特定の量の阻害性試薬は許容される。
様々なポイントオブケア診断用途に適用することができる、生体試料から核酸を迅速に調製するための方法が、本明細書において提供される。これらの方法は、15分以下、好ましくは5分以下で実施することができる。ほとんどの用途に関して、核酸のさらなる精製は必要ない。したがって、本方法は、PCRおよびRT-PCRに対して阻害的である試薬、例えば、強力な変性剤もしくはカオトロピック剤(例えば、グアニジンイソチオシアネート (GITC))および/または有機溶媒(例えば、イソプロピルアルコール (IPA))などを欠いている。それにもかかわらず、ある特定の量の阻害性試薬が存在してもよい。しかしながら、任意の阻害性試薬の濃度は、PCRまたはRT-PCR反応に対して有意に阻害的であるにはあまりにも低く、したがって増幅反応において許容される。
複数のDNA/RNA標的を、病原体カクテルを用いてアッセイした。病原体カクテルは、RNAウイルス(A型インフルエンザおよびB型インフルエンザ)、グラム陰性菌(パラ百日咳菌 (Bordetella parapertussis))、グラム陽性菌(黄色ブドウ球菌 (S. aureus))、ならびに酵母(C. アルビカンス (C. albicans))からなった。
複数のDNA/RNA標的を、病原体カクテルを用いてアッセイした。病原体カクテルは、RNAウイルス(A型/B型インフルエンザ)、グラム陰性菌(パラ百日咳菌)、グラム陽性菌(黄色ブドウ球菌)、および酵母(C. アルビカンス)からなった。
病原体カクテルに培地も含めたことを除いて、実施例1に記載されたのと同じ実験を行った。3種類の異なる培地を試験して、それらが5分の酸化還元溶解プロトコールを阻害するかどうかを判断した。試験した培地は、eSwab(商標)(Copan)、MicroTest(商標)M5(商標)(Remel(商標)、Thermo Fisher)、およびUTM(商標)(Copan) であった。陽性対照として、試料をまた、Luminex ARIES(登録商標)ベンチトップシステムを用いて解析した。図1のグラフから、いずれの培地も、陽性対照と比較して、15分の酸化還元溶解プロトコールを阻害しなかったことが示される。
試験した試料が、表3に示される病原体について陽性であることが公知である臨床試料であることを除いて、実施例2に記載されたのと同じ実験を行った。4つの異なる病原体を試験した。A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、RSV、およびC. アルビカンス。陽性対照として、Luminex ARIES(登録商標) ベンチトップシステムを用いて試料を解析した。結果を表3に提供する。
Claims (31)
- 生体試料から増幅可能な核酸を得る方法であって、
(a) 該生体試料を過炭酸塩、ヌクレアーゼ抑制剤、およびキレート剤と接触させて、酸化還元反応組成物を形成させる段階;
(b) 該酸化還元反応組成物を、20~65℃である第1温度でインキュベートする段階;ならびに
(c) 該酸化還元反応組成物を、60~100℃である第2温度でインキュベートする段階
を含む、前記方法。 - 前記酸化還元反応組成物が、前記第1温度で1~3分間インキュベートされる、請求項1に記載の方法。
- 前記酸化還元反応組成物が、前記第2温度で30~90秒間インキュベートされる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記酸化還元反応組成物を撹拌する段階をさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸化還元反応組成物が15~90秒間撹拌される、請求項4に記載の方法。
- 前記酸化還元反応組成物が、(i) 前記第1温度でインキュベートする段階中、(ii) 前記第1温度でインキュベートする段階と前記第2温度でインキュベートする段階との間;(iii) 前記第2温度でインキュベートする段階中;および/または (iv) 前記第2温度でインキュベートする段階の後のうちのいずれか1つまたは複数において撹拌される、請求項4に記載の方法。
- 前記酸化還元反応組成物が、(i) 前記第1温度でインキュベートする段階と前記第2温度でインキュベートする段階との間、および (ii) 前記第2温度でインキュベートする段階の後に撹拌される、請求項6に記載の方法。
- 前記酸化還元反応組成物が、前記第1温度でインキュベートする段階と前記第2温度でインキュベートする段階との間に15~90秒間、および前記第2温度でインキュベートする段階の後に15~90秒間撹拌される、請求項7に記載の方法。
- 前記第1温度が35~60℃である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2温度が70~95℃である、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記撹拌が、機械的撹拌または超音波処理を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料をビーズと接触させる段階をさらに含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ビーズが、シリカビーズまたはガラスビーズである、請求項12に記載の方法。
- 前記過炭酸塩が過炭酸ナトリウムを含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ抑制剤がプロテイナーゼKを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が、前記酸化還元反応組成物の形成前に緩衝液で希釈される、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が、前記酸化還元反応組成物の形成前に緩衝液で1:1~1:5に希釈される、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝液がTrisである、請求項18に記載の方法。
- 前記増幅可能な核酸の少なくとも一部を増幅する段階をさらに含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅可能な核酸の少なくとも一部を増幅する段階が、PCRまたはRT-PCRを実施することを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記増幅可能な核酸の少なくとも一部を増幅する前に、前記酸化還元反応組成物に炭酸水素ナトリウムもチオ硫酸ナトリウムも添加されない、請求項20または21に記載の方法。
- 前記増幅可能な核酸の少なくとも一部を増幅する前に、前記酸化還元反応組成物に対して洗浄段階が実施されない、請求項20~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸化還元反応組成物が、前記増幅可能な核酸の少なくとも一部をPCRまたはRT-PCRによって増幅する前に緩衝液で希釈される、請求項20~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸化還元反応組成物が、前記増幅可能な核酸の少なくとも一部をPCRまたはRT-PCRによって増幅する前に緩衝液で1:1~1:5に希釈される、請求項20~24のいずれか一項に記載の方法。
- 過炭酸塩、ヌクレアーゼ抑制剤、およびキレート剤を含み、乾燥形態である、組成物。
- 前記過炭酸塩が過炭酸ナトリウムを含む、請求項26に記載の組成物。
- 前記ヌクレアーゼ抑制剤がプロテイナーゼKを含む、請求項26または27に記載の組成物。
- 前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む、請求項26~28のいずれか一項に記載の組成物。
- ビーズをさらに含む、請求項26~29のいずれか一項に記載の組成物。
- アスコルビン酸を本質的に含まない、請求項26~30のいずれか一項に記載の組成物。
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