CN105483119A - 一种固定线虫单条虫dna粗提液及其制备方法与应用 - Google Patents

一种固定线虫单条虫dna粗提液及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学检测鉴定技术领域，具体涉及一种固定线虫单条虫DNA粗提液及其制备方法与应用。本发明通过线虫样品的洗涤、固定线虫样品的裂解以及DNA粗提液的制备等步骤，制备得到固定线虫单条虫DNA粗提液，该提取液进一步进行PCR扩增并检测，条带清晰，结果可靠，准确性、灵敏度和特异性高，操作简单，成本低，可用于线虫的分子鉴定。对于其他已固定植物寄生线虫的分子鉴定具有重要的理论依据和指导意义。

Description

一种固定线虫单条虫DNA粗提液及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物学检测鉴定技术领域，具体涉及一种固定线虫单条虫DNA粗提液及其制备方法与应用。
背景技术
核酸的分离与纯化是分子生物学研究中重要的技术，现有的DNA提取与纯化方法一般只适用于新鲜材料，虽然对于一些较为特殊材料的DNA提取已提出一些专一方法，但是对于福尔马林长期保存生物标本基因组DNA的提取至今未能彻底解决。作为生物标本的保存液，福尔马林的优点在于渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快，具有能快速杀死生物细胞以固定生物大分子的功能。因此在过去的若干年中，世界各国生物学家采集了大量生物标本并保存于福尔马林中，这些标本在研究物种起源、系统进化、特定物种基因资源保护以及生物多样性等方面具有很高的学术研究价值。如不能正常提取基因组总DNA，就会给从分子水平上比较研究这类生物带来障碍(徐来祥等，2002)。对于线虫研究来说，由于采集的样品多混合不同营养类型的线虫(如自由生活和植物寄生线虫)，而且包含的种类也非常多，所以，要先将样品固定，再做形态鉴定将不同类群分开，才能做进一步的研究。
对固定线虫PCR扩增的研究报道不是很多。Thomas等(1997)曾对5％甲醛固定48h的自由生活线虫(Caenorhabditiselegans、Zeldiapunctata、Aduncospiculumhalicti)的D2-D3扩展区进行了成功扩增，目的片段约<400bp；沈锡权等(2005)对丙酮、乙醇、乙醇+50mmol/LEDTA(pH8.0)和5％海水福尔马林等4种固定剂中对海洋线虫18S核糖体RNA基因进行了研究，发现用蛋白酶K法提取DNA可以扩增到约1.7kb的目的片段。对固定植物寄生线虫的研究报道更是很少，Rubtsova等(2005)对使用TAF(三乙醇胺：福尔马林：蒸馏水＝2:7:91)固定24h的植物寄生线虫长针线虫(Longidorusspp.)，以及该固定液固定后，脱水制成永久玻片保存最长达11年的长针线虫分别进行D2-D3扩展区PCR扩增，均成功扩增到约200bp的目的片段。Dorris等(2002)在对用4％福尔马林固定的人寄生线虫(Strongylidesspp.)进行DNA提取时发现，对于新4％福尔马林固定和酒精脱水保存在甘油中的标本使用蛋白酶K裂解，可以从核糖体DNA小亚基(约1700bp长)中获得约1000bp的片段；但对福尔马林固定保存10年后又酒精脱水保存在甘油玻片中的线虫来说，同样步骤则很难获得，需要使用更强的裂解方法，才能使线虫表皮破裂，但也可以获得目的片段。相似穿孔线虫(Radopholussimilis(Cobb)Thorne,1949)是一种迁移性植物内寄生线虫，已报道的寄主植物超过250种(O’Bannon,1977)，严重危害多种经济植物和观赏植物((Lucetal，1990；Richardsonetal，1993；Uchidaetal，2003；Sundararajuetal，1979)，是诸多国家的重要检疫危险性植物有害生物(CottonJetal；OEPP/EPPO，2008)，也是中国禁止进境植物检疫性有害生物(中华人民共和国农业部，2007)。目前，随着经济及农业生产和农产品贸易迅速发展，植物种苗等种植材料在国家和地区间调运的数量不断增加，从而促使了相似穿孔线虫在世界广泛的传播。由于相似穿孔线虫对作物为害所造成的损失非常大，所以需要建立起一系列的检测方法，来检测该线虫在我国的侵染情况。相似穿孔线虫寄生植物根系，在植物组织和土壤中均能生存完成生活史。由于土壤中线虫种类较多，但植物线虫数量分布不均匀，所以每种种类分离到的可能较少，这对于缺乏形态学分类鉴定专门知识技能的相关人员来说，难以根据形态学特征进行快速准确的属种鉴定，一般都采取先杀死固定保存，然后再逐步进行相关研究的程序。所以发明一种可以检测固定植物线虫的PCR检测方法对于植物线虫种类鉴定具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种固定线虫单条虫DNA粗提液的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述制备方法制备得到的固定线虫单条虫DNA粗提液。
本发明的再一目的在于提供上述固定线虫单条虫DNA粗提液的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种固定线虫单条虫DNA粗提液的制备方法，包含如下步骤：
(1)线虫样品的洗涤：将固定线虫置于水中初步清洗，然后将线虫转至1×TE缓冲液或1×PBS缓冲液中，浸泡洗涤12h～24h；
(2)固定线虫样品的裂解：将步骤(1)洗涤后的单条固定线虫置于6μL～10μL裂解液中，并将线虫刺破，得到固定线虫和裂解液的混合物；然后将混合物迅速冻结；
(3)DNA粗提液的制备：将步骤(2)中冻结后的固定线虫和裂解液的混合物在95℃～99℃的条件下处理5min～10min；然后加入蛋白酶K除蛋白，得到固定线虫单条虫DNA粗提液；
步骤(1)中所述的固定线虫的固定液为包含福尔马林、甘油和水的FG固定液，其中，福尔马林、甘油和水的体积比为10:1:89；
步骤(1)中所述的1×TE缓冲液包含如下质量百分比计的组分：Tris碱1.211％，Na2EDTA0.3722％，水补足100％；所述的1×TE缓冲液的pH值为8.0；
步骤(1)中所述的1×PBS缓冲液包含如下组分：终浓度为137mM的NaCl、终浓度为2.7mM的KCl、终浓度为10mM的Na2HPO4和终浓度为2mM的KH2PO4；
步骤(1)中所述的固定线虫采用1×PBS缓冲液浸泡洗涤时，优选用1×PBS缓冲液浸泡洗涤2h后，重新更换新鲜PBS缓冲液再次浸泡洗涤12h～24h；
步骤(1)中所述的冻结的温度优选为不超过-80℃；
步骤(2)中所述的裂解液包含如下组分：终浓度为10mM的Tris、终浓度为2.5mM的MgC12和终浓度为50mM的KC1以及体积百分比为0.45％的TWEEN20和质量百分比为0.05％的gelatin；所述的裂解液的pH值为8.2；
步骤(2)中所述的蛋白酶K的工作浓度优选为400～500μg/mL；
步骤(2)中所述的除蛋白的条件优选为65℃处理60min，然后95℃处理10min；
一种固定线虫单条虫DNA粗提液通过上述方法制备得到；
所述的固定线虫单条虫DNA粗提液在线虫检测鉴定领域中的应用；
所述的固定线虫单条虫DNA粗提液在线虫检测鉴定领域中的应用，优选包含如下步骤：
(1)以上述固定线虫单条虫DNA粗提液为模板，设计线虫特异性引物，进行PCR扩增；
(2)对步骤(1)得到的PCR扩增产物进行分析，确定线虫的种类；
所述的PCR扩增的体系优选为25μL反应体系，具体如下所示：
所述的的PCR扩增的条件优选为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，68℃1min，共35个循环；68℃延伸10min；
所述的聚合酶优选为高保真高扩增率酶KODFX；
所述的线虫优选为相似穿孔线虫；
所述的上游引物和下游引物优选为：
上游引物：5’-CTACAAATGTGACGCGAA-3’；
下游引物：5’-CAATCTGCACAATGAACATAC-3’；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
目前对于固定线虫PCR的报道并不多，而已有的报道多是对福尔马林新固定的线虫，且多数扩增片段较短，一般小于400bp，而对于固定植物寄生线虫的报道也较少，对世界范围内的检疫性线虫相似穿孔线虫的PCR检测尚未有报道。线虫固定液中的甲醛能够很好固定保存线虫的形态结构，但甲醛在空气中容易氧化成甲酸，后者对DNA具有较强的降解作用，且甲醛溶于水可以生成水合甲醛而且反应是可逆的，所以，用水冲洗样品始终有部分甲醛残留在标本中，对下一步实验造成障碍；本发明在提取固定线虫DNA之前，采用1×TE缓冲液或PBS缓冲液浸泡洗涤线虫以彻底替换掉其中的甲醛，1×TE对DNA具有保护作用，其中的EDTA的自由基团能与甲醛结合，消除甲醛影响，用来溶解保存提取的DNA，对后续的PCR扩增无影响。
(2)固定后的线虫体壁角质层会变结实，不容易裂解从而不容易释放内含物，由于单条虫很难使用研磨工具进行研磨，所以本发明采用直接机械刺破法、裂解法和冻融法三种方法结合的方式，使单条虫快速破壁，充分释放内含物，从而获得较多的游离核酸物质，同时避免操作时间过长，导致DNA降解；获得完整DNA模板，从而达到从固定的单条线虫中进行目的PCR扩增的目的。
(3)现有技术中对于新热杀死后线虫，在线虫裂解后可不采用蛋白酶K除蛋白，直接进行PCR扩增鉴定，一般不影响最终的鉴定结果。但是对于固定线虫，如果裂解后直接进行PCR扩增鉴定，则检测不到目的条带，严重影响鉴定结果；而本发明在线虫裂解后选择工作浓度400～500μg/mL蛋白酶K除蛋白，可扩增得到清晰的目的条带。
(3)对固定5年的相似穿孔线虫，利用本发明可以扩增到500bp左右的目的片段，条带清晰，准确性、灵敏度和特异性高，操作简单，成本低。所以本发明对于其他已固定植物寄生线虫的分子鉴定具有重要的理论依据和指导意义。
附图说明
图1是固定2d或28d的相似穿孔线虫特异引物PCR扩增的结果分析图；其中，1～10：FG固定线虫，11～12：新热杀死后线虫，13：活虫对照；固定时间上，1～4：固定24d，5～10：固定2d；洗涤方式上，1～2、5～6和9～13：清水初步清洗后，1×PBS缓冲液洗涤，3～4和7～8：清水初步清洗后，1×TE缓冲液洗涤；M：DL2000Marker。
图2是固定1个月和4个月的相似穿孔线虫特异性引物PCR扩增的结果分析图；其中，1～2：FG固定4个月的线虫，3～4：无水酒精内保存1个月的线虫，M：DL2000Marker。
图3是固定1年以上相似穿孔线虫的特异性PCR扩增的结果分析图；其中，1～2：固定1年3个月的相似穿孔线虫，3～4：固定5年的相似穿孔线虫，M：DL2000Marker。
图4是不经过1×TE缓冲液或1×PBS缓冲液浸泡洗涤的固定相似穿孔线虫特异性引物PCR扩增的结果分析图；其中，1：FG固定2d的相似穿孔线虫；2：FG固定28d的相似穿孔线虫；2：FG固定1年3个月的相似穿孔线虫；2：FG固定5年的相似穿孔线虫。
图5是不经过除蛋白处理的固定相似穿孔线虫特异性引物PCR扩增的结果分析图；其中，1：FG固定2d的相似穿孔线虫；2：FG固定28d的相似穿孔线虫；2：FG固定1年3个月的相似穿孔线虫；2：FG固定5年的相似穿孔线虫。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1使用不同洗涤液对固定1个月内相似穿孔线虫的PCR特异性检测
(1)研究材料
1)线虫种群：相似穿孔线虫，将经鉴定为相似穿孔线虫且培养在胡萝卜愈伤组织上的线虫冲洗，经65℃温热杀死后，用FG固定液固定2d或28d；另设新热杀死后线虫和活虫作为对照；
2)引物：见文献(刘一帆，徐春玲，张超，苏秀敏，谢辉.从混合线虫样品和植物组织中直接检测香蕉穿孔线虫的ITS-PCR方法.中国农业科学，2011，44(19)：3991-3998”)，具体如下：
上游引物：5’-CTACAAATGTGACGCGAA-3’；
下游引物：5’-CAATCTGCACAATGAACATAC-3’；
3)缓冲液和固定液
1×TE缓冲液：Tris碱12.11g，Na2EDTA3.722g，蒸馏水800mL，搅拌溶解，用浓盐酸调节pH值至8.0，定容到1L，高温灭菌后使用；
1×PBS包含如下组分：终浓度为137mM的NaCl、终浓度为2.7mM的KCl、终浓度为10mM的Na2HPO4和终浓度为2mM的KH2PO4；高温灭菌后备用；
裂解液包含如下组分：终浓度为10mM的Tris、终浓度为2.5mM的MgC12和终浓度为50mM的KC1以及体积百分比为0.45％的TWEEN20和质量百分比为0.05％的gelatin，高温灭菌后备用；具体见文献(ThomasKW,VidaJT,FrisseLMetal.DNAsequencesfromformalin-fixednematodes:Integratingmolecularandmorphologicalapproachestotaxonomy.JournalofNematology,1997,29(3):250-254)；裂解液的pH值为8.2；
FG固定液：按体积比为福尔马林：甘油：蒸馏水＝10:1:89比例进行配制，无需灭菌；
(2)试验方法
1)线虫样品的洗涤：挑取若干固定2d或28d线虫于载有蒸馏水的玻片上，挑针拨动初步清洗，挑取线虫至加有1×TE缓冲液的1.5mL离心管中，室温浸泡过夜(浸泡洗涤12h)；或待线虫在玻片上初步清洗后，挑取线虫至带有1×PBS缓冲液的1.5mL离心管中，浸泡2h后，重新更换新鲜PBS缓冲液，摇床过夜(浸泡洗涤12h)；
2)固定相似穿孔线虫样品的裂解：在体视镜下，将200μLPCR管横放，分别挑取步骤1)浸泡洗涤过的固定单条线虫、活虫和刚热杀死的线虫放入滴有6μL裂解液的PCR管壁上，用无菌1号昆虫针将单条线虫刺破，竖立PCR管使含线虫片段的悬浮液滑入管底，立即放入-80℃低温保存箱冻结；
3)DNA粗提液的制备：将步骤2)中冻结后的PCR管拿出，放入PCR仪中，99℃处理10min；加入蛋白酶K(工作浓度为500μg/mL)到样品中，涡旋混匀，置于PCR仪中按如下程序进行除蛋白处理：65℃60min，95℃处理10min，最后4℃保存，得到固定线虫单条虫DNA粗提液；
4)PCR检测：使用相似穿孔线虫特异引物进行扩增，配制25μL反应体系，具体如下，步骤3)制得的固定线虫单条虫DNA粗提液作为模板2μL，2×PCRbuffer12.5μL，2mMdNTP5μL，KODFX0.5μL(TOYOBO)，上下游引物各0.8μL，加入适量灭菌三蒸水，补足25μL；将PCR管放入PCR仪中，按照如下反应程序进行反应：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec和68℃1min，共35个循环；68℃延伸10min；4℃保存；
5)PCR反应结果检测：取5μLPCR产物使用质量体积比1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR结果进行检测，在凝胶成像系统上观察PCR产物扩增片段的大小和有无，结果见图1。
从图1可以看出，本实施例可以扩增到500bp的相似穿孔线虫特异区段，扩增效率高，目的条带非常清晰，该目的段与文献报道一致。此外，由图1可知，使用1×TE缓冲液和1×PBS缓冲液作为洗涤液对扩增结果并无明显差异。
实施例2对固定4个月相似穿孔线虫的PCR特异性检测
(1)研究材料
1)线虫种群：FG固定液固定4个月的相似穿孔线虫或无水酒精杀死保存1个月的相似穿孔线虫；
2)引物：同实施例1；
3)缓冲液和固定液：1×TE缓冲液、裂解液和固定液的配制同实施例1；
(2)试验方法
1)线虫样品的洗涤：挑取若干FG固定液固定4个月的相似穿孔线虫于载有蒸馏水的玻片上，挑针拨动初步清洗，挑取线虫至带有1×TE缓冲液的1.5mL离心管中，室温浸泡过夜(浸泡洗涤14h)；另挑取无水酒精杀死保存1个月的相似穿孔线虫至载有蒸馏水的玻片上，挑针拨动清洗后备用作为对照；
2)固定相似穿孔线虫样品的裂解：分别挑取步骤1)洗涤过的FG固定单条线虫和无水酒精杀死保存1个月的的线虫放入滴有6μL裂解液的PCR管壁上，其它步骤同实施例1；
3)DNA粗提液的制备：同实施例1；
4)PCR检测：同实施例1；
5)PCR反应结果检测：同实施例1；
由图2可知，本实施例中FG固定4个月和无水酒精中保存的相似穿孔线虫都可以扩增到500bp的特异片段，由于在酒精中保存的线虫虽然可以有效保护DNA不降解，但是虫体难以辨认，所以对于形态未确定的植物寄生线虫，目前仍然以固定液保存备用。
实施例3对固定1年以上相似穿孔线虫的PCR特异性检测
(1)研究材料
1)线虫种群：FG固定液固定1年以上外的相似穿孔线虫；
2)引物：同实施例1；
3)缓冲液和固定液：同实施例1；
(2)试验方法
1)线虫样品的洗涤：分别挑取固定1年3个月和5年的相似穿孔线虫于载有蒸馏水的玻片上，挑针拨动初步清洗，挑取线虫至带有1×TE缓冲液的离心管中，室温浸泡过夜(浸泡洗涤24h)；
2)固定相似穿孔线虫样品的裂解：同实施例1；
3)DNA粗提液的制备：同实施例1；
4)PCR检测：同实施例1；
5)PCR反应结果检测：同实施例1；
由图3可知使用该方法对FG固定1年以上至5年的相似穿孔线虫都可以扩增到500bp的特异片段，且条带非常清晰。这表明该发明技术扩增效果较好，对于固定5年以下的相似穿孔进行特异性检测表现出非常稳定的扩增效率。
对比实施例1
(1)研究材料
1)线虫种群：FG固定液固定2d、28d、固定1年3个月或5年的相似穿孔线虫；
2)引物：同实施例1；
3)缓冲液和固定液：同实施例1；
(2)试验方法
1)线虫样品的洗涤：挑取若干固定2d、28d、固定1年3个月或5年线虫于载有蒸馏水的玻片上，挑针拨动初步清洗；
2)固定相似穿孔线虫样品的裂解：在体视镜下，将200μLPCR管横放，挑取步骤1)洗涤后的线虫至滴有6μL裂解液的PCR管壁上，用无菌1号昆虫针将单条线虫刺破，竖立PCR管使含线虫片段的悬浮液滑入管底，立即放入-80℃低温保存箱冻结；
3)DNA粗提液的制备：同实施例1；
4)PCR检测：同实施例1；
5)PCR反应结果检测：同实施例1一样进行PCR电泳观察；
结果见图4，对于采用FG固定液固定的相似穿孔线虫在裂解前如果只是简单的采用蒸馏水清洗而不采用1×TE缓冲液或1×PBS缓冲液浸泡洗涤，即使只固定2d，也检测不到目的条带。
对比实施例2
1)研究材料
1)线虫种群：同对比实施例1；
2)引物：同对比实施例1；
3)缓冲液和固定液：同对比实施例1；
(2)试验方法
1)线虫样品的洗涤：同对比实施例1；
2)固定相似穿孔线虫样品的裂解：同实施例1；
3)DNA粗提液的制备：将步骤2)中冻结后的PCR管拿出，放入PCR仪中，99℃处理10min，得到固定线虫单条虫DNA粗提液(即不进行除蛋白处理)；
4)PCR检测：同对比实施例1；
5)PCR反应结果检测：同对比实施例1；
结果见图5，对于采用FG固定液固定的相似穿孔线虫在裂解后如果不进行除蛋白处理，则检测不到目的条带。
以上实施例的结果说明，对新固定直至已经固定5年的相似穿孔线虫，都能用本发明进行PCR扩增，获得相似穿孔线虫500bp的特异序列，而且条带清晰。该方法即可实现操作简单易行，又能保证PCR特异性片段的清晰，达到特异性检测固定相似穿孔线虫的目的。因此，本发明所提供的发明能应用于固定5年内相似穿孔线虫的PCR检测诊断。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种固定线虫单条虫DNA粗提液的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)线虫样品的洗涤：将固定线虫置于水中初步清洗，然后将线虫转至1×TE缓冲液或1×PBS缓冲液中，浸泡洗涤12h～24h；
(2)固定线虫样品的裂解：将步骤(1)洗涤后的单条固定线虫置于6μL～10μL裂解液中，并将线虫刺破，得到固定线虫和裂解液的混合物；然后将混合物迅速冻结；
(3)DNA粗提液的制备：将步骤(2)中冻结后的固定线虫和裂解液的混合物在95℃～99℃的条件下处理5min～10min；然后加入蛋白酶K除蛋白，得到固定线虫单条虫DNA粗提液。
2.根据权利要求1所述的固定线虫单条虫DNA粗提液的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的1×TE缓冲液包含如下质量百分比计的组分：Tris碱1.211％，Na2EDTA0.3722％，水补足100％；所述的1×TE缓冲液的pH值为8.0。
3.根据权利要求1所述的固定线虫单条虫DNA粗提液的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的1×PBS缓冲液包含如下组分：终浓度为137mM的NaCl、终浓度为2.7mM的KCl、终浓度为10mM的Na2HPO4和终浓度为2mM的KH2PO4。
4.根据权利要求1所述的固定线虫单条虫DNA粗提液的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的固定线虫采用1×PBS缓冲液浸泡洗涤时，用1×PBS缓冲液浸泡洗涤2h后，重新更换新鲜PBS缓冲液再次浸泡洗涤12h～24h。
5.根据权利要求1所述的固定线虫单条虫DNA粗提液的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的裂解液包含如下组分：终浓度为10mM的Tris、终浓度为2.5mM的MgC12和终浓度为50mM的KC1以及体积百分比为0.45％的TWEEN20和质量百分比为0.05％的gelatin；所述的裂解液的pH值为8.2。
6.根据权利要求1所述的固定线虫单条虫DNA粗提液的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的蛋白酶K的工作浓度为400～500μg/mL。
7.一种固定线虫单条虫DNA粗提液，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到。
8.权利要求7所述的固定线虫单条虫DNA粗提液在线虫检测鉴定领域中的应用。
9.根据权利要求8所述的固定线虫单条虫DNA粗提液在线虫检测鉴定领域中的应用，其特征在于包含如下步骤：
(1)以权利要求7所述的固定线虫单条虫DNA粗提液为模板，设计线虫特异性引物，进行PCR扩增；
(2)对步骤(1)得到的PCR扩增产物进行分析，确定线虫的种类。
10.根据权利要求9所述的固定线虫单条虫DNA粗提液在线虫检测鉴定领域中的应用，其特征在于：
所述的线虫为相似穿孔线虫。
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