CN102472696A - 双马来酸酐交联剂在固定细胞样品或组织样品中的用途 - Google Patents
双马来酸酐交联剂在固定细胞样品或组织样品中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及新颖的双马来酸酐。本发明尤其涉及以下发现:双马来酸酐交联剂可被用于保存/固定细胞样品或组织样品。因其具有很大优势,故双马来酸酐交联剂可用于需要固定细胞样品或组织样品并且与此同时需要固定剂对随后的操作如免疫组织化学、荧光原位杂交或RT-PCR中对蛋白或核酸的检测几乎没有影响的方法。
Description
技术领域
本申请涉及新颖的双马来酸酐(bis-maleic anhydride)。本申请尤其涉及以下发现:双马来酸酐交联剂可被用于保存/固定细胞样品或组织样品。因其具有很大优势,故双马来酸酐交联剂可用于需要固定细胞样品或组织样品并且与此同时需要固定剂对随后的操作(如免疫组织化学、荧光原位杂交或RT-PCR)中对蛋白或核酸的检测几乎没有影响的方法。本申请同样证实了使用双马来酸酐交联剂作为固定剂很大程度地促进了在预先固定的细胞样品或组织样品中对感兴趣的分析物的随后的检测。
背景技术
迄今为止,没有通常可应用的、“理想的”方式来制备例如分别用于免疫组织化学或感兴趣的核酸的检测的细胞样品或组织样品。固定和通过固定所引入的负面效应的可逆性分别对多肽抗原和核酸的可检测性,以及对由此获得的结果的再现性产生主要影响。
对于细胞样品或组织样品中的抗原的成功的免疫染色,至少要满足三个标准:a)抗原在其原位的保留(retention),b)抗原的可接近性(accessibility)和c)对感兴趣的抗原/表位进行正确的构建/保存。目前看来,没有固定和/或检测操作完全满足了所有这三个标准。对于本领域已知的操作而言,对于这些标准中的一个或两个的最好的表现导致了至少一个其它标准的降低的表现的代价。
一些固定剂是可获得的并且在临床病理学实验室的例行程序中使用,如戊二醛、甲醛和丙酮,或其它有机溶剂。然而,绝大部分的固定操作是基于交联剂的使用,如甲醛。固定剂溶液通常为含有磷酸钠的甲醛水溶液,其被配制成提供至pH为7.2-7.6的缓冲作用(在加入少量的强酸或碱后产生最小的pH变化)和大约等渗的溶液(一种其渗透压与哺乳动物细胞外液相同的溶液,通常基于生理盐水)。
按照现有技术的发展水平,需要固定操作是正好恰当的。
如果固定时间太短,则仅发生由用于使样品脱水的醇导致的蛋白质的凝结,而不发生固定。这可能例如负面地影响组织形态学的保存或损伤长期的保存稳定性。
伴随着延长的甲醛固定,交联蛋白分子形成可削弱石蜡的渗透或/和抗体分子进入的致密的网络。由此,感兴趣的抗原可能被可逆性地或者甚至不可逆地掩蔽。进一步地,表位可能被化学修饰(“破坏”)(例如,通过与甲醛反应)。
此外,已知甲醛固定后大多数酶的活性受到了损伤。
如上所提及,在甲醛中的固定在临床病理学上的应用最为广泛。其主要原因最可能是通过用甲醛固定,感兴趣的抗原被捕捉在其在活体中所占据的位置。凭借甲醛固定后引入的亚甲基桥,细胞样品或组织样品的形态学也得以很好的保存。然而,这些正面作用需要付出样品通透性方面的代价,并导致了引起易接近性和/或感兴趣的抗原/表位的构型的变化、核酸的损伤和酶活性的失活的固定。
由甲醛固定导致的交联可能会掩蔽或损坏表位,导致假阴性免疫染色。当主要的免疫试剂为单克隆抗体时,上述失效甚至比使用多克隆抗血清时更有可能会发生。这就是为什么进行了许多次尝试并发现于与处理逆转甲醛固定效应相关的文献中。
为进行长期储存,固定的细胞样品或组织样品通常需要为脱水的并且包埋在合适的包埋剂中。相对于塑料包埋或用震动切片机(vibrating microtome)或在恒冷切片机中切割未包埋样品,石蜡包埋通常是优选的。
如上所述,在某种程度上,所有的固定操作表示各种妥协方案。最好的形态学保存经常付出了对于抗体的易接近性或在抗原或其上的表位的破坏的代价。
但是且对于本发明而言同样重要的,不仅存在在样品的制备期间(如样品的固定或进一步的加工如用石蜡包埋)引入的高的差异性,还可能存在甚至更大的差异性,其是由各种方式和途径的在核酸检测中恢复免疫反应性或可接近性,即在被称为抗原修复的操作中所导致的。
尽管例如免疫组织化学方法或用于在细胞样品或组织样品中检测感兴趣的核酸的方法得以广泛应用并具有重要用途,仍存在对进一步改善的巨大需求。这样的改善可以例如涉及更温和的细胞样品或组织样品的固定、抗原修复中的改善或/和结果的更好的可比性和再现性,以及可以甚至涉及使用其中相应的抗原或表位在标准操作如甲醛固定中被破坏的抗体的可能性。
本发明的发明人已经令人惊奇地发现双马来酸酐作为交联剂在细胞样品或组织样品的制备/固定中的用途具有巨大优势,并且可以且将导致关于本领域已知的至少一个或甚至几个问题的显著性的改善。
发明内容
本方面涉及用于体外固定细胞样品或组织样品的方法,其中所述细胞样品或所述组织样品与双马来酸酐交联剂孵育,由此将所述细胞样品或所述组织样品固定。
本申请进一步公开了保存细胞样品或组织样品的方法,所述方法包括用双马来酸酐交联剂固定组织样品和将所述固定的样品包埋于石蜡中的步骤。
本发明还公开了用于在细胞样品或组织样品上进行免疫组织化学的方法,所述方法包括如下步骤:用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品,将所述固定的样品包埋于石蜡中,将所述样品脱去石蜡,除去双马来酰胺交联以及免疫检测感兴趣的表位。
本申请还描述了用于通过在细胞样品或组织样品上进行原位杂交从而体外检测感兴趣的核酸的方法,所述方法包括以下步骤:用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品,将所述固定的样品包埋于石蜡中,将所述样品脱去石蜡,除去双马来酰胺交联以及通过原位杂交来检测感兴趣的核酸。
本申请进一步给出了用于通过在细胞样品或组织样品中的RT-PCR从而体外检测感兴趣的核酸的方法,所述方法包括以下步骤:用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品,将所述固定的样品包埋于石蜡中,将所述样品脱去石蜡,除去双马来酰胺交联以及通过进行RT-PCR来检测感兴趣的核酸。
本申请也显示了基于本发明的方法,在从细胞样品或组织样品制备的相同的样品中感兴趣的多肽和感兴趣的核酸均可以被检测出来。本发明涉及用于在一个包含细胞样品或组织样品的测试样品中通过免疫组织化学体外检测至少一种感兴趣的多肽和检测至少一种感兴趣的核酸的方法,所述方法包括以下步骤:用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品,将所述固定的样品包埋于石蜡中,将所述样品脱去石蜡,除去双马来酰胺交联以及通过进行RT-PCR或荧光原位杂交来免疫检测至少一种感兴趣的多肽和检测至少一种感兴趣的核酸。
本发明进一步涉及双马来酸酐交联剂在固定细胞样品或组织样品中的用途以及双马来酸酐交联剂在制造用于固定细胞样品或组织样品的固定剂中的用途。
具体实施方式
在第一个实施方案中,本发明涉及用于体外固定细胞样品或组织样品的方法,其中所述细胞样品或所述组织样品与式I的双马来酸酐孵育,
其中R1和R2独立地选自:氢、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基,其中X为长度在1个和30个原子之间的连接基,并由此将所述细胞样品或所述组织样品固定。
有时式I的化合物将被简单地称作“双马来酸酐交联剂”或“双马来酸酐”。
应当理解“用于固定的方法”在本发明中的意思等于“处理方法”,“固定”等于“交联”,“被固定”将可替换地表达为“被交联”,以及通过及在本发明的方法中“固定的”涉及“包括(comprising)双马来酰胺的交联”或“包括(comprise(s))双马来酰胺的交联”。从便利的角度出发,以及考虑到以下事实即本领域的技术人员完全知晓依附于如固定、固定剂或固定的术语的含义,以及为了便利,在说明书通篇中通常将仅使用这些术语。
也应当理解,在科学上正确的意义上,并非是细胞样品或组织样品为固定的或交联的,而是包含在这样的样品中的生物分子在如本发明中公开的固定方法中被交联或固定。这些生物分子中的交联可以为分子内交联以及分子间交联。
如果通过连接基X(至少为双马来酸酐)彼此相连接的至少两个马来酸酐与至少两个伯胺反应,则形成至少两个酰胺键并且所述至少两个伯胺通过至少两个酰胺键和通过连接基X而交联。为了便利的目的,这种类型的交联接下来将会被称为“双马来酰胺的交联”。
本申请中使用的冠词“一(a)”和“一(an)”是指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。
表达“一个或多个”或“至少一个”表示1-20,优选1-15,还优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12。
本发明是基于令人惊奇的和惊人的发现即双马来酸酐可用于温和的和可逆的固定细胞样品或组织样品。不愿被理论所束缚,据信上述巨大优点是由于以下事实即a)双马来酸酐交联剂快速地并有效地形成双马来酰胺交联,b)每当需要时所述交联剂双马来酸可以被容易地除去和/或也有可能是c)相比于相对短的交联剂甲醛,通过使用合适长度的连接基X可使发生负面效应如表位的变形或破坏的可能性减少。
为完全理解本申请的方法的巨大优点,更详细地讨论那些最经常使用的组织固定操作,即基于甲醛作为固定剂使用的操作将会是有用的。
基于甲醛的固定剂通常得自福尔马林,其为含有37%w/w(=40%w/v)甲醛于水中的溶液。工作固定剂为十倍稀释的福尔马林(每100ml 4克)。可以用多聚甲醛作为原料来制备几乎相同的组合物溶液。多聚甲醛为固体聚合物,当加热至(在微碱性的水中)60℃时其变化成甲醛。尽管短语“固定于4%多聚甲醛中的”通常用于文献中,其并不是完全正确的。大多数于稀释的水溶液中的甲醛以亚甲基二醇的形式存在,其是通过将分子水加成至一甲醛分子中形成的:
游离甲醛于固定剂溶液中的浓度是非常低的。然而,进入固定的化学反应的是游离甲醛,而不是亚甲基二醇。
通过甲醛的固定主要与伯胺例如存在于多肽中的伯胺发生化学反应。
甲醛固定并不显示为两步的过程。在第一步中,甲醛被快速地结合。通过该快速结合,甲醛可能停止自溶,但其并不稳定组织的精细结构,并且不对后续处理诸如石蜡包埋的破坏性作用提供有效的保护。
在第一阶段(小时)中,甲醛分子与蛋白质分子的各个部分结合,特别是赖氨酸侧链氨基和肽键的氮原子:
在第二阶段中,结合的羟基甲基与相同或邻近的蛋白质分子的其它氮原子反应,由此产生亚甲基交联或桥。这些亚甲基(-CH2-)桥是稳定的且解释了已经被甲醛所固定的含有蛋白质的组织的不溶性和刚性。一种可能的反应为:
蛋白质-NH-CH2OH+NH2-蛋白质→蛋白质-NH-CH2-NH-蛋白质+H2O
除与蛋白质的反应之外,甲醛也可以与一些碱性脂质结合。
上面讨论的两个步骤的需要“完全的”甲醛固定的化学反应有可能解释了一些当用甲醛固定的材料来操作时所面临的困难。短暂的暴露于甲醛中并不导致充分的交联以固定小蛋白质或其它小的分析物。太长的固定可导致不可逆的损害,特别是由于过量的亚甲基桥的形成。对于合理的结构保存,通常接受的是样品应当在甲醛溶液中至少保存过夜或甚至保存约24小时。
在免疫组织化学中,感兴趣的抗原表位必须为可接近主要抗体的。表位为特异性结合至抗体分子的结合位点的大分子的小部分,诸如约5至约10个氨基酸的氨基酸序列。单克隆抗体仅识别一个表位。另一方面,多克隆抗血清可以识别几个不同的表位。
逆转例如甲醛固定的不希望的负面的副作用在标题如抗原修复或表位修复的文献中是已知的。
抗原修复的至少三种不同的途径被广泛地单独或组合使用:部分酶消化、加热和/或被假定逆转甲醛的作用的不同的化学物质。
对于部分蛋白水解消化,使用例如廉价级的猪胰蛋白酶(含有一些糜蛋白酶)。使用蛋白水解酶的原理是破坏一些肽键将使交联的蛋白质的基质(matrix)中形成缺口,允许例如抗体分子的进入。然而,蛋白水解酶常常进攻所有蛋白质,包括感兴趣的抗原。走钢丝(tight-rope walk)是指消化正好足够的长度且任何人可以容易地理解消化的条件将会从组织到组织和/或从抗原到抗原而变化。
大多数结合至固定的组织的甲醛可以通过加热诱导的抗原修复来除去。然而,加热也可以导致靶标分析物的不可逆的破坏。已知加热例如损坏不耐热的表位或不耐热的酶。
加热诱导的抗原修复通常与特定的“修复”或“提取”缓冲液的使用相结合。然而,这些操作的成功是不能预测的并且这些操作的不可预测的后果是例如免疫组织化学领域的重大谜团之一。
已经单独或与化学物质组合使用了许多不同的缓冲液和pH-值(例如枸橼酸盐;甘氨酸/HCl-主要为约2.5至约6范围内的酸性pH-值,以及pH范围为约9至10的基于Tris碱性缓冲液),所述化学物质被认为至少部分逆转由甲醛引入的亚甲基交联的负面效应。将化学物质单独溶解于水中,或溶解于缓冲液例如EDTA、柠康酸、硫氰酸铅、氯化铝或硫酸锌中而使用。
在用于高温抗原修复的溶液中所使用的成分的巨大多样性表明可能涉及多于一种机理。大多数抗原可以在接近中性的pH被修复,但其中一些需要更碱性的介质且其它需要酸性条件。在某些情况下,与组织结合的钙离子相结合可掩蔽表位,迫使需要通过螯合来除去金属离子。修复溶液的其它成分包括重金属离子(其可以通过对蛋白质的凝固样作用而暴露表位),以及离液序列高的物质(其可以通过改变水分子簇的结构而修饰蛋白质的形状)。
对于核酸(例如从甲醛固定的石蜡包埋的(FFPE)组织中)的分析,各种抗原(分析物)修复的方法(通常非常不同于感兴趣的表位的免疫检测所需的方法)被推荐和在本领域中使用。然而,同样被接受的是甲醛固定可对核酸产生负面影响。例如,已知在FFPE组织中的信使RNA(m-RNA)被至少部分地破坏,使得长度大于100个核苷酸的m-RNA的检测成为特别具有挑战性的任务。
现在谈及示于本申请中的双马来酸酐交联剂的性质和优点:马来酸酐与伯胺的反应可以通过下述反应方案来描述:
重要的是一方面,所形成的酰胺键在基于这样的试剂固定的样品的(长期)储存期间是更稳定的并且在另一方面,可以容易地将酰胺键断裂且伯胺可以容易地且在温和条件下恢复。
伯氨基和马来酸酐基团之间的酰胺键的形成在中性和碱性pH快速地发生。优选细胞样品或组织样品与式I的双马来酸酐的孵育在7.0或更高的pH值进行。也优选pH值低于pH 12。进一步优选的,用于固定的pH值在pH 7.0至pH 11.0的范围内,包括端点。也优选孵育在7.5至10.0的pH值进行,包括端点。为显而易见的原因,包含伯胺的缓冲物质应当被避免。
优选地,固定剂将不但被缓冲以在固定期间稳定pH值,而且缓冲液也将具有生理盐浓度。如果双马来酸酐交联剂被提供在也包含可与水混溶的有机溶剂的缓冲液中,则是进一步有利且优选的。在本文中优选的有机溶剂为乙醇、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)。
通过马来酸酐与伯胺的反应形成的酰胺键在碱性pH是稳定的。如果储存的话,用式I的双马来酸酐进行固定的样品优选在中性或碱性pH(采用上面对固定或孵育步骤给出的相同的优选范围)保存。
包含于混悬液中的细胞的样品或者1μm3或更小的小组织样品可以在短时间内如,例如10至60分钟内被固定。然而,在临床的例行程序中,组织样品将通常比1μm3大得多。因此,为了例行程序的目的,优选将细胞样品或组织样品与双马来酸酐交联剂孵育1-72小时。作为技术人员会认为将细胞样品或组织样品固定1-72小时。还优选在本发明的方法中,细胞样品或组织样品在包含式I的双马来酸酐的固定剂中的孵育进行2至48小时。
双马来酸酐交联剂可以例如以高浓度溶解于有机溶剂中并且可以被稀释以得到合适的工作浓度或终浓度。用于孵育/固定步骤中的双马来酸酐交联剂的终浓度可以在一定程度上变化。优选的终浓度在0.1和20%之间。进一步优选的终浓度将会在0.25和10%之间(%按每体积的重量计)。
在本申请中公开的固定方法中伯氨基和马来酸酐基团之间形成的酰胺键可以在酸性缓冲条件下快速地断裂。在酸性pH-缓冲液中孵育后,酰胺键断裂,双马来酰胺交联被除去且双马来酸酐可以被洗去。与此同时,之前作为与交联剂之间的酰胺键的一部分的伯胺得到恢复并再次呈现。优选地,通过在酸性pH孵育固定的样品(即通过使用式I的双马来酸酐固定的样品)来除去双马来酰胺的交联。优选地,通过在具有从2.0至6.5的pH缓冲液中孵育来除去双马来酰胺的交联。也优选用于除去双马来酰胺的交联的缓冲液将具有从2.5至6.5或从3.0至6.0的pH值,其中每个端点包括在内。除去快速地发生,反应速度越快,缓冲液越呈酸性。优选地,将固定的样品孵育2分钟至2小时,也优选5分钟至1小时从而除去双马来酰胺的交联。
已经发现用于在本申请中公开的方法中使用的双马来酸酐交联剂的残基R1和R2需要选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基。
进一步优选的,式I的残基R1和/或R2选自氢、甲基或乙基。也优选用于在本发明的方法中使用的双马来酸酐为式I的双马来酸酐,其中R1为氢或甲基且R2为氢或甲基。
如果R1和R2相同,则在细胞样品或组织样品固定期间形成的酰胺键可以在相同条件下逆转。每当尽可能多的交联剂应当被除去并且与此同时尽可能多的伯胺应当恢复的时候,这将会是有利的。因此,在优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的双马来酸酐为式I的双马来酸酐,其中R1和R2是相同的。
正如熟练的技术人员将会理解的那样,既然已经发现双马来酸酐可以用于固定细胞样品或组织样品,则可以设计和使用许多种包括至少两个通过连接基相连的马来酸酐的化合物。
用于在本发明的方法中使用的双马来酸酐中的连接基X具有1个和30个原子之间的长度。术语长度必须理解为包括所给出的原子的数目。长度为30个原子的连接基具有由30个原子组成的主链。
显然,正如该特定申请可要求的那样,连接基X可以采用许多方式来设计,并且没有不适当的限制或约束将会是恰当的。然而,将会给出这样的连接基的一些优选的实施例。
在一个优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐将具有含有由碳原子和任选一个或多个选自O、N和S的杂原子组成的主链的连接基X。也优选包括在连接基X的主链中的杂原子将会为O或N或两者。
连接基X可以携带侧链。在优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐将具有含有一个或多个被设计为分别携带一个或多个另外的马来酸酐基团的侧链的连接基X。优选地,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐将具有含有1-3个连接至一个或多个侧链的马来酸基团的连接基X,从而导致具有3-5个马来酸酐基团的式1的化合物。
优选地,用于在本发明的方法中使用的式I的化合物中的连接基X将具有10kD或更低的分子量。也优选连接基X将具有5kD或更低、3kD或更低、2kD或更低或1kD或更低的分子量。在一个优选的实施方案中,用于在本申请的方法中使用的双马来酸酐交联剂将具有1kD或更低的分子量。
尽管设计和使用包括三个、四个、五个或甚至更多的马来酸酐基团的马来酸酐交联剂是可能的,优选使用具有正好两个通过连接基X相连接的马来酸酐基团的双马来酸酐交联剂。
然而,在一些申请中,连接基X中的侧链将可应用于其它申请中,具有无侧链的主链的连接基X将会是优选的。无侧链的连接基为仅具有主链原子和直接连接至主链原子的原子的连接基。
在一个优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐将具有长度为1-20个原子的连接基X。
在一个优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐中的连接基X选自下述的连接基:长度为1-30个原子的连接基,主链由碳原子和任选的一个或多个选自O、N和S的杂原子组成;1-20个亚甲基(-CH2-)单元的连接基;3个至30个原子的连接基,由亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-C2H4-)和/或亚丙基(-C3H6-)单元和氧组成,其中具有氧的醚键的数目为1-8个;主链为5-30个原子的连接基,包括多个亚甲基和1-4个通过酯键或酰胺键结合的羰基单元,或11-30个原子的连接基,包括6-25个亚甲基、2个通过酯键或酰胺键结合的羰基单元,还包括通过醚键相连接的1-6个氧原子。
在一个优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐的连接基X选自下述的连接基:长度为1-30个原子的连接基,主链由碳原子和任选的一个或多个选自O、N和S的杂原子组成;1-6个亚甲基(-CH2-)单元的连接基;在3个至30个原子的连接基,由亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-C2H4-)和/或亚丙基(-C3H6-)单元和氧组成,其中具有氧的醚键的数目为1-8个;主链为5-30个原子的连接基,包括多个亚甲基和1-4个通过酯键或酰胺键结合的羰基单元,或11-30个原子的连接基,包括6-25个亚甲基、2个通过酯键或酰胺键结合的羰基单元,还包括通过醚键相连接的1-6个氧原子。
在一个优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐将具有1-20个亚甲基(-CH2-)单元的连接基X。优选地,这种连接基将具有1-8个亚甲基单元且也优选2-6个亚甲基单元。
在一个优选的实施方案中,本申请涉及式I的双马来酸酐,其中连接基X由五个亚甲基单元组成。
在一个优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐将具有3个至30个原子的连接基X,由亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-C2H4-)和/或亚丙基(-C3H6-)单元和氧组成,其中具有氧的醚键的数目为1-6个。
这样的连接基的实例在下述式II中给出。
优选地,这样的连接基将包括4-8个亚甲基、亚乙基(-C2H4-)和/或亚丙基(-C3H6-)单元和1-8个醚键。也优选连接基将具有4-6个亚甲基单元和1或2个醚键。
在一个优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐将具有含有5-30个原子的主链的连接基X,包括多个亚甲基和1-4个通过酯键或酰胺键结合的羰基单元。也优选连接基X的长度将具有8-20个原子,包括4-16个亚甲基和2-4个通过酯键或酰胺键结合至连接基X的主链中的羰基单元。也优选连接基X将包括4至12个亚甲基和2-4个通过酯键或酰胺键结合至连接基主链中的羰基单元。在另一个优选的实施方案中,连接基X将包括4-8个亚甲基和2个通过酯键或酰胺键结合至连接基主链中的羰基单元。这样的双马来酸酐的实例在下述式III和式IV中给出。
在一个优选的实施方案中,用于在本发明的方法中使用的式I的双马来酸酐将具有11-30个原子的;连接基,包括6-25个亚甲基、2个通过酯键或酰胺键结合至连接基X的主链中的羰基单元以及1-6个通过醚键相连接的氧原子的连接基X。优选的实例描述于下述式V至VII中。
式V
细胞样品或组织样品可包括得自体外细胞或组织培养的细胞或可表现为可在临床例行程序中获得的样品。在优选的实施方案中,细胞样品或组织样品将会包含在临床例行程序中进行研究的感兴趣的细胞。在肿瘤学领域,这样的细胞样品或组织样品可例如包括循环的肿瘤细胞或为被怀疑或已知包含肿瘤细胞的组织。优选的样品为全血和组织样品,如通过外科手术或活组织检查获得的样品。
正如本领域的技术人员将会理解的那样,本发明的任何方法是在体外进行的。在分析后,患者的样品被贮存或丢弃。样品并不送回到患者的体内。
例如包含在血液中的细胞为通常至少部分地从血浆分离的,且可以在混悬液中固定或包埋至琼脂中。组织样品(例如通过切除或活组织检查获得的)通常在生理缓冲液中进行短暂地洗涤或直接转移至含有适当的固定剂的溶液中。
如在更上面提到的,甲醛固定为两步过程并且因此控制其是不容易的。在本发明的方法中使用的双马来酸酐具有巨大的优点,它们仅需发生一种类型的反应,即酰胺键的形成。一旦在至少两个伯氨基和马来酸酐基团之间形成至少两个通过连接基X相互连接的酰胺键,由此已经发生了交联。不需要在第二种类型的化学反应中的亚甲基桥的形成。
尽管可能是最关键的步骤,细胞样品或组织样品的固定在大多数情况下仅为临床例行程序中的几个潜在关键的步骤中的一个。
通常细胞样品或组织样品用显微镜来研究。为了该目的,需要制备具有用于染色和显微镜研究的合适的厚度的样品。在组织样品的情况下,通常将冷冻样品或所谓的石蜡块(参见下面)用切片机切成所谓的薄切片。薄切片通常为2-10μm厚。在样品为组织样品的情况下,在这样的样品的研究中所使用的分析方法优选在组织薄切片上进行。
在临床病理学中,采取允许细胞样品或组织样品的长期储存的手段是例行程序。尽管例如组织保存也可以通过低温储存(例如在约-70℃)来获得,例行的储存条件为在4-8℃储存,或者甚至在环境温度储存。
在细胞样品或组织样品固定之后,在本申请上述公开的方法中,直接使用这样的样品来除去双马来酸酐交联剂及进一步的分析是可能的并且表示优选的实施方案。可使用下面更详细给出的任何用于FFPE材料的方法来分析样品。
尽管在细胞样品或组织样品固定之后,在本申请上述公开的方法中,将固定的样品包埋于石蜡中仅为在临床例行程序中最为广泛使用的操作的几种选择中的一种。石蜡包埋表示在固定和分析之间的中间步骤。
为了在例如环境温度长期储存,将细胞样品或组织样品脱水并包埋在合适的介质中是标准实践。有经验的技术人员完全知晓操作细节且并不需要在此处给出这些。也优选实施在本申请中公开的采用用于自动组织加工如包埋、脱去石蜡和/或染色的机器的方法。
在临床例行程序中,石蜡最广泛地用于包埋和保存用于例如后续的组织病理学、免疫组织化学等的样品。本发明的方法适于用于在石蜡中包埋的例行方法。因此在优选的实施方案中,本发明涉及保存细胞样品或组织样品的方法,所述方法包括如下步骤
a)用双马来酸酐交联剂固定组织样品,和
b)将步骤(a)的所述固定的样品包埋于石蜡中。
通过该过程,获得了可以被容易地切割成薄切片的石蜡块。
一旦被包埋,可以储存细胞样品或组织样品直到分析到期。该分析可以在几小时或几天内或依情况可以在几年后进行。在进行后续的分析之前,在例如石蜡包埋的组织切片上,必须要除去石蜡并再水化感兴趣的样品。可使用各种用于除去石蜡的方法,且有经验的技术人员将在合适的方法中毫不费力地除去石蜡。
如上所提及,各种类型的分析可以在细胞样品或组织样品上进行。通常评估形态学、酶活性、免疫反应性和/或核酸。正如将会理解的那样,这些种类的评估中的每种将会在很大程度上取决于待研究的样品的结构和功能上保存的程度。
因通常观察到的甲醛对酶活性的负面效应的缘故,如果甲醛被用作固定剂,则对酶性质的研究通常并不处于风险中。由于在本发明公开的方法中的温和的固定,更有可能的是酶活性被较少地影响或依情况可能甚至没有被影响。在优选的实施方案中,本发明涉及用于在细胞样品或组织样品中分析酶活性的方法,所述方法包括如下步骤:用双马来酸酐交联剂固定样品,除去双马来酰胺交联以及分析酶活性。
可以将具有显著优点的用本申请的双马来交联剂固定的方法用于免疫组织化学的例行操作中。在优选的实施方案中,本发明因此涉及用于在细胞样品或组织样品上进行免疫组织化学的方法,所述方法包括如下步骤
a)用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品,
b)将步骤(a)的所述固定的样品包埋于石蜡中,
c)将所述样品脱去石蜡,
d)除去双马来酰胺交联,和
e)对感兴趣的表位进行免疫检测。
在一个实施方案中,本发明涉及包括本发明中公开的固定细胞样品或组织样品的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺交联,和
e)对感兴趣的表位进行免疫检测。
如果细胞样品或组织样品是用双马来交联剂固定的且双马来酰胺的交联在分析前被释放,最初在样品中出现的伯胺则会再次成为可获得的。预期这将会表示优于其它固定剂如甲醛(已知它们通常对许多表位产生有害的和不可逆的作用)的主要优点。如果被单克隆抗体所识别的单个表位被侵袭或破坏,则该负面作用可能是特别严重的。许多这些潜在性地极其有价值的单克隆抗体还未获得关注和市场渗透,这是因为其不能在基于福尔马林固定的石蜡包埋的组织(FFPET)的标准免疫组织化学中发挥作用。很有可能的是许多不能用于FFPET的单克隆抗体将会在用双马来酸酐交联剂固定的样品上发挥作用。在优选的实施方案中,本发明因此涉及免疫组织化学方法,所述方法基本上为在前述段落中描述的方法,并具有以下附加技术特征:感兴趣的表位为当包括所述表位的所述细胞样品或组织样品用甲醛固定剂固定时被掩蔽或破坏的表位。换言之,该方法是使用对FFPET不发挥作用的抗体来实施的。
如上所述,本申请公开的方法很好地对具有例如酶或抗原性质的多肽发挥作用。令人惊奇地,本申请公开的方法在感兴趣的核酸的检测中也是有利的。
在一个优选的实施方案中,核酸为例如在真核细胞的细胞核中出现的脱氧核糖核酸(DNA)。在一个优选的实施方案中,DNA是通过原位杂交方法来分析的。用于原位杂交(ISH)的方法对于熟练的技术人员而言是公知的。基因扩增可以例如用原位杂交方法如荧光原位杂交技术(FISH)、显色原位杂交技术(CISH)或银原位杂交技术(SISH)来测量。在优选的实施方案中,本发明涉及用于通过在细胞样品或组织样品上进行原位杂交从而体外检测感兴趣的核酸的方法,所述方法包括如下步骤
a)用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品,
b)将步骤(a)的所述固定的样品包埋于石蜡中,
c)将所述样品脱去石蜡,
d)除去双马来酰胺交联,和
e)通过进行原位杂交来检测感兴趣的核酸。
在一个实施方案中,本发明涉及包括本发明中公开的固定细胞样品或组织样品的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将步骤(a)的固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺交联,和
d)通过进行原位杂交来检测感兴趣的核酸。
令人惊奇地,本发明中描述的固定方法在用双马来酸酐交联剂制备的细胞样品或组织样品中的m-RNA的检测中也是有利的。可以通过合适的技术,诸如RNA印迹(Northern Blot)、实时聚合酶链反应(RT-PCR)等来确定感兴趣的m-RNA的表达水平。所有这些检测技术在本领域是公知的并且可以从标准教科书诸如Lottspeich(Bioanalytik,Spektrum Akademischer Verlag,1998)或Sambrook和Russell(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSHPress,Cold Spring Harbor,NY,USA)中演绎出来。优选m-RNA使用实时聚合酶链反应(RT-PCR)进行检测。
在优选的实施方案中,本发明因此涉及用于通过在细胞样品或组织样品中的RT-PCR从而体外检测感兴趣的核酸的方法,所述方法包括如下步骤
a)通过本申请上面描述的方法用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品,
b)将步骤(a)的所述固定的样品包埋于石蜡中,
c)将所述样品脱去石蜡,
d)除去双马来酰胺交联,和
e)通过进行RT-PCR来检测感兴趣的核酸。
在一个实施方案中,本发明涉及包括本发明中公开的固定细胞样品或组织样品的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺交联,和
d)通过进行RT-PCR来检测感兴趣的核酸。
在进一步优选的实施方案中,核酸是从已经用双马来酸酐交联剂固定的细胞样品或组织样品中分离的,并且分离的核酸被进一步的分析。进一步优选这样分离的核酸用于突变分析。在优选的实施方案中,本发明因此涉及用于在从细胞样品或组织样品分离的核酸样品上进行体外突变分析的方法,所述方法包括如下步骤
a)用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品,
b)将步骤(a)的所述固定的样品包埋于石蜡中,
c)将所述样品脱去石蜡,
d)除去双马来酰胺的交联,
e)分离核酸,和
f)用步骤(e)中分离的核酸进行突变分析。
在一个实施方案中,本发明涉及包括本发明中公开的固定细胞样品或组织样品的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺的交联,
d)分离核酸,和
e)用步骤(d)中分离的核酸进行突变分析。
确定特定突变的存在或缺失可以采用多种方式来进行。这样的方法包括但不限于PCR、用等位基因特异性探针杂交、酶突变检测、错配的化学裂解、质谱法或DNA序列测定,包括微序列测定。在具体实施方案中,用等位基因特异性探针杂交可以采用两种方式来进行:(1)结合至固相(玻璃、硅、尼龙膜)的等位基因特异性寡核苷酸和溶液中的标记的样品,如在许多DNA芯片的应用中,或(2)结合的样品(通常为克隆的DNA或PCR扩增的DNA)和溶液中的标记的寡核苷酸(等位基因特异性的或短的从而允许通过杂交进行序列测定)。优选地,突变的存在或缺失的确定包括通过诸如聚合酶链反应(PCR)、DNA序列测定、寡核苷酸探针杂交分析法或质谱法的方法确定包括突变位点的合适的核苷酸序列。
采用目前通过本申请中所提供的公开可利用的方法,甚至可能的是在相同的样品中检测感兴趣的核酸和感兴趣的多肽。在进一步优选的实施方案中,本发明涉及用于在一个包含细胞样品或组织样品的测试样品中通过免疫组织化学体外检测至少一种感兴趣的多肽和检测至少一种感兴趣的核酸的方法,所述方法包括如下步骤
a)用双马来酸酐交联剂固定细胞样品或组织样品,
b)将步骤(a)的所述固定的样品包埋于石蜡中,
c)将所述样品脱去石蜡,
d)除去双马来酰胺交联,和
e)通过进行RT-PCR或荧光原位杂交来免疫检测至少一种感兴趣的多肽以及检测至少一种感兴趣的核酸。
在一个实施方案中,本发明涉及包括本发明中公开的固定细胞样品或组织样品的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺交联,和
d)通过进行RT-PCR或荧光原位杂交来免疫检测至少一种感兴趣的多肽以及检测至少一种感兴趣的核酸。
如上面所讨论的以及将进一步在给出的实施例中示例说明的,双马来酸酐交联剂的使用相对于在当前的病理学实验室的例行程序中使用的其它固定剂和操作在许多方面具有显著优点。在非常优选的实施方案中,本发明因此涉及双马来酸酐交联剂在固定细胞样品或组织样品中的用途。
仍在进一步优选的实施方案中,双马来酸酐交联剂在随时可用的固定剂的制备中使用。优选地,本发明因此涉及双马来酸酐在制备用于固定细胞样品或组织样品的固定剂中的用途。
优选地,用于固定细胞样品或组织样品或在制备用于固定细胞样品或组织样品的固定剂中使用的双马来酸酐交联剂将会为如式I所定义的双马来交联剂。优选地,当实施本发明中公开的固定方法时,式I的连接基X将会选自作为优选的而公开的连接基。在进一步的实施方案中,交联剂将会选自如式II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX中所描述的化合物。
既然使用双马来酸酐交联剂具有巨大优点,特别是已知其容易实现可逆性,故可以容易地设想这样的试剂可与其它固定剂(例如带来永久固定的固定剂)进行组合。采用这种方式来进一步改善组织的长期保存是可能的,然而具有容易地恢复感兴趣的核酸或抗原的至少相关的部分的可能性。
在另一个优选的实施方案中,本申请涉及固定细胞样品或组织样品的方法,其中使用了包含双马来酸酐交联剂和选自甲醛和/或戊二醛的第二种交联剂的混合物。优选地,这样的混合物为下文中描述的一种。仍在另一个优选的实施方案中,本申请涉及包含双马来酸酐交联剂和选自甲醛和/或戊二醛的固定剂的固定剂。这样的固定剂的其它组分将会选自对上述双马来酸酐固定剂所给出的优选的实施方案。优选地,所使用的双马来酸酐交联剂与甲醛或戊二醛或与两者的总和(如果使用混合物)之间的基于体积的比例将会为从1∶10至10∶1(重量/重量)。在这样的混合物中的固定剂的总和的终浓度将会为上述对于仅含有双马来酸酐交联剂的固定剂所阐述的那样。优选地,这样的包含双马来酸酐交联剂和甲醛或戊二醛或两者的固定剂将具有在pH8.0至11.0范围内的pH值。
提供下述实施例、序列表和附图以帮助理解本发明,其真正的范围在附加的权利要求中给出。应理解在不偏离本发明的主旨的前提下,可以对所给出的操作方法进行修改。
附图说明
图1展示了从用特异性结合至IGF-1R的单克隆抗体5G11染色的H322M异种移植物荷瘤SCID米色小鼠获得的染色的4μm薄切片。已经分别用不同的固定剂(使用4%甲醛(“福尔马林”)、4%或8%双柠康酸)进行了组织固定。分别在对甲醛固定的组织进行的加热诱导的抗原修复和通过使用酸性缓冲液从用双柠康酸固定的组织中除去双柠康酸之后,IGF-1R的免疫组织化学定位分别在固定剂福尔马林(图1;A)或在4%(图1:B)和8%(图1:C)使用的双柠康酸之间显示出具有可比性的染色强度或质量。
图2展示了从用特异性结合至EGFR的单克隆抗体3C6染色的H322M异种移植物荷瘤SCID米色小鼠获得的染色的4μm薄切片。已经分别用不同的固定剂(使用4%甲醛(“福尔马林”)、4%或8%双柠康酸)进行了组织固定。分别在对甲醛固定的组织进行的蛋白酶辅助的抗原修复和通过使用酸性缓冲液从用双柠康酸固定的组织中除去双柠康酸之后,EGFR的免疫组织化学定位分别在固定剂福尔马林(图2;A)或在4%(图2:B)和8%(图2:C)使用的双柠康酸之间显示出具有可比性的染色强度或质量。
图3展示了使用从已经经受不同的预处理/固定方案的MDA468细胞中分离的mRNA进行的EGFR基因的PCR扩增。展示的是EGFR-mRNA从MDA-MB468细胞(新鲜的和在RPMI中保存4个小时的均未固定的,分别在10%DMSO、80%DMSO、10%DMSO与1%双柠康酸、80%DMSO与1%双柠康酸以及水“Wasser”(作为阴性对照)中处理/固定的新鲜的MDA-MB468细胞)中的扩增。正如从扩增曲线和所插入的表格中所显而易见的那样,来自所有样品中的mRNA以相当类似的方式扩增。
图4展示了使用从已经经受不同的预处理/固定方案的MDA468细胞中分离的mRNA进行的HER2基因的PCR扩增。展示的是HER2-mRNA从MDA-MB468细胞(新鲜的和在RPM中保存4个小时的均未固定的,分别在10%DMSO、80%DMSO、10%DMSO与1%双柠康酸、80%DMSO与1%双柠康酸以及水“Wasser”(作为阴性对照)中处理/固定的新鲜的MDA-MB468细胞)中的扩增。正如从扩增曲线和所插入的表格中所显而易见的那样,来自所有样品中的mRNA以相当类似的方式扩增。
实施例1:
式VIII的“双柠康酸”的合成
甲基-3-甲苯基氨基甲酰基-丙烯酸的合成
历时15分钟向3.2ml 3-甲基-呋喃-2,5-二酮(柠康酸酐)于25ml乙醚中的溶液中滴加3.74g对甲苯基胺于25ml乙醚中的溶液。将黄色混悬液搅拌1小时并过滤。将残余物用乙醚洗涤并真空干燥。
收率:7.22g,94%
3-甲基-1-对甲苯基-吡咯-2,5-二酮的合成
将7.22g甲基-3-甲苯基氨基甲酰基-丙烯酸混悬于60ml乙酸酐中。将混悬液回流加热3小时。冷却至室温后,真空除去溶剂。将残余物从乙醇中重结晶。
收率:4.32g,65%
3-(5-(4-甲基-2,5-二酮-1-对甲苯基-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基)-戊基-)-4-甲基-1-对甲苯基-吡咯-2,5-二酮的合成
将12g 3-甲基-1-对甲苯基-吡咯-2,5-二酮和15.6g三苯基膦溶解于155ml乙酸中并加入2.15ml戊二醛。将反应混合物回流20小时。通过蒸馏除去乙酸并将残余物加热至150-160℃且保持6小时。
通过硅胶柱色谱法(石油醚∶乙酸乙酯7∶3)纯化粗产物。通过在甲醇中消化将产物进一步纯化,过滤和干燥。
收率:2g,35%
3-(5-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢-呋喃-3-基)-戊基)-4-甲基-呋喃-2,5-二酮(“双柠康酸”)的合成
将1.07g 3-(5-(4-甲基-2,5-二酮-1-对甲苯基-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基)-戊基-)-4-甲基-1-对甲苯基-吡咯-2,5-二酮溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的1∶1混合物中。在加入3.48g溶解于水中的氢氧化钾之后,将混合物回流加热3小时。通过蒸馏除去溶剂,并将残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚∶乙酸乙酯7∶3)纯化。真空干燥产物。
收率:402mg,60%
实施例2:
3-(5-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢-呋喃-3-基)-3-氧杂-戊基)-4-甲基-呋喃-2,5-二酮(式IX)的合成:
类似于实施例1中描述的操作,使用3-氧杂-1,5-戊二醛代替1,5-戊二醛来合成交联剂3-(5-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢-呋喃-3-基)-3-氧杂-戊基)-4-甲基-呋喃-2,5-二酮(式IX)。原料3-氧杂-1,5-戊二醛被Bowers,S.等人,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19(2009)6952-6956所描述。
实施例3:
用IGF-1R抗体染色
将H322M异种移植物荷瘤SCID米色小鼠处死。将肿瘤取出并切割成大约相同大小的3块。随后将组织样品转移至各个固定溶液中。对于用双柠康酸固定,将该物质通过在室温反复移液而溶解于DMSO中达80%的终浓度。在完成溶解之后,将该溶液直接使用,或者以1∶1稀释于DMSO中并进一步稀释于1×PBS pH 7.4中,最终分别形成具有终浓度为10%DMSO和8%或4%的双柠康酸的PBS。为测试不同浓度的双柠康酸对固定效果的影响,制备了含有4%或8%双柠康酸(w/v)的溶液。对于甲醛固定剂的制备,将福尔马林(40%(w/v)多聚甲醛于H2O中的溶液)以1∶10溶解于1×PBS pH 7.4中。
将所有肿瘤样品在室温固定过夜保持12小时。第二天,将组织样品用H2O洗涤1小时。然后,将固定的肿瘤组织包埋于石蜡中。
使用常规的旋转切片机,将用不同固定剂(4%福尔马林、4%或8%双柠康酸)固定的石蜡包埋的组织样品的切片以4μm进行切割。对于IGF-1R的免疫组织化学定位,将切割的组织切片装载在载玻片上。组织样品的脱石蜡在Ventana Benchmark XT自动化IHC染色器(Ventana,Tucson)上进行。对于通过免疫组织化学用<IGF-1R>5G11单克隆抗体(Ventana,Tucson)使IGF-1R在FFPE组织中定位,需要在福尔马林固定的样品的染色之前进行加热诱导的抗原修复。为IGF-1R的免疫组织化学的检测而进行的加热诱导的抗原修复是通过将组织切片在Ventana Benchmark XT上在95℃在缓冲液CC1(Ventana,Tucson)中孵育1小时而进行的。先前用双柠康酸固定的且之后用石蜡包埋的薄切片中的抗原修复可以通过将组织切片简单的孵育在具有酸性pH的缓冲液中来进行。将薄切片在pH值5.8的缓冲液中孵育2小时。抗原修复之后,将所有的载玻片放置于Ventana Benchmark上并进行IGF-1R的染色(一次抗体孵育时间为16分钟)。结合的一次抗体用Ventana iview DAB检测试剂盒来检测。染色的切片的检查显示出用双柠康酸进行的组织固定保留了该组织的形态学(图1B和C)。此外,可以通过在酸性缓冲液溶液中进行简单的孵育而重新得到双柠康酸。IGF-1R的免疫组织化学定位并未显示出染色强度或形态学质量在福尔马林(图1;A)或双柠康酸固定的组织(图1;B和C)之间存在显著区别。
在该实施例中所获得的结果证实了用双柠康酸固定使保存以及容易和温和的表位修复成为可能,所述表位在福尔马林固定的组织中仅在组织用被称为加热诱导的抗原修复的方法处理之后才变成是可接近的。
实施例4:
用EGFR抗体染色
通过类似于实施例2的操作,制备了福尔马林或双柠康酸固定的组织以用于使用抗体3C6(<EGFR>mAB 3C6;Ventana,Tucson)的EGFR染色。已知该抗体依赖于源自FFPE的组织切片的蛋白酶预处理从而重新获得对在这样的FFPE样品中的其表位的可接近性。如图2所示,没有发现EGFR的免疫组织化学定位在福尔马林固定和蛋白酶辅助的表位修复或双柠康酸固定和修复(通过在酸性缓冲液中孵育)之间存在区别。
在该实施例中所获得的结果证实了用双柠康酸固定使保存以及容易和温和的表位修复成为可能,所述表位在福尔马林固定的组织中仅在组织用蛋白酶处理之后才变成是可接近的。
如实施例2和3整体所证实,双柠康酸固定和修复为用于不同表位的检测的方法,所述表位迄今为止在福尔马林-固定的组织中需要通过一个或多个不同的修复方法(加热或蛋白酶诱导的)来修复。作为其它双马来酸酐的原型,双柠康酸在使用时不需要用于不同抗体(否则需要非常不同的修复方法)的严格的修复方法。反之,加热诱导的或蛋白酶辅助的修复的标准化和再现是不容易的,通过使用温和和容易的除去基于如上所示的双马来酸酐交联剂的固定剂的方法,获得更具重现性的抗原/表位的可接近性/反应性将会是可能的。
实施例5:
用于基因扩增分析的DNA分离和qPCR
将MDA-MB468细胞首先固定于不同的固定试剂中固定10分钟,然后在枸橼酸盐缓冲液(pH 4.4)中进行中和。图3中给出的不同的样品为MDA-MB468细胞(新鲜的和在RPM中保存4个小时的均未固定的,分别在10%DMSO、80%DMSO、10%DMSO与1%双柠康酸以及80%DMSO与1%双柠康酸中处理/固定的新鲜的MDA-MB468细胞)。
在不同的固定操作之后,使用1x 107个MDA-MB468细胞进行DNA分离。为分离DNA,根据制造商的说明书而使用高纯度模板制备试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,目录编号:11796828)。将分离的DNA储存在-20℃。
在MDA-MB468细胞中测量了EGFR和HER2的扩增状态。因此,使用基因特异性引物和探针(参见表1)进行了基于水解探针(Taqman探针)的使用的定量PCR。用Fam在5`端和用BHQ-2在3`端对靶标基因的探针进行标记。
表1:靶标基因HER2和EGFR的引物和探针
对于每种基因,使用了单独的、经过验证的PCR-混合物(参见表2)。
表2:用于qPCR测定的PCR-混合物组合物
每种混合物由5μM正向引物和反向引物以及2μM探针组成。所应用的Z05聚合酶被包括在购自Roche Molecular Diagnostics(Branchburg,USA)的COBAS Taqman RNA反应混合物(LUO M/N 58004938)中并根据不同的寡核苷酸(oligo)混合物以不同的浓度加入乙酸镁[25mM](Fluka,目录编号:63049)。使用2μl DNA模板并用不含核酸酶的水加满至5μl。对每种样品测量三次。使用LightCycler 480(Roche Diagnostics GmbH)和合适的96-孔板以及密封箔来进行所述测量。在所述周期计(cycler)中使用下述热循环参数(表3)。
表3:LightCycler热循环参数
程序名 | 循环数 | 分析模式 |
去污染 | 1 | 定量 |
扩增 | 47 | 定量 |
冷却 | 1 | 无 |
Claims (15)
1.用于体外固定细胞样品或组织样品的方法,其中所述细胞样品或所述组织样品与式I的双马来酸酐孵育,
其中R1和R2独立地选自:氢、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基,
其中X为长度在1个和30个原子之间的连接基,
由此将所述细胞样品或所述组织样品固定。
2.权利要求1的方法,其中在所述双马来酸酐中,R1为氢或甲基且R2为氢或甲基。
3.权利要求1或2的方法,其中在所述双马来酸酐中,R1和R2是相同的。
4.权利要求1、2或3的方法,其中在所述双马来酸酐中,连接基X的长度为1-20个原子。
5.权利要求1-4中任一项所述的双马来酸酐,其中连接基X的主链由碳原子和任选的一个或多个选自O、N和S的杂原子组成。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述样品与双马来酸酐孵育1-72个小时。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括将固定的样品包埋于石蜡中的步骤。
8.权利要求1-6中任一项所述的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺交联,和
e)对感兴趣的表位进行免疫检测。
9.权利要求8的方法,其中所述感兴趣的表位为当包括所述表位的所述细胞样品或组织样品用甲醛固定剂固定时被掩蔽或破坏的表位。
10.权利要求1-6中任一项所述的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将步骤(a)的固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺交联,和
d)通过进行原位杂交来检测感兴趣的核酸。
11.权利要求1-6中任一项所述的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺交联,和
d)通过进行RT-PCR来检测感兴趣的核酸。
12.权利要求1-6中任一项所述的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺交联,和
d)通过进行RT-PCR或荧光原位杂交来免疫检测至少一种感兴趣的多肽以及检测至少一种感兴趣的核酸。
13.权利要求1-6中任一项所述的方法,所述方法进一步包括如下步骤
a)将固定的样品包埋于石蜡中,
b)将所述样品脱去石蜡,
c)除去双马来酰胺的交联,
d)分离核酸,和
e)用步骤(d)中分离的核酸进行突变分析。
14.双马来酸酐交联剂在固定细胞样品或组织样品中的用途。
15.双马来酸酐交联剂在制备用于固定细胞样品或组织样品的固定剂中的用途。
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