JPH01500221A - 配列決定された核酸を特異的に検出及び測定するための分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 配列決定された核酸を特異的に検出及び測定するだめの分析方法 この発明は、特定の塩基配列を含有する核酸を測定するための方法に関する。例 えば生物学的サンプル中に存在するり、ＮＡ又はＲＮＡ中のそのような核酸の決 定は生物医学的及び遺伝的研究において非常に重要である。

今日、生物学的サンプル、例えば体液、組織サンプル、例えば絨毛サンプル、綿 棒等中の特定の核酸配列を検出することが臨床的に必要である。この様な分析か らの結果を用いて、遺伝子異状及び癌罹病性から細胞性、ウィルス性及び真菌性 感染性疾患にわたる異常を固定及び／又は検出することができる。

しかしながら、今までのところ、このようなヌクレオチド検出のために使用され る方法は日常環境には容易に適用されず、そして専門化されたスタッフ及び実験 室設備なくしては行われ得ない。これは、手順が複雑であシ、災害を発生しやす い材料（例えば、ラジオアイソトープ）を必要とし、そして結果を達成するため に長いインキュベーション時間を必要とするためである。

従来から、反応に引き続き検出を行うためにラベルされている相補的ヌクレオチ ドとのインキュベージ田ンにより所望の核酸配列が検出されている。この相補的 配列（又はプローブ）は従来技術を用いて容易に設計することができる。

核酸プローグ技法の実力は検出方法の特異性に由来し、これは核酸配列がユニー クであること、及び完全な配列対合と不完全な配列対合の間の識別を可能にする ストリンジエンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができること、 の両方に基く。

適切なサイズのプローブ及び特定のハイブリダイゼーション条件を用いることに よシ、ヌクレオチドを１測具にするＤＮＡ中の２つの配列の間を識別することが 可能である。これは、試験配列中の単一点変異の存在の検出を可能にし、そして このような変異が疾患、例えば特定の癌及び他の疾患と関連する場合、これらの 方法はこの様な疾患の診断に適用されよう。

第二に、特定のオリゴヌクレオチド配列の自動化合成系の開発が、今日入手可能 な広範でかつ急速に増加しつつある核酸データから誘導される塩基配列を有する プローグの造成を促進した。

従来、例えばＤＮＡの特定の配列の検出は三段階法である（　Ｐ、　５ＺＡＢＯ 等、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　（１９ ８２）、　４２５−４２７頁〕。まず、一般に固体基材に付着されているサンプ ルとプローグＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションカッブリングが行われる。

第二に、非特異的に結合したプローグＤＮＡが洗浄除去され、そして第三に特異 的に結合したＤＮＡが埋す定される。歴史的には、プローブＤＮＡは糖−リン酸 １主鎖”に本質的（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）ラベルとして３２ｐを導入することに よシ、又は塩基の芳香族構造中に外的（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ）ラベルとして導入 された１２５Ｉによシ放射性ラベルされていた。こうして、今日の検出系はオー トラジオグラフィー又はアイソトープ計数法によシ細胞当シ１ゲノムのオーダー の非常に高い感度を達成した（　Ｈａｇｓｅ　Ｅ、Ｔ、等（１９８２）　。

度を定量化するためのアイソトープラベル化はイムノアッセイにおけるよく確立 された技法である。しかしながら、放射性化合物を用いて研究する場合の災害の 観点から、イムノアッセイにおいてアイソトープの使用を避け、そしてその代り に酵素、螢光又は化学発光ラベルを使用するためにこの１０年間に大きな努力が なされてきた。イムノアッセイにおいて得られた今日の大きな経験により、核酸 のための非放射性ラベルの検索がスタートした。しかしながら、ハイブリダイゼ ーション試験のかなシ苛酷な条件のため、酵素ラベルを用いることはできない。

なぜなら、これらは今日のハイブリダイゼ一シヨン条件下では変性するであろう からである。

ラジオアンソトープラベル及び核酸プローブ、そしてさらに延長された反応時間 及び　Ｐ−ラベル化ＤＮＡを可視化するために必要な特殊な装置の本質的な欠点 を克服するための多くの開発が行われている。

Ｄａｖｉｄｓｏｎ及び共同研究者はチトクロームＣ又はポリアミン橋を介してビ オチンをＲＮＡに共有結合せしめた。サンプルとのハイブリダイゼーションの後 、メタクリル樹脂球体上に固定化されたアビジンとの反応によってグローブが測 定される。そして、ラベルとして働く球体によシ、ハイブリダイゼーション部位 が電子顕微鏡によシ検出され得る（　Ｊ、Ｅ、ＭＡＮＮＩＮＧこの方法は、染色 体マツプ法において好結果をもって適用された。Ｌａｎｇｅｒ等（：　Ｐｒｏｃ ｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ、　ＵＳＡ　７８　（１９８１）ｙ６６３３−６６３７　）はビリ ジノン又はプリン環に共有結合したビオチンを含有する数のヌクレオチド類似体 を合成した。複雑な一連の化学反応によシラリジントリホスフェート（ＵＴＰ） 及びｄＵＴＰのビオチン−ラベルされた誘導体が製造された。これらの類似体は 一連のＤＮＡ　、ｆ？リメラーゼを用いるインビトロ反応によｐ　ＤＮＡに好結 果に導入された。次に、修飾されたＤＮＡ分子（グローブ）を用いてアビジン又 は抗−ビオチン抗体を結合せしめた。ここで、アビジン及び抗体の両シグナル発 生成分がパーオキシダーゼ発色系を用いて色度計によシ確認された。好結果に説 明されたが、この方法は多くの欠点を有する。第一に、比較的不安定なヌクレオ シド−トリホスフェート−ビオチン類似体の調製は技術的に簡単にはいかない。

第二に、ＤＮＡへのこの様な類似体の酵素的導入は制御が困難であシ、効率的で なく、そして一般にグローブＤＮＡ分子当たシ最大１〜２個のビオチン分子をも たらす。最後に、ビオチンに対するビオチン抗体の親和性（最良でもｌＯ８〜１ ０１０）はアビジンのそれよシもかなシ低い。ヌクレオチド類似体のこの使用の これ以上の開発がＶｉｎｅｅｎｔ等［：　Ｎｕｃｌｅｔｅ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａ ｒｃｈ　（１９８）　１０．６７８７−６７９６　）によシ示され、彼等はＬａ ｎｇｅｒ等に類似する方法に従ってジニトロフェノール（ＤＮＰ）ヌクレオチド 類似体を造成した。この類似体は、グローブ分子当９１〜２分子のＤＮＰのおよ その比率でＤＮＡに好結果に導入された。グローブの検出は、抗−ＤＮＰ抗体と の反応、及びこれに続く抗一種抗体一ノソーオキシダーゼ接合体との反応による 特異的に結合した抗体の検出によって行われた。

しかしながら、アイソトープ技法と比較した場合、この例は効率的に鋭敏ではな かった。１つの大きな理由は、ハイブリダイゼーション複合体内で結合しておシ 従って抗体との反応に利用されない抗原（ＤＮＰ　）分子の比率のためであった 。

最近、螢光シグナル発生成分及び基材へのプローブＤＮＡの連結に基く、ＤＮＡ の検出のだめの改良された方法が開発された。例えば、ＦＲ−Ａ−２，４８０， ９４３（ＷＡＮＧ等；アボットラボラトリーズ）は、核酸、特に二本鎖核酸と接 触した場合に強く螢光を発する新しい種類の色素を開示している。標的核酸の不 存在下においては水溶液中に螢光が存在せず、そして単鎖ポリヌクレオチド（ｍ ＲＮＡ　）によシ比較的弱い螢光が存在する。測定は螢光顕微鏡によりバルク溶 液上で行われる。例えば、水性ヨウ化３−γ−ジメチルアミノグロビルー２−ｐ −ジメチルアミノスチリルベンゾチアゾリウムＣ２１Ｃ２１ｎ９７を用いて濃度 １〜１００　ｎＭのＤＮＡが測定され得る。螢光はサンプル中のＤＮＡの量に直 線的に比例する。

文献ＥＰ　−Ａ　−５７，５５３（ＢＩＲＮＢＯＩＭ　：　Ａｔｏｍｉｃ　Ｅｎ ｅｒｇｙｏｆ　Ｃａｎａｄａ　）は、二本鎖ＤＮＡと反応して螢光をもたらすが 、しかし単鎖ＤＮＡによっては螢光をもたらさない螢光色素の使用を教示してい る。この技法は、熱、声、化学物質、照射又は他の変性条件に基くＤＮＡの変性 の程度を測定することができる。適当な色素は臭化エチジウム、４’、６−ジア ミン−２−フェニルインドールニ塩酸塩、ミチラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｉｃ ｉω、ベキスト３３２５８等である。螢光は・マルク溶液中で測定される。

ＵＳ−Ａ４，４２３．１５３（Ｄ、Ｆ、ＲＡＮＡＥＹ等）は特異的ＤＮＡ　−フ ルオロクロームアダクトに関し、その生成がサンプル中に存在する全二本鎖ＤＮ Ａに直接比例して螢光の増強をもたらす。好ましい螢光増強剤は二本鎖ＤＮＡに 特異的に結合するミスラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｉｃｉｎ）である。螢光計に よシパルク中で螢光が測定される。

幾つかの便利な市販の螢光計が特に挙げられる。

文献ＵＳ−Ａ−４，２５７，７７４（ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ等、メロイラボラト リーズ）はＤＮＡの螢光インターカレーター（１ｎｔｅｒ　ｃａｌａｔｏｒ）　 、例えばＤＮＡの定量のだめのエチジウム塩、ダウンマイシン、メツ９クリン及 びアクリジンオレンジ並びに４′、６−ジアミツー２−フェニルインドールの直 接結合を記載している。前記色素の結合と通常競争し、このために螢光の対応す る減少を導く非−螢光ＤＮＡ結合剤の測定のだめの試験において螢光分析が使用 される。

さらに、支持体に固定化されたグローブが開示されている。例えば、文献ＥＰ− Ａ−１３１８３０（ＤＡＴＴＡＧＵＰＴＡ等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃｓ）は、特定の塩基対配列を含有するＤＮＡの決定のための、ノ・ イブリダイゼーションにおける検出のための核酸のラベル化を開示している。ラ ベル化された核酸は、検出されるべき配列と実質的に相補的であるか又はそれと 相同である少なくとも１つの単鎖塩基配列を含んで成る。グローブは、固体支持 体、例えばニトロセルロース、修飾されたナイロン、及びフィルター又はシート の形の弗素化炭化水素上に固定化され得る。ラベル化のため、酵素又はピオチン −アビジン系が開示される。同様に、Ｅ　Ｐ　−Ａ　−１３０，５２３（ＤＡＴ ＴＡＧＵＰＴＡ等；Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　）は、固体 基材上への核酸グローブの固定化を記載している。カル？キシ、アミノ及びヒド ロキシのごとき反応性基を有する基材、例えば綿、紙、カルボキシメチルセルロ ース等が適当である。

核酸は、光化学的に反応性の核酸結合リガンド、例えばフロクマリン、アングリ シン、グツ２レン及びアミノフェナンスリジウムハライドのごときインターカレ ーター、又はネオトログシン、ジスタマイシン、Ｈｏｅｃｈｔｓ　３３２５８及 びビスベンズイミダゾールのごときインターカレーターを用いて基材に連結され る。リガンドと基材とのカッブリングは、ＣＮＢｒ、ジアルデヒド及びジ−グリ シジルエーテルのごとき架橋剤によシ行われる。

基材に固定化された螢光発生成分の検出も研究された。すなわち、ＥＰ−Ａ−７ ０６８７（Ｍ、Ｊ、ＨＥＬＥＲ。

Ａｍｏｃｏ　Ｃｏｒｐ、）はＤＮＡハイブリダイゼーションにおける反応体の測 定化を扱っている。例えば、固定化された単鎖ポリヌクレオチドが光放射ラベル された相補的ポリヌクレオチド試薬とハイブリダイズされる。ハイブリダイズさ れなかった試薬を固定化されたサンプルから分離した後、光ラベルを励起し、そ して光応答を検出する。引用されている固定化基材はガラスピーズ、ポリアクリ ルアミド、アガロース、セファデックス、セルロース等である。光ラベルは化学 発光、生物発光、リン光又は螢光であることができる。検出のため、市販の検出 機、例えば光電子増倍管を用いることができる。

また、ＥＰ−Ａ−１１７，７７７（ＴＨＡＮＡ　ＴＨＵＯＮＧ　ＮＧＵＹＥＮ等 。

ＣＮＲ８）は、核酸配列認識系として使用される。アクリジン、フロクマリン及 びエリブチシン誘導体のごときインターカレーターに共有結合によシ付着された 裁断されたオリゴヌクレオチドを開示している。

バルク又はグル螢光に基く測定が引用される。

従来技術の確かな確立にもかかわらず、特によシ迅速で且つ鋭敏な試験、及び現 在の技法に随伴する多数の熟練を有する操作の回避の観点から、一層の改良が望 ましいと感じられた。

これは本発明の方法に従って達成された。この方法はグローブ固定化支持体とし ての光学導波体（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）　、該導波体の出力において検出されそ して測定される螢光シグナルを与える該導波体中を移動する波エネルギーと相互 作用するポリヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション生成物をラベルする ために使用される螢光マーカーの使用に頼る。

この方法は、添付された請求の範囲第１項に簡単に要約されている。この請求の 範囲において、測定は検出、同定、定量、濃度測定、及び分析対象に対して行わ れるべきこれらに類するものを含むことが意図される。

具体的には、核酸グローブが常用手段又は新規な手段によシ光ガイド、又は導波 体として機能する光学的に透明な支持体に連結される。単鎖サンプル核酸とイン ターカレーション螢光色素の存在下でのグローブとの反応が許容される。この様 な色素は二本鎖核酸の鎖の内に自ら入シ込む（すなわち、これらはインターカレ ートする）。インターカレーションの後、色素螢光量子収量の増強、螢光の半減 期の延長、及び螢光放射波長の赤−シフトが起シ、このすべてが光学的にモニタ ーされる。グローブはハイブリダイゼーションの前又は後において導波体表面上 に固定化され、しかし導波体に結合した二本鎖の螢光中心のみが測定のために使 用される螢光シグナルをもたらすであろう。

従来の光透過測定法によっては支持体表面に固定された分子のハイブリダイゼー ションと溶液中で起こるハイブリダイゼーション反応との間を同時に識別するこ とが不可能であることが注目される。しかしながら、導波体支持体内の螢光励起 光を内部反射することによって、すなわちエパネッセントベクタ−（ｅｖａｎｅ ｓｃｅｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ）と導波体表面分析対象における複合体との相互作用 から生ずる光シグナルと溶液内で生ずる他の光学的変化とを識別することによっ て、導波体表面におけるハイブリダイゼーション反応を測定することができる。

この発明の具体例においてこの方法を用いて、ラベルされたグローブをあらかじ め用意することを必要としないで、反応が完結することを必要としないで（モニ ターがリアルタイムであるため）、そして測定に先立って系から他の材料を分離 することを必要としないで（表面反応のみがモニターされるため）、核酸ハイブ リダイゼーションの動的測定を行うことができる。

一層詳細な事項は添付図面に言及しながら記載しよう。

この図面において、第１図は相補的塩基配列を特徴とするポリヌクレオチドにつ いて生ずるハイブリダイゼーション反応を模式的に示してアシ、塩基配列の幾ら か（グローブ）は支持体の表面に連結されている。

第２図は支持体表面へのグローブの連結の１つの好ましい態様を模式的に示す。

第３図は周囲媒質のｎ２よシも大きい屈折率ｎ１の導波体中の内部反射による光 ビームの伝播の様子を模式的に示す。

第４図、すなわち第４Ａ図、第４Ｂ図、第４Ｃ図及び第４Ｄ図は、導波体との界 面において光シグナルを発生する種を含有する分析対象と接触すべき導波体を照 明するだめの具体的装置並びに該シグナルを検出しそして収集するための具体的 装置を模式的に示す。

第５図（Ａ及びＢ）は第４図の装置を用いて行われる測定の代表的な曲線を示す 。

第６図は第５図のそれに類似する他の曲線を示す。

第７図は導波体の中空円筒状の具体例を模式的に示す。

第８図はこの発明の異る具体例を示すダイアダラムである。

第１図は、単鎖核酸鎖７及びインターカレーション色素分子９を含有する分析対 象溶液２と接触している導波体ｌを模式的に示す。導波体１は、物質的又は化学 的リンカ−６によシ該導波体の表面に固定化されたオリゴヌクレオチドグローブ ５によシコートされている。、ｊ？　リヌクレオチド主鎖に共有結合によシ結合 したヌクレオチド塩基が番号８で示される。

ヌクレオチドサンプル鎖７の幾らかはグローブ５のそれと相同の塩基配列を有し 、そしてこれらはそれらとハイブリダイズして塩基対５ａ　−７ａを形成する・ 銀量の結合の形成は番号８ａで示される。この図面に示すように、他のバイブリ ドがさらに溶液それ自体中で形成される。デュプレックスが形成された後、色素 分子９が銀量にインターカレートしく９ａ）、そして螢光性となる。通常、ＤＮ Ａについては５塩基対に１個の色素分子がインターカレートし、そしてＲＮＡに ついては１０対に１個がインターカレートする。（Ｊ　、　Ｂ、　ＬＥＰＥＣＱ 等、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２７　（１９６７）。

８７−１０６）。励起光３が、臨界角θ。よシ大きな角度θでの複数回又は１回 の内部反射によシ導波体内を進む。この励起光はそのエバネッセントベクター成 分によシ界面の近傍において相互作用する。この光成分の貫通深さく波長の分数 ）は、結合した複合体の螢光中心との最大効率の相互作用に対応する、最大強度 の電磁界を与えるように調整され、実際に、この貫通の程度を変える１つの方法 はＵＳＰ　４，６０８，３４４に記載されているように角θを変えることによる 。

すなわち、薄いフィルム中での表面反応についての改良された感度はθがθ。に 非常に近い値から選択される場合である。この分野における他の有用な参照文献 は、Ｎ、Ｊ、ＨＡＲＲＩＣＫ、　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎＳｐ ｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、　Ｗｙｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨー ク（１９６７）である。次に、この相互作用から生ずる螢光はほとんど導波体中 に再注入され、そしてその出口において通常の手段によシ収集されそしてモニタ ーされ得る。ある場合、例えば導波体が反応体溶液を保持するキュベツトの壁か ら成シそして螢光１０＆が膣壁を通して外側に放射される場合には、上記の方法 に代えて、又は上記の方法と組み合わせて、側方に、例えば導波体の表面に対し て直角に（１０ａ）放射される螢光を集めそして測定することができる。この方 法において鍵となる性質の１つは、導波体の表面に結合した螢光中心から生ずる シグナルが溶液のバルク中で生ずるそれと区別され得ることである。従って、導 波体に結合したグローブとは独立に分析対象溶液中で生ずる副反応のパックグラ ウンド効果が効果的に除去され得る。すなわち、この方法においては、励起光は 固／液界面を波長璽数だけ貫通するから、導波体表面において（すなわち、！ロ ープポリヌクレオチドと共に）形成される二本鎖物質のみが検出される。実際に 、螢光応答はすべての方向（１０，１０ａ　）に放射されるが、しかし入。

射光反射臨界角θｃＫ近い好ましい角確率（ａｎｇｕｌａｒｐｒｏｂａｂｉｌｉ ｔｙ）を有する。

成功のためのもう１つの鍵因子は、ハイブリダイゼーションの前又は後のいずれ かにおける、導波体表面へのグローブ核酸の固定化である。核酸のごとき生物学 的巨大分子を固体支持体に固定化するだめの多くの技法が存在する。これら、又 はこれらの変法は同様にこの発明に適用され得る。しかしながら光透過性の導波 体を使用する場合、固定化技法が表面の光特性に不都合な影響を与えるべきでは なく、幾つかの制限が課される。生物学的化合物を表面に固定化するだめの２つ の基本的技法は物理的吸着及び共有化学結合である。総説については、ｗＢ　Ｊ ａｋｏｂｙ及びＭ、　Ｗｉｌｃｈｅｃｋ　（１９７８）、Ａｆｆｔｎｉｔｙ　Ｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅ＋ｓ。

Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｔ、　ＸＸＸＩＶ、アカデ ミツクプレス、　ＮＹ；　Ｍｏ５ｂａｃｈ、　Ｋ（１９７６）　、　Ｉｍｍｏｂ ｉｌｉｓｅｄＥｎｚｙｍｅｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、　、ＹｏＬ、　ＸＬＩＶ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ：　５ｃｏｕｔｅｎ、　ＷＨ（１９８１ ）　。

Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ。

ＮＹ：Ｍｅｉｎｋｏｔｈ、　Ｊ及びＷａｈｌ、　Ｇ、　（１９８４）、　Ａｎａ ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３８，２６７−２８４を参照のこと。これらの技法は現在 の適用において利点及び欠点を有する。

導波体表面への物理的吸着によれば、ヌクレオチド塩基が導波体表面に直接結合 するのでゾロープ分子の有意な部分が反応のために利用されないであろう。

同様に、グローブの共有結合架橋の場合、従来法のほとんどが塩基上の官能基と 固体相上にあらかじめ置かれた反応性基との間の共有結合反応に頼る。得られる グローブは多数の部位に結合し、多くの塩基がハイブリダイゼーションのために 利用されなくなるであろう。理想的な系は、すべての関連塩基がサンプル核酸と の反応のために利用可能で１）、そしてグローブの大部分が励起光の貫通深さ内 に固定化されてサンプル核酸との反応の後に最大シグナルを与えるように、グロ ーブを表面に結合せしめるものである。

上記の考慮に従って結合されたプローブを有する導波体が本発明において利用可 能にされた。これは第２図に例示される。ここで、グローブ５０末端ヌクレオチ ド１２は、該グローブの一端が導波体３上の活性基１３に共有結合することがで きるように修飾されている（例えばそのリン酸末端によい）。例えば、この基１ ３はアミノシランのＮＦ２であることができ、これはグローブとの反応の後ホス ファミド連結合を導く。別の方法として、例えばインシアナトシランとアルキレ ンジアミンとの反応から式−ＣＯＮ’）（−（ＣＨ２）ｎ一定−Ｐのウレタン− ホスファミド連結も可能である。また、導波体表面上に分子１４が溶液２に対面 する正電荷によシ付着している。正電荷を有する分子１４はプローグ５中の負に 荷電したヌクレオチドホスフェートを引き付ける。正に負荷した部位に対する基 １３の比率は、塩基８がハイブリダイゼーションのために自由であることを保ち ながらグローブの最適な固定化が可能なように、すなわち、利用可能な１３の当 量がグローブのモル濃度におよそ対応するように調整される。陽性中心の量はそ の平均長さくセグメント中の平均塩基数）におよそ依存するであろう。グローブ ：正荷電分子の生ずる複合体は、関連塩基８がサンプルの核酸と反応するために 利用可能な状態で導波体表面に平行して完全に又は部分的に固定化されたグロー ブ分子をもたらすことができる。この系の具体例を実験の部で詳細に記載しよう 。この方法の予想外の利点は、ＤＮＡグローブをこの様な表面にこの様な配置で 濃縮することによシ、ハイツリダイゼーションアッセイのための迅速で鋭敏な検 出方法が見出されることである。

さらに、このプローブ：表面分子複合体は、一旦形成されれば、他の核酸分子か らの化学的又は競争的結合による排除に抵抗することも予想外である。導波体上 の正荷電中心は例えば第四アミノ基であることができる。この様な基は例えば、 導波体に結合したジアルキル−アミノ−アルキル−アミンのジアルキルアミノ末 端基を、例えばアルキルハライドのごとき第四級化剤によシ第四級化することに よシ得ることができる。−例として、導波体表面をトリヒドロキシ−γ−アミノ グロビルシランで処理し、そして臭化メチルによシ第四級化する。

この発明において使用できる導波体の選択には特別の制限はなく、そして当業界 において現在知られているほとんどのタイプを使用することができ、これには板 状体、棒状体、光ファイバー等が含まれる。

これらの多くは多くの刊行物中に開示されておシ、これらの刊行物はまた必要と される照射系、光検出器、及びグローブを取扱いそして対応する試験を行うだめ の光学配置をも記載している。螢光検出分析及びこの発明に従って得られるシグ ナルの定量化は光子計数装置（光電子増倍管）を用いて強化することができる。

インターカレーションされた色素からの識別はこの発明の技法と他の既知の技法 、例えば螢光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　） 及び／又は時分解螢光（ｔｉｍｅｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ）との組み合わせによシ行うことができる。これに関して有用な他の技法は螢光 ラマン散乱、螢光関連分光法（ｆｌｕｏｒｅｓ＋ｃｅｎｃｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔ ｉｏｎ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）　、及び螢光変動分光法（ｆｌｕｏｒｅｓ ｃｅｎｃｅ　ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）である。この 分野における有意義な参照文献はＭｏｄｅｒｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　５ ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（１９８−）　ＷＥＢＲＹ編、Ｈｅｙｄｎ、　＝　ニー 　ヨーク：米国特許Ａ　３．９７５，０８４　；屋３．４３６，１５９　：Ａ４ ，４４７，５４８　：煮３．９９９，８５５：及び扁３．６０４，９７７である 。

この発明の方法は、導波体の出口、すなわちその一端又は両端あるいはそれに対 して側方における螢光シグナルを測定することに依存するが、このタイプの相互 作用に限定されない。確かに、導波体の界面における核酸の反応はまた他の光現 象、例えばシグナル吸収、散乱等によっても検出することができ、特にヌクレオ チド塩基が幾つかの特定の周波数において強い光吸収を有する場合そうである。

従って、ＵＶ範囲、可視範囲及びＩＲ範囲における射熱による励起が可能である 。

さらに、引用される従来技術は標準的導波体、例えばガラス、石英又は適当なプ ラスチックから作られたグリズム、プレート又はファイバーを主として扱ってい るが、この発明においては、効果的に非常に薄い（１〜１０ミクロンの）（１又 は複数の）絶縁体層が他の絶縁体上に付着されている光キャビティーと称される 非常に薄い導波体を包含する多くの技法によシ界面における光相互作用を増強す ることができる（　Ｈａｒｒｉｅｋによる前記の参照文献１４７−１７７頁及び Ｊ、　ＤＥＬＡＹ等、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１２（１９７０） 、１３３：Ｖ、Ａ、Ｒ，ＨＵＳＳ等、　Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌ。

体、すなわち円筒状又は毛細管状導波体であって、その中を分析対象が循環する ものも可能である。

この様な界面からのシグナルを増強するための他の可能性ある方法は、固定化さ れた核酸と導波体との間に薄い金属層（５００−６００オングストロームのオー ダーの）を加えることである。この技法は、光条件（例えば、金属のタイプ、層 の厚さ１、入射光の角度、入射光ビームの偏光、入射光ビームの波長）の適当な 選択により、光学的に粗の媒質、すなわちサンプル中で、金属フィルムを用いな い場合よシも８０倍まで強い電磁界を発生せしめることができる〔参照文献とし て、Ｈ，Ｒａｅｔｈｅｒ　（１９７７）　、　ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎ　 ０ｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　 １ｎＰｈｙｓｉｃｓ　ｏｆ　Ｔｈ１ｎ　Ｆｉｌｍｓ、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、　Ｇ、　Ｈａａｓ及びＭ ＨＦｉａｎｃｏｍｂｅ　ｉｉ集。

アカデミツクプレス、Ｎ、Ｙ、、１４５−２６１頁；ＨｏＲａｅｔｈｅｒ　（１ ９８０）、Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｓｍｏｎｓ　ａｎｄＩｎｔｅｒ ｂａｎｄ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｅ１ｅｅｔｒｏｎｓ＋　Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ、　ＦＲＧ：　Ｂ、　Ｌｉｅｄｂｅｒｇ、　Ｃ，Ｎｙｌａ ｎｄｅｒ及び■。

Ｌｕｎｄａｔｒｏｍ　（１９８３）、　５ｅｎｓ、　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ　４． ２９９−３０４を参照のこと〕。表面ゾラスモン（ｐｌａｓｍｏｎ）共鳴と称さ れるこの技法は界面における層の厚さの変化の鋭敏な検出器として使用すること ができる。

これはまた、励起光磁界の増強された強度に基く表面における螢光強度を増強す る方法であることができる。前記の刊行物は内部反射分光技法の原理を詳述して いるが、この発明を明瞭にしそしてこの発明に関連付けるため、第３図に言及し ながら、次に簡単に記載しよう。

第３Ａ図に示すように、光ビーム２１が、２つの透明な媒質（ｎｌ）ｎ２）の間 の界面を高い方の屈折率ｎ１を有する媒質２３から照射する場合、反射角θが臨 界角θ。よシも大である時、内部全反射が起こシ（Ｈａｒｒｉｃｋ、　１９６７ ）、ここでθ。の値は次の式にょシ与えられる。

ｄｅ　＝　ｄｎ−’　（ｎ２／ｎ１）　（１）この場合、エバネッセント（。ｖ ａｎ＠５ｃｅｎｔ）波が波長の分数のオーダー距離（ｄｐ）だけ、反射面を越え て粗媒質２６中に貫通する。Ｍａｘｗｅ　Ｉ　１の式に例えば、反射面に対して 垂直な安定な正弦波が密媒質中に確立される。非吸収粗媒質中へのエネルギーの 正味の流れは存在しないが、この媒質中にエバネッセント場が存在する。場ベク トルの連続条件のため、電界強度（Ｅ）は界面において最大（ＥＯ）であシ、そ して界面からの距離（Ｚ）と共に指数的に崩壊する。

Ｅ　＝　Ｅｏ−ｅＸＰ　（−Ｚ／ｄｐ）　＋２）電界強度が界面における値のｅ ｘｐ　（−１）に低下するのに必要な距離として定義される貫通の距離（ｄｐ） は次の式： として与えられる。

この量はθの増加と共に減少し、そして屈折率が近ずく（すなわちｎ　２　／ｎ 　、→１）に従って増加する。

さらに、ｄｐは波長に比例するから、これはより長い波長においてよ多大となる 。

従って、内部反射要素の屈折率ｎ１．入射角、及び波長の適切な選択によシ、主 として界面に近接しているか又はそれに固定されている化合物との光相互作用を 促進し、セしてバルク溶液との光相互作用を最小にするようにｃｉｐを選択する ことができる。

貫通の深さは、内部反射における吸収フィルムによシ起こる減衰を決定する因子 の１つである。

他の因子は反射界面における偏光依存電界強度、θの増加と共に増加するサンプ リング面積及び密謀質の屈折率と粗媒質のそれとの一致（これは今度は光カップ リングの強さを制御する）である。これらの因子すべてを説明する適当な量は有 効厚さｄｅである。これは、伝導実験において同じ吸収を得るために必要なフィ ルムの実際の厚さを代表する。

感度を上げるため、多反射要素がしばしば使用される。反射の回数（Ｎ）は長さ くＬ）、導波体の厚さくＴ）、及び入射角（θ）の関数である。

Ｎ　＝　Ｌ／Ｔ＠　ｃｏｔθ　（４） 導波体が長くなるに従って、且つ薄くなるに従ってＮが大となシ、そして一層し ばしはエパネッセント波は抗体−抗原複合体の表面層と相互作用する。

１回の屈折について反射率（Ｒ）が、 Ｒ＝１−α・ｄｅ　（５） （式中、αは吸収係数であシ、セしてｄｅは弱く吸収する層の有効厚さである） であれば、Ｎ回の反射の後、反射損失は、 Ｒ−１−Ｎ−α・ｄｅ（６） であシ、すなわちＮの関数である。

従って、本発明においては、種々の光学的技法によシ表面反応をモニターするた めにエパネッセント波を有利に使用することができる。これらの光学的技法の１ つを例示のため第４Ａ図、４Ｂ図及び４Ｃ図に言及しながら下に詳細に記載する 。但しこれに限定されない。

使用される装置を第４Ｃ図に模式的に示す。この図はブロック線図として主要構 成要素を示し、これらの構成要素はモノクロメータ−３９、光源３６、導波体３ ８を伴うフローセル３７、フィルター５２、及び光電子増倍管検出器４０を含む データー獲得及び処理マイクロコンピュータ−を伴つＩＥ子装置、前増幅機４１ 、マイクロプロセッサ−光源制御系４２、マイクロコンピュータ−４３、プリン ター４４、及びメモリー（例えばフロッピーディスク）４５を含んで成る。

導波体／液体界面における螢光を集めるため、選択可能なシグナル収集技法を用 いることができる（第４Ａ図及び第４Ｂ図）。界面から放射される螢光は、検出 器５４が界面に対して直角に配置される場合（第４Ａ図）には従来法により、そ して／又は検出器４０が存在する場合には一次元ビームとイン−ライン（ｉｎ− １１ｎｅ）で（第４Ｂ図）検出され得る。イン−ライン検出における放射の立体 角（ｓｏｌｉｄ　ａｎｇｌｅ）が直角検出の放射角に比べて非常に小さいことを 考慮すれば、前者が非常に効率的であるとは考えられない。しかしながら、増強 効果が存在し、そして、理論が予測するところによれば、ｎ２媒質としての水を 伴う溶融シリカ導波体については、イン−ライン螢光は導波体に対して直角に放 射される螢光よシも５０倍高いことができる。螢光が導波体にトンネルバックす るというこの効果は理論的にも実験的にも証明される〔例えば、Ｃ，に、　Ｃａ ｒｎｉｇｌｉａ等、　１．　Ｏｐｔ、　Ｓｏｃ。

Ａｍｅｒ、６２　（１９７２）：４７７−４８５）。

最初の段階において、入射平面波がエパネッセント波を生じさせ、これが、エバ ネツセンス電界強度に比例する局部分布をもって表面近くの分子を励起する〔式 （２）を参照のこと〕。特徴的な励起された寿命の後、式（２）によシ記述され る励起強度分布に非常に近似する表面の近傍、すなわちエバネッセント波のそれ 、における局部分布をもって、しかし螢光波長において、螢光を放射する。螢光 エバネッセント波に何が起こるかの問題には、光の相互作用の原理を適用するこ とによっては答えることができない。

この原理は、この光が平面波がエパネッセント波を生じさせる時の主たる過程と 同様にして平面波として導波体にカップルパックすることを述べている。

理論が示すところによれば、螢光放射強度は内部全反射の臨界角においてピーク となシ、それは内部に反射され得る。強度を増強するため、螢光を幾つかの反射 から集めそしてそれを検出器に導くように内部反射要素を構成することができる 。

これは、長いファイバーから直角に放射される螢光を検出器に容易に集めること ができないように、光ファイバーを内部反射要素として使用する場合に特に有利 である。イン−ライン検出もまた、ファイバーを包囲するサンプル溶液のバルク を通しての螢光の測定を回避する。これはそうでなければ使用される色素に依存 して有意な影響を与えることがある。

本発明の具体例における光源３６はキセノン・フラッジ・ランフ’　（Ｅ、Ｇ、 　＆　Ｇ、　Ｓａｌｍ、　ＨＡ、　ＵＳＡ　）であシ、そして５　ｍｍの解像を 可能にするようにモノクロメータ−は凹形のホログラフ格子を備えていた。フラ ッシュランプの操作はマイクロコンビエータ−４２によシ制御された。サンプル を入口４８を通してセル３７に注入するため、好ましくはプログラム可能な自動 ピｄ　ット（Ｍｉｃｒｏｌａｂ−Ｐ　；　＆ｍｉｌｔｏｍ　Ｂｏｎａｄｕｚ社。

Ｂｏｎａｄｕｚ　、スイス）が使用された。光学要素はさらに２個の鏡Ｍ、及び Ｍ２並びに２個のプリズム４６及び４７を有した。導波体の出口に置かれた検出 器４０の光電子増信管（Ｒ９２８；浜松、東京）が光強度の変化を直接モニター した。これに代って、又はこれと同時Ｋ、フィルター５３を伴う検出器５４が直 角螢光放射からのシグナルをもたらした（第４Ａ図を参照のこと）。光電子増倍 管からのシグナルは増幅され、フラッシュタイムの間積分され（４）、そして標 準的１２−ビットアナログ／ディジタルコンバーター（示されていない）によシ デジタルホーマットに転換された。内蔵マイクロコンピュータ−４２が迅速なシ グナルの平均を行い、そしてすべてのデータがモノクロメータ−内に置かれた光 ダイオード４９との比較によシフラッシュランプの強度の変化について調整され た。シグナルは、ディスプレー及び貯蔵のため、マイクロコンピュータ−４３、 好ましくはＡＰＰＬＥ　Ｉｔモデル、に伝達された。

第４Ｃ図上に示される分析セル又はキュベツトは顕微鏡スライド導波体系に基礎 を置く。例示された系はフローセル３７を示し、このセルの底は実際に顕微鏡ス ライド３８である。密着性はガスケット４゜によシ保証され、スライド３８は、 好ましくはＨｅｒａｅｕ＋ｓからの２個の半球シリカプリズム４６及び４７に、 屈折率マツチ油の使用にょシ直接光接触状絶に置かれた。こうして屈折率マツチ 油が特に研摩された光学的に平らな導波体表面の必要性を排除した。プリズムは 、入射光の角度θ（第３図参照のこと）の容易な調整が可能な様Ｋ、そして光と シール用ガスケット５０との接触を回避するように設計された。

アルミニウム合金から機械加工されたフローセルは光路にそっての急速で泡を含 まない層流を可能にするという基準に合致する。他の金属、例えば黄銅も適当で あるが、本発明者等はアルミニウム合金を選択する。なぜなら、その良好な熱伝 導性、塩溶液との比較約２しい反応性、迷走光効果を回避するためＫつや消しブ ラックがメッキされた後の低い光反射率のためである。ガスケット５０は０．５ 　ＩＩＩの厚さの医療名柄のシリコーンゴムであシ、そして２ｋｇ／ｃ！ＩＬ２ の一定のシーリング圧のもとで水密性であった。

入口４８及び出口５１を含めて全セル容積は１．８　ｒｎｌであシ、導波管のす ぐ下の容積は０．６６ｍ／（５３ｘ２５Ｘ０．５）であシ、そして光路上の容積 は０．２９Ｍ（３６Ｘ　１６　Ｘ　Ｏ，５ｘｘ　）であった。前記の装置は次の 様にして操作される。

第一段階において、導波体３８が、第２図に関連して記載されておシそして後で 詳述される技法を用いてグローブＤＮＡ　Ｋよりコートされ、次に分析キュベツ ト３７の底部を構成するコートされた導波体が配置され、そしてエネルギー発生 要素及び検出要素を作動させた後、分析対象溶液（核酸断片及び色素を含有する ）がセルに添加され、これＫよシ相補的ポリヌクレオチド鏡開のハイブリダイゼ ーションが起こる。色素分子がデュプレックス鏡開にインターカレートレ、そし て励起の際螢光をもたらすであろう。従って、導波体界面、において発生した螢 光は導波体の出口において放射されそして検出器４０によシ集められるか、ある いは導波体に対して直角に放射され、そして残りの励起成分をそれぞれフィルタ ー５２又は５３によ＃）Ｐ去した後検出器５４により集められる。次Ｋ、検出器 ４０によシもたらされる対応するシグナル４０は所望の結果を得るために装置の 残シの要素４１〜４５によ多処理される。螢光の増加速度がハイブリダイゼーシ ョン速度を表わし、そしてそれ故にプローブに相補的なりＮＡのサンプル中濃度 、及びゾロープ忙対するその親和性に依存する。固定時測定及びエンドポイント 測定を行って類似の結果又は関連する結果を得ることもできる。相補的ＤＮＡの 既知サンプルを用いて標準試験を行って装置を検定し、そしてその後で未知サン プルを測定するためのターンプレートとして用いることができる。言うまでもな く、この装置はまた、測定されるべきポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ ョンの後にグローブを導波体に結合せしめるという態様で使用することもでき、 この態様における唯一の主たる相違は、混合物がセルに導入される前に反応体が 反応可能にされることである。

第４Ｄ図は、導波体を通してトンネルバックされそしてそこから入口側に出る螢 光を検出及びモニターするための他の装置である。この態様の作動構成要素は第 一の態様の場合とおよそ同じであシ、そして光源５７、フィルター５８、導波管 ５９、比較検出器６１、螢光放射フィルター６２、及びシグナル検出器６３を含 む。これにさらに、光源からの入射波長を導波管に向けて反射するビームスプリ ッタ−６０を含む。

ここで、光源５７によシ発生しそしてフィルター５８によｌ）濾過された励起光 は光ビームスグリツタ−６０を介して導波体５７の光入口面６４に反射される。

導波体と分析対象溶液（示されていない）との界面で発生した螢光は導波体にト ンネルパックし、そして面６４から出る。ビームスシリツタ−６０の光性能の正 しい選択によシ、この螢光シグナルの大部分がビームスプリッタ−を直接通過し て、濾過（６２）の後検出器６３によシ検出される。

第４Ｃ図に例示されるものに対するこの設計の利点は、励起光がサンプル検出器 ６３に直接入射されず、従ってバックグラウンドシグナルレベルカ最小となるこ とである。適切なビームスグリツタ−は単一石英スライドであってもよく、又は さらに複雑な二色ラミネートであってもよい。後者は励起光を導波体５９に直接 的に反射し、そして螢光をシグナル検出器６３に伝達するので、後者が好ましい 。

第４Ｄ図の態様の変形においては、入ロア１及び出ロタイブ７２によシ被験液が その中を循環される中空導波体７０（第７図）によシ平らな導波体５９を置き替 えることができる。クラッド７０ａを有するこの中空導波体は毛細管であること ができ、この毛細管はその内面積がその内容積に比べて非常に大であることがで き、この配置はエパネッセント波シグナルとコート７３によシ示されるハイブリ ダイズした材料の螢光中心との間の相互作用部位の高い密度をもたらす。第７図 において、試験キュベツトとして実際に機能するチーープの末端が栓７４及び７ ５によシ閉止されているが、液体をチェープ内に保持しそしてそれが末端から漏 れるのを防止する他の任意の手段か有効であることは明らかである。

この導波体の操作は第４Ｄ図に示されたものとおよそ同じである。矢印７６で示 される入射光は導波体の壁７０を通って伝わシ、そしてエバレッセント波成分が 材料７３と相互作用し、そして点の矢印７７によシ示される螢光シグナルを発生 させる。この螢光が第４Ｄ図の検出器６３に類似する検出器によシ取シ上げられ る。その他については、構成及び操作は第４Ｄ図の具体例と正確に類似する。

チェープ状導波体の利点は、それが比較的多量の溶液（例えば貯蔵器中に保持さ れる。図には示してない）の循環又は同じサンプルの再循環を可能にし、チーー プの内壁にコートされたグローブによるすべての分析対象分子の最大の取シ込み を保証することるべき核酸が非常に薄い場合であっても、循環が進行するに従っ てそれは次第にプローブに結合し、そして全体的感度が非常に増強されるであろ う。

インターカレーターとして使用される色素は特徴付けられそして研究されており 、そして二本鎖核酸の測定におけるそれらの使用は従来技術に属する。

適当な色素のリストはＥＰＡ８４１０７６２４．３及びＦＲ−Ａ−８１０７９２ ８に挙げられている。この発明において特に興味あるのはフエナントリジン色素 （例えば臭化エチジウム及び臭化エチジウムホモダイマー）、並びにアクリジン 色素である。顕著な光学的及び構造的性質の幾つかの総説がＲＨＳａｒｍａ　（ １９８０）　５Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄ　Ｇｅｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　Ｄｙｎ ａｍｉｃｓ、　ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓｓ　ロンドン、に記載されている。

他の重要な参照文献は、Ｊ−Ｂ　Ｌｅｐｅｃｑ及びＣ，Ｐａｏｌｅｔｔｉ（１９ ６７）。

Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２７．８７−１０６　；　Ｊ−Ｂ　Ｌｅｐｅｅｑ、 　Ｍ、　ＬｅＢｒｅｔ。

Ｊ、　Ｂａｒｋｅｔ、及びＢ、　Ｒｏｑｕｅｓ　（１９７５）ｅ　Ｐｒｏｅ、Ｎ ａｔｌ。

Ｍ、　ＬｅＢｒｅｔ及びＯ，Ｃｈａｌｖｅｔ　（１９７７）、　Ｊ、　Ｍｏ１． ５ｔｒｕｃｔ。

５７１−５９４　；　Ｊ、　Ｍａｒｋｏｖｉｔｓ　Ｂ−Ｐ　Ｒｏｑｕｅｓ及びＪ −Ｂ　Ｌｅｐｅｃｑ（１９７９）、　Ａｎｄｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９４．２ ５９−２６４である。これらの色素に関する重要な因子は、二本鎖核酸間への色 素のインターカレーションの後のスペクトル特性の変化である。インターカレー ションの後、螢光の寿命が延され、螢光量子収率が増加し、そして螢光放射波長 の赤シフトが存在する。光学系の最適な選択によシ、インターカレートされた色 素からの螢光は、適当な放射フィルターを選択することによジインターカレート されていない色素から容易に識別され得る。螢光シグナルは二本鎖核酸の濃度に 直接比例する（色素が過剰濃度で存在する場合）。これは米国特許扁４，４２３ ，１５３．全細胞ＤＮＡの検出方法の基礎である。

これらの色素は多くの種〔例えば、ウシ胸腺ＤＮＡ、マウスファージＴ４、Ｅ、 コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、Ｐ、プルがリス（Ｐ、　ｖｕｌｇａｒｉｓ　）、Ｍ、 リゾデイクチリス（Ｍ。

Ｉｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ　）、ヒトＤＮＡ　、種々のＲＮＡ　、及びホモポ リヌクレオチド、例えばポリｄＡ：ポリｄＴ　、ポ！Ｊ　ｄＣ：ポＩＪ　ｄＧ　 （上記の参照文献から）〕からの二本鎖ＤＮＡと反応することが示されており、 そしてそれ故に普遍的に適用可能である。

ある種の色素（例えばアクリジンオレンジ）と二本鎖核酸との相互作用は他のイ ンターカレーター（例えばアクチノマイシンＤ）により阻害され得る。

これは米国特許Ａ４，２５７，７７４中に記載されている、核酸と反応する化合 物を検出するため試験系の基礎である。

インターカレーションが生ずるためには核酸は二本鎖でなければならないから１ 例えば低照射量又はある種の化学物質によシ惹起されるこの二本鎖の切断は、障 害剤に暴露されていない対照サンプルと比較する場合、低い螢光シグナルをもた らす場合がある。これは障害されたＤＮＡの検出のための方法としてのＥＰＡ　 ８２３００３７６．０１の基礎である。

これらの方法はいずれも、多くの核酸分子の混合物中の特定のヌクレオチド配列 の検出（これが本発明の主目的である）には適用され得ない。

ラベル化されたグローブを合成するための光化学的に活性化されたインターカレ ート化合物の使用はＥＰＡ　８４１０７６２４．３に記載されている。ここでは 、光化学的に活性なインターカレーターがヌクレオチドに連結され、そしてハイ ブリダイゼーションの後にグローブを検出するために螢光が使用されるか、又は ラベルトして検出されるべき他の物質、例えば酵素、アビノン−ビオチン、抗生 物質への架橋としてインターカレーターが使用される。しかしながら、この方法 は常用のハイツリダイゼーシ、ンアッセイ系に向けられておシ、そして導波管、 非分離／非洗浄／動的ハイブリダイゼーションアッセイとは関係なく、そして上 記従来技術の技法は、この発明の方法におけるようにその湯でのラベルではなく 、反応に先立つプローブの前−ラベル化を必要とする。

前記のように界面において二本鎖ＤＮＡを形成し、そしてその後で該二本鎖ＤＮ Ａを該鎖を架橋するインターカレーターによシラペルすることができることに注 目すべきである。これによれば、固定化された物質が特定のシグナルのロスを伴 わないで、しかし最小のパックグラウンドシグナルのために一層の感度の上昇を 伴って機能することが可能である。このことは、非常に高い感度を要求する用途 のために必要である。さらＫ、１種類よシ多くのグローブを使用することによシ 反応の連鎖を予想することができる。例えば、サンドインチハイツリダイゼーシ ョンのタイプＩ：　Ｍ、　ＲＡＤＫＩ等、　Ｇｅｎｅ　２１　（１９８３）、７ ７−８５　）であシ、この場合サンプルＤＮＡが固定化されたグローブ及び第二 の（又はよシ多数の）螢光的にラベルされた溶液中プローブと反応する。生ずる 複合体は、本発明の技法を用いて界面において測定され得る。

この様な系の利点は、多数の選択された用途に適合することができる“一般的” 固相プローブを使用し同時に特異的プローブを溶液中に加えることができ、こう して一連の固相プローブ−導波体を製造する必要性が減少することである。

従って、本発明は従来技術と比較して異シ、そして多数のユニークな特徴を有し 、この特徴によシ本発明の方法は臨床診断目的の分析を行うために非常に有用な ものとなシ、そしてこの特徴は今日の他のいずれの系にも存在しないものである 。これらの特徴は特Ｋ、定められた核酸配列を速度的測定方式において迅速に測 定できること；前−ラベル試薬が必要でないためこの発明に基くキット／装置系 が技術的に容易であること；固相を洗浄する必要がなくそしてハイブリダイズし たプローブをその場で検出すること；インターカレートした色素の増強された螢 光のため及び内部反射検出技法の使用のため鋭敏であること；並びに核酸プロー ブのため、及び内部反射を使用して薄い表面膜のみを検出し他の余分の物質を検 出しないため特異性が高いことである。

この分野での使用（例えば、臨床試験室、農業試薬室、食品技術、原料品質管理 等）のため、この発明によりキットが提供される。この様なキットは次の構成要 素、すなわち、サンプル採取装置（注射器、綿棒等）；単鎖核酸の脱蛋白質溶液 を得るためのサンプル調製装置を含んで成シ、そして該キットはさらにこの発明 の方法に従う核酸ノ・イブリダイゼーション系を含む。考慮される態様に依存し て、単−低一スルーグツト（ｓｉｎｇｌｅ　ｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　） 装置、大きな夢分析対象、多サンプル完全分析用品、手動式又は自動式等である 。いずれの場合にも、導波管は、内表面の部分にプローブ付着した核酸を有する 安価なディスポーサプルキュペット（例えば成形されたプラスチック）の部分で ある。すべての反応はキュベツト内で起こシ、そして光測定はキュベツトのコー トされた部分を用いる。よシ複雑な態様のためには、再使用可能な装置に結合し たプローブを有するのが適当であシ、この場合分析ユニットは一体部分として導 波体を有するプローセル型（第４Ｃ図を参照のこと）である。ＤＮＡの場合、ベ ースラインシグナルの測定、サンプル及び色素を注入した後の特異的結合シグナ ルの測定、次に二本鎖ＤＮＡの破壊及び次のサンプルの受け入れに備えるための 系の再平衡化を可能にするために、一連の溶液がセルに通される。デＳｆレック スＤＮＡの破壊は通常の化学的又は物理的手段によシ達成することができる。デ エグレックスＤＮＡを変性せしめる最も簡単な方法はサンプルをある温度で加熱 することであシ、この温度は相対塩基対濃度、ハイブリダイズした分子の長さ、 及び２本のアニールした鎖の“適合の良好さ”に依存する。従って、その温度に おいて２本の鎖が分離する平均変性温度（Ｔｍ）が存在する。このＴｍ温度値は 、第二のサンプルを用意する場合に鎖を分離するために使用され得るのみならず 、この発明の特徴を含む温度調整装置は多数の利点を有することができる。

塩基対配列とＴｍとの間の関係は合理的に正確に次の式： ％式％ によシ定義され、ここでＧ及びＣはグアニン及びシトシンの当量％濃度であシ、 そしてＸは緩衝液のイオン強度である。この式はある種のポリマー、例えばポリ エチレングリコールの存在下で変形されなければならないであろう。これはこの 様なポリマーの排除性のためである〔Ｍ、ＧＩＬＬＩＳ等、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２　（１９７０）　ｓ　 １４３−１５３を参照のこと〕。一般原則として、最大効率の核酸再ハイブリダ イゼーションは穏和に上昇した温度（〉３０℃）を含む反応条件下で起こシ、そ して相補的鏡開の最大反応速度はＴｒｎよシ約２５℃低い温度で起こる（　Ｊ、 　ＭＡＲＭＵＲ等、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３（１９６１）　、 　５８５−６００　］。従って、温度調節されたハイブリダイゼーション及び変 性を含む本発明の方法を達成するための装置は、前記の関係に従って適切な温度 を選択することＫよシ最大結合効率において運転するために容易に最適化するこ とができる。

温度調節のため目的は核酸の２本の鏡開の６適合の良好さ″に関連する。セル内 の温度勾配を用いることＫより、ハイブリダイズした分子を脱アニール及びモニ ターに動的Ｋかける場合にＴｍの正確な測定を行うことができる。適合の良好さ を伴うＴｍ変化が小さくなるに従って、適合が悪くなる（Ｒ，Ｂ。

ＷＡＬＬＡＣＡ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　６　（１９７９）　 、　３５４３−３５５７　：ｌ。従って、本発明の技法を含む装置はＴｍを正確 に測定し、サンプルＤＮＡについて観察されたＴｍを予測されたＴｍと比較し、 そして注目のＤＮＡ鎖の実際の適合の良好さを正確に決定することを可能にする 。これは、ある種の関連微生物について存在する部分的な塩基対相同性の検出又 は幾つかの遺伝的疾患に関連する単一点変異の検出において非常に重要である。

この発明が適用される、適合の良好さのチェックを含む池の技法は例えば次のも の：イオン強度変化［Ｂ、Ｊ、　ＭｃＡｒｔｈｙ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ 　Ｊｏｕｒｎａ１２　（１９６８）　、　３７−３８　］　；　＃ルＡ７ミド濃 度（”　Ｂ−Ｃ。

Ｍｅ　Ｃ０ＮＡＵＧＨＹ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８　（１９６８）　 、　３２８９−３２９５　］　；他のチャオトロビック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｉ ｃａｇｅｎｔ　）　、例えば過ヨウ素酸ナトリウム［Ｋ、ＨＡＭＡＧＵＣＨＩ等 、　Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ、堕（１９６２）　、　１３２９−１３３８］　；過塩素酸 ナトリウム、チオシアイ酸ナトリウム及びヨウ化カリウム［Ｄ、Ｒ，ＲＯＢＩＮ ＳＯＮ等＃　Ｊ、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｒｎ。

２４１　（１９６６）　、　４０３０−４０４２　］　；デキストランサルフェ 　−　ト　（Ｇ、Ｍ、ＷＡＨＬ　等　、Ｐｒｏｃ、　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔ、Ａ ｃａｄ。

Ｓｃ、　ＵＳＡ　７６　（１９７９）　、　３６８３−３６８７　）を包含する 。

最近、反応緩衝液中ある比率のポリエチレングリコ−ルを用いて十分なハイブリ ダイゼーション速度の増加が示された［　Ｒ，Ｍ、　ＡＭＡＳＩＮＯ等、　Ａｎ ｎａｌｓ　Ｂｉｏｅｂｅｍ。

１５２　（１９７６）　、　３０４−３０７１゜ハイブリダイゼーション緩衝液 のための最適条件も上記のことを考慮するであろう。

導波体表面（ガラス又はプラスチック）上に核酸（単鎖プローブ又はデュプレッ クス構造）を固定化するための反応において３つの主たる態様が可能である：ａ ）７’ロープ、すなわち既知ポリヌクレオチド配列の導波体への固定化及びこれ に続く該導波体上の“グローブ″と測定されるべきＤＮＡ分析対象との反応ｓ　 ｂ）　特別な結合配列を介してのハイブリダイゼーション生成物のプローゾ上へ の固定化；及びＣ）分析されるべきＤＮＡの混合物の導波体への固定化及び後者 と既知“プローブ″ＤＮＡとの反応。技法ａ）及びｂ）が本発明において特に重 要である。

ＤＮＡの基材上への固定化を達成するため、後者を核性にすることができる。す なわち、基材はその後求電子性核酸中心（電子不足部位、例えば活性されたカル ボン酸エステルのＣ＝０、又はリン酸エステル）と結合するであろう。基材はま た電子性にされ得、そして核性核酸（例えば、リン酸塩）を引き付ける。これは 第２図に示される代替法であり、この方法においてはデュプレックスＤＮＡは色 素のインターカレーションの後平らに横だわシ、但しプローブは１点（３′又は ５′末端）においてのみ共有結合によシ固定化される。なお、ただ１点での固定 は反応性を増強するであろう。鎖が自由に溶液中で屈曲し又はもとにもどること ができるからである。次に、導波体界面に平行した螢光複合体の配向が螢光中心 とエバネセンス曲成分との相互作用を増強しそして試験感度を増幅するであろう 。

一端のみでのプローブの結合には特別な化学的方法の開発が必要である。

未修飾ＤＮＡ　ヲセルロース又はアガロースに連結するだめの少数の技法が報告 されている。次の参照文献が示される：　Ｍ、Ｓ、　Ｐｏｏｎｉａｎ等、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌｏ　（１９７１）　４２４−２７　；　Ｐ、Ｔ、　Ｇｉ ｌｈａｍ　Ａｄｖ、　Ｅｘｐ。

−３１０；　Ｍ、Ｌ、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ。

６８　（１９７９）　、　２０６−２２０　；　Ｌ、Ｇ、　Ｍｏ５ｓ等、　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５６　（１９８１）　、　１２６５５−５８゜通常、求核性基又 は電子性基を担持する固体支持体について低い収率が報告されている請求電子性 固体支持体について強塩基性条件を用いて良好な結果が記載されている（上記Ｍ ｏ５ｓを参照のこと）。しかしながら、プレート上の感受性リンカ−については 幾つかの条件を用いることができない。ＤＮＡ７′ＭＡの修飾又は核酸の少なく とも活性化もまた、穏和な条件下で良好な収率を得るために必要である。

例えば、導波体表面が、反応性基、例えばアミノ、ＳＨ、ＮＣＳ　、　ＮＣＯ、 エポキシ、アジド、　ＣＨＯ、ハライド、カルゴキシ、エステル等を担持するト リヒドロキシ又はトリアルコキシシランによジシラン処理された。

３−アミノプロピル、３−チオヒドロキシアルキル、グリシドキシゾロビルを担 持するシラン化合物をシラン処理のために使用することができ、次にアミンとア リール又はアルキル−ジインチオシアネートとの反応がＮＣ８停止グラフトをも たらすであろう。次にポリリジンを遊離のＮＣ８に結合せしめて、導波体表面上 の核性アミノ基の数を増加することができる。

グローブＤＮＡが通常の技法によシ、例えばオリゴヌクレオチドの製造のために 適当な方法に従って合成された。このため、例えば、Ｓ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇ ｅ等＃　ＴｅｔｒａｂｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２２（１９８１）、　１８５ ９−１８６２　；　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　、　Ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ 　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｙｎｅｎ ｔｓ、　Ｈ，Ｇ、　５ａｓｕｅｒ及びＡ、　Ｌａｎｇ編集（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈ ｅｍｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、　ＦＲＧ　）（１９８１）ｙ７１−７９頁を参 照のこと。

１つの具体例において、約２５ヌクレオチドのオリゴ−（ｄＣ）−３’−メチル グルコシドが、過ヨウ素酸塩で酸化した後、シアノボロヒドリド溶液中アミノゾ ロピルシランにより６らかしめシラン処理されたガラスプレート上に固定化され た。

他の態様に従えば、ポリリゾヌクレオチドも同じ手順を用いて固定化することが できる。そして、ポリデオキシリボヌクレオチドは、ターミナルデオキシヌクレ オチジルトランスフェラーゼ及びリボヌクレオシドトリホスフェートを用いて、 その〔３′〕−末端へのりがヌクレオチドの付加によシ、酵素的に修飾すること ができる（　Ｒ，ＲＯＹＣＨＯＯＤＨＵＲＹ等、Ｍｅｔｈｏｄｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ　６５　（１９８０）、４３−６２　）　ｏ次に、前記の様にして、 過ヨウ素酸酸化及び還元的縮合がシラン処理された導波体表面上でのＤＮＡの効 果的な固定化を可能にする。

３′−末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチドの合成を行うこともできる。

すなわち、前記のようにして過ヨウ素酸塩によシ酸化されたオリゴ（ｄＣ）−３ ′−メチルグルコシド（２５−ｍａｒ）ｄ”クロマトグラフィーにより精製され 、そしてトリシン緩衝液中と１，６−ジアミツヘキサンと連結された。次に、生 成物はシアノボロヒドリドにより還元され、ＨＰＬＣによシ精製され、そしてイ ンチオシアネートでグラフトされた導波体ガラスプレート上に固定化された。

核酸のその５′−末端における修飾もまた、わずかに酸性の条件下でのイミダゾ ール又は類似体による活性化を含む技法を用いて達成された。この技法は、Ｂ、 Ｃ，Ｅ、　ＣＨＯ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉ′ｄＲｅｓ、　ｆＪ　（１９８３ ）、６５１３−２９；　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、ＵＳＡ　１９８２．９　６３−９　６ 　７の開示との類似性によシ適用された。これは、短い合成りＮＡ鎖及び長い制 限断片を固定化するために好結果に適用された。

要約すれば、オリゴヌクレオチド、例えば、調節された孔のガラス支持体上で固 相法により調製されたｄＣ（３０）がＡＴＰ及びＴ４オリゴヌクレオチドキナー ゼによりリン酸化され、反応経過はγ−（３２Ｐ）　ＡＴＰによりラベルされた １／１０アリコートによシモニターされた。リン酸化されたオリゴヌクレオチド がカルボジイミドの存在下でβ−イミダゾールによシ活性化され、次にこれは、 ｐＨ８，５においてアミノプロピルシランによジシラン処理された導波体の表面 に連結された。

デュプレックスＤＮＡもまた導波体上にコートされた。例えば、ファージλＤＮ Ａが適切なエンドヌクレアーゼによシ断片化され、そしてエタノール沈澱された 断片がイミダゾールにより活性化され、そしてカルボジイミドにより導波体プレ ート上にグラフトされたアミノプロピル残基上に連結された。この構成は、前記 の態様（ｂ）を用い、そしてさらにインターカレーター色素の添加後の光学的螢 光応答に関して本発明の実施可能性を証明するために行われた。この発明に従っ て実際の光測定を行うため、第４図に示される装置を主として用いた。使用した 導波管は平波ガラス又は射出成形されたプラスチック顕微鏡スライドであった。

入射角は鏡Ｍ１及びＭ２によシ調節された。分析されるべき溶液はフローセル３ ２にポンプ輸送され、そして界面で生じた螢光応答は直角（５３）において又は 導波体の出口（４０）において検出された。フィル５２が残シの放射波長をブロ ックした。検出器４０（又は５３）により生じたシグナルは次に電子要素４１〜 ４５において処理され、そして常用手段によシブイスプレーされた。

導波体茨面上のグローブＤＮＡの実際の表面密度を調節することによシ感度の変 化を試験するのに加えて、溶液中でのＤＮＡ検出の分野における従来技術の教示 から得られる他の感度増幅技法を行った。

例えば、本発明において、多数内部反応光法によシ得られるシグナルの大きさは エバネッセント波成分が得られる空間内の螢光発生部位の濃度に依存する。所与 のインターカレーター色素について、この応答はその空間内のデュプレックスＤ ＮＡの合計量の関数である（インターカレーション部位の線密度が一定に維持さ れることを当然に仮定する）。

しかしながら、存在するこのデュプレックスＤＮＡは相補的にアニールされた試 験ＤＮＡと会合したもとのグローブＤＮＡを含むバイブリドに限定されない。

先に形成されたデュプレックス構造を保完する手段が存在し、これらの手段には 例えば既存のポリヌクレオチドグローブ鎖の延長及び延長された配列に相補的な 単鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションが含まれ、他の経路はあらかじめ形成され た二本鎖バイブリドの添加である。

他の方法は、プローグとハイブリダイズした物質を含有する反応媒体に、試験Ｄ ＮＡすなわちグローブＤＮＡと相同でない試験ＤＮＡ配列の部分に対して相補的 なりＮＡを補充することである。この方法の結果は導波管界面の光探査される空 間内で螢光部位形成のために利用され得る塩基対の量を増加することである。

変法においては、利用可能な鎖長及び螢光部位濃度をさらに増加するであろう前 ハイブリダイズした形で補充ＤＮＡを与えることができる。交互に存在する相補 配列及び非−相補配列によるネットワーク形成によシ一層の増幅を行うことがで きる。

他の方法は前ラベルされた相補的ＤＮＡとして外的螢光部位を得ることであシ、 ラベル化はｐＩ’ｌ’ｌ＋のごとき螢光複合体によシ行われ、従って、前記のよ うに相互作用する補充ＤＮＡの合成のために螢光性ヌクレオチド置換が用いられ るが、これは注目の光領域内の全螢光を増加するであろう。

デュプレックスが導波体に結合される前にプローブが溶液中で分析対象ＤＮＡと 反応する前記の第二変法ｂ〕に関し、主たる利点はハイブリダイゼーションの速 度の上昇である。この場合、グローブは非ハイブリダイズ末端に付加されたその 固定化配列（例えば複合免疫対一方の成分）を有し、そして導波体は対応する結 合ツヤ−トナーによシコートされる。幾つかの可能性ある態様の例が上記の参照 文献に記載されておシ、そして下記の特定の場合が含まれる。

１）グローブ（３′）末端にポリヌクレオチドを付加し、そして導波体金相補的 ポリヌクレオチドでコートする。

１１）免疫的結合対の−（又は複数）成分をグローブにカップリングし、そして 導波体を免疫的結合パートナ−によシコートする（例えば、ビオチン−プローブ 、及び表面上の抗−ビオチン抗体〕。

１１１）天然の又は修飾された結合対の−（又は複数〕成分をグローブにカップ リングし、そしてその対応するパートナ−を導波体にカップリングする（例えば 、ビオチン−プローブ、及び表面上のアビゾン）。

今や、下記に示す実験の部において実施の詳細を記載する。

１、ＤＮＡの連結のための導波体表面の調製ａ）求核性部位の適用、例えばγ− アミノプロピルシランによるグラフト ガラス又はグラスチック成形顕微鏡のスライド形の導波体を洗浄溶液中で清浄に しく例えば、ガラスをＦ３Ｃ−ＣＯＯＨ中室温にて３０分間エツチングし）そし てアルゴンの下で３−アミノグロピルートリエトキシシランの２重量％）ルエン 溶液中に浸漬し、そしてアルゴンのもとて１００℃にて一装置いた。次に、プレ ートをメタノール及び水で逐次洗浄し、そして真空乾燥した。グラフト密度およ そ１０−１０〜１０−９モル／ｃｒｎ２であったが、さらに高くてもよい。

グラフトされたプレートを使用前アルゴンのもとてアセトン溶液中に貯蔵した。

ａ２）　γ−メルカグトグロピルシランによるグラフト 上記の方法音用いたが、しかし前記アミンシランの代りにγ−チオヒドロキシゾ ロピルートリエトキシシラン金用いた。グラフト密度はおよそ上記の通りであっ た。

ｂ）求核性部位の調製、例えばインチオシアネートによるグラフト 上記（、）のもとに得られたプレートを１．４−フェニレンジインチオシアネー トの５重量％乾燥ＤＭＦ溶液に２時間浸漬した。次に、プレートをＤＭＦ中で洗 浄し、エーテルで乾燥し、そしてアルゴンのもとで貯蔵した。

Ｃ）導波体上のアミン密度を増加するだめのポリリジンによる導波体のコーティ ング ｂ）に記載したようにしてインチオシアネート基によりグラフトされた導波体プ レートを０．１　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，６）中で３時間、過剰の１０ −３Ｍポリリジン溶液（Ｍｗ：４０００）と室温において反応せしめた。グレー トをメタノール及び水で洗浄し、これを乾燥し、そして使用前アルゴンのもとで 貯蔵した。

コーティング密度はおよそ５０ピコモルのりジン／ｃｒｎ２の導波体表面であっ た。

ｄ）導波体上正荷電基の調製 上記（、）又は（Ｃ）において得られたプレートを常法に従って臭化メチル又は 硫酸メチルによシ第四級化した。この第四級化反応には利用可能なアミノ基の約 １０〜４０％が関与した。別の方法として、導波体表面上への第四級アンモニウ ム化合物の結合は、表面を式（ＭｅＯ）３Ｓｉ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＲ５（式中、 Ｒは低級アルキル、例えばＭｅ又はＥｔである）のシランの水溶液で処理するこ とによっても行うことができる。この種のシランは商業的に入手可能でおる。

２、グラフトされた導波体に連結するための核酸の修飾 ａ）末端糖又はリボヌクレオシドによるオリゴヌクレオチドの３′−末端の修飾 −固定化されたメチルグルコシド基を担持するＣＰＧの合成 メチルα−グルコピラノシド（１，９４ｇ　、１０ｍｍｏｌ）を、ピリジン（２ ０ｒａｔ　）及びＤＭＦ　（３０ｍｌ）中対応する塩化物（４，２Ｆ　、　１１ ｍｍｏｌ　）を用いて、通常の手段によりジメトキシトリチル保護基（ＤＭＴ） でエステル化した。生ずるメチル６−０−ジメトキシトリチル−グルコシド（３ ，３！ｉ、６２％ンを、ジメチルアミノピリノン（イ）を含有するピリノン中で 無水コハク酸（１，８，９，３当量）と反応せしめ、そして生成物をシリカゲル 上でのフラッシュクロマトグラフィー（１％ピリジンを含むＣＨＣｔ５Δ４ｅＯ Ｈ８ｏ／２０　）により精製した。溶出液を溶出させた後、酸をピリジンに再度 溶解し、そして蒸発せしめることにより残留メタノールを除去した。収量２．５ ｇ。サクシニル化糖を、ピリジン（１，５ｍＡ！　）　ＤＣＣ（０，８８１１， ４ｍｍｏｌ）及びｐ−−”トロフェノール（０，５６Ｊｉ’　、　４ｍｍｏｌ） を含有するジオキサン（１２ｍ／）中に溶解し、そしてこの溶液を室温にて２時 間振とうした。ジシクロヘキシル尿素を戸去し、そしてこの溶液を直接用いて、 調節された孔のガラス（ＣＰＧ）ビーズ［ＣＰＧ／長鎖アルキルアミン（ＬＣＡ Ａ）　：孔直径５００オングストローム；名柄、Ｐｉｅｒｃｅ社製２４８７５　 ］にカップリングせしめた。ＣＰＧ　（５１）を迅速にジインプロピルエチルア ミンの溶液（エーテル中５％）により洗浄し、そして乾燥ＤＭＦ　（’３０　ｍ ｌ　）中に懸濁した。ｐ−二トロフェニルサクシニル化糖誘導体を加え、そして 懸濁液をゆっくり攪拌しながら室温に置いた。

＋１ＶＦで洗浄した後、残留する遊離アミン及びヒドロキシ基を、ジメチルアミ ノピリジン（１％）を含有するピリジン（７ゴ）中無水酢酸（１ゴ）によシキャ ップした。洗浄（Ｄ■゛）シた後、ＣＰＧビーズを、ＤＣＣ（０，６Ｆ　）及び ｐ−ニトロフェノール（０，４Ｎ）を含有する乾燥ピリジン（１０ｍＡ’）中に 再懸濁し、そして６時間ゆっくりと振とうした。次にモルホリン（０，４ｍＡり １加え、そして懸濁液をさらに１５分分間上うした。

洗浄及び乾燥の後、固体支持体をトリチル陽イオンについてアッセイした。ＣＰ Ｇグラム当り１９μｍｏｌの糖が固定化された。

（３′）−修飾末端を担持するオリゴヌクレオチドの化学合成 ＣＰＧ　（５３１１１ｆ　：糖１　ｐ　ｍｏｌ　）を、マクロポーラスポリエチ レンフィルターが当てられた２、　５　ｍｌガラスシリンジの底に入れ、そして Ｓ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ等、Ｔｅｔｒａｈ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１９８２ 　ｍ　２２　ｙ　１８５９によシ開示されたホスホラミダイト法を用いてこの装 置中でオリゴヌクレオチドを合成した。

その中にＣＰＧを包む開放シリンジを試験管上に置き、そして（５′）−末端脱 保護が完成するまでジクロロ酢酸（２％〕ですすいだ。アセトニトリル及びＤＭ Ｆによシ逐次洗浄した後、シリンジを組立て、そして固体支持体を、シリンジに 適合された針を用いてセプタームを通して乾燥アセトニトリルを吸引して３回次 々と洗浄することにより乾燥した。次に。

ＣＰＧを乾燥アセトニトリル（１ｍｌ）中に懸濁し、そしてデオキシシトシンヌ クレオチドホスホラミダイ）（１６ｑ：２０当量）を含む１．５　ｍｌプラスチ ック二ツインドルフチューブに圧しもどした。次に、この溶解した組立ブロック を、テトラゾール（１４＃：２００当量）を含有する他の１．５　ｍｌプラスチ ックエッペンドルフチューブに圧しもどした。最後に、溶解した活性化されたホ スホラミダイトをシリンジ中に吸引した。そして、シリンジを機械的回転板上で の回転のもとに３分間型いた。２，６−ルチジンで洗浄した後、未反応種を、Ｔ ＨＦ中無水酢酸（５％）。

ルチジン（２０％〕及びジメチルアミノピリジン（１０チ）の溶液（１ｍ／）に よシキャッグした。

次に、シリンジのプラグを除去し、そして残シのすべての酸化、洗浄及び酸処理 段階を、真空エルレンマイヤーフラスコを覆うセプタム中にではなく針上に置か れた開放シリンジを用いて行った。

ヨウ素（１，７，９）を含有するヨウ素溶液Ｃ２１！Ｌｌ）、ＴＨＦ　（４０ｍ ｌ　）、２，６−＃チジｙ（２０１Ｊ）をハＬ／ル中に加えた。３５〜４５秒の 後、ＣＰＧをアセトニトリル及びジクロロメタンによシ洗浄した。ジクロロ酢酸 （２％）による新たな処理の後、新たな組立ブロックを新たに添加するために固 体支持体を準備した。

上記の方法を用いてメチルグルコシド−及びヌクレオシド誘導体化された支持体 を用いてオリゴヌクレオチドを調製した。各サイクルにおいて、２０倍過剰の所 望のヌクレオシドホスホラミダイトを使用し、そして必会な回数だけサイクルを 反復した。なお、これらの合成段階は遺伝子機械を用いて行うこともできる。

開放及び脱保護はＭ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ＋　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＥ ｎｚｙｍａｔｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｏｎｅ　Ｆｒａｇｍ＠ｎｔｓ ＋　ＧＡＳＳＥＲ＆　ＬＡＮＧＩ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ＋　Ｗｅｉｎｈ ｅｉｍ　ｔ　ＢＲＤ＋　７１−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　 Ｍ、Ｊ、　ＧＡＩＴ編集、ＩＲＬゾレス、オックスフォード、３５−８１頁（１ ９８４）に記載されているようにして行った。

オリゴ−ｄ（Ｃ）の（３′）酵素修飾 保護されたｄ（Ｃ）誘導体化ＣＰＧから出発してオリゴｄ（Ｃ）−ｍａｒを調製 し、そして完全な脱保護の後、グル電気泳動（２０チ尿累グル）及び逆相Ｃ−Ｓ カラム（２５ｃｍ　）上での）（ＰＬＯによシ精製した。

最終容量２００μを中オリゴｄ（Ｃ）（４０μｇ）、ｌｏｘ移行緩衝液（２０μ ｔ）、ｒＣＴＰ　（２ｎ　ｍｏｌ　）及びターミナルトランスフェラーゼ（４０ ユニツ）　）　ｔ　３７℃にて６時間インキュベートした。ＥＤＴＡ処理（０， ５Ｍ；２０μｍ）及び常法通りフェノール／クロロホルムによる抽出の後、得ら れる核酸をセファデックスＧ−５０カラム（ファルマシア・ファイン・ケミカル ス）を通して脱塩し、そしてＵＶ吸収によシ検出した（溶剤：　１　ｍＭ　）リ シン緩衝液）。

オリ：７−　ａ（ｃ）−（３’）−メチルグルコシド又はオリゴｄ（ｃ）−（３ ’）−オリゴｒＣの過ヨウ素酸酸化オリゴｄ（Ｃ）−（３′）メチルグルコシド （２５−ｍａｒ　）（１０μｇ　／　１００μｔ）、又は（３′）−末端におい てシチジル化されたオリゴｄ（Ｃ）　（３０−ｍａｒ　）　（１０μｇ７１００ μｔ）ｋメタ過ヨウ素酸ナトリウム（１チ溶液：１μｔ）と４℃にて反応せしめ た。３０分後、ＮａＣｔ（４Ｍ；ＺｏｏμＬ　）　、　Ｎ！ＬＨＰＯ４（０，５ Ｍ　；　１００μｔ）及びグリセリン（１チ溶液；１０μｔ）を加えた。さらに ４℃にて３０分間インキュベートした後、溶液を凍結乾燥し、そして前に記載し たようにして残渣をセファデックスＧ−５０カラムを通して脱塩した。

最後に、核酸溶液を１ｍ７！に調整した。

アミノプロピルガラスプレート上へのオリゴｄ（Ｃ）の固定化 アミノプロピル−誘導体化ガラスプレートを、トリシン緩衝液（ｐＨ７，０）中 通ヨウ素酸酸化されたオリゴヌクレオチド溶液（５００μｔ　：　３−５μｇ） で覆った。これを、時々振とうしながら３時装置いた。

次に、シアノポロヒドリド（１％溶液、１μｔ）揉加し、そして反応物をさらに ２時装置いた。水で十分に洗浄した後、使用するまでプレートをアルゴンのもと ４℃にて保持した。

上記の技法をオリゴｄ　（Ａ）でコートされた導波管の調製のためにも用いた。

その（３′）−末端に核性アミンを担持するヌクレオチドの固定化 酸化されたオリゴｄ（Ｃ）−（３’）−メチルグルコシド（２５−ｍａｒ　）　 （約１０μｇ）を通常通シ脱塩し、そして溶液の半分全１，６−ジアミツヘキサ ン（１％溶液；１μｔ）と、室温にて２時間、トリジ／緩衝液（０，１Ｍ　；ｐ Ｈ７，０）中で反応せしめた。次に、シアノゴロヒドリド（１チ溶液；１μｔ） を加え、そして室温にてさらに２時間置いた後、生ずる化合物を酢酸アンモニウ ム緩衝液（０，１Ｍ　；ｐＨ５，５）中Ｃ−８カラム上でのＨ，Ｐ、Ｌ、Ｃによ り精製した。イソチオシアネート−誘導体化ガラスプレート上への固定化を硼酸 緩衝液（０，１Ｍ　；ｐＨ９，５）中で室温にて２時間行った。

ｂ）核酸の（５′）−末端修飾 可溶性ＤＣＣ及び請求核性”固体支持体の存在下での（５’）　−１Ｊン酸化核 酸の直接縮合は通常貧弱である。

しかしながら、Ｃｈｕ　Ｂ、Ｃ，Ｆ、及びＯｒｇｅｌ　Ｌ、Ｅ、　、　Ｐ、Ｎ、 Ａ、５１９８５．８２．９６３−６７　；及びＣｈｕ　Ｂ、Ｃ，Ｆ、　、　Ｗａ ｈｌＧ、Ｍ、　＋　Ｏｒｇｅｌ　Ｌ、Ｅ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｔｄｓ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　１９８Ｌ１１．６５１３−２９によシ報告されているように、 声約６におけるイミダゾール又は類似体による活性化によシ、縮合はよシ効率的 であシ且つ特異的であることが示された。

この方法を、短い合成りＮＡ鎖及び長い制限断片の固定化に用いた。

合成オリゴｄ（ｃ）（３０−ｍａｒ　）のその（５′）−末端における活性化及 び固定化 オリゴｄ（Ｃ）（３０−ｍａｒ）（４０μｇ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ （１０ユニツト）によシキナーゼ緩衝液中３７℃にて２時間ＡＴＰの存在下でリ ン酸化した。

γ（”Ｐ）　−ＡＴＰを用いて１／１０アリコートにおいてリン酸化を追跡した 。処理及び凍結乾燥の後、オリゴヌクレオチドをセファデックスＧ−５０カラム を通して脱塩した。

約４μＩを、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノグロビル）−カルボジイ ミド塩酸塩（可溶性Ｄｅｃ）（０，１Ｍ）を含有するイミダゾール−ＨＣｔ緩衝 液（０，１Ｍ；ｐＨ６，１）３００μを中に溶解した。そして、溶液を時々振と うしながら室温にて３時間置いた。

活性化されたヌクレオチドを、酢酸トリエチルアンモニウム（０，１Ｍ、ｐＨ７ ，０）／アセトニトリルのグラジェントを用いる逆相ＨＰＬＣによシ精製した。

次にこれを１０チルチジン／水溶液中６０℃にてｐＨ８，５にて４分間、導波体 グレートと反応せしめた。次に、プレートを十分に洗浄し、そして使用するまで ４℃にて貯蔵した。

Ｃ）単鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡの固定化λＤＮＡ　（５０μを中３μｇ）を低 塩緩衝液中制限酵素ＨｐａＩ［によシ３７℃にて２時間処理した。通常の処理の 後、ＤＮＡをエタノール沈澱せしめ、そして可溶性ＤＣＣ（０，１Ｍ　）及びＮ ａＣｔ（０，５Ｍ）を含有するイミダゾール緩衝液（３００μｔ、ｐＨ６，２） に溶解した。

溶液を時々振とうしながら室温にて２時間置いた。

エーテル中ジイソグロピルエチルアミン（５％）によυあらかじめ洗浄された活 性化されたアミノプロピルガラスプレートに、ＮａＣ６（４Ｍ　）を含有するク エン酸緩衝液（０，２Ｍ、３００μｔ、ｐＨ８，４）を加えた。活性化されたＤ ＮＡをグレート上に添加し、そして混合し、そして４０℃にて０．５時間置いた 。ＮａＣｔ（２Ｍ）で洗浄した後、プレートをアルゴンのもと４℃にて密閉雰囲 気中に置いた。

別の方法として、単鎖ＤＮＡをＮａＣ１の非存在下で７０℃にて４分間加熱する ことによシガラスプレートに連結した。消化されたλＤＮＡの新たな溶液を１０ ０℃にて３分間加熱することによシ変性し、そしてＮａＣｔ溶液（４Ｍ；３００ μｔ）によシ覆われたプレートに加え、そして８０℃にて３分間保持した。

次に、溶液を徐々に冷却し、これによりノ・イブリダイゼーションが起った。

ｄ）　４種類のｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用い るフィルイン技法による長いハイブリダイズした核酸にそっての固定化されたグ ローブの延長 ｐＢＲ−３２２の非コード鎖の合成４５−　ｍａｒ　（ヌクレオチド４３８７１ −３９１６　）を２（ｂ）に記載したようにして導波管上に固定した。

ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＪ消化物を１００℃にて３分間２００ｐｌの緩衝液Ｂ　 （４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐＨ７，５、２０ｍＭＭｇＣ１２中で変性した 。急に冷却した後、Ｉ　Ｍ　ＮａＣｔ（２００μｔ）を添加し、そしてこの単鎖 ＤＮＡを導波管上にコートされたグローブに７１イプリダイズせしめた〔８０℃ にて５分間、室温に徐々に冷却（１５分間）〕。

ＮａＣ１（０，５Ｍ　）及びジチオスレイトール（１ｍＭ　）を含有する緩衝液 で洗浄した後、４０μｔのＮＴＰ　（３蔵の４種類すべてのデオキシリゾヌクレ オシドトリホスフェート）を、ＮａＣ２（０，５Ｍ　）及びジチオスレイトール （１ｎＭ　）を含有する４００μｔの緩衝液Ｂに室温にて加え、そして次に２０ ユニツトのＫｌｅｎｏｗ大断片を加えた。

ｅ）オリゴｄＣ−（３’）−末端を担持する第二グローブ並びに二本鎖の複合ネ ットワークを形成するだめのポリｄＧ及びポリｄＣの使用による１サンドイツチ ハイブリダイゼーシヨン”の例 シラスミドｐＢＲ３２２のＥｅｏＲｌ消化物（１μｇ）を１００℃にて５分間変 性し、そして（５′）リン酸末端において導波体に結合された合成４５−ｒｎｅ ｒ（非コード鎖のヌクレオチドＡ３８７１−３９１６）にノーイプリダイズせし めた。その−次構造がｐＢＲ３２２の非コ−ド鎖のヌクレオチド７ｆＩ７０−１ ００である第二オリゴヌクレオチド（０，５μ９）をその（３′）においてｄ　 ＣＴＰ　（５ｍＭ　）によシカコジル酸緩衝液（Ｍｅｔｈ、ｏｆＥｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ　Ａ　６５　、　ｐ　４３５による）中で延長した。

固定化された核酸への第ニゲローブのハイブリダイゼーションの後、ポＩＪｄＧ 及びポリｄＣを加えて二本鎖複合ネットワークを作った。

ｆ）ポリｄＣのデオキシシチジンがＮ’　−（６−アミノヘキシル）デオキシシ チジン（ａａｈａｃ）によシ置き換えられておシ、そしてＦＩＴＣと反応した“ サンドイッチ”ノ・イブリダイゼーション（前の例に類似する）の例 Ｉ　Ｍ　Ｎａ２Ｓ２Ｏ５／　Ｉ　Ｍ　１．６−ソアミノヘキサン／１０ｍＭハイ ドロキノン（Ｆ）１７．３）の新たに調製された溶液１　ｍｌ中ポリｄ　（Ｃ） 　（５Ａ　ユ＝　７ト；０．３−０．４ダ）を６０℃にて４日間加熱した。次に 、この溶液を１００ｍＭ硼酸緩衝液（ｐＨ９，０）に対して透析し、そしてセフ ァデックスＧ−５０カラムを通過させた。

この修飾された？リマーを硼酸緩衝液（ｐ）１９．０）中フルオレッセインイソ チオシアネートと反応せしめることによシフロロレッセイン化ポリ（ｄａｈｄＣ ）を調製し、これを前の例における場合と同様に、複合ネットワークを作るため にポリｄＧを用いる１サンドイツチ”ハイブリダイゼーションにおいて使用した 。

ｇ）溶液ハイブリダイゼーション及びこれに続く固定化（及び）・イブリダイズ した複合体の検出：次の項で開示される）の例 要約すれば、簡単な一般的配列、例えばポＩＪ−ｄＧを導波体に結合させる。分 析対象配列のヌクレオチド、例えば１〜５０に対して相補的な配列を担持する、 ポリ−ｄＧに類似する長さの隣接するポリ−ｄＣから成る第ニブローブを溶液中 で前記分析対象配列と前ハイブリダイズせしめ、次にこのノ・イブリダイズした シグナル発生デュゾレツクスを前記の結合した一般配列にノ・イブリダイズせし める。

実験的には、ｅ）において前記したように、その（３）においてｄＣＴＰにより 延されたｐＢＲ３２２の非コード鎖の７０−１００ｂｐの調製されたオリがヌク レオチド（０，５μＩ）を、プラスミドｐＢＲ３２２の熱変性されたＥｃｏＲＩ 消化物に５分間ノ・イブリダイズせしめた。次にこの溶液をポＩＪ　ｄＧでコー トされた導波体と反応せしめることによりすべてのプローブを固定化した。

プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションに先立って、試験配列の例えば５５ −２００ヌクレオチドに対して相補的な第三グローブ配列要素を添加することに よシ、上記の技法の感度をさらに増強することができる（試験配列が例えば２０ ０ｂｐを有する場合）・この追加の要素のハイブリダイゼーションは過剰のグロ ーブを用いて最適条件下で行われる。次に、この部分的バイブリドを、導波体に 結合したプローブにハイブリダイズせしめる。従って、バイブリドのシグナル発 生ポテンシャルが増強される。

３、　ＤＮＡ測定実験 使用した装置は第４Ａ図、第４Ｂ図及び第４Ｃ図に関連して前記したものである 。導波体３８は平らな射出成形されグラスチック顕微鏡スライドである。

フラッシュランプ３６からの光は注目の特定の波長を選択するためのモノクロメ ータ−３９を通して向けられる。導波体／液体界面における励起光の入射角は２ 個の鏡Ｍ１及びＭ２を用いて調節される。光は２個の半球石英プリズム４６及び ４７を用いて導波体に入れられそしてそれから出される。螢光は、導波体に対し て直角に検出器５４により検出されるか、又は導波体にトンネルパックされた螢 光が導波体の出口において、放射フィルター５２を通過する螢光を検出するため に配置された光電子増倍管を含む検出器によシ検出される。系はトンネルパック した螢光を集る方式で例示されるが、しかし第４Ａ図に示すようにフィルター／ 検出器を再配置することによシ直角の螢光を測定するように容易に調節される。

シグナルは４１において前増幅され、そしてマイクロプロセサーでコントロール されたフラッシュコントロール／データー獲得系１２−４５に入る。

次にデジタル化されたシグナルがフロッピー７”　イスク１５に貯蔵されるか、 又はハードコピー４４としてグリントされる。サンゾルはフローセル３７を用い て導入され、そして導波体表面と接触する体積はゴムガスケット５０により決定 される。サングルは注入容量及び流速を再現可能に調節する自動ピペット（例え ば、Ｍｉｅｒｏｌａｂ　Ｐ、ハミルトンインダストリーズ、パナダツ、ＣＨ）を 用いてセルに注入される。

一般に、グローブヌクレオチドは前の第２項に詳述した技法によシ導波体に連結 された。次Ｋ、第４Ｃ図に示されるようにグラフトされた導波体が光学装置中に 置かれ、そしてフローセルが上に置かれた。

次に、ハイブリダイゼーション緩衝液（ＮａＣｔＭ）がセル内に入れられ、そし て作動開始の後、ディスプレー上にベースラインが得られた。次に、セルに試験 溶液を加えることによシ特異的反応を行い、そして導波体出口において、又は導 波体の下方で螢光の変化によりモニターした。

２つの基礎的実験を行った。

ａ）エンドポイント（第５Ａ図） これは実際に試験の確実性を示すための対照実験、すなわち二本鎖ＤＮＡへのイ ンターカレーター色素の添加後の十分に強いシグナルの形成である。第一の変法 においては、２（Ｃ）項のもとで調製された、すなわち非変性λＤＮＡ断片でコ ートされた導波体が同じ緩衝液（ＮａＣ６Ｍ　；　１００μｇの色素／　ｍｌス トック溶液）中種々の量の臭化エチジウムにより処理された。１〜１００μｍ７ ７ｍ１のセル中濃度の臭化エチジウムにより有用な応答が得られた。当然に、応 答はまた導波体上のＤＮＡの密度に比例的であった。

第５Ａ図は、セル中臭化エチジウム濃度６０μｙ／ｌ１ｉｌに対して使用された ＤＮＡグローブがおよそ１０　〜１０−１μｍｏｌｅλＤＮＡ／α２ｆローブ表 面の密度をする場合の条件を示す。第５Ａ図において、線ＢはデュプレックスＤ ＮＡでコートされた導波体の存在下でのセルへの色素の添加から生ずる応答の増 加を示す。線Ａは同一の条件下であるが導波体上にＤＮＡが存在しない場合に得 られた対照を示す。線Ａのわずかなジャンプは溶液の内因性の螢光、及びインタ ーカレートされない色素からの小さい螢光シグナルに基く。

第二の変法においては単鎖ＤＮＡによシコートされた導波体が使用された。使用 されたグローブプレートは、２（Ｃ）項の手順に従って得られ、次に変性された ものであり且つλＤＮＡ由来の単鎖ＤＮＡを含有するものであった。次に、変性 されたＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液が添加された。この溶液は、２（Ｃ）項の第 −節に示したようにＨｐａＩ［エンドヌクレアーゼで処理した後にＤＮＡの混合 物を変性することによシ調製された。単鎖ＤＮＡが添加された後、）・イブリダ イゼーションが室温にて２０分分間性するように追跡され、この後第−の変法に おいて前記したように臭化エチジウム溶液が添加された。第５Ａ図線Ｂに典型的 に類似する応答が得られた。所定の量の臭化エチジウム試薬について、これは分 析対象サンプル中の相補的ＤＮＡに比例的であった。

第三の変法においては、ハイブリダイゼーションの後で二本螺旋ポリヌクレオチ ドを延長する効果を試験した。

このため、前記２（ｄ）項に言及される。この項の第−節の手順においては、ｐ ＢＲ３２２の消化変性物が合成ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズされ た。

このハイブリダイゼーション溶液に臭化エチジウムが添加されたとき、第５Ａ図 曲線Ｂによシ示される種類の応答曲線が得られた。

同様にして調製された導波体を室温にて１５分間、前記２（ｄ）項第二部に開示 される延長されたノ・イブリダイズした生成物を含有する溶液と接触せしめ、そ して次に０．５　Ｍ　ＮａＣ４水溶液中臭化エチジウムを添加し、第一のシグナ ルの約２倍の高さの応答曲線を得た。

第四の変法においては、固定化配列を含有するグローブオリゴヌクレオチドを造 成することによる、溶液ハイブリダイゼーション及び形成後のハイブリダイズし た複合体の検出を試験した。ここで、配列は反復する既知塩基のポリヌクレオチ ドであったが、これは同様に、その相補的結合部を介しての表面への複合体の固 定化を許容するがしかしグローブとのハイブリダイゼーション反応（例えば免疫 結合対、レクチンと糖、他の蛋白質とハプテン結合剤）を阻害しない反復するポ リマーであることができる。溶液ハイブリダイゼーション及びこれに続くハイブ リダイズした複合体の固定化及び検出を行うため、２（ｇ）項に概略記載した方 法に従い、次にＮａＣｔ水溶液（０，５Ｍ）中実化エチジウムを添加し、そして 螢光を測定した。このデーターは、第５Ａ図曲線Ｂに類似するがしかし高さを異 にする２つの応答曲線を示す。低い方の曲線である第一曲線は変性された標的Ｄ ＮＡ　ｐＢＲ３２２の不存在下で得られた応答であり、そしてこのシグナルは導 波体に固定されたポリｄＧへのアニーリングゾロ−ブーポリｄＣのみのノ〜イブ リダイゼーションに由来する。

高い方の曲線である他方の類似の曲線は標的ＤＮＡへのグローブのハイブリダイ ゼーション及び固定化反応の実施の後に得られたものであシ、これはハイブリダ イズしたグローブ／　ＰＢＲ３２２複合体の存在を示し、そしてプローブはその 相補的ＤＮＡとノーイプリダイズした後導波体の表面に結合したことを証明した 。従って、本発明の方法に従って溶液ハイブリダイゼーションを行うことができ そしてノ・イブリダイズした生成物を測定することができる。溶液ノ・イブリダ イゼーションは幾つかの場合、結果を得るスピードにおいて特別な利点を有する 。

ｂ）速度応答 この方法は、前記具体例３（ａ）の第二の変法と実質的に同じであるが、しかし 臭化エチジウム（セル中５０μｍ／／ｎｌ）を相補的ＤＮＡサンプルと同時に注 入した点て異る。結果を第５Ｂ図に示す。ここで、ベースラインＣは第５Ａ図の 線Ａと同じ意義を有する。

線りは、グローブ上のＤＮＡと分析対象中の相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼー ションの速度に比例する螢光の増加速度を示す。線りの高さは前記分析対象中の ＤＮＡの量に比例する。上記の結果は色素のインターカレーションがハイブリダ イゼーションの速度に関連しておよそ即座に進行することを示す。

一般的実験条件は次の通シである。

すべての場合、ハイブリダイゼーション緩衝液は蒸留水中１　ｍｏｌ　／　ｌ　 ＮａＣ６であった。色素との反応の前に行われたハイブリダイゼーションは１０ ０℃にて反応した。セル内で行われたハイブリダイゼーションは２２℃にて行わ れた。ハイブリダイゼーションのその場でのモニターに対する温度の詳細な効果 はまだ決定されていない。励起波長は３００　ｎｍに選択された。狭バンド−パ ス干渉フィルターがＰ、Ｍ上に置いて６００　ｎｍにおける螢光を測定した（タ イゾロ００８１０−２５，０ｒｔｅｌ　）。界面における励起光の入射角は、可 能な限り６６°において臨界角に近いように選択された。これは系の感度を最大 にするために非常に重要であることが見出された。なぜなら、この角度において 最多数の反射が存在しそしてそれ故に最大表面積が検知され、そして臨界角に近 い角度において表面における界強度が最強であシそれ故に表面反応をモニターす る機会が増加するからである。

臭化エチジウム（フル力・ケミカルス）の濃度は異ったが１〜１００μ７７／ｒ ｔｔｌの間で有用であることが見出された。

Ｃ）励起波長の効果 シグナルの検出に対する励起波長の効果を証明するため、表面に固定された二本 鎖ＤＮＡを有する導波体を光ペンチ中に置き、励起λをセル中の緩衝液を用いて 、そして反応後は臭化エチジウムを用いて、３００　ｎｍカラ６００　ｎｍまで スキャンニングした。

対照として、表面上にＤＮＡを有しない清浄な導波体を用いてこれを反復した。

４種類の波長、３ｏＯ２３６０，５００及び５５０　ｎｍの結果を任意単位によ シ次に示す。

λ　３００　３６０　５００　５５０ パツクグラウンド　２４　２６　１０　１１色素添添加後　５５５　７２　１０ １　９２比率　２３．１　２．８　１０．１　８．４　ＤＮＡ パックグラウンド　１８　２５　８　１２色素添加後　１８５　４０　３５　３ ０比率　１０．３　１．６　４．４　２．５上記の結果は、この特定の系に使用 するためＫは３００　ｎｍが最良のλであることを示す。これらの結果はまた、 ＤＮＡが表面に固定されている場合とＤＮＡが溶液中又はグル中に遊離している 場合とで、インタカレートした色素が類似の螢光特性を示すことを証明している 。

ｄ）二本鎖ＤＮＡ形成の速度的モニターポ！Ｊ−ｄＡが固定されているプレート 導波体を用いた（　２　（ａ）項での調製を参照のこと）。次に、導波体をフロ ーセルに固定し、そしてセル中の緩衝液にょシベースラインシグナルを得た。臭 化エチジウム及び０．２５Ｕ／ｍｌのポリ−ｄＴの両者を混合し、そして同時に フローセルに注入し、そして反応をモニターした。第６図線Ｆに結果を示す。臭 化エチジウムのみをセルに注入した場合の対照実験も示されるＣｍＥ）。これら の結果は、ＤＮＡの相補的鋼量の結合が、それが本発明を用いて起こる場合に、 モニターされ得ることを示している。さらに、モニター反応は効果的に即座であ う、そして二本鎖ＤＮＡ間の特異的インターカレーションのみが検出される。こ れもまた、臨床的及び診断的用途のためのＤＮＡゾロープ分析を行うための分析 機を製造するのに非常に有用である。

ポリ−ｄＣ及びポリ−ｄＧを用いて類似のデーターが見出されたが、しかしシグ ナルは一層強かった。多くのインターカレーション部位を与えるためにポリ−Ｃ ：ポリｄＧによシネットワークが形成される二本鎖複合体の形成と組み合わされ た“サンドイッチ”型ハイブリダイゼーションを用いる一般的有用性を証明する ために他の試験が行われた。２（ｅ）項に詳述された手原に従い、そして臭化エ チジウムの存在下でハイブリダイゼーションを行った。上記のように螢光によ多 速度を測定し、そして第６図に示されるのと類似の曲線が得られた。第一曲線（ 下方）は複合体形成の最終段階前に得られたシグナルを示す。

第二曲線（第６図Ｆに類似する）は２つのポリヌクレオチド（ポリｄＧ及びプリ ａＣ）を臭化エチジウムと混合しそして反応を動的にモニターするととＫよシ得 られた。これらのデータは、非−複合体形成に対するこの方法の上昇した感度を 示す。

第８図は、一連のダイアグラム（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）によシ、この発明によシ使 用される主たる分析方法を示す。これらのダイアグラムの目的は、この明細書に 記載した種々の簡単な要約を与えることである。

ダイヤグラムＡは、プローブポリヌクレオチド１０１がリンカ−１０２によシ導 波体の結合部位１０３に付着されている導波体１００を示す。このダイアグラム はまた分析対照ポリヌクレオチド１０４のセグメントを示し、その中央部分がプ ローブに対して相補的であシ、そして該プローブとハイブリダイズする。

ダイアグラムＢは、導波体１００に付加されたプローブ１０１とハイブリダイズ した１片のＤＮＡ　１０４の単鎖末端１０６が延長のために相補的塩基１０５に よシ満たされている場合［２（ｄ）項を参照のこと〕を示す。

ダイアグラムＣは、被験ＤＮＡ　１０４の遊離部分１０６に対して相補的なりＮ Ａ　１０７の逐次的補充を示し、この補充ＤＮＡ　１０７は他の配列１０８を担 持しており、後でＤＮＡ　１０９及び１１０によシさらに補充される。これらの 補充配列は合成ホモポリヌクレオチド（ポリーｄＡ、ポリーｄＴ、ポリ−ｄＣ， ポリ−ｄＧ　）であることができる。これは、２（ｅ）項の６サンドインチ“ハ イブリダイゼーション法を示す。

この延長はユニットプローブにより螢光部位の数を増加せしめそして感度を上昇 せしめる。番号１０９及び１１０によシ定義される配列は、不均一なものとして 示されているが、同一の又は異るヌクレオチドから成ることができ、条件は１０ ９の部分が１０８に対して相補的で６Ｃ、セして１１０の少なくとも部分が１０ ９の少なくとも一部分に対して相補的であることである。従って、例えば１０９ が全体としてポリ−ｄＣであシ、そして１１０が全体としてポリ−ｄＣであるこ とができよう。

なお、ダイアグラムＣＫよう示される態様の意味において、プローブＤＮＡは、 リンク１０２−１０３によシ導波体にすでに結合された相補的ＤＮＡとのハイブ リダイゼーションによシ導波管に付加される１片のＤＮＡから成ることができる 。

ダイアグラムＤは、プローブと被験ＤＮＡ　１０４との溶液ハイブリダイゼーシ ョン並びにそれに続く連結員１０２及び１０３を介しての導波体１００へのバイ ブリドの付加を示す。

本発明の測定技法は、螢光の変化のモニターに（すなわち、ハイブリダイゼーシ ョンが導波体の表面で起こる時、又は溶液）・イブリダイゼーションから生ずる デエプレックスが導波体に付着するとき）、及びエンドポイント測定（すなわち 、反応が完了した後、又は注目のハイブリダイズした生成物が導波体に付着した 後の導波体の出口における螢光の測定）に、同様に適用されることにも注目すべ きである。

この場合、出力シグナルは導波体がなお分析対象サンプル溶液に接触している間 に、又は導波体が該溶液から分離された後に測定され得る。シグナルを測定する 前にこの発明を実施する利点は、溶液の／？ラックラウンドノイズを減少し又は 除去することである。

Ｉ ＦＩＧ、　５Ａ ＦＩＧ、　５８ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　７ 国際調査報告 ＩＩＩ＋−１−−＾−−”−ＩＩ＃　ＰＣＴ／ＥＰ　８フ１００２３４ＡＮＮＥ Ｘ　Ｔｏ　’−ＨＥ　ｒＮＴＥ：’ｗＮＡｒ工０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨａ＝ｐｃ ａ＝　ＯＮ

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリヌクレオチドの液体分析対象サンプル混合物中に存在する１又は複数の 注目のポリヌクレオチド配列を特徴付ける核酸（ａ）を測定する方法てあって、 該方法は ｉ）前記サンプルを反応媒体中て前記注目の配列に対するポリヌクレオチド対応 物を特徴付けるポリヌクレオチドプローブ（ｂ）と、該プローブに対する結合親 和性を有する固体支持体の存在下で接触せしめ、これによって二本鎖デュプレッ クス構造の形成を伴って（ａ）と（ｂ）との間のハイブリダイゼーションが生じ 、 ｉｉ）前記デュプレックスを特異的にラベルするように計画されたラベル化合物 を添加することにより該デュプレックスの鎖間にインターカレートせしめ、こう して該デュプレックスの形成を示す螢光性複合シグナル発生成分を得る、 ことを含んで成り、前記固体支持体が、段階ｉ）の前又は後において前記プロー ブがそれに結合され、そして内部反射する波シグナルを運ぶ導波体てあり、該シ グナルが前記結合した複合体とその表面において相互作用しそして螢光応答を生 成し、この応答が前記導波体の出口において測定され、こうして前記測定を代表 するデーターを得る、ことを特徴とする方法。
2. ２．前記プローブが段階ｉ）の前に前記導波体に連結され、該導波体の表面にお いてハイブリダイゼーションが生じ、そして螢光の増加が前記ハイブリダイゼー ションの速度、すなわちサンプル中の分析対象核酸の量を示す、請求の範囲第１ 項に記載の方法。
3. ３．プローブが導波体に結合する前に段階ｉ）が開始され、これによって螢光の 経時的増加が導波体へのデュプレックス構造の結合速度を示し、そして全エンド ポイント螢光がサンプル中の分析対象核酸の量に関連する、請求の範囲第１項に 記載の方法。
4. ４．前記導波体が直線状の透明な固体であり、該導波体のシグナル出力が該導波 体に対して直角に横から集められ、又は該導波体の一端又は両端において軸方向 に集められる、請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．前記導波体が、分析反応試験キュベットの壁を形成する光学的棒状体又は繊 維又はプレートである、請求の範囲第１項に記載の方法。
6. ６．前記導波体の出力シグナルが該界面に直角に横から集められ、放射された螢 光が前記界面と反対側の導波体の側方から検知される、請求の範囲第５項に記載 の方法。
7. ７．反射された波シグナルと前記螢光性複合体との前記相互作用が、主として、 導波体／分析対象界面から波長の分数だけ離れた範囲で起こり、これによって導 波体に連結された前記複合体により生成される螢光を分析対象のバルク内で起こ るそれから明瞭に識別することができる、請求の範囲第１項に記載の方法。
8. ８．核酸プローブが末端ヌクレオチドにより共有結合的に導波体に連結され、該 核酸のすべて又はほとんどの塩基がハイブリダイゼーションのために利用可能で ある、請求の範囲第２項に記載の方法。
9. ９．前記プローブヌクレオチドが前記導波体と平行関係に配列し、この方向性が 、該プローブオリゴヌクレオチドのリン酸成分に対する静電的親和性を有する部 位の前記導波体上での存在によりもたらされる、請求の範囲第８項に記載の方法 。
10. １０．前記部位が、正荷電基、例えば第四アンモニウム基の導波体表面上での存 在からもたらされる、請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．前記共有結合による付加が、−ＮＨ２，−ＯＨ，−ＳＨ，グリシドキシ， −ＮＣＯ等のごとき反応性基を担持する導波体トリアルコキシシラン上をまずグ ラフトし、そしてこの後でこれらの基又はその誘導体をプローブポリヌクレオチ ドのためのプローブとして用いることにより与えられる、請求の範囲第８項に記 載の方法。
12. １２．前記核酸プローブが約１０〜１０５ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオ チドから成る、請求の範囲第８項に記載の方法。
13. １３．前記共有結合による付加が、プローブヌクレオチドと、あらかじめ導波体 物質に導入された反応性基との反応により与えられる、請求の範囲第８項に記載 の方法。
14. １４．前記導波体が、成形されたディスポーサブルプラスチックキャベットの部 分又は全体である、請求の範囲第１項に記載の方法。
15. １５．前記導波体がポリカーボネート又はポリメチル−メタクリレートのごとき 高い光学的品質のプラスチックから成形されている、請求の範囲第１項に記載の 方法。
16. １６．螢光シグナルのモニターが、平衡において該螢光を測定することにより又 は反応の進行に従う螢光の変化の速度を測定することにより、あるいは両者によ り行われる、請求の範囲第１項に記載の方法。
17. １７．反応が制御された温度条件のもとで行われる、請求の範囲第１項に記載の 方法。
18. １８．温度が連続的に、直線的に、又は段階的勾配に従って変化する、請求の範 囲第１７項に記載の方法。
19. １９．測定された結果がコンピューター処理され、ハイブリダイズした生成物の 平均熱変性温度を得る、請求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．デキストランサルフェートポリマー、ポリエチレングリコール、ヨウ化ナ トリウム及び過塩素酸塩から選択される１又は複数のチャオトロピック剤又はポ リマーが反応媒体に添加される、請求の範囲第１項に記載の方法。
21. ２１．次の構成要素を含む、請求の範囲第１項の方法を実施するためのキット： −生物学的細胞材料のためのサンプル採取装置；−前記細胞材料からの選択され た核酸サンプルの鎖を抽出し、脱蛋白質しそして分離するためのサンプル調製装 置； −ヌクレオチドプローブを導入するキュベット−導波体； −該キュベット−導波体に前記調製されたサンプル及びインターカレート（ｉｎ ｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）色素を導入するための手段； −全反射シグナルを前記導波体に照射しそして時間をあわせそして前記サンプル 核酸とプローブとのハイブリダイゼーションの後に導波体表面において発生する 螢光をモニターするための光学装置；−モニターされた螢光を電気的に処理しそ して前記ハイブリダイゼーション反応を代表する読み取り可能な結果を表示する ためのシグナル処理装置及びディスプレー。
22. ２２．前記キュベット−導波体がディスポーサブルで安価な成形キュベット又は 再使用可能なフローセルである、請求の範囲第２１項に記載のキット。
23. ２３．励起シグナルにより光学的にプローブされる空間における利用可能な螢光 部位濃度を増加することにより注目の螢光シグナルを増幅することを含む、請求 の範囲第１項に記載の方法。
24. ２４．前記濃度の増加が、プローブ表面におけるハイブリダイゼーションからも たらされるデュプレックス構造の長さの延長により与えられる、請求の範囲第２ ３項に記載の方法。
25. ２５．前記長さの延長が、結合した被験ヌクレオチド中のまだハイブリダイズし ていない配列に対して相同な他の核酸配列を添加し、これによって連続的な他の 色素インターカレートー部位の提供を伴ってさらにアニールが起こる、請求の範 囲第２４項に記載の方法。
26. ２６．５′−リン酸連結ヌクレオチドプローブが、４種類のデオキシヌクレオシ ドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素（フィル−イン技法 ）、あるいは両者を用いて、ハイブリダイズされた鎖にそって延長される、請求 の範囲第１項に記載の方法。
27. ２７．前記プローブが、前記導波体に連結されているか又はその上にコートされ ている相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより導波体に結合する、請求 の範囲第１項に記載の方法。
28. ２８．プローブが結合対の一方のパートナーに連結され、そして該対の他方のパ ートナーが導波体表面に連結され、これによって導波体へのプローブの付着が結 合対の形成を介して進行する、請求の範囲第１項に記載の方法。
29. ２９．前記１つの第一のパートナーが抗原、人ブテン、ガリコシド、糖、ビオチ ン、アビジン及び他の結合性蛋白質から選択され、そして他のパートナーが該第 一のパートナーに対して相補的である、請求の範囲第２８項に記載の方法。
30. ３０．前記導波体が中空チューブであり、そして前記プローブがその内表面もし くは外表面又は両方に固定される、請求の範囲第１項に記載の方法。
31. ３１．前記測定が、ハイブリダイゼーション中に螢光をモニターすることにより 、又はハイブリダイゼーションが完了した後の螢光エンド−ポイントの測定によ り行われる、請求の範囲第１項に記載の方法。
32. ３２．螢光エンド−ポイント測定を含んで成り、該測定が液体分析対照溶液の存 在下又は非存在下で行われる、請求の範囲第３１項に記載の方法。