JP2003035709A - 色素を用いたｒｎａ検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 発光性化合物を用いて簡便かつ迅速にＲＮＡ
を高感度に検出する方法を提供する。 【解決手段】 溶液中、固体中、又は固相担体上などに
存在するＲＮＡを光学的に検出する方法であって、下記
の工程：(1)シアニン色素、オキソノール色素、及びキ
サンテン色素からなる群から選ばれ、２個以上のボロン
酸基を有する色素とＲＮＡとの複合体を得る工程；及び
(2)該複合体を光学的に検出する工程を含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＲＮＡの検出方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＲＮＡを検出することは、単に核酸の存
在を検出する意味の他に、遺伝子解析の観点から極めて
重要な意味を持っている。ハイブリダイゼーション法に
基づく遺伝子解析においては、プローブ核酸に対して標
的核酸を相互作用させ、配列の相補的な標的核酸を抽出
し、検出を行っている。この際に、通常は標的核酸に対
して検出可能な基によって標識し、ハイブリッドの存在
を検出することにより、標的核酸の有無、あるいは存在
量を解析している。

【０００３】発現解析を行うためには、一般に標的核酸
はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡの発現を解析することによ
って、各々の生体組織の発現遺伝子を調べることができ
る。しかし、生体から抽出したｍＲＮＡは標識されてい
ないため、そのまま検出することは困難であり、通常は
ｍＲＮＡに対する相補的な配列をＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と
してを酵素的に転写し、この際に蛍光色素や放射性同位
元素など適当な標識基を導入する方法がとられている。

【０００４】この際に、本来のｍＲＮＡの情報がそのま
まｃＤＮＡへと転写されず、ｍＲＮＡの存在の有無、量
などの情報がそのままｃＤＮＡへと反映されない場合が
多いという問題がある。こうしたことから、生体組織か
ら抽出したｍＲＮＡを標識せずに、直接的に検出するこ
とができれば、情報のロスがなく、極めて質の高い情報
を提供できることになり、臨床診断などへの応用を考え
るとその価値は大きい。

【０００５】一方、特開平１０−１７５７３号公報には
ボロン酸を有する蛍光性化合物が示されており、ここに
開示されている方法によれば、原理的にはこの化合物を
用いて直接的にＲＮＡの存在を検出する可能性があると
思われる。しかし、ここで述べられている蛍光性化合物
はＲＮＡの標識効率やＲＮＡ選択性、蛍光色素としての
機能（吸光係数、蛍光量子収率）が不十分であり、十分
な感度、定量性が得らないため、さらなる機能向上が求
められていた。また、蛍光色素を検出する際には、励起
波長と検出波長が測定機器に適合していることも必要で
あり、励起波長と発光波長の調節が容易であることも色
素の重要な特性である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、発光
性化合物を用いて簡便かつ迅速にＲＮＡを高感度に検出
する方法を提供することにある。また、本発明の別の課
題は、ＤＮＡとＲＮＡの２本鎖ハイブリッドを簡便かつ
高感度で検出可能にする方法を提供し、遺伝子発現解析
の情報をより質の高いものにすることである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、ボロン酸を２個以
上有するシアニン色素やキサンテン色素がＲＮＡに対し
て高い相互作用と選択性を有することを見出した。ボロ
ン酸と水酸基との相互作用は一般的に強いものではな
く、特に核酸誘導体が取り扱われる水溶液系では両者に
より形成される複合体は容易に解離する場合が多いこと
が知られているが、本発明者らは、ボロン酸を２個以上
有するシアニン色素、オキソノール色素、又は起算点色
素がＲＮＡに対して強く相互作用し、ＲＮＡを選択的に
安定な複合体を形成できることを見出した。本発明は上
記の知見を基にして完成されたものである。

【０００８】すなわち、本発明は、ＲＮＡを光学的に検
出する方法であって、下記の工程： (1)シアニン色素、オキソノール色素、及びキサンテン
色素からなる群から選ばれ、２個以上のボロン酸基を有
する色素とＲＮＡとの複合体を得る工程；及び(2)該複
合体を光学的に検出する工程を含む方法を提供するもの
である。

【０００９】本発明の好ましい態様によれば、ＲＮＡが
溶液中、固体中、又は固相担体上に存在する上記の方
法；ＲＮＡがＤＮＡと相補的に結合した２本鎖ハイブリ
ッド核酸である上記の方法；及びＲＮＡが固相担体上に
固定されたプローブＤＮＡに相補的に結合したＲＮＡで
ある上記の方法が提供される。

【００１０】別の観点からは、ＲＮＡを光学的に検出す
るために用いるための複合体であって、(a)ＲＮＡ、及
び(b) シアニン色素、オキソノール色素、及びキサンテ
ン色素からなる群から選ばれ、２個以上のボロン酸基を
有する色素を含む複合体が本発明により提供される。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の方法は、ＲＮＡを光学的
に検出する方法であって、下記の工程： (1)シアニン色素、オキソノール色素、及びキサンテン
色素からなる群から選ばれ、２個以上のボロン酸基を有
する色素とＲＮＡとの複合体を得る工程；及び(2)該複
合体を光学的に検出する工程を含むことを特徴としてい
る。

【００１２】本発明に用いられるシアニン色素、オキソ
ノール色素、及びキサンテン色素からなる群から選ばれ
る色素は、ＲＮＡと相互作用して複合体を形成可能なボ
ロン酸基を２個以上有していることが特徴である。これ
らの色素としては、可視光域のみでなく紫外域や近赤外
域に吸収を有するようなものも用いることができるが、
検出の容易さから可視光域及び／又は近赤外域に吸収を
有する色素が好ましく、可視光域に吸収を有する色素が
最も好ましい。微量なＲＮＡを検出するためには検出感
度が高いことが必要であり、この目的のために色素は蛍
光性であることが好ましい。

【００１３】シアニン色素、オキソノール色素、キサン
テン色素は励起波長と発光波長の調節が容易であるとい
う特徴を有しており、高い分子吸光係数及び高い蛍光量
子収率が得られる点でも好ましい色素である。なお、特
開平１０−１７５７３号公報に記載されているポルフィ
リン骨格を有する色素は光安定性が低く、検出光により
ブリーチされやすいという問題を有している。シアニン
色素、オキソノール色素、及びキサンテン色素が高い光
安定性を有していることも、これらが本発明の方法に有
利に使用される理由である。

【００１４】ボロン酸基を２個以上有する蛍光性色素の
具体例を示すが、本発明の方法に用いられる発光性化合
物の範囲はこれらの具体例に限定されることはない。

【００１５】

【化１】

【００１６】

【化２】

【００１７】

【化３】

【００１８】

【化４】

【００１９】ボロン酸を２個以上有する色素は既知の方
法で容易に合成することができる。例えば、カルボキシ
ル基を有する色素に対して、アミノ基を有するボロン酸
化合物を公知の方法で縮合する方法を一般的に用いるこ
とができる。また、カルボキシル基、メルカプト基、ア
ミノ基、フェノール性水酸基などの求核性基を有する色
素の場合には、置換活性な離脱基（ハロゲン原子やスル
ホニルオキシ基など）を有するボロン酸化合物を用いて
置換反応を行い、ボロン酸基を導入することができる。
また、シアニン色素など、合成原料段階に４級化反応を
含むものについては４級化の試薬としてボロン酸を有す
るハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、アルキ
ルスルホナートなどを用いて４級化することでボロン酸
基を導入できる。

【００２０】本発明の方法において、ＲＮＡは溶液中に
存在していてもよく、あるいは固体状態であってもよ
い。また、例えばＤＮＡチップやＤＮＡアレイと呼ばれ
る固相担体上に相補的結合により固定されている状態で
もよい。溶液の場合には、溶媒としては水または緩衝液
が好ましく、水の他に水と混和しうる溶媒を適宜混合し
て用いるのが好ましい。水と混和して用いる溶媒の例と
しては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、イソプロパノール、グリセリン、エチレングリコー
ル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジ
メチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、アセトニト
リル、スルホランなどが挙げられる。固体状態の場合に
は、検出対象となるＲＮＡは他の物質と混合状態であっ
てもよい。または、純粋な形のＲＮＡあるいは２種以上
のＲＮＡの混合物であってもよい。ＲＮＡとしては、全
体が天然型のＲＮＡである場合のほか、ＲＮＡをその一
部に含む核酸、非天然型のヌクレオチドを含むＲＮＡな
どはいずれも本発明の方法で検出対象物となる。また、
本発明の方法ではＲＮＡの断片も検出可能である。

【００２１】固相担体上にＲＮＡが固定されている場
合、該固相担体としては、例えば、ガラス、セメント、
陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、
ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフ
ェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメ
チルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、
多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、
多孔質活性炭、織捕物、不織布、減紙、短繊維、メンブ
レンフィルター等の多孔質物質などを拳げることができ
る。多孔質物質の細孔の大きさは、２〜１０００ｎｍの
範囲にあることが好ましく、２〜５００n mの範囲にあ
ることが特に好ましい。表面処理の容易さや電気化学的
方法による解析の容易さの観点から、固相担体の材質は
ガラス又はシリコンであることが特に好ましい。固相担
体の厚さは、１００〜２０００μｍの範囲にあることが
好ましい。

【００２２】また、固相担体はビーズ状になったものや
アクリルアミドゲルのようにゲル状のものであってもよ
い。また、ＲＮＡが単に固相担体上に物理的に密着され
ていてもよく、固相担体上から一部固相担体内に浸透し
た形態であってもよい。また、ＲＮＡが完全に固相担体
に浸透した形態であってもよく、共有結合で化学的に固
相担体に結合されていてもよい。さらに、検出対象物の
ＲＮＡが、該ＲＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ又は
ＰＮＡなどの核酸誘導体とハイブリッド（本明細書にお
いて相補的結合又はその結果物のことをハイブリッドと
いう場合がある）を形成して、該ハイブリッドを介して
固相担体に固定されていてもよい。ｍＲＮＡの発現解析
を行うなどＲＮＡの配列情報を得る目的には、このよう
にハイブリッドを形成したＲＮＡを検出するように設計
することが好ましい。

【００２３】ボロン酸を２個以上有する色素をＲＮＡと
相互作用させて複合体を形成させる方法としては、該色
素を溶液としてこれらの状態にあるＲＮＡと接触または
混合させる方法が好ましい。この操作の時期はハイブリ
ダイゼーション中であってもよく、又はハイブリダイゼ
ーションの後であってもよい。この際の溶媒としては水
と混和しうる溶媒が好ましく、該色素が水に溶解する場
合には水を用いてもよい。水と混和しうる溶媒の例とし
てはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロ
パノール、ジメチルホルムアミド、グリセリン、エチレ
ングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセト
アミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、スルホ
ランなどが好ましい。該色素溶液の好ましい濃度は目的
により異なるが、例えば１０^-3モル／リットル〜１０^-9
モル／リットルが好ましく、１０^-4モル／リットル〜１
０^-8モル／リットルがより好ましい。相互作用させる時
間は５秒から１８時間の間で選択することが好ましく、
１０秒から１２時間がより好ましく、迅速な測定を行う
意味から１０秒から３０分の間が好ましい。

【００２４】ハイブリダイゼーション終了後、あるいは
ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと該色素との
複合体を形成させた後に、界面活性剤と緩衝液との混合
溶液を用いて洗浄を行ってもよい。界面活性剤として
は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが
好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩
衝液、ホウ酸緩衝被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を
用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが
特に好ましい。なお、本明細書において用いられる「相
互作用」という用語については、上記色素及びＲＮＡが
イオン結合、水素結合、又は疎水結合などの共有結合よ
りも弱い結合を介して相互に結合状態にあることを意味
しており、「複合体」とはそのような結合状態にある上
記の２つの物質を含む構造体を意味する。

【００２５】本発明の方法における光学的な検出の手段
は特に限定されず、例えば、分光光度計、蛍光光度計、
スキャニング装置、蛍光スキャニング装置などを用いて
通常の方法により光学的な検出を行うことができる。本
明細書において用いられる「検出」という用語は、検出
対象物質の存在を証明するためのほか、検出対象物質の
定量などを含めて最も広義に解釈しなければならず、い
かなる意味においても限定的に解釈してはならない。光
学的な検出により得られた結果はコンピュータを用いた
演算処理を施して視覚化することもできる。

【００２６】本発明の方法をＤＮＡチップ又はＤＮＡア
レイを用いたＲＮＡの検出に用いる場合についてさらに
具体的に説明するが、本発明の方法は下記の説明の細部
に限定されることはない。ＤＮＡ断片としては、目的に
応じて二種類のプローブを適宜使い分けることができ
る。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用すること
が好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が
未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録
された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノム
のライブラリー、あるいは全ゲノムをテンプレートとし
てＰＣＲ法によって増幅して調製することができる。Ｐ
ＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用すること
ができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標
準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応す
る種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用する
ことが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４
ⁿ（ｎは塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成し
たものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配
列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が
決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２〜５
０量体であることが好ましく、１０〜２５量体であるこ
とが特に好ましい。

【００２７】ＤＮ酸断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。点着後のプローブ核酸断片の乾燥
を防ぐために、プローブ核酸断片を溶解又は分散させた
水性液中に高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物
質としては、プローブ核酸断片を溶解又は分散させた水
性液に溶解し得るものであって、試料核酸断片とのハイ
ブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性の大
きくない物質であることが好ましい。このような物質と
しては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルス
ルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げること
ができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミ
ド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウ
ム等を挙げることができ、該ポリマーの分子量は１０³
〜１０⁵の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質と
しては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用い
ることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特
に好ましい。高沸点の物質の濃度は、プローブ核酸断片
の水性液中、０．１〜２容量％の範囲にあることが好ま
しく、０．５〜１容量％の範囲にあることが特に好まし
い。また、同じ目的のために、プローブ核酸断片を点着
した後の固相担体を９０％以上の相対湿度および２５〜
５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。

【００２８】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理として、複数の種類を組み合わ
せて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理とを組み合わ
せて行うことが特に好ましい。点着後は、インキュベー
ションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点
着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。

【００２９】ＤＮＡ断片は、固相担体表面に対して、１
０²〜１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが好ましい。
プローブ核酸の量は、例えば１〜１０^-15モルの範囲で
あり、質量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。
点着によってプローブ核酸の水性液は固相担体表面にド
ットの形状で固定される。ドットの形状は、通常、ほと
んど円形であり、形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあるこ
とが好ましく、１００〜３００μｍの範囲にあることが
特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜
３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量
は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、
１〜１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。

【００３０】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップでは
数週間程度であり、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤ
ＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチ
ップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、
変異解析、多型解析等に利用される。

【００３１】多重情報を得る目的で本発明の検出方法と
他の標識方法を同時に行うことも可能である。標織方法
としては、ＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化
学発光法等）とが知られているが、蛍光法を用いること
が好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合
できるものであれば何れも用いることができるが、シア
ニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅ[登録商標]シリーズのＣ
ｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキ
シ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるい
はＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することが
できる。

【００３２】試料に含まれるＲＮＡ断片としては、その
配列や機能が未知であるＲＮＡ断片を用いることが好ま
しい。該ＲＮＡ断片は、遺伝子発現を調べる目的では真
核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好まし
い。試料がゲノムである場合には、赤血球を除く任意の
組織サンプルから単離することができる。赤血球を除く
任意の組織は、抹消血液りンパ球、皮膚、毛髪、精液等
であることが好ましい。核酸がｍＲＮＡである場合に
は、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出するこ
とが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要な
ｍＲＮＡの量は、液量や標識方法によって異なるが、数
μｇ以下であることが好ましい。ＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料中の核酸断
片を低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞
では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡ
を用いることが好ましい。

【００３３】試料核酸断片を溶解または分散させた水性
液を９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分
注し、ＤＮＡチップ上に点着することによってハイブリ
ダイゼーションを行うことが好ましい。点着の量は、１
〜１００ｎＬの範囲であることが好ましい。ハイブリダ
イゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で行うことが
でき、６〜２０時間程度で完了する。ハイブリダイゼー
ション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用い
て洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが
好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液として
は、クエン酸緩衝被、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝被、ト
リス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、
クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。

【００３４】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、核酸断片の使用量が非常に少ないことで
ある。そのため、固相担体に固定するプローブ核酸の鎖
長や標識した核酸断片の種類などに応じてハイブリダイ
ゼーションの最適条件を設定する必要があるが、その手
法は当業者に周知かつ慣用である。遺伝子発現の解析の
目的には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように長
時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーショ
ンを行うことが好ましい。

【００３５】

【実施例】本発明を実施例によりさらに具体的に説明す
るが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることは
ない。下記の実施例において、化合物番号は上記に好ま
しい化合物として示した化合物の番号に対応させてあ
る。 合成例１：化合物（３）の合成 化合物（３）は以下の合成スキームに従って合成した。

【化５】

【００３６】１−１．５，６−ジクロロ−２−メチル−
（１−（３−スルホプロピル））ベンズイミダゾール
（化合物（Ａ））の合成 １６ｇの５，６−ジクロロ−２−メチルベンズイミダゾ
ールにプロパンサルトン７．３ｍＬ、ジメチルホルムア
ミド１０ｍＬを加え、１５０℃で２時間反応した。冷却
後、酢酸エチルを加えて撹拌すると目的物が結晶として
得られた。結晶を濾取し、酢酸エチルで洗浄、乾燥を行
った。

【００３７】１−２．３−（５，６−ジクロロ−３−
（３−エトキシカルボニルプロピル）−２−メチルベン
ズイミダゾリウム−１−イル）プロパンスルホナート
（化合物（Ｂ））の合成 化合物（Ａ）３．２ｇに１０ｍＬの４−ブロモプタン酸
エチル、２ｍＬのトリエチルアミンを加え、１４０℃で
３時間反応を行った。冷却後、酢酸エチルを添加し、撹
拌とデカンテーションによる酢酸エチル可溶分の除去を
繰り返して、目的物結晶を得た。

【００３８】１−３．化合物（Ｃ）の合成 化合物（Ｂ）１ｇ、２０ｍＬの無水酢酸、４ｇのＮ，
Ｎ’−ジフェニルホルムアミジンを混合し、１５０℃で
３時間反応を行った。冷却後、酢酸エチルを加え、撹拌
とデカンテーションによる酢酸エチル可溶分の除去を繰
り返して、目的物を得た（ハルツ状）。

【００３９】１−４．化合物（Ｄ）の合成 １−３．で得た化合物（Ｃ）に０．６ｇの化合物（Ｂ）
を加え、１５ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した。
ついで、１ｍＬのトリエチルアミンを添加し、６０℃で
１時間反応した。反応液に１００ｍＬの酢酸エチルを加
えて、生成した沈殿をジクロロメタンとメタノールに溶
解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行
った。さらにセファデックスＬＨ−２０をクロマトグラ
フィー担体として用いて（メタノール溶出）２回精製を
行い、目的物１００ｍｇを得た。

【００４０】１−５．化合物（Ｅ）の合成 前項で得た色素５０ｍｇを１０ｍＬのメタノールに溶解
し、５ｍＬの１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて１晩
放置した。この後、溶媒を減圧下で留去し、セファデッ
クスＬＨ−２０をクロマトグラフィー担体として用いて
（メタノール溶出）２回精製を行い、目的物（化合物
（Ｅ））３３ｍｇを得た。

【００４１】１−６．化合物（３）の合成 化合物（Ｅ）１０ｍｇ、３−アミノフェニルボロン酸１
０ｍｇを２ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解し、０．
５ｍＬのトリエチルアミンを加えた後、１５ｍｇのベン
ゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミ
ノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを添加
し、室温で３時間反応した。反応混合物に酢酸を加えて
酸性とし、そのまま分取用液体クロマトグラフィーを用
いて分取した。目的物が主生成物として得られ、溶離液
を留去すると淡オレンジ色の粉末として得られた。

【００４２】合成例２．化合物（６）の合成 化合物（６）は以下の合成スキームに従って合成した。

【化６】

【００４３】２−１．２，３，３−トリメチル−３Ｈ−
ピロロ〔２，３−ｂ〕ピリジン（化合物（Ｆ）の合成 ２−ヒドラジノピリジン１０ｇに３−メチル−２−ブタ
ノン２０ｍＬを加え、８０℃で１時間加熱した。生成し
た水と過剰の３−メチル−２−ブタノンを減圧下にて留
去し、１ｇの塩化亜鉛を添加して２００℃で３時間加熱
した。この混合物を減圧蒸留し、さらにヘキサンから再
結晶して目的物を得た。

【００４４】２−２．４−ブロモメチルフェニルボロン
酸（化合物（Ｇ））の合成 １０ｇの４−メチルフェニルボロン酸を１５０ｍＬの酢
酸エチルと混合し、２０ｇのＮ−ブロモコハク酸イミド
を加え、白熱電灯で照射しながら５時間反応した。反応
終了後、冷却し、溶媒を減圧留去したのち、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーにて精製を行った。目的物は
原料とＲｆ値が近いため、ヘキサン／酢酸エチルで慎重
に分離を行った。目的物は無色粉末として得られた。収
量３ｇ

【００４５】２−３．臭化７−（４−ジヒドロキシボロ
ノベンジル）−２，３，３，−トリメチル−３Ｈ−ピロ
ロ〔２，３−ｂ〕ピリジニウム（化合物（Ｈ））の合成 ０．５ｇの化合物（Ｆ）に１ｇの化合物（Ｇ）、１ｍＬ
のスルホランを添加し、１２０℃で１時間反応した。冷
却後、酢酸エチルを加え、撹拌とデカンテーションによ
る酢酸エチル可溶分の除去を繰り返して、目的物を得た
（茶褐色ハルツ状）。

【００４６】２−４．化合物（６）の合成 前項で得た化合物（Ｈ）にピリジン５ｍＬ、酢酸１ｍ
Ｌ、トリエチルアミン１ｍＬと１ｍＬのオルトぎ酸エチ
ルを加え、１３０℃で３０分加熱した。冷却後、酢酸エ
チルを加え、析出した油状物をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーで精製した（クロロホルム／メタノールで
溶出）。収量５０ｍｇ

【００４７】実施例１：ＲＮＡとの相互作用の検出 ＲＮＡ（酵母由来）１ｍｇを１０ｍＬのトリス緩衝液
（ｐＨ７．４）に溶解し、溶液を作製しＷ液とした。一
方、ボロン酸色素（比較例１、化合物（１）、化合物
（６）、及び化合物（８））０．１ｍＭジメチルスルホ
キシド溶液をそれぞれ作製し、Ｙ−１、Ｙ−２、及びＹ
−３とした。Ｗ液とＹ液をそれぞれ１ｍＬと０．１ｍＬ
ずつ混合し、それぞれエタノール３ｍＬを加えて遠心操
作を行った。上清を除いたのちに沈殿を０．１ｍＬのト
リス緩衝液に溶解し、ガラススライド上に点着した。

【００４８】このガラススライドについて富士写真フイ
ルム株式会社製のＦＬＡ２０００を用いて蛍光観察を行
ったところ、本発明で用いられるボロン酸を２個以上有
する色素に由来する蛍光が観察された。同様の実験をＲ
ＮＡの代わりにＤＮＡを用いて行ったところ、ＲＮＡを
用いた場合よりも明らかに弱い蛍光が観測された。一
方、比較例１の化合物ではＲＮＡの方がＤＮＡよりも高
い蛍光強度を与える現象は観察されなかった。従って、
本発明の方法で用いる特定のボロン酸色素のみがＲＮＡ
に対して選択的に相互作用して強い蛍光を発することが
明らかである。

【００４９】

【化７】

【００５０】実施例２：ＤＮＡ及びＲＮＡハイブリッド
の検出 （１）ＤＮＡ断片固定スライドの作成 ２質量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を３質量％化合物ＶＳ−１
溶液に、１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄
後、１２０℃で１５分間乾燥して、ＶＳ−１被覆スライ
ド（Ｂ）を作成した。

【００５１】

【化８】 （２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 5'-未端がアミノ基で修飾されたＤＮＡ断片（配列表に
配列を示した）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に
分散して水性液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）を調製し、上
記実施例１で得たスライド（Ｂ）に点着した。直ちに、
点着後のスライドを６０℃、相対湿度９０％にて１時間
放置した後、１２０℃で２０分間加熱した。このスライ
ドを０．１質量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と
２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈し
た溶液、ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合
溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄し
た。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシ
ン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸
留水で洗浄し、室温で乾燥してＤＮＡ断片が固定された
スライド（Ｄ）を得た。

【００５２】このスライドに対して上記ＤＮＡ配列と相
補的な配列を有する６０m e rのＲＮＡ、及びボロン酸
色素（化合物（１）、化合物（６）、及び化合物（１
１））又は比較例２の化合物（各々０．１ｍＭを１μ
Ｌ）をハイブリダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣおよ
び１０質量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散
させたものを、上記で得たスライド（Ｄ）に付与した。
このスライドの表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した
後、モイスチャンバー内にて６０℃で１０時間インキュ
ベートした。次いで、このスライドを０．１質量％ＳＤ
Ｓと２×ＳＳＣとの混合溶液で洗浄した後、６００ｒｐ
ｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライドガラス
表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したとこ
ろ、比較例２の化合物を用いた場合には蛍光スポットが
観察されなかったのに対し、２個のボロン酸基を有する
上記色素を用いた場合には、ＤＮＡ断片をスポットした
部分のみに蛍光が観察された。

【００５３】

【化９】

【００５４】

【発明の効果】本発明の方法によれば、ＲＮＡを高感度
に検出でき、例えば、遺伝子診断等で用いられる核酸の
２本鎖ハイブリッドを標的核酸の長さに依存せずに定量
的かつ高感度に検出できる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co. Ltd. <120> Method for detecting RNA by using a dye <130> A11321M <160> 1 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <400> 1 gctgctgctg ggccagtggt tcctccatgt ccggggagga tcagacactt caaggtctag 60

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ＺＮＡ Ａ Ｆターム(参考） 2G045 BB14 BB29 BB48 BB51 DA13 DA14 FB02 FB11 FB12 GC15 2G054 AA06 CA22 CE02 EA03 GB02 4B024 AA11 CA01 CA11 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ52 QR32 QR35 QR56 QR66 QR82 QS34 QX02

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＲＮＡを光学的に検出する方法であっ
   て、下記の工程： (1)シアニン色素、オキソノール色素、及びキサンテン
   色素からなる群から選ばれ、２個以上のボロン酸基を有
   する色素とＲＮＡとの複合体を得る工程；及び(2)該複
   合体を光学的に検出する工程を含む方法。
2. 【請求項２】 ＲＮＡが溶液中、固体中、又は固相担体
   上に存在する請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ＲＮＡがＤＮＡと相補的に結合した２本
   鎖ハイブリッド核酸である請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 ＲＮＡが固相担体上に固定されたプロー
   ブＤＮＡに相補的に結合したＲＮＡである請求項３に記
   載の方法。