JP2003035708A - 発光性化合物を用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 発光性化合物を用いて簡便かつ迅速に核酸な
どの微量成分を高感度に検出する方法を提供する。 【解決手段】 核酸などの検出対象物を光学的に検出す
る方法であって、下記の工程：(1)検出対象物と２０個
以上の水酸基を有する化合物との結合物を得る工程；
(2)上記工程(1)で得られた結合物と２個以上のボロン酸
基を有するシアニン色素、オキソノール色素、又はキサ
ンテン色素などの発光性化合物との複合体を得る工程；
及び(3)該複合体を光学的に検出する工程を含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微量生体成分の検
出あるいは遺伝子解析等に有用な増幅的検出方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】核酸を高感度で検出することは、遺伝子
解析の観点から極めて重要な意味を持っている。ハイブ
リダイゼーション法に基づく遺伝子解析においては、プ
ローブ核酸に対して標的核酸を相互作用させ、配列の相
補的な標的核酸を抽出し、検出を行っている。この際
に、通常は標的核酸に対して検出可能な基によって標識
し、ハイブリッドの存在を検出することにより、標的核
酸の有無、あるいは存在量を解析している。しかし、こ
の方法は一般に標識色素の導入率が標的核酸の長さ（塩
基対数）に依存するため、標的核酸の長さが既知の場合
以外は正確な量を求めることは困難である。

【０００３】また、発現解析を行うためには、一般に標
的核酸はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡの発現を解析するこ
とによって、各々の生体組織の発現遺伝子を調べること
ができる。しかし、生体から抽出したｍＲＮＡは標識さ
れていないため、そのまま検出することは困難であり、
通常はｍＲＮＡに対する相補的な配列をＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）としてを酵素的に転写し、この際に蛍光色素や放射
性同位元素など適当な標識基を導入する方法がとられて
いる。

【０００４】この際に、本来のｍＲＮＡの情報がそのま
まｃＤＮＡへと転写されず、ｍＲＮＡの存在の有無、量
などの情報がそのままｃＤＮＡへと反映されない場合が
多いという問題がある。こうしたことから、生体組織か
ら抽出したｍＲＮＡを標識せずに、直接的に検出するこ
とができれば、情報のロスがなく、極めて質の高い情報
を提供できることになり、臨床診断などへの応用を考え
るとその価値は大きい。

【０００５】核酸の量は採取可能な試料生体組織の量に
依存するため、微量の生体組織しか採取できない場合に
は検出の感度は高いことが望まれ、また、その感度が標
的核酸の長さに依存しないことが正確な遺伝子の量を測
定することになるため、標的核酸の長さに依存せず、高
感度で検出する技術が求められていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明の課題は、発光性化合物を用いて簡便か
つ迅速に微量成分を増幅的に高感度に検出する方法を提
供することにある。本発明者らは上記の課題を解決すべ
く鋭意研究を行った結果、ボロン酸を２個以上有するシ
アニン色素やキサンテン色素がポリオール化合物（本明
細書において、水酸基を多数有する化合物を「ポリオー
ル化合物」と呼ぶ。）に対して高い相互作用を発揮する
ことを発見した。ボロン酸と水酸基との相互作用は一般
的に強いものではなく、特に核酸誘導体が取り扱われる
水溶液系では両者により形成される複合体は容易に解離
する場合が多いことが知られているが、本発明者らは、
ボロン酸を２個以上有する化合物がポリオール化合物に
対して強く相互作用し、安定な複合体を形成できること
を見出した。

【０００７】本発明者らは上記の知見に基づいてさらに
研究を行ない、検出対象に特定のポリオール化合物を結
合し、さらにこのポリオール部分に対してボロン酸基を
２個以上有する発光性化合物を相互作用させ、両者の安
定な複合体を形成させることによって検出対象を発光性
化合物で標識できることを見出した。また、その結果、
極めて簡便かつ迅速に検出対象を増幅的に検出できるこ
とを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成さ
れたものである。

【０００８】すなわち、本発明は、検出対象物を光学的
に検出する方法であって、下記の工程： (1)検出対象物と２０個以上の水酸基を有する化合物と
の結合物を得る工程； (2)上記工程(1)で得られた結合物と２個以上のボロン酸
基を有する発光性化合物との複合体を得る工程；及び (3)該複合体を光学的に検出する工程を含む方法を提供
するものである。

【０００９】上記発明の好ましい態様によれば、検出対
象物が核酸である上記の方法；検出対象物が固相担体上
に固定されたプローブ核酸に相補的に結合した核酸であ
る上記方法；及び該発光性化合物がシアニン色素、オキ
ソノール色素、及びキサンテン色素からなる群から選ば
れる化合物である上記方法が提供される。

【００１０】別の観点からは、検出対象物と２０個以上
の水酸基を有する化合物との結合物を用いて検出対象物
を光学的に検出するために用いる２個以上のボロン酸基
を有する発光性化合物；検出対象物の光学的検出のため
の複合体であって、下記の(a)及び(b)：(a)検出対象物
と２０個以上の水酸基を有する化合物との結合物、及び
(b)２個以上のボロン酸基を有する発光性化合物を含む
複合体が本発明により提供される。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の方法は、検出対象物を光
学的に検出する方法であって、下記の工程： (1)検出対象物と２０個以上の水酸基を有する化合物と
の結合物を得る工程； (2)上記工程(1)で得られた結合物と２個以上のボロン酸
基を有する発光性化合物との複合体を得る工程；及び (3)該複合体を光学的に検出する工程を含むことを特徴
としている。

【００１２】検出対象物には、生体成分、生体関連物
質、及びその他の低分子物質又は高分子物質が包含され
るが、水酸基を２０個以上有する化合物と結合可能な部
分構造を有している必要がある。検出対象物としては、
例えば、ホルモン、酵素、蛋白質、オリゴペプチド、核
酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類縁物である天然又は非
天然のポリヌクレオチドを意味する）、ポリサッカライ
ドなどの高分子物質のほか、薬剤、ヌクレオチド、オリ
ゴヌクレオチド、アミノ酸、オリゴペプチド、ステロイ
ド、糖などの低分子物質を挙げることができるが、これ
らに限定されることはない。検出対象物を含む試料の種
類は特に限定されないが、例えば、ヒトを含む哺乳類動
物から分離、採取した血液、尿、汗、組織片、臓器片、
毛髪などの生体試料が好ましく用いられる。

【００１３】検出対象物と水酸基を２０個以上有する化
合物との結合は、例えば、共有結合、イオン結合、水素
結合、又は疎水結合、あるいはこれらの組合せのいずれ
でもよい。これらのうち、検出対象物と水酸基を２０個
以上有する化合物とが共有結合で結合していることが好
ましい。両者が共有結合で結合する場合、検出対象物及
び水酸基を２０個以上有する化合物は、例えば下記の表
に示した部分構造の組合せにより結合形成を行うことが
できる。通常は、下記表の右側に示した反応性官能基を
水酸基を２０個以上有する化合物に導入しておくことが
好ましい。

【００１４】

【表１】

【００１５】上記以外にも、ディールス・アルダー反応
として知られる反応対の組合せ、１，３−双極子付加と
して知られる反応対の組合せ、パラジウムなどの遷移金
属を触媒とした有機ハライドとボロン酸とのカップリン
グ反応、有機ハライドと末端アルキンの反応などを用い
ることもできる。

【００１６】本発明で特に好ましく用いられる共有結合
の形成反応としては、例えば、アミンとカルボン酸（又
はその活性エステル）の組合せ、アミンとスルホニルハ
ライド（又はその活性エステル、活性アミド）の組合
せ、アミンと活性ヘテロアリールハライド（又は活性ア
リールスルホナート）、メルカプタンとアルキルハライ
ド（又はアルキルスルホナート）の組合せ、メルカプタ
ンとα，β−不飽和スルホン、メルカプタンとα，β−
不飽和エステル、メルカプタンとα，β−不飽和カルボ
アミドが挙げられる。この中で最も好ましいのはアミン
とカルボン酸（又はその活性エステル）の組合せ、メル
カプタンとアルキルハライド（又はアルキルスルホナー
ト）又はメルカプタンとα，β−不飽和スルホンの組合
せである。これらの結合反応については既知の有機反応
を用いることで極めて容易に行うことができる。

【００１７】これらの反応において用いられる溶媒とし
ては、水の他に、アルコール類、ジメチルスルホキシ
ド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、スルホラ
ンなどの水と混和しうる極性溶媒から、トルエン、酢酸
エチル、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、ベ
ンゼン、テトラヒドロフランなどの比較的低極性の溶媒
まで、適当なものを広い範囲から選択することができ
る。また、適宜これらの混合溶液を用いることもでき
る。

【００１８】２０個以上の水酸基を有する化合物として
は、上記の反応性官能基を末端に有するポリビニルアル
コールなどの合成ポリマーやセルロース、キチン・キト
サン類などの天然化合物の誘導体を用いることができる
が、ポリビニルアルコールを最も好ましく用いることが
できる。反応性官能基を末端に有するポリビニルアルコ
ールは広範囲の分子量のものが試薬として入手可能であ
り、また当分野においてその合成法は既知である。上記
化合物において、水酸基の個数は２０以上１００００以
下であることが好ましく、３０以上８０００以下がより
好ましく、５０以上５０００以下が最も好ましい（水酸
基の個数は平均値として示す）。

【００１９】ボロン酸基を２個以上有する発光性化合物
としては、ボロン酸基を２個以上有している蛍光性色素
を好ましく用いることができる。ボロン酸基の数は２個
以上１０個以下が好ましく、２個以上５個以下がより好
ましい。蛍光性色素の例としてはHandbook of Fluoresc
ent Probes and Research Chemicals 8th Edition （Mo
lecular Probes社刊ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）の中に
多岐にわたる多様な蛍光性色素の例が記載されており、
本発明には上記刊行物に記載の蛍光性色素を使用するこ
とができる。さらに好ましい蛍光性色素としてはポリメ
チン色素を挙げることができ、シアニン色素又はオキソ
ノール色素がさらに好ましい。他の骨格の蛍光色素とし
てはカルボニウム色素が好ましく、特にキサンテン色素
が好ましい。また、可視光域のみでなく紫外域や近赤外
域に吸収を有するような蛍光色素も用いることができる
が、検出の容易さから可視光域及び／又は近赤外域に吸
収を有する色素が好ましく、可視光域に吸収を有する色
素が最も好ましい。シアニン色素、オキソノール色素、
又はキサンテン色素については、励起波長と発光波長の
調節が容易であることは当該分野では良く知られてお
り、この点でもこれらの色素を用いることが好ましい。

【００２０】また、溶液中では実質的に蛍光性を示さな
いか、あるいは非常に弱い蛍光性しか示さない蛍光色素
であっても、検出時の環境（固相担体との相互作用、試
料との相互作用、標識された水酸基との相互作用など）
において蛍光性を示すものであれば本発明の方法に用い
ることができる。

【００２１】ボロン酸基を２個以上有する蛍光性色素の
具体例を示すが、本発明の方法に用いられる発光性化合
物の範囲はこれらの具体例に限定されることはない。

【００２２】

【化１】

【００２３】

【化２】

【００２４】

【化３】

【００２５】

【化４】

【００２６】ボロン酸を２個以上有する色素は既知の方
法で容易に合成することができる。例えば、カルボキシ
ル基を有する色素に対して、アミノ基を有するボロン酸
化合物を公知の方法で縮合する方法を一般的に用いるこ
とができる。また、カルボキシル基、メルカプト基、ア
ミノ基、フェノール性水酸基などの求核性基を有する色
素の場合には、置換活性な離脱基（ハロゲン原子やスル
ホニルオキシ基など）を有するボロン酸化合物を用いて
置換反応を行い、ボロン酸基を導入することができる。
また、シアニン色素など、合成原料段階に４級化反応を
含むものについては４級化の試薬としてボロン酸を有す
るハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、アルキ
ルスルホナートなどを用いて４級化することでボロン酸
基を導入できる。

【００２７】上記(2)の工程では、２０個以上の水酸基
を有する化合物と検出対象物との結合物を２個以上のボ
ロン酸基を有する発光性色素と相互作用させることによ
り、両者の複合体が生成する。上記複合体の生成は溶液
中で行ってもよく、また上記結合物が固相担体に固定さ
れている場合には固液二相系で行ってもよい。溶媒は適
宜選択できるが、例えば、水の他に、アルコール類、ジ
メチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニ
トリル、スルホランなどの水と混和しうる極性溶媒、ト
ルエン、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ジクロ
ロメタン、ベンゼン、テトラヒドロフランなどの比較的
低極性の溶媒など、適当なものを広い範囲から選択する
ことができる。また、適宜これらの混合溶液を用いるこ
ともできる。反応にあたって撹拌を行ってもよいし、静
置して反応を行ってもよい。相互作用させる時間は５秒
から１８時間の間で選択することが好ましく、１０秒か
ら１２時間がより好ましく、迅速な測定を行う意味から
１０秒から３０分の間が好ましい。

【００２８】２０個以上の水酸基を有する化合物と検出
対象物との結合物に対して添加する発光性化合物の濃度
は特に限定されず、結合物の存在量によって適宜選択可
能であるが、通常は１０^-2モル／リットル〜１０^-7モル
／リットルが好ましく、１０^-3モル／リットル〜１０^-6
モル／リットル程度の濃度で反応を行うことがより好ま
しい。なお、本明細書において用いられる「相互作用」
という用語については、上記発光性化合物及び水酸基を
有する化合物と検出対象物との結合物が、イオン結合、
水素結合、又は疎水結合などの共有結合よりも弱い結合
を介して相互に結合状態にあることを意味しており、
「複合体」とはそのような結合状態にある上記の２つの
物質を含む構造体を意味する。

【００２９】光学的な検出の手段は特に限定されず、例
えば、分光光度計、蛍光光度計、スキャニング装置、蛍
光スキャニング装置などを用いて通常の方法により光学
的な検出を行うことができる。本明細書において用いら
れる「検出」という用語は、検出対象物質の存在を証明
するためのほか、検出対象物質の定量などを含めて最も
広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても
限定的に解釈してはならない。光学的な検出により得ら
れた結果はコンピュータを用いた演算処理を施して視覚
化することもできる。

【００３０】以下、ガラスやメンブレンなどの固相担体
上にプローブ核酸を固定し、該プローブと検出対象物で
ある核酸とを相補的に結合させた場合について、本発明
の方法により該核酸を光学的に検出する工程を具体的に
説明するが、本発明の方法は下記の説明の細部に限定さ
れることはない。

【００３１】核酸の処理は例えば次のようにして行うこ
とができる。生体組織から抽出されたｍＲＮＡを定法に
より逆転写酵素を用いたｃＤＮＡへと逆転写する。この
際、前述した２０個以上の水酸基を有する化合物と結合
可能な基をプライマーの末端に導入しておくことができ
る。次に逆転写されたｃＤＮＡに対して２０個以上の水
酸基を有する化合物を結合させる。この段階で生成した
ｃＤＮＡ末端にはすべてポリオールが結合されているこ
とになる（このｃＤＮＡが「結合物」に相当する。）。

【００３２】末端が２０個以上の水酸基を有する化合物
と上記ｃＤＮＡとの結合物をプローブ核酸が固定されて
いる固相担体上に付与し、ハイブリダイゼーションの条
件下におく。ボロン酸を有する発光性化合物を相互作用
させる段階はハイブリダイゼーションの前、ハイブリダ
イゼーションと同時、又はハイブリダイゼーションの後
のいずれでもよく、ハイブリダイゼーション後の洗浄の
後でもよい。また複数の段階で相互作用させてもよい。
このような操作を行うことによって、ボロン酸基を有す
る発光性化合物と該結合物との複合体が形成され、それ
によってｃＤＮＡを検出することができる。

【００３３】本発明の別の態様として、ポリＴの末端に
２０個以上の水酸基を有する化合物を結合する方法を用
いてもよい。ポリＴにポリオール化合物を結合する手段
として、ポリＴ合成の際に末端に前記の反応性官能基を
導入しておき、すでに説明した方法でポリＴと２０個以
上の水酸基を有する化合物とを結合させることができ
る。 別途、生体組織から抽出されたｍＲＮＡをプロー
ブ核酸が固定されている固相担体上に付与し、ハイブリ
ダイゼーションを行う。ｍＲＮＡは末端にポリＡ構造を
有しているため、上記ポリＴは該ｍＲＮＡに相補的結合
することが可能である。２０個以上の水酸基を有する化
合物が結合した核酸ハイブリッドに対して、２個以上の
ボロン酸基を有する発光性化合物を相互作用させること
により核酸ハイブリッドと発光性化合物の複合体が形成
され、それによって核酸ハイブリッドを光学的に検出す
ることが可能となる。発光性化合物を相互作用させる時
期は特に限定されないが、２０個以上の水酸基を有する
化合物が結合したポリＴをｍＲＮＡのポリＡ部分と相互
作用させる過程、又はその後に生成したハイブリッドに
対して相互作用させることが好ましい。

【００３４】ボロン酸を２個以上有する発光性化合物を
相互作用させる際の溶媒としては水と混和しうる溶媒が
好ましく、該化合物が水に溶解する場合には水を用いて
もよい。水と混和しうる溶媒の例としてはメタノール、
エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ジメチ
ルホルムアミド、グリセリン、エチレングリコール、ジ
メチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒ
ドロフラン、アセトニトリル、スルホランなどが好まし
い。該化合物溶液の好ましい濃度は、核酸を検出する場
合には、１０^-3モル／リットル〜１０^-8モル／リットル
が好ましく、１０ ^-4モル／リットル〜１０^-7モル／リッ
トルがより好ましい。

【００３５】ハイブリダイゼーション終了後、あるいは
標識された核酸ハイブリッドと該発光性化合物との相互
作用処理の後に、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用
いて洗浄を行ってもよい。界面活性剤としてはドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩
衝液としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩衝液、ホウ酸
緩衝被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることが
できるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好まし
い。核酸ハイブリッドと該発光性化合物との相互作用を
検出する光学的な検出法としては、例えば蛍光光度計を
用いて検出する方法や、検出対象が固相担体上に固定さ
れている場合には蛍光スキャニング装置やマイクロアレ
イスキャナーなどを用いる方法を採用することができ
る。

【００３６】プローブ核酸としては、目的に応じて二種
類のプローブを適宜使い分けることができる。遺伝子の
発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、Ｅ
ＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。
これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であって
もよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を
基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリ
ー、あるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法に
よって増幅して調製することができる。ＰＣＲ法によっ
て増幅しないものも好ましく使用することができる。ま
た、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知
の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリ
ゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好まし
い。さらに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは塩基
の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用
することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的
な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されてい
ることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２〜５０量体である
ことが好ましく、１０〜２５量体であることが特に好ま
しい。

【００３７】プローブ核酸断片の点着は、ＤＮＡ断片を
水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もし
くは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した
水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴
下して行うことが好ましい。点着後のプローブ核酸断片
の乾燥を防ぐために、プローブ核酸断片を溶解又は分散
させた水性液中に高沸点の物質を添加してもよい。高沸
点の物質としては、プローブ核酸断片を溶解又は分散さ
せた水性液に溶解し得るものであって、試料核酸断片と
のハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘
性の大きくない物質であることが好ましい。このような
物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメ
チルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げ
ることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリ
ルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナ
トリウム等を挙げることができ、該ポリマーの分子量は
１０ ³〜１０⁵の範囲にあることが好ましい。高沸点の物
質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを
用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いること
が特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、プローブ核酸
断片の水性液中、０．１〜２容量％の範囲にあることが
好ましく、０．５〜１容量％の範囲にあることが特に好
ましい。また、同じ目的のために、プローブ核酸断片を
点着した後の固相担体を９０％以上の相対湿度および２
５〜５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。

【００３８】プローブ核酸を点着後、紫外線、水素化ホ
ウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施し
てもよい。これらの後処理として、複数の種類を組み合
わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理とを組み合
わせて行うことが特に好ましい。点着後は、インキュベ
ーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未
点着のプローブ核酸を洗浄して除去することが好まし
い。

【００３９】プローブ核酸断片は、固相担体表面に対し
て、１０²〜１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが好ま
しい。プローブ核酸の量は、例えば１〜１０^-15モルの
範囲であり、質量としては数ｎｇ以下であることが好ま
しい。点着によってプローブ核酸の水性液は固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、通
常、ほとんど円形であり、形状に変動がないことは、遺
伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重
要である。ドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲に
あることが好ましく、１００〜３００μｍの範囲にある
ことが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が
５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好まし
く、１〜１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。

【００４０】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップでは
数週間程度であり、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤ
ＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチ
ップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、
変異解析、多型解析等に利用される。

【００４１】多重情報を得る目的で本発明の検出方法と
他の標識方法を同時に行うことも可能である。標織方法
としては、ＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化
学発光法等）とが知られているが、蛍光法を用いること
が好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合
できるものであれば何れも用いることができるが、シア
ニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅ[登録商標]シリーズのＣ
ｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキ
シ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるい
はＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することが
できる。

【００４２】試料に含まれる核酸断片としては、その配
列や機能が未知であるＤＮＡ断片あるいはＲＮＡ断片を
用いることが好ましい。該核酸断片は、遺伝子発現を調
べる目的では真核生物の細胞や組織サンプルから単離す
ることが好ましい。試料がゲノムである場合には、赤血
球を除く任意の組織サンプルから単離することができ
る。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液りンパ球、皮
膚、毛髪、精液等であることが好ましい。核酸がｍＲＮ
Ａである場合には、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡの量は、液量や標識方法によって
異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。ＤＮＡチ
ップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、試
料中の核酸断片を低分子化しておくことが望ましい。原
核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。核酸断片は、
遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマー
もしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲ
を行って得ることが好ましい。

【００４３】標識した試料核酸断片を溶解または分散さ
せた水性液を９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレ
ートに分注し、ＤＮＡチップ上に点着することによって
ハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。点着の
量は、１〜１００ｎＬの範囲であることが好ましい。ハ
イブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で行
うことができ、６〜２０時間程度で完了する。ハイブリ
ダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶
液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去す
ることが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液
としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができ
るが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。

【００４４】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、核酸断片の使用量が非常に少ないことで
ある。そのため、固相担体に固定するプローブ核酸の鎖
長や標識した核酸断片の種類などに応じてハイブリダイ
ゼーションの最適条件を設定する必要があるが、その手
法は当業者に周知かつ慣用である。遺伝子発現の解析の
目的には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように長
時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーショ
ンを行うことが好ましい。

【００４５】

【実施例】本発明を実施例によりさらに具体的に説明す
るが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることは
ない。下記の実施例において、化合物番号は上記に好ま
しい化合物として示した化合物の番号に対応させてあ
る。 合成例１：化合物（３）の合成 化合物（３）は以下の合成スキームに従って合成した。

【化５】

【００４６】１−１．５，６−ジクロロ−２−メチル−
（１−（３−スルホプロピル））ベンズイミダゾール
（化合物（Ａ））の合成 １６ｇの５，６−ジクロロ−２−メチルベンズイミダゾ
ールにプロパンサルトン７．３ｍＬ、ジメチルホルムア
ミド１０ｍＬを加え、１５０℃で２時間反応した。冷却
後、酢酸エチルを加えて撹拌すると目的物が結晶として
得られた。結晶を濾取し、酢酸エチルで洗浄、乾燥を行
った。

【００４７】１−２．３−（５，６−ジクロロ−３−
（３−エトキシカルボニルプロピル）−２−メチルベン
ズイミダゾリウム−１−イル）プロパンスルホナート
（化合物（Ｂ））の合成 化合物（Ａ）３．２ｇに１０ｍＬの４−ブロモプタン酸
エチル、２ｍＬのトリエチルアミンを加え、１４０℃で
３時間反応を行った。冷却後、酢酸エチルを添加し、撹
拌とデカンテーションによる酢酸エチル可溶分の除去を
繰り返して、目的物結晶を得た。

【００４８】１−３．化合物（Ｃ）の合成 化合物（Ｂ）１ｇ、２０ｍＬの無水酢酸、４ｇのＮ，
Ｎ’−ジフェニルホルムアミジンを混合し、１５０℃で
３時間反応を行った。冷却後、酢酸エチルを加え、撹拌
とデカンテーションによる酢酸エチル可溶分の除去を繰
り返して、目的物を得た（ハルツ状）。

【００４９】１−４．化合物（Ｄ）の合成 １−３．で得た化合物（Ｃ）に０．６ｇの化合物（Ｂ）
を加え、１５ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解した。
ついで、１ｍＬのトリエチルアミンを添加し、６０℃で
１時間反応した。反応液に１００ｍＬの酢酸エチルを加
えて、生成した沈殿をジクロロメタンとメタノールに溶
解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行
った。さらにセファデックスＬＨ−２０をクロマトグラ
フィー担体として用いて（メタノール溶出）２回精製を
行い、目的物１００ｍｇを得た。

【００５０】１−５．化合物（Ｅ）の合成 前項で得た色素５０ｍｇを１０ｍＬのメタノールに溶解
し、５ｍＬの１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて１晩
放置した。この後、溶媒を減圧下で留去し、セファデッ
クスＬＨ−２０をクロマトグラフィー担体として用いて
（メタノール溶出）２回精製を行い、目的物（化合物
（Ｅ））３３ｍｇを得た。

【００５１】１−６．化合物（３）の合成 化合物（Ｅ）１０ｍｇ、３−アミノフェニルボロン酸１
０ｍｇを２ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解し、０．
５ｍＬのトリエチルアミンを加えた後、１５ｍｇのベン
ゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミ
ノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを添加
し、室温で３時間反応した。反応混合物に酢酸を加えて
酸性とし、そのまま分取用液体クロマトグラフィーを用
いて分取した。目的物が主生成物として得られ、溶離液
を留去すると淡オレンジ色の粉末として得られた。

【００５２】合成例２．化合物（６）の合成 化合物（６）は以下の合成スキームに従って合成した。

【化６】

【００５３】２−１．２，３，３−トリメチル−３Ｈ−
ピロロ〔２，３−ｂ〕ピリジン（化合物（Ｆ）の合成 ２−ヒドラジノピリジン１０ｇに３−メチル−２−ブタ
ノン２０ｍＬを加え、８０℃で１時間加熱した。生成し
た水と過剰の３−メチル−２−ブタノンを減圧下にて留
去し、１ｇの塩化亜鉛を添加して２００℃で３時間加熱
した。この混合物を減圧蒸留し、さらにヘキサンから再
結晶して目的物を得た。

【００５４】２−２．４−ブロモメチルフェニルボロン
酸（化合物（Ｇ））の合成 １０ｇの４−メチルフェニルボロン酸を１５０ｍＬの酢
酸エチルと混合し、２０ｇのＮ−ブロモコハク酸イミド
を加え、白熱電灯で照射しながら５時間反応した。反応
終了後、冷却し、溶媒を減圧留去したのち、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーにて精製を行った。目的物は
原料とＲｆ値が近いため、ヘキサン／酢酸エチルで慎重
に分離を行った。目的物は無色粉末として得られた。収
量３ｇ

【００５５】２−３．臭化７−（４−ジヒドロキシボロ
ノベンジル）−２，３，３，−トリメチル−３Ｈ−ピロ
ロ〔２，３−ｂ〕ピリジニウム（化合物（Ｈ））の合成 ０．５ｇの化合物（Ｆ）に１ｇの化合物（Ｇ）、１ｍＬ
のスルホランを添加し、１２０℃で１時間反応した。冷
却後、酢酸エチルを加え、撹拌とデカンテーションによ
る酢酸エチル可溶分の除去を繰り返して、目的物を得た
（茶褐色ハルツ状）。

【００５６】２−４．化合物（６）の合成 前項で得た化合物（Ｈ）にピリジン５ｍＬ、酢酸１ｍ
Ｌ、トリエチルアミン１ｍＬと１ｍＬのオルトぎ酸エチ
ルを加え、１３０℃で３０分加熱した。冷却後、酢酸エ
チルを加え、析出した油状物をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーで精製した（クロロホルム／メタノールで
溶出）。収量５０ｍｇ

【００５７】実施例１：ポリオールとボロン酸を有する
発光性化合物の相互作用。 （１）ＤＮＡ断片固定スライドの作成 ２質量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を３質量％化合物ＶＳ−１
溶液に、１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄
後、１２０℃で１５分間乾燥して、ＶＳ−１被覆スライ
ド（Ｂ）を作成した。

【００５８】

【化７】

【００５９】（２）前項で作成したスライド（Ｂ）に末
端にメルカプト基を有するポリオール化合物（ポリオー
ル化合物の平均水酸基の数とともに示した。）をそれぞ
れ１０ ^-8モル／リットルの濃度で表２に示したように点
着し、６０℃で１時間乾燥した後、蒸留水で洗浄、乾燥
を行いスライド（Ｃ）とした。次に、表２に示したボロ
ン酸を有する発光性化合物を１０^-4モル／リットルの濃
度でスライド（Ｃ）の表面に付与し、１５分後に蒸留水
で洗浄し、ついでアセトニトリルで洗浄、自然乾燥を行
った。得られたスライドを蛍光スキャナーで測定を行っ
たところ、水酸基を５個有するポリオールではほとんど
蛍光が観察されなかったが、水酸基を２０以上有するポ
リオールを点着した部分に強い蛍光が観察された。

【００６０】

【表２】

【００６１】実施例２：核酸ハイブリッドの検出 （１）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 5'-未端がアミノ基で修飾されたＤＮＡ断片（配列表に
配列を示した）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に
分散して水性液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）を調製し、上
記実施例１で得たスライド（Ｂ）に点着した。直ちに、
点着後のスライドを６０℃、相対湿度９０％にて１時間
放置した後、１２０℃で２０分間加熱した。このスライ
ドを０．１質量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と
２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈し
た溶液、ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合
溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄し
た。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシ
ン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸
留水で洗浄し、室温で乾燥してＤＮＡ断片が固定された
スライド（Ｄ）を得た。

【００６２】（３）ポリオールで標識された試料の作成 上記ＤＮＡ配列と相補的な配列を有し、同様に５’末端
にアミノ基を有する６０m e rのＤＮＡをトリス緩衝液
（ｐＨ７．４）溶液としてクロロアセチルイミダゾール
と反応させた。１００個の水酸基を有し、末端にメルカ
プト基を有するポリオール化合物を上記の溶液に小過剰
量添加し、６０℃で３時間反応した。次に液体クロマト
グラフィーでポリオールが結合したＤＮＡを精製し、得
られた核酸をハイブリダイゼーション用溶液（４×ＳＳ
Ｃおよび１０質量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）
に分散させてスライド（Ｄ）に付与した。すぐに、表面
を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバ
ー内にて６０℃で１０時間インキュベートした。このス
ライドを０．１質量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液
で洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で
乾燥し、スライド（Ｅ）とした。

【００６３】次いでボロン酸色素（比較例１、化合物
（１）、化合物（６）、及び化合物（１１））（各々
０．１ｍＭを１μＬ）をハイブリダイゼーション用溶液
（４×ＳＳＣおよび１０質量％のＳＤＳの混合溶液）
（２０μＬ）に分散させてスライド（Ｅ）に付与し、表
面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、３０分室温で
放置した。このスライドを０．１質量％ＳＤＳと２×Ｓ
ＳＣとの混合溶液で洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒
間遠心し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光
強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、表３に
示すように、ボロン酸基を持たない比較例１の化合物で
は蛍光スポットがほとんど観測されないのに対し、２個
以上のボロン酸基を有する化合物を用いた場合には、Ｄ
ＮＡ断片をスポットした部分のみに蛍光が観察された
（表中、相対蛍光強度は化合物（１）を用いた場合に観
測された蛍光強度を１とした相対強度である）。

【００６４】

【化８】

【００６５】

【表３】

【００６６】

【発明の効果】本発明の方法によれば、核酸などの微量
成分を増幅的に高感度に検出できる。例えば、遺伝子診
断等で用いられる核酸の２本鎖ハイブリッドを標的核酸
の長さに依存せずに定量的かつ高感度に検出できる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co. Ltd. <120> Method for detection by using luminescent compound <130> A11320M <160> 1 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <400> 1 gctgctgctg ggccagtggt tcctccatgt ccggggagga tcagacactt caaggtctag 60

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB10 BB14 BB29 BB46 BB48 BB50 BB51 DA13 FB02 FB13 FB16 GC15 2G054 AA06 CA22 CE02 EA01 GE03 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA12 HA14 HA19 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ42 QQ52 QR32 QR38 QR56 QR66 QR82 QS25 QS28 QS34 QS39 QX02

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検出対象物を光学的に検出する方法であ
   って、下記の工程： (1)検出対象物と２０個以上の水酸基を有する化合物と
   の結合物を得る工程； (2)上記工程(1)で得られた結合物と２個以上のボロン酸
   基を有する発光性化合物との複合体を得る工程；及び (3)該複合体を光学的に検出する工程を含む方法。
2. 【請求項２】 検出対象物が核酸である請求項１に記載
   の方法。
3. 【請求項３】 検出対象物が固相担体上に固定されたプ
   ローブ核酸に相補的に結合した核酸である請求項１に記
   載の方法。
4. 【請求項４】 発光性化合物がシアニン色素、オキソノ
   ール色素、及びキサンテン色素からなる群から選ばれる
   化合物である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   方法。
5. 【請求項５】 検出対象物の光学的検出のための複合体
   であって、下記の(a)及び(b)： (a)検出対象物と２０個以上の水酸基を有する化合物と
   の結合物、及び (b)２個以上のボロン酸基を有する発光性化合物を含む
   複合体。