CN118265800A - 用于多路fish的比率计量符号与顺序编码 - Google Patents

用于多路fish的比率计量符号与顺序编码 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于生成比率计量符号的方法，用于多路荧光原位杂交(FISH)的顺序杂交条形码化。而且，除了其使用方法外，本公开还阐述了其他方法以及相关领域中的问题的其他解决方案。

Description

用于多路FISH的比率计量符号与顺序编码
相关申请的交叉引用
本申请要求申请日为2021年6月8日美国临时专利申请第63/208,364号的权益，以上参考的申请的内容通过整体引用并入。
背景技术
顺序荧光原位杂交(Sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH)方法已被用于多路检测细胞和样品中的大量分子。实验的主要限制因素之一是成像时间，其受杂交的轮数控制。一方面，应用更多轮的杂交明智地使得密集的靶标被稀释和超分辨。另一方面，更多轮的杂交耗费成像时间并减少可以处理的样品量。然而，可能存在获取速度更重要的情况，并且需要实施更少轮的杂交以增加样品处理通量。
发明内容
本公开提供了用于大幅减少多路荧光原位杂交(Fluorescence In SituHybridization，FISH)所需的杂交轮数的方法。除了其使用方法外，本公开还阐述了其他方法以及相关领域中的问题的其他解决方案。
在一些实施方式中，提供了用比率计量符号对一种或多种分子靶标进行条形码化的方法，该方法包括使包含复数个分子靶标的样品与第一复数个一种或多种初级探针接触的步骤，其中一种或多种初级探针与一种或多种分子靶标相互作用，并且其中每种初级探针包含针对可检测标记探针的一个或多个结合位点。在一些实施方式中，该方法包括使一种或多种初级探针与一组或多组比率计量可检测标记探针接触。在一些实施方式中，比率计量可检测标记探针至少包含与第一初级探针结合位点相互作用的第一可检测标记探针。在一些实施方式中，一组或多组比率计量可检测标记探针包含与第一初级探针结合位点相互作用的第二可检测标记探针。在一些实施方式中，第一可检测标记探针的标记不同于第二可检测标记探针的标记。在一些实施方式中，第一可检测标记探针和第二可检测标记探针以预先确定的比率与第一初级探针结合位点接触。在一些实施方式中，该方法包括对于每组比率计量可检测标记探针，对不同通道之间的不同可检测标记的强度进行成像以确定不同的比率，以便检测可检测标记探针与其初级探针的相互作用。在一些实施方式中，该方法包括为每个比率产生比率计量符号。在一些实施方式中，该方法包括为每种分子靶标产生非比率计量符号。在一些实施方式中，该方法包括任选地重复任何前述实施方式，每次使用一组或多组可检测标记探针，以便通过条形码描述样品中的一种或多种分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个比率计量符号，并且其中至少一种分子靶标可以通过它们的条形码的差异而区别于样品中的另一种分子靶标。
在一些实施方式中，提供了用比率计量符号对一种或多种分子靶标进行条形码化的方法，该方法包括使包含复数个分子靶标的样品与第一复数个一种或多种初级探针接触的步骤，其中一种或多种初级探针与一种或多种分子靶标相互作用，并且其中每种初级探针包含一个或多个放大器序列。在一些实施方式中，该方法包括使一种或多种初级探针与一种或多种放大器接触以形成一种或多种放大支架，其中放大器包含一个或多个放大器序列，并且其中放大器序列包含一个或多个接头序列。在一些实施方式中，该方法包括使一种或多种放大器支架与一组或多组比率计量接头探针接触。在一些实施方式中，每组比率计量接头探针至少包含与放大器支架上的第一接头序列相互作用的第一接头探针。在一些实施方式中，每组比率计量探针包含与第二比率计量接头探针相互作用的第二可检测标记探针。在一些实施方式中，第一接头探针和第二接头探针以预先确定的比率与第一初级探针结合位点接触。在一些实施方式中，该方法包括使一组或多组比率计量接头探针与一组或多组可检测标记探针接触。在一些实施方式中，每组可检测标记探针至少包含与第一比率计量接头探针相互作用的第一可检测标记探针。在一些实施方式中，每组可检测标记探针包含与第二比率计量接头探针相互作用的第二可检测标记探针。在一些实施方式中，第一可检测标记探针的标记不同于第二可检测地标记探针的标记。在一些实施方式中，该方法包括对于每组比率计量接头探针，对不同通道之间的不同可检测标记的强度进行成像以确定不同的比率，以便检测接头探针与其初级探针的相互作用。在一些实施方式中，该方法包括为每个比率产生比率计量符号。在一些实施方式中，该方法包括任选地重复任何前述实施方式中的步骤，每次使用一组或多组比率计量接头探针，以便通过条形码描述样品中的一种或多种分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个比率计量符号，并且其中至少一种分子靶标可以通过它们的条形码的差异而区别于样品中的另一种分子靶标。
在一些实施方式中，该方法用于减少多路荧光原位杂交(FISH)所需的杂交轮数。与需要初级探针具有特定数目的针对每个可检测标记探针的结合位点的其他方法相比，本文所述的方法利用一组比率计量可检测标记探针中的竞争性相互作用以快速且有效地对分子靶标进行条形码化。
例如，细胞中的分子靶标(RNA-1)可以被含有RNA-1特异性结合序列以及可以被可检测标记探针结合的序列的初级探针靶向。可检测标记探针可以用Cy3或AF750N标记。通过以固定比率(例如0:5、1:4、2:3、3:2、4:1、5:0)混合Cy3和AF750N标记的探针，可以从图像中的每个点区分6个不同的比率，从而允许特异性鉴定6种分子种类。因此，可以从RNA靶标上Cy3和AF750N信号的比率产生6个比率计量符号。
另外，如果初级探针具有针对另一具有不同荧光基团的可检测标记探针的额外结合位点，则可以产生另外六个符号。可以产生总共6x6＝36个条形码，从而在仅1轮杂交中使用4个颜色通道特异性地鉴定36种不同的RNA种类。如果初级探针具有针对其他可检测标记探针的额外结合位点，则该方法在额外的杂交轮中呈指数级放大，并且允许总共AN个可区分条形码，其中A是符号量，且N是结合位点的数目。例如，66＝46,656个条形码允许仅在3轮杂交中用4个荧光通道编码24,000个基因的整个转录组。相比之下，在没有比率计量符号的情况下，编码24,000个基因需要至少8轮杂交，48＝65,536，在杂交和成像时间方面是其2.6倍以上。因此，本文所述的方法应使得效率提高。
在一些实施方式中，该方法用于减少指数发光栓系的连锁放大(linkedamplification tethered with exponential radiance，LANTERN)(LANTERN)所需的杂交轮数。LANTERN提供强荧光信号，以通过接头或与接头探针相互作用的可检测标记探针的竞争性结合产生比率计量符号。可以在来自初级探针的放大信号上更准确地产生比率计量符号，因为在结合中有更大数量的结合位点和更少的随机噪声，其标度为√S，其中S是结合位点的数量。
本文所述的方法应该比直接在初级探针上的比率计量编码更准确，其中初级探针包含特定数目的用于可检测标记探针进行相互作用的位点。这是因为初级探针与细胞中分子靶标的相互作用可能是高度随机的，导致更少并且更难以彼此区分的比率计量符号。此外，读出探针的竞争性结合应该比在初级探针上具有不同数目的结合位点更容易实现。这是因为在寡核苷酸的情况下，编码更大的比率差异(例如8:1)需要更长的初级探针序列，其增加了探针的成本并增加了非特异性结合。竞争性结合的实现方式应具有仅需要初级探针上的单个读出位点和可通过改变读出探针的相对浓度灵活调节的比率的优点，使得能够快速调节比率计量符号。
附图说明
图1.实现比率计量符号的示例。RNA被初级探针靶向，其通过挂锁或滚环机制放大。不同浓度的二级探针在扩增子上的竞争性结合在每个RNA分子上产生比率计量符号。
图2.示出了同一细胞样品的6个比率计量水平的图像。每个比率计量水平示出了两个通道(Cy3和AF750N)。强度比为0:5、1:4、2:3、3:2、4:1、5:0。每个点对应于单个RNA分子，并且以定义的强度比存在于两个荧光通道中。
图3.细胞中不同符号的点强度比直方图。设计了6个不同的比率计量符号，Cy3标记的二级探针和AF750N标记的二级探针以固定比率(0:5、1:4、2:3、3:2、4:1、5:0)混合。从样品的单分子强度计算6个不同的直方图。
图4.具有比率计量符号的36个靶标的条形码化方案。(A)来自LANTERN的放大DNA支架编码针对指定浓度的具有不同的荧光团的两种竞争性可检测标记探针的结合位点。(B)从6x6比率计量符号产生的36个靶标的条形码化方案。每个比率计量符号都有其与指定比率相关的独特的放大器序列。(C)正交可检测标记探针通过荧光显微镜在其各自的波长下成像。荧光通道之间校准后的荧光强度用于计算比率，形成在代码本中使用的比率计量符号。下图显示了编码36个靶标(在这种情况下，即来自36个不同基因的mRNA)的36个独特的放大器序列产生的不同比率。
图5.来自比率计量条形码化实验的代表性原始图像。通过6x6比率计量条形码化方案展示了36个条形码。可检测标记的寡核苷酸包含荧光染料Cy3b、AF750N(对于左侧可检测标记探针)和Alexa 488和Alexa 647(对于右侧可检测标记探针)。较小的图是黄色盒的缩放图像(AF：Alexa Fluor)。
图6.在单个细胞中的比率计量条形码化。(A)计算来自图5所示的实验的所有检测的点的左侧和右侧比率的2D直方图。(B)2D热图表明，通过使用左侧和右侧接头的0:9、1:8、2:7、3:6、4:5、5:4、6:3、7:2、8:1、9:0的浓度比，可以产生10个不同的比率计量符号。
图7.在初级探针上用更多的放大器序列编码极大地扩展了编码容量。例如，由于每个放大器序列理论上可以通过使用6X6比率计量方案提供36个条形码或使用10X10比率计量方案提供100个条形码，因此包含两个独特的放大器序列可以在2轮连续杂交中提供6x6x6x6＝1296个条形码或10x10x10x10＝10,000个条形码。额外的放大器序列可以并入初级探针中，使得2个或更多个放大支架可以在靶标分子上形成。例如，三个放大器将在3轮连续杂交中提供6x6x6x6x6x6＝46656个条形码。
具体实施方式
给出以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用所公开的主题并将其并入应用的上下文中。对于本领域技术人员来说，各种修改以及在不同应用中的各种用途将是显而易见的，并且本文定义的一般原理可以应用于广泛的实施方式。因此，本公开无意限于所示出的实施方式，而是应被赋予与本文所公开的原理和新特征一致的最广范围。
定义
除非另有说明，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
如本文所用，关于数字的术语“大约”或“约”通常被认为包括在该数字的任一方向(大于或小于)上落入5％、10％、15％或20％的范围内的数字，除非另有说明或从上下文中明显看出(除了这样的数字将小于0％或超过可能值的100％的情况)。
术语“寡核苷酸”是指核苷酸单体的聚合物或寡聚物，其含有核碱基、经修饰的核碱基、糖、经修饰的糖、磷酸桥或经修饰的桥的任意组合。
寡核苷酸可以有多种长度。在具体实施方式中，寡核苷酸的长度可以在约2至约200个核苷酸的范围内。在多个相关实施方式中，寡核苷酸(单链、双链和三链)的长度范围可以为约4至约10个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸、约20至约30个核苷酸的长度。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为约9个氨基酸至约39个氨基酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为4个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为5个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为6个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为7个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为8个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为9个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为10个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为11个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为12个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为15个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为20个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为25个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为30个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸是长度为至少18个核苷酸的互补链的双链体。在一些实施方式中，寡核苷酸是长度为至少21个核苷酸的互补链的双链体。
如本文所用，术语“探针(probe/probes)”是指可以将自身直接或间接附接到分子靶标(例如，mRNA样品、DNA分子、蛋白质分子、RNA和DNA同种型分子、单核苷酸多态性分子等)的合成或天然存在的任何分子。例如，探针可以包括核酸分子、寡核苷酸、蛋白质(例如，抗体或抗原结合序列)或其组合。例如，蛋白质探针可以与一个或多个核酸分子连接以形成为嵌合体的探针。如本文所公开的，在一些实施方式中，探针本身可以产生可检测的信号。在一些实施方式中，探针直接或通过中间分子间接与可产生可检测信号的信号部分(例如，染料或荧光团)连接。
如本文所用，术语“样品”是指如本文所述从感兴趣的来源获得或衍生的生物样品。在一些实施方式中，感兴趣的来源包括生物体，例如动物或人。在一些实施方式中，生物样品包括生物组织或液体。在一些实施方式中，生物样品是或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样品；含细胞体液；游离核酸；痰；唾液；尿液；脑脊液、腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；妇科液；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗涤液或灌洗液，例如导管灌洗液或支气管肺泡灌洗液；抽吸物；刮擦物；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物；和/或来自其中的细胞等。在一些实施方式中，生物样品是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方式中，样品是通过任何适当的手段直接从感兴趣的来源获得的“原始样品”。例如，在一些实施方式中，通过选自由活检(例如，细针抽吸或组织活检)、手术、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)收集等的组成的组中的方法获取原始生物样品。在一些实施方式中，如从上下文将明确的，术语“样品”是指通过处理原始样品(例如，通过除去原始样品的一种或多种组分和/或通过向原始样品中加入一种或多种试剂)而获得的制备物。例如，使用半透膜过滤。这种“处理的样品”可以包括例如从样品中提取的、或通过使原始样品经受诸如mRNA的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等技术而获得的核酸或蛋白质。在一些实施方式中，术语“样品”是指核酸，例如DNA、RNA、转录本或染色体。在一些实施方式中，术语“样品”是指已经从细胞中提取的核酸。
如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或性质的总的或接近总的范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行到完全或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于体现在许多生物和/或化学现象中固有的完整性潜在缺乏。
如本文所公开的，术语“标记”通常是指可以识别并结合细胞中分子靶标内的特定靶标位点的分子。例如，标记可以包含可结合细胞中的分子靶标的寡核苷酸。寡核苷酸可以连接至对分子靶标具有亲和力的部分。寡核苷酸可以连接到能够共价连接到分子靶标的第一部分。在某些实施方式中，分子靶标包含能够与标记形成共价键的第二部分。在特定实施方式中，标记包含能够提供对包含分子靶标的细胞的识别的核酸序列。在某些实施方式中，标记复数个细胞，其中复数个细胞中的每个细胞相对于其他标记的细胞具有独特的标记。
如本文所公开的，术语“条形码”通常是指通过本文所述的方法产生的标记的符号序列。条形码序列通常是具有足够的长度和独特性，以识别分子目标。
在一些实施方式中，靶标选自转录本、RNA、DNA基因座、染色体、DNA、蛋白质、脂质、聚糖、细胞靶标、细胞器及其任意组合。在某些实施方式中，转录本、RNA、DNA基因座、染色体、DNA、蛋白质、脂质、聚糖、细胞靶标、细胞器及其任意组合缀合至寡核苷酸。
概述
本公开提供了用于大幅减少多路荧光原位杂交(FISH)所需的杂交轮数的方法。除了其使用方法外，本公开还阐述了其他方法以及相关领域中的问题的其他解决方案。
在一些实施方式中，提供了用比率计量符号对一种或多种分子靶标进行条形码化的方法，该方法包括使包含复数个分子靶标的样品与第一复数个一种或多种初级探针接触的步骤，其中一种或多种初级探针与一种或多种分子靶标相互作用，并且其中每种初级探针包含针对可检测标记探针的一个或多个结合位点。在一些实施方式中，该方法包括使一种或多种初级探针与一组或多组比率计量可检测标记探针接触。在一些实施方式中，比率计量可检测标记探针至少包含与第一初级探针结合位点相互作用的第一可检测标记探针。在一些实施方式中，一组或多组比率计量可检测标记探针包含与第一初级探针结合位点相互作用的第二可检测标记探针。在一些实施方式中，第一可检测标记探针的标记不同于第二可检测标记探针的标记。在一些实施方式中，第一可检测标记探针和第二可检测标记探针以预先确定的比率与第一初级探针结合位点接触。在一些实施方式中，该方法包括对于每组比率计量可检测标记探针，对不同通道之间的不同可检测标记的强度进行成像以确定不同的比率，以便检测可检测标记探针与其初级探针的相互作用。在一些实施方式中，该方法包括为每个比率产生比率计量符号。在一些实施方式中，该方法包括为每种分子靶标产生非比率计量符号。在一些实施方式中，该方法包括为每个分子靶标产生非比率计量符号，以便通过条形码描述样品中的一种或多种分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个比率计量符号，并且其中至少一种分子靶标可以通过其条形码的差异而区别于样品中的另一种分子靶标。在一些实施方式中，该方法包括任选地重复任何前述步骤，每次使用一组或多组可检测标记探针，以便通过条形码描述样品中的一种或多种分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个比率计量符号，并且其中至少一种分子靶标可以通过其条形码的差异而区别于样品中的另一种分子靶标。
在一些实施方式中，提供了用比率计量符号对一种或多种分子靶标进行条形码化的方法，该方法包括使包含复数个分子靶标的样品与第一复数个一种或多种初级探针接触的步骤，其中一种或多种初级探针与一种或多种分子靶标相互作用，并且其中每种初级探针包含一个或多个放大器序列。在一些实施方式中，该方法包括使一种或多种一级探针与一种或多种放大器接触以形成一种或多种放大支架，其中放大器包含一个或多个放大器序列，并且其中放大器序列包含一个或多个接头序列。在一些实施方式中，该方法包括使一种或多种放大器支架与一组或多组比率计量接头探针接触。在一些实施方式中，每组比率计量接头探针至少包含与放大器支架上的第一接头序列相互作用的第一接头探针。在一些实施方式中，每组比率计量探针包含与第二比率计量接头探针相互作用的第二可检测标记探针。在一些实施方式中，第一接头探针和第二接头探针以预先确定的比率与第一初级探针结合位点接触。在一些实施方式中，该方法包括使一组或多组比率计量接头探针与一组或多组可检测标记探针接触。在一些实施方式中，每组可检测标记探针至少包含与第一比率计量接头探针相互作用的第一可检测标记探针。在一些实施方式中，每组可检测标记探针包含与第二比率计量接头探针相互作用的第二可检测标记探针。在一些实施方式中，第一可检测标记探针的标记不同于第二可检测地标记探针的标记。在一些实施方式中，该方法包括对于每组比率计量接头探针，对不同通道之间的不同可检测标记的强度进行成像以确定不同的比率，以便检测接头探针与其初级探针的相互作用。在一些实施方式中，该方法包括为每个比率产生比率计量符号。在一些实施方式中，该方法包括为每个比率产生比率计量符号，以便通过条形码描述样品中的一种或多种分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个比率计量符号，并且其中至少一种分子靶标可以通过其条形码的差异而区别于样品中的另一种分子靶标。在一些实施方式中，该方法包括任选地重复任何前述实施方式，每次使用一组或多组比率计量接头探针，以便通过条形码描述样品中的一种或多种分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个比率计量符号，并且其中至少一种分子靶标可以通过它们的条形码的差异而区别于样品中的另一种分子靶标。
在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括与第一初级探针结合位点相互作用的第三可检测标记探针。在一些实施方式中，第三可检测标记探针不同于第一或第二可检测标记探针的标记。在一些实施方式中，第一可检测标记探针、第二可检测标记探针和第三可检测标记探针以预先确定的比率与第一初级探针结合位点接触。
在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括与第一初级探针结合位点相互作用的第四可检测标记探针。在一些实施方式中，第四可检测标记探针不同于第一、第二或第三可检测标记探针的标记。在一些实施方式中，第一可检测标记探针、第二可检测标记探针和第三可检测标记探针以预先确定的比率与第一初级探针结合位点接触。
在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括使包含复数个分子靶标的样品与第一复数个可检测标记探针接触的步骤，该第一复数个可检测标记探针至少包含与第一分子靶标相互作用的第一可检测标记探针。在一些实施方式中，第一复数个可检测标记探针包含与第二分子靶标相互作用的第二可检测标记探针。在一些实施方式中，第一可检测标记探针不同于第二可检测标记探针。在一些实施方式中，该方法包括在第一接触步骤后对样品成像，以便检测可检测标记探针与其靶核酸的相互作用。在一些实施方式中，该方法包括为每种分子靶标产生非比率计量符号。在一些实施方式中，该方法包括重复进行接触和成像步骤，每次用新的复数个可检测标记探针来进行，以便通过条形码描述样品中的分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个非比率计量符号，并且其中条形码可以通过其条形码的差异而区别于样品中的另一靶核酸。
在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括在使样品与复数个比率计量探针接触之前使样品与复数个非比率计量探针接触。在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括在使样品与复数个比率计量探针接触的同时使样品与复数个非比率计量探针接触。在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括在使样品与复数个比率计量探针接触之后使样品与复数个非比率计量探针接触。
在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括使一种或多种初级探针与2、3、4、5、6、7或8组比率计量可检测标记探针接触。
在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括使一种或多种放大器支架与2、3、4、5、6、7或8组比率计量接头探针接触。
在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括在步骤(ii)之前通过滚环、挂锁、分支DNA、ClampFISH、LANTERN或其任意组合放大初级探针。
样品和分子靶标
在一些实施方式中，该方法包括分析样品，其中样品包括细菌细胞、古细菌细胞、真核细胞或其组合。在某些实施方式中，样品包括组织、细胞或来自细胞的提取物。在某些实施方式中，样品包括从患者获得的细胞。在某些实施方式中，样品包括从患者获得的液体。
在一些实施方式中，样品包括选自蛋白质、修饰的蛋白质、转录本、RNA、DNA基因座、外源蛋白质、外源核酸、激素、碳水化合物、小分子、生物活性分子及其组合的分子靶标。在一些实施方式中，靶标包括亚细胞特征。
初级探针
在一些实施方式中，该方法包括使包含复数个分子靶标的样品与复数个一种或多种初级探针接触。
在一些实施方式中，初级探针选自蛋白质、修饰的蛋白质、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片段及其组合。
在一些实施方式中，初级探针包含寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含具有可检测部分的寡核苷酸。
在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少5个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少6个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少7个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少8个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少9个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少10个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少11个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少12个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少13个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少14个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少15个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少16个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少17个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少18个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少19个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少20个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少21个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少22个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少23个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少24个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少26个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少27个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少28个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少29个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，初级探针包含长度为至少30个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，任何前述实施方式的初级探针包含长度小于35、40、45、50、100个核苷酸的寡核苷酸。
在一些实施方式中，初级探针包含与分子靶标互补的序列。在一些实施方式中，序列互补性包含至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％，
在一些实施方式中，初级探针包含一个或多个放大器序列。在一些实施方式中，初级探针包含两个或多个放大器序列。在一些实施方式中，初级探针包含三个或多个放大器序列。在一些实施方式中，初级探针包含四个或多个放大器序列。在一些实施方式中，初级探针包含五个或多个放大器序列。在一些实施方式中，初级探针包含六个或多个放大器序列。在一些实施方式中，初级探针包含七个或多个放大器序列。在一些实施方式中，初级探针包含八个或多个放大器序列。
在一些实施方式中，一个或多个放大器序列是相同序列。在一些实施方式中，一个或多个放大器序列中的至少一个放大器序列是相同序列。在一些实施方式中，一个或多个放大器序列彼此不同。在一些实施方式中，一个或多个放大器序列中的至少一个放大器序列彼此不同。
在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少5个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少6个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少7个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少8个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少9个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少10个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少11个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少12个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少13个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少14个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少15个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少16个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少17个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少18个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少19个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少20个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少21个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少22个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少23个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少24个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少25个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少26个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度为至少27个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，放大器序列包含长度小于35、40、45、50、100个核苷酸的核苷酸序列。
放大器
在一些实施方式中，该方法包括使一种或多种初级探针与一种或多种放大器接触以形成一种或多种放大支架。在一些实施方式中，放大器包含一个或多个放大器序列。在一些实施方式中，放大器序列包含一个或多个接头序列。
在一些实施方式中，一种或多种放大支架是相同的。在一些实施方式中，一种或多种放大支架是不同的。
在一些实施方式中，放大器序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个接头序列。
在一些实施方式中，放大器序列包含一个或多个接头序列。在一些实施方式中，放大器序列包含两个或更多个接头序列。在一些实施方式中，放大器序列包含三个或更多个接头序列。在一些实施方式中，放大器序列包含四个或更多个接头序列。在一些实施方式中，放大器序列包含五个或更多个接头序列。在一些实施方式中，放大器序列包含六个或更多个接头序列。在一些实施方式中，放大器序列包含七个或更多个接头序列。在一些实施方式中，放大器序列包含八个或更多个接头序列。在一些实施方式中，放大器序列包含少于10、15、20或25个接头序列。
在一些实施方式中，接头序列的长度为至少5个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少6个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少7个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少8个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少9个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少10个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少11个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少12个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少13个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少14个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少15个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少16个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少17个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少18个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少19个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少20个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少21个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少22个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少23个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少24个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少25个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少26个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少27个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少28个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少29个核苷酸。在一些实施方式中，接头序列的长度为至少30个核苷酸。在一些实施方式中，任何前述实施方式的接头序列包含长度小于35、40、45、50、100个核苷酸的核苷酸序列。
可检测标记探针
在一些实施方式中，该方法包括通过使用可检测标记探针对分子靶标进行条形码化。
在一些实施方式中，可检测标记探针选自蛋白质、修饰的蛋白质、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片段及其组合。在一些实施方式中，可检测标记探针还包含可检测部分。在一些实施方式中，可检测部分是荧光基团。
在一些实施方式中，可检测标记探针包含具有可检测部分的寡核苷酸。
在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少5个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少6个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少7个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少8个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少9个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少10个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少11个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少12个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少13个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少14个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少15个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少16个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少17个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少18个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少19个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少20个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少21个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少22个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少23个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少24个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少26个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少27个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少28个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少29个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含长度为至少30个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，任何前述实施方式的可检测标记探针包含长度小于35、40、45、50、100个核苷酸的寡核苷酸。
在一些实施方式中，可检测标记探针包含与初级探针互补的序列。在一些实施方式中，序列互补性包括至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
在一些实施方式中，可检测标记探针包含具有相同序列的寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含具有不同序列的寡核苷酸。
中间探针
在一些实施方式中，该方法包括可检测标记探针通过一种或多种中间探针与其初级探针或放大支架相互作用。在一些实施方式中，中间探针是接头探针。
在一些实施方式中，可检测标记探针通过与一种或多种中间探针结合或杂交而与其靶标相互作用。在一些实施方式中，中间探针包含寡核苷酸、抗体、抗体片段、蛋白质或其组合。
在一些实施方式中，中间探针结合、杂交或以其他方式连接至靶标。在一些实施方式中，该方法包括通过与杂交至靶标的中间探针杂交而与靶标相互作用的可检测标记寡核苷酸，其中中间探针包含与靶标互补的序列和突出端序列。在一些实施方式中，序列互补性包括至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少5个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少6个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少7个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少8个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少9个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少10个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少11个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少12个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少13个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少14个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少15个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少16个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少17个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少18个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少19个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少20个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少21个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少22个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少23个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少24个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少26个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少27个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少28个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少29个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，中间探针包含长度为至少30个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方式中，任何前述实施方式的中间探针包含长度小于35、40、45、50、100个核苷酸的寡核苷酸。
在一些实施方式中，中间探针包含与可检测标记探针互补的突出端序列。在一些实施方式中，序列互补性包括至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
在一些实施方式中，中间探针包含与桥接探针互补的突出端序列。在一些实施方式中，桥接探针包含与可检测标记探针互补的序列。在一些实施方式中，桥接探针包含与中间探针互补的序列。
在一些实施方式中，该方法包括通过多次接触和成像步骤保存的中间探针。在一些实施方式中，该方法包括去除步骤，该步骤去除可检测标记探针，任选地保持中间探针完整。在一些实施方式中，该方法包括去除步骤，该步骤去除可检测标记探针并保持中间探针完整。在一些实施方式中，可检测标记探针在化学或酶方面不同于中间探针，以便可以选择性地去除可检测标记寡核苷酸。
在一些实施方式中，该方法包括为中间探针的接头探针。在某些实施方式中，接头探针选自蛋白质、修饰的蛋白质、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片段及其组合。在某些实施方式中，接头探针是寡核苷酸。在某些实施方式中，接头探针杂交至放大器支架。在某些实施方式中，每个接头探针包含与初级探针互补的序列和突出端序列。在某些实施方式中，突出端序列与可检测标记探针互补。在某些实施方式中，突出端序列与桥接探针互补。在某些实施方式中，桥接探针与可检测标记探针互补并与接头探针互补。
比率
在一些实施方式中，可检测标记探针以预先确定的比率与初级探针结合位点接触。在一些实施方式中，该方法包括通过使用不同浓度的可检测标记探针以预先确定的比率直接或间接竞争初级探针上的结合位点来产生比率计量符号。在某些实施方式中，可检测标记探针以预先确定的比率间接竞争初级探针上的结合位点，这通过添加诱饵探针到该比率来进行。在一些实施方式中，该方法包括使样品与不同浓度的可检测标记探针接触，其中不同浓度是可检测标记探针的不同比率。
在一些实施方式中，任意两种可检测标记探针之间的每个预先确定的比率大于或等于0.0。在一些实施方式中，任意两种可检测标记探针之间的每个预先确定的比率小于或等于1.0。在一些实施方式中，任意两种可检测标记探针之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。在一些实施方式中，三种可检测标记探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。在一些实施方式中，四种或更多种三种可检测标记探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。在一些实施方式中，五种、六种、七种或八种或更多种可检测标记探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。
在一些实施方式中，任意两种可检测标记探针之间的每个预先确定的比率为约0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9或1.0。在一些实施方式中，任意三种探针之间的每个预先确定的比率为0.10:0.20:0.70；0.25:0.25:0.50；0.25:0.50:0.25；0.50:0.25:0.25；或0.70:0.20:0.10。在一些实施方式中，任意四种探针之间的每个预先确定的比率为0.10:0.10:0.10:0.70；0.10:0.20:0.20:0.50；0.25:0.25:0.25:0.25；0.50:0.20:0.20:0.10；0.70:0.10:0.10:0.10。
在一些实施方式中，该方法包括使一种或多种放大器支架与一组或多组比率计量接头探针以预先确定的比率接触。在一些实施方式中，该方法包括通过使用不同浓度的比率计量接头探针来直接或间接竞争放大器支架上的结合位点来产生比率计量符号。在某些实施方式中，比率计量接头探针通过以一定比率添加诱饵探针来间接竞争放大器支架上的结合位点。在一些实施方式中，该方法包括使样品与不同浓度的比率计量接头探针接触，其中不同浓度是接头探针的不同比率。
在一些实施方式中，任意两种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率大于或等于0.0。在一些实施方式中，任意两种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率小于或等于1.0。在一些实施方式中，任意两种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。在一些实施方式中，三种比率计量接头探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。在一些实施方式中，四种或更多种比率计量接头探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。在一些实施方式中，五种、六种、七种、八种或更多种比率计量接头探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。在一些实施方式中，任意两种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率为约0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9或1.0。在一些实施方式中，任意三种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率为0.10:0.20:0.70；0.25:0.25:0.50；0.25:0.50:0.25；0.50:0.25:0.25；或0.70:0.20:0.10。在一些实施方式中，任意四种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率为0.10:0.10:0.10:0.70；0.10:0.20:0.20:0.50；0.25:0.25:0.25:0.25；0.50:0.20:0.20:0.10；0.70:0.10:0.10:0.10。
条形码化靶标
在一些实施方式中，该方法包括对一种或多种分子靶标进行条形码化。在一些实施方式中，分子靶标选自蛋白质、修饰的蛋白质、转录本、RNA、DNA基因座、外源蛋白质、外源核酸、激素、碳水化合物、小分子、生物活性分子及其组合。在一些实施方式中，靶标包括亚细胞特征。例如，核纤层蛋白可以用一组条形码标记，核仁可以用另一组条形码靶向。然后每个样品可以用不同亚细胞区室上的条形码的组合独特地标记。在一些实施方式中，该方法包括对靶标进行条形码化，其中靶标是不同的。
在一些实施方式中，该方法包括荧光检测。在一些实施方式中，该方法包括荧光检测或其他检测的方法。在一些实施方式中，该方法包括顺序杂交以检测靶标分析物。
在一些实施方式中，探针用于对一种或多种分子靶标进行条形码化的方法中。参见，例如，2014年4月30日提交的标题为“通过顺序杂交条形码化对分子进行多路标记”的国际PCT专利申请号PCT/US2014/036258，其全部内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
在一些实施方式中，探针用于指数发光栓系的连锁放大(LANTERN)的方法中。参见，例如，2022年3月24日提交的标题为“指数发光栓系的连锁放大”的国际专利申请号PCT/US 2022/021826，其全部内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
在一些实施方式中，探针用于ClampFISH实验。参见，例如，ClampFISH使用基于点击化学的放大检测单个核酸分子，Rouhanifard S.H.等人，Nature Biotechnology 37:84-89(2019)，其全部内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
在一些实施方式中，该方法包括可检测标记探针，其选自蛋白质、修饰的蛋白质、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片段及其组合。
在一些实施方式中，该方法包括使所述一个或多个样品中的每个样品与第一复数个可检测标记探针接触，以便该探针与一个或多个靶标相互作用。在一些实施方式中，该方法包括在第一接触步骤之后对样品成像，以便检测可检测标记探针与其靶标的相互作用。
在一些实施方式中，该方法包括接触步骤，该接触步骤在标记至少一种靶标中不同于另一接触步骤。
在一些实施方式中，该方法包括接触步骤，其中第一复数个探针中的每个可检测标记探针都标记有可检测部分。
在一些实施方式中，该方法包括接触步骤，其中每个可检测标记探针包含可检测部分，并且至少一个接触步骤因对每个靶标具有不同的可检测部分而不同于另一个接触步骤。
在一些实施方式中，该方法包括接触步骤，其中至少两种不同的可检测标记探针与第一靶标相互作用，并且其中至少两种不同的可检测标记探针与第二靶标相互作用。
在一些实施方式中，可检测标记探针包含选自两种、三种或四种不同标记的标记。
在一些实施方式中，样品中针对靶标的条形码包含放大的信号。在某些实施方式中，样品中针对靶标的条形码包含通过滚环、挂锁、分支DNA、ClampFISH、LANTERN或其任意组合放大的信号。
在一些实施方式中，该方法包括使用可检测标记探针，其中每个可检测标记探针包含相同的可检测部分和相同的序列。
在一些实施方式中，该方法包括可检测标记探针，其中每个可检测标记探针通过一个或多个中间探针与其靶标相互作用，每个中间探针都与靶标杂交。
在一些实施方式中，该方法包括重复接触和成像步骤，每次用新的复数个可检测标记探针来进行，以便通过条形码描述样品中的靶标，并且该靶标可以通过它们的条形码的差异区分于样品中的另一靶标。
在一些实施方式中，任何前述实施方式中的条形码包含比率计量符号、非比率计量符号及其任意组合。在一些实施方式中，条形码包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个比率计量符号。在一些实施方式中，条形码包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非比率计量符号。
在一些实施方式中，比率计量符号经过几轮杂交产生。例如，Cy3可检测标记探针可用于第一轮杂交，Cy5可检测标记探针可用于第二轮杂交以产生比率计量符号。
在一些实施方式中，该方法包括误差校正轮。参见，例如，2017年8月0日提交的标题为“基于具有嵌入纠错机制的伪彩色条形码的分子靶的顺序探测”的国际专利申请号PCT/US2017/044994，其全部内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
在一些实施方式中，该方法包括通过选自诸如汉明码(Hamming codes)、里德-所罗门码(Reed-Solomon codes)、格雷码(Golay codes)或其任意组合的区块码来执行的误差校正轮。
在一些实施方式中，任何前述实施方式的方法进一步包括误差校正步骤。在某些实施方式中，误差校正步骤包括在步骤(i)-(v)之前或之间或之后执行额外轮次的接触和成像。
在某些实施方式中，任何前述实施方式的方法包括：比率计量符号的分配包括应用机器学习算法。
去除探针
在某些实施方式中，该方法包括在一个或多个成像步骤后去除可检测标记探针的步骤。在一些实施方式中，去除可检测标记探针的步骤包括使复数个可检测标记探针与消化可检测标记探针的酶接触。在一些实施方式中，去除步骤包括使复数个可检测标记探针与DNA酶接触、使复数个可检测标记探针与RNA酶接触、光漂白、链置换、甲酰胺洗涤、热变性、或其组合。在一些实施方式中，去除步骤包括去除可检测标记探针的光漂白。
在一些实施方式中，该方法包括通过使用剥离试剂、洗涤缓冲液、光漂白、化学漂白及其任意组合来去除可检测标记探针。
在一些实施方式中，该方法包括清除样品。在一些实施方式中，样品通过CLARITY清除。
某些去除探针的技术在本领域是已知的。参见，例如，2014年4月30日提交的标题为“通过顺序杂交条形码化对分子进行多路标记”的国际PCT专利申请号PCT/US2014/036258，其全部内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
使样品成像
在一些实施方式中，该方法包括对可检测标记探针进行成像。在一些实施方式中，该方法包括对条形码进行成像。如本领域具有普通技术人员所理解的，不同的技术可用于成像步骤。
在一些实施方式中，成像方法包括但不限于落射荧光显微术、共聚焦显微术、不同类型的超分辨率显微术(PALM/STORM、SSIM/GSD/STED)和光片照明显微术(SPIM等)。
在一些实施方式中，成像方法包括示例性超分辨率技术，包括但不限于I5M和4Pi-显微术、受激发射损耗显微术(STEDM)、基态损耗显微术(GSDM)、空间结构照明显微术(SSIM)、光激活定位显微术(PALM)、可逆可饱和光学线性荧光跃迁(RESOLFT)、全内反射荧光显微镜(TIRFM)、双折射-PALM(FPAL M)、随机光学重建显微术(STORM)、具有一纳米精度的荧光成像(FIONA)及其组合。例如：Chi,2009“Super-resolution microscopy:breakingthe limits,”Nature Methods 6(1):15-18；Blow 2008,“New ways to see a smallerworld,”Nature 456:825-828；Hell等人,2007,“Far-Field Optical Nanoscopy,”Science316:1153；R.Heintzmann和G.Ficz,2006,“Breaking the resolution limit in lightmicroscopy,”Briefings in Functional Genomics and Proteomics 5(4):289-301；Garini等人,2005,“From micro to nano:recent advances in high-resolutionmicroscopy,”Current Opinion in Biotechnology 16:3-12；和Bewersdorf等人,2006,“Comparison of I5M and 4Pi-microscopy,”222(2):105-1 17；和Wells,2004,“Man theNanoscopes,”JCB 164(3):337-340。
在一些实施方式中，电子显微镜(EM)用于成像。
在一些实施方式中，成像步骤检测靶标。在一些实施方式中，成像步骤定位靶标。在一些实施方式中，成像步骤提供靶标的三维空间信息。在一些实施方式中，成像步骤定量靶标。通过使用多次接触和成像步骤，所提供的方法能够以令人惊讶的高通量对于大量靶标提供空间和/或定量信息。例如，当使用F个可检测的不同类型的标记时，在N个接触和成像步骤之后可以获得多达FN个靶标的空间和/或定量信息。
某些用于成像的技术是本领域已知的。参见，例如，2014年4月30日提交的标题为“通过顺序杂交条形码化对分子进行多路标记”的国际PCT专利申请号PCT/US2014/036258，其全部内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
在一些实施方式中，该方法包括分析细胞大小和形状、标志物、免疫荧光测量或其任意组合。
荧光基团
在一些实施方式中，该方法包括用荧光基团检测探针、可检测标记探针或其寡核苷酸。在一些实施方式中，可检测标记探针包含荧光基团。
在一些实施方式中，荧光基团是本领域技术人员认为合适的任何荧光基团。
在某些实施方式中，荧光基团包括但不限于荧光素、罗丹明、Alexa Fluor类、DyLight Fluor类、ATTO染料或其任何类似物或衍生物。在某些实施方式中，可检测基团包括但不限于荧光素和荧光素的化学衍生物；伊红；羧基荧光素；异硫氰酸荧光素(FITC)；荧光素亚膦酰胺(FAM)；赤藓红；玫瑰孟加拉红；从细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)分泌的荧光素；亚甲蓝；激光染料；罗丹明染料(例如，罗丹明、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明123、金胺O、磺基罗丹明101、磺基罗丹明B和德克萨斯红)。
在一些实施方式中，荧光团包括但不限于ATTO染料；吖啶染料(例如，吖啶橙、吖啶黄)；Alexa Fluor；7-氨基放线菌素D；8-苯胺基萘-1-磺酸盐；金胺-罗丹明染色剂；苯并蒽酮；5,12-双(苯乙炔基)并四苯；9,10-双(苯乙炔基)蒽；黑光漆；脑虹；钙黄绿素；羧基荧光素；羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯；羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；1-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽；2-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽；2-氯-9,10-二苯基蒽；香豆素；花菁染料(例如，花菁如Cy3和Cy5、DiOC6、SYBR Green I)；DAPI、Dark quencher、DyLight Fluor、Fluo-4、FluoProbes；荧光酮染料(例如，钙黄绿素、羧基荧光素、羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、曙红、曙红B、曙红Y、赤藓红、荧光素、异硫氰酸荧光素、荧光素亚膦酰胺、印度黄、汞溴红)Fluoro-Jade染色剂；Fura-2；Fura-2-乙酰氧基甲酯；绿色荧光蛋白、Hoechst染色剂、印度黄、Indo-1、萤光黄、萤光素、部花菁、光学增白剂、噁嗪类染料(例如，甲酚紫，尼罗蓝，尼罗红)；二萘嵌苯；菲啶染料(溴化乙锭和碘化丙啶)；荧光桃红，藻胆素，藻红蛋白，藻红素，羟基芘磺酸，罗丹明，罗丹明123，罗丹明6G，RiboGreen，RoGFP，红荧烯，SYBR GreenI，(E)-二苯乙烯，(Z)-二苯乙烯，磺基罗丹明101，磺基罗丹明B，Synapto-pHluorin，四苯基丁二烯，四钠三(红菲绕啉二磺酸)钌(II)、德克萨斯红、TSQ、伞形酮或黄色荧光蛋白。
在一些实施方式中，荧光基团包括但不限于荧光染料的Alexa Fluor家族(Molecular Probes，Oregon)。Alexa Fluor染料在荧光显微术和细胞生物学中广泛用作细胞和组织标记。Alexa Fluor系列的激发和发射光谱覆盖可见光谱并延伸到红外光谱。该家族的各个成员大致根据其激发最大值(以nm为单位)进行编号。某些Alexa Fluor染料通过香豆素、罗丹明、氧杂蒽(如荧光素)和花菁素染料的磺化而合成。在一些实施方式中，磺化使得Alexa Fluor染料带负电荷且亲水。在一些实施方式中，Alexa Fluor染料比具有相当的激发和发射的常见染料(例如荧光素、罗丹明)以及在某种程度上更新的青色素系列更稳定、更亮并且pH敏感性更低。示例性Alexa Fluor染料包括但不限于Alexa-350、Alexa-405、Alexa-430、Alexa-488、Alexa-500、Alexa-514、Alexa-532、Alexa-546、Alexa-555、Alexa-568、Alexa-594、Alexa-610、Alexa-633、Alexa-647、Alexa-660、Alexa-680、Alexa-700、或Alexa-750。
在一些实施方式中，荧光基团包括荧光染料的DyLight Fluor家族(Dyomics和Thermo Fisher Scientific)中的一种或多种。示例性DyLight Fluor家族染料包括但不限于DyLight-350、DyLight-405、DyLight-488、DyLight-549、DyLight-594、DyLight-633、DyLight-649、DyLight-680、DyLight-750或DyLight-800。
在一些实施方式中，荧光基团包含纳米材料。在一些实施方式中，荧光基团是纳米颗粒。在一些实施方式中，荧光基团是或包含量子点。在一些实施方式中，荧光基团是量子点。在一些实施方式中，荧光基团包含量子点。在一些实施方式中，荧光基团是或包含金纳米颗粒。在一些实施方式中，荧光基团是金纳米颗粒。在一些实施方式中，荧光基团包含金纳米颗粒。
洗涤
在一些实施方式中，前述实施方式中任一个的方法包括任选地在每个步骤后洗涤样品。在某些实施方式中，用去除非特异性杂交反应的缓冲液洗涤样品。在某些实施方式中，在洗涤步骤中使用甲酰胺。在某些实施方式中，洗涤缓冲液是严格的。在某些实施方式中，洗涤缓冲液包含10％甲酰胺、2x SSC和0.1％tritonX-100s。
已经详细描述了实施方式，将显而易见的是，在不脱离所附权利要求中限定的范围的情况下，修改、变化和等同实施方式是可能的。此外，应当理解，本公开中的所有示例都是作为非限制性示例提供的。
提供以下非限制性方法和实施例以进一步说明本文所公开的实施方式。本领域技术人员应当理解，在以下方法和实施例中公开的技术代表已经发现在实践中良好发挥作用的方法，并因此可以被认为构成用于其实践模式的示例。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离实施方式的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方式中进行许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果。
提供以下非限制性方法以进一步说明本文公开的本发明的实施方式。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表已经发现在本发明的几个实施方式的实践中良好发挥作用的方法，并因此被认为构成用于其实践模式的示例。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方式中进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。
实施例
实施例1
如图2所示。使可检测标记探针与初级探针杂交，该初级探针与小鼠NIH/3T3成纤维细胞中的真核延伸因子2(Eef2)mRNA杂交，并用共焦显微镜成像。
Eef2 mRNA被通过LANTERN放大的初级探针靶向。具有不同比率的可检测标记探针的竞争性结合在每个RNA分子上产生比率计量符号。
实施例2
如图5所示，在单个细胞中进行比率计量条形码化。通过6x6比率计量条形码化方案展示了36个条形码。
使用具有用于LANTERN放大的放大器序列的初级探针靶向小鼠NIH/3T3细胞中的真核延伸因子2(Eef2)mRNA。二级LANTERN放大器的寡核苷酸序列为：GAAAGGGTCGAGTTTTTAAAAGGATTCGTGACGGCGACGTTTTGACTTTAATAAAGGAT TCGTGACGGCGACGTTTTGACTTTAAAAGTGCAATGCGAAC。
三级LANTERN放大器的寡核苷酸序列为：CGTCACGAATCCTTTAAAAAACTCGACCCTTTCGTTCGCATTGCACTTTTTAAAACTCGA CCCTTTCGTTCGCATTGCACTTTATAAGTCAAAACGTCGC。
根据这些比率(0:5、1:4、2:3、3:2、4:1、5:0)制作左侧接头和右侧接头。
左侧接头包括：
接头-1：GAAAGGGTCGAGTTTAATAGCATCCACTTCCAATCCC
接头-2：GAAAGGGTCGAGTTTAACACACTTCGCCACTCAGAAC。
右侧接头包括：
接头-1：CGATAACCTAACCGTGCTGCTTAAGTGCAATGCGAAC
接头-2：CACTGGTGATAACGCTAACCTTAAGTGCAATGCGAAC。
将接头探针混合物与其相应的可检测标记探针一起孵育。Cy3和AF750N用于左侧可检测标记探针。Alexa488和Alexa647用于右侧可检测标记探针。
可检测标记探针包括：
/5Alex488N/TGGGATTGGAAGTGGATGCTA
/5Alex647N/GTTCTGAGTGGCGAAGTGTG
/5Alex750N/GGTTAGCGTTATCACCAGTG
/CY3 B/GCAGCACGGTTAGGTTATCG。
如图4B所示混合探针以产生编码36个比率计量符号的36种不同的读出混合物。
然后通过流体系统将混合物依次流入样品中进行杂交。杂交后，进行洗涤，并使用波长设定为730nm、647nm、561nm、488nm和405nm的激光通过荧光显微镜对样品进行成像。
使用Cy3b和AF750N通道之间的mRNA点强度比计算左侧接头比率。使用AF488和AF647通道之间的mRNA点强度比计算右侧接头比率。比率计量符号由左比率和右比率产生。
如图6A所示，构建了2D直方图，其示出了通过绘制计算的所有检测点的左侧和右侧比率的2D直方图，可以从36个条形码重新获得35个簇。此外，如图6B所示，构建了2D热图，其示出了可以通过使用对于左接头和右接头两者的0:9、1:8、2:7、3:6、4:5、5:4、6:3、7:2、8:1、9:0的浓度比来产生10个不同的比率计量符号。
实施例3
使用具有用于LANTERN放大的放大器序列的初级探针靶向小鼠NIH/3T3细胞中的真核延伸因子2(Eef 2)mRNA。设计了三种接头，以与三种荧光基团AF 647、AF 488和Cy3b的可检测标记探针相互作用。
竞争性地混合接头以与放大器序列上的相同寡核苷酸结合位点相互作用。
以这种方式，通过使用以下相对浓度比混合接头和相应的可检测标记探针来产生18个比率计量符号方案：0:1:4、0:2:3、0:3:2、0:4:1、0:5:0、1:0:4、1:2:2、1:3:1、1:4:0、2:0:3、2:1:2、2:3:0、3:0:2、3:1:1、3:2:0、4:0:1、4:1:0、5:0:0。
通过使用波长为647nm、488nm和561nm的激光对所检测的点的强度进行成像来计算比率计量符号。
结果表明，使用在不同杂交循环内在同一通道下检测的点的强度可以计算比率计量符号。该结果显示了，条形码化方案可以进一步扩展到设计接头以竞争相同的放大器结合位点。
参考文献
以下参考文献以其整体并入本文。
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Claims (67)

1.一种用比率计量符号对一种或多种分子靶标进行条形码化的方法，包括以下步骤：
(i)使包含复数个分子靶标的样品与第一复数个一种或多种初级探针接触，其中所述一种或多种初级探针与一种或多种分子靶标相互作用，并且其中每种初级探针包含针对可检测标记探针的一个或多个结合位点；
(ii)使所述一种或多种初级探针与一组或多组比率计量可检测标记探针接触；其中每组所述比率计量可检测标记探针至少包含：
与第一初级探针结合位点相互作用的第一可检测标记探针；和
与所述第一初级探针结合位点相互作用的第二可检测标记探针；
其中所述第一可检测标记探针的标记不同于所述第二可检测标记探针的标记；以及其中所述第一可检测标记探针和所述第二可检测标记探针以预先确定的比率与所述第一初级探针结合位点接触。
(iii)对于每组比率计量可检测标记探针，对不同通道之间的不同可检测标记的强度进行成像以确定不同的比率，以便检测所述可检测标记探针与其初级探针的相互作用；
(iv)为每个比率产生比率计量符号；以及
(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)，每次使用一组或多组可检测标记探针，
以便通过条形码描述所述样品中的一种或多种分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个比率计量符号，并且其中至少一种分子靶标可以通过它们的条形码的差异而区别于所述样品中的另一种分子靶标。
2.一种用比率计量符号对一种或多种分子靶标进行条形码化的方法，包括以下步骤：
(i)使包含复数个分子靶标的样品与第一复数个一种或多种初级探针接触，其中所述一种或多种初级探针与一种或多种分子靶标相互作用，并且其中每种初级探针包含一个或多个放大器序列；
(ii)使所述一种或多种初级探针与一种或多种放大器接触以形成一种或多种放大支架，其中所述放大器包含一个或多个放大器序列，并且其中所述放大器序列包含一个或多个接头序列；
(iii)使一种或多种放大器支架与一组或多组比率计量接头探针接触；其中每组所述比率计量接头探针至少包含：
与所述放大器支架上的第一接头序列相互作用的第一接头探针；和
与所述放大器支架上的所述第一接头序列相互作用的第二接头探针；
其中，所述第一接头探针和所述第二接头探针以预先确定的比率与所述放大器支架上的所述第一接头序列接触；
(iii)使所述一组或多组比率计量接头探针与一组或多组可检测标记探针接触；其中每组所述可检测标记探针至少包含：
与第一比率计量接头探针相互作用的第一可检测标记探针；和
与第二比率计量接头探针相互作用的第二可检测标记探针；和
其中所述第一可检测标记探针的标记不同于所述第二可检测标记探针的标记；
(iv)对于每组比率计量接头探针，对不同通道之间的不同可检测标记的强度进行成像以确定不同的比率，以便检测所述接头探针与其初级探针的相互作用；
(v)为每个比率产生比率计量符号；以及
(vi)任选地重复步骤(ii)-(v)，每次使用一组或多组比率计量接头探针，
以便通过条形码描述所述样品中的一种或多种分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个比率计量符号，并且其中至少一个分子靶标可以通过它们的条形码的差异而区别于所述样品中的另一种分子靶标。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述可检测标记探针的组包含：
与第一初级探针结合位点相互作用的第三可检测标记探针；和
其中所述第三可检测标记探针的标记不同于所述第一第二可检测标记探针或所述第二可检测标记探针的标记；并且其中所述第一可检测标记探针、所述第二可检测标记探针和所述第三可检测标记探针以预先确定的比率与所述第一初级探针结合位点接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述比率计量可检测标记探针的组包含：
与第一初级探针结合位点相互作用的第四可检测标记的探针；和
其中所述第四可检测标记探针的标记不同于所述第一可检测标记探针、所述第二可检测标记探针或所述第三可检测标记探针的标记；并且其中所述第一可检测标记探针、所述第二可检测标记探针和所述第三可检测标记探针以预先确定的比率与所述第一初级探针结合位点接触。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(ii)与2、3、4、5、6、7或8组比率计量可检测标记探针接触。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤(iii)与2、3、4、5、6、7或8组比率计量接头探针接触。
7.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，包括在步骤(ii)之前通过滚环、挂锁、分支DNA、ClampFISH、LANTERN或其任意组合放大所述初级探针。
8.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述靶标选自转录物、RNA、DNA基因座、染色体、DNA、蛋白质、脂质、聚糖、细胞靶标、细胞器及其任意组合。
9.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述初级探针选自蛋白质、修饰的蛋白质、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片段及其组合。
10.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，每个初级探针包含与靶核酸序列互补的核酸序列。
11.根据权利要求10所述的序列互补性，其中，所述序列互补性的百分比至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
12.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述可检测标记探针选自蛋白质、修饰的蛋白质、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片段及其组合。
13.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，每个可检测标记探针包含与针对可检测标记探针的初级探针结合位点互补的核酸序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述序列互补性的百分比至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述可检测标记探针包含具有相同序列的寡核苷酸。
16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述可检测标记探针包含具有不同序列的寡核苷酸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述可检测标记探针包含长度至少为17个核苷酸的寡核苷酸。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中，所述可检测标记探针通过一种或多种中间探针与所述初级探针上的结合位点相互作用。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述中间探针选自蛋白质、修饰的蛋白质、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片段及其组合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述中间探针为寡核苷酸。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述中间探针杂交至初级探针。
22.根据权利要求18-21所述的方法，其中，每个中间探针包含与所述初级探针互补的序列和突出端序列。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述突出端序列与可检测标记探针互补。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述突出端序列与桥接探针互补。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述桥接探针与可检测标记探针互补并与中间探针互补。
26.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，通过使用不同浓度的可检测标记探针直接或间接竞争所述初级探针上的所述结合位点以产生所述比率计量符号。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述可检测标记探针的不同浓度是所述可检测标记探针的不同比率。
28.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，任意两种可检测标记探针之间的每个预先确定的比率大于或等于0.0。
29.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，任意两种可检测标记探针之间的每个预先确定的比率小于或等于1.0。
30.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，任意两种可检测标记探针之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。
31.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，三种可检测标记探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。
32.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，四种或更多种三种可检测标记探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。
33.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，五种、六种、七种或八种或更多种可检测标记探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。
34.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，任意两种可检测标记探针之间的每个预先确定的比率为约0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9或1.0。
35.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，任意三种探针之间的每个预先确定的比率为0.10:0.20:0.70；0.25:0.25:0.50；0.25:0.50:0.25；0.50:0.25:0.25；或0.70:0.20:0.10。
36.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，任意四种探针之间的每个预先确定的比率为0.10:0.10:0.10:0.70；0.10:0.20:0.20:0.50；0.25:0.25:0.25:0.25；0.50:0.20:0.20:0.10；0.70:0.10:0.10:0.10。
37.根据权利要求2所述的方法，其中，所述接头探针是中间探针。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述接头探针选自蛋白质、修饰的蛋白质、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片段及其组合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述接头探针是寡核苷酸。
40.根据权利要求18所述的方法，其中，所述接头探针杂交至放大器支架。
41.根据权利要求39-40所述的方法，其中，每个接头探针包含与所述初级探针互补的序列和突出端序列。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述突出端序列与可检测标记探针互补。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述突出端序列与桥接探针互补。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述桥接探针与可检测标记探针互补并与接头探针互补。
45.根据权利要求2所述的方法，其中，通过使用不同浓度的比率计量接头探针直接或间接竞争所述放大器支架上的结合位点以产生所述比率计量符号。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述比率计量接头探针的不同浓度是不同比率。
47.根据权利要求2所述的方法，其中，任意两种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率大于或等于0.0。
48.根据权利要求2所述的方法，其中，任意两种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率小于或等于1.0。
49.根据权利要求2所述的方法，其中，任意两种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。
50.根据权利要求2所述的方法，其中，三种比率计量接头探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。
51.根据权利要求2所述的方法，其中，四种或更多种比率计量接头探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。
52.根据权利要求2所述的方法，其中，五种、六种、七种、八种或更多种比率计量接头探针中的任意两种之间的每个预先确定的比率在约0.0至1.0之间。
53.根据权利要求2所述的方法，其中，任意两种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率为约0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9或1.0。
54.根据权利要求2所述的方法，其中，任意三种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率为0.10:0.20:0.70；0.25:0.25:0.50；0.25:0.50:0.25；0.50:0.25:0.25；或0.70:0.20:0.10。
55.根据权利要求2所述的方法，其中，任意四种比率计量接头探针之间的每个预先确定的比率为0.10:0.10:0.10:0.70；0.10:0.20:0.20:0.50；0.25:0.25:0.25:0.25；0.50:0.20:0.20:0.10；0.70:0.10:0.10:0.10。
56.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括以下步骤：
(vi)使包含复数个分子靶标的样品与第一复数个可检测标记探针接触，所述第一复数个可检测标记探针至少包含：
(i)与第一分子靶标相互作用的第一可检测标记探针；和
(ii)与第二分子靶标相互作用的第二可检测标记探针；
其中，所述第一可检测标记探针不同于所述第二可检测标记探针；
(vii)在所述第一接触步骤后对所述样品成像，以便检测所述可检测标记探针与其靶核酸的相互作用；
(viii)为每个分子靶标产生非比率计量符号；以及
(ix)重复所述接触和成像步骤，每次用新的复数个可检测标记探针来进行，以便通过条形码描述所述样品中的分子靶标，其中至少一个条形码包含至少一个非比率计量符号和至少一个比率计量符号，并且其中所述条形码可以通过其条形码的差异而区别于所述样品中的另一靶核酸。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，在产生所述比率计量符号之前产生所述非比率计量符号。
58.根据权利要求56所述的方法，其中，在产生所述比率计量符号期间产生所述非比率计量符号。
59.根据权利要求56所述的方法，其中，在产生所述比率计量符号之后产生所述非比率计量符号。
60.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述条形码包含比率计量符号、非比率计量符号及其任意组合。
61.根据权利要求62所述的方法，其中，所述条形码包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个比率计量符号。
62.根据权利要求62所述的方法，其中，所述条形码包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、8、9、或10个非比率计量符号。
63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在每个步骤之后对所述样品进行洗涤。
64.根据权利要求65所述的方法，其中，用去除非特异性杂交反应的缓冲液洗涤所述样品。
65.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包含误差校正步骤。
66.根据权利要求67所述的方法，其中，所述误差校正步骤包括在所述步骤(i)-(v)之前或之间或之后执行额外轮次的接触和成像。
67.根据权利要求1所述的方法，其中，所述比率计量符号的分配包括应用机器学习算法。
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