JP2002538836A - 遺伝子発現の変化の分析 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、発現の変化または２種の検体の存在を検出するための方法、並びに、より特に、迅速で効率的な生物系での遺伝子発現の分析を提供する手法を提供する。特に、本発明は、２種の起源の核酸の相違を検出、分析する方法を提供し、その方法は：ａ．２種の起源のからの核酸を標識したプローブとして用意し、ｂ．標識したプローブとプールした試薬の混合物を形成し(ここで、各試薬はポリヌクレオチド標的を担持するビーズの集団であり、ある試薬の標的は他の試薬の標的と異なり、ある試薬のビーズを他の試薬のビーズから識別することができる)、ｃ．プローブと試薬の特異的ハイブリダイゼーションを促進する条件下で混合物をインキュベートし、ｄ．混合物中のビーズをフローサイトメトリーによって分析することを含む。
Description
【０００１】 本発明は、２種のアナライトの発現または存在の変化を検出するための方法、
より特に、生物系における遺伝子発現の迅速かつ効率的な分析を提供する手法に
関する。 細胞内遺伝子発現の分析は、生物体の機能の理解を得ることおよび重要細胞内
事象を制御する機構を解明するための鍵であり、細胞内制御過程の崩壊から生じ
る病状の処置のための戦略および薬物を展開するのに重要である。
より特に、生物系における遺伝子発現の迅速かつ効率的な分析を提供する手法に
関する。 細胞内遺伝子発現の分析は、生物体の機能の理解を得ることおよび重要細胞内
事象を制御する機構を解明するための鍵であり、細胞内制御過程の崩壊から生じ
る病状の処置のための戦略および薬物を展開するのに重要である。
【０００２】 ｍＲＮＡ発現レベルにおいてまたは細胞内に存在する特定のタンパク質の量を
調査することによって、遺伝子発現を分析する様々な方法が、開発されてきた。
ほとんどの方法は、発現の変化を調査するという点で同じ実験的基礎を有してい
る；すなわち、異なる条件に曝露されてきた２種の細胞の間の１以上の細胞内構
成要素の発現における相違を調査する。このような試験は、典型的には、未処置
集団の細胞(コントロール細胞)における発現レベルと、ある形の刺激、例えば、
ホルモン、薬物または他の化学物質へ曝露されてきた同じ細胞型(試験細胞)の別
の集団における発現レベルを比較する。
調査することによって、遺伝子発現を分析する様々な方法が、開発されてきた。
ほとんどの方法は、発現の変化を調査するという点で同じ実験的基礎を有してい
る；すなわち、異なる条件に曝露されてきた２種の細胞の間の１以上の細胞内構
成要素の発現における相違を調査する。このような試験は、典型的には、未処置
集団の細胞(コントロール細胞)における発現レベルと、ある形の刺激、例えば、
ホルモン、薬物または他の化学物質へ曝露されてきた同じ細胞型(試験細胞)の別
の集団における発現レベルを比較する。
【０００３】 遺伝子発現の変化の分析のための初期の方法は、主として電気泳動ゲル上の(
しばしばわからない)ｍＲＮＡバンドの分析に基づいていた。このようなアプロ
ーチは、多数の特定の配列を整列されたパターンで固体の表面上に据えて、試験
中の細胞に由来する標識したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのハイブリダイゼーション
および捕捉のための標的を形成する核酸のアレイ(array)の使用に基づくより強
力で再現性があり有益な方法によって広くおきかえられてきた。このようなアレ
イを、ナイロン膜やガラスやシリコンウエハーのような様々な支持体上に構築す
る。支持体が何であれ、使用される本質的な方法は同じである：最初に、既知の
、細胞内ｍＲＮＡと相補的で、合成オリゴヌクレオチドの形でまたはＰＣＲ産物
としての配列を、特定の位置にスポット状に固体支持体上に据える。これらの固
定された配列(標的)を、次に、試験中の細胞または組織から抽出された配列(プ
ローブ)に曝露する。ここで、プローブは、次の分析において検出できるある種
のラベルで標識されている。
しばしばわからない)ｍＲＮＡバンドの分析に基づいていた。このようなアプロ
ーチは、多数の特定の配列を整列されたパターンで固体の表面上に据えて、試験
中の細胞に由来する標識したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのハイブリダイゼーション
および捕捉のための標的を形成する核酸のアレイ(array)の使用に基づくより強
力で再現性があり有益な方法によって広くおきかえられてきた。このようなアレ
イを、ナイロン膜やガラスやシリコンウエハーのような様々な支持体上に構築す
る。支持体が何であれ、使用される本質的な方法は同じである：最初に、既知の
、細胞内ｍＲＮＡと相補的で、合成オリゴヌクレオチドの形でまたはＰＣＲ産物
としての配列を、特定の位置にスポット状に固体支持体上に据える。これらの固
定された配列(標的)を、次に、試験中の細胞または組織から抽出された配列(プ
ローブ)に曝露する。ここで、プローブは、次の分析において検出できるある種
のラベルで標識されている。
【０００４】 初期の方法において、サザンおよびノーザンブロッティング法から開発された
方法を使用し、放射性ラベルを使用して、ナイロン膜上の標的を探索した。しか
し、これらの方法は、ハイブリダイゼーション過程を２回実施することを必要と
した。その１回は、コントロールサンプルについて、１回は試験サンプルについ
てである。これらは、コントロールと試験プローブを標識するための色が異なる
蛍光体(coloured fluorophor)を使用することに基づき、ガラスに結合したＰＣ
Ｒ産物(Schena M. et al,(1996), Proc. Natl. Acad. Sci., 93(20), 10614-106
19)またはフォトリソグラフ法を使用してガラス上に直接合成されるオリゴヌク
レオチド(Chee M. et al, (1996), Science 274(5287),610-61)を使用して、一
般に「マイクロアレイ」と呼ばれるものを形成するより洗練された方法によって段
々ととってかわられた。
方法を使用し、放射性ラベルを使用して、ナイロン膜上の標的を探索した。しか
し、これらの方法は、ハイブリダイゼーション過程を２回実施することを必要と
した。その１回は、コントロールサンプルについて、１回は試験サンプルについ
てである。これらは、コントロールと試験プローブを標識するための色が異なる
蛍光体(coloured fluorophor)を使用することに基づき、ガラスに結合したＰＣ
Ｒ産物(Schena M. et al,(1996), Proc. Natl. Acad. Sci., 93(20), 10614-106
19)またはフォトリソグラフ法を使用してガラス上に直接合成されるオリゴヌク
レオチド(Chee M. et al, (1996), Science 274(5287),610-61)を使用して、一
般に「マイクロアレイ」と呼ばれるものを形成するより洗練された方法によって段
々ととってかわられた。
【０００５】 両方の方法において、コントロールおよび試験細胞または組織から抽出された
ｍＲＮＡ配列を、直接標識するかまたは最初に変換または増幅し、次いで、標識
された対応するｃＤＮＡ配列を得る。アレイ上に位置する相補的標的配列にハイ
ブリダイゼーションによって固定されると、プローブに結合した蛍光ラベルをス
キャンニングまたはイメージングによって検出、定量して、試験およびコントロ
ールサンプルに含まれる様々なｍＲＮＡの量のデータを得る。試験およびコント
ロール細胞からの配列は、異なる蛍光体で標識されているので、両方のサンプル
を同時に適用、ハイブリダイズし、ハイブリダイズしたプローブの得られたパタ
ーンおよび強度を、使用された蛍光体の発光波長を区別するよう調整された検出
機器を使用して決定する。
ｍＲＮＡ配列を、直接標識するかまたは最初に変換または増幅し、次いで、標識
された対応するｃＤＮＡ配列を得る。アレイ上に位置する相補的標的配列にハイ
ブリダイゼーションによって固定されると、プローブに結合した蛍光ラベルをス
キャンニングまたはイメージングによって検出、定量して、試験およびコントロ
ールサンプルに含まれる様々なｍＲＮＡの量のデータを得る。試験およびコント
ロール細胞からの配列は、異なる蛍光体で標識されているので、両方のサンプル
を同時に適用、ハイブリダイズし、ハイブリダイズしたプローブの得られたパタ
ーンおよび強度を、使用された蛍光体の発光波長を区別するよう調整された検出
機器を使用して決定する。
【０００６】 この結果、これらの２種の色の方法によって、２種の細胞集団の間のｍＲＮＡ
の発現の変化を直接視覚化することができ、遺伝子発現の制御および結果を研究
するライフサイエンスリサーチの多くの分野において広く使用される。 しかし、これらの方法は比較的簡単で洗練されているにもかかわらず、オペレ
ーションにおいて、遺伝子発現の分析のための方法の適用の容易さおよび速度を
制限する多くの技術的困難がある。標的アレイを構築することは、時間を消費し
、正確な技術を要し、しばしば高価につく過程である；光制御(light directed)
オリゴヌクレオチド合成に要するマスクの構築およびアラインメント、またはＤ
ＮＡアレイのための液体のナノリットル小滴の正確な適用のためである。ＤＮＡ
スポットに基づくアレイは、小容量の不等使用あるいは乾燥によって生ずる人為
的問題があり、正確なデータを得るために反復スポットをしばしば要する。いず
れの型のアレイにおいても、使用者は、その実験を変更してさらなる配列を含ま
せることを望むなら、アレイ全体を新しい標的に適応させるように構築しなけれ
ばならない。単に、単一の新しい配列を前に存在する何千もの配列のライブラリ
ーに付加するために、全く新しいアレイを製造しなければならないことは珍しい
ことではない。
の発現の変化を直接視覚化することができ、遺伝子発現の制御および結果を研究
するライフサイエンスリサーチの多くの分野において広く使用される。 しかし、これらの方法は比較的簡単で洗練されているにもかかわらず、オペレ
ーションにおいて、遺伝子発現の分析のための方法の適用の容易さおよび速度を
制限する多くの技術的困難がある。標的アレイを構築することは、時間を消費し
、正確な技術を要し、しばしば高価につく過程である；光制御(light directed)
オリゴヌクレオチド合成に要するマスクの構築およびアラインメント、またはＤ
ＮＡアレイのための液体のナノリットル小滴の正確な適用のためである。ＤＮＡ
スポットに基づくアレイは、小容量の不等使用あるいは乾燥によって生ずる人為
的問題があり、正確なデータを得るために反復スポットをしばしば要する。いず
れの型のアレイにおいても、使用者は、その実験を変更してさらなる配列を含ま
せることを望むなら、アレイ全体を新しい標的に適応させるように構築しなけれ
ばならない。単に、単一の新しい配列を前に存在する何千もの配列のライブラリ
ーに付加するために、全く新しいアレイを製造しなければならないことは珍しい
ことではない。
【０００７】 ハイブリダイゼーション過程には、システムの構造およびハイブリダイゼーシ
ョン過程に必要な温度から生ずる多くの問題がある。低レベルのｍＲＮＡを検出
する十分な感度を得るために、標的配列に対する最大のハイブリダイゼーション
を達成するために高濃度の標識したプローブを使用することが必要である；この
必要性および利用可能なプローブ材料の限られた量のために、実施されるハイブ
リダイゼーション反応は非常に小規模となる。したがって、マイクロリットルの
量の溶液でアレイの十分な適用範囲を確保することの困難性が生じ、得られた薄
い液体フィルムは、可動のプローブ配列が固定された標的配列へ良好にアクセス
するのを促進しない；一般にハイブリダイゼーションに使用される４０℃ないし
６５℃の温度においては、蒸発によるさらなる問題も常在する。
ョン過程に必要な温度から生ずる多くの問題がある。低レベルのｍＲＮＡを検出
する十分な感度を得るために、標的配列に対する最大のハイブリダイゼーション
を達成するために高濃度の標識したプローブを使用することが必要である；この
必要性および利用可能なプローブ材料の限られた量のために、実施されるハイブ
リダイゼーション反応は非常に小規模となる。したがって、マイクロリットルの
量の溶液でアレイの十分な適用範囲を確保することの困難性が生じ、得られた薄
い液体フィルムは、可動のプローブ配列が固定された標的配列へ良好にアクセス
するのを促進しない；一般にハイブリダイゼーションに使用される４０℃ないし
６５℃の温度においては、蒸発によるさらなる問題も常在する。
【０００８】 最終的に、マイクロアレイ上での蛍光体標識されたプローブの検出および定量
には、非常に低レベルの蛍光の存在を検出するための専用の洗練された装置を要
する。要求される感度を達成するために、スキャンニングレーザースポットを使
用し、蛍光体分子を励起して検出を最も一般的には実施する；これは、単一のア
レイの測定を完成するために数時間までも要する非常にゆっくりとした過程であ
り得る。
には、非常に低レベルの蛍光の存在を検出するための専用の洗練された装置を要
する。要求される感度を達成するために、スキャンニングレーザースポットを使
用し、蛍光体分子を励起して検出を最も一般的には実施する；これは、単一のア
レイの測定を完成するために数時間までも要する非常にゆっくりとした過程であ
り得る。
【０００９】 本発明は、遺伝子発現の分析のためのマイクロアレイシステムに代わるものを
提供する。整列された２Ｄアレイをランダムに配向された３Ｄアレイで置きかえ
る粒子に基づく技術(迅速に容易に新しい標的配列を含むように修飾することが
できる)を使用して分析を実施する手段を提供する。本方法は、効率的なハイブ
リダイゼーションを促進するために好適な空間的および動力学的特性を提供し、
それは、標準的反応チューブにおいて実施でき、数千の標的配列にハイブリダイ
ズしたプローブの測定を数秒内で可能とする。
提供する。整列された２Ｄアレイをランダムに配向された３Ｄアレイで置きかえ
る粒子に基づく技術(迅速に容易に新しい標的配列を含むように修飾することが
できる)を使用して分析を実施する手段を提供する。本方法は、効率的なハイブ
リダイゼーションを促進するために好適な空間的および動力学的特性を提供し、
それは、標準的反応チューブにおいて実施でき、数千の標的配列にハイブリダイ
ズしたプローブの測定を数秒内で可能とする。
【００１０】 本発明は、２種の起源の核酸の相違を検出、分析する方法を提供し、その方法
は： a.標識したプローブとして２種の起源からの核酸を用意する； b.標識したプローブとプールした試薬の混合物を形成し、ここで、各試薬は、ポ
リヌクレオチド標的を担持するビーズの集団であり、ある試薬の標的は他の試薬
の標的と異なり、ある試薬のそのビーズは他の試薬のそのビーズと識別できる； c.プローブと標的の間の特異的ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、混
合物をインキュベートする； d.混合物中のビーズをフローサイトメトリーによって分析する ことを含む。 ポリヌクレオチド標的は、一部または全部が一本鎖であり、特異的ハイブリダ
イゼーションが可能である。少なくとも８残基のオリゴヌクレオチドが好ましい
。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって、細胞内ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ配列
が好ましい。
は： a.標識したプローブとして２種の起源からの核酸を用意する； b.標識したプローブとプールした試薬の混合物を形成し、ここで、各試薬は、ポ
リヌクレオチド標的を担持するビーズの集団であり、ある試薬の標的は他の試薬
の標的と異なり、ある試薬のそのビーズは他の試薬のそのビーズと識別できる； c.プローブと標的の間の特異的ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、混
合物をインキュベートする； d.混合物中のビーズをフローサイトメトリーによって分析する ことを含む。 ポリヌクレオチド標的は、一部または全部が一本鎖であり、特異的ハイブリダ
イゼーションが可能である。少なくとも８残基のオリゴヌクレオチドが好ましい
。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって、細胞内ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ配列
が好ましい。
【００１１】 プールした試薬は、各試薬の１個のビーズまたは好ましくは複数個のビーズを
含み得る。 本発明の特徴は： a)遺伝子発現検定を担体ビーズ上で実施する； b)それぞれ同定可能なビーズまたは異なる標的配列をそれぞれ担持するビーズの
集団を調製する； c)選択されたビーズまたはビーズの集団を懸濁物中にともにプールし、それぞれ
の調査のための所望のすべての配列を担持する粒子のランダムに配向された３Ｄ
アレイを用意する； d)コントロールおよび試験細胞または組織から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ
を蛍光標識で標識し、それらの起源を同定する； e)標識したプローブの種類を、ビーズを担持する標的のプールした懸濁物と、プ
ローブと標的の特異的ハイブリダイゼーションを促進する条件下で混合する； f)ビーズの混合物をフローサイトメトリーによって分析し、分析した各ビーズの
同一性(つまりビーズによって担持される標的配列の同一性)を同時に決定し、各
ビーズに結合したコントロールおよび試験プローブの両方の量を定量する；並び
に g)データを分析して、コントロールおよび試験サンプル中の各ｍＲＮＡの相対的
、絶対的存在量の情報を得る ことを含む。 ある試薬のビーズを他の試薬のビーズから、多くの様々な手段によって識別で
きる。適当な識別手段は、大きさ、色もしくは蛍光における相違またはビーズに
結合したマーカーの性質もしくは濃度を含む。ある試薬のビーズを１以上の手段
を使用して他の試薬のビーズから識別することができる。
含み得る。 本発明の特徴は： a)遺伝子発現検定を担体ビーズ上で実施する； b)それぞれ同定可能なビーズまたは異なる標的配列をそれぞれ担持するビーズの
集団を調製する； c)選択されたビーズまたはビーズの集団を懸濁物中にともにプールし、それぞれ
の調査のための所望のすべての配列を担持する粒子のランダムに配向された３Ｄ
アレイを用意する； d)コントロールおよび試験細胞または組織から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ
を蛍光標識で標識し、それらの起源を同定する； e)標識したプローブの種類を、ビーズを担持する標的のプールした懸濁物と、プ
ローブと標的の特異的ハイブリダイゼーションを促進する条件下で混合する； f)ビーズの混合物をフローサイトメトリーによって分析し、分析した各ビーズの
同一性(つまりビーズによって担持される標的配列の同一性)を同時に決定し、各
ビーズに結合したコントロールおよび試験プローブの両方の量を定量する；並び
に g)データを分析して、コントロールおよび試験サンプル中の各ｍＲＮＡの相対的
、絶対的存在量の情報を得る ことを含む。 ある試薬のビーズを他の試薬のビーズから、多くの様々な手段によって識別で
きる。適当な識別手段は、大きさ、色もしくは蛍光における相違またはビーズに
結合したマーカーの性質もしくは濃度を含む。ある試薬のビーズを１以上の手段
を使用して他の試薬のビーズから識別することができる。
【００１２】 明確のために、後記の図を参照して本発明を説明する。 図１は、２Ｄ整列されたアレイおよび３Ｄランダムアレイの概略図である。 図２は、ビーズに基づくフローサイトメトリー遺伝子発現法の原理を示すフロー
チャートである。 図３は、ビーズに基づくフローサイトメトリー遺伝子発現法の概略図である。 図４は、ＬＰＳ刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦおよびＧＡＰＤＦ遺伝子
の発現の変化の分析方法の概略図である。
チャートである。 図３は、ビーズに基づくフローサイトメトリー遺伝子発現法の概略図である。 図４は、ＬＰＳ刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦおよびＧＡＰＤＦ遺伝子
の発現の変化の分析方法の概略図である。
【００１３】 図１によれば、二次元整列したアレイにおいて、平面表面上に固定した各標的
スポットの位置を、ｘ、ｙ座標によって定義し、標的配列をこの座標によって同
定する。これに対して、次元ｘ、ｙ、ｚによって定義された空間中に散在した粒
子で形成された３Ｄアレイにおいて、各粒子が独立的にある固有の特徴によって
同定可能であるならば、各ビーズの同一性を特定するためにｘ、ｙ、ｚ位置を使
用することは必要ではなく、粒子を液体におけるビーズの懸濁物のように空間全
体にランダムに分配することができる。各ビーズがそれぞれ同定可能であるなら
ば、それより前にそのビーズに結合した任意の標的配列も同定可能ということに
なる。したがって、多くの様々なビーズまたは別々のビーズの集団をそれぞれ調
製すれば(ここで、各ビーズが様々な標的配列を担持して、次に選択的にプール
される)、プールされたビーズは３Ｄアレイを形成して、それを遺伝子発現分析
のために使用できる。
スポットの位置を、ｘ、ｙ座標によって定義し、標的配列をこの座標によって同
定する。これに対して、次元ｘ、ｙ、ｚによって定義された空間中に散在した粒
子で形成された３Ｄアレイにおいて、各粒子が独立的にある固有の特徴によって
同定可能であるならば、各ビーズの同一性を特定するためにｘ、ｙ、ｚ位置を使
用することは必要ではなく、粒子を液体におけるビーズの懸濁物のように空間全
体にランダムに分配することができる。各ビーズがそれぞれ同定可能であるなら
ば、それより前にそのビーズに結合した任意の標的配列も同定可能ということに
なる。したがって、多くの様々なビーズまたは別々のビーズの集団をそれぞれ調
製すれば(ここで、各ビーズが様々な標的配列を担持して、次に選択的にプール
される)、プールされたビーズは３Ｄアレイを形成して、それを遺伝子発現分析
のために使用できる。
【００１４】 本発明の方法における使用のために適当なビーズは、フローサイトメトリーに
よる分析中に容易に同定することのできるものである。そのようなビーズは先に
開発され、診断検定に使用して、イムノアッセイによって血液および他の生物性
流体における広範囲の検体を測定する。より高い処理量を得るため本出願人は、
マルチプレックス法を開発し、それによれば、１より多い検体をフローサイトメ
トリー分析によって同時に測定することが可能である。マルチプレックスは、プ
ラスチックまたはラテックスビーズを検定基質として使用する固相結合検定を実
施することによって達成する。各ビーズ型がある検定のための試薬を担持してい
る場合、それぞれお互いに識別できる多くの別々のビーズ型を使用することによ
って、標準的フローサイトメトリー機器を使用して、ビーズ型を同定し、各ビー
ズと会合した検定シグナルを測定し得る。ビーズ集団の区別を、大きさによって
(Frengen J. et al(1995), Journal of Immunological Methods, Volume 178, p
141)、色もしくは蛍光によって(Fulwyier M.J. UK Patent 1,561,042)または電
子的手段によって(Mandecki W. US Patent 5,641,634)達成することができる。
よる分析中に容易に同定することのできるものである。そのようなビーズは先に
開発され、診断検定に使用して、イムノアッセイによって血液および他の生物性
流体における広範囲の検体を測定する。より高い処理量を得るため本出願人は、
マルチプレックス法を開発し、それによれば、１より多い検体をフローサイトメ
トリー分析によって同時に測定することが可能である。マルチプレックスは、プ
ラスチックまたはラテックスビーズを検定基質として使用する固相結合検定を実
施することによって達成する。各ビーズ型がある検定のための試薬を担持してい
る場合、それぞれお互いに識別できる多くの別々のビーズ型を使用することによ
って、標準的フローサイトメトリー機器を使用して、ビーズ型を同定し、各ビー
ズと会合した検定シグナルを測定し得る。ビーズ集団の区別を、大きさによって
(Frengen J. et al(1995), Journal of Immunological Methods, Volume 178, p
141)、色もしくは蛍光によって(Fulwyier M.J. UK Patent 1,561,042)または電
子的手段によって(Mandecki W. US Patent 5,641,634)達成することができる。
【００１５】 ここで、本発明の方法の一般的な原理を、図２によって説明する。選択された
標的ｃＤＮＡ配列を、標的配列をビーズに結合させることのできる手段を含む標
準的ＰＣＲ法によって調製する。ある適当な方法は、５’ビオチンをＰＣＲプラ
イマーの１つにおいて使用して、ストレプトアビジンコートしたビーズに結合す
るのに適した５’ビオチン化したＤＮＡを得る。当業者は、別の化学的結合方法
を利用できることがわかる。そのような別の方法は、例えば、５’末端にアミノ
基等の化学基を有するオリゴヌクレオチドを合成して、それを、例えば、カルボ
キシル基を表面上に有するように修飾されたビーズと架橋するのに適するように
させる方法を含み得る。末端のビオチンまたは他の結合基を有する合成されたオ
リゴヌクレオチドを、ＰＣＲ生成されたＤＮＡ配列の代わりに容易に使用し得る
こともわかる。
標的ｃＤＮＡ配列を、標的配列をビーズに結合させることのできる手段を含む標
準的ＰＣＲ法によって調製する。ある適当な方法は、５’ビオチンをＰＣＲプラ
イマーの１つにおいて使用して、ストレプトアビジンコートしたビーズに結合す
るのに適した５’ビオチン化したＤＮＡを得る。当業者は、別の化学的結合方法
を利用できることがわかる。そのような別の方法は、例えば、５’末端にアミノ
基等の化学基を有するオリゴヌクレオチドを合成して、それを、例えば、カルボ
キシル基を表面上に有するように修飾されたビーズと架橋するのに適するように
させる方法を含み得る。末端のビオチンまたは他の結合基を有する合成されたオ
リゴヌクレオチドを、ＰＣＲ生成されたＤＮＡ配列の代わりに容易に使用し得る
こともわかる。
【００１６】 必要な数の標的ｃＤＮＡ(ｃＤＮＡ１ないしｃＤＮＡｎ)を調製したら、各標的
配列を対応する別々のビーズの集団(それぞれビーズ１ないしビーズｎ)に別々に
結合させる。次に、等量物を各集団から取り出し、プールし、標的配列のランダ
ムに配向された３Ｄアレイを構成するビーズの混合した懸濁物を形成する。次に
、３Ｄアレイを、２種の異なる蛍光体(それぞれFluor(蛍光体)AおよびFluor(蛍
光体)B)で標識したコントロールおよび標的細胞または組織から調製した蛍光的
に標識したプローブ(ＲＮＡまたはｃＤＮＡ)とハイブリダイズさせる。ハイブリ
ダイゼーションに続いて、混合されたビーズの集団をフローサイトメトリーによ
って分析する。各ビーズを分析するのでフローサイトメトリー検出器(detector)
からの情報を使用してビーズを同定し、Fluor(蛍光体)A(コントロールｍＲＡＮ)
およびFluor(蛍光体)B(サンプルｍＲＮＡ)の量を測定し、それらは、ビーズによ
って担持されている相補的標的配列に結合している。次に、これらの測定値によ
って、サンプル中の各ｍＲＮＡの相対的な発現を決定する。
配列を対応する別々のビーズの集団(それぞれビーズ１ないしビーズｎ)に別々に
結合させる。次に、等量物を各集団から取り出し、プールし、標的配列のランダ
ムに配向された３Ｄアレイを構成するビーズの混合した懸濁物を形成する。次に
、３Ｄアレイを、２種の異なる蛍光体(それぞれFluor(蛍光体)AおよびFluor(蛍
光体)B)で標識したコントロールおよび標的細胞または組織から調製した蛍光的
に標識したプローブ(ＲＮＡまたはｃＤＮＡ)とハイブリダイズさせる。ハイブリ
ダイゼーションに続いて、混合されたビーズの集団をフローサイトメトリーによ
って分析する。各ビーズを分析するのでフローサイトメトリー検出器(detector)
からの情報を使用してビーズを同定し、Fluor(蛍光体)A(コントロールｍＲＡＮ)
およびFluor(蛍光体)B(サンプルｍＲＮＡ)の量を測定し、それらは、ビーズによ
って担持されている相補的標的配列に結合している。次に、これらの測定値によ
って、サンプル中の各ｍＲＮＡの相対的な発現を決定する。
【００１７】 本発明の方法のさらなる説明として、図３に示すある実施態様を参照されたい
。コントロール(１)および試験(２）プローブを調製し、標準的方法を使用して
標識し、所望の標的配列を担持するビーズ(４)の混合物を含むチューブ(３)にお
いて等量物を混合し、チューブをシールする。プローブおよび標的配列のハイブ
リダイゼーションを、特異的核酸ハイブリッドを形成できると知られる熱、ｐＨ
および塩濃度条件下で、混合物をインキュベートすることによって促進する。ハ
イブリダイゼーションに続いて、ビーズ混合物を、マルチプルチャンネル蛍光検
出を使用するフローサイトメトリーによって分析する。示した実施態様において
、２種の蛍光チャンネルを使用して、ビーズを同定し、２種のさらなるチャンネ
ルを使用して、コントロールおよび試験プローブの蛍光を測定する。フローサイ
トメーターを通して通過する各ビーズについて、このデータによって、コントロ
ールプローブ(７)及び試験プローブ(６)についての３Ｄプロットとして表される
ことのできる一組のデータ値が得られる。ビーズの同一性を、製造中にビーズに
取り込まれた２種の異なる蛍光体(ビーズFluor(蛍光体)1およびビーズFluor(蛍
光体)2)の量を測定することによって決定する。２種の蛍光体の強度をｘ、ｙ軸(
８&９)上にプロットすることによって、使用された異なるビーズ集団を区別する
。
。コントロール(１)および試験(２）プローブを調製し、標準的方法を使用して
標識し、所望の標的配列を担持するビーズ(４)の混合物を含むチューブ(３)にお
いて等量物を混合し、チューブをシールする。プローブおよび標的配列のハイブ
リダイゼーションを、特異的核酸ハイブリッドを形成できると知られる熱、ｐＨ
および塩濃度条件下で、混合物をインキュベートすることによって促進する。ハ
イブリダイゼーションに続いて、ビーズ混合物を、マルチプルチャンネル蛍光検
出を使用するフローサイトメトリーによって分析する。示した実施態様において
、２種の蛍光チャンネルを使用して、ビーズを同定し、２種のさらなるチャンネ
ルを使用して、コントロールおよび試験プローブの蛍光を測定する。フローサイ
トメーターを通して通過する各ビーズについて、このデータによって、コントロ
ールプローブ(７)及び試験プローブ(６)についての３Ｄプロットとして表される
ことのできる一組のデータ値が得られる。ビーズの同一性を、製造中にビーズに
取り込まれた２種の異なる蛍光体(ビーズFluor(蛍光体)1およびビーズFluor(蛍
光体)2)の量を測定することによって決定する。２種の蛍光体の強度をｘ、ｙ軸(
８&９)上にプロットすることによって、使用された異なるビーズ集団を区別する
。
【００１８】 単一の検定で測定できる可能な標的配列の数は、混合物中において識別できる
ビーズ集団の数によって必然的に制限を受ける。この点、現行のフローサイトメ
トリー機器については、この方法の有用性に限界を見出さない。典型的な現代の
フローサイトメトリー機器は、４種の波長における蛍光を、他のパラメーター、
例えば、分析中の粒子の大きさの測定である光散乱等と同時に測定することがで
きる。さらに、蛍光検出の動的範囲は高く、蛍光を規模のいくつかのオーダーに
わたって正確に測定し得る。この洗練された測定によれば、多くのそれぞれ識別
できるビーズ集団を得て、担体として供する仕組みを考案することは比較的簡単
である。例えば、各蛍光体が１０種類のレベルのうちの１レベルとして存在する
、２種の別の蛍光体を含むビーズを調製すれば、１０２＝１００種のビーズ型が
できる。蛍光体の数または各蛍光体のレベル数を増やすことによって、または他
の変数、例えば、ビーズの大きさ等を導入することによって、多数の区別できる
ビーズ型を創ることができる。
ビーズ集団の数によって必然的に制限を受ける。この点、現行のフローサイトメ
トリー機器については、この方法の有用性に限界を見出さない。典型的な現代の
フローサイトメトリー機器は、４種の波長における蛍光を、他のパラメーター、
例えば、分析中の粒子の大きさの測定である光散乱等と同時に測定することがで
きる。さらに、蛍光検出の動的範囲は高く、蛍光を規模のいくつかのオーダーに
わたって正確に測定し得る。この洗練された測定によれば、多くのそれぞれ識別
できるビーズ集団を得て、担体として供する仕組みを考案することは比較的簡単
である。例えば、各蛍光体が１０種類のレベルのうちの１レベルとして存在する
、２種の別の蛍光体を含むビーズを調製すれば、１０２＝１００種のビーズ型が
できる。蛍光体の数または各蛍光体のレベル数を増やすことによって、または他
の変数、例えば、ビーズの大きさ等を導入することによって、多数の区別できる
ビーズ型を創ることができる。
【００１９】 ２種の異なるプロット(１０&１１)のｚ軸上にプローブ蛍光体の強度をプロッ
トすることによって、各ビーズ集団に結合したコントロール(１０)および試験(
１１)プローブの量がわかる。これにより、検体における各標的配列に結合した
量の表(１４)を得る。示した方法の例において、あるｍＲＮＡの種類(１２)を、
コントロール(１３)におけるよりも、より低レベルで試験サンプル中に発現させ
る。発現における他の違いを、２個のプロットにおける対応するピークの高さの
違いとして容易に同定できる。
トすることによって、各ビーズ集団に結合したコントロール(１０)および試験(
１１)プローブの量がわかる。これにより、検体における各標的配列に結合した
量の表(１４)を得る。示した方法の例において、あるｍＲＮＡの種類(１２)を、
コントロール(１３)におけるよりも、より低レベルで試験サンプル中に発現させ
る。発現における他の違いを、２個のプロットにおける対応するピークの高さの
違いとして容易に同定できる。
【００２０】 マイクロアレイ法において、適用ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド標的配列を
、１０−１００μｍの範囲の次元の区別できる領域として(液体の小滴として適
用されるＤＮＡスポットは５０−１００μｍの次元が典型的である)、固体表面
に典型的には適用し、より小さい領域が、フォトリソグラフオリゴヌクレオチド
合成を利用する方法において使用される。発現の変化の測定における正確性を確
保するためには、固相上に存在するＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドの量が、プ
ローブ溶液における相補的配列より過剰であり、標的配列が、ハイブリダイゼー
ションの結果をゆがめることにつながる制限とはならないことが重要である。結
果的に、ビーズ上に担持される標的配列を使用する遺伝子発現の分析のためのフ
ローサイトメトリーを使用する任意の方法において、系の能力が、通常の方法に
おいて使用されるのと同程度の標的:プローブ過剰を維持することが重要である
。フローサイトメトリーに使用されるビーズは、典型的には１−１０μｍの範囲
の次元を有し、したがって、それぞれは、典型的なマイクロアレイと代替するの
に十分な表面面積を有していない。しかし、いくつかのビーズを使用して各標的
配列を担持することによって、後記の例に示したように、標的の提示を同等に達
することができる：
、１０−１００μｍの範囲の次元の区別できる領域として(液体の小滴として適
用されるＤＮＡスポットは５０−１００μｍの次元が典型的である)、固体表面
に典型的には適用し、より小さい領域が、フォトリソグラフオリゴヌクレオチド
合成を利用する方法において使用される。発現の変化の測定における正確性を確
保するためには、固相上に存在するＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドの量が、プ
ローブ溶液における相補的配列より過剰であり、標的配列が、ハイブリダイゼー
ションの結果をゆがめることにつながる制限とはならないことが重要である。結
果的に、ビーズ上に担持される標的配列を使用する遺伝子発現の分析のためのフ
ローサイトメトリーを使用する任意の方法において、系の能力が、通常の方法に
おいて使用されるのと同程度の標的:プローブ過剰を維持することが重要である
。フローサイトメトリーに使用されるビーズは、典型的には１−１０μｍの範囲
の次元を有し、したがって、それぞれは、典型的なマイクロアレイと代替するの
に十分な表面面積を有していない。しかし、いくつかのビーズを使用して各標的
配列を担持することによって、後記の例に示したように、標的の提示を同等に達
することができる：
【００２１】 １００μｍ(直径)スポットを有する２Ｄアレイの場合： スポット面積＝πｒ２ ＝３．１４×(５０)２ ＝７８５０μｍ２ 光線(表面の５０％を照射)中の１０μｍ(直径)ビーズの場合： 光った面積＝２πｒ２ ＝２×３．１４×(５)２ ＝１５７μｍ２ ビーズ：スポット相当＝７８５０／１５７ ＝５０ビーズ ビーズ体積(立方体の充填を仮定)＝１０３μｍ３ ５０ビーズの体積 ＝５００００μｍ３ １０％ｖ／ｖ懸濁物を仮定 ＝５０００００μｍ３ ＝５×１０５／ｌ×１０９μｌ ＝１×１０−３μｌ ＝１ｎｌ
【００２２】 結果として、５０ビーズ／標的を使用する１０００個の標的の検定を達成する
ために、検定に要する総体積は１μｌである。所望により、より大きい体積をハ
イブリダイゼーションまたは分析の便宜のために使用し得る；例えば、１％ｖ／
ｖの濃度におけるビーズを使用して１０μｌ総体積を得る。 本発明の方法によってより多数のビーズを使用して、結果として総ビーズ集団
の上に広がって、より多量の標的配列を結合する能力を増大させることができる
。まれな種類を検出するために、方法の感度を増大させるためにビーズ集団に結
合したプローブの量を増大させるのが望ましいならば、使用者はこの方法によっ
てこれが可能となる。あるいは、それによって、例えば、コントロールおよび１
より多い試験サンプル中の遺伝子のパネルの発現を同時に測定する場合のように
、サンプルの数を増加させることが可能となる。ここで、前記のように各コント
ロールまたは試験サンプルを異なる蛍光体で標識する。そのように検定の複雑さ
を増大させることは、固体表面上の通常のアレイでは感度を減少させることなく
達成することができない。アレイスポットが相補的配列を結合する能力は限られ
ているためである。
ために、検定に要する総体積は１μｌである。所望により、より大きい体積をハ
イブリダイゼーションまたは分析の便宜のために使用し得る；例えば、１％ｖ／
ｖの濃度におけるビーズを使用して１０μｌ総体積を得る。 本発明の方法によってより多数のビーズを使用して、結果として総ビーズ集団
の上に広がって、より多量の標的配列を結合する能力を増大させることができる
。まれな種類を検出するために、方法の感度を増大させるためにビーズ集団に結
合したプローブの量を増大させるのが望ましいならば、使用者はこの方法によっ
てこれが可能となる。あるいは、それによって、例えば、コントロールおよび１
より多い試験サンプル中の遺伝子のパネルの発現を同時に測定する場合のように
、サンプルの数を増加させることが可能となる。ここで、前記のように各コント
ロールまたは試験サンプルを異なる蛍光体で標識する。そのように検定の複雑さ
を増大させることは、固体表面上の通常のアレイでは感度を減少させることなく
達成することができない。アレイスポットが相補的配列を結合する能力は限られ
ているためである。
【００２３】 当業者は、本発明の方法が前記の２Ｄアレイに基づく遺伝子発現の分析のため
の方法より多くの有意義な利点を提供することがわかる： a)ビーズに基づく検定のための基本的な構成要素を、標準的な結合方法を使用し
て商業的に利用可能なビーズにｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドの溶液を結合
させることによって容易に調製する； b)マイクロアレイには、専用のアレイを製造することとスキャンニング装置が必
要であるのに対して、調製または分析のために特別の装置を必要としない； c)実験のデザインを、随意に標的配列を付加または削除することによって容易に
変更することができ、すでにある材料を廃棄することを必要としない； d)ハイブリダイゼーションを標準的反応容器中の懸濁物の中で実施することがで
き、それによって、マイクロアレイを覆っている液体の薄いフィルムに関する蒸
発という問題を回避し、プローブおよび標的配列の効率的な混合を通じてハイブ
リダイゼーションを促進する；並びに e)分析スピードを有意に改善する：フローサイトメトリーは、典型的には、１０
００−１００００ビーズ／秒の速度でビーズを分析し、２、３秒の内に１００種
の配列の遺伝子発現分析を進めることができる。
の方法より多くの有意義な利点を提供することがわかる： a)ビーズに基づく検定のための基本的な構成要素を、標準的な結合方法を使用し
て商業的に利用可能なビーズにｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドの溶液を結合
させることによって容易に調製する； b)マイクロアレイには、専用のアレイを製造することとスキャンニング装置が必
要であるのに対して、調製または分析のために特別の装置を必要としない； c)実験のデザインを、随意に標的配列を付加または削除することによって容易に
変更することができ、すでにある材料を廃棄することを必要としない； d)ハイブリダイゼーションを標準的反応容器中の懸濁物の中で実施することがで
き、それによって、マイクロアレイを覆っている液体の薄いフィルムに関する蒸
発という問題を回避し、プローブおよび標的配列の効率的な混合を通じてハイブ
リダイゼーションを促進する；並びに e)分析スピードを有意に改善する：フローサイトメトリーは、典型的には、１０
００−１００００ビーズ／秒の速度でビーズを分析し、２、３秒の内に１００種
の配列の遺伝子発現分析を進めることができる。
【００２４】 本発明のさらなる説明として、図４に示す実施態様を参照されたい。 図４は、細菌性リポ多糖類(ＬＰＳ) (Su S. et al BioTechniques 1997, 22:1
107-1113)の存在(試験)または不存在(コントロール)の下で処置したＴＨＰ−１
細胞における腫瘍壊死因子(Tumour Necrosis Factor, ＴＮＦ)発現の変化の分析
のための方法の概要を示す。この方法において、コントロールおよび試験サンプ
ル中のＴＮＦ遺伝子転写物の量の変化を、同じサンプル中のグリセルアルデヒド
−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)遺伝子に由来する転写物の
レベルと同時に比較する。
107-1113)の存在(試験)または不存在(コントロール)の下で処置したＴＨＰ−１
細胞における腫瘍壊死因子(Tumour Necrosis Factor, ＴＮＦ)発現の変化の分析
のための方法の概要を示す。この方法において、コントロールおよび試験サンプ
ル中のＴＮＦ遺伝子転写物の量の変化を、同じサンプル中のグリセルアルデヒド
−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)遺伝子に由来する転写物の
レベルと同時に比較する。
【００２５】 簡単には、５×１０５細胞／ｍｌのヒトの単球ＴＨＰ−１細胞を、１０μｇ／
ｍｌのＬＰＳの存在(試験サンプル)および不存在(コントロールサンプル)下で９
０分間処置する。処置に続いて、両方のサンプルを別々に修飾し、コントロール
および試験サンプル中に存在するＲＮＡ集団を、Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, pp7.3-7.87に示さ
れた標準的方法にしたがって単離する。ＲＮＡ単離のための他の適当な方法を、
当業者は認識し、商業的に利用可能な試薬またはキット(例えば、RNeasy, Qiage
n)の使用を含む。
ｍｌのＬＰＳの存在(試験サンプル)および不存在(コントロールサンプル)下で９
０分間処置する。処置に続いて、両方のサンプルを別々に修飾し、コントロール
および試験サンプル中に存在するＲＮＡ集団を、Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, pp7.3-7.87に示さ
れた標準的方法にしたがって単離する。ＲＮＡ単離のための他の適当な方法を、
当業者は認識し、商業的に利用可能な試薬またはキット(例えば、RNeasy, Qiage
n)の使用を含む。
【００２６】 ＲＮＡ単離に続いて、ｍＲＮＡ分子をｃＤＮＡに酵素的な手法、すなわち逆転
写酵素によって、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harb
our Laboratory Press 1989, pp8.11-8.13に示された標準的な方法を使用して変
換する。
写酵素によって、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harb
our Laboratory Press 1989, pp8.11-8.13に示された標準的な方法を使用して変
換する。
【００２７】 次に、各サンプルから得られたｃＤＮＡ分子を、標準的条件(Molecular Cloni
ng, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, pp14
.5-14.20)並びにＧＡＰＤＨおよびＴＮＦを増幅するプライマーの組(Su S. et a
l BioTechniques 1997, 22:1107-1113)を使用して、別々のマルチプレックスＰ
ＣＲ反応において使用する。各プライマーの組の一のプライマーを、この方法の
次の段階の鎖分離の助けのためにその５’末端においてビオチン分子で修飾する
。これを修飾したフォスフォルアミダイト、例えば：５’−ビオチンフォスフォ
ルアミダイト(Glen Research)によるオリゴヌクレオチド合成中に標準的方法を
使用して容易に達成する。蛍光標識したヌクレオチドを増幅したＰＣＲ反応物に
取り込ませ、増幅したＰＣＲ産物を標識し、それによって試験またはコントロー
ルＲＮＡ集団からの起源を確立し得る。したがって、コントロール細胞から調製
したｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物は、Ｃｙ３(商標)−ｄＣＴＰを含み、試験
細胞から調製したｃＤＮＡを含む反応混合物は、Ｃｙ５(商標)−ｄＣＴＰを含む
(Ｃｙ３(商標)−ｄＣＴＰおよびＣｙ５(商標)−ｄＣＴＰはAmersham Pharmacia
Biotechから得る)。これらの反応によって、増幅されたレベルの蛍光標識された
ｃＤＮＡ産物を得る。ここで、それぞれのｃＤＮＡの種類の相対存在量は、細胞
または組織サンプルから単離したＲＮＡ集団におけるそれぞれの親ｍＲＮＡの種
類の量に対応する。ここで、試験またはコントロールサンプル集団からの任意の
所望の分子の起源を、分子によって担持された蛍光標識によって決定することが
できる。
ng, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, pp14
.5-14.20)並びにＧＡＰＤＨおよびＴＮＦを増幅するプライマーの組(Su S. et a
l BioTechniques 1997, 22:1107-1113)を使用して、別々のマルチプレックスＰ
ＣＲ反応において使用する。各プライマーの組の一のプライマーを、この方法の
次の段階の鎖分離の助けのためにその５’末端においてビオチン分子で修飾する
。これを修飾したフォスフォルアミダイト、例えば：５’−ビオチンフォスフォ
ルアミダイト(Glen Research)によるオリゴヌクレオチド合成中に標準的方法を
使用して容易に達成する。蛍光標識したヌクレオチドを増幅したＰＣＲ反応物に
取り込ませ、増幅したＰＣＲ産物を標識し、それによって試験またはコントロー
ルＲＮＡ集団からの起源を確立し得る。したがって、コントロール細胞から調製
したｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物は、Ｃｙ３(商標)−ｄＣＴＰを含み、試験
細胞から調製したｃＤＮＡを含む反応混合物は、Ｃｙ５(商標)−ｄＣＴＰを含む
(Ｃｙ３(商標)−ｄＣＴＰおよびＣｙ５(商標)−ｄＣＴＰはAmersham Pharmacia
Biotechから得る)。これらの反応によって、増幅されたレベルの蛍光標識された
ｃＤＮＡ産物を得る。ここで、それぞれのｃＤＮＡの種類の相対存在量は、細胞
または組織サンプルから単離したＲＮＡ集団におけるそれぞれの親ｍＲＮＡの種
類の量に対応する。ここで、試験またはコントロールサンプル集団からの任意の
所望の分子の起源を、分子によって担持された蛍光標識によって決定することが
できる。
【００２８】 ここで、コントロール(Ｃｙ３−標識された)および試験(Ｃｙ−５標識された)
反応物に由来するＰＣＲ産物を、さらなる修飾に先立って共に混合する。 ＰＣＲ反応の二本鎖ｃＤＮＡ産物を、さらなる分析の前に、ＰＣＲ産物をビオ
チン経由で各ＰＣＲ産物のその５’末端でストレプトアビジンコートマグネチッ
クビーズ(MagneSphere, Promega)に結合することによって、一本鎖ｃＤＮＡ分子
に変換する。結合したら、０．２体積の２Ｍ ＮａＯＨを添加することによって
二本鎖ＰＣＲ産物を変性し、１０分間室温でインキュベートし、ビーズから非ビ
オチン化の鎖を解放する。マグネットに引きつけてビーズを溶液から分離し、溶
液を清澄化する。それ(溶液)は一本鎖の標識されたＰＣＲ産物を含み、除去して
、１体積の０．４Ｍ ＨＣｌを添加することによって中性にされる。二本鎖ＤＮ
Ａ分子を分離する他の方法が当技術分野で既知である。
反応物に由来するＰＣＲ産物を、さらなる修飾に先立って共に混合する。 ＰＣＲ反応の二本鎖ｃＤＮＡ産物を、さらなる分析の前に、ＰＣＲ産物をビオ
チン経由で各ＰＣＲ産物のその５’末端でストレプトアビジンコートマグネチッ
クビーズ(MagneSphere, Promega)に結合することによって、一本鎖ｃＤＮＡ分子
に変換する。結合したら、０．２体積の２Ｍ ＮａＯＨを添加することによって
二本鎖ＰＣＲ産物を変性し、１０分間室温でインキュベートし、ビーズから非ビ
オチン化の鎖を解放する。マグネットに引きつけてビーズを溶液から分離し、溶
液を清澄化する。それ(溶液)は一本鎖の標識されたＰＣＲ産物を含み、除去して
、１体積の０．４Ｍ ＨＣｌを添加することによって中性にされる。二本鎖ＤＮ
Ａ分子を分離する他の方法が当技術分野で既知である。
【００２９】 遺伝子発現の変化の分析を実施するために適当なビーズまたは粒子の集団を、
蛍光色素(SPHERO(商標), Spherotech Inc.)を含むビーズを使用して調製する。
黄色蛍光ストレプトアビジン被覆したビーズを、ＧＡＰＤＨのための５’ビオチ
ンプライマーで被覆し、青色蛍光ストレプトアビジン被覆したビーズをＴＮＦの
ための５’ビオチンプライマーで被覆する(前記で使用したのと同じ５’ビオチ
ンプライマーを使用する)。したがって、これらのビーズの集団は、２種類の識
別できる特徴を有しており、すなわち、各ビーズ集団は、すべての他のビーズ集
団からその蛍光特性によって識別でき、各ビーズ集団は、単一のｃＤＮＡの種類
(ＴＮＦまたはＧＡＰＤＨ)を認識することができる。
蛍光色素(SPHERO(商標), Spherotech Inc.)を含むビーズを使用して調製する。
黄色蛍光ストレプトアビジン被覆したビーズを、ＧＡＰＤＨのための５’ビオチ
ンプライマーで被覆し、青色蛍光ストレプトアビジン被覆したビーズをＴＮＦの
ための５’ビオチンプライマーで被覆する(前記で使用したのと同じ５’ビオチ
ンプライマーを使用する)。したがって、これらのビーズの集団は、２種類の識
別できる特徴を有しており、すなわち、各ビーズ集団は、すべての他のビーズ集
団からその蛍光特性によって識別でき、各ビーズ集団は、単一のｃＤＮＡの種類
(ＴＮＦまたはＧＡＰＤＨ)を認識することができる。
【００３０】 別々に調製したビーズを一緒に混合し、さらに先に調製したＣｙ３およびＣｙ
５標識した一本鎖ｃＤＮＡ産物と混合し、フローサイトメトリーによってビーズ
集団を分析する前に、ハイブリダイゼーションバッファー（０．１ＭトリスＨＣ
ｌ ｐＨ７．４、７５０ｍＭ ＮａＣｌ)中で４５℃で２時間インキュベートす
る。混合した集団に由来するｃＤＮＡ産物を、ビーズ上に担持されたそれらの相
補的な捕捉配列に特異的に結合させ、試験およびコントロール集団から生ずる単
一の種類の標識したｃＤＮＡの混合物で各ビーズを最終的に修飾する。ここで標
識の相対存在量は、もとの試験およびコントロール集団における単一の種類の相
対存在量を反映している。
５標識した一本鎖ｃＤＮＡ産物と混合し、フローサイトメトリーによってビーズ
集団を分析する前に、ハイブリダイゼーションバッファー（０．１ＭトリスＨＣ
ｌ ｐＨ７．４、７５０ｍＭ ＮａＣｌ)中で４５℃で２時間インキュベートす
る。混合した集団に由来するｃＤＮＡ産物を、ビーズ上に担持されたそれらの相
補的な捕捉配列に特異的に結合させ、試験およびコントロール集団から生ずる単
一の種類の標識したｃＤＮＡの混合物で各ビーズを最終的に修飾する。ここで標
識の相対存在量は、もとの試験およびコントロール集団における単一の種類の相
対存在量を反映している。
【００３１】 コントロールおよび試験サンプルに由来した分子の集団におけるＧＡＰＤＨ転
写物の相対存在量を、４６０ｎｍ／４８０ｎｍ(励起／発光)における黄色ビーズ
の蛍光を検出することによって比較する。さらに、黄色ビーズの集団内に、結合
Ｃｙ３標識した転写物を５５０ｎｍ／５７０ｎｍ(励起／発光)で検出し、結合Ｃ
ｙ５標識した転写物を６５０ｎｍ／６７０ｎｍ(励起／発光)で検出する。試験お
よびコントロールサンプルに由来した分子中のＴＮＦ転写物の相対存在量を、青
色ビーズの６５０ｎｍ／７１０ｎｍ(励起／発光)における蛍光を検出することに
よって決定する。さらに結合Ｃｙ３標識した転写物を５５０ｎｍ／５７０ｎｍ(
励起／発光)で、結合Ｃｙ５標識した転写物を６５０ｎｍ／６７０ｎｍ(励起／発
光)でさらに検出する。したがって、ビーズ蛍光は、各ビーズと会合した遺伝子
の同一性を決定するために使用し、標識蛍光を、ビーズに結合した試験およびコ
ントロールサンプルから生ずるｃＤＮＡの相対存在量を決定するために使用する
。さらに、後者から、もとの細胞または組織サンプルの処置中に使用した条件で
のその遺伝子の発現の変化の情報を得る。
写物の相対存在量を、４６０ｎｍ／４８０ｎｍ(励起／発光)における黄色ビーズ
の蛍光を検出することによって比較する。さらに、黄色ビーズの集団内に、結合
Ｃｙ３標識した転写物を５５０ｎｍ／５７０ｎｍ(励起／発光)で検出し、結合Ｃ
ｙ５標識した転写物を６５０ｎｍ／６７０ｎｍ(励起／発光)で検出する。試験お
よびコントロールサンプルに由来した分子中のＴＮＦ転写物の相対存在量を、青
色ビーズの６５０ｎｍ／７１０ｎｍ(励起／発光)における蛍光を検出することに
よって決定する。さらに結合Ｃｙ３標識した転写物を５５０ｎｍ／５７０ｎｍ(
励起／発光)で、結合Ｃｙ５標識した転写物を６５０ｎｍ／６７０ｎｍ(励起／発
光)でさらに検出する。したがって、ビーズ蛍光は、各ビーズと会合した遺伝子
の同一性を決定するために使用し、標識蛍光を、ビーズに結合した試験およびコ
ントロールサンプルから生ずるｃＤＮＡの相対存在量を決定するために使用する
。さらに、後者から、もとの細胞または組織サンプルの処置中に使用した条件で
のその遺伝子の発現の変化の情報を得る。
【図１】 図１は、２Ｄ整列されたアレイおよび３Ｄランダムアレイの概略
図である。
図である。
【図２】 図２は、ビーズに基づくフローサイトメトリー遺伝子発現法の原
理を示すフローチャートである。
理を示すフローチャートである。
【図３】 図３は、ビーズに基づくフローサイトメトリー遺伝子発現法の概
略図である。
略図である。
【図４】 図４は、ＬＰＳ刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦおよびＧ
ＡＰＤＦ遺伝子の発現の変化の分析方法の概略図である。
ＡＰＤＦ遺伝子の発現の変化の分析方法の概略図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月２０日（２００１．３．２０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】 両方の方法において、コントロールおよび試験細胞または組織から抽出された
ｍＲＮＡ配列を、直接標識するかまたは最初に変換または増幅し、次いで、標識
された対応するｃＤＮＡ配列を得る。アレイ上に位置する相補的標的配列にハイ
ブリダイゼーションによって固定されると、プローブに結合した蛍光ラベルをス
キャンニングまたはイメージングによって検出、定量して、試験およびコントロ
ールサンプルに含まれる様々なｍＲＮＡの量のデータを得る。試験およびコント
ロール細胞からの配列は、異なる蛍光体で標識されているので、両方のサンプル
を同時に適用、ハイブリダイズし、ハイブリダイズしたプローブの得られたパタ
ーンおよび強度を、使用された蛍光体の発光波長を区別するよう調整された検出
機器を使用して決定する。Schema et al.(Science, 270, October 1995, page 4 67-470)は、そのような方法の適用を記載している。
ｍＲＮＡ配列を、直接標識するかまたは最初に変換または増幅し、次いで、標識
された対応するｃＤＮＡ配列を得る。アレイ上に位置する相補的標的配列にハイ
ブリダイゼーションによって固定されると、プローブに結合した蛍光ラベルをス
キャンニングまたはイメージングによって検出、定量して、試験およびコントロ
ールサンプルに含まれる様々なｍＲＮＡの量のデータを得る。試験およびコント
ロール細胞からの配列は、異なる蛍光体で標識されているので、両方のサンプル
を同時に適用、ハイブリダイズし、ハイブリダイズしたプローブの得られたパタ
ーンおよび強度を、使用された蛍光体の発光波長を区別するよう調整された検出
機器を使用して決定する。Schema et al.(Science, 270, October 1995, page 4 67-470)は、そのような方法の適用を記載している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】 最終的に、マイクロアレイ上での蛍光体標識されたプローブの検出および定量
には、非常に低レベルの蛍光の存在を検出するための専用の洗練された装置を要
する。要求される感度を達成するために、スキャンニングレーザースポットを使
用し、蛍光体分子を励起して検出を最も一般的には実施する；これは、単一のア
レイの測定を完成するために数時間までも要する非常にゆっくりとした過程であ
り得る。 ＷＯ９８／２６０９８は、ｃＤＮＡライブラリーからの同定されていない核酸 配列をそれぞれ担持するビーズを使用して、２種以上の集団内の特定の相対存在 量を有する配列を同定する方法を記載している。
には、非常に低レベルの蛍光の存在を検出するための専用の洗練された装置を要
する。要求される感度を達成するために、スキャンニングレーザースポットを使
用し、蛍光体分子を励起して検出を最も一般的には実施する；これは、単一のア
レイの測定を完成するために数時間までも要する非常にゆっくりとした過程であ
り得る。 ＷＯ９８／２６０９８は、ｃＤＮＡライブラリーからの同定されていない核酸 配列をそれぞれ担持するビーズを使用して、２種以上の集団内の特定の相対存在 量を有する配列を同定する方法を記載している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 アマーシャム・ファルマシア・バイオテッ ク・インコーポレーテッド Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ． アメリカ合衆国ニュージャージー州08855 −1327，ピスカタウェイ，センテニアル・ アベニュー 800，ピー・オー・ボックス 1327 800 Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕ ｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ 1327，Ｐｉｓｃａ ｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ 08855−1327，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ニコラス・トーマス イギリス、シーエフ４・８アールユー、カ ーディフ、ラディア、メイプルトゥリー・ クロース12番 (72)発明者 アラン・ワゴナー アメリカ合衆国15213ペンシルベニア州ピ ッツバーグ、フィフス・アベニュー4400 番、カーネギー・メロン・ユニバーシティ Ｆターム(参考） 2G045 CB01 DA13 FB02 FB12 GC15 2G054 AA08 CA22 CE02 EA03 GA04 4B024 AA11 CA04 CA09 CA12 CA20 HA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QQ43 QQ53 QR08 QR32 QR35 QR38 QR42 QR56 QR62 QR83 QS16 QS25 QS34 QS39 QX02
Claims (15)
- 【請求項１】 ２種の起源からの核酸の相違を検出、分析する方法であって
： a.標識したプローブとして２種の起源からの核酸を用意する； b.標識したプローブとプールした試薬の混合物を形成し、ここで、各試薬は、ポ
リヌクレオチド標的を担持するビーズの集団であり、ある試薬の標的は他の試薬
の標的と異なり、ある試薬のビーズは他の試薬のビーズと識別できる； c.プローブと標的の間の特異的ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、混
合物をインキュベートする； d.混合物中のビーズをフローサイトメトリーによって分析する ことを含む方法。 - 【請求項２】 請求項１の方法であって、２種の起源からの核酸が、細胞ま
たは組織からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである方法。 - 【請求項３】 請求項１または請求項２の方法であって、ポリヌクレオチド
標的が、細胞内ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡである方法。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかの方法であって、ポリヌクレオ
チド標的がＰＣＲアンプライマーである方法。 - 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれかの方法であって、ポリヌクレオ
チド標的が、末端ビオチン基を担持しており、それによってストレプトアビジン
被覆ビーズに結合されている方法。 - 【請求項６】 請求項１ないし５のいずれかの方法であって、ポリヌクレオ
チド標的が一本鎖核酸である方法。 - 【請求項７】 請求項１ないし６のいずれかの方法であって、標識されたプ
ローブが一本鎖核酸である方法。 - 【請求項８】 請求項１ないし７のいずれかの方法であって、ある試薬のビ
ーズが他の試薬のビーズと大きさによって識別できる方法。 - 【請求項９】 請求項１ないし８のいずれかの方法であって、ある試薬のビ
ーズが、他の試薬のビーズと、ビーズに結合されたマーカーの性質によって識別
できる方法。 - 【請求項１０】 請求項１ないし９のいずれかの方法であって、ある試薬の
ビーズが、他の試薬のビーズと、ビーズに結合されたマーカーの濃度によって識
別できる方法。 - 【請求項１１】 請求項１ないし７のいずれかの方法であって、ある試薬の
ビーズが、他の試薬のビーズと、大きさによって並びに／またはビーズに結合さ
れたマーカーの性質および／もしくは濃度によって識別できる方法。 - 【請求項１２】 請求項８ないし１１のいずれかの方法であって、蛍光マー
カーが、ビーズに結合されている方法。 - 【請求項１３】 請求項１または請求項２の方法であって、各プローブが起
源を示す蛍光標識で標識されている方法。 - 【請求項１４】 請求項１ないし１３のいずれかの方法であって、フローサ
イトメトリーによる分析を実施し、各ビーズを同定し、それに結合されたプロー
ブを定量する方法。 - 【請求項１５】 請求項１ないし１４のいずれかの方法であって、フローサ
イトメトリーによって得られたデータを分析し、２種の起源からの核酸の各配列
の相対的および／または絶対的存在量についての情報を得る方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9905807.5 | 1999-03-12 | ||
| GBGB9905807.5A GB9905807D0 (en) | 1999-03-12 | 1999-03-12 | Analysis of differential gene expression |
| PCT/GB2000/000807 WO2000055363A2 (en) | 1999-03-12 | 2000-03-09 | Analysis of differential gene expression |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000605779A Pending JP2002538836A (ja) | 1999-03-12 | 2000-03-09 | 遺伝子発現の変化の分析 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1163367A2 (ja) |
| JP (1) | JP2002538836A (ja) |
| AU (1) | AU2928400A (ja) |
| GB (1) | GB9905807D0 (ja) |
| WO (1) | WO2000055363A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007142202A1 (ja) | 2006-06-06 | 2007-12-13 | Panasonic Corporation | ヌクレオチド鎖修飾方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| AU7875600A (en) * | 1999-10-08 | 2001-04-23 | University Of Utah Research Foundation | Particle analysis assay for biomolecular quantification |
| DE60219428T2 (de) * | 2001-02-13 | 2008-01-03 | Pronostics Ltd., Babraham | Biochemische methode und apparat zur detektion genetischer charakteristika |
| ATE359512T1 (de) * | 2001-02-13 | 2007-05-15 | Pronostics Ltd | Biochemisches verfahren und vorrichtung zur bestimmung von eigenschaften von proteinen |
| WO2003045310A2 (en) | 2001-11-21 | 2003-06-05 | Applera Corporation | Digital assay |
| DE10323901A1 (de) * | 2003-05-26 | 2005-01-05 | Institut Virion/Serion Gmbh | Verfahren und Testmittel zur Untersuchung und/oder zum Nachweis von Biomolekülen und/oder Wirkstoffen in Flüssigkeitsproben |
| WO2005071412A2 (en) | 2004-01-09 | 2005-08-04 | Applera Corporation | Phosphor particle coded beads |
| CN105026562B (zh) * | 2013-03-12 | 2019-06-07 | 株式会社日立制作所 | 基因定量、序列分析用二维细胞阵列器件及装置 |
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|---|---|---|---|---|
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| DE69638321D1 (de) * | 1995-10-11 | 2011-03-03 | Luminex Corp | Gleichzeitige mehrfachanalyse klinischer proben |
| US6060240A (en) * | 1996-12-13 | 2000-05-09 | Arcaris, Inc. | Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom |
| JP4357112B2 (ja) * | 1997-10-14 | 2009-11-04 | ルミネックス コーポレイション | 精密蛍光染色された粒子及びその製造及び使用方法 |
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| US6265163B1 (en) * | 1998-01-09 | 2001-07-24 | Lynx Therapeutics, Inc. | Solid phase selection of differentially expressed genes |
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1999
- 1999-03-12 GB GBGB9905807.5A patent/GB9905807D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-03-09 EP EP00907817A patent/EP1163367A2/en not_active Withdrawn
- 2000-03-09 JP JP2000605779A patent/JP2002538836A/ja active Pending
- 2000-03-09 AU AU29284/00A patent/AU2928400A/en not_active Abandoned
- 2000-03-09 WO PCT/GB2000/000807 patent/WO2000055363A2/en not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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