EA011415B1

EA011415B1 - Раствор для лизиса клеток или придания им проницаемости и способы детектирования нуклеиново-кислотной мишени

Info

Publication number: EA011415B1
Application number: EA200400081A
Authority: EA
Inventors: Ричард М. Крис; Стефен Фелдер
Original assignee: Хай Трупут Дженомикс, Инк.
Priority date: 2001-06-26
Filing date: 2002-06-26
Publication date: 2009-02-27
Also published as: EA200400081A1

Abstract

Данное изобретение предлагает раствор для лизиса клеток или придания им проницаемости. Раствор содержит формамид и додецилсульфат натрия в 0,5-6Х SSC, используемого в качестве буфера. Применение этого раствора обеспечивает эффективное высвобождение нуклеиновокислотной мишени и не мешает проведению ее детектирования. Предложены варианты способов детектирования нуклеиновокислотной мишени. Способы пригодны для одновременного проведения множества биологических или химических анализов с высокой производительностью.

Description

Данная заявка представляет заявку на патент США под номером 09/337325, поданную 21 июня 1999 г., которая представляет заявку на патент США под номером 09/218166, поданную 22 декабря 1998 г., которая представляет заявку на патент США под номером 09/109076, поданную 2 июля 1998 г. Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки № 60/068291, поданную 19 декабря 1997 г.

Область изобретения

Данное изобретение относится, например, к композициям, аппаратуре и способам для обеспечения одновременного проведения множества биологических или химических анализов с использованием повторяющихся совокупностей (матриц) зондов. Множество областей для каждой из них включает ряд близких якорных молекул. Якоря связаны с бифункциональными линкерами, каждый из которых содержит участок, специфичный, по меньшей мере, к одному из якорей, и участок, который представляет собой зонд для интересующей мишени. Полученная совокупность (матрица) зондов используется для анализа на присутствие одной или более молекул-мишеней, которые специфически взаимодействуют с зондами. Изобретение также относится к раствору для лизиса клеток или придания им проницаемости, который применяется в рамках указанных способов. Изобретение относится к различным областям, отличающимся природой молекулярного взаимодействия, включая, но не ограничиваясь разработкой фармацевтических препаратов, молекулярной биологией, биохимией, фармакологией и медицинской диагностической технологией.

Предпосылки изобретения

В различных биологических и химических анализах используется множество молекулярных зондов, расположенных на поверхности, или «чипов». Анализы проводят для того, чтобы определить, взаимодействуют ли интересующие молекулы с одним из зондов. После воздействия зондов на молекулымишени в выбранных условиях тестирования с помощью детектирующих устройств определяют, взаимодействовала ли молекула-мишень с данным зондом.

Данные системы пригодны для различных скрининговых методов с целью получения информации либо о зондах, либо молекулах-мишенях. Например, среди прочего их использовали для скрининга пептидов или потенциальных лекарственных препаратов, которые связываются с интересующими рецепторами; для скрининга проб, например, на наличие генетических мутаций, аллельных вариантов в популяции или конкретного патогена или штамма патогена среди многих других; для изучения экспрессии генов, например, для идентификации мРНК, экспрессия которой коррелирует с определенным физиологическим состоянием, стадией развития или болезненным состоянием и т. д.

Описание изобретения

Данное изобретение обеспечивает композиции, аппаратуру и способы для одновременного проведения множества биологических и химических анализов и позволяет проводить высокопроизводительный анализ множества проб, например, множества проб от пациентов для скрининга в диагностическом тесте или множества потенциальных лекарственных препаратов или лечебных средств для тестирования при разработке лекарственных препаратов. Изобретение также обеспечивает раствор для лизиса клеток или придания им проницаемости, который применяется в рамках указанных способов. Обеспечивается комбинация, пригодная для детектирования одной или более мишеней в пробе. Данная комбинация содержит поверхность, включающую множество пространственно разобщенных областей, которые можно назвать тест-областями и которые могут представлять собой лунки, по меньшей мере две из которых в основном являются одинаковыми. Каждая поверхность включает по меньшей мере две, предпочтительно по меньшей мере двадцать или более, например по меньшей мере 25, 50, 96, 864 или 1536 и т.д. подобных в основном одинаковых областей. Каждая тест-область определяет пространство для введения пробы, содержащей (или потенциально содержащей) одну или более мишеней и содержит биологическую или химическую совокупность. (Подобные фразы как «проба, содержащая мишень» или «детектирование мишени в пробе» не предназначены для исключения проб или определений (попыток детектирования), в которых не содержится или не детектируется мишень. В общем смысле данное изобретение включает совокупности для определения того, находится ли мишень в пробе, независимо от того, детектируется она или не детектируется). Данная совокупность (матрица) включает близкие «якоря», каждый связанный с бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к якорю, и второй участок, который содержит зонд, специфичный по меньшей мере к одной из мишени(ей). Комбинацию по настоящему изобретению приводят в контакт с пробой, содержащей одну или более мишеней, которые необязательно взаимодействуют с детектирующей молекулой(ами), и затем определяют детектирующим устройством, которое детектирует реакции между молекулами-мишенями и зондами в тестобластях, тем самым получая результаты анализа.

Изобретение обеспечивает способы и композиции, в частности, пригодные для постановки биологических анализов с высокой пропускной способностью.

Изобретение обеспечивает раствор для лизиса клеток или придания им проницаемости, который содержит формамид, додецилсульфата натрия (8Ό8) и 88С в качестве буфера. При этом концентрация формамида варьирует от приблизительно 8 до приблизительно 60% (об./об.), концентрация 8Ό8 составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,5% (об./об.). Буфер представлен как 0,5-6Х 88С. Использование такого раствора обеспечивает высвобождение мишени из клеток и не мешает проведению

- 1 011415 анализа по выявлению мишенной нуклеиновой кислоты.

В особенно предпочтительных воплощениях изобретение можно использовать для высокопроизводительного скрининга при разработке лекарственных препаратов. Например, анализ с высокой пропускной способностью можно одновременно проводить на многих (например, 100) 96-луночных микропланшетах. Каждая лунка планшета может иметь, например, 36 различных тестов, проводимых в ней, с использованием совокупности (матрицы) из примерно 36 пар якорей и линкеров. То есть, на 100 96луночных планшетах, и каждый с 36 тестами на лунку, можно в целом ставить 345000 тестов, например, каждый из 9600 различных потенциальных лекарственных препаратов можно одновременно тестировать на 36 различных параметров и тестов. Высокопроизводительные анализы обеспечивают значительно больше информации для каждого кандидата для лекарственного препарата, чем тесты, которые позволяют анализировать одновременно только один параметр. Например, возможно в одном первоначальном высокопроизводительном скрининговом тесте определить, является ли потенциальный лекарственный препарат избирательным, специфическим и/или нетоксичным. Для способов с низкой пропускной способностью требуется проведение обширных, следующих друг за другом тестов для определения таких параметров для каждого интересующего потенциального лекарственного препарата. Несколько типов высокопроизводительных скрининговых тестов описаны, например, в примерах 15-17. Способность одновременно проводить широкий ряд самых различных биологических анализов и одновременно ставить много тестов (т. е. с высокой пропускной способностью) является двумя важными преимуществами изобретения.

В одном воплощении, например, с использованием 96-луночных планшетов для связывания ДНК (Согшид СоМаг), сделанных из полистирола с дериватизированной поверхностью для связывания первичных аминов, таких как аминокислоты или модифицированные олигонуклеотиды, ряд из 36 различных олигонуклеотидов можно нанести на поверхность каждой лунки каждого планшета для функционирования в качестве якорей. Якоря могут быть ковалентно присоединены к дериватизированному полистиролу, и для всех скрининговых тестов можно использовать одни и те же 36 якорей. Для любого конкретного анализа можно использовать данный ряд линкеров для того, чтобы сделать поверхность каждой лунки специфической для 36 различных интересующих мишеней или тестов, и различные пробы для тестирования можно вносить в каждую из 96 лунок в каждом планшете. Тот же ряд якорей можно использовать многократно для перепрограммирования поверхности лунок для других интересующих мишеней и тестов или его можно использовать многократно с тем же набором линкеров. Подобная гибкость и возможность многократного использования представляют дополнительные преимущества изобретения.

Одно воплощение изобретения представляет комбинацию, пригодную для детектирования одной или более мишени(ей) в пробе, которая включает перед добавлением указанной пробы:

a) поверхность, содержащую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых являются в основном одинаковыми, где каждая область содержит

b) по меньшей мере, восемь различных олигонуклеотидных якорей, каждый связанный с

c) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к олигонуклеотидному якорю, и второй участок, который включает зонд, специфичный к указанной мишени(ям).

Другое воплощение изобретения представляет комбинацию, пригодную для детектирования одной или более мишени(ей) в пробе, которая включает перед добавлением указанной пробы:

b) по меньшей мере восемь различных якорей, каждый связанный с

c) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к якорю, и второй участок, который включает зонд, специфичный к указанной мишени(ям).

Другое воплощение изобретения представляет способ детектирования по меньшей мере одной мишени, который включает контактирование пробы, которая может содержать мишень(и), с комбинацией, описанной выше, в условиях эффективных для связывания указанной мишени(ей) с указанной комбинацией. Другое воплощение изобретения представляет способ определения характера экспрессии РНК, который включает инкубацию пробы, содержащей в качестве мишени(ей) по меньшей мере две молекулы РНК, с комбинацией, описанной выше, где, по меньшей мере, один зонд комбинации представляет нуклеиновую кислоту (например, олигонуклеотид), который является специфичным (т. е. избирательным) по меньшей мере к одной из РНК-мишеней, в условиях, эффективных для специфической гибридизации РНК-мишени (ей) с зондом(ами). Другое воплощение представляет способ идентификации агента (или условия(ий)), который модулирует характер экспрессии РНК, который представляет способ, описанный выше для определения характера экспрессии РНК, дополнительно включающий сравнение характера экспрессии РНК в присутствии указанного агента (или условия(ий)) с характером экспрессии РНК при различных условиях.

В качестве примера на фиг. 1 и 2 представлена комбинация по изобретению и способ ее применения для детектирования мРНК-мишени. Поверхность по изобретению, представленная на фиг. 2, содержит 15 одинаковых тест-областей; и в особенно предпочтительном воплощении изобретения, каждая из этих тест-областей представляет лунку в титрационном микропланшете. Каждая из тест-областей содержит

- 2 011415 шесть различных якорей под номерами 1-6. На фиг. 1 схематично представлен один из подобных якорей, якорь 1, который в наиболее предпочтительном воплощении изобретения, представляет олигонуклеотид. К якорю 1 присоединена молекула линкера, линкер 1, который включает два участка. Первый участок, который является специфичным к якорю, на данной фигуре представляет олигонуклеотид, который специфически гибридизуется с якорем. Второй участок, который является зондом, специфичным к интересующей мишени, в данном случае мРНК-мишень 1, на данной фигуре представляет олигонуклеотид, который гибридизуется со своей мишенью. Несмотря на то, что это не представлено на фигуре, каждый из оставшихся пяти якорей может гибридизоваться с его собственным линкером через специфичный к якорю участок; каждый линкер включает участок зонда, специфичный, например, к мРНК, отличной от (или такой же) мРНК 1. Данную представленную на фигуре комбинацию можно одновременно использовать для анализа 15 различных проб на присутствие мРНК 1 (или одновременно 15 мРНК-мишеней, которые специфичны (запрограммированы) 5 другими зондами в совокупности). Для постановки теста каждую пробу, которая в данном примере может быть экстрактом РНК, например, из одной из 15 независимых клеточных линий, добавляют в небольшом объеме к одной из областей, или лунок, и инкубируют в условиях, эффективных для гибридизации зонда и мишени. Для того чтобы определить, присутствует ли мРНК 1 в пробе, используют детектирующее устройство, которое распознает типы и/или может обнаруживать специфические положения в каждой области на наличие сигнала. Если клеточные линии инкубируют в условиях, при которых метка включается в молекулу мРНК в условиях ίη νίνο, и если мРНК 1 находится в пробе, то детектор обнаружит сигнал, исходящий от меченной мРНК в положении, определяемом комплексом якорь/зонд.

1. Альтернативно, в мРНК можно непосредственно ввести метку в условиях ίη νίίτο до или после добавления в области (лунки). Альтернативно, как представлено на фиг. 1, мРНК можно пометить опосредованно перед или после ее гибридизации с зондом, например, при инкубации РНК с меченым «детектирующим»-олигонуклеотидом (мишень-специфический олигонуклеотид-репортер), который является комплементарным к иной последовательности, чем та, которая распознается зондом. В представленном примере одновременно можно анализировать 15 проб. Поскольку по данному изобретению одновременно можно анализировать по меньшей мере 20 или более, например 1536 или более проб, то это аналитическая система с очень высокой пропускной способностью.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «мишень» относится к соединению, чье присутствие, активность и/или количество желательно определить, и которое обладает аффинностью для данного зонда. Мишени могут быть искусственно полученными или природными соединениями. Также их можно использовать в неизмененном виде или в виде агрегатов с другими веществами. Мишени можно связать, ковалентно или нековалентно, со связывающим членом, либо непосредственно, либо с помощью специфического связывающего соединения. Примеры мишеней, которые можно использовать по данному изобретению, включают, но не ограничиваются рецепторами (на везикулах, липидах, клеточных мембранах или различными другими рецепторами); лигандами, агонистами или антагонистами, которые связываются со специфическими рецепторами; поликлональными антителами, моноклональными антителами и антисыворотками, реагирующими со специфическими антигенными детерминантами (такими, как на вирусах, клетках или других субстанциях); лекарственными препаратами, нуклеиновыми кислотами или полинуклеотидами (включая мРНК, тРНК, рРНК, олигонуклеотиды, ДНК, вирусную РНК или ДНК, Е8Т, кДНК, амплифицированные с помощью ПЦР продукты, полученные из РНК или ДНК, и их мутанты, варианты или модификации); белками (включая ферменты такие, как ответственные за расщепление нейромедиаторов, протеазы, киназы и тому подобное); субстратами для ферментов; пептидами, кофакторами; лектинами; сахарами; полисахаридами; клетками (которые могут включать поверхностные антигены); клеточными мембранами; органеллами и т. д., а также другими молекулами или другими соединениями, которые могут находиться в виде комплекса, связанными ковалентными или поперечными связями и т. д. В том смысле, в котором они здесь используются, термины нуклеиновая кислота, полинуклеотид, полинуклеиновая кислота и олигонуклеотид являются взаимозаменяемыми. Мишени также можно отнести к антизондам.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется «зонд» представляет соединение, например молекулу, которая может специфически распознаваться определенной мишенью. Типы потенциальных связывающихся компонентов зонд/мишень или мишень/зонд включают рецептор/лиганд; лиганд/антилиганд; взаимодействия нуклеиновых кислот (полинуклеотидов), включая ДНК/ДНК, ДНК/РНК, ПНК (пептид-нуклеиновая кислота)/нуклеиновая кислота; ферменты, другие катализаторы и другие соединения с субстратами, небольшими молекулами или эффекторными молекулами и т. д. Примеры зондов, которые предположительно входят в объем настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются органическими и неорганическими соединениями или полимерами, включая металлы, хелатообразующие агенты или другие соединения, которые специфически взаимодействуют с металлами, пластиками, агонистами и антагонистами клеточных мембранных рецепторов, токсинами и ядами, вирусными эпитопами, гормонами (например, опиоидными пептидами, стероидами и т.д.), рецепторами гормонов, липидами (включая фосфолипиды), пептидами, ферментами (такими, как протеазы или киназы), субстратами ферментов, кофакторами, лекарственными препаратами, лектинами, сахарами, нуклеи

- 3 011415 новыми кислотами (включая олигонуклеотиды, ДНК, РНК, ПНК, или модифицированные или замещенные нуклеиновые кислоты), олигосахаридами, белками, ферментами, поликлональными и моноклональными антителами, одноцепочными антителами или их фрагментами. Зонды-полимеры могут быть линейными или циклическими. С помощью зондов можно различить фосфорилированные и нефосфорилированные белки либо посредством дифференциальной активности, либо дифференциального связывания. С помощью зондов, таких как лектины, можно различить гликозилированные белки. В том смысле, в котором они здесь используются, термины нуклеиновая кислота, полинуклеотид, полинуклеиновая кислота и олигонуклеотид являются взаимозаменяемыми. Любое из соединений, описанных выше в качестве «зондов», может также служить в качестве «мишеней» и тому подобное.

Любую сочетаемую поверхность можно использовать по изобретению. Поверхность (обычно твердая) может быть из различных органических и неорганических материалов или их сочетаний, включая, только в качестве примера, пластмассы, такие как полипропилен или полистирол; керамика; силикон; окись кремния (плавления) кварц или стекло, которые могут иметь толщину, например, предметного стекла для микроскопии или покровного стекла; бумага такая, как фильтровальная бумага; диазотированная целлюлоза; фильтры из нитроцеллюлозы; нейлоновые мембраны; или полиакриламид или другой тип гелевых основ, например, аэроосновы или аэрогранулы, сделанные из аэрогеля, который является, например, высокопористым твердым веществом, включая пленку, которую готовят высушиванием сырого геля с помощью любого из самых разнообразных обычных, общепринятых в таких случаях методов. Когда при постановке способов применяются тесты с оптическим детектированием, то вполне применимы пропускающие свет субстраты. Поверхность может быть любой толщины или прозрачности, которые совместимы, например, с обычными методами детектирования. Например, поверхность может быть с толстым дном, прозрачным или непрозрачным планшетом. В предпочтительном воплощении поверхность является пластиковой поверхностью из множества лунок, например, для культивирования тканей, например, 24-, 96-, 256-, 384-, 864- или 1536-луночным планшетом (например, модифицированным планшетом, таким как планшет для связывания ДНК производства Сотшид Со81ат). Якоря могут быть присоединены, например связаны непосредственно с поверхностью, или могут быть присоединены к одному типу поверхности, например стеклу, которое, в свою очередь, приводят в контакт со второй поверхностью, например «лункой» из пластика в титрационном микропланшете. Форма поверхности не является решающей. Она может быть, например, плоской поверхностью такой, как квадрат, прямоугольник или окружность; изогнутой поверхностью или трехмерной поверхностью такой, как гранула, частица, нить, осадок, трубочка, сфера и т.д.

Поверхность включает области, которые являются пространственно разобщенными и адресуемыми или идентифицируемыми. Каждая область включает ряд якорей. То, как разделены области, их физические свойства и их относительная ориентация по отношению друг к другу, не является решающим. В одном воплощении области можно отделить друг от друга любым физическим барьером, который устойчив для прохождения жидкостей. Например, в предпочтительном воплощении области могут представлять собой лунки в многолуночном планшете (например, для культивирования тканей), например, в 24-, 96-, 256-, 384-, 864- или 1536-луночном планшете. Альтернативно, поверхность может быть стеклянной поверхностью с гравировкой, чтобы на ней находилось, например, 864 или 1536 раздельных мелких лунок. Альтернативно, поверхность может включать области без разделений или лунок, т. е., например, быть плоской поверхностью, например кусочком пластика, стекла или бумаги, и отдельные области можно дополнительно разделить лежащей сверху структурой (например, кусочком пластика или стекла), которая будет разделять отдельные области. Необязательно поверхность может уже включать одну или более совокупностей якорей или якорей, связанных с линкерами, перед разделением на отдельные области. В другом воплощении совокупности якорей внутри каждой области можно отделить друг от друга контрольными пространствами на поверхности, на которых отсутствуют якоря, или химическими линиями раздела такими, как воск или силиконы, для предупреждения растекания капель.

В еще одном воплощении области можно выделить в виде трубочек или контролирующих жидкость каналов, например, предназначенных для проточных тестов, как раскрывается, например, у ВсаШс е! а1. (1995), С11П. С11ст. 4, 700-706. Трубочки могут быть любого размера, например это могут быть капилляры или более широкие трубочки для того, чтобы могли протекать жидкости, или они могут быть частично или полностью заполнены гелем, например агарозой или полиакриламидом, по которым осуществляется транспорт соединений (проходят через, протекают через, проходят под давлением через), например, при электрофорезе; или по каналам с заполненным матриксом пространством, например линейными каналами, описанными, например, у А1Ьо!а е! а1. (1998), 8с1еисе 281, 1653-1656; СитрЦои е! а1. (1998), Ма!. Кек. 8ос. 8утр. Ргос. 488, 217-225; и/или Ситрйои е! а1. (1999), Ыа!иге 398, 51-54. В подобном заполняющем пространство матриксе жидкость и/или молекулы могут двигаться не только в направлении, перпендикулярном стенкам трубочки, но также они могут диффундировать в латеральных направлениях. В предпочтительном воплощении трубочка заполнена гелем или заполняющим пространство матриксом; гель или заполняющий пространство матрикс активированы для связывания с якорями, и различные якоря проходят последовательно, что позволяет образоваться совокупности (например, линейной совокупности) якорей внутри геля; и линкеры, мишени и т.д. также проходят последовательно. Совокупность

- 4 011415 может быть линейной или 2- или 3-мерной.

В одной трубочке можно поставить множество тестов. Например, одну совокупность якорей или якорей, связанных с линкерами, в трубочке можно использовать повторно (например, соскребать и использовать повторно, или перепрограммировать) в последовательных тестах с одинаковыми или разными пробами. В другом воплощении множество трубочек используют в одном тесте, например, интересующую пробу анализируют во множестве трубочек, содержащих различные совокупности. Якоря или комплексы якорь/линкер в трубочках могут представлять любой из типов, описанных здесь.

Области внутри или на и т.д. поверхности можно отделить путем модификации самой поверхности. Например, поверхность из пластика может включать участки, сделанные из модифицированного или дериватизированного пластика, который может служить, например, в качестве сайтов для добавления специфических типов полимеров (например, ПЭГ можно связать с поверхностью из полистирола и затем дериватизировать по карбоксильной или аминогруппе, двойным связям, альдегидам и тому подобное). Альтернативно пластиковая поверхность может включать отлитые структуры, такие как выступы или выпуклости, которые могут выполнять роль площадок для добавления якорей. В другом воплощении области могут представлять собой гелевые основы, например основы из полиакриламидного геля или аэроосновы, которые располагаются в желаемом порядке на поверхности такой, как стекло, или их располагают между двумя поверхностями, например, такими как стекло и кварц. Якоря, линкеры и т.п.можно иммобилизовать на поверхности таких основ или можно погрузить внутрь. Специалисту в данной области, очевидно, будут понятны различные другие расположения гелевых основ на поверхностях, и которые можно получить обычными, общепринятыми в таких случаях методами. Тест-области могут располагаться в любой относительной ориентации, включая, но не ограничиваясь параллельными или перпендикулярными совокупностями внутри квадрата или прямоугольника, или другой поверхности, с радиальным распространением совокупностей внутри окружности или другой поверхности, или линейными совокупностями и т. д.

Пространственно разобщенные области по изобретению находятся во множестве копий. То есть, имеется, по меньшей мере, две, предпочтительно по меньшей мере двадцать или по меньшей мере примерно 24, 50, 96, 256, 384, 864, 1536, 2025 или более, и т.д. в основном одинаковых, пространственно разобщенных (отдельных) областей. Возрастающее число повторяемых областей позволяет проводить анализы со значительно более высокой пропускной способностью. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, в основном одинаковые области относится к областям, которые включают одинаковые или в основном одинаковые совокупности якорей и/или комплексы якорь/линкер. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, в основном одинаковые означает, что совокупность или область предназначена для выполнения в основном такой же функции, что и другая совокупность или область в отношении анализа мишени по данному изобретению. Различия, не оказывающие существенного влияния на функцию, т. е. детектируемость мишеней, совместимы с небольшими изменениями нуклеотидов (пропусками/вставками/заменами) или изменениями олигонуклеотидов (слабое связывание с поверхностью) и т.д., что в значительной мере не влияет на результаты определения.

Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что не все области на поверхности должны быть идентичны друг другу. Например, если параллельно проводится тест с двумя различными рядами совокупностей, то может быть выгодным включить оба ряда совокупностей на одной поверхности. Например, два различных ряда совокупностей можно расположить в чередующемся порядке, в виде полос для облегчения сравнения между ними. В другом воплощении практикующему специалисту может быть желательно включить области, которые можно детектировать отличным от других областей на поверхности образом, и использовать их в качестве «области(ей) регистрации». Например, область регистрации может включать олигонуклеотиды или пептиды, которые имеют различный тип флуоресцентных молекул, которые можно распознать сканирующим детектирующим устройством, в качестве «стартовой точки» для расположения областей на поверхности.

Размер и физическое размещение тест-областей не ограничиваются. Типичные области имеют площадь примерно от 1 до 700 мм², предпочтительно от 1 до примерно 40 мм², и они располагаются на расстоянии от 0,5 до примерно 5 мм друг от друга, и обычно выбраны в зависимости от площади. В предпочтительном воплощении области расположены примерно на расстоянии 5 мм друг от друга. Например, каждая область может включать прямоугольную сетку, например, с 8 рядами и 6 колонками из грубо округлых пятен якорей, которые в диаметре составляют примерно 100 мкм, и находятся на расстоянии 500 мкм друг от друга; такая область будет занимать площадь примерно 20 мм². Включаются области с большей и меньшей площадью и расстоянием между собой.

Области также можно дополнительно подразделить таким образом, что некоторые или все якоря области будут физически отделены от соседних якорей с помощью, например, впадин или углублений. Например, число подсекций (подобластей) в области может исчисляться в пределах примерно от 10 до примерно 100 или более или менее. В одном воплощении область, которая представляет лунку в 1536луночном планшете, может дополнительно подразделяться на меньшие лунки, например, примерно от 4 до примерно 900, предпочтительно примерно от 16 до примерно 36 лунок, образуя, таким образом, совокупность лунок внутри лунок. См. фиг. 4. Подобная поверхность с углублениями уменьшает толерант

- 5 011415 ность, необходимую для физического размещения одного якоря (или группы якорей) в каждом планируемом пространстве (локусе), и размер областей, содержащих якоря, является более однородным, что облегчает детектирование мишеней, которые связываются с зондом.

Термин «якорь» в том смысле, в котором он здесь используется, относится к любому веществу или соединению, например, молекуле, которая связывается (например, иммобилизуется на или присоединяется ковалентно или нековалентно) с поверхностью или участком такой поверхности (например, дериватизированным участком поверхности из пластика), и которая может специфически взаимодействовать или связываться с линкером или другим соединением, описанным выше. Участок якоря, который связывается, например, с молекулой линкера, может быть непосредственно присоединен к поверхности, или якорь может включать промежуточный «спейсер». Подобный спейсер может быть любым веществом, например, любым из различных веществ, которые являются общепринятыми в данной области. В одном воплощении спейсер представляет линейную углеродсодержащую молекулу, имеющую, например, примерно 5-20 атомов С, предпочтительно 12 атомов С. В другом воплощении спейсер представляет нуклеиновую кислоту (любую из описанных здесь типов), которая специфически не взаимодействует или связывается, например, с молекулой линкера.

Термин «якорь» в том смысле, в котором он здесь используется, также относится к группе, в основном, одинаковых якорей. Смотри, например, фиг. 7, на которой схематично представлена тест-область, включающая 3 якоря (А, В и С), каждый из которых находится в многочисленных копиях («группа»). Положение каждой группы якорей называется здесь «локусом». Как это хорошо известно специалистам в данной области, число отдельных якорных молекул, находящихся в локусе, ограничивается только физическими препятствиями, возникающими, например, в результате размера якорей. Например, локус, который имеет диаметр, например, примерно 25-200 мкм, может содержать миллионы якорей.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «комплекс якорь/линкер» существует, если якорь и линкер соединены молекулярной связью специфическим образом. Взаимодействие с линкером может быть либо необратимым, таким, как посредством определенных ковалентных связей, либо обратимым таким, как посредством гибридизации нуклеиновых кислот.

В предпочтительном воплощении якорь представляет нуклеиновую кислоту, которая может быть любой длины (например, олигонуклеотидом) или типа (например, ДНК, РНК, ПНК или продукт ПЦР молекулы РНК или ДНК). Нуклеиновую кислоту можно модифицировать или подвергнуть замещению (например, включить неестественные нуклеотиды такие, как инозин; соединить посредством известных связей таких, как сульфамат, сульфамид, фосфоротионат, метилфосфонат, карбамат и т.д. или получить полусинтетическую молекулу такую, как конъюгат ДНК-стрептавидин и т.д.). Предпочтительными являются одноцепочечные нуклеиновые кислоты.

Нуклеиновокислотный якорь может быть любой длины, совместимой с изобретением. Например, якорь может быть олигонуклеотидом длиной примерно от 8 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно 10, 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов. В другом воплощении якорь может быть длиной примерно от 50 до примерно 300 нуклеотидов или быть более длинным или коротким, предпочтительно примерно от 200 до примерно 250 нуклеотидов.

Например, якорь может включать примерно от 150 до примерно 200 нуклеотидов нуклеиновой кислоты-«спейсера», как описано выше, и смежную со спейсером, более короткую последовательность, например, примерно из 10, 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов, которая предназначена для взаимодействия с молекулой линкера («линкер-специфическая последовательность»). Такие спейсеры могут быть любой длины или типа нуклеиновой кислоты, и могут иметь любой состав оснований, который является функциональным для изобретения. В предпочтительном воплощении спейсеры каждого из якорей в локусе и/или якорей в различных локусах внутри области, в основном являются одинаковыми; так, якоря отличаются друг от друга в основном по их линкер-специфическим последовательностям.

Спейсеры могут придавать якорям преимущество, позволяющее повысить их производительность. Например, линкер-специфические участки такого якоря находятся дальше от поверхности и, следовательно, они имеют меньшие физические препятствия и подвергаются меньшему стерическому затруднению, чем нежели, если бы они находились ближе к поверхности. Это облегчает, например, связывание множества различных линкеров (например, примерно от 2 до примерно 100), обладающих различной специфичностью к мишени, с якорями в данном локусе. Как будет более подробно обсуждаться ниже, отдельный якорь может включать (в дополнении к спейсеру) множество линкер-специфических последовательностей, расположенных, например, в линейном порядке; это позволяет множеству различных типов линкеров связываться по меньшей мере с одним подобным якорем в данном локусе. Также ниже более подробно обсуждается другой путь, при котором множество различных типов линкеров может быть связано с якорями в данном локусе: в «смешанном локусе», где каждый из двух или более якорей связан с различным линкером, обладающим различной специфичностью к мишени. В результате физической гибкости якорей, включающих спейсеры, якоря в данном локусе могут легко связываться со множеством различных линкеров без физических затруднений со стороны молекул смежных якорей. Преимущество связывания множества линкеров с якорями в данном локусе заключается в том, что становится возможным детектировать большое число мишеней в определенном локусе. В одном воплощении множество

- 6 011415 линкеров, связанных в данном локусе, имеют зонды, которые специфичны для различных участков одной и той же интересующей мишеневой нуклеиновой кислоты (например, для различных олигонуклеотидных последовательностей внутри нуклеиновой кислоты). Это позволяет проводить амплифицированное детектирование мишени по сравнению с детектированием с одним зондом. В другом воплощении множество линкеров имеют зонды, которые являются специфическими к различным, не близким друг к другу мишеням. Это позволяет детектировать множество различных мишеней внутри определенного локуса. Дополнительным преимуществом якорей, включающих спейсеры, является то, что они могут легко включать линкеры, которые связаны с относительно крупными молекулами, например, такими, как белки, и/или которые связаны с относительно крупными мишенями, например, такими, как белки, мембраны или клетки.

Состав оснований нуклеиновокислотного якоря строго не ограничивается. Подходящим является любой состав оснований якорей при условии, что якоря являются функциональными для целей изобретения. Например, якоря на основе одноцепочечной нуклеиновой кислоты в локусе или в различных локусах области могут включать частично или полностью произвольные последовательности (например, произвольно полученные последовательности, например, без ограничений по относительным количествам А, С, Т и/или С). В одном воплощении якоря не являются «изомерами по последовательностям» (например, «произвольными изомерами по последовательностям»), т.е. олигонуклеотидами, содержащими одинаковые количества С, С, А и Т, но которые расположены в различном относительном порядке. То есть якоря, например, в различных локусах области не удовлетворяют уравнению С_пС_пА_тТ_т, где η и т целые числа. См., например, якоря, представленные в примере 1, которые не являются произвольными изомерами по последовательностям. В якорях по изобретению количество С и С не должно быть примерно одинаковым, как и относительные количества А и Т. Кроме того, суммарные относительные количества С, С, А и Т особым образом не ограничиваются. Например, состав оснований якорей в области может находиться в пределах от относительно высокого содержания СС (т.е. выше 50% С+С) до равного содержания С, С, А и Т, и до относительно высокого содержания АТ (т.е. выше 50% А+Т). В одном воплощении якоря получают произвольно, например, без ограничений в отношении относительно высоких количеств С, С, А и Т.

Якоря, включающие нуклеиновокислотный спейсер и один или более линкер-специфических участков, вряд ли будут согласовываться с любым конкретным ограничением в отношении состава оснований. Например, если якоря, расположенные в различных локусах в области, имеют спейсеры, которые в основном являются одинаковыми, например, представляют в основном одинаковый 25-мерный или 200мерный олигонуклеотид, то каждый якорь обладает различной линкер-специфической группой (например, 25-мерной), даже, если линкер-специфические группы удовлетворяют определенным требованиям (например, число А и С является примерно одинаковым, число Т и С является примерно одинаковыми; олигонуклеотид соответствует уравнению С_пС_пА_тТ_т; и/или содержание С+С удовлетворяет конкретному требованию), то в целом якоря не будут удовлетворять данным конкретным требованиям. Аналогично, даже если линкер-специфические группы якорей в различных локусах области в основном отличаются друг от друга (например, каждая линкер-специфическая группа имеет последовательность, которая отличается по меньшей мере примерно на 20 или 50%, или 80% от каждой другой линкер-специфической группы в области), то общая идентичность последовательностей якорей с учетом полной длины нуклеиновой кислоты может быть значительно меньше. Например, если каждый из якорей включает в основном одинаковый 25-мерный спейсер, и 25-мерную линкер-специфическую группу, которая на 100% отличается от каждой другой линкер-специфической группы в области, то якоря по-прежнему будут отличаться друг от друга только на 10%.

Якорь может быть пептидом или белком. Например, он может быть поликлональным или моноклональным антителом или их фрагментом, или одноцепочечным антителом или его фрагментом, которые специфически связываются с участком линкера, представляющим антиген или антитело; дополнительно якорь может быть пептидом, и участок линкера, который связывается с ним, может быть антителом или тому подобное. В другом воплощении якорь может быть лектином (таким, как конканавалин А или агглютинины из организмов, таких как Ыти1и8, земляной орех, золотистая фасоль, Рйа8ео1и8, зародыши пшеницы и т. д.), который является специфическим к определенному углеводу. В другом воплощении якорь может включать органическую молекулу, такую как модифицированный или дериватизированный пластиковый полимер, который может быть полезен, например, в качестве основы специфического твердофазового химического синтеза олигонуклеотида. В данном случае дериватизированный пластик может быть распределен в виде совокупности разобщенных, дериватизированных локусов, которые в целом образуют пластиковую поверхность комбинации в производственном процессе. В другом воплощении якорь обладает преимуществом специфического или предпочтительного связывания между ионами металлов, например, N1, Ζη, Са, Мд и т.д. и определенными белками и хелатообразующими агентами. Например, якорь может быть полигистидином, и якорь-специфический участок линкера может быть никелем, который связывается с помощью хелатообразующего агента для никеля с мишень-специфическим зондом. Альтернативно хелатообразующий агент может быть якорем, и полигистидин - участком, входящим в состав зонда. Альтернативно якорь может включать неорганическое соединение. Например, он

- 7 011415 может включать металл, такой как кальций или магний, и якорь-специфический участок линкера может быть предпочтительным хелатообразующим агентом, таким как, соответственно, ЭДТА или ЭГТА, который связывается с мишень-специфическим зондом. Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что широкий ряд других типов молекул может служить в качестве якорей как таковые общие типы, уже упомянутые в связи с зондами и мишенями.

Якорь также может быть гибридной структурой, такой как ДНК-дуплекс или дуплекс, включающий, например, ДНК и белок, которые специфически взаимодействуют любым путем, описанным здесь. Например, «основная группа» якоря-дуплекса (участка, который непосредственно контактирует с поверхностью) может включать необязательно модифицированную одноцепочечную нуклеиновую кислоту; предпочтительно основная группа также включает спейсер, например линейный углеродсодержащий спейсер, как описано выше. В одном воплощении вторая одноцепочечная нуклеиновая кислота связывается (например, гибридизуется) с данной основной группой с образованием якоря, который включает, по меньшей мере, частично двухцепочечную (дуплекс) нуклеиновую кислоту. Например, основная группа может включать линейный углеродсодержащий спейсер, который присоединен к поверхности по одному концу, и по другому концу связан с одноцепочечным ДНК-олигонуклеотидом примерно из 10-100 нуклеотидов, предпочтительно примерно из 25 нуклеотидов, и вторая группа дуплекса может включать последовательность, которая комплементарна, по меньшей мере, участку основной группы (например, примерно 40 концевым нуклеотидам), затем необязательный спейсер (например, примерно из 5-15, предпочтительно примерно из 10 нуклеотидов), затем линкер-специфическую последовательность (например, последовательность длиной примерно из 8-50 нуклеотидов, предпочтительно примерно 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов, наиболее предпочтительно примерно 25 нуклеотидов).

Относительная длина и состав оснований комплементарных участков якоря-дуплекса и его линкерспецифической последовательности(ей) могут быть различными для того, чтобы соответствовать требованиям теста, с использованием способов оптимизации, принятых в данной области. Например, последовательности можно выбрать таким образом, чтобы линкеры могли диссоциировать (например, отщепляться при плавлении) из дуплекса-якоря в условиях, при которых сами дуплекс-якоря остаются интактными. Затем оставшиеся совокупности дуплексов-якорей можно, если желательно, использовать повторно для гибридизации с таким же или другим линкерами. Альтернативно последовательности можно выбрать таким образом, чтобы как гибриды якорь/линкер, так и два комплементарных участка дуплексаякоря будут диссоциировать в одинаковых условиях, оставляя в контакте с поверхностью только основные группы. В одном воплощении все или в основном все основные группы в определенном локусе или во всех локусах области являются одинаковыми или в основном одинаковыми. Совокупности основных групп, оставшихся после подобной диссоциации, можно использовать повторно (например, для гибридизации с линкерами), только если возвращаются обратно комплементарные участки дуплекса-якорей, способом, для которого необходимо знать последовательность основной группы, которая принимает участие в образовании дуплекса. Возможность производства совокупностей якорей, которые можно или нельзя использовать повторно пользователем, которому неизвестна последовательность основных групп, представляет преимущество использования таких гибридных якорей. Например, изготовитель может предупредить неразрешенное повторное использование его совокупностей. Предупреждение такого повторного использования может, например, предотвратить проблемы снижения производительности или ненадежности, которые возникают в результате интенсивного использования.

В одном воплощении группа якорей в данном локусе внутри области является в основном одинаковой (например, они специфичны к «якорь-специфическому» участку линкера одного типа или только для одной мишени). См., например, фиг. 7. В другом воплощении множество различных якорей, обладающих специфичностью ко множеству различных линкеров и/или ко множеству различных мишеней, может находиться в определенном локусе, называемом «смешанным локусом», например, множество примерно из 2 до примерно 100, например по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 4 или, по меньшей мере 10. Преимущество смешанных локусов заключается в том, что при этом возможно детектирование большого числа различных мишеней в определенном локусе. В одном воплощении каждый смешанный локус содержит один якорь, который является одинаковым в каждом или по меньшей мере нескольких локусах. Например, якорь, который является одинаковым в более чем одном локусе, можно использовать для гарантии качества и/или контроля, или нормализации сигнала.

Конечно, «смешанные локусы» также являются преимущественными для поверхностей, имеющих только одну (неповторяющуюся) область. Якоря в каждом из локусов подобной отдельной области могут взаимодействовать с линкерами или непосредственно с интересующими мишенями.

Число якорей (т.е. групп якорей в отдельных локусах) в тест-области может составлять по меньшей мере два, предпочтительно в пределах примерно от 8 до примерно 900 (при большем или меньшем содержании), более предпочтительно примерно от 8 до примерно 300 и наиболее предпочтительно примерно от 30 до примерно 100 (например, примерно 64). В некоторых предпочтительных воплощениях имеется примерно 16, 36, 45 или 100 якорей/тест-область для поверхности с 96 тест-областями (например, лунками) или примерно 9, 16 или 25 якорей/тест-область для поверхности с 384 тест-областями (например, лунками). В наиболее предпочтительном воплощении каждый якорь в тест-области обладает раз

- 8 011415 личной специфичностью по сравнению с каждым другим якорем в совокупности. Однако два или более якорей могут обладать одинаковой специфичностью, и все якоря могут быть одинаковыми. В одном воплощении, в котором комбинация по изобретению включает очень большое число тест-областей (например, примерно 864, 1536 или выше) в результате чего можно одновременно обработать большое число тестируемых проб, то может быть интересным тестировать данные пробы только по ограниченному числу параметров (например, примерно 2, 4, 6 или 9). Другими словами, для комбинаций, включающих очень большое число областей, может быть преимущественным иметь только примерно 2-9 якорей на область.

Физическое расположение и относительная ориентация якорей (т.е. групп якорей в отдельном локусе) в или на тест-области не ограничиваются. Как правило, расстояние между якорями составляет примерно от 0,003 до примерно 5 мм или меньше, предпочтительно примерно от 0,03 до примерно 1. Возможны большие и меньшие расстояния между якорями (и их площадями).

Якоря можно расположить в любой ориентации относительно друг друга и границ области. Например, их можно расположить в двумерной ориентации, такой как квадратная, прямоугольная, шестиугольная или другая совокупность, или круговые совокупности с якорями, исходящими из центра в радиальных направлениях или в виде концентрических окружностей. Также якоря можно расположить в виде одномерной, линейной совокупности. Например, олигонуклеотиды можно гибридизовать со специфическими участками в последовательности ДНК или РНК с получением надмолекулярной совокупности или в линейном расположении в проточном геле или на поверхности проточного устройства или структуры внутри проточного устройства. Альтернативно, якоря могут быть углублены в «полосоообразное» образование (см. фиг. 6). Например, якоря могут быть в виде длинных полос, параллельных друг другу. Расстояние между или ширина каждой длинной линии может варьировать в регулярном порядке с получением простого, опознаваемого шаблона, напоминающего решетку, например, первая и третья линии могут быть в два раза длиннее остальных, линии могут быть пропущены и т. д. Дополнительную пустую линию можно поместить после последней линии для отделения одной тест-области, и решетка может повторяться в последующих тест-областях.

Расположение якорей не должно быть в строгом соответствии с положением разделенных аналитических лунок (тест-областей) или отдельных аналитических капель. Термин «аналитические положения» будет использоваться по отношению к аналитической поверхности, куда наносятся пробы для анализа. (Таковые можно определить, например, по положению отдельных капель пробы для анализа или по положению лунок, или разделителей, определяющих отдельные лунки для анализа на многолуночном планшете). Сам характер расположения якорей (например, «полосоообразный» характер расположения олигонуклеотидных якорей) используется для определения того, где точно располагается каждый отдельный якорь по характеру узнавания, поскольку каждая линия решетки распознается по ее положению относительно остальных линий. Следовательно, не требуется, чтобы первый якорь находился на одном крае или в одном углу каждого аналитического положения. Первый якорь будет обнаружен характером узнавания в большей мере, чем по положению относительно аналитического положения. Поскольку площадь, используемая для каждого аналитического положения (например, площадь капли или площадь лунки), является достаточно большой для того, чтобы включать по меньшей мере одну цельную единицу повторяющихся совокупностей якорей, то затем в каждой точке анализа проба будет тестироваться по положению анализа для всех мишеней, определенных по (решетке) совокупности, где совокупность находится внутри площади аналитического положения.

Не требуется, чтобы якоря располагались в строгом или даже фиксированном порядке внутри каждой тест-области. Например, каждый якорь может быть соединен с частицей, гранулой или тому подобное, которые принимают произвольное положение внутри тест-области. Положение каждого якоря можно определить при использовании, например, детектируемой метки. Например, в линкер, специфический для каждого типа якорей, можно ввести различную флуоресцентную, люминесцентную и т. д. метку, и можно определить положение частицы, содержащей определенную пару линкер/якорь, по природе сигнала, исходящего от линкера, например по спектру возбуждения или эмиссии. Специалисты в данной области могут приготовить ряд линкеров с различными такими прикрепленными метками, каждая имеющая различимый спектр. Альтернативно, якоря можно пометить непосредственно. Например, в каждый тип якорей можно ввести метку, которая будет флуоресцировать с характерным спектром, отличным от меток якорей других типов. Альтернативно частицы, гранулы или тому подобное могут различаться друг от друга по размеру или форме. Можно использовать любой метод мечения и детектирования, описанный здесь. Например, интенсивность флуоресценции можно определить при использовании системы для визуализации на основе ССД, с помощью сканирующего флуоресцентного микроскопа или клеточного сортера с возбуждением флуоресценции.

Якорь может взаимодействовать или специфически связываться с одним участком - якорьспецифическим участком - линкера. В данном случае под терминами «взаимодействовать» или «связываться» понимается, что два вещества или соединения (например, якорь и якорь-специфический участок линкера, зонд и его мишень или мишень и мишень-специфический репортер) связываются (например, присоединяются, связываются, гибридизуются, совмещаются, подвергаются отжигу, ковалентно связы

- 9 011415 ваются или как-то соединяются иначе) друг с другом в достаточной мере для проведения предназначаемого анализа. В данном случае под термином «специфический» или «специфически» понимается, что два компонента (например, якорь и якорь специфическая область линкера, зонд и его мишень или мишень и мишень-специфический репортер) избирательно связываются друг с другом, и в отсутствии любой защиты, но, как правило, не с другими компонентами, не предназначенными для связывания с данными компонентами. Параметры, необходимые для специфических взаимодействий, можно определить обычными методами, например с использованием общепринятых в данной области методов.

Специалист в данной области может определить экспериментально свойства нуклеиновых кислот (такие, как длину, состав оснований и степень комплементарности), которые будут способствовать тому, чтобы нуклеиновая кислота (например, олигонуклеотидный якорь) гибридизовалась с другой нуклеиновой кислотой (например, якорь-специфическим участком линкера) в условиях выбранной жесткости, одновременно сведя до минимума неспецифическую гибридизацию с другими соединениями или молекулами (например, другими олигонуклеотидными линкерами). Как правило, ДНК или другая нуклеиновокислотная последовательность якоря, участка линкера или детектирующего олигонуклеотида будут обладать достаточной комплементарностью в отношении партнера по связыванию, способствующей гибридизации в выбранных жестких условиях гибридизации, и значение Т_т будет составлять примерно на 10-20°С выше комнатной температуры (например, примерно 37°С). В основном олигонуклеотидный якорь может иметь длину в пределах примерно от 8 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «высоко жесткие условия гибридизации» означают любые условия, при которых будет происходить гибридизация, когда имеется по меньшей мере 95%, предпочтительно от 97 до 100% комплементарность нуклеотидов (идентичность) между нуклеиновыми кислотами. Однако в зависимости от желаемой цели можно выбрать условия гибридизации, для которых потребуется меньшая комплементарность, например на уровне примерно 90, 85, 75, 50% и т.д. Параметрами реакции гибридизации, которые могут различаться, являются концентрация соли, буфер, значение рН, температура, время инкубации, количество и тип денатурирующего агента, такого как формамид и т.д. (смотри, например, 8атЬгоок е! а1. (1989), Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (2й ей.) Уо1к. 1-3, Со1й 8рппд НагЬог Ргекк, Ыете Уогк; Натек е! а1. (1985), Ыис1ею Ас1й НуЬпЙ1/а1юп. 1Ь Ргекк; Ωηνίκ е! а1. (1986), Вакю Ме11юйк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Е1кеу1г 8с1епсек РиЬйкЫпд, 1пс., Ыете Уогк). Например, нуклеиновую кислоту (например, линкерные олигонуклеотиды) можно внести в тест-область (например, лунку многолуночного планшета - в предпочтительном воплощении 96или 384-луночного или более планшета) в объеме в пределах примерно от 0,1 до примерно 100 мкл или более (в предпочтительном воплощении, примерно от 1 до примерно 50 мкл, наиболее предпочтительно примерно 40 мкл) при концентрации в пределах примерно от 0,01 до примерно 5 мкМ (в предпочтительном воплощении примерно 0,1 мкМ) в буфере, например, таком как 6Х 88РЕ-Т (0,9М ЫаС1, 60 мМ ЫаН₂РО₄, 6 мМ ЭДТА и 0,05% Тритона Х-100) и гибридизировать со связывающимся партнером (например, олигонуклеотидным якорем на поверхности) в течение примерно от 10 мин до примерно, по меньшей мере, 3 ч (в предпочтительном воплощении, по меньшей мере, в течение 15 мин) при температуре в пределах примерно от 4 до примерно 37°С (в предпочтительном воплощении примерно при комнатной температуре). Условия могут быть выбраны для получения высокой пропускной способности. В одном воплощении изобретения условия реакции можно приблизить к физиологическим условиям.

Конструирование других типов соединений или молекул (например, полипептидов, лектинов и т.д.), которые могут служить, например, в качестве якорей или участков линкеров, и условия реакции, необходимые для достижения специфических взаимодействий со связывающимися партнерами, являются обычными и общепринятыми в данной области (например, как описано у Метеуег е! а1. (1994), М.1с1. Ас1йк Век. 22, 5530-5539; Еойог е! а1. (1996), в патенте США № 5510270; Ритипд е! а1. (1992), в патенте США № 5143854). Параметрами инкубации являются буфер, концентрация соли, значение рН, температура, время инкубации, присутствие носителя и/или агентов или условий, способствующих уменьшению неспецифических взаимодействий и т.д. Например, в тест-область (например, лунку многолуночного планшета, в предпочтительном воплощении 96- или 384-луночного или более планшета), которая содержит в качестве якорей антитела, можно внести анти-антитела (например, антигены или антитело специфические вторичные антитела) в объеме в пределах примерно от 0,1 до примерно 100 мкл или выше (в предпочтительном воплощении примерно от 1 до примерно 50 мкл, наиболее предпочтительно примерно 40 мкл) при концентрации в пределах примерно от 10 пкМ до примерно 10 нМ (в предпочтительном воплощении примерно 1 нМ) в буфере, например, таком, как 6Х 88РЕ-Т, РВ8 или физиологический раствор, и инкубировать с якорями на поверхности в течение примерно от 10 мин и до по меньшей мере примерно 3 ч (в предпочтительном воплощении по меньшей мере в течение 15 мин) при температуре в пределах от 4 до примерно 45°С (в предпочтительном воплощении примерно 4°С). Для якорей на основе пептидов предпочтительной является длина примерно от 5 до примерно 20 аминокислот.

В некоторых воплощениях изобретения каждый якорь в совокупности может взаимодействовать с якорь-специфическим участком соответствующего ему линкера в основном в той же степени, что и другие якоря в совокупности, в выбранных условиях реакции. Это может гарантировать, что якоря точно обеспечивают в основном однородную совокупность линкеров и, следовательно, зондов.

- 10 011415

Якоря (т.е. группы якорей в отдельных локусах) внутри тест-области могут быть «родственного» ряда, т.е. каждый якорь которого может взаимодействовать с одним или более различными линкерами, имеющими участок, специфичный к подобному якорю, но различающиеся по участкам «зонда»; таким образом, одну совокупность родственных якорей можно использовать для программирования или определения различных рядов зондов. Гибкую природу такой родственной совокупности якорей можно увидеть при обращении к фиг. 1 и 2. На фиг. 2 представлена поверхность, включающая 15 тест-областей, каждая из которых содержит совокупность из 6 различных якорей, которые в данном примере являются олигонуклеотидами. На фиг. 1 представлен один из (олигонуклеотидных) якорей, якорь 1, который контактирует с линкером 1, включающим один участок, специфический к якорю 1, и второй участок, специфический к мРНК-мишени 1. Альтернативно, можно заменить, например, на линкер 2, который как и линкер 1, включает участок, специфический к якорю 1, но который включает второй участок, специфический к мРНК-мишени 2 вместо мРНК-мишени 1. Так, якорь 1 можно использовать для определения (или программирования, или установления, или определения) зондов для каждой из двух или более различных мРНК-мишеней. Способ получения и присоединения высокоразрешающего ряда (совокупности) олигонуклеотидов или пептидов может быть дорогостоящим, длительным по времени и/или физически трудно выполнимым. Возможность применять заранее определенную совокупность якорей для программирования широкого ряда совокупностей зондов является еще одним преимуществом данного изобретения.

Несмотря на то, что родственные якоря, представленные на фиг. 2, определяют характер олигонуклеотидных зондов, совокупность одинаковых зондов можно также использовать для программирования совокупности различных зондов, например, рецепторных белков (см., например, фиг. 3). Понятно, что возможны многие пермутации, в результате которых получают ряд типов взаимодействий якорь/линкер, например, даже более сложных зондов типа «сэндвич» или «многослойные», таких как комбинации белок/антитело. Например, в одном воплощении родственный ряд якорей можно связать (ковалентно или нековалентно) с рядом линкеров с получением модифицированной совокупности «конъюгированных» якорей, как более подробно представлено ниже. Таким образом, поверхность якорей по изобретению сама по себе предоставляет новые преимущества.

В одном воплощении изобретения якоря могут взаимодействовать с линкерами обратимо, так, ряд близких якорей можно использовать повторно для программирования других рядов зондов. Например, олигонуклеотидный якорь можно отделить от олигонуклеотидного участка линкера, например, при нагревании, которое приводит к диссоциации двух олигонуклеотидов, и затем можно вновь связать его со вторым линкером. Способность повторного использования совокупностей якорей, получение которых может быть дорогостоящим, длительным по времени и/или физически трудно выполнимым, является еще одним преимуществом изобретения.

Якорь необязательно должен взаимодействовать с линкером. Например, якорь можно связать (прямо или опосредованно) с детектируемой молекулой, такой как флуорохром, и тем самым он может служить для установления локализации пятна внутри сетки, например, в целях различения тест-поверхности и детектора. Альтернативно, в якорь можно ввести метку с известным количеством детектируемой молекулы, тем самым она будет служить в качестве внутреннего маркера для количественного определения, например, для калибровки.

В том смысле, в котором он здесь используется, термин «линкер» относится к бифункциональному соединению, которое содержит первый участок (или группу, или область), который специфичен к выбранному (сконструированному) якорю или подгруппе якорей («якорь-специфический»), и второй участок, который включает зонд, специфический к интересующей мишени («мишень-специфический»). Два участка линкера могут быть соединены посредством ковалентной или нековалентной связи, и могут быть связаны непосредственно или посредством промежуточной группы (например, спейсера).

Химическая природа якорь-специфического участка линкера, конечно, является функцией якоря или якорей, с которыми он взаимодействует. Например, если якорь представляет олигонуклеотид, то участок линкера, который с ним взаимодействует, может быть, например, пептидом, который специфически связывается с олигонуклеотидом, или нуклеиновой кислотой, которая может эффективно и специфически гибридизироваться с ним в выбранных жестких условиях гибридизации. Нуклеиновая кислота может быть, например, олигонуклеотидом, ДНК, РНК, ПНК, продуктом ПЦР или замещенной или модифицированной нуклеиновой кислотой (например, включающей неестественные нуклеотиды, например, такие как инозин; соединенной посредством различных известных связей, таких как сульфамат, сульфамид, фосфоротионат, метилфосфонат, карбамат; или полусинтетической молекулой, такой как конъюгат ДНКстрептавидин и т.д.). Предпочтительными являются одноцепочечные группы. Участок линкера, специфический к олигонуклеотидному якорю может иметь длину в пределах примерно от 8 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно примерно 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов. Если якорь представляет антитело, то участок линкера, который взаимодействует с ним, может быть, например, анти-антителом, антигеном или более мелким фрагментом одной из этих молекул, которые могут специфически взаимодействовать с якорем. Соединения или молекулы, которые специфически взаимодействуют с другими типами якорей, описанными выше, и которые могут служить в качестве якорь-специфического участка линкера,

- 11 011415 являются хорошо известными в данной области, и могут быть получены с использованием общепринятых методов (например, см. выше).

Химическая природа мишень-специфического участка линкера, конечно, является функцией мишени, для которой является зондом и с которым она взаимодействует. Например, если мишень представляет определенную мРНК, то мишень-специфический участок линкера может быть, например, олигонуклеотидом, который специфически связывается с мишенью, но не взаимодействует с РНК или ДНК в выбранных условиях гибридизации. Специалист в данной области с использованием общепринятых в данной области методов экспериментально определит свойства олигонуклеотида, который будет оптимально гибридизироваться с мишенью, при минимальной гибридизации с неспецифической мешающей ДНК или РНК (например, смотри выше). Как правило, длина олигонуклеотидного зонда, используемого для обнаружения мРНК-мишени, находящейся на фоне большого избытка немишеневой РНК, может составлять примерно от 8 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно примерно 18, 20, 22 или 25 нуклеотидов. Олигонуклеотидный зонд для применения в биохимическом анализе, при котором отсутствует значительный фон конкурентных мишеней, может быть короче. С использованием принятых в данной области методов (например, компьютерной программы ВЬЛ8Т) можно выбрать последовательности олигонуклеотидных зондов, которые взаимонесвязаны и отличаются от потенциально мешающих последовательностей в известной базе данных по генетике. Обычным образом можно выбрать условия гибридизации, позволяющие протекать специфической гибридизации олигонуклеотидного зонда с РНК с использованием общепринятых в данной области методов (например, смотри выше). Например, РНК-мишень (например, общую фракцию РНК или мРНК, выделенную из тканей и клеток, культивированных (и необязательно обработанных интересующим агентом) в любой емкости, такой как лунки многолуночного титрационного микропланшета (например, 96 или 384 лунок или более), вносят в тест-область, содержащую совокупность олигонуклеотидных зондов (смотри выше) в буфере таком, как 6Х 88РЕ-Т или других, необязательно содержащем агент для уменьшения неспецифического связывания (например, примерно 0,5 мг/мл разрушенной ДНК спермы сельди или лосося, или дрожжевой РНК) и инкубируют при определенной эмпирическим путем температуре в течение периода времени в пределах примерно от 10 мин и до по меньшей мере 18 ч (в предпочтительном воплощении примерно 3 ч). Жесткость условий при гибридизации может быть такой же или ниже, чем жесткость, используемая для связывания якорей с якорь-специфическим участком линкеров. Конструирование и применение других типов зондов также является обычным в данной области, например, как уже обсуждалось выше.

В одном воплощении все или в основном все линкеры, связанные с якорями в данном локусе, содержат одинаковый (или в основном одинаковый) зонд, который является специфичным к отдельной, специфической интересующей мишени. В другом воплощении один или более линкеров, связанных с якорями в данном локусе, включает множество различных зондов и таким образом является специфичным к множеству различных мишеней. Данные зонды можно расположить в линкере в виде части разветвленной структуры или предпочтительно можно расположить в линейном порядке, и они могут представлять собой одно и тоже вещество (например, все являются нуклеиновой кислотой, или все представляют пептидные последовательности) или комбинации различных веществ. На практике наличие множества зондов в каждом линкере повышает число мишеней, которые можно детектировать в конкретном локусе. В одном воплощении во множестве зондов в данном линкере все являются специфичными к конкретной интересующей мишени (например, они специфичны к различным участкам отдельной интересующей мРНК или специфичны к защитным от нуклеаз фрагментам, соответствующим различным участкам этой мРНК); это повышает чувствительность анализа в отношении мишени, например, мишени, которая находится в пробе в низкой концентрации. Число зондов в линкере может составлять, например, примерно 2-50, предпочтительно примерно 2, 4 или 10.

Конечно, линкеры, которые включают такое множество различных зондов, также являются преимущественными для применения с поверхностями, которые содержат одну (неповторяющуюся) область.

Якорь-специфический и мишень-специфический участки линкера можно объединить (соединить, связать) посредством любой из различных ковалентных или нековалентных связей, природа которых не имеет значения для изобретения. Два участка можно соединить непосредственно или с помощью промежуточной молекулы. В одном воплощении, в котором оба участка линкера представляют олигонуклеотиды, их можно соединить ковалентными связями, такими как фосфодиэфирные связи с получением одной, колинеарной нуклеиновой кислоты. В другом воплощении, в котором якорь-специфический участок является олигонуклеотидом, и мишень-специфический участок представляет рецептор, например, рецепторный белок, то два участка можно соединить посредством взаимодействия молекул биотина и стрептавидина, пример представлен на фиг. 3. Известно много вариантов таких связей (например, смотри №етеуег с1 а1. (1994), ΝΆΚ 22, 5530-5539). Альтернативно два участка можно соединить непосредственно, например, олигонуклеотид можно амидировать и затем непосредственно связать (например, сшить поперечными связями) с пептидом или белком по амидной связи, или присоединить к мембранному компоненту через амидную связь или присоединить к липиду. Способы образования таких ковалентных и нековалентных связей являются обычными, и специалист в данной области может легко их оптимизиро

- 12 011415 вать. Спейсерные последовательности (например, нуклеиновая кислота) также может находиться между якорь-специфическим и мишень-специфическим участками линкера.

После связывания двух соединений (например, при инкубации двух нуклеиновых кислот, двух белков, белка плюс нуклеиновой кислоты или других) с образованием комплекса (такого, как, например, комплекс якорь/линкер), полученный комплекс можно необязательно обработать (например, промыть) для удаления несвязанных соединений (например, линкеров) с использованием условий, которые можно легко определить эмпирически, оставляя специфические взаимодействия интактными, но удаляя при этом неспецифически связанные вещества. Например, реакционные смеси можно промыть от одного до десяти раз или более в аналогичных или несколько более жестких условиях, которые использовались для получения комплекса (например, комплекса якорь/линкер).

Специалисту в данной области, очевидно, понятно, что можно получить различные типы «сэндвичей» якорей и линкеров. Например, к совокупности якорей (например, из якорей, имеющих в основном одинаковые последовательности) можно присоединить первую группу линкеров, каждый из которых имеет первую группу, специфическую к якорю, и вторую группу, специфическую к одному из второй группы линкеров и так далее. На практике данный второй слой «сэндвича» позволяет превратить первую группу якорей (например, одинаковых олигонуклеотидов) в другую совокупность, имеющую другую группу специфичностей, «конъюгированных» якорей. Различные группы линкеров и якорей можно связать друг с другом ковалентно или нековалентно, как желательно.

Комбинации по данному изобретению можно производить обычным образом с использованием общепринятой технологии.

Некоторые поверхности, которые можно использовать по изобретению, являются промышленно доступными из различных источников. В предпочтительном воплощении поверхность представляет 96-, 384- или 1536-луночный титрационный микропланшет такой, как модифицированные планшеты производства Сотшпд Сойат. Альтернативно, поверхность, включающая лунки, которые, в свою очередь, содержат впадины или «углубления», которые можно сделать микрообработкой соединения, такого как алюминий или сталь, с получением формы, затем микроинъецировать пластик или аналогичный материал в форму с получением структуры, такой как представлена на фиг. 4. Альтернативно, можно собрать структуру такую, как представлена на фиг. 4 из стекла, пластика, керамики или тому подобное, например, из трех частей таких, как представлены на фиг. 5; первой секции, называемой луночным разделителем (фиг. 5а), который будет образовывать разделения между лунками для проб; второй секции, называемой подразделителем (фиг. 5Ь), который будет образовывать подразделы или углубления внутри каждой тест-лунки и третьей секции, называемой основанием (фиг. 5с), которая будет образовывать основание планшета и нижнюю поверхность тест-лунок. Разделителем может быть, например, кусочек материала, например, силикона с расположенными на нем отверстиями так, что каждое отверстие будет составлять стенки тест-лунки при соединении трех кусочков. Подразделителем может быть, например, тонкий кусочек материала, например, силикона, имеющий форму сита или мелкой сети. Основание может быть плоским кусочком из материала, например стекла, например, в форме нижней части обычного микропланшета, используемого для проведения биохимических анализов. Верхняя поверхность основы может быть плоской, как представлено на фиг. 5с, или может иметь впадины, которые будут расположены с подразделителем для обеспечения подсекций, или лунок внутри каждой лунки для проб. Три части можно соединить обычными способами, например, способами, используемыми для сборки силиконовых облаток.

Олигонуклеотидные якоря, линкеры или детекторы можно синтезировать с использованием общепринятой технологии, например, с помощью промышленно доступного синтезатора олигонуклеотидов и/или лигированием субфрагментов, которые были синтезированы таким образом. Нуклеиновые кислоты, которые являются слишком длинными для удобного синтеза с помощью таких способов, можно получить амплификацией, например, с помощью ПЦР при использовании общепринятых методов. В одном воплощении изобретения предопределенные нуклеиновокислотные якоря такие, как олигонуклеотидные якоря, можно расположить на или внутри поверхности тест-области с помощью любого из общепринятых в таких случаях методов, включая фотолитографию или химическое соединение, расположение с помощью чернил, капилляры, решетчатые или канальные чипы, электрохимию с использованием электродов, контактирование со штифтом или стержнем, или денатурацию с последующим облучением УФ на фильтрах (например, см. Ката е! а1. (1996), патент США № 5545531; Робот е! а1. (1996), патент США № 5510270; 2апхисс1и е! а1. (1997), патент США № 5643738; Вгеппап (1995), патент США № 5474796; заявку на патент \УО 92/10092; заявку на патент XVО 90/15070). Якоря можно поместить в верхней части поверхности тест-области, или, например, в случае основы из полиакриламидного геля их можно погрузить внутри поверхности так, чтобы некоторые якоря выступали из поверхности и были доступными для взаимодействия с линкером. В предпочтительном воплощении предопределенные олигонуклеотидные якоря дериватизируют по 5'-концу свободной аминогруппой; растворяют при концентрации, обычно легко определяемой эмпирически (например, примерно 1 мкМ) в буфере, таком как 50 мМ фосфатный буфер, рН 8,5 и 1 мМ ЭДТА и распределить с помощью пипетки-дозатора (Сайеиаи Тесйпо1од1е8) в каплях объемом примерно 10,4 нанолитров в определенных положениях внутри тест-лунки, чья верхняя поверх

- 13 011415 ность представляет свежий планшет для связывания ДНК (Согшид Сок!аг). В зависимости от относительной скорости присоединения олигонуклеотида и испарения может быть необходимым контролировать влажность в лунках во время приготовления. В другом воплощении олигонуклеотидные якоря можно синтезировать непосредственно на поверхности тест-области с использованием общепринятых методов, таких как активированное снятие защиты с наращивающихся олигонуклеотидных цепей (например, в сочетании с использованием сайт-направленной «маскировки») или распределением нанолитровых капель деактивирующего соединения с использованием пипетки-дозатора. Можно провести снятие защиты со всех наращивающихся последовательностей для получения, например, отдельного нуклеотида, и затем нуклеотид нанести на поверхность. В другом воплощении олигонуклеотидные якоря можно присоединить к поверхности через 3'-концы олигонуклеотидов с использованием обычной методологии.

Пептиды, белки, лектины, хелатообразователи, пластики и другие типы якорей или линкеров также можно получить обычными способами, и якоря можно расположить на или внутри поверхностей с использованием подходящей доступной технологии (см., например, Ройог с1 а1. (1996), патент США № 5510270; Рптиид е1 а1. (1992), патент США № 5143854; /ап/иссЫ е1 а1. (1997), патент США № 5643738; 1,о\\е е1 а1. (1985), патент США № 4562157; Метеуег е1 а1. (1994), ΝΑΚ 22, 5530-5539).

В некоторых воплощениях изобретения раскрытые комбинации используются в самых различных скрининговых способах и/или для получения информации об уровне, активности или структуре зондов или молекул-мишеней. Подобные тесты называются скрининговыми со множеством совокупностей на планшетах (МАРЕ) способами или анализами, и поверхности, содержащие совокупности якорей и якорей плюс зондов, которые используются для анализов, называются МАРЕ-тестами или МАРЕ-планшетами.

Компоненты реакционной смеси, анализ или способ скрининга можно объединить в любом порядке. Например, якоря, линкеры и мишени можно объединить последовательно, или мишени и линкеры, в присутствии или отсутствии репортеров, можно объединить в растворе и затем привести в контакт с якорями.

Одно воплощение изобретения относится к способу детектирования по меньшей мере одной мишени, включающему:

a) контактирование пробы, которая может включать указанную мишень(и) с бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичными к олигонуклеотидному якорю, и второй участок, содержащий зонд, специфичным к указанной мишени(ей) в условиях, эффективных для получения первого продукта гибридизации между указанной мишенью(ями) и указанным линкером;

b) контактирование указанного первого продукта гибридизации с комбинацией в условиях, эффективных для получения второго продукта гибридизации между указанным первым продуктом гибридизации и указанной комбинацией, где указанная комбинация включает, перед добавлением указанного первого продукта гибридизации:

1) поверхность, содержащую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых являются в основном одинаковыми, где каждая область включает

2) по меньшей мере 8 различных олигонуклеотидных якорей;

c) контактирование указанного первого продукта гибридизации или указанного второго продукта гибридизации с меченым детектирующим зондом и

й) детектирование указанного детектирующего зонда. Каждый из анализов или способов, описанных ниже, можно проводить высокопроизводительным способом, при котором большое количество проб (например, примерно 864, 1036, 1536, 2025 или более, в зависимости от числа областей в комбинации) анализируют на каждом планшете или поверхности быстро и одновременно. Кроме того, многие планшеты или поверхности можно обработать одновременно. Например, при разработке лекарственных препаратов большое количество проб, каждая содержащая потенциальный лекарственный препарат (например, соединение из комбинаторной химической библиотеки, такой как варианты небольших молекул, пептидов, олигонуклеотидов, или других соединений) можно внести в отдельные области, описанной комбинации, или можно добавить в биологические или биохимические пробы, которые затем вносят в отдельные области комбинации и инкубируют с совокупностями зондов, находящихся в областях; и тесты можно проводить с каждой из проб. С учетом последних достижений и продолжающейся разработки микропланшетов с высокой плотностью, инструментов для нанесения ДНК и таких методов, как лазерная технология для получения и сбора данных даже от очень плотных микропланшетов, применения автоматики, усовершенствованных дозаторов, сложных современных детектирующих систем и программного обеспечения для обработки данных, способы по данному изобретению можно использовать для скрининга и анализа тысяч или десятков тысяч соединений в день.

Например, в воплощениях, где зонды представляют олигонуклеотиды, анализ может быть скринингом с применением диагностической нуклеиновой кислоты или полинуклеотида (например, в тесте связывания или другом) большого числа проб на присутствие генетических вариаций или дефектов (например, полиморфизма или специфических мутаций, связанных с заболеваниями такими, как кистозный фиброз. Смотри, например, 1Юа е1 а1. (1992), Мо1еси1аг апй Се11и1аг РгоЬек 6, 505-512); патогенных микроорганизмов (таких, как бактерии, вирусы и простейшие, хозяевами которых являются животные, включая людей, или растения) или типов транскрипции мРНК, которые являются диагностическими для оп

- 14 011415 ределенных физиологических состояний или заболеваний. Совокупности нуклеиновокислотных зондов, включающих участки Е8Т (включая полноразмерные копии), можно использовать для оценки характера транскрипции в клетках, из которых были получены Е8Т (или другие). С помощью нуклеиновокислотных зондов также можно детектировать пептиды, белки или домены белков, которые специфически связываются с определенными нуклеиновокислотными последовательностями (и тому подобное).

Аналогично в воплощениях, в которых зонды представляют собой антигенсвязывающие молекулы (например, антитела), тест может быть скринингом вариантных белков или типов экспрессии белков, которые являются диагностическими для определенных физиологических состояний или болезненных состояний. Смотри, например, фиг. 40 и 41, на которых представлены типы молекул, которые можно детектировать.

В другом воплощении комбинации по изобретению можно использовать для мониторинга биохимических реакций, например, при взаимодействии белков, нуклеиновых кислот, небольших молекул и тому подобное, например, в отношении эффективности или специфичности взаимодействия между антигенами и антителами, или рецепторами (таких, как очищенные рецепторы или рецепторы, связанные с клеточными мембранами) и их лигандами, агонистами или антагонистами, или ферментами (такими, как протеазы или киназы) и их субстратами, или увеличения или уменьшения количества субстрата, превращаемого в продукт, а также многого другого. Некоторые биохимические тесты можно применять для характеристики свойств зонда или мишени, или в качестве основы скринингового теста. Например, для проведения скрининга проб на присутствие определенных протеаз (например, протеаз, принимающих участие в свертывании крови, таких как протеазы Ха и УИа), пробы можно тестировать на комбинациях, в которых зонды являются флуорогенными соединениями, специфическими к каждой интересующей протеазе. Если мишеневая протеаза связывается с и отщепляет субстрат, то субстрат будет флуоресцировать, обычно в результате, например, отщепления и разделения двух пар, переносящих энергию, и в результате сигнал можно детектировать. В другом примере для скрининга проб на присутствие определенной киназы(киназ), (например, 8тс, тирозинкиназы или ΖΑΡ70), пробы, содержащие одну или более интересующих киназ, можно подвергнуть анализу на комбинациях, в которых зонды представляют пептиды, которые можно избирательно фосфорилировать с участием одной из интересующих киназ. С использованием принятых в данной области, легко определяемых условий, пробы можно инкубировать с совокупностью субстратов в подходящем буфере и в присутствии необходимых кофакторов в течение эмпирически подобранного периода времени. (В некоторых тестах, например, при проведении биохимических исследований по факторам, которые регулируют активность интересующих киназ, концентрацию каждой киназы можно довести таким образом, чтобы каждый субстрат фосфорилировался с одинаковой скоростью). После обработки (например, промывания) каждой реакционной смеси в эмпирически подобранных условиях для удаления киназ и нежелательных компонентов реакции (не обязательно), можно детектировать фосфорилированные субстраты, например, при их инкубации с детектируемыми реагентами, такими как меченные флуоресцеином антитела к антифосфотирозину или антитела к антифосфосерину (например, в концентрации примерно 10 нМ или выше, или ниже), и в итоге можно детектировать сигнал. В другом примере можно поставить тесты связывания. Например, 8Н2-домены такие, как СКБ2 8Н2 или ΖΑΡ70 8Н2, можно подвергнуть анализу на совокупности зондов из соответствующих фосфорилированных пептидов; или сыворотку крови можно подвергнуть скринингу на совокупности зондов из определенных рецепторов на наличие иммунодефицита. Кроме того, с использованием подобной совокупности можно провести иммуноферментный анализ. Комбинации по изобретению также можно использовать для обнаружения мутантных ферментов, которые являются более или менее активными по сравнению с аналогами дикого типа, или скрининга различных агентов, включая гербициды или пестициды.

Конечно, ΜΑΡδ-тесты можно использовать для количественного анализа (количественного определения) активной мишени в пробе, при условии, что зонд не является полностью занятым, т. е. не более чем примерно 90% доступных сайтов зонда связано (или реактивировано, или гибридизировано) с мишенью. В этих условиях можно количественно определить мишень, поскольку чем больше мишени, тем больше будет связан зонд. С другой стороны, в условиях, когда более чем примерно 90% доступных сайтов зонда связано, то при увеличении количества мишени не будет происходить увеличения количества мишени, связанной с зондом. Таким образом, можно количественно определять любую из вышеуказанных типов мишеней. Например, в примере 6 описано количественное определение олигонуклеотидных мишеней. Кроме того, там же показано, что даже если мишень находится в большом избытке (например, если она находится в таких больших количествах, что насыщает количество доступного зонда в ΜΑΡ8совокупности зондов), то при добавлении известных количеств не включающей метку мишени в смесь для связывания, можно «сдвинуть чувствительность» реакции для того, чтобы стало возможным количественно определить даже такие большие количества мишени.

В другом воплощении комбинации по изобретению можно использовать для скрининга агентов, которые модулируют взаимодействие мишени и данного зонда. Агент может модулировать взаимодействие мишень/зонд, взаимодействуя непосредственно или опосредованно либо с зондом, мишенью, либо с комплексом, образованным мишенью и зондом. Модуляция может принимать самые разнообразные формы, включая, но не ограничиваясь повышением или снижением аффинности связывания мишени с

- 15 011415 зондом, повышением или снижением скорости связывания мишени и зонда, конкурентным или неконкурентным ингибированием связывания зонда с мишенью или повышением или снижением активности зонда или мишени, что, в свою очередь, может привести к увеличению или снижению взаимодействия зонда/мишень. Такие агенты можно получить искусственно, или они представляют собой природные соединения. Кроме того, подобные агенты можно использовать в неизмененном виде, или в виде агрегатов с другими соединениями, и их можно соединить, ковалентно или нековалентно, со связывающим партнером либо непосредственно, либо с помощью специфического связывающего соединения. Например, для определения потенциальных «агентов для разжижения крови» или агентов, которые взаимодействуют с одним из каскадов протеаз, которые вызывают свертывание крови, смеси интересующих протеаз можно подвергнуть анализу с включением в него множества потенциальных агентов и затем тестировать на активность, как описано выше. Другие примеры агентов, которые можно использовать по изобретению являются очень разнообразными, и включают пестициды и гербициды. В примерах 16 и 17 описаны анализы с высокой пропускной способностью для агентов, которые избирательно ингибируют определенные киназы, или для избирательных ингибиторов взаимодействия 8Н2-доменов и фосфорилированных пептидов.

В другом воплощении комбинации по изобретению можно использовать для скрининга агентов, которые модулируют характер экспрессии генов. Совокупности олигонуклеотидов можно использовать, например, для обнаружения видов мРНК, чей тип экспрессии из группы генов коррелирует с определенным физиологическим состоянием или стадий развития, или с болезненным состоянием («коррелятивные» гены, РНК или типы экспрессии). Под терминами «коррелирует» или «коррелятивный» понимается, что характер синтеза РНК связан с физиологическим состоянием клетки, но при этом совершенно необязательно, чтобы экспрессия данной РНК была ответственна за или являлась причиной определенного физиологического состояния. Например, можно идентифицировать небольшую подгруппу мРНК, которые экспрессируются, их экспрессия увеличивается и/или уменьшается в клетках, которые служат в качестве модели определенного болезненного состояния; данный измененный тип экспрессии по сравнению с таковым в нормальных клетках, в которых отсутствует патологический фенотип, может служить индикатором болезненного состояния («индикатором» генов, РНК или типов экспрессии). Термины «коррелятивный» или «индикатор» можно использовать взаимозаменяемо. Например, клетки, обработанные опухолевым промотором, таким как форболмиристат, могут иметь тип экспрессии генов, который напоминает таковой на ранних стадиях роста опухолей. На другой модели опухолей, в клетках мышиной инсулиномы (например, клеточной линии ТСР61) при заражении аденовирусом, происходит повышение экспрессии, например, с-1ии и М1Р-2, в то время как экспрессия вспомогательных генов, таких как САРЭН и Ь32, в основном остается без изменений.

Агенты, которые после контактирования с клеткой, происходящей из модели заболевания, либо непосредственно, либо опосредованно, и или в условиях ίη νίνο, или ίη νίίτο (например, в культуре тканей), модулируют показатель экспрессии, могут функционировать в качестве лечебных средств или препаратов на уровне организма (например, у человека или животных, или растений), страдающих данным заболеванием. Такие агенты могут также модулировать экспрессию при прямом контактировании с нуклеиновой кислотой, например, в экспрессирующей системе ίη νίίτο (в пробирке). В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «модулировать» означает вызывать увеличение или уменьшение количества и/или активности молекул или тому подобное, которые принимают участие в определяемой реакции. Комбинации по изобретению можно использовать для скрининга подобных агентов. Например, группы клеток (например, происходящих из модели заболевания) могут контактировать с группой агентов (например, в течение периода времени примерно от 10 мин до примерно 48 ч или более), и затем с использованием обычных, общепринятых в данной области методов (например, с помощью промышленно доступных наборов) готовят экстракты цельной фракции РНК или мРНК. Если желательно амплифицировать количество РНК, то можно использовать обычные методы амплификации, такие как КТ-ПЦР (см., например, Ιηηίκ с1 а1. ебк., (1996) РСК РгоЮсоЕ: А Сшбе ίο МеЙюбк ίη Λιηρίίίχαΐίοη. Асабетк Ргекк, Ыеет Υοιί<). Экстракты (или амплифицированные из них продукты) контактируют (например, инкубируют) со множеством в основном одинаковых совокупностей, которые включают зонды для соответствующих индикаторных РНК, и можно обнаружить агенты, которые связаны с изменением типа экспрессии индикатора. В примере 15 описывается анализ с высокой пропускной способностью для скрининга соединений, которые могут изменять экспрессию генов, которые являются коррелятивными для болезненных состояний.

Аналогично, можно идентифицировать агенты, которые модулируют типы экспрессии, связанные с конкретными физиологическими состояниями или стадиями развития. Подобные агенты могут быть искусственно полученными или природными соединениями, включая факторы внешней среды, такие как соединения, принимающие участие в эмбриональном развитии или регуляции физиологических реакций, или соединения, имеющие значение для сельского хозяйства, такие как пестициды или гербициды. Кроме того, подобные агенты могут использоваться в неизмененном состоянии или в виде агрегатов с другими соединениями; и их можно соединить, ковалентно или нековалентно, со связующим членом либо непосредственно, либо посредством специфического связывающего соединения.

- 16 011415

Другое воплощение изобретения представляет набор, пригодный для детектирования по меньшей мере одной мишени в пробе, включающий:

a) поверхность, содержащую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых являются в основном одинаковыми, где каждая область содержит по меньшей мере восемь различных якорей (олигонуклеотидов, или один из других типов, описанных здесь) и

b) контейнер, включающий по меньшей мере один бифункциональный линкер, который имеет первый участок, специфичный по меньшей мере к одному указанному якорю(ям), и второй участок, который включает зонд, специфичный по меньшей мере к одной указанной мишени(ям).

В одном воплощении обеспечивается поверхность, как указано в п.а) выше, и набор инструкций для соединения по меньшей мере одного якоря с бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный по меньшей мере к одному указанному якорю(ям), и второй участок, который включает зонд, специфичный по меньшей мере к одной мишени. Инструкции могут включать, например, (но не ограничиваясь этим) описание каждого якоря на поверхности, описание того, как много якорей находится, и где они расположены на поверхности, и протокол специфического присоединения (соединения, связывания) линкеров с якорями. Например, если якоря представляют собой олигонуклеотиды, то инструкции могут включать последовательность каждого якоря, с помощью которой практикующий специалист сможет сконструировать комплементарные якорь-специфические группы линкеров для специфического взаимодействия (например, гибридизации) с якорями; если якоря представляют пептиды, то в инструкции может входить информация, например, об антителах, которые будут специфически взаимодействовать с пептидами. Инструкции также могут включать протокол связывания якорей и линкеров, например, описание условий и реагентов для гибридизации (или другого типа соединения), таких как температура и продолжительность инкубации, условий и реагентов для удаления несвязавшихся молекул (например, растворы для промывания) и тому подобное. Кроме того, инструкции могут включать информацию о конструировании и применении любого из типов контрольных линкеров, уже обсужденных здесь, и о методах проведения, например, количественного определения, нормализации, «тонкой настройки» или калибровки с комбинациями. В инструкцию могут входить любой из параметров, условия или воплощения, раскрытые в данной заявке, которые все может выполнить специалист в данной области обычным образом с использованием общепринятых в данной области методов.

Как обсуждается в данной заявке, практикующий специалист может присоединить к поверхности по изобретению, включающей данную совокупность (или совокупности) якорей, самые разно образные типы линкеров, тем самым программируя любую из широкого ряда совокупность зондов. Кроме того, практикующий специалист может удалить с поверхности по изобретению данную группу линкеров и добавить к ней другую группу линкеров (или такую же или отличную от первой группы), что дает возможность многократно использовать данную поверхность. Данная гибкость и возможность повторного использования составляют дополнительные преимущества изобретения.

В другом воплощении комбинации по изобретению можно использовать для картирования Е8Т (меток экспрессированных последовательностей). То есть, МЛР8-тесты можно использовать для определения того, какая, если вообще таковая имеется, группа Е8Т получена из различных (или частично перекрывающихся) участков одного и того же гена(ов), и какая, если вообще таковая имеется, является уникальной. На фигурах 18, 19, 20 и 21 представлен такой анализ, в данном примере показан тест для определения того, какие, если вообще таковые имеются, из 16 Е8Т «связаны» с общим геном. Первой стадией теста (смотри фигуру 18) является сборка совокупностей, в которых каждая из Е8Т, которые следует картировать, представлена по меньшей мере одним олигонуклеотидным зондом, который ей соответствует. Число совокупностей, равное (или выше) числу Е8Т, которые следует картировать, распределяют на отдельные области (например, лунки) на поверхности; в представленном примере поверхность комбинации включает 16 лунок, каждая из которых включает совокупность из 16 различных Е§Т-специфических олигонуклеотидов под номерами 1-16. Олигонуклеотид, который «соответствует» Е8Т (является «Е8Тспецифическим»), представляет таковой, который в достаточной мере комплементарен Е8Т так, что в выбранных жестких условиях гибридизации олигонуклеотид будет специфически гибридизоваться с данной Е8Т, но не с другими, неблизкими Е8Т. Е8Т-соответствующий олигонуклеотид данного типа может специфически связываться (в оптимальных условиях) с кодирующей или некодирующей цепью кДНК, синтезированной из гена, из которого первоначально получена Е8Т, или с мРНК, синтезированной из гена, из которого первоначально была получена Е8Т. В настоящей заявке уже обсуждались факторы, которые следует учитывать при конструировании олигонуклеотидов, и параметры гибридизации для их оптимизации в целях получения специфической гибридизации. Для того чтобы собрать совокупности, готовят молекулы линкеров, каждая из которых включает группу, специфичную к одному из якорей родственной совокупности плюс группу, включающую олигонуклеотидный зонд, который соответствует одной из Е8Т, которые подвергаются картированию; и линкеры соединяют с якорями, как уже обсуждалось в данной заявке. На следующей стадии аликвотную порцию пробы, содержащей смесь нуклеиновых кислот (например, мРНК, или одноцепочечной или денатурированной ДНК), которая может включать последовательности, комплементарные одному или более олигонуклеотидных зондов, вносят в каждую из областей (лунок), которая содержит совокупность зондов; затем смесь инкубируют в обыч

- 17 011415 ных, определенных как оптимальные, условиях, позволяя тем самым нуклеиновой кислоте связаться с комплементарными зондами. Если несколько Е8Т-специфических зондов комплементарны различным участкам одной нуклеиновой кислоты, то эта нуклеиновая кислота будет связываться с каждым локусом в совокупности, в котором расположен один из данных зондов.

На следующей стадии другой детектирующий олигонуклеотид (в представленном примере детекторы #1-16) вносят в каждую область (лунку)(смотри фиг. 19). Детектирующий олигонуклеотид конструируют для каждой из Е8Т, которые подвергается картированию. Каждый Е8Т-специфический детектор соответствует другому (по меньшей мере, частично неперекрывающемуся) участку Е8Т, чем это делает зонд-олигонуклеотид так, что зонд и детектирующие олигонуклеотиды не мешают друг другу. Смотри, например, Е8Т, представленные на фиг. 21, которые соответствуют Е8Т 1, 2 и 6 на фиг. 18-20. На фиг. 21 показано, что обе Е8Т #1 и #2 получены из гена X (они «связаны»), в то время как Е8Т #6 получена из другого, неродственного гена. Если аликвотные порции пробы, содержащей смесь мРНК, включая полученную из гена X, инкубируют с совокупностями зондов, представленных на фигурах 18-20, то мРНК гена X будет, в оптимальных условиях, гибридизироваться в локусах с зондами 1 и 2, но не в них, в случае зонда 6. (Конечно, каждую мРНК следует добавлять в молярном избытке к суммарному количеству зондов, с которыми она может гибридизироваться.) Если детектирующий олигонуклеотид 1 вносят в область (лунку) 1, то он будет гибридизоваться с мРНК гена X, которая связана в локусах 1 и 2 совокупно сти зондов, но не в локусе 6. Аналогично, если детектирующий олигонуклеотид 2 вносят в другую лунку, например, лунку #2, то он также будет связываться в локусах 1 и 2, но не в локусе 6. Таким образом, можно определить при высокой пропускной способности, которые из Е8Т связываются, т.е. код для участков одного и того же гена, и какие Е8Т являются уникальными. Для гипотетического примера, представленного на фиг. 20, первые 3 Е8Т кодируют участки одного и того же гена, в то время как последние 5 Е8Т кодируют участки другого гена, и оказалось, что остальные Е8Т не связаны. В данной заявке уже обсуждались условия гибридизации, необязательные стадии промывания, способы детектирования и тому подобное в отношении других ΜΆΡδ-тестов. Для того чтобы подтвердить данные по связыванию, полученные в ΜΆΡδ-тесте, можно поставить ПЦР с использованием пар Е§Т-специфических олигонуклеотидных зондов в качестве смысловых и антисмысловых праймеров. Каждая пара связанных Е8Т должна дать продукт ПЦР. Следует отметить, что данный ПЦР-тест по парному признаку можно провести для прямого определения связи без использования ΜΆΡδ-анализа связи, однако, в данном случае будет необходима постановка многих реакций, и потребуется синтезировать каждый Е8Т-праймер в качестве смысловой и антисмысловой цепей. В качестве показательного примера потребуется 180 подобных реакций.

В одном аспекте изобретение относится к способу определения того, какие из множества Е8Т комплементарны к данной нуклеиновой кислоте, включающему:

a) инкубацию иммобилизованной совокупности олигонуклеотидных зондов, по меньшей мере один из которых соответствует каждой из указанных Е8Т, с тестируемой пробой, которая может содержать указанную данную нуклеиновую кислоту, с получением продукта гибридизации указанных олигонуклеотидных зондов и указанной нуклеиновой кислоты;

b) инкубацию указанного продукта гибридизации с детектирующим олигонуклеотидом, который соответствует Е8Т, которой соответствует один из указанных олигонуклеотидных зондов, но который является специфичным к другому участку Е8Т, чем указанный олигонуклеотидный зонд и

c) детектирование того, в каком олигонуклеотидном зонде из указанной совокупности находится метка, внесенная с помощью указанного детектирующего олигонуклеотида, где указанная совокупность олигонуклеотидных зондов иммобилизована в области комбинации, где указанная комбинация включает:

1) поверхность, содержащую ряд пространственно разобщенных, в основном одинаковых, областей, равный ряду Е8Т, которые подвергаются исследованию, где каждая область включает

2) ряд различных якорей, равный ряду Е8Т, которые подвергаются исследованию, в сочетании с

3) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфический к якорю, и второй участок, который включает олигонуклеотидный зонд, соответствующий по меньшей мере одной из Е8Т.

В другом аспекте изобретение относится к вышеуказанному способу, где указанные Е8Т могут быть комплементарны указанной нуклеиновой кислоте и где каждая из указанных Е8Т включает две различных олигонуклеотидных последовательности, первая из которых определяет олигонуклеотидный зонд, соответствующий указанной Е8Т, и вторая из которых определяет детектирующий олигонуклеотид, соответствующий указанной Е8Т, включающему:

a) контактирование пробы, которая включает молекулы указанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере с одной областью комбинации, где указанная область содержит совокупность олигонуклеотидных зондов, по меньшей мере один из которых соответствует каждой из указанных Е8Т;

b) инкубацию указанной пробы с указанной областью, тем самым позволяя молекулам указанной нуклеиновой кислоты связываться с указанными Е8Т-соответствующими олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны участкам указанной нуклеиновой кислоты;

c) инкубацию указанной области, включающей молекулы указанной нуклеиновой кислоты, связан

- 18 011415 ной с одним или более из указанных ΕδΤ-соответствующих олигонуклеотидных зондов с детектирующим олигонуклеотидом, который соответствует Ε8Τ, которой соответствует данный один из олигонуклеотидных зондов указанной совокупности, тем самым связывая детектирующие олигонуклеотиды с молекулами нуклеиновой кислоты, которые связаны с указанным данным олигонуклеотидным зондом или с другими олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны указанной нуклеиновой кислоте;

ά) детектирование присутствия указанных детектирующих олигонуклеотидов, и тем самым идентификация таких ΕδΤ-соответствующих олигонуклеотидных зондов указанной совокупности, которые комплементарны участкам нуклеиновой кислоты, которая связывается с указанным данным Несоответствующим олигонуклеотидным зондом, тем самым идентификацию таких Ε8Τ, которые комплементарны указанной данной нуклеиновой кислоте, где указанная совокупность олигонуклеотидных зондов иммобилизована в области комбинации, где указанная комбинация включает

1) поверхность, содержащую ряд пространственно разобщенных, в основном одинаковых областей, равный ряду Ε8Τ, которые подвергаются исследованию, где каждая область включает

2) ряд различных якорей, равный ряду Ε8Τ, которые подвергаются исследованию, в сочетании с

3) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к якорю, и второй участок, который включает олигонуклеотидный зонд, соответствующий, по меньшей мере, одной из указанных Ε8Τ.

Компоненты теста для картирования Ε8Τ можно объединить в любом порядке. Например, якоря, линкеры и Ε8Τ можно объединить последовательно, или линкеры и Ε8Τ в присутствии или отсутствии репортеров, можно объединить в растворе и затем добавить к якорям.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения того, какие из множества Ε8Τ комплементарны данной нуклеиновой кислоте, включающему:

a) инкубацию группы бифункциональных олигонуклеотидных линкеров, каждый из которых включает первый участок, который представляет зонд, соответствующий по меньшей мере одной из указанных Ε8Τ, и второй участок, специфичный к якорному олигонуклеотиду, с тестируемой пробой, которая может содержать указанную данную нуклеиновую кислоту, с получением первого продукта гибридизации указанных олигонуклеотидных зондов и указанной нуклеиновой кислоты;

b) инкубацию указанного первого продукта гибридизации с иммобилизованной совокупностью якорных олигонуклеотидов, где каждый якорный олигонуклеотид соответствует якорь-специфическому участку по меньшей мере одного из указанных линкеров, с получением второго продукта гибридизации, включающего указанные якоря, указанные олигонуклеотидные зонды и указанную нуклеиновую кислоту и

c) инкубацию либо указанного первого, либо указанного второго продукта гибридизации с детектирующим олигонуклеотидом, который соответствует Ε8Τ, которой соответствует один из указанных олигонуклеотидных зондов, но который является специфичным к другому участку Ε8Τ, чем указанный олигонуклеотидный зонд и

ά) детектирование, в какие олигонуклеотидные зонды указанной совокупности включилась метка с помощью указанного детектирующего олигонуклеотида, где указанная совокупность якорных олигонуклеотидов иммобилизована в области комбинации, где указанная комбинация включает:

2) ряд различных якорей, равный ряду Ε8Τ, которые подвергаются исследованию.

Конечно, вышеуказанные способы картирования Ε8Τ можно использовать для картирования тестируемых последовательностей (например, полинуклеотидов) в любой интересующей нуклеиновой кислоте. Например, можно определить, относятся ли два или более клонированных фрагмента ДНК или кДНК к одной и той же геномной ДНК. Подобный способ может помочь, например, установлению структуры длинных сложных генов. Аналогичным образом, можно определить, относится ли одна или более сплайсированных последовательностей или кодирующих последовательностей к одной и той же геномной ДНК. Подобное определение можно использовать, например, в диагностическом тесте для того, чтобы различить нормальное и болезненное состояния, которые характеризуются различными типами сплайсинга. Специалистам в данной области, очевидно, станут понятными многие другие применения способа картирования.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения того, какие из множества полинуклеотидов являются комплементарными для данной нуклеиновой кислоты, где один или более указанных полинуклеотидов может быть комплементарным для указанной нуклеиновой кислоты, и где каждый из указанных полинуклеотидов включает две различных олигонуклеотидных последовательности, первая из которых определяет олигонуклеотидный зонд, соответствующий указанному полинуклеотиду, и вторая из которых определяет детектирующий олигонуклеотид, соответствующий указанному полинуклеотиду, включающему

а) контактирование пробы, которая включает молекулы указанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере с одной областью комбинации, где указанная область содержит совокупность олигонуклеотидных зондов, по меньшей мере один из которых соответствует каждому из указанных полинуклеотидов;

- 19 011415

b) инкубацию указанной пробы с указанной областью, тем самым позволяя молекулам указанной нуклеиновой кислоты связываться с указанными полинуклеотид-соответствующими олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны участкам указанной нуклеиновой кислоты;

c) инкубацию указанной области, включающей молекулы указанной нуклеиновой кислоты, связанной с одним или более из указанных полинуклеотид-соответствующих олигонуклеотидных зондов, с детектирующим олигонуклеотидом, который соответствует полинуклеотиду, которому соответствует данный один из олигонуклеотидных зондов указанной совокупности, тем самым связывание детектирующих олигонуклеотидов с молекулами нуклеиновой кислоты, которые связаны с указанным данным олигонуклеотидным зондом или с другими олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны указанной нуклеиновой кислоте;

ά) детектирование присутствия указанных детектирующих олигонуклеотидов, тем самым идентификацию таких полинуклеотид-соответствующих олигонуклеотидных зондов указанной совокупности, которые комплементарны участкам нуклеиновой кислоты, которая связывается с указанным данным олигонуклеотидным полинуклеотид-соответствующим зондом, тем самым идентификацию таких полинуклеотидов, которые комплементарны указанной данной нуклеиновой кислоте, где указанная совокупность олигонуклеотидных зондов иммобилизована в области комбинации, где указанная комбинация включает

1) поверхность, содержащую ряд пространственно разобщенных, в основном одинаковых областей, равный ряду полинуклеотидов, которые подвергаются исследованию, где каждая область включает

2) ряд различных якорей, равный ряду полинуклеотидов, которые подвергаются исследованию, где каждый якорь связан с

3) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфический к якорю, и второй участок, который включает олигонуклеотидный зонд, соответствующий по меньшей мере одному из указанных полинуклеотидов.

В другом аспекте изобретения вышеуказанные способы картирования Е8Т или других полинуклеотидов дополнительно включают удаление несвязанных участков пробы между одной или более стадиями.

В другом воплощении изобретения одну или более интересующих РНК-мишеней (например, мРНК или другие типы РНК) превращают в кДНК с помощью обратной транскриптазы, и затем данные кДНК гибридизируют с совокупностью зондов. Данный тип анализа схематично представлен на фиг. 8. Из клеток и тканей готовят экстракты РНК (или очищенную мРНК), как здесь уже было описано. Затем к пробе с РНК добавляют обратную транскриптазу и олигонуклеотидные праймеры, специфические к интересующей РНК и при использовании принятых в данной области условий и методов, которые можно легко определить и оптимизировать, получают первые цепи кДНК. Термин «специфический» праймер относится к таковому, в достаточной мере который является комплементарным к интересующей мРНК, чтобы связаться с ней в выбранных жестких условиях гибридизации, и распознаваться обратной транскрипцией, но который не связывается с нежелательной нуклеиновой кислотой (см. выше обсуждение подходящих условий реакции для достижения специфической гибридизации). Остаточные молекулы РНК мРНК, которые не были распознаны специфическими праймерами, и/или другие типы загрязняющих молекул РНК в экстракте РНК, такие как тРНК или рРНК, можно удалить с помощью любой из самых различных рибонуклеаз или химическими методами такими, как обработка щелочью, оставляя одноцепочечную кДНК, которую затем приводят в контакт с совокупностью МАР8-зондов. Применение в данном способе обратной транскриптазы сводит до минимума необходимость в интенсивной обработке РНК, которая может быть чувствительной к разрушению под действием нуклеаз, и что таким образом вызывает затруднения при работе с ней. Кроме того, дополнительная специфичность, возникающая в результате специфических праймеров обратной транскриптазы, вносит в способ дополнительную специфичность.

Необязательно описанную выше кДНК можно амплифицировать перед гибридизацией с совокупностью зондов для повышения интенсивности сигнала. Описанные выше олигонуклеотидные праймеры обратной транскриптазы могут включать на их 5'-концах последовательности (которые могут быть длиной примерно 22-27 нуклеотидов), что делает специфичными сайты инициации для РНК-полимеразы (например, Т7-, Т3- или 8Р2-полимеразы и тому подобное). В примере, представленном на фиг. 8, последовательность Т7-промотора добавляют к праймеру обратной транскриптазы. Сайт распознавания полимеразы становится включенным в кДНК, и затем он может играть роль сайта распознавания для многих циклов транскрипции с участием соответствующей РНК-полимеразы (транскрипции ίη У1!го или 1УТ). Необязательно полученные таким образом молекулы мРНК можно дополнительно амплифицировать с использованием ПЦР и соответствующих праймеров, или саму кДНК можно амплифицировать. Таким образом, способы транскрипции и постановки ПЦР являются обычными и хорошо известны в данной области.

Гибкость ПЦР позволяет вносить многие изменения в способы по изобретению. В одном воплощении один или оба праймера для ПЦР, которые используют для амплификации мишени, могут включать химическую модификацию, в результате которой продукт ПЦР, специфически или неспецифически,

- 20 011415 присоединяется к твердой подложке. Подобные химические модификации включают, например 5'амидирование, что позволяет связываться с поверхностями, такими как планшеты для связывания ДНК производства СоЧаг (например, модифицированные Ν-оксисукцинимидэфиром, или покрытые малеиновым ангидридом планшеты, такие как планшеты Кеасй-Втб производства Р1егсе, ВоекГогй. 1Ь). Способы получения олигонуклеотидов, включающих подобные химические модификации, являются обычными и общепринятыми в данной области. Продукт ПЦР, содержащий подобный модифицированный праймер, можно присоединить к любой желаемой подложке, включая твердую подложку, например внутренние стенки лунки на титрационном микропланшете, гранулу (например, немагнитную или магнитную гранулу) или любой тип поверхностей, описанных здесь. Конечно, праймер для ПЦР можно присоединить к подложке перед началом реакции ПЦР. Несколько циклов ПЦР можно повторить без промывания, но с избытком связанного праймера так, чтобы полученный продукт ПЦР оставался связанным с подложкой. Присоединение амплифицированной мишеневой последовательности к подложке может облегчить промывание (или очистку) мишени или перед ее контактом (например, гибридизацией) с поверхностью, включающей якоря и/или линкеры, или после контакта с ней и затем высвобождения из подобной поверхности.

В другом воплощении один или более праймеров для ПЦР, используемых для амплификации мишени, могут включать один или более сайт рестрикции, что позволяет ввести сайты рестрикции, смежные с любым концом, или фланкирующие, интересующей последовательности-мишени. Сайты рестрикции можно добавить к амплифицированной ПЦР мишени либо перед, либо после контакта (например, гибридизацией) с поверхностью, включающей якоря и/или линкеры. Введенный таким образом сайт(ы) рестрикции могут, например, облегчить клонирование амплифицированной мишени обеспечением сайтов клонирования, которые фланкируют последовательность-мишень. Сайты рестрикции также могут облегчить очистку амплифицированной последовательности. Например, один или более сайтов рестрикции можно ввести в праймер для ПЦР между мишеневой специфической последовательностью и химической модификацией, что позволяет присоединиться к подложке. После амплификации мишени с помощью ПЦР с использованием модифицированного праймера для ПЦР и связывания с подложкой посредством химической модификации, ее можно отмыть и затем расщепить по сайту(ам) рестрикции, смежному с мишеневой последовательностью, тем самым высвобождая отмытую мишень. См., например, фиг. 23.

Конечно, в способах, описанных выше, можно также использовать другие расщепляемые сайты, чем сайты рестрикции, например пептид можно расщепить специфической протеазой, или другой компонент, который можно расщепить и/или высвободить химически, физически или другими средствами.

В другом воплощении один или оба праймера для ПЦР, используемые для амплификации мишени, могут включать последовательность (которая необязательно присутствует в мишени), специфическую, например, к мишень-специфическому репортеру или детектирующему линкеру.

Конечно, вышеуказанные модификации праймеров можно использовать вместе в любой желаемой комбинации и можно добавить к амплифицированному продукту на любой стадии теста. В примерах 21 и 22 представлены протоколы, в которых несколько вышеописанных модификаций праймеров включают в амплифицированную мишень.

Вышеописанные способы, в которых мРНК-мишени превращают в кДНК с помощью обратной транскриптазы и/или амплифицируют ПЦР перед анализом на МАРЗ-планшетах, можно использовать вместо обычного МАРЗ-анализа для любого вышеописанного анализа для РНК.

Нуклеиновые кислоты, используемые в способах по изобретению, например, мишени, олигонуклеотиды, участвующие в детектировании мишени, или защитные от нуклеаз фрагменты (описанные здесь), можно амплифицировать с помощью любого из самых разнообразных ферментативных методов, включая ПЦР и реакции с участием лигазы. Одним из таких методов является опосредуемая транскрипцией амплификация (см., например, АЬе е1 а1. (1993), I. С11п. МюгоЬю1. 31, 3270-3274). См. также пример 32 и фиг. 36-39 и 42.

В другом воплощении изобретения одну или более интересующих нуклеиновокислотных мишеней гибридизируют со специфическими полинуклеотидными защитными фрагментами и подвергают методу защиты от нуклеаз, и данные защитные фрагменты, гибридизированные с интересующей мишенью(ями), анализируют на МАРЗ-планшетах. Конечно, подобные «МАРЗ-планшеты» могут включать якоря, которые не связаны с линкерами (например, которые могут непосредственно связываться с интересующей мишенью или защитным от нуклеаз фрагментом); преимущества защиты от нуклеаз при использовании в сочетании с любым типом совокупности зондов, станут, очевидно, понятными специалистам в данной области из настоящего описания и любого из его предшественников, для которых заявлено преимущество. Если представляющая интерес мишень является РНК, и защитный фрагмент представляет ДНК, то способ защиты от нуклеаз/МАРЗ (№А-МАР§) может снизить необходимость в интенсивной обработке РНК, которая может быть чувствительной к разрушению под действием загрязняющих нуклеаз, и таким образом вызвать затруднения при работе с ней. Обработка пробы способом защиты от нуклеаз также создает возможность получить пробу с низкой вязкостью. Защита пробы от нуклеаз также позволяет повысить чувствительность и воспроизводимость способа. См., например, пример 30, в котором показана

- 21 011415 чувствительность и воспроизводимость типичного анализа, в котором пробу обрабатывают способом защиты от нуклеаз. Преимущество изобретения заключается в том, что тесты могут быть в достаточной мере чувствительными, чтобы отпала необходимость в амплификации мишени (например, ПЦР) для детектирования сигнала. В ΝΡΑ-ΜΑΡδ-способе зонды в совокупности зондов являются олигонуклеотидами, имеющими то же число цепочек, что и представляющие интерес нуклеиновые кислоты-мишени, в большей степени, чем комплементарные им, как в стандартном ΜΑΡδ-тесте. Один пример способа ΝΡΑΜΑΡ8 схематично представлен на фиг. 9.

В тесте ΝΡΑ-ΜΑΡ8 интересующая мишень может быть нуклеиновой кислотой, например геномной ДНК, кДНК, вирусной ДНК или РНК, рРНК, тРНК, мРНК, олигонуклеотидами, фрагментами нуклеиновых кислот, модифицированными нуклеиновыми кислотами, синтетическими нуклеиновыми кислотами и тому подобное. В предпочтительном воплощении изобретения способ используется для анализа одной или более мРНК-мишеней, которые находятся в тканевом или клеточном экстракте РНК. Пробу, которая содержит интересующую мишень(и), вначале гибридизируют в выбранных жестких условиях (см. выше обсуждение, касающееся подходящих условий реакции для достижения специфической гибридизации) с избытком одного или более специфического защитного фрагмента(ов). Защитный фрагмент представляет полинуклеотид, который может быть, например, РНК, ДНК (включая продукт ПЦР) , ПНК, или модифицированной или замещенной нуклеиновой кислотой, специфичный к участку интересующей нуклеиновой кислоты-мишени. Под «специфическим» защитным фрагментом понимается полинуклеотид, который в достаточной мере является комплементарным по отношению к предназначаемому связывающему партнеру для связывания с ней в выбранных жестких условиях, но который не будет связываться с другими, непредназначенными для этого нуклеиновыми кислотами. Защитный фрагмент может быть длиной по меньшей мере из 10 нуклеотидов, предпочтительно от 50 до примерно 100 или может представлять собой полноразмерную кДНК. В предпочтительном воплощении защитные фрагменты являются олигонуклеотидами на основе одноцепочечной ДНК. Защитные фрагменты, специфические в отношении 100 или более мишеней, можно включить в одну реакцию гибридизации. После гибридизации пробу обрабатывают смесью одной или более нуклеаз, для разрушения других нуклеиновых кислот чем защитный(ые) фрагмент(ы), гибридизированные с интересующей нуклеиновой кислотой(ами) и (необязательно) участком(ами) мишеневой нуклеиновой кислоты, гибридизированными и защищенными от действия нуклеаз во время проведения способа защиты от нуклеаз (находятся в дуплекс-гибриде). Например, если проба представляет клеточный экстракт, то нежелательные нуклеиновые кислоты, такие как геномная ДНК, тРНК, рРНК и мРНК, т.е. иные, чем представляющие интерес, могут в основном разрушиться на данной стадии. Можно использовать любую из самых различных нуклеаз, включая, например, РНКазу из поджелудочной железы, нуклеазу из золотистой фасоли, 81-нуклеазу, РНКазу А, рибонуклеазу Т1, экзонуклеазу III, экзонуклеазу VII, РНКазу СЬВ, РНКазу ΡΙινΜ. РНКазу И2 и тому подобное в зависимости от природы гибридизированных комплексов и нежелательных нуклеиновых кислот, находящихся в пробе. РНКаза Н может быть особенно пригодной для расщепления остаточной РНК, связанной с защитным фрагментом ДНК. Условия реакции с участием данных фрагментов являются хорошо известными в данной области, и их можно эмпирически оптимизировать. Кроме того, можно использовать химические методы, например, щелочной гидролиз РНК. Если это необходимо, то затем пробы можно обработать с использованием хорошо известных в данной области способов для удаления негибридизированного вещества и/или инактивации, или удаления остальных ферментов (например, экстракцией фенолом, осаждением, колоночной фильтрацией и т.д.). Способ гибридизации, после расщепления нуклеазами и (необязательно) химического разрушения, называется способом защиты от нуклеаз; описано много самых разных способов защиты от нуклеаз (см., например, Ьее с1 а1. (1987), Мс111. Εηζνιηοΐ. 152, 633-648. Ζίηη с1 а1. (1983), Се11 34, 865-879). Пробы, обработанные защитой от нуклеаз, с последующей (необязательной) инактивацией нуклеаз, приводят в контакт с ΜΑΡδ-совокупностью зондов и проводят обычные стадии ΜΑΡδ-анализа. Связанные защитные фрагменты можно обнаружить, например, с помощью гибридизации мечеными мишень-специфическими репортерами, как здесь описано для стандартных ΜΑΡδ-тестов, или защитные фрагменты можно пометить сами по себе, ковалентно или нековалентно, с помощью детектируемой молекулы.

Если желательно, можно включить один или более контролей для нормализации способа ΝΡΑΜΑΡ8. Например, можно использовать один или более защитных фрагментов, соответствующих нуклеиновой кислоте, которая, как предполагается, находится в каждой серии проб в основном постоянном количестве (например, конститутивно продуцированная мРНК, участок геномной ДНК, тРНК или рРНК).

Возможность детектировать или количественно определять внутренний контроль для нормализации, например, геномную ДНК в тесте определения нуклеиновых кислот, которые находятся в различных количествах (например, мРНК), представляет преимущество применения защитных фрагментов в тестах.

Поскольку количество стандарта(ов) для нормализации может быть ниже, чем таковое интересующей экспрессированной мРНК, то тест можно довести таким образом, чтобы сигналы, соответствующие экспрессированным генам, не заглушали сигнал(ы), соответствующий стандарту(ам) нормализации. Способы доведения сигналов являются общепринятыми и, очевидно, понятны для специалистов в дан

- 22 011415 ной области. Например, можно использовать любой из способов, описанных здесь, для уравновешивания интенсивности сигналов (например, ослабление сигналов, тонкая настройка)(например, использование блокированных линкеров; введение метки в сигнальную группу, сконструированную для обнаружения стандарта нормализации на более высоком уровне по сравнению с предназначенным для детектирования мРНК; размещение локуса, предназначенного для детектирования стандарта нормализации, множества линкеров, специфических к различным участкам нуклеиновой кислоты для нормализации, или для защитных фрагментов, которые соответствуют различным участкам этой нуклеиновой кислоты и т.д.). Стандарт(ы) нормализации и нуклеиновые кислоты-мишени (например, мРНК), представляющие интерес, можно детектировать одновременно или последовательно, например, любым описанным здесь способом. В примерах 28 и на фиг. 29 представлен типичный опыт, в котором внутренние стандарты нормализации в виде ДНК используют при анализе мРНК.

В предпочтительном воплощении в защитный фрагмент непосредственно вводят метку, например, в большей степени, чем при гибридизации с мишень-специфическим репортером. Например, репортер связывают с защитным фрагментом посредством взаимодействия лиганд-антилиганд, например комплекс стрептавидин-фермент добавляют к биотинилированному защитному олигонуклеотиду. В другом примере защитный фрагмент модифицируют химически (например, прямой конъюгацией с пероксидазой из хрена (НКР) или флуоресцентной краской), и детектируют данную химическую модификацию либо с участком нуклеиновой кислоты защитного фрагмента, либо без него (например, после отщепления модификации, например, в результате ферментативной или химической обработки). В любом из вышеуказанных способов защитный фрагмент можно пометить до или после гибридизации с соответствующей линкерной молекулой.

Для контроля того, что способ защиты от нуклеаз функционирует правильно, т.е., что негибридизованные нуклеиновые кислоты расщепляются, как это и желательно, можно сконструировать один или более защитных фрагментов с включением выступающих (негибридизованных) сегментов, которые будут отщепляться под действием нуклеаз, если способ функционирует правильно. Присутствие или отсутствие выступающих фрагментов можно определить гибридизацией с комплементарным, меченым, детектирующим зондом, или выступающие участки защитного фрагмента можно пометить сами по себе, ковалентно или нековалентно, с помощью детектируемой молекулы. Данную контрольную операцию можно провести до того, как пробу приводят в контакт с совокупностью зондов, или она будет составной частью самого МЛР8-теста. Пример такого контрольного теста описан в примере 15. Конечно, поскольку различные метки легко различаются (например, флуоресцентные краски с различными спектрами поглощения), в один анализ можно включить несколько по-разному меченых олигонуклеотидов. Кроме того, стандартный тест защиты от нуклеаз, при анализе электрофорезом в геле, можно использовать во время разработки анализа для подтверждения того, что, как и предполагается, защитные фрагменты обработаны.

Специалистам в данной области, очевидно, станут понятны другие контроли правильного расщепления нуклеазами. Например, можно включить в анализ защитный от нуклеаз фрагмент, который, как заведомо известно, не обладает специфичностью к любой нуклеиновой кислоте в пробе (например, при анализе растительных нуклеиновых кислот, можно включить защитный фрагмент, специфический к гену животных, который, как заведомо известно, отсутствует в растениях).

После детектирования мишеней сигнал детектирующего зонда (например, НКР-меченного) можно элиминировать (например, денатурировать, уничтожить, погасить, подавить, блокировать), планшеты промывают для удаления любых полученных реагентов, агентов или буферов, которые могут помешать на последующей стадии (например, денатурирующий реагент), и затем выступающий фрагмент можно детектировать другим детектирующим зондом (например, также НКР-меченным). Денатурацию сигнала с последующим добавлением другого детектирующего зонда с той же сигнальной группой можно использовать на различных стадиях анализа. Применение двух различных флуоресцентных зондов и двойное цветное детектирование можно использовать без денатурации или блокирования сигнала.

Как отмечалось выше, в одном воплощении изобретения олигонуклеотидный зонд используют для скрининга нуклеиновой кислоты, которая включает один или более полиморфизмов. В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота (например, ДНК, такая как геномная ДНК, или РНК, такая как мРНК) включает один или несколько 8ΝΡ. Для постановки этого метода можно использовать обычные, общепринятые в данной области операции. Например, для скрининга ДНК, включающей известный 8ΝΡ. или мРНК, экспрессированную из такой ДНК, «ΞΝΡ-специфический» защитный фрагмент гибридизируют с пробой, содержащей нуклеиновые кислоты, которые могут включать такой 8ΝΡ. Под «8ΝΡспецифическим» защитным фрагментом в данном контексте понимается защитный фрагмент, который включает измененное основание 8ΝΡ или, если анализу подвергается мРНК, то обратный комплемент такой последовательности. Затем пробу обрабатывают одной или более соответствующих нуклеаз, которые в подходящих, эмпирически подобранных условиях расщепляют негибридизированную одноцепочечную нуклеиновую кислоту и расщепляют двухцепочечную (дуплекс) нуклеиновую кислоту (например, гибриды ДНК-ДНК, гибриды ДНК-РНК и тому подобное) по сайту ошибочного спаривания оснований (например, ошибочного спаривания одной пары оснований). Подходящие нуклеазы включают, на

- 23 011415 пример, 81 или РНКазу Н. Если в пробе находится нуклеиновая кислота, включающая 8ΝΡ, и она гибридизирована с 8№-специфическим защитным фрагментом, то защитный фрагмент останется интактным при переваривании, и его можно подвергнуть МАР8-анализу и детектировать с помощью детектирующего зонда или детектирующего олигонуклеотида, который специфичен к последовательности защитного фрагмента. Нуклеиновые кислоты, не содержащие 8ΝΡ, будут расщепляться по сайту ошибочного спаривания оснований между ΞΝΡ-специфическим защитным фрагментом и соответствующей последовательностью дикого типа в нуклеиновой кислоте. Если желательно, то можно удалить участок защитного фрагмента, находящийся дистальнее или проксимальнее к сайту расщепления (например, денатураций при нагревании, ферментативным расщеплением и т. д.). Анализ можно построить таким образом, либо, чтобы расщепленные молекулы (или их участки) не связывались с линкерами, либо, чтобы подобные расщепленные молекулы, даже если их участок связывается с линкером, не детектировались с помощью соответствующим образом сконструированного детектирующего зонда или детектирующего олигонуклеотида. В примере 29 и на фиг. 30 и 31 показано, что при постановке тестов по изобретению можно детектировать ошибочное спаривание одной пары оснований в экспрессированном 8ΝΡ. В примере 32 (фиг. 41) показан тест детектирования 8ΝΡ, который применим, например, для детектирования 8ΝΡ в геномной ДНК.

Тесты ΝΡΑ-ΜΑΡ8 можно использовать для количественного определения мишени в пробе. Если защитный фрагмент добавлен в достаточно большом молярном избытке по сравнению с мишенью для проведения реакции гибридизации до конца, то количество защитного фрагмента, остающееся после проведения стадии защиты от нуклеаз, будет отражать, то как много мишени находилось в пробе. Пример подобной количественной реакции приведен в примерах 12 и 13.

В одном воплощении изобретения различные типы мишеней в пробе, например, различные комбинации ДНК, РНК, внутриклеточных белков и секретированных белков, можно анализировать с помощью одной совокупности зондов. См. фиг. 40 и 41 для примеров таких тестов.

ΝΡΑ-ΜΑΡΞ-тесты можно применять для осуществления любого из способов, описанных выше, в которых используются обычные ΜΑΡΞ-тесты.

В предпочтительном воплощении полинуклеотидные защитные фрагменты определяют на массспектрофотомере в большей мере, чем на ΜΑΡ8-планшетах. В наиболее предпочтительном воплощении ни один из полинуклеотидов не присоединяется (прикрепляется) к твердой поверхности во время стадии гибридизации или расщепления нуклеазами. После гибридизации гибридизованную мишень можно разрушить, например, с помощью нуклеаз или химической обработкой, оставив при этом защитный фрагмент в прямой пропорции к количеству фрагмента, которое подверглось гибридизации с мишенью. Альтернативно, пробу можно так обработать, чтобы оставить (одну цепочку) гибридизированный участок мишени или дуплекс, образованный гибридизированной мишенью и защитным фрагментом, для проведения последующего анализа. Пробы, которые подвергаются анализу, отделяют от остальной смеси для гибридизации и обработки нуклеазами (например, осаждением этанолом или адсорбцией, или аффинной хроматографией и т.д.), элюируют или солюбилизируют, и вводят в масс-спектрофотометр с высокой пропускной способностью через инжекторную петлю. В предпочтительном воплощении пробы, которые анализируют (например, защитные фрагменты), адсорбируют на поверхности и анализируют лазерной десорбцией с использованием хорошо известных в данной области методов. Для получения высокой чувствительности можно использовать Еоипег ТгаикГогт Макк 8рес!готе!гу (ЕТМ8)(или аналогичный современный метод), позволяющий детектировать каждый защитный фрагмент на уровне фемтомолей или ниже.

Защитные фрагменты, которые следует детектировать в одной (или более) проб, можно сконструировать с получением уникального сигнала для используемого масс-спектрометра. В одном воплощении каждый защитный фрагмент имеет уникальную молекулярную массу после гибридизации и обработки нуклеазами, и их молекулярная масса и характерный тип ионизации и фрагментации будут достаточными для определения их концентрации. Для повышения чувствительности или упрощения анализа сложных смесей защитные фрагменты можно модифицировать (например, дериватизировать) химическими группами, придающими четкие уникальные сигналы. Например, каждый защитный фрагмент можно дериватизировать различными природными или неестественными аминокислотами, связанными через амидную связь с олигонуклеотидной цепочкой по одному или нескольким положениям по гибридизованному участку цепочки. На масс-спектрометре соответствующей энергии происходит фрагментация амидных связей, при этом высвобождается характерное соотношение аминокислот. Данный подход, при котором химические группы среднего размера (грубо с молекулярной массой 80-200) используют в качестве масс-спектрофотометрических меток, желателен, поскольку молекулы данного размера, как правило, легче детектировать. В другом примере химическая модификация представляет органическую молекулу с определенным масс-спектрафотометрическим сигналом, таким как группа тетраалкиламмония, которой можно, например, дериватизировать другую молекулу, такую как, например, аминокислота. В другом примере сигналы положительных или отрицательных ионов усиливают реакцией с любым из ряда агентов. Например, для повышения детектирования положительных ионов можно провести реакцию между солью пирилия (такой, как 2-4-дитенил, 6-этилпирилия тетрафторборат или многие другие) с

- 24 011415 амином с образованием соли пиридиния; можно использовать любые другие усиливающие агенты для образования других положительно заряженных функциональных групп (см., например, Рипке е! а1. (1994), Апа1у11са1 Сйет181ту 66, 1302-1315). Аналогичным образом можно провести реакцию с любым из общепризнанных в данной области агентов с получением соединений, усиливающих отрицательные ионы. Химическую модификацию можно детектировать, конечно, либо после отщепления от нуклеиновой кислоты, либо в составе нуклеиновой кислоты. Имея возможность идентифицировать каждый защитный фрагмент различимым образом, становится возможным анализировать (например, подвергнуть скринингу) большое число различных мишеней (например, 2, 6, 10, 16 или более различных мишеней) в одном анализе. Многие подобные тесты можно провести быстро и легко. Следовательно, такой тест или группу тестов можно проводить с высокой пропускной способностью, как здесь определено.

Независимо от того, детектируются ли олигонуклеотиды непосредственно по их массе, или используются уникальные молекулярные метки, сигналы для каждой молекулы, которая детектируется, можно полностью охарактеризовать с чистыми препаратами в известной концентрации. Это позволит точно замерять сигнал (определять, количественно определять). Для любой молекулы, которая детектируется масс-спектрометрией, невозможно точно предугадать интенсивность и профиль. Тенденция молекулы к ионизации, чувствительность всех химических связей внутри молекулы к фрагментации, степень с которой каждый фрагмент множественно заряжается или однократно заряжается, все это слишком сложно для того, чтобы делать какие-то прогнозы. Однако для данного прибора с фиксированной энергией и характеристики обработки проб интенсивность и профиль сигнала очень становятся воспроизводимыми. Следовательно, для каждого зонда можно охарактеризовать сигнал с чистыми стандартами и точно количественно интерпретировать экспериментальные сигналы.

В одном аспекте изобретение относится к способу детектирования одной или более нуклеиновых кислот, представляющих интерес, включающему обработку пробы, содержащей интересующую нуклеиновую кислоту(ы), защитой от нуклеаз с одним или более защитным фрагментом, и детектирование гибридизованных дуплекс-молекул, или защищенной нуклеиновой кислоты, или защитного фрагмента, масс-спектрометрией.

Методы анализа нуклеиновых кислот масс-спектрометрией хорошо известны в данной области. Смотри, например, А1рег е! а1. (1998), Бс1епсе 279, 2044-2045 и Койет, патент США № 5605798.

В дополнении к разнообразным высокопроизводительным способам, описанным здесь, специалистам в данной области, очевидно, станут понятными многие другие.

Преимущество использования тестов со множеством зондов заключается в возможности включить ряд «контрольных» зондов в каждую совокупность зондов, которые подвергаются воздействию тех же условий реакции, что и действительно опытные зонды. Например, каждая область в совокупности может включать положительный и/или отрицательный контроли. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «положительный контрольный зонд» означает контрольный зонд, который, как это известно, например, в основном взаимодействует с мишенью, или взаимодействует с ней количественно или качественно известным образом, тем самым функционируя в качестве (внутреннего) стандарта для взаимодействия зонд/мишень. Подобный зонд, например, может быть контролем эффективности гибридизации. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «отрицательный контрольный зонд» означает контрольный зонд, который, как известно, в основном не взаимодействует с мишенью. Подобный зонд, например, может быть контролем специфичности гибридизации. В качестве примера типов контролей, которые можно использовать, рассмотрим тест, в котором совокупность олигонуклеотидных зондов используют для скрининга агентов, которые модулируют экспрессию группы коррелятивных генов для заболевания. Для внутреннего контроля нормализации переменных показателей таких, как число лизированных клеток в каждой пробе, извлечение мРНК или эффективность гибридизации, совокупность зондов может включать зонды, специфические к одному или более фоновому уровню или конститутивных вспомогательных генов, таких как структурные гены (например, актина, тубулина или других) или связывающихся с ДНК белков (например, факторы, регулирующие транскрипцию или другие), для которых не предполагается модуляция их экспрессии под действием тестируемых агентов. Кроме того, для определения того, вызывают ли тестируемые агенты нежелательные побочные эффекты, такие как гибель клеток или токсичность, совокупность зондов может включать зонды, специфичные к генам, которые, как известно, индуцируются, как составная часть апоптоза (запрограммированной гибели клеток), или которые индуцируются в условиях повреждения клеток (например, белки теплового шока) или токсического воздействия на клетки (например, гены р450).

В совокупность можно включить другие контрольные зонды для «тонкой настройки» чувствительности анализа. Например, рассмотрим тест для выявления агентов, которые модулируют продукцию мРНК, связанной с конкретным болезненным состоянием. Если в предшествующих анализах указывалось, что одна из коррелятивных мРНК (скажем, мРНК-А) в данной группе продуцируется в таких больших количествах по сравнению с другими, что ее сигнал «заглушает» таковые, исходящие от других мРНК, то линкеры можно подвести для «тонкой настройки» теста так, чтобы уравнять интенсивность сигналов. «Блокированные линкеры», которые включают якорь-специфическую олигонуклеотидную последовательность, предназначенную для мРНК-А-мишени, но в которых отсутствует зонд

- 25 011415 специфическая последовательность, можно добавить для разбавления пула мишень-специфических линкеров и таким образом снизить чувствительность теста для данной мРНК. Специалисты в данной области могут определить подходящие соотношения блокированных и неблокированных линкеров простыми, общепринятыми в данной области методами.

«Тонкую настройку» теста для конкретной мишени разбавлением активного элемента неактивным элементом можно также осуществить на других стадиях анализа. Например, ее можно провести на уровне детектирования разбавлением меченого, мишень-специфического репортера «неактивным» мишеньспецифическим репортером, например, таковым с такой же мишень-специфической группой (например, олигонуклеотидной последовательностью), но без сигнальной группы, или с инактивированной или неактивной формой сигнальной группы. В том смысле, в котором этот термин здесь используется «сигнальная группа» относится к метке, молекуле или другому соединению, которое испускает детектируемый сигнал, или способно генерировать такой сигнал, например флуоресцирующая молекула, люминесцирующий фермент или любая из самых различных сигнальных групп, раскрытых здесь). В особенно предпочтительном воплощении «тонкую настройку» можно провести на стадии контактирования содержащего мишень комплекса с детектирующим линкером (детектирующие линкеры описаны ниже, например, в разделе, касающемся сложных способов детектирования типа «сэндвича», пример 23 и фиг. 24). Можно сконструировать группу детектирующих линкеров, например, для «тонкой настройки» чувствительности для анализа каждой отдельной мишени. Например, если известно, что определенная мишень находится в пробе в очень высокой концентрации, то детектирующий линкер для такой мишени можно разбавить эмпирически подобранным количеством «блокированного детектирующего линкера», включающего мишень-специфическую группу (например, олигонуклеотидную последовательность), но в котором отсутствует группа, специфическая к репортеру, или включающего мишень-специфическую группу и репортер-специфическую группу, которая предварительно была связана с неактивным репортером. То есть, вместо включения группы, специфической к репортеру, эта группа может отсутствовать, или предупреждают (например, блокируют) ее взаимодействие (например, гибридизацию) с репортером. В некоторых случаях подобная тонкая настройка относится к «ослаблению» сигналов. На фиг. 28 представлен опыт, в котором проводят подобное ослабление сигналов.

Пробы, которые подвергаются тестированию в анализах по изобретению, могут включать любую из мишеней, описанных выше, или другие. Жидкие пробы, подвергающиеся анализу, могут находиться в любом объеме, подходящем для размера тест-области, в пределах примерно от 100 нл до примерно 100 мкл. В предпочтительном воплощении жидкие капли объемом примерно 1 мкл вносят в каждую лунку 1536-луночного титрационного микропланшета. Пробы можно привести в контакт с совокупностью зондов самыми различными способами, подходящими для анализа с высокой пропускной способностью, например, с помощью пипеток, дозаторов или применением репликаторов. Пробы инкубируют в условиях (например, концентрация соли, значения рН, температура, продолжительность инкубации и т.д. - см. выше), эффективных для достижения связывания или другого стабильного взаимодействия зонда и мишени. Данные условия являются легко определяемыми. После инкубации пробы необязательно обрабатывают (например, промывают) для удаления несвязавшейся мишени с использованием условий, которые подбираются эмпирически так, чтобы оставить интактными специфические взаимодействия, но при этом удалить неспецифически связавшиеся вещества. Например, пробы можно промыть примерно от одного до десяти раз и более в одних и тех же или более жестких условиях по сравнению с теми, которые использовались для достижения связывания зонда/мишени.

Пробы, содержащие РНК-мишень, например мРНК, рРНК, тРНК, вирусную РНК или общую фракцию РНК, можно приготовить любым различным методом. Например, культуры клеток ίη νίίτο, из которых следует экстрагировать мРНК, можно внести в области поверхности, такие как отдельные лунки титрационного микропланшета. Необязательно данные клетки после достижения желаемой клеточной плотности можно обработать интересующим агентом, таким как стимулятор или потенциальное терапевтическое средство, которое можно добавить к клеткам любым из различных способов, например, с помощью репликатора (такого, как 96- или 386-игольчатые репликаторы от Весктап), с помощью пипеток или дозаторов, и инкубировать с клетками в течение соответствующего периода времени, например, примерно от 15 мин до примерно 48 ч, в зависимости от анализа. Экстракты цельной фракции РНК, мРНК и т.д. из тканей или клеток из источника ίη νίίτο или ίη νίνο можно получить с использованием обычных, общепринятых в данной области методов (например, с помощью промышленно доступных наборов).

В одном воплощении клетки лизируют (или делают проницаемыми) в присутствии или отсутствии защитного от нуклеаз фрагмента(ов) и неочищенный лизат используют непосредственно (например, в лунке титрационного микропланшета) без дополнительной очистки, например, от других клеточных компонентов. Если клетки лизируют в отсутствии защитных от нуклеаз фрагментов, то затем такие защитные фрагменты можно необязательно добавить к лизату.

В предпочтительном воплощении, например, когда детектируют защитные от нуклеаз фрагменты, пробы готовят контактированием интересующих клеток (например, клеток на поверхности лунки титрационного микропланшета; клеток в ткани или в пробе из организма, или тому подобное) с водной средой

- 26 011415 (раствор для лизиса), которая содержит поверхностно-активное вещество или детергент (например, 8Ό8, в концентрации примерно от 0,01 до примерно 0,5% мас./об.) и агент (например, формамид (например, в концентрации примерно от 8 до примерно 60%, об./об.), гуанидин НС1 (например, в концентрации примерно от 0,1 до примерно 6М), гуанидин изотиоцианат (например, в концентрации примерно от 0,05 до примерно 8М) или мочевину (например, в концентрации примерно от 40 до примерно 46%, мас./об. или примерно 7М), которая одна или в сочетании с одним или более другими агентами, может функционировать в качестве хаотропического агента. Водную среду можно забуферить любым стандартным буфером. В предпочтительном воплощении буфером является примерно 0,5-6Х 88С, более предпочтительно примерно 3Х 88С. Необязательно водная среда также может содержать тРНК в соответствующей концентрации, примерно 0,1-2,0 мг/мл, предпочтительно примерно 0,5 мг/мл. В водную среду можно также добавить защитные от нуклеаз фрагменты перед его добавлением к клеткам. Оптимальную концентрацию каждого защитного фрагмента можно определить эмпирически с использованием общепринятых методов. В предпочтительном воплощении концентрации каждого защитного фрагмента составляет примерно от 3 до примерно 300 пкМ, более предпочтительно примерно 30 пкМ.

Клетки инкубируют в водном растворе, пока клетки не становятся проницаемыми и/или лизируются, и ДНК и/или мРНК высвобождаются из клеток в водную среду. Клетки инкубируют в водной среде в течение эмпирически подобранного периода времени (например, примерно от 1 до примерно 60 мин), при эмпирически подобранной оптимальной температуре (например, примерно от 37 до примерно 115°С, предпочтительно примерно от 90 до примерно 115°С).

Например, в одном воплощении, когда как ДНК, так и РНК высвобождаются из клеток в денатурированной форме, способной связываться с защитным фрагментом, то клетки инкубируют в течение примерно от 1 до примерно 60 мин, предпочтительно примерно от 5 до примерно 20 мин в водной среде при температуре примерно от 90 до примерно 115°С, предпочтительно примерно при 105°С. Если желательно, например, когда требуется проанализировать ДНК в отсутствии РНК, то в инкубационную смесь можно включить различные общеприменяемые рибонуклеазы. Специалист в данной области может легко выбрать соответствующую рибонуклеазу и оптимальные условия расщепления.

В другом воплощении мРНК можно получить при инкубации клеток в течение примерно от 5 до примерно 20 мин, предпочтительно примерно 10 мин, в водной среде при температуре примерно от 90 до примерно 100°С, предпочтительно примерно 95°С, необязательно в присутствии одного или более защитных фрагментов. В данном случае мРНК в основном высвобождается из клеток в денатурированной форме, способной связываться с защитным фрагментом, и ДНК остается в основном внутри или прикрепленной к клеткам, или недоступной для зонда за счет ее двухцепочечной природы, или она высвобождается из клеток, но в форме, неспособной связываться с защитным фрагментом (например, неденатурирована). Не стремясь связываться с каким-либо определенным механизмом, оказалось, что поскольку нуклеиновая кислота высвобождается из лизированных/сделанных проницаемыми клеток, достаточно ее денатурировать для связывания с защитным фрагментом с образованием стабильного дуплекса, который устойчив к разрушительному действию эндогенных или экзогенных реагентов или ферментов, а белки внутри клеток (например, нуклеазы) денатурируются и/или инактивируются.

После получения интересующей нуклеиновой кислоты вышеуказанным способом пробу можно разбавить до соответствующего объема так, чтобы водная среда не ингибировала функции экзогенных внесенных белков, таких как, например, нуклеазы (например, 81-нуклеаза), полимеразы (например, полимеразы, необходимые для постановки ПЦР) или связывающие белки (например, стрептавидин). Количества для разбавления, и идентичность и количества компонентов для использования в водном растворе, описанном выше, можно определить эмпирически с использованием обычных методов.

Для любого из способов по настоящему изобретению в мишени можно ввести метку (пометить) с помощью любого из самых разнообразных методов, которые хорошо известны в данной области и/или которые здесь описаны (например, в отношении детектирования защитных от нуклеаз фрагментов). Например, к молекулам-мишеням можно непосредственно или опосредованно присоединить химические группы, которые обеспечивают сигнал для детектирования, такие как хемилюминесцентные молекулы или ферменты, которые катализируют продуцирование хемилюминесцентных молекул, или флуоресцентные молекулы, такие как флуоресцеин или су5, молекула со время-разрешающей флуоресценцией, такая как один из металлов-хелатообразователей ряда лантанидов, или радиоактивное соединение. Альтернативно, мишени можно пометить после их взаимодействия с зондом с помощью одного или более меченых мишень-специфических репортеров (например, антител, олигонуклеотидов, как представлено на фиг. 1, или любым из общих типов молекул, уже обсужденных выше в отношении зондов и мишеней).

Одним типом флуоресцирующей молекулы может быть «непревращаемый фосфор», т.е. флуоресцентная метка, которая поглощает и возбуждается при дальних длинах волн (например, ИК), затем испускает при более коротких длинах волн (например, видимый свет). Поскольку непревращаемые фосфоры испускают при более коротких длинах волн, чем это делает большинство потенциально мешающих веществ, обычно находящихся в типичной пробе, которая подвергается анализу, применение непревращаемых фосфоров делает возможным уменьшить помехи, вызываемые веществом в пробе, по сравнению с фосфорами, которые поглощают при более коротких длинах волн. Узкий спектр эмиссии большинства

- 27 011415 непревращаемых фосфоров также позволяет проводить одновременное детектирование большого количества различных непревращаемых фосфоров. Непревращаемые фосфоры являются хорошо известными, и их использование является общепринятым в данной области, и включают, например, ионы редкоземельных металлов, таких как иттербий (УЬ), эрбий (Ег), тулий (Тт) и празеодим (Рг), особенно в виде оксисульфида. Описано 80 или более независимо детектируемых непревращающихся фосфоров. (Смотри, например, Вю1одюа1 Адеп! Бе1есйоп апй Иепййсайоп, Арп1 27-30, 1999, БАКРА, Вю1одюа1 ХУагГаге БеГепке, БеГепке Еаепсек ОГйсе.) Фосфоры можно необязательно присоединить к любой поверхности, например к микросфере или грануле из латекса. Как и другие флуоресцентные метки, непревращаемые фосфоры можно детектировать по переходу энергии (или модуляцией) к метке в достаточно близком линкере, мишени или репортере. Кроме того, как и другие сигнальные группы, раскрытые здесь, непревращаемые фосфоры можно использовать для количественного определения мишени, и можно использовать в любом из самых разнообразных способов, описанных здесь, например, для детектирования защитных от нуклеаз фрагментов.

Конечно, непревращаемые фосфоры можно также использовать для детектирования мишеней, которые распределены любым другим образом на поверхности, например, мишеней (включая защитные от нуклеаз фрагменты), которые непосредственно присоединены к поверхности, связаны непосредственно с совокупностью различных олигонуклеотидов на поверхности, или связаны через бифункциональные линкеры с якорями (различными или в основном одинаковыми), которые распределены на поверхности в основном равномерно или в любой желательной организации или порядке. Можно использовать любую поверхность, например проточную систему или твердую поверхность, например, такую как гранулы. Гранулы, используемые в любом из тестов по изобретению, могут быть любого типа, например, из любого материала, магнитные и/или немагнитные; и гранулы, используемые в одном тесте, могут быть в основном одинаковыми или различными по размеру и/или форме.

Можно использовать различные более сложные способы детектирования типа «сэндвича». Например, мишень можно гибридизировать с бифункциональной молекулой, содержащей первую группу, специфическую к мишени, и вторую группу, которую может распознать обычный (т. е. одинаковый) репортер, например, меченый полинуклеотид, антитело или тому подобное. Бифункциональные молекулы можно сконструировать таким образом, чтобы в каждом анализе можно было использовать любое желаемое число обычных репортеров.

Для любого из способов по изобретению можно использовать разнообразные сложные методы детектирования типа «сэндвича» для введения метки в мишени. Например, мишень может взаимодействовать, например, гибридизоваться с бифункциональной (или мультифункциональной) молекулой («детектирующим линкером»), содержащей первую группу, специфичную к мишени, и вторую группу, которая специфична для «репортера». Термин «специфический» имеет значения, уже определенные для взаимодействия, например зондов и мишеней. Термин «репортер», в том смысле, в котором он здесь используется, относится к меченому полинуклеотиду, антителу или любому из обоих типов молекул, уже обсужденных здесь в связи с зондами и мишенями. Данные две группы детектирующих линкеров могут распознавать (взаимодействовать или связываться с) их соответствующие партнеры для связывания любым способом, обсужденным выше в связи, например, с зондами и мишенями. Детектирующий линкер также может включать другие последовательности, например последовательности, специфичные к мишени, но отличающиеся (не перекрывающиеся) от мишень-специфической группы соответствующего комплекса якорь-связанный линкер. Любая последовательность в детектирующем линкере может служить в качестве последовательности узнавания для детектирующего зонда или репортера. В предпочтительном воплощении детектирующий линкер является полинуклеотидом.

Детектирующие линкеры можно сконструировать таким образом, чтобы в анализе можно было использовать любое желаемое число общих репортеров. Например, группу детектирующих линкеров можно сконструировать таким образом, что каждый детектирующий линкер будет специфичным к разным мишеням, но будет включать сайт связывания для одного и того же (общего), или одного из ограниченного числа репортеров. Возможность использовать ограниченное число (например, один) репортеров для мечения различных мишеней в одном анализе обеспечивает преимущество низкой стоимости и более низкого фона. Конечно, комбинации детектирующий линкер/репортер можно использовать для детектирования мишеней, которые распределены любым образом на поверхности, например, как описано выше для типов расположения мишеней, которые можно детектировать непревращающимися фосфорами.

В наиболее предпочтительном воплощении детектирующие линкеры можно сконструировать для детектирования защитных от нуклеаз фрагментов таким образом, чтобы защитные фрагменты, отщепленные под действием нуклеазы от контрольных «выступающих» последовательностей во время проведения способа защиты от нуклеаз (как, например, описано в примере 15), преимущественно метились. Данный тип детектирования схематично представлен на фиг. 24. В данном воплощении детектирующий линкер включает первую группу, специфичную к мишени и вторую группу, специфичную к общей контрольной выступающей последовательности, которая в предпочтительном воплощении находится в основном во всех защитных от нуклеаз фрагментах в начале анализа. Если желательно, контрольную выступающую последовательность можно отщепить от защитного от нуклеаз фрагмента во время реакции

- 28 011415 защиты от нуклеаз, мишень-специфическая группа детектирующего линкера будет гибридизироваться с отщепленным защитным фрагментом, но контрольная выступающая последовательность-специфическая группа детектирующего линкера будет оставаться несвязанной и доступной для последующей гибридизации. С другой стороны, если контрольная выступающая последовательность-специфическую последовательность не отщепить от защитного фрагмента, например, в результате неполного расщепления нуклеазами во время реакции защиты от нуклеаз, то обе мишень-специфическая и контрольная выступающая последовательность-специфическая группа детектирующего линкера будет гибридизоваться с защитным фрагментом, и они будут недоступными для последующей гибридизации. В предпочтительном воплощении комплексы, включающие защитные от нуклеаз фрагменты и связанные детектирующие линкеры, затем на последующей стадии гибридизуются с репортером, который включает сигнальную группу (например, флуорохром, гаптен, фермент или любую другую молекулу, несущую детектируемый сигнал или генерирующую сигнал группу, как здесь уже было описано) и группу (например, олигонуклеотид), которая специфична к контрольная выступающая последовательность-специфической группе детектирующего линкера. Репортер предпочтительно будет связываться и метить такие комплексы, в которых контрольная выступающая последовательность защитного от нуклеаз фрагмента отщеплена (т. е. комплекс, в котором контрольная выступающая последовательность-специфическая группа детектирующего линкера доступна для последующей гибридизации с репортером).

Специалистам в данной области, очевидно, понятны многочисленные другие вариации способов «сэндвич»-детектирования.

Способы, с помощью которых мишени можно инкубировать с мишень-специфическим репортером(ами), или можно инкубировать комплексы мишень/детектирующий линкер с репортерами в условиях, эффективных для достижения связывания или другого стабильного взаимодействия, являются легко определяемыми (смотри выше). Например, флуоресцентные олигонуклеотидные репортеры (в концентрации примерно от 10 нМ до примерно 1 мкМ или выше, предпочтительно примерно 30 нМ, в буфере, таком как 6Х 88РЕ-Т или другие) можно инкубировать со связанными мишенями в течение примерно от 15 мин до 2 ч или дольше (предпочтительно примерно от 30 до 60 мин) при температуре в пределах примерно от 15 до примерно 45°С (предпочтительно около комнатной температуры). После инкубации пробы необязательно можно обработать (например, промыть) для удаления несвязавшихся мишеньспецифических репортеров с использованием условий, которые легко определяются эмпирически, оставляя интактными специфические взаимодействия, но при этом удаляя неспецифически связанные вещества. Например, пробы можно промыть от одного до десяти раз или более в тех же или несколько более жестких условиях, чем таковые, которые использовались для достижения связывания мишень/репортер.

Мечение мишень-специфическим репортером(ами) может обеспечить дополнительную специфичность для начальной реакции гибридизации, например, в случае, когда мишень-специфический олигонуклеотидный репортер связывается с другим участком последовательности нуклеиновой кислотымишени, чем олигонуклеотидный зонд, или когда зонд и репортерные антитела распознают различные эпитопы антигена-мишени. Кроме того, мечение мишень-специфическими репортерами позволит «настраивать» чувствительность реакции. Например, если мРНК-мишень, которая является частью коррелятивного типа экспрессии, экспрессируется в очень низкой концентрации, то уровень сигнала можно увеличить (амплификация сигнала) гибридизацией связанной мишени с несколькими (например, примерно двумя или примерно пятью или более) мишень-специфическими олигонуклеотидными репортерами, каждый из которых специфически гибридизуется с различным участком мРНК-мишени.

Возможность независимо детектировать два типа меток позволяет иметь дополнительный контроль в МАР8-тестах. Некоторые (например, примерно от 10 до примерно 100%) линкеры, сконструированные для конкретного локуса якорей (на фиг. 7 показано 3 типичных локуса якорей, каждый включающий множество в основном одинаковые якорей (А, В и С)), могут иметь метку (например, флуоресцирующую метку), связанную с одним концом. Например, родамин или Су5-флуор можно связать с 5'-концом линкера. Подобные модифицированные линкеры называются «контрольными линкерами». После связывания смеси линкеров и контрольных линкеров с якорями и инкубации пробы, содержащей мишень, с полученной совокупностью зондов, мишень-специфический репортер, несущий другую флуоресцентную метку (например, флуоресцеин или другую детектирующую метку такую, как хемилюминесцентная) можно использовать (или мишень можно непосредственно пометить флуоресцентной меткой или другой детектирующей меткой), и определить соотношение двух сигналов. Присутствие контрольных линкеров позволяет провести калибровку числа функциональных якорей (например, способных к взаимодействию с линкерами) внутри и между тест-областями (т.е. тестируется способность каждого локуса совокупности связываться с мишенью для нормализации сигналов), служит в качестве основы для количественного определения связанной мишени, помогает при расположении локусов якорей и/или обеспечивает положительный контроль, например, в случаях, когда сигнал отсутствует в результате отсутствия мишени в пробе. В одном воплощении изобретения можно также использовать две различные метки (например, флуорофоры) для детектирования двух различных популяций молекул-мишеней; однако возможность распознавания присутствия мишеней пространственным разрешением сигналов позволяет использовать сигнальный тип метки для различных мишеневых молекул.

- 29 011415

Возможность независимо детектировать метки (например, с помощью флуоресцентных меток, излучение от которых происходит при различных длинах волн, таких как, например, флуоресцеин и родамин, или различные непревращаемые фосфоры), придает способам по изобретению дополнительную гибкость. Например, каждую из двух или более мишеней можно пометить, непосредственно или опосредованно, с помощью его собственной, уникально детектируемой метки. Это позволяет детектировать метки на основе свойств, специфических для меток (например, цвет эмиссии) в дополнении (или вместо), например, к идентификации положения локализованной на поверхности мишени или идентификации мишени посредством размера гранулы, на которой она находится. В другом воплощении изобретения множество мишеней можно детектировать независимо в одном локусе внутри области. Например, две или более мишеней (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) можно детектировать в локусе, который определяется одной группой (в основном одинаковых) якорей. То есть, можно использовать группу линкеров, каждый из которых имеет якорь-специфический участок, специфичный к одному и тому же якорю плюс мишень-специфический участок, специфичный к другой мишени. Если используется, например, группа из четырех подобных линкеров, то все четыре могут связываться с членами группы якорей в одном локусе, что позволяет четырем различным мишеням связываться в данном локусе. Если каждая из данных мишеней помечена (непосредственно или опосредованно) с помощью разных, различимых меток, то исследователь может независимо установить присутствие каждой из четырех мишеней в локусе. Следовательно, совокупность, например, пяти якорей (групп якорей) в области можно использовать в сценарии, описанном выше, для детектирования, например, двадцати различных мишеней. Подобный анализ представлен в примере 24 и на фиг. 25. Аналогичным образом множество мишеней, например, 80 или более, можно независимо детектировать, когда распределяется один тип якорей, но не в одном локусе, а равномерно, или в любом желаемом порядке, на твердой поверхности, например, такой как гранула или проточное устройство, и можно использовать другие аспекты такие, как размер или распределение гранул для обеспечения информации об идентичности мишеней или групп мишеней.

Связывание многих линкеров (например, в пределах от 2 до примерно 50 или более), обладающих различной специфичностью по отношению к мишени, с якорями в данном локусе (либо группа в основном одинаковых якорей, «смешанный локус»), в некоторых случаях, относящаяся к «смешанным линкерам», составляет основу для других воплощений изобретения, которые будут, очевидно, понятны специалистам в данной области. Например, в данном локусе якоря можно связать со смесью линкеров, которые специфичны ко множеству различных защитных фрагментов, каждый из которых соответствует (или специфичен к) различному участку нуклеиновой кислоты (например, мРНК), представляющей интерес. Присутствие подобного множества различных линкеров в локусе позволяет значительно повысить чувствительность детектирования интересующей мишени (например, мРНК), например, находящейся в пробе в небольшом количестве. Каждый локус можно сконструировать так, что число линкеров, соответствующих различным участкам мРНК, соответствующей данному локусу, обратно пропорционально (эмпирически определенным образом) содержанию данной мРНК в пробе. Например, если в предварительном опыте обнаружено, что одна представляющая интерес мРНК находится в пробе в большом избытке по сравнению со второй представляющей интерес мРНК, то относительное число линкеров, соответствующих различным участкам двух мРНК, можно подвести таким образом, что относительная интенсивность сигналов, соответствующих каждой мРНК, в основном будет одинаковой. То есть, интенсивность сигналов можно подвести таким образом, что сигнал, соответствующий первой мРНК не будет перекрывать сигнал, соответствующий второй мРНК. Таким образом, анализ подводится так, что можно проводить одновременное детектирование множества мРНК, которые находятся в пробе в резко отличающихся количествах, уравновешивая интенсивность сигналов, соответствующих каждой мРНК.

Как уже отмечалось выше, в другом воплощении изобретения данный локус может включать линкеры, которые специфичны ко множеству неродственных или различных мишеней, или защитных фрагментов, что позволяет детектировать значительно большее число мишеней или защитных фрагментов с использованием одной совокупности якорей. Например, если каждый локус совокупности из 350 якорей включает линкеры, специфические к 10 различным мишеням, то тогда совокупность можно использовать для детектирования 3500 мишеней. На практике подобное расположение позволит превратить совокупность, с помощью которой можно определять низкую плотность мишеней в таковую, которая позволяет определять высокую плотность мишеней.

Множество молекул (например, защитных фрагментов), связанных в одном локусе, можно детектировать последовательно или одновременно, например, с использованием способов детектирования, описанных в настоящей заявке. (См., например, обсуждение, касающееся «детектирующих линкеров» и «репортеров», в разделе выше по сложным способам детектирования «сэндвич»-типа.) В одном воплощении первую мишень (например, защитный фрагмент) в данном локусе детектируют, например, с помощью первой системы детектирования (например, детектирующим линкером/репортером или детектирующим зондом, специфическим к ней); затем первый детектирующий линкер/репортер или зонд удаляют или инактивируют с использованием обычных способов (например, изменением рН для инактивации репортера, включающего фермент, генерирующий хемилюминесцентный сигнал), и используют второй детектирующий линкер/репортер или детектирующий зонд, специфический ко второй мишени в том же локу

- 30 011415 се, для детектирования второй мишени; и так далее проводят много циклов, если желательно. В другом воплощении первый детектирующий линкер/репортер или детектирующий зонд добавляют к описанной выше комбинации, но не удаляют или инактивируют до добавления второго детектирующего линкера/репортера или детектирующего зонда. В данном воплощении количество сигналов, соответствующих второй мишени, можно определить вычитанием количества сигналов, соответствующих первой мишени. В другом воплощении первый и второй детектирующие линкеры/репортеры или детектирующие зонды добавляют к вышеуказанной комбинации в основном одновременно и проводят индивидуальное детектирование, например, используя различные детектируемые метки, как описано выше. В любом описанном здесь способе детектирования детектирующие линкеры могут включать группы, специфичные к одним и тем же или различным репортерам. Например, если четыре мишени связаны с линкерами в данном локусе, то каждый из детектирующих линкеров, специфичных к каждому из четырех мишеней, может включать группу, специфичную к другому репортеру. Следовательно, после гибридизации группы из всех четырех детектирующих линкеров с мишенями мишени можно детектировать последовательно или одновременно, как описано выше, с использованием четырех различных репортеров. Специалистам в данной области, очевидно, понятны другие способы детектирования, а также сочетания вышеуказанных способов.

Конечно, «смешанные линкеры» являются также преимущественными для применения на поверхностях, содержащих одну (неповторяющуюся) область.

В другом воплощении изобретения «якоря», специфические к представляющей интерес мишени(ям), не связываются с линкерами, а в большей мере непосредственно связываются с мишенью(ями); в свою очередь, мишень(и) могут необязательно взаимодействовать с детектирующим линкером(ами) или детектирующим зондом(ами).

Мишени, с меткой или без метки, можно детектировать любым из различных способов, которые являются обычными и общепринятыми в данной области (смотри, например, Еобог с1 а1. (1996), патент США № 5510270; Ριιτιιιιμ е! а1. (1992), патент США № 5143854; Ко^ег (1997), патент США № 5605798; НоШ§ е! а1. (1997), патент США № 5653939; Не11ег (1996), патент США № 5565322; Еддега е! а1. (1997), патент США № 5670322; Μρδίιιιΐζ е1 а1. (1995), ВюТес11пк|ие5 19, 442-447; ЗоиШегп (1996), Тгепбк ίη 6епеНс5 12, 110-115). Способы детектирования включают детектирование с участием ферментов, колориметрические методы, 8ΡΑ, авторадиографию, масс-спектрометрию, электрические методы, детектирование по поглощению или люминесценции (включая хемилюминесценцию или электролюминесценцию) и детектирование по рассеиванию света, например, от микроскопических частиц, используемых в качестве меток. Кроме того, можно детектировать флуоресцентные метки, например, при получении изображения с заряд-сопряженным устройством (ССЭ) или с помощью флуоресцентного микроскопа (например, сканирующего или конфокального флуоресцентного микроскопа) или сочетанием сканирующей системы с ССЦ-матрицей или фотоумножителя, или при использовании технологии детектирования на основе совокупности (например, можно детектировать поверхностный потенциал, каждый из 10-микроновой части тест-области, или можно использовать поверхностный плазменный резонанс, если можно получить достаточно высокое разрешение). Альтернативно, совокупность может содержать метку (например, одну из пары передающих энергию зондов таких, как флуоресцеин и родамин), которую можно детектировать по переходу энергии (или модуляции с помощью) к метке на линкере, мишени или репортере. Среди систем детектирования на основе флуоресценции находится интенсивность флуоресценции, флуоресцентная поляризация (ΕΡ), время-разрешающая флуоресценция, передача флуоресцентной резонансной энергии и гомогенная высвобождаемая во времени флуоресценция (НТКЕ). Анализ повторяющихся полосообразных шаблонов можно проводить по типу узнавания (нахождение соответствующего пятна или линии для каждой специфически меченой мишени по ее положению относительно других пятен или линий) с последующим количественным определением интенсивности меток. Созданы и/или являются промышленно доступные устройства для распознавания и программное обеспечение для анализа одно- или двумерных совокупностей (например, смотри Вауа е1 а1. (1996), патент США № 5545531) .

Другим методом, который можно использовать для детектирования, является двухфотонная флуоресценция, включая варианты, когда флуоресценцию эндогенных или конъюгированных флуорохромов компонентов, связанных с поверхностью совокупностей, усиливают тесным связыванием с поверхностью совокупности, например близким расположением к субстрату, на котором образована совокупность, или близким расположением к другим агентам, включенным в якорь или линкер, или включенным в связанный комплекс. Другие флуоресцентные методы или применения включают флуоресценцию во времени, поляризацию, передачу энергии и т.д. Например, с помощью подобных методов можно проводить одновременное детектирование или распознавание множества мишеней внутри одного локуса, и в некоторых случаях можно различить связанную метку и несвязанную метку, при этом отпадает необходимость отмывки несвязанной метки из совокупности, и таким образом облегчается определение быстро обратимых или слабых взаимодействий совокупности.

Способы получения или применения совокупностей по изобретению, включая приготовление поверхностей или областей таких, как здесь описаны, синтеза или очистки и прикрепления, или присоединения соединений таких, как якоря, линкеры, зонды и детектирующие зонды, описанные здесь, и детек

- 31 011415 тирования и анализа меченых или включающих метку соединений, описанных здесь, являются хорошо известной и общепринятой технологией. В дополнении к способам, раскрытым в цитируемых выше источниках, смотри, например, патенты, принадлежащие ЛГГутах. АГГутеРтх, Ыаподеп, Рго!одепе, 8рес!гадеп, МгШроге и Весктап (чьи продукты, пригодные для осуществления изобретения, являются промышленно доступными); обычные справочники по молекулярной биологии и науке о белках, включая цитированные здесь, и СохеНе е! а1. (1991), патент США № 5063081; 8ои!кетп (1996), Сиггеп! Ор1шоп ίη В1о!ескпо1о§у 7, 85-88; СНее е! а1. (1996), 8с1епсе 274, 610-614 и Еобог е! а1. (1993), Ыа!иге 364, 555-556.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена схема конструирования олигонуклеотидов, на которой линкер 1 включает участок, специфичный к якорю 1, и другой участок (зонд), специфичный к мРНК-мишени 1, и на которой меченый детектирующий зонд 1 является специфичным к последовательности мРНК-мишени, которая отличается от последовательности мишень-специфического участка линкера.

На фиг. 2 представлена поверхность, содержащая 15 тест-областей, каждая из которых включает совокупность из шести якорных олигонуклеотидов.

На фиг. 3 представлена схема линкера для теста связывания с рецептором, на которой якорьспецифический участок линкера связан с участком зонда (рецепторным белком) через молекулы биотина и стрептавидина, и на которой лиганд, специфичный к рецептору, помечен флуоресцентной меткой. В: биотин. 8А: стрептавидин. Вес: рецепторный белок. Лиганд: природный или синтетический лиганд для рецептора. *: флуоресцентная метка, связанная с лигандом.

На фиг. 4 представлена поверхность, которая включает 21 тест-областей, каждая из которых дополнительно разделена на 16 подобластей (впадины, углубления).

На фиг. 5а, 5Ь и 5с представлено три части, из которых может быть собрана поверхность такая, как представлена на фиг. 4. На фиг. 5а представлен луночный разделитель; на фиг. 5Ь представлен подразделитель, и на фиг. 5с представлено основание.

На фиг. 6 представлены две тест-области, каждая из которых включает линейную совокупность зондов (или якорей), которые расположены в «полосатообразном» порядке.

На фиг. 7 схематично представлена тест-область, включающая 3 якоря (А, В и С), каждый из которых находится во множественных копиях («группа»). Положение каждой группы якорей называется «локусом».

На фиг. 8 представлен тест, в котором молекула(ы) кДНК, полученная с помощью специфической обратной транскриптазы, анализируется на МАР8-планшетах.

На фиг. 9 представлен тест, в котором используется способ защиты от нуклеаз (№А-МЛР8-тест). Пробу РНК получают из клеток или из ткани, и она представлена в виде тонких волнистых линий. К пробе РНК добавляют группу полинуклеотидных защитных фрагментов, представленных в виде жирных, темных и светлых линий. Темные участки защитных фрагментов представляют сегменты, которые комплементарны специфическим РНК-мишеням, и они гибридизуются с этими мишенями. Светлые участки представляют выступающие участки: последовательности, смежные с комплементарной последовательностью, но не комплементарные мишени. Защитные фрагменты добавляют в избытке. После гибридизации всех доступных мишеней с защитными фрагментами, пробы обрабатывают соответствующей смесью нуклеаз и проводят химическую обработку, в результате чего разрушается нежелательная негибридизованная РНК и негибридизованный полинуклеотид. Например, 81-нуклеаза может расщепить любую находящуюся одноцепочечную ДНК. В результате, избыток защитных фрагментов гидролизуется, как выступающий негибридизованный участок связанного защитного фрагмента. РНК можно гидролизовать добавлением рибонуклеаз, включая рибонуклеазу Н, или нагреванием проб в основании. Оставшееся представляет смесь отщепленных защитных фрагментов, что отражает количество каждой РНКмишени, находящейся в пробе. Оставшиеся защитные фрагменты определяют МАР8-тестом гибридизации.

На фиг. 10 показана специфичность гибридизации в МАР8-тесте.

На фиг. 11 представлена кинетика связывания якоря с линкером.

На фиг. 12 представлен тест МАР8 двух олигонуклеотидных мишеней.

На фиг. 13 представлено количественное определение сдвига чувствительности.

На фиг. 14 представлено определение температуры плавления четырех комбинаций олигонуклеотидный линкер/якорь.

На фиг. 15 представлен №А-МАР8-тест с мРНК.

На фиг. 16 представлена кривая разбавления с ХРА-МАР8.

На фиг. 17 представлен тест для детектирования пептидов, содержащих остатки фосфотирозина.

На фиг. 18 представлена первая стадия теста для картирования Ε8Τ: сборка линкеров, соответствующих каждому из Ε8Τ, которые подвергаются картированию на совокупностях близких якорей на МАР8-планшете. К поверхности каждой из 16 лунок микропланшета присоединены линкеры, включающие 16 различных олигонуклеотидных зондов, расположенных на матрице 4x4. В первом локусе находится олигонуклеотид 1, который комплементарен участку первой последовательности Ε8Τ, и так далее для 16 Ε8Τ, которые подвергаются анализу.

- 32 011415 кДНК или мРНК, полученные из генов, из которых получены Е8Т, вносят во все 16 лунок и дают возможность гибридизоваться в соответствующих условиях. В результате, будет связываться любая из кДНК или мРНК, которая содержит одну из 16 последовательностей Е8Т, в локусе, где расположен комплементарный ей зонд.

На фиг. 19 показана последующая стадия теста для картирования Е8Т: добавление детекторных олигонуклеотидов на МАР8-планшете. В каждую лунку планшета вносят детектирующий олигонуклеотид, который соответствует одной из Е8Т, которые подвергаются картированию. Каждый детектирующий олигонуклеотид представляет олигонуклеотид, связанный с молекулой, используемой для детектирования, например, флуоресцеином, если методом детектирования является получение изображения одного из Е8Т с помощью флуоресценции. Каждый детектирующий олигонуклеотид является комплементарным одному из Е8Т, но отличается от Е8Т-специфического зонда так, что зонд и детектирующий олигонуклеотид, которые комплементарны одному Е8Т, могут оба одновременно связаться.

После промывания один детектирующий олигонуклеотид вносят в каждую лунку, как пронумеровано на фигуре. То есть, в первую лунку вносят детектирующий олигонуклеотид с последовательностями, комплементарными первому Е8Т, и так далее.

На фиг. 20а, Ь приведены результаты теста картирования Е8Т, представленного на фиг. 18 и 19. После гибридизации детектирующих олигонуклеотидов и промывания в условиях соответствующей жесткости, 16 лунок микропланшета визуализируют с использованием флуоресцентного прибора для визуализации на основе ССЭ. На фиг. 20а представлены стилизованные результаты. Полагается, что каждый Е8Т-специфический детектирующий олигонуклеотид будет метить мРНК или кДНК, фиксируемую Е8Тспецифическим зондом. Например, зонд 5 связывается с кДНК или мРНК, содержащей пятую последовательность Е8Т в этом локусе, таким образом, пятый детектирующий олигонуклеотид будет также гибридизоваться с кДНК или мРНК в этом же локусе. Это отражено в стилизованных данных для каждого детектирующего зонда. Кроме того, каждый из первых трех детектирующих олигонуклеотидов метит кДНК или мРНК, удерживаемую первыми тремя зондами, тем самым становится очевидным, что данные последовательности находятся в одном гене. Аналогичным образом, связанными оказались последние пять Е8Т. Связь, полученная из этих данных, графически представлена на фиг. 20Ь.

На фиг. 21 представлена взаимосвязь зондов, детектирующих олигонуклеотидов и Е8Т # 1, 2 и 6, показанных на фиг. 18-20.

На фиг. 22 представлен анализ с высокой пропускной способностью.

На фиг. 23 представлен способ приготовления амплифицированной мишени.

На фиг. 24 представлен тест с детектирующими линкерами и репортерами.

На фиг. 25 представлено использование многочисленных флуоресцентных меток.

На фиг. 26 представлен анализ с высокой пропускной способностью.

На фиг. 27 представлено пространственное расположение генов клеток ТНР-1 наряду с двумя пробами клеток (взято из фиг. 26).

На фиг. 28 представлен тест с ослаблением сигналов.

На фиг. 29 представлен тест, в котором определяют геномную ДНК и экспрессированную РНК в одной и той же пробе в одной и той же лунке, например, в котором геномная ДНК служит в качестве контроля для нормализации. На левом фотоснимке представлено определение одной ДНК; на правом фотоснимке представлено определение как ДНК, так и РНК СЛРЭН (определены в каждом углу совокупности).

На фиг. 30 и 31 представлено детектирование экспрессированных 8ЫР.

На фиг. 32-35 представлены чувствительность и воспроизводимость теста.

На фиг. 36 представлены некоторые типы конфигураций теста, входящие в объем изобретения.

На фиг. 37 представлена амплификация защитного от нуклеаз фрагмента с помощью ПЦР.

На фиг. 38 представлена амплификация защитного от нуклеаз фрагмента с помощью лигазы.

На фиг. 39 представлена амплификация защитного от нуклеаз фрагмента с помощью защиты от нуклеаз.

На фиг. 40 и 41 представлены тесты, в которых в одной пробе одновременно анализируются белок и мРНК.

На фиг. 42 представлена амплификация защитного от нуклеаз фрагмента с помощью полимеразы. Представлено применение для детектирования 8ЫР.

Примеры

Пример 1. Специфичность гибридизации (см. фиг. 10)

Общий МАР8-планшет получали с использованием впрыскивающего пипетки-дозатора системы Р1ХИ8 (Сайеыап ТесЬпо1од1е8, 1пс., 1гуше, СА) с получением одинаковой сетки ДНК внутри каждой лунки титрационного микропланшета. Все олигонуклеотиды были производства Вюкоигсе 1п!егпа!юпа1 (СатагШо, СА). На каждом планшете в каждую лунку вносили семь различных олигонуклеотидных якорей в порядке, представленном в виде ключа (на фигуре слева). Каждый олигонуклеотид вносили дозатором в виде капли объемом 10 нл на два пятна, из 2 мкМ раствора, содержащего 500 мМ фосфатный буфер с рН 8,5 и 1 мМ ЭДТА в лунки планшета для связывания ДНК (Согшпд Сойаг) и давали возможность высо

- 33 011415 хнуть. После присоединения лунки блокировали 50 мМ Трис-буфером с рН 8, и затем олигонуклеотид, который не связывался ковалентно с поверхностью, вымывали 0,1% 8Ό8 в буфере 5х 88Р.

На отмытые планшеты добавляли меченные флуоресцентной меткой линкерные олигонуклеотиды и гибридизовали в буфере 6Х 88РЕ с 0,1% Тритоном Х-100 при комнатной температуре в течение 30 мин. Это предпочтительный протокол присоединения линкеров. Линкерные олигонуклеотиды во время синтеза Су5-дериватизировали, и они были комплементарны по сегментам из 25 пар оснований специфическим якорным олигонуклеотидам. Последовательности семи якорей и линкеров были следующими (все в направлении 5'-3').

#1 Якорь*: ЗЕО ΙΌ: 1

ТССАССТСАССАСС0САСС6С0ТСС

Линкер** 8Еф ГО: 2 гГГГПТТГГСАТХЛТТ^САОТСЛТАСаАТАстаАОТбОАСОССОТССбОТХТСАаЛтаЭА

РНК (миметик (мышиного С-;ип); £>Е<2 Ю:3 .

СГАТ<1АСТСК1АААС16ТСК1АААСОАСОАТАСТ6АОТТООАССТААСАТТССАТСТСА.ТТСА Детектирующий олигонуклеотид *” 8ЕфЮ:4

ТОААТОАОАТСОААТаТТАааТССА #2 Якорь *_: ЗЕфГО:5

САСТАСООСТОАОСАССТССОСТОС

Линкер** 8ЕС)Ю:6

СТАаОСТОААСТаТООСГССАСТХЛХЗСАОСССАООТаСТСАСССаТАбТО

РНК миметик (мышиного ΜΙΡ-2):

8ΕΟ©:7

АОДСТССАСтССАСА£ПТСАС<ХТАС1САТАСТСАСЛ'СТОААСАААООСАА6ССТААСТОАС

Детектирующий олигонуклеотид ·

5ЕфГО:8

ОТСАОГГАОССТТСССТППТГСАО #3 Якорь*: 8Е(2П):9

ОТСАеТТАЙССТГСССТТТбТТСАО

Линкер 5ЕС)Ю:1О АСХЗАТСТАСТТОАССТСААТОААОСИЗСОСГСССАСААСОСТСОАССООСС

РНК миметик (мышиного СА ΡΟΗ): ΙΟ: 11

ССТГСАТТСАССТСААСГАСАТОТТОАТАСТОАбТОаАСАААССТОССААОТАТСАТйАС

Детектирующий олигонуклеотид ЗЕЦ ГО: 12

ОТСАТСАТАСГГСЮСАССПТСТСС #4 Якорь’: 8Εζ) 10:13 СААССССТСОССТГетТСГАСАСССА

Линкер ” 8Е<510:14

СТАССОАССАААСГССАААТОАААТГбССГОТАОААСАСОСОАССббТТС

РНК миметик (мышиного белка 132): 8Е(210:15

АТТТСАТ1ТССА<ЗТТТОСТСС<ЗТАССАТАСТ<ЗАаГСгА<лТСАССААТ(Х5СААСаССА.<ЭССГ

Детектирующий олигонуклеотид 8ВС> 10:16

АткхлчсатхжтттостоАСгс #5 Якорь 8ЕС> 10:17 СТСОТ'СССССТСССТСССТСССАа

Линкер** 5ЕЦ 10:18 СТПССАОССАС6СЗАСОССОААСОАО #6 Якорь *: 8Е<г 10:19 ССКПСОССАТООТАССАСАОТССОС

Линкер ” 8Е<210:20 сазсАстотоотАссАтахоАссе #7 Якорь*: 5ЕрП>:21 оаэсоссаат’АтосАтсгсггсо Линкер ” 5Е<210:22

СОААОАОАТССАТААСОСООССЗССа • Якоря синтезировали с С12-спейоером по амидной связи на б'-кснце «Линкеры синтезировали с Суб, связанным с б'-концом •••Детектирующие олигонуклеотиды синтезировали с биотином, связанным о б'-концом

В каждую лунку объемно вносили либо один линкер, либо смесь линкеров (как указано на фигуре). (В лунку, отмеченную «все» добавляли смесь всех семи линкеров.) После инкубации и промывания буфером 5х 88Р 3 раза, изображение флуоресценции, представленное в правой части фигуры, получали с

- 34 011415 помощью прибора для визуализации Типбга (ΣΚΙ, δΐ. СаШеппек, ОгИапо). Как можно увидеть, линкеры сами присоединялись к поверхности посредством специфического связывания с комплементарными к ним якорями.

Данную процедуру повторяют за исключением того, что в каждую лунку вносят восемь различных якорей, и затем линкеры, предпочтительно связывающиеся с ними. Повторяют полный процесс с 36, 64 и т.д. различными якорями в каждой лунке 24-, 96-, 384-, 864- или 1536-луночного планшета.

Пример 2. Кинетика связывания (см. фиг. 11)

Представлена скорость гибридизации Су5-дериватизированного молекулы линкера номер 1 с комплементарным связанным с ним якорем для различных концентраций линкера. Общий МАР8-планшет готовили как для фиг. 1, за исключением того, что якорь 1 был связан на четырех пятнах на лунку. Инкубацию проводили при комнатной температуре в буфере 5х88Р с 0,1% Твином-20, лунки 3 раза промывали 5х 88Р и определяли связанную флуоресцентную метку. Картину флуоресценции на планшете получали с использованием прибора для визуализации Типбга, фон вычитали, и суммарную интенсивность каждого пятна внутри каждой лунки рассчитывали с помощью программного обеспечения Типбга. Высчитывали среднее значение и стандартное отклонение для значений суммарной интенсивности для четырех пятен внутри каждой из двух параллельных лунок.

Пример 3. Флуоресцентный линкер

Готовят общий МАР8-планшет с одним якорным олигонуклеотидом, нанесенным либо на 1 пятно на лунку (верхние два ряда), 4 пятна на лунку (следующие четыре ряда) или 16 пятен на лунку (нижние два ряда) с использованием методов, уже обсужденных выше. К каждой лунке присоединяли комплементарный, меченный флуоресцентной меткой линкер, с использованием предпочтительного протокола, описанного в примере 1. После промывания флуоресцентное изображение планшета воспроизводили с помощью прибора Типбга. По количеству флуоресцентной метки в каждом пятне определяли количество функционального линкера, доступного для гибридизации с мишенью. Количество сигнала, детектируемого на повторяющихся пятнах, было высоковоспроизводимым.

Пример 4. Кривые связывания

В планшет, полученный, как описано в примере 3, вносили различные концентрации олигонуклеотида-мишени. Линкер, который присоединялся, содержал 25-мерную последовательность, комплементарную участку мишени. Мишень вносили в буфере 5х 88Р с 0,05% δΌδ в общем объеме 30 или 100 мкл, планшет покрывали и инкубировали при 50°С в течение ночи. После гибридизации мишени с присоединенным линкером мишень визуализировали по предпочтительному протоколу с использованием хемилюминесценции. В концентрации 30 нМ добавляли биотинилированный детектирующий олигонуклеотид, содержащий 25-мерную последовательность, комплементарную отдельному участку мишени (но не к тому же участку, комплементарному линкеру). Биотинилированный детектирующий олигонуклеотид можно внести на 30 мин после вымывания избытка несвязанной мишени или его можно добавить вместе с мишенью для полной гибридизации в течение ночи. После присоединения детектирующего олигонуклеотида поверхность дважды промывали буфером 5х§8Р, один раз буфером 1х§8Р, содержащим 0,1% Твин-20 и 1% ПЭГ (88РТР) и вносили 250 мкг/мл пероксидазы из хрена в разведении 1:50000, конъюгированной со стрептавидином (НКР:8А от Р1егсе, ЯоскГогй, 111.) на 5 ч при комнатной температуре. Лунки четыре раза промывали 88РТР и один раз промывали и затем инкубировали с реагентом §ирег §1дпа1 И11га (Р1егсе). Через несколько минут с помощью прибора для визуализации Типбга получали люминесцентное изображение с помощью ССИ-матрицы в течение 5 мин. Мишень можно визуализировать в тех же лунках в такой маленькой концентрации как ~5х10^-13 М; как правило, количество сигнала становится насыщенным при концентрации мишени, равной ~10^-10 М. Количество сигнала, детектируемого в повторяющихся пятнах, является высоковоспроизводимым.

Пример 5. Анализ двух олигонуклеотидов (см. фиг. 12)

Представлена кривая связывания, показывающая МАР8-тест гибридизации, с использованием предпочтительного вышеописанного протокола для двух различных олигонуклеотидов-мишеней. Готовили общий МАР8-планшет с четырьмя различными якорными олигонуклеотидами, каждый распределенный четыре раза в каждой лунке. Для второго и четвертого якоря комплементарные линкерные олигонуклеотиды присоединялись к поверхности, как описано. Добавляли две мишени в представленных концентрациях в объеме 40 мкл в каждую лунку, как описано, и инкубировали при 50°С в течение ночи. Количество каждой связанной мишени визуализировали присоединением биотинилированного детектирующего олигонуклеотида, специфичного к каждой мишени, с последующим внесением НКР:8А и получали хемилюминесцентное изображение, как описано. В нижней части фигуры представлено количественное определение интенсивности изображения. Проводили сканирование интенсивности изображений по линиям между стрелками, как представлено на верхнем фотоснимке, с использованием программного обеспечения, которое является частью системы Типбга. При наиболее низкой концентрации мишени, 1,1 пкМ, на сканированных изображениях хорошо видны гауссовые пики в каждом пятне, в то время как в самой левой пробе при 0-й концентрации мишени различимые фоновые пики отсутствуют.

- 35 011415

Пример 6. Сдвиг чувствительности (см. фиг. 13)

МАРЗ-тест гибридизации также можно использовать для определения концентрации группы олигонуклеотидов при их связывании с поверхностью и их мечении. Эти способы пригодны для олигонуклеотидов, которые находятся в средней или низкой концентрации. В этом случае можно различить две пробы, поскольку, чем больше в одной пробе содержится олигонуклеотида, тем больше он будет связываться. С другой стороны, если концентрация олигонуклеотида-мишени является насыщенной для поверхности (т. е., если она является достаточно высокой, чтобы занять все места связывания), то тогда при увеличении концентрации связывания не может происходить увеличения связывания и, следовательно, невозможно определить количество. Однако кривую связывания мишени можно сдвинуть добавлением немеченого конкурентного лиганда.

Получали кривые связывания для четырех различных олигонуклеотидных мишени, которые все приводили к насыщению поверхности (т.е. достигали максимального связывания) грубо при 3 нМ. Добавлением немеченных конкурентных мишеней во все лунки сдвигали связывание меченого олигонуклеотида для того, чтобы достичь связывания при более низкой концентрации, и при которой уровень насыщения сдвигается. Можно добавить конкурентные олигонуклеотиды, например, для мишеней 1 и 3, но не 2 и 4. Это приводит к сдвигу чувствительности теста только для мишеней 1 и 3. Таким образом, внутри одной тест-лунки можно определять множество олигонуклеотидных мишеней с различной концентрацией, если относительное количество олигонуклеотида предположительно известно.

Как уже пояснялось выше, данные можно обработать количественно для связывания одной из олигонуклеотидных мишеней. На фиг. 13 количественно показано, что включение конкурентного олигонуклеотида в тест сдвигает кривую связывания, используемую для анализа данной мишени, находящейся в более высоких концентрациях.

Пример 7. Температура плавления четырех зондов (см. фиг. 14)

Построили график зависимости концентрации четырех различных меченных флуоресцентной меткой линкерных олигонуклеотидов, специфически гибридизованных с якорными олигонуклеотидами в МАРЗ-тесте от повышения температуры. Вначале четыре олигонуклеотида гибридизовали при 50°С в течение 1 ч при концентрации 300 нМ. Затем лунки промывали ЗЗС без зондов и определяли связанное количество, как описано выше по флуоресценции (точка 50°С). Затем поверхность инкубировали при 55°С в течение 30 мин и определяли связанную флуоресцентную метку и так далее при всех показанных значениях температуры.

Пример 8. Способы детектирования

Два способа детектирования можно непосредственно сравнить между собой. К МАРЗ-планшету с четырьмя присоединенными олигонуклеотидными якорями, каждый в четырех пятнах на лунку, добавляли два олигонуклеотида в каждую лунку, оба включали ковалентно связанную Су5-группу или оба содержали биотин. Проводили определение эпи-флуоресценции, как описано в отношении визуализации и определения флуоресцентного линкера. Определение хемилюминесценции проводили, как описано для МАРЗ-теста, с последующим добавлением НКР:ЗА и хемилюминесцентного субстрата. Генерированные сигналы имели примерно ту же величину. Однако вследствие геометрических свойств микропланшетов, которые имеют стенки, отделяющие каждую лунку, и случайных пузырьков жидкости или миниска жидкости, возникающие отражения на эпи-флуоресцентных изображениях, могут мешать интерпретации данных.

Пример 9. Продукты хемилюминесценции

Можно сравнить два промышленно доступных продукта в качестве хемилюминесцентных субстратов для пероксидазы из хрена для детектирования в МАРЗ-тесте. МАРЗ-планшеты готовили, как в примере 8, и инкубировали с биотинилированными линкерными олигонуклеотидами. Затем добавляли либо щелочную фосфатазу, конъюгированную со стрептавидином (Л1кРйо8:ЗЛ), или НКР:ЗА с последующим промыванием и добавлением либо СЭР-З1аг (Ττορίχ) в лунки с А1кР1ю5:ЗА или ЕСЬ-Р1и8 в лунки с НКР:ЗА. Мечение с ЗА-дериватизированными ферментами и субстратами проводили согласно указаниям изготовителей в отношении введения метки при постановке вестерн-блоттинга. Два этих субстрата (а также другие промышленно доступные субстраты) можно использовать для оценки гибридизации олигонуклеотидов с МАРЗ-планшетами.

Пример 10. Разрешение при 0,6 мм

Разрешение данной системы для МАРЗ-теста оценивали при приготовлении МАРЗ-планшетов с четырьмя различными олигонуклеотидными якорями на каждую лунку, каждый внесенный четыре раза в лунку, при модуле (расстояние от центра до центра), равном 0,6 мм. Затем гибридизовали либо су5дериватизированные линкеры, либо биотинилированные линкеры, детектирование и сканирование проводили, как описано выше. Для определения эпи-флуоресценции разрешение было выше (и модуль можно, вероятно, уменьшить). При детектировании хемилюминесценции смежные пятна полностью не разделялись, но все равно даже при таком расстоянии отдельные пики можно было разрешить с помощью компьютера.

Пример 11. Протокол теста защиты от нуклеаз

В тесте для анализа оптимальных условий гибридизации и обработки нуклеазами в протоколе за

- 36 011415 щиты от нуклеаз использовали набор для теста защиты от нуклеаз производства Αιηόίοη (ΛυδΙιη, Техак) для обеспечения условий, буферов и ферментов. В одном из трех буферов готовили восемь проб. НуЬ Ви££ 1 представляет 100% буфер для гибридизации (ΑιηΝοη) ; НуЬ Ви££ 2 представляет 75% буфера для гибридизации и 25% разбавляющего буфера для гибридизации (ΑтЬ^οи), и НуЬ Ви££ 3 содержит по 50% каждого. Синтезировали 70-мерный олигонуклеотид, содержащий 60 остатков, комплементарных тестируемой мРНК (В1О8Оигсе Щетайоиаф СатагШо, СΑ) и метили Псорален-флуоресцеином (§сЫе1сйег и 8сйие11, Кссис, ΝΗ) с последующим проведением протокола, предлагаемого для мечения Псораленбиотином фирмой ΑтЬ^οи. Кратко, защитные фрагменты разбавляли до концентрации 50 мкг/мл в 20 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-буфера, 1 мМ ЭДТА, рН 8), кипятили в течение 10 мин и быстро охлаждали на льду. Добавляли 4 мкл раствора Псорален-флуоресцеина в ДМФА с концентрацией 130 мкг/мл и пробу освещали в течение 45 мин при 40°С ручным источником ультрафиолетовых длинных волн. Свободный Псорален-флуоресцеин удаляли экстракцией насыщенным бутанолом. Использованная мРНК представляла антисмысловую мΡΗΚ-СΛΡ^Η, полученную из антисмысловой плазмиды (ρΤΡΙ-ΟΑΡΌΗмышиная антисмысловая контрольная матрица от ΑтЬ^οи) с использованием Т7-промотора и набора Мах1-8спр1 (ΑтЬ^οи). Короткий защитный фрагмент представлял 60-мерный комплементарный участок, синтезированный отдельно и меченный аналогичным образом. Последовательности защитных фрагментов являются следующими:

Полноразмерный защитный фрагмент; 5Εζ} Ю: 23

ССАОАААТАТОЛ<>АСТСАСТСААОАТТОТСАССААТОСАГССТ<ЗСАССАССААСТОСТТйСГГОТ СТАЛ Короткий защитный фрагмент: 5ЕС> П>: 24

ССАОАААТАТОАСААСТСАСТСААОАТГОТСАОСААТОСАТССТОСАССАССААСТОС'ГТ

Гибридизацию проводят смешением защитных фрагментов в концентрации 20 нМ и мРНК-СΛΡ^Η В концентрации 60 нМ в 10 мкл конечного объема в течение двух часов при 22 и 37°С. После гибридизации добавляют 200 мкл смеси нуклеаз согласно инструкциям изготовителя (набор для защиты от нуклеаз производства ΑтЬ^οи, смесь нуклеаз в разведении 1:200) и вновь инкубировали при той же температуре в течение 30 мин. Гидролиз останавливают буфером для ингибирования гибридизации (^11^1011), олигонуклеотиды осаждают центрифугированием и промывали этанолом. Добавляют 10 мкл 1х буфера для нанесения проб на гель (ΑιηΝοη) и олигонуклеотиды разделяют в 15% геле ТВЕ-мочевина. Гель промывают в буфере в течение 30 мин, помещают на пластиковый планшет и визуализируют с помощью ТииФи с использованием фильтров с флуоресцеином при выбранных длинах волн возбуждения и эмиссии. Изображение аккумулируют на совокупности ССИ в течение 2 мин. Наилучшие результаты получают, когда пробы инкубируют в НуЬ Ви££ 2 при 37°С или в НуЬ Ви££ 3 при 22°С. В данных пробах отсутствовали детектируемые полноразмерные защитные фрагменты, и можно было обнаружить значительные количества участка полноразмерного защитного фрагмента примерно такого же размера, как короткие защитные фрагменты.

Пример 12. Тест определения мРНК с ΝΡΑ-ΜΑΡδ (см. фиг. 15)

Использовали полный протокол ΝΡΑ-ΜΑΡδ с условиями гибридизации и обработки нуклеазами, аналогичными описанным в примере 11. В тесте исследовали десять проб. Во всех пробах находилось одинаковое количество 70-мерных олигонуклеотидных защитных фрагментов и различные количества мРНК-СΛΡ^Η. Пробы для гибридизации в количестве 10 мкл в смеси 50% буфера для гибридизации и 50% буфера для разведения, содержащей 0,08 мг/мл дрожжевой РНК (ΑιΜοη), нагревали при 90°С в течение 6 мин, быстро центрифугировали, нагревали при 70°С в течение 5 мин, давали охладиться до 19°С и инкубировали в течение 19 ч. Затем к каждой пробе добавляли 20 мкл смеси нуклеаз на 30 мин при 19°С. Из каждой пробы отбирали 60 мкл для проведения ΜΑΡδ-теста. Добавляли 2 мкл 10н №1ОН и 2 мкл 0,5 М ЭДТА и пробу нагревали при 90°С в течение 15 мин, при 37°С в течение 15 мин и давали охладиться до комнатной температуры в течение 20 мин. Затем пробы нейтрализовали 2 мкл 10 М НС1 и добавляли 12 мкл буфера 20х δδ^ содержащего 2 М №ΡΕδ с рН 7,5 и 200 нМ биотинилированных детектирующих олигонуклеотидов, специфичным к защитному фрагменту, а также 1 мкл 10% δΌδ. Пробы смешивали, нагревали при 80°С в течение 5 мин и две аликвотные порции каждой пробы объемом 35 мкл вносили пипеткой в две лунки ΜΑΡδ-планшета (каждую пробу разделяли на две и проводили параллельный анализ на ΜΑΡδ-планшетах). Планшет готовили по обычному протоколу для ΜΑΡδ с присоединением Су5-дериватизированного линкера, специфичным к уже присоединившемуся защитному фрагменту. ΜΑΡδ-планшеты накрывали и инкубировали при 50°С в течение ночи, детектирование и люминесцентный анализ проводили, как описано. В последнюю пробу нуклеазы не добавляли во время проведения теста и визуализировали в качестве контроля для оценки того, как будет детектироваться один защитный фрагмент в ΜΑΡδ-тесте. В нижней части фигуры представлен скан интенсивности (анализ с помощью прибора для визуализации) для верхнего ряда лунок. Количество мРНК-СΛΡ^Η, находящейся в пробе (т.е. количество в каждой параллельной лунке после нанесения аликвотной порции на ΜΑΡδпланшет), представлено на фигуре.

Олигонуклеотиды, использованные для ΜΛΡδ-планшетов, были следующими:

- 37 011415

Якорь*: ЗЕф ΙΟ: 25

С6ссс5тс5асссттстсосазссс

Линкер** ЗЕЙ 10:26

СТТЙАеТбАСТТСТСАТАТТТСТСССАТАСТСАСТССССТСССАСААСССТСеАСС босс

Защитный фрагмент (комплементарный антисмысловой мРНК для

СКРОИ)

ЗЕ(2 Ю: 27 СОаСАААТАТСАСААСТСАСТСаАОАТТСТСАССААТеСАТССТОСАССАССААСТОСТТССТ ТСТСТАА

Детектирующий олигонуклеотид*** - меченный биотином на 5'-конце £Ες ГО: 28

ААССАСТТССТССТССАОЙАТССАТ * Якоря синтезировали с С12-спейсером по амидной связи на 5'-конце ** Линкеры синтезировали с Су5, связанным с 5'-концом *** Детектирующие олигонуклеотиды синтезировали с биотином, связанным с 5'-концом

Пример 13. Кривая разбавления, ΝΡΑ-ΜΑΡ8 (см. фиг. 16)

Данные, которые обсуждались в примере 12 и представленные на фиг. 15, подвергали количественному анализу и строили график в виде кривой разбавления. Вычисляли среднее и стандартное отклонение для всех восьми пятен в двух параллельных лунках для каждой концентрации мРНК. Кривая связывания представлена в виде:

Связанная фракция=максимально связанная* 1/(1 + 1С₅₀/Ь), где максимально связанная представляет максимальное связывание при насыщении, связанная фракция представляет связанное количество при концентрации лиганда, Ь, и 1С₅₀ - концентрация лиганда, при которой связанная фракция составляет половину от максимально связанной. Кривая представлена в виде точек и тире на фигуре со значением 1С50=4,2.

Пример 14. Тест ΝΡΑ-ΜΑΡ8 определения мРНК-ΟΑΡΌΗ в цельном экстракте общей фракции РНК из мышиной печени

Экстракт общей фракции мышиной РНК анализируют на содержание мРНК-ΟΑΡΌΗ в тесте ΝΡΑΜΑΡ8 и строят кривую разбавления. Общую фракцию РНК из мышиной печени готовят с использованием набора Οίαβοη. РНК осаждают 70% ЕЮН с 0,5 М ацетата и ресуспендируют в 10 мкл буфера 5х 88С с 0,05% 8Ό8 с 1,8 нМ защитного фрагмента. Защитный фрагмент добавляют к олигонуклеотиду из 70 пар оснований, из которых 60 оснований было комплементарно мышиной ΟΑΡΌΗ. Используют либо фрагмент, комплементарный мышиной мРНК-ΟΑΡΌΗ («защитный фрагмент»), либо комплементарный последовательности, использованный в качестве отрицательного контроля («антисмысловой фрагмент»).

Пробы РНК с защитными фрагментами нагревают при 90°С в течение 5 мин и проводят гибридизацию при нагревании проб до 70°С и затем их медленно охлаждают до комнатной температуры в течение ночи. Добавляют нуклеазу 81 (Гютс^а) в разведении 1:10 в 30 мкл буфера для нуклеазы 81 (Гюте^а) на 30 мин при 19°С и останавливают добавлением 1,6 мкл 10н ΝαΟΗ и 2,7 мкл 0,5 М ЭДТА. Пробы нагревают при 90°С в течение 15 мин и затем при 37°С в течение 15 мин для денатурации и разрушения РНК, нейтрализуют 1,6 мкл 10 М НС1 и инкубируют на ΜΑΡ8-планшетах в течение ночи в буфере 5х 88С с 0,5% 8Ό8 с добавлением 200 мМ ΗЕΡЕ8 с рН 7,5, к которому добавляют 30 нМ биотинилированного детектирующего олигонуклеотида. Промывание и визуализацию с 8Α-ΗΚΡ проводят, как уже описано. Количество сигнала снижается параллельно со снижением количества мышиной РНК (пробы содержат 500, 170, 50, 5 или 0,5 мкг общей мышиной РНК). Включают две контрольные пробы, в которые не добавляют нуклеазу 81. Сигнал обнаруживают только для комплементарного защитного фрагмента.

Использовали олигонуклеотиды:

- 38 011415

Якорь*: 5ВС>10:25

СОСЮЭОТТ^ОССТТСТССОАОСОС

Линкер* 8Εζ) ТО: 26

СП'ОАОТОАОПОТОКТАТТГСТСООАТАСЮАОТССОСГСССА^

Защитный фрагмент (комплементарный мышиной антисмысловой мРНКдля СЗАРРН) ЗЕТ?©: 27 СОАОАААТАТОАСААСТСАСТСААОАТТОТСАбСААТССАТССТОСАССАССААСТССТТ ОСТГОТСТАА .

Детектирующий олигонуклеотид*** 8Εζ) Ш: 28

ААОСАОТТООТОСТССАООАТОСАТ

Для проб со смысловой мРНК ΘΑΡΡΗ .

Якорь*: 8ЕфШ: 25 сассоотсалосаттотоооАасос Линкер’* 8ЕфЮ:29

АТОСАТССТОСАСХАОСМСТОСТГС^^^

Защитный фрагмент (комплементарный мышиной мРНКдля ΘΑΡΡΗ) 8Е(?©:30

ААС5САССТОСГОСТОСАСаАТОСАСТаСТОАСААТОТОАСГОАОТТСТСАТА1ТТСТСО ОСГТОТСТАА

Детектирующий олигонуклеотид*** 5Е<Э©:31 СОАОАААТАТалСААСТСЛСТСААО • Якоря синтезировали с С12-спейоером по амидной связи набЧонце ·· Линкеры синтезировали с Суб, связанным с бЧонцом «•Зонды синтезировали с биотином, связанным с б’-концом

Пример 15. Тест защиты от нуклеаз ΜΑΡ8 с контролями мРНК экстрагируют из мышиной печени и защиту от нуклеаз в основном проводят, как описано в примере 14, за исключением того, что ΟΑΡΌΗ-специфический защитный фрагмент содержит 60 нуклеотидов, которые комплементарны мышиной ΟΑΡΌΗ, с последующими 15 «выступающими» нуклеотидами на 3'-конце фрагмента, которые не комплементарны мишени. После гибридизации и расщепления нуклеазой оставшийся защитный фрагмент гибридизуется с ΜΑΡδ-планшетом, как описано в примере 14, за исключением того, что для детектирования иммобилизованного защитного фрагмента используют два различных олигонуклеотидных детектирующих фрагмента. Один детектирующий фрагмент является комплементарным ΟΑΡΌΗ-специфическому участку защитного фрагмента, и другой, контрольный комплементарен выступающему участку защитного фрагмента из 15 оснований. Каждый детектирующий фрагмент используют в различных воспроизведенных пробах (т. е. различных лунках) так, что оба детектирующих фрагмента можно пометить одной детектирующей молекулой. В настоящем примере оба фрагмента метят НКР. Без добавления нуклеазы сигналы идут от обоих детектирующих фрагментов, в то время как после расщепления нуклеазой можно детектировать сигнал, соответствующий последовательностям ΟΑΡΌΗ. Значение ΟΑΡΌΗ-специфического сигнала снижается относительно такового, наблюдаемого при отсутствии расщепления нуклеазой, поскольку защитный фрагмент добавляют в избытке по отношению к количеству находящейся мРНК-ΟΑΡΌΗ. Это позволяет ограничить количество мРНКΟΑΡΌΗ защитной гибридизацией так, что количество образовавшегося двухцепочечного гибрида (и, следовательно, количество защитного фрагмента, которое защищено от воздействия нуклеазы), отражает количество мРНК. Когда в реакционную смесь не входит мРНК, то при добавлении нуклеаз сигнал не детектируется. Вышеописанные установленные факты показывают, что стадии гибридизации и расщепления в анализе протекают, как это желательно.

Когда защитные фрагменты, соответствующие различным мишеням, включают в данный тест, то каждый из защитных фрагментов может содержать один и тот же выступающий участок из 15 оснований. Это позволяет использовать один детектирующий фрагмент для тестирования остающегося выступающего участка во всех пробах.

Пример 16. Тест транскрипции для скрининга соединений, которые могут изменять экспрессию генов, являющихся коррелятивными для болезненных состояний

Используют линию клеток, полученную из опухоли человека. Установили, что в ней экспрессируется 30 генов на более высоком уровне, чем в нормальных клетках (т.е., данные 30 генов использовались в большей степени по сравнению с нормальными клетками для продукции мРНК и затем для продукции белков, которые кодируются данными генами. Анализ транскрипции позволяет определить, как много генов используется по определению того, как много мРНК присутствует для каждого гена). С использованием теста защиты от нуклеаз на ΜΑΡδ-планшетах (ΝΡΑ-ΜΑΡ8) тестируют 8800 химических соединений для установления того, снижается ли в культивируемых клетках в присутствии соединений экспрессия некоторых из 30 коррелятивных генов без воздействия на экспрессию шести нормальных генов (конститутивных, вспомогательных генов). Любое соединение, оказывающее влияние, могло быть пригодным при будущей разработке лекарственных препаратов для лечения данного вида опухоли.

В каждую лунку 100 96-луночных планшетов из полистирола вносят примерно 10000-100000 клеток, и клетки культивируют в течение 2 суток, пока они не покрывают поверхность каждой лунки. В 8

- 39 011415 лунках каждого планшета клетки растут без добавления тестируемых соединений. В оставшиеся 88 лунок каждого планшета вносят различные химические соединения так, чтобы можно было оценить эффект каждого из них. На 100 планшетах одновременно можно тестировать или подвергнуть скринингу 8800 соединений. Клетки культивируют в течение 24 ч в присутствии соединений, и затем клетки собирают для анализа. Клетки в каждом планшете обрабатывают согласно инструкциям для получения РНК в пробах из 96-луночных планшетов (например, прилагаемых к наборам О1адеп КНеаку 96). После получения РНК количественно определяли 36 различных видов мРНК способом ΝΡΑ-ΜΑΡ8, включая 30 коррелятивных генов и 6 нормальных вспомогательных генов. 36 олигонуклеотидных защитных для ДНК фрагментов, каждый соответствующий одному из интересующих генов, вносили в каждую лунку и гибридизовали в выбранных жестких условиях с их мишеневыми последовательностями мРНК. Затем добавляли нуклеазу 81 для разрушения гибридизованной ДНК, и пробы обрабатывают химически также для разрушения РНК. Оставшееся представляет олигонуклеотидные защитные фрагменты для каждого из 36 генов пропорционально количеству находящейся в обработанных клетках мРНК в каждой пробе.

Приготовили одну тысячу 96-луночных планшетов, каждый из которых содержит совокупность множества 36 различных якорных олигонуклеотидов в каждой лунке, добавлением в каждую лунку 36 различных линкерных олигонуклеотидов. Линкеры присоединяются к поверхности каждой лунки, превращая общие планшеты в МАР8-планшеты, содержащие специфические зонды для каждого из 36 олигонуклеотидных защитных фрагментов. Каждый линкер имеет участок, специфичный к одному из 36 якорей, и участок, специфичный к сегменту одного из 36 защитных олигонуклеотидов. Пробу олигонуклеотидов из каждой лунки 100 планшетов с пробами добавляли в соответствующую лунку 100 МАР8планшетов. После гибридизации в выбранных жестких условиях добавляли детектирующий олигонуклеотид для каждой мишени с конъюгированным хемилюминесцентным ферментом так, что каждое специфическое пятно в каждой лунке светилось пропорционально количеству мРНК, находящейся в пробе. Все лунки, в которых отмечали пониженные количества коррелятивных генов без воздействия на 6 вспомогательных генов, представляют интерес. Возможно, соединения, добавленные к клеткам данных проб, представляют исходные точки в разработке противоопухолевых средств.

Пример 17. Экспрессия индуцированных и конститутивных генов

РНК получали в основном, как описано в примере 14, из печени мышей, либо незараженных («контрольные»), либо через один час после заражения («зараженные») аденовирусом. Для каждой пробы использовали 60 мкг печеночной РНК, и пробы готовили в параллелях. Каждая лунка для анализа содержала три группы параллельных локусов, соответствующих трем описанным выше генам. Каждый локус содержал якорь, связанный с линкером, включающим зонд, который был комплементарным защитному фрагменту, соответствующему одному из трех генов. МАР8-тест защиты от нуклеаз проводили в основном, как представлено на фиг. 12, и изображения собирали и сканировали, как уже описано. Представленное собранными необработанными визуализированными данными и сканами интенсивности для параллельных лунок для каждой из трех мРНК-мишеней. Числа по линиям сканов представляют интегрированные значения интенсивности и стандартные отклонения для каждого условия (п=4). Вспомогательный ген ΟΑΡΌΗ, изменение которого не предполагалось, показал незначительное увеличение в 1,3 раза в зараженной пробе, которое было статистически недостоверным. Транскрипция М1Р-2 и с-щп увеличивалась соответственно в 4 и 6 раз. Данные установленные факты свидетельствуют о том, что два гена, М1Р2 и с-щп. показывают повышенную экспрессию в ответ на заражение аденовирусом по сравнению с контролем, конститутивно экспрессированным геном - САРЭН.

Пример 18. Ферментный способ скрининга соединений, избирательно ингибирующих тирозин- или серинкиназы (см. фиг. 17)

Киназы представляют ферменты, под действием которых фосфат присоединяется к белкам. Было показано, что многие из них стимулируют рост нормальных или злокачественных клеток. Следовательно, соединения, которые ингибируют специфические киназы (но не все киназы), могут использоваться для анализа участия киназ в развитии патологии и, если да, то они могут служит ли в качестве отправной точки для разработки фармацевтических препаратов. Например, пятью тирозинкиназами, которые участвуют в стимуляции роста клеток или регуляции воспалительной реакции, являются кгс, 1ск, Гуп, Ζηρ70 и уек. Каждая киназа имеет субстраты, которые частично установлены такие, как короткие пептиды, содержащие тирозин. Специфичность некоторых киназ перекрывается так, что различные киназы могут одинаково фосфорилировать некоторые пептиды, но другие - только предпочтительно. Для пяти киназ отбирали 36 пептидных субстратов, которые показывают спектр специфической и перекрывающейся специфичности.

Используют одну тысячу 96-луночных планшетов; каждая лунка содержит 36 общих олигонуклеотидных якорей. Получают 36 линкеров для превращения общей совокупности олигонуклеотидов (только с якорями) в совокупности, включающие пептидные субстраты. Синтезируют 36 пептидных субстратов и каждый соединяют ковалентной связью по амидной связи, например, с олигонуклеотидом, содержащим 5'-аминогруппу. Олигонуклеотиды содержат последовательности, которые гибридизуют специфически с якорями. Линкеры пептид/олигонуклеотид сами присоединяются к поверхности при их добавлении во все лунки на МАР8-планшетах.

- 40 011415

Для скрининга пять киназ в соответствующих концентрациях (так, чтобы скорости фосфорилирования субстратов были максимально уравновешены) вносят в каждую лунку вместе с одним из 8800 различных соединений, предназначенных для тестирования. Соединения тестируют на их способность непосредственно ингибировать выделенные ферменты. Степень фосфорилирования каждого, входящего в совокупность пептида, детектируют добавлением меченых антител, которые связываются только с пептидами, фосфорилированными по тирозину. Представляет интерес любая лунка, в которой отмечается снижение флуоресценции фосфотирозиновых пятен, но не все лунки. Соединения, которые внесли в данные лунки, можно тестировать дополнительно в качестве возможных избирательных ингибиторов некоторых тестированных киназ.

Схема анализа представлена в верхней части фиг. 17. Получают химерную линкерную молекулу, в которой олигонуклеотид из 25 пар оснований, комплементарный одному из якорей, сшивают с пептидным субстратом тирозинфосфокиназы. Химерный олигонуклеотид-пептидный субстрат сам связывается с совокупностью олигонуклеотидных якорей, киназу используют для фосфорилирования пептидного участка химеры, и после проведения ферментативной реакции определяют степень фосфорилирования пептида с помощью антител к антифосфотирозину и антифосфосерину с конъюгированным детектирующим флуорохромом или ферментом.

Результаты теста представлены в нижней части фигуры. Гомобифункциональный линкер для поперечного сшивания, Ό88 (Пег се), использовали для связывания 5'-аминогруппы олигонуклеотидного линкера с Ν-концом синтезированного пептида с фосфорилированным тирозином. Последовательность пептида, представленная в виде кода из начальных букв, представляла Τ8ΕΡ0ρΥ0Ρ6ΕΝΕ (8Е0 ГО: 32), где ρΥ является фосфотирозином. Химеру использовали либо непосредственно, либо вначале значение рН доводили до 14 в течение 60 мин для частичного гидролиза фосфатной группы в тирозине. Фосфорилированные или частично дефосфорилированные химерные молекулы сами связывались с комплементарными якорными молекулами на планшете ΜΑΡ8 в концентрациях, представленных для одного часа. После промывания и блокирования лунок 0,3% Β8Α в 88ΡΤΡ добавляли антитела к антифосфотирозину, конъюгированные с ΗΒΡ (антитело 4610 производства ирк!а!е Вю1ес1то1оду. Лаке Ρ^ίά, ΝΥ) в разведении 1:3000 в 88ΡΤΡ на один час, и определяли количество антител, связавшихся с хемилюминесцентным субстратом, 8ирег 8щпа1 В1ахе. Представленное изображение аккумулировали на совокупности ССЭ в течение 1 мин. Как и предполагалось, наблюдали различия в количестве фосфата, связывающегося с олигонуклеотид-пептидом. Данные различия являются основой для последующего анализа того, какова будет активность киназ при обработке различными возможными ингибиторами.

Пример 19. Тест связывания для детектирования избирательных ингибиторов взаимодействия 8Η2доменов и фосфорилированных пептидов

8Н2-домены служат в качестве срезающих субъединиц для некоторых регулирующих рост белков. Домены связываются с содержащими фосфотирозин белками или пептидами с низкой специфичностью. То есть, некоторые содержащие фосфотирозин пептиды специфически связываются с одним или несколькими 8Н2-белками, в то время как другие - со многими 8Н2-белками.

Для данного теста линкеры представляют собой фосфорилированные пептиды, ковалентно связанные с олигонуклеотидами. Пептидные группы выбирают по их способности связываться с группой выбранных 8Н2-белков. Линкеры превращают планшеты общего типа в ΜΑΡ8-планшеты с лигандами, специфичными к группе белков, содержащих 8Н2. Готовят 100 96-луночных планшетов ΜΑΡ8, несущих лиганды. Белки выделяют и метят, например, Су5-флуоресцентной молекулой.

Для проведения скрининга ингибиторов взаимодействия 8Н2-домен-фосфопептид группу меченых белков с 8Н2 вносят в каждую лунку 100 96-луночных планшетов и в каждую лунку добавляют различные тестируемые соединения. Следовательно, индивидуально тестируется влияние каждого соединения на взаимодействие 8Н2-белков с их фосфопептидными лигандами. Тест позволяет определить флуоресценцию связанного 3Н2-белка, соединенного с каждым связанным с поверхностью пептидным линкером. Для любой лунки, в которой наблюдают пониженную флуоресценцию в некоторых пятнах, но не во всех пятнах, внесенное соединение может быть тестировано далее в качестве предполагаемого избирательного ингибитора 3Н2-срезающего домена.

Пример 20. Высокопроизводительный скрининг (см. фиг. 22)

Представленное является ΜΑΡ8-планшетом с высокой пропускной способностью для детектирования сигнала из 96 лунок в одном опыте. Определяли гибридизацию одного олигонуклеотида с 16 репликатами в 80 лунках. Как показано, воспроизводимость 1280 тестов гибридизации была очень высокой. Самые левые и самые правые колонки служат в качестве контролей для стандартизации сигнала при различных концентрациях олигонуклеотида.

Аналогичным образом в каждой лунке можно тестировать 16 различных олигонуклеотидов и повторить тест в 80 различных лунках на планшете. Конечно, в каждой лунке можно тестировать даже большее число различных олигонуклеотидов или других зондов (например, 100 нуклеотидных зондов), и одновременно можно проводить анализ многих планшетов (например, 100 планшетов, таких как 96луночный титрационный микропланшет). Большое количество анализов, которое можно ставить с каждой пробой (например, в последнем случае примерно 100 различных анализов) и большое число проб,

- 41 011415 которое можно анализировать одновременно (например, в последнем случае примерно 96x100 или 9600 различных проб) обеспечивает аналитическую систему с высокой пропускной способностью.

Пример 21. Приготовление амплифицированной мишени (см. фиг. 23)

Праймер для ПЦР (праймер один) присоединяют к твердой подложке (например, грануле или реакционному сосуду) посредством химической модификации, которую вводят в 5'-конец праймерного олигонуклеотида. Праймер включает в направлении 5'-3' химическую модификацию, сайт рестрикции и последовательность, комплементарную интересующей мишени (например, копия кДНК интересующей мРНК). Мишень амплифицируют ПЦР, с использованием в качестве праймеров для ПЦР присоединенного праймера один плюс праймер два, который включает в направлении 5'-3', последовательность, специфичную к детектирующему олигонуклеотиду, и последовательность, комплементарную другому участку мишени, чем таковой в праймере один. После ПЦР амплификации амплифицированную ДНКмишень отмывают для удаления избытка реакционного материала и высвобождают с твердой подложки расщеплением рестриктазой, специфичной к сайту рестрикции в праймере один. Таким образом, амплифицированный праймер высвобождается в жидкую фазу. Термическую и/или химическую обработку можно использовать для дезактивации рестриктазы и денатурации продукта двухцепочечной ДНК. Затем высвобожденная одноцепочечная ДНК-мишень может контактировать с поверхностью, содержащей якоря и/или линкеры, и мишень можно детектировать с использованием детектирующих олигонуклеотидов, комплементарных детектор-специфическим последовательностям праймера два.

Пример 22. Приготовление амплифицированной мишени

Праймер для ПЦР (праймер один) присоединяют к твердой подложке (например, шарику и реакционному сосуду) посредством химической модификации, которую вводят в 5'-конец праймерного олигонуклеотида. Праймер включает в направлении 5'-3' химическую модификацию, пептидную последовательность, которую можно расщепить протеазой и последовательность, комплементарную интересующей мишени (например, копию кДНК интересующей мРНК). Вместо пептида, также можно использовать любой другой элемент, который можно специфически расщепить. После ПЦР амплификации, как описано, например, в примере 21, продукт ПЦР, по-прежнему присоединенный к твердой подложке, денатурируют и (необязательно) отмывают, оставляя одноцепочечную молекулу, присоединенную к подложке. Затем отмытую, присоединенную молекулу можно отщепить и высвободить (например, обработкой соответствующей протеазой) и подвергнуть контакту с поверхностью, содержащей якоря и/или линкеры. Альтернативно, цепь амплифицированной мишени, которая высвобождается после денатурации, может контактировать с поверхностью, содержащей якоря и/или линкеры. В данном случае контактирует только одна цепь амплифицированной мишени (например, гибридизованной) с линкером так, что конкуренция со стороны противоположной цепи амплифицированной мишени в отношении гибридизации отсутствует, и снижается фон. Линкеры можно сконструировать так, чтобы они были специфичными к одной или обеим амплифицированным мишеневым цепочкам.

Пример 23. Тест с детектирующими линкерами и репортерами (см. фиг. 24)

Пробу, содержащую интересующую мРНК подвергают способу защиты от нуклеаз с использованием в качестве защитного фрагмента олигонуклеотид, который включает специфическую мишень-группу и контрольную выступающую группу, не комплементарную мРНК. После расщепления нуклеазой можно отщепить контрольную выступающую группу, как показано на фигуре справа. Полученные защитные от нуклеаз фрагменты гибридизуют с детектирующим линкером, который включает мишеньспецифическую группу и контрольная выступающая последовательность специфическую группу. В тесте, представленном на фигуре слева, контрольная выступающая группа детектирующего линкера остается негибридизованной; в противоположность в тесте, представленном на фигуре справа, контрольная выступающая группа детектирующего линкера гибридизуется с оставшейся контрольной выступающей последовательностью защитного фрагмента. На последующей стадии анализа репортер, включающий группу, которая может взаимодействовать с контрольной выступающей-специфической группой детектирующего линкера, взаимодействует с комплексами. В тесте, представленном на фигуре слева репортер гибридизируется с контрольной выступающей последовательностью специфической группой детектирующего линкера, который остается доступным для гибридизации, и комплекс можно детектировать посредством сигнальной группы в репортере. В противоположность, в тесте, представленном на фигуре справа, репортер не может связываться с комплексом, поскольку комплементарные последовательности не доступны для гибридизации, таким образом, сигнал, связанный с комплексом, отсутствует.

Во многих тестах по настоящему изобретению репортер может взаимодействовать с любой последовательностью, присутствующей в детектирующем линкере, не ограничиваясь последовательностью, специфичной к контрольной выступающей группе.

Пример 24. Множественные флуоресцентные метки (см. фиг. 25)

Область, включающая пять локусов А-Е, представлена на фиг. 25. Каждый локус включает различную группу в основном одинаковых якорей, якоря А-Е. С якорями в локусе А гибридизуют четыре различных типа линкеров, каждый из которых включает группу, специфичную к якорю А. Однако каждый из якорей включал различную мишень-специфическую группу: для мишеней 1, 2, 3 или 4. Следовательно, после гибридизации мишеней с комплексами якорь/линкер, все мишени 1, 2, 3 и 4 локализуются в

- 42 011415 локусе А. Аналогичным образом, четыре различных типа линкеров можно гибридизовать с локусом В. Каждый линкер содержит группу, специфичную к якорю В, а мишень-специфические группы специфичны к мишеням 5, 6, 7 и 8. Аналогично мишени 9-12 могут связаться с локусом С, мишени 13-16 - с локусом Ό и мишени 17-20 - с локусом Е. Если каждая из этих мишеней является меченой, либо непосредственно, либо опосредованно, с различной, независимо детектируемой флуоресцентной меткой, например, такой, как непревращаемые фосфоры, то можно независимо детектировать все 20 мишеней в пяти указанных локусах.

Пример 25. Анализ в высокопроизводительной форме

В данном примере анализ транскрипции по изобретению используется для детектирования и количественного определения изменений в характере экспрессии генов, в виде высокопроизводительного скрининга. Все стадии анализа выполняются автоматически. Обычные стадии промывания описываются схематично. Все реакции проводят с использованием общепринятых методов, которые известны в данной области и/или описаны здесь.

Человеческие моноциты ТНР-1 культивируют в 96-луночных титрационных микропланшетах с Vобразным дном при титре 50000 или 150000 клеток/лунку. Клетки либо не обрабатывают, либо дифференцируют с помощью форбол-12-миристата-13-ацетата (РМА) в течение 48 ч с последующей активацией липополисахаридом (ЬР8) в течение четырех часов. После обработки клетки лизируют изотиоцианатом гуанидина и замораживают до использования. мРНК получают с использованием стрептавидинпарамагнитных частиц, с которыми связан биотин-полибТ. Альтернативно общую фракцию РНК получают экстракцией триреагентом (8Цта С11С1шса1 Со., Ьошк, МО). Пробы, содержащие либо мРНК, либо общую фракцию РНК, обрабатывают защитой от нуклеаз, используя в качестве ДНК-защитных фрагментов смесь тринадцати 60-мерных одноцепочечных олигонуклеотидов, каждый из которых включает в направлении 5'-3' 25-мерный специфичный к одной из тринадцати представляющих интерес мишени (ΟΆΡΌΗ, 1Ь-1, ТИР-а, катепсин С, сох-2, циклин-2, виментин, ΕΌ78-β, НМС-17, остеопонтин, (βтромбоглобин, ангиотензин или актин); 10-мерный спейсер; 25-мерный специфичный к общему олигонуклеотидному детектирующему зонду и 15-мерную общую контрольную выступающую последовательность. При этом мРНК превращается в стехиометрическое количество «соответствующего ДНК защитного фрагмента», который детектируют в тесте. В контрольных опытах, в которых соответствующие ДНК-защитные фрагменты инкубируют с зондом, специфичным к контрольной выступающей последовательности, было показано, что в основном в соответствующих защитных фрагментах находятся только последовательности, специфичные к мРНК-мишеням, представляющим интерес, что и ожидалось в том случае, если расщепление нуклеазой протекало по желаемому пути.

Поверхности готовят согласно способам по изобретению. В каждую лунку 96-луночного планшета для связывания ДНК помещают совокупность шестнадцати различных 25-мерных олигонуклеотидных якорей. Используется четырнадцать различных видов якорей. Один вид якорей используется в трех из четырех углов совокупности, и используется 13 различных видов якорей, по одному в оставшихся положениях совокупности. Затем совокупности гибридизуются, в определенном ортогональном порядке, с 60-мерными олигонуклеотидными линкерами, каждый из которых включает в направлении 5'-3' 25мерную, соответствующую одной из интересующих мишеней, 10-мерный спейсер и 25-мерный, специфичный к одному из якорей. Таким образом, в каждой множественно повторяющейся совокупности из 16 пятен, каждый из тринадцати мишень-специфических линкеров расположен в определенном положении (локусе) в совокупности. См. фиг. 18, на которой показана такая ортогональная совокупность. Линкеры, соответствующие САРЭН. конститутивно экспрессирующийся ген «домашнего хозяйства», который служит в качестве внутреннего контроля нормализации, представлены в трех локусах внутри каждой совокупности. В контрольных опытах было показано, что линкеры, а также защитные фрагменты и детектирующие олигонуклеотиды, использованные в опыте, проявляют желаемую специфичность.

Пробы, включающие смеси соответствующих защитных фрагментов, приготовленные, как описано выше, гибридизуют с совокупностями якорь/линкеры. Используют пробы, полученные из необработанных или индуцированных культур. Затем детектируют наличие и определяют количество гибридизованных защитных фрагментов в каждом локусе гибридизацией с мечеными детектирующими олигонуклеотидами. Для того чтобы нормализовать величину сигнала в каждом локусе, детектирующие олигонуклеотиды разбавляют соответствующими количествами блокированных олигомеров, как здесь уже было описано. Величина сигнала в каждом локусе обрабатывается и нормализуется до сигналов контрольного САРЭН. Полученные данные воспроизводятся в восьми параллельных пробах, а также в пробах, полученных в трех независимых опытах, поставленных в разные дни. Суммарные данные по относительному содержанию тринадцати транскриптов в одном опыте представлены в таблице ниже.

- 43 011415

Относительная интенсивность (10* «лвгок/лунку)

Среднее

САРРЫ

пя

ΤΝΡ

ОАРОН

Катепсин 0

СОХ-2

Цикли н-2

Виментин

Ц378

НМ6-17

Остеопонтин

Тронботобупин

САГОН

Ангиотензин

Актин

(контроль)

Индуцированная

СУ {п-10

Соотношение

Пример 26. Компьютерный алгоритм количественного определения данных на планшете со множе ственными совокупностями

С помощью предпочтительного алгоритма можно найти положение всех пятен на МАР8-планшете и автоматически рассчитать значение амплитуды сигнала для каждой точки данных. Предпочтительно алгоритм проводится с помощью компьютерной программы.

1. Выбрать небольшую часть данных изображения, квадрат 40x40, содержащий значение интенсивности каждого пикселя (элемента картинки) изображения, которое включает первую лунку для анализа.

2. Определить функцию, с помощью которой можно было бы рассчитать предполагаемую интенсивность в каждом положении пикселя с использованием 16 неизвестных. Неизвестными являются:

амплитуды каждого из 13 различных пятен микросовокупностей (то есть, яркость реальных сигналов в каждом положении совокупности ДНК). Имеется 13 таких пятен 4x4 (=16) внутри каждой лунки, поскольку некоторые из 16 пятен являются параллельными для одной и той же мишени;

смещение х и смещение у определяют точное положение совокупности 4x4 пятен внутри данной конкретной лунки;

фоновая интенсивность изображения внутри лунки.

С помощью функции для каждого положения пикселя рассчитывается расстояние между пикселем и каждым пятном и добавляется вклад каждого пятна в интенсивность, определяемую в пикселе умножением амплитуды пятна на ответную функцию импульса для данного расстояния. Для изображений используемая ответная функция импульса определяется суммой Саикыап и ЬогепШап соответствующих (постоянных) радиусов.

3. Начните освещать данную лунку, быстро определяя значения параметров. Сделав это, рассчитайте среднюю интенсивность изображения для 16 областей картинки, где, как полагается, находятся пятна. Вычтите смещение из этих 16 средних значений и определите по масштабу разницу с помощью постоянного фактора. Смещение и постоянная масштаба определяются эмпирически. Перегруппируйте данные для получения 16 пятен с 13 амплитудами. Для фона и смещения используйте любые небольшие числа.

4. Оптимизируйте значение (для 16 неизвестных) по кривой. В частности, используйте нелинейный алгоритм наименьших площадей по методу Магдиай! для линеаризации функции с 16 неизвестными к 40x40 = 1600 уравнений (хотя, конечно, не все уравнения являются линейно независимыми).

5. Используйте смещение х, у для данной лунки для установления с повышенной точностью, где будет находиться сетка следующей лунки на микропланшете. Полагается, что расстояние будет составлять 9 мм по отношению к следующей, соседней лунке (превратите в расстояние число пикселей с помощью фактора увеличения системы изображения). Поскольку расстояние между лунками является небольшим по отношению к размеру планшета, использование локальных значений положения является

- 44 011415 наиболее точным.

6. При более точном установлении положения ограничьте меньший квадрат изображения для следующей лунки, перейдя к квадрату 30x30 пикселей. Это делает определение более быстрым.

Вернитесь к стадии 2 и повторите для каждой лунки.

Пример 27. Высокопроизводительный скрининг (см. фиг. 26 и 27)

На фиг. 26 представлены необработанные данные визуализации для теста с использованием детектирующих линкеров и одного репортера. В тесте анализируется экспрессия 13 природных видов мРНК из 96 различных проб клеток. В каждой лунке 96-луночного планшета содержится 10⁵ необработанных клеток ТНР-1 (на фигуре слева) или индуцированных до моноцитов с помощью РМА и ЬРА (на фигуре справа).

Характер экспрессии изменялся последовательно. Индукции подвергаются 1Ь-1, ΤΝΡ, СОХ-2, виментин, ЬБ78, остеопонтин и бета-тромбоглобин. Экспрессия катепсина-С, циклина-Ь, НМС-17 и ангиотензина снижается. Экспрессия САРБН и актина не изменяется.

На фиг. 27 представлено пространственное расположение генов клеток ТНР-1 вместе с лунками для двух проб (выбраны из фиг. 26).

Олигонуклеотиды, использованные в данных опытах, перечислены ниже. Для некоторых мишеней интенсивность сигнала снижается при разбавлении детектирующего линкера неполным детектирующим линкерным олигонуклеотидом, содержащим 25 оснований, комплементарных защитному фрагменту, но не содержащим последовательность, комплементарную репортеру. Данные неполные олигонуклеотиды относятся к «факторам ослабления».

В табл. 1 представлена количественная обработка данных, представленных выше. Данный скрининговый тест проводится с высокой пропускной способностью. Клетки культивируют и обрабатывают в 96луночных планшетах при титре в среднем 10⁵ клеток/лунку, при данном титре с клетками легко обращаться на микропланшетах. Определяют характер экспрессии 13 генов высокопропускным способом в небольших пробах клеток. Полученные данные, представлены в табл. 1, с использованием способа в высокопропускной форме. С помощью способа можно детектировать менее чем одну копию на клетку. В литературных источниках отражены наблюдения, собранные для различных близких типов клеток, таких как клетки И-937. Заметные существенные различия между контрольными и индуцированными условиями являются результатом очень низких фоновых сигналов для определений, проводимых заявителями. Применение детектирующих линкеров только с одним видом репортера помогает уменьшить фон для анализа. Это возможно в результате того, что общая концентрация НКР-содержащего репортера значительно снижается.

Таблица 1. Относительное содержание (молекул РНК на клетку) в формате МАРЕ 96-16, 10⁵ клеток/лунку

Ген	Контроль	Индуцированная	Литература
САРРН	30±*7%	30±14%	Без изменений
1Ъ-1-бета	*+Не детектируется	684±*14%	Увеличение
ΤΝΕ	3,0±40%	214±23%	Увеличение
Катепсин-С	53+8%	Не детектируется	Снижение
СОХ-2	Не детектируется	8,3±23%	Увеличение
Диклин-2	2, 8±11%	0,5±46%	Без изменений
Виментин	Не детектируется	37±33%	Увеличение
ЬС78-Ь	Не детектируется	3360±28%	Увеличение
НМС-17	33б±5%	33±23%	Снижение
Остеопонтин	Не детектируется	18±23%	Сообщения отсутствуют
Тромбоглобулин	Не детектируется	66±15%	Увеличение
Ангиотензин	0,5±18%	0,1±66%	Сообщения отсутствуют
Актин	7 9+7%	43±21%	Без изменений

+ Установленные значения, принимая, что САРБН составляет 30/клетку * % СУ (стандартное отклонение/среднее значение в виде %) (п=48)

Олигонуклеотидами, используемыми в примере 27 с детектирующими линкерами и одним зондом, являются:

- 45 011415

Фиксированный зонд: САССТССАААСАбТбААОСАСАССА (согфидаДей ίο НКР) (5Е<2 Ιϋ:33)

МишеньМ; Ю:М178516АР0Н (572-513)

Якорь: -длина=25

ССССССТССАСССТТСТ6С6АСС6С (ЗЕО Ю:34)

Мишень:-длина=60

ТСАСААСТАТСАСААСАСССТСААСАТСАТСАбСААТбУУТССТССАССАСС

ААСТССТТ (ЗЕ<2 Ιϋ:35)

Линкер: -длина=60

АТСССТССТССАССАССААСТПСТТСАТАСТСАетССССТСССАСААСССТСС

АСССССС (ЗЕ<3 10:36)

Защитный фрагмент: - длина=75

ААССАСТТССТССТОСАССАСССАТТССТСАТеАТСТТеАСОСТСТТСТСАТ

АСТТСТСАОСТГСТСТААОТСТО (8Е0Ю:37)

Детектирующий линкер: длинною

ТОСТСТССТГСАСТОтССАООТСбАТАСТОАОТТОАОААЭТАТОАСААСА

Θ

ССТСАА6 (8ВрГО:38)

Фактор ослабления: длина=25

ТОАОАА0ТАТОАСААСАОССТСААО (3Ε<?ΠΞ>:39)

МтенЙ; ГО: М15840 ПЛ -Ъйа (43924333)

Якорь: длина=25

ТССАССТОАОСАСССОАСООССТСС (8Е(}ГО:40)

Мишень: дпинерЯ)

СОАСАСАТОС(иТААС(ЗАОССПАТСТОСАССАТССАССТСТАССАТСАСТС

ААСТОСАС (5Е()ГО:41)

Линкер:дпина=60

САССТОТАССЗАТСАСТСААСТОСАСОАТАСТОАОТССАСОСССТССбОТССТ

САССТОСА (5Е<5ГО:42)

Защитный фрагмент длина=75

СТОСАС1ДСАОТСАТССТАСА(ЗОТ(К)АТСОТ(ЮАСАТААЖСТС(НТАТСССА

ТСТОТСОССГТОТСТААСТСТО (БЕб'П): 43)

Детектирующий линкер: длина =60

ТОЙХЗТССТГСАСТбТТТбОАСОТССАТАСТОАбТСбАСАСАТСЗООАТААСО

А

ОССТТАТ (8ЕОЮ:44)

Фактор ослабления: длина=25

СОАСАСАТСОСАТААСбАеССТТАТ (8Е<? ГО: 45)

Мишень #3; ГОМО98УЮТ (780-721)

Якорь: длина=25

САСТАСбОСТСАССАСбТССССТОС (8ЕС! ГО: 46)

Мишень: длина=60

СбОААСССААОССТАОААСТТГААбСААСААОАССАССАСТТСОАААССТОС

САГГСАСС (БЕЗ ГО; 47)

Линкер: дпина=60

АССАСТТССАААССТСС(лАТТСАСЮСАТАСТ(ЗАОТ(ЗСА(лС(1САС010СТСАСг

ССОТАОТО (8Е(}ГО:48)

Защитный фрагмент: длинг=75

- 46 011415 «ЛХЗААТСССА(ЮТТТСОААОТСЮТСОТСПаПОСТТАААОТТСТААОС1ТО

ССТТСССССТГОТСТААСТСТа (5ЕфП>49)

Детектирующий линкер: длина =60

ТОСГСТС(^ГСАСТ01ТГ(Х5АО(Н’(ЮАТАСТСАОТСОСААСССААССТТАСАА СГГГААО (8ВС5 ПЭ: 50)

Фактор ослабления: длина -25

С(ЮААСССААССГГАСААСТТТААО (8ЕОП>51)

Мишень #4; ШМГ78510АРОН (572-513) (та же, что мишень #1)

Мишень#5_; ГО:МК11ТКетепсин-(3(373-314)

Якорь:длина=25

ОААССОСТСХЮОТСТТСТАСАСЗССА (ЗЕфГО: 52)

Мишеныдлина=60

ССОСАССАТССАСААТСАСАТСАТСТТАТТОСА6СТОАОСАОАА6АСТСАСА ССОААТСС (£Е(2ПЗ:53)

Линкердпина=60

ТСАбСАСААСАОТСАОАСССААТСССАТАСТСАОТТОССТСТАОААСАСбС 6АССССТТС (5Е0 ГО: 54)

Защитный фрагмент: длина-75

СХтАЗТССОТСТСАСТСГТСТССТСАбСТССААТААСАТОАТСЗТСАТТСТООАТ

ОСТССССОСТтеТСТААОТСТО (8ЕОГО: 55)

Детектирующий линкер: дпина=60 таСТСТССПСАСТОТТПЮАООТССАТАСТОАСТССССАССАТССАОААТСА

САТСАТС (ЗЕС2ГО:56)

Фактор ослабления; дпина=25

ОСООАССАТССАОААТСАСАТСАТО (ЗЕф ГО: 57)

Мишень #6; ПЖ9010000Х-2 (240-181)

Якорь: дпина-25

СТССТТССССОТССОТХЭОСТОССАО (8Е()ПЭ:58)

Ми1иенъдпина=60 ссоАашиАтстАТОАСшзтасаАттто^

СООАСАОО (ЗЕОЮ:59)

Пинкер:длина=60

- 47 011415

АТААСТ6С6АТТЭТАСССССАСАСС<ЗАТАСТОА(ЗТСТСКгСА<оССАС6<дАССС 6ОААССАО (5В0 ГО: 60)

Защитный фрагмент:длина=75

ССГОТСССЮОТАС.\АТСО€АСТГАТАСТСЗОТСАААТСССАСАСТСАТАСАТАС

АССТООСКЗСТГОТСТААСТСТС (5Е(}ГО:61)

Детектируюи^й линкер: дл ина=60

ТССТСТССТТСАСГОТТТООА<ЗСгГСОАТАСТОА<ЗТСС0А(ЭОТ(ЭТАТОТАТОА(} ТОТОООА (ЗЕрГО: 62)

Фактор ослабления: длина=25

ССОАЗЗТЗТАТЗТАТЗАОТСЗТбСЗА (3Εζ ГО: 63)

Мишень #_7; Го: М74091циклин (932-873)

Якорь:дпина^с25

СООТСООСАТОаТАССАСАОТССОС (8ЕфГО:64)

Мишень:длина=60

САССТССАААСА6ТОААОЗАСЗАССАСКЮТССАААТССААСТСАОААС7ТСТА ОСТАСАССС (ЗЕфШ:65)

Линкер:длина=60

СЗААОТСАОААСТСТАЗСТАСАОССОАТАСТОАСТСССОАСТСТСХлГАССАТ СССОАССО (8ЕР Го: 66)

Защитный фрагмент: дпина=75

С9<ЗСГСТА(ЮГАОА&ТТСТСАСТТ(ХАТТТССАСССТаСТСТСС1ТСАСТОТТТ

ОЗАбОТСОСТТОТСТААОТСТО (ЗЕфГО:67)

Детекпфующий линкер дпина=В0

ТОСГСТССТТСАСТ31ТГОЗАС<71ХЮАТАСгаАОТСАССТССАААСАОТОААО

ОАСАОСА (5ЕфГО:68)

Фактор ослабления: дпина=25

САССТССАААСАОТОААСОАОАССА (5Еф ГО: 69)

Мишень #8; ПХМ14144вимеитиф1338-1279)

Якорь: дпина=25

ССОС(ХС(Х:31ТАТССАТСТСТГСЗ (ЗЕЦГО: 70)

Мишень: длина=60 сп'с<тАтСхСссттааа6саассаатсаотссстсС’Аас6Ссаоатсзсзтсааа таЗААОАО (ЗЕф ГО: 71)

Пинкер: дпина=60

АССССАОАТОСОТОАААТСХЗААСАЗОАТАСТЗАСТССААОАОАТйСАТААС

- 48 011415

ОССССССОС (5ЕОЮ:72)

Защитный фрагмент: дпина-75 _____

СТСТТССАТГТСАСбСАТСТООСОТТССАОбОАСТСАТТСЮТТССТТТААОСС САТССАСОСТТОТСТААСТСТС (ЙЕО©:73)

Детектирующий линкер: длина=60

ТОСТСТСС1ТСАСТ(ЛТГ(ЮАООТСОАТАСТОАОТОТ(ЮАТОСССТТАААССА

АССААТО (5ЕЦЮ:74)

Фактор ослабления: длина=25

ОТСЮАТССССТТАААСХЭААССААТа (8ЕЦ 10:75)

Мишень Ю; Ц9О145 Ш78-Ъ (2049-1990)

Яюрыдпина=25

СГГАОСАТАСОТОТСАССАСАСССО (8Е<31П:7б)

Мишень: длина=60

САССТССССАСАСАТТССАСАСААТТГСАТАОСТОАСГАСТТГСАОАСОАОС

АОССАСТО (8Е(2ГО:77)

Линкер:дпина=60

АСТАСТТТОАСАССАССА<лССАСТССАТАСТОА(ЗТССО<дТСТССТ6АСАСОТ

АТССТААС (8ЕЦ1О:78)

Защитный фрагмент: длина=75

САСТОССТ(Х7ГСОТСТСАААОТАСТСА<ЭСТАТ(лАААТТСТ<лТ(л<}ААТСТСТСС

ОСАСаТООСГТСТСТААОТСТО (5ВОП>:79)

Детектирующий линкер: длина=60

ТССТСТССТТСАСТ6ТТТОСАООТСХ1\ТАСТОАОТСАССТССССАСАОАТТСС АСАСААТ (ЗВОШ:80)

Фактор ослабления: дпина=25

САССТСССОАСАСАТТССАСАОААТ (5Е0ГО:§1)

Мишень#!^ ц>_: Х13546НМС-17 М12б23-:м-РНК (191-132)

Якорь: длина=25

С0ТСАСТСССТСССССА6СТСТТСС (5Е$ 10:82)

Мишень: длина=60

САААСЮТСААООАСаААССАСАСАОААСАТССОСОАОСТТСТСТССТАААС СГССТОСТС (8Е<210:83)

Линкер: длина=60 ’

АОС1ТОТСТ(ХЯАА4СС7Г<КТССТССАТАСТОАОТОаААОАОСГа<ЗССОАС<Э САСТСАСС (ЗЕ4}1О:М)

- 49 011415

Защитный фрагмент: длина=75

САСОАСЮАСЮтАОСАОАСААССТССЮООАТСТТСТСТСТСОТТСатССТГС

АССТТГСССТТСТСГААОТСТО (8ЕОЮ.-85)

Детектирующий линкер: длина··®}

ТОСГСТССТТСАСГОТГТССАСОТООАТАСТОАОТСАААООТОААССАСОАА

ССАСАОАО (8ЕОШ:8б)

Фактор ослабления: длина=25

САААООТСААОСАССААССАСАОАО (8Еф10:87)

Мишень#! 1; Ю: Х1369ФК^{;теопон}™^н (783-724)

Якорь: длина=25

АТССАСТГААССАСАТССГАСТАСС (5ЕрП>:88)

Мишень: дпнна=60

СССТОССААОбАСАОТТАТОАААССАОТСАбСТССАТбАССАОАСТОСТСА ААСССАСАО (8Е0 ГО: 89)

Линкер: длива=60

АТСАССАОАбТОСТОАААСОСАСА(3<ЗАТАСТСА(ЗТ<л<ЗТАСТА(ЭСАТ(ЗТ60ТТ ААСТСОАТ (8Βς ГО: 90)

Защитный фрагмент: дпина=75

СТСТбГЭСТТТСАбСАСТСТООТСАТССАбСТОАСТССТГТСАТААСТОТССТТ

С ССАСХЭСбСТТаТСТААОТСТС (8ЕС> ГО: 91)

Детектирующий линкер: дпина=60

ТССТСТССТТСАСТОТТТССАСЮТССАТАСТСАСТССОТОСОААООАСАОТТА ТОАААСО (8Ер ГО: 92)

Фактор ослабления: дпина=25

СССТОССААСОАСАОГТАТСАААСО (5Е(2ГО:93)

ТТАбСОГГОЗСССАОеТТСАТАОСС (5Ε(}Π>94)

Мишень. Дпина=60

СТСТАААСАТСАСТГССААССГОСЮССТбОСТСТСТТСССАОССТТССТОАТГ

ТСТОСАС (8ЕРГО:95)

Линкер:длина=60 ттссг^сюсттсхтгсаттгстссассата^^ АСССТАА (8ΕςΠλ96)

Защитный фрагмент: дпинз=75

- 50 011415

СТСКЗАОАААТСАСЮААСССТОССААСхАСЗАОССАСОСССАСЗСТТОСААСТСА ТСПТАСАСОСТТОТСТААОТСТО (ЗЕрГО:97)

Детекпфующий линкер: длина₽60

ТССТСТССТТСАСТСТТТООАСОТССАТАСТСАбТСТОТАААСАТСАСТТССА

АОСТООС (8ЕОГО:98) Фактор ослабления: длина=25 ОТОТАААСАТОАСТТССААССТССС (ЗЕР ГО: 99)

Мишеиь#13;ГО:М1785ЮАРПН(572-513) (та же, что мишень #1)

МишеныИ4; Ш; К02215^ан™°^тензчн(805-74б)

Якорь: дпина=25

САТГАССАСТОСАТТСОСАТСААСР (ЗВр ГО: 100)

Мишень: длина=60 САСОСГСТСТООАСТТСАСАОААСТССАТОТТаСТОСТОАСААСАТТСАСАО СТГСАТСС (5Е<2 ГО: 101)

Линкер: длина=60 .

ССТОАСААОАТТСАСА(КГТТСАТОССАТАСТаАОТССТТОАТОС(1ААТОСАС ТСОТААТО (8ЕРГО: 102) Защитный фрагмент: дпина=75 осатоаасстстраатсттстсаосаосаасатссасттстстсаастссао

А САОСОТСКЮТТСТСТААСТСГС (ЗЕО ГО: 103) .

Детектирующий линкер: дпина-60

Т(ЮГСЛГС1ТСАСТ<ЗТТТсЗСАСКЗТССАТАСТ(1АСТСАСССТСТСГ(Э<ЗАСТТСА САСААСТ (ЗЕрГО: 104)

Фактор ослеплений: длина=25 САСССТСТСТОТАСГТСАСАОААСТ (ЗЕрГО: 105)

Мишень#15; ГОАЯ0277рктин (2627-2568)

Якорь: дпина=25

АТСА1ХИАА<ЖТГШЗТСО<ЭТС6С (ЗЕрГО: 106)

Мишень: дпина=60 СА<31ШГСТ<ЮСАТССАС(хАААСТАССТГСААСГ<ХАТСАТСЗАА6ТОТ0АСС Т

СОАСАТС. (5Е() ГО: 107)

ТАСАТОАТ (ЗЕфШ: 108) Защитный фрагмент: длина=75

ОАТетССАСОТСАСАСТГСАТОАТООАОТТОААООТАСТТТСбТОСАТСССА

С АООАСТСбСТТОТСТААОТСТО (ЗЕфШ: 109)

Детектирующий линкер: дпина=60

ТССТСТССТТСАСТаТТТСОАСбТСРАТАСТОАРТОАОТССТбТ&ОСАТССАС ОАААСТА (ЗЕр ГО: 110)

Фактор ослабления: длина=25 ОАСТССТСТСССАТССАССАААСТА (ЗЕРГО: 111)

Мишень#16; ( тЫб εροί ίε ηοΐ иней)

Мишень #16; (это пятно не применяли).

Пример 28. Одновременное определение ДНК и РНК (см. фиг. 29)

Человеческие моноциты ТНР-1 культивируют в 96-луночных с У-образным дном титрационных микропланшетах при титре 30000-150000 клеток/лунку. Использовали контрольные клетки, которые не дифференцировали с помощью РМА и не активировали с помощью ЬР8, поскольку РНК для некоторых генов (например, 1Ь-2, Сох-2, ЬО78, остеопонтина и тромбоглобулина) отсутствует в данных клетках и, следовательно, в тесте определяют только ДНК, в то время как для САРЭН присутствуют, а значит и определяют как ДНК, так и РНК. Клетки нагревают до 105°С в водной среде (лизирующий буфер) и к лизатам добавляют защитные от нуклеаз фрагменты для интересующих мишеней. При лизисе при повышенной температуре ДНК высвобождается в определяемой форме также, как и РНК. Для определения ДНК защитные от нуклеаз фрагменты добавляют как таковые для 1Ь-1, Сох-2, ЬО78, остеопонтина и

- 51 011415 тромбоглобулина. Для одновременного определения ДНК и РНК добавляют предшествующие защитные от нуклеаз фрагменты, а также специфичный к САРЭН. Реакции защиты от нуклеаз проводят в лунках, описано в заявке.

Получают совокупности и проводят гибридизацию защитных фрагментов в основном, как описано в примере 27. Детектирование ДНК против ДНК+РНК проводят серийной гибридизацией детектирующих линкеров. В данном случае серийную гибридизацию проводят для того, чтобы уравновесить сигналы от РНК- и ДНК-мишеней (как обсуждается ниже); серийная гибридизация, конечно, не является обязательным условием проведения тестов, в которых одновременно детектируются ДНК- и РНК-мишени. На первой стадии вносят детектирующие линкеры для 1Ь-2, Сох-2, ΕΌ78, остеопонтина и тромбоглобулина. На второй стадии добавляют детектирующий линкер для САРЭН. Проводят серийную гибридизацию для того, чтобы визуализировать сигнал ДНК, который относительно намного слабее, чем сигнал РНК, за счет значительно меньшего числа копий на пробу, в течение более длительного периода времени для того, чтобы накопить более высокую интенсивность сигнала.

Результаты представлены на фиг. 29. Слева на фигуре показано, что, когда исследованию подвергается одна геномная ДНК, то тестируемые геномные последовательности - 1Ь-1, Сох-2, ΕΌ78, остеопонтина и тромбоглобулина - все можно детектировать в соответствующих локусах, и они находятся примерно в одинаковых количествах. Результаты определения данной геномной ДНК представлены в таблице 1, из данных которой следует, что в этих контрольных клетках, РНК для данных генов не детектируется. Справа на фигуре показано, что, когда определяли как ДНК, так и РНК, то визуализацию проводили в течение значительно более короткого периода времени, поскольку сигнал ДНК значительно слабее, чем, как показано слева, и было установлено, что, когда ДНК и РНК определяют вместе, то контрольные геномные последовательности можно детектировать до этого, в качестве внутренних стандартов для нормализации, и экспрессированный ген-САРЭН находится в значительно большем количестве, чем в контроле. При количественном определении относительных количеств сигнала в контроле и экспрессированной мРНК САРЭН, можно рассчитать количество экспрессированной мРНК на клетку.

Пример 29. Детектирование экспрессированных 8ИР (см. фиг. 30 и 31)

На фиг. 30 схематично представлен один тип анализа экспрессированных 8ИР. В данном случае защитный фрагмент от нуклеаз сконструирован для гибридизации с областью РНК, содержащей 8ИР, таким образом, что, когда вносят соответствующий фермент (например, РНКазу Н), если защитный от нуклеаз фрагмент гибридизуется с РНК, для которой имеется ошибочно спаренное основание (в данном случае 8ИР), то фермент будет отщеплять защитный от нуклеаз фрагмент. В данном случае полученный отщепленный фрагмент не может гибридизоваться с совокупностью (например, за счет условий гибридизации таких, как используемая температура). В других воплощениях гибридизация с совокупностью может иметь место, но детектирующий линкер не может связываться с отщепленным защитным фрагментом (например, за счет условий гибридизации, таких как используемая температура); или отщепление протекает таким образом, что отщепленный защитный фрагмент может гибридизоваться с совокупностью и с детектирующим линкером.

На фиг. 31 представлены результаты такого теста, проведенного обычными способами, как здесь описано. В качестве внутреннего контроля использовали актин дикого типа, и защитный фрагмент, соответствующий САРЭН, содержащий сконструированную 8ИР, отличался от защитного фрагмента, соответствующего САРЭН дикого типа. На фиг. 31 показан анализ множества проб, содержащих либо САРЭН дикого типа, либо актин дикого типа (левая колонка и левый снимок в большом увеличении), либо содержащих 8ИР САРЭН и актин дикого типа (правая колонка и правый снимок в большом увеличении). На центральном снимке в большом увеличении показана схема совокупностей.

Пример 30. Высокопроизводительный скрининг (см. фиг. 32-35)

Анализ транскрипции проводят в основном, как описано в примере 28, за исключением того, что, например, якоря размещают в большей степени на облученных планшетах, чем на планшетах для связывания ДНК. Используют те же якоря, описанные в примере 27, но изменяют некоторые мишени в совокупности, а именно используют только один якорь для определения САРЭН и добавляют тубулин, актин и ЬНЭ. Другими анализируемыми мишенями являются 1Ь-1, ТИР-а, катепсин-С, Сох-2, С-С8Е, СМ-С8Е, С8Т-Р11, НМС-17 циклофилин, β-тромбоглобулин, Т1МР-1, ММР-9. Совокупность представлена на фиг. 32, и линкер и последовательности защитных от нуклеаз фрагментов представлены ниже. Используют примерно 30000 клеток на лунку (не обработанных для продолжительной пролиферации контрольных клеток во время обработки РМА и БЭН обработанных клеток). Последовательности:

Мишень #1 САРЭН (та же, что мишень #1 в примере 27)

Мишень #2 1Ь-1Ь (та же, что мишень #2 в примере 27)

Мишень #3 ТИР-α (та же, что мишень #3 в примере 27)

- 52 011415

Мишень #4 тубулин (АРН1347) якорь: дпина=25

ТААбСОТСТСГАСЮААООСАСХЗТСО (8Е<5ГО: 112)

Мишень: длина=60

САСОТООГТСССАААОАТОТСААТОСТСССАТТОССАССАТСААОАССААСС 6ТАССАТС (8ЕЦ ГО: 113)

Линкер: длина=60

САССАТСААОАССААОСаТАССАТССАТАСТСАСТССАССТСССТГССГАСА САССгСТТА (5Е<2 ЛЭ: 114)

Защитный фрагмент: длина= 75сатсотас<зстт<з<н<7пх7атсютсюсаатсиюаск/атт<тасатсттт(Э{Кг ААССАСОТСССГТОТСТААСТСТО (5Е<? ГО: 113)Детектарующий линкер: длина=60 ТССТСТССТЛДАСТОТГТССАССТОСАТАСТСАСТОАССТбСГГСССАААОАТ «ЗТСААТС(2Е<2ГО: 116)

Фактор ослабления: длина=25

САССтХГГГСССАААСАТОТСААТС (ЗЕрШ: ЦТ)

Мишень #5 катепсин-6 (та же, что мишень #5 в примере 27)

Мишень #6 Сох-2 (та же, что мишень#6 е примере 27)

Мишень #7 (ЗС5Г(Ё01219)

Якорь: длина=25

ССЮТСООСАТССТАССАСАОТСССС (Ж) ТО: 118)

Мишень: дпина=60

ОАООСАбСАСАСАОСАОСААТСАТСТСАОСССТСТОтеТОАААООААССТС САСТОТСАС (ЗЕО ГО: 119)

Линкер: длина=60

СТСТСАААС6АА0СТССАСТСТСАС0АТАСТ0А0ТаС0САСТетС(ПАССАТ

ССССАССО (Ж2 ГО: 120)

Защитный фрагмент: длина=75

СТаАСАСТаСАОСТТССГГТСАСАСАСАССССТСАСАТСАТТССТССТСТСТС

СТСССТСОСТтеТСТААСТСТО(8ЕЦШ: 121)

Детектирующий линкер: длина=60

ТОСТСТССПСАСГОттеАООТООАТАСТСАОТОАОООАССАОАСАбСАа СААТСАТО /2ЕО И): 122)

- 53 011415

Мишень#8 (МС8Г (Е02975)

Якорь: длина=25 (ЗСССССС6С(ЛТАТаСАТСТСТГСа(8ЕрЮ: 124)

Мишень; длинам .

САСТАСААССАССАСТССССТССААССССССАААСТТССТОТОСААСССАОА

ТТАТСАСС(8Е()ГО: 125)

Линкер: длина=50

ТТССТбТбСААСССАбАТТАТСАССбАТАСТСАСТССААСАСАТОСАТААСС

С(ЗСССССС(8Е()ГО: 126)

Защитный фрагмент: длина=75

ОСТСАТААТСТбССТТССАСАСХЗААСТПССССОСТГОСАССЮСАОТССТСС

ПОТАОТОССПСТСТААОТСТС (ЗВр ГО: 127)

Детектирующий линкер: длина-60 ТОСТСТССПСАСТбТТГООАОСТОСАТАСТСАОТСАСТАСААССАЖАСТОС ССТССАА(ЗЕОЮ: 128)

Фактор ослабления: длина=25

САСТАСААОСАССАСТССССТССАА (5Εζ) ГО: 129)

Мишень#? 68Τ-ΡΙ1 Х06547

Якорь: длина=25

ОТГАОСАТАССТОТСАССАСАССОО (8Е0 Юс 130)

Мишень: длина=60

САСХХкАОССААСАССТТСАТТОТбОСАДАССАСАТСТССТТСбСТСАСТАСА

АССТ6СТ0(^ГО: 131)

Линкер: длина=60

СТССПСССТОАСТАСМССТССТСЮА^^^

ТОСТААС(8ЕрЮ: 132)

Защитный фрагмент: длина=75 .

САОСА6ОПОТАДТСА6С(1АА(ЮАОАТСТОСТСТСССАСААТСАА6СТСТТ(}

ССТСССТСОСТТСТСТМОТСТС (8Е() ГО: 133)

Детектирующий линкер: длина=60 т«дстсспсАСт<ттоо^^

ΑΤΤΟΤΟϋ(3ΕςΐΏ: 134)

Фактор ослабления: длина-25

САОСДАООСААОАССТГСАТТбТОО (5ЕС> ГО: 135)

- 54 011415

Мишень #10 ΗΜ<3· 17 (та же, что мишень # 10 в примере 27)

Мишень #11 Цикл офел ин Х52851

Якорь: длина =25

АТССА0ТТААССАСАТ6СТАСТАСС (ЗЕр ГО: 136)

Мишень: дпина=60 6(КЛТТАТ(ЗТОТСАОССгТ(5ОТС1АСТТСАСАССССАТААТООСАСТ6СгТ(КЗСА АОТССАТС (ЗЕС> ГО: 137)

Линкер: длина=60

ТААТОК:АСТСЮТСЗССААОТССАТССАТАСТСАОТС<ЭТАСТАОСАТ<7ГОО'ГГ ААСТССАТ (Ж) ГО: 138)

Защитный фрагмент; длина-75

САТССАСГГОССАССАОТСССА'П'АТСССОТОТОААбТСАССАСССТСАСАС

АТАААСССОСГТСТСТААОТСТС (8Е<2 ГО: 139)

Детектирующий линкер: дпина=60

ТОСТСТССТТСАСТСтССАСбТОСАТАСТбАОТОбОТТГАТОТСТСАОаОТ СЮТСАСТ (3Εζ> ΙΒ; 140)

Фактор ослабления: длина=25 (ЗбКЛТТАТОТСТСАОббТСОТСАСТ (5Е<2 ГО: 141)

Мишень #12 Ь-тромбоглобулин (та же, что мишень # 12 в примере 27)

Мишень#131ГОН Х02152

Якорь: длина=25

ТСТСОСТСТОСААССССССОСААСТ (ЗЕР ГО: 142)

Мишень: длина=60 бОТОетТОАОАОТОСТТАТОАСОТОАТСАААСТСАААООСГАСАСАТССТОС ССГАТГСС(ЗЕС>ГО: 143)

Линкер; длина=60

ААСЮСТАСА(>ТССТ6ОССТА1Т(ЗС0АТАСТСАеТА0ТГ0СС0СССОТГССА

САОСОАСА(8ЕрГО: 144)

Защитный фрагмент: длина=75

ССААТАОСССАСйАТСТСТАОССПТбАОТТТСАТСАССТСАТААССАСТСТС ААССАССС5СТТОТСТААСТСТС(8Е(2ГО: 145)

Детектирующий линкер: дпина=60

ТССГСТССТТСАСТСТП'ССАСХЗТООАТАСТСАОТСтСгТбСТГСАСАСТОСТТА ТСАСОТО(8ЕОГО: 146)

Фактор ослабления: дпина=25

ООТОСГГОАОА6ТССГГАТ<ЗАООТО(8Ерт: 147)

Мииень#14ТМР-1 Х03124

- 55 011415

Якорь: длина=25

САТТАСОАОТССАТТСОСАТСААОО (ЗЕр ГО: 148)

Мишень: длина=60

САССААОАССТАСАСТаТТаОСТОТОАССААТОСАСАСТСТТГСССТОТТТАТ

ССАТССС(ЗЕрГО:149)

Линкер: дпина=60

САОТаГГТСССТОТТТАТССАТСССОАТАСТСАОТССГГОАТбСаААТбСАСТ

ССТААТ6(5ЕС)ГО: 150)

Защитный фрагмент: длина=75

ООСАТСОАТАААСАОООАААСАСТОТССАТГССГСАСАСССААСАбТСТАОО

ТСТТООТбОСТНЭТСТААСГСТО (ЗЕСТ ГО: 151)

Детектирующий линкер: длина=60

ТОСТСТССТТСАСТОТТТаСАОСТООАТАСТОАОТСАССААОАССТАСАСТОТ

ТСССТОТ(8ЕрГО: 152)

Фактор ослабления: длина=25

САССААОАССТАСАСТеТТООСТОТ (ЗЕр ГО: 153)

Мишень #15 ММР-9 ГО5070

Якорь: дпина*25

АТСАТСТААСтТСТТСбОТСССТОСС (ЗЕР ГО: 154)

Мишень: длинз=60

ОСААССТОААСАТСТТСОАССССАТСССССАОАТТООСААССАСЗСТСТАТГГ (ЗТТСААСО(ЗЕрШ: 155)

Линкер: длина=60

ОС<ЗААССА<ЗСТОТАТТТСТГСАА6ССАТАСТСА6ТаССАСС(}АССОААОАСТ ТАСАТСАТ (ЗЕр ГО: 156)

Защитный фрагмент: длина=75

ССТТСААСАААТАСАОСГСОТТСССААТСТССССОАТООС6ТСОААОАТОТТ

САСОТГОСССТТОТСТААОТСТС (5ЕР ГО; 157)

Детектирующий линкер: дпйна=60

ТССТСТССТТСАСТСТТТОСАССТОбАТАСТСАОТОСААСбТСААСАТСГГСб

АССССАТ (ЗЕр ГО: 158)

Фактор ослабления; длина=25 аСААССТаААСАТСТТССАСаССАТ(ЗЕрП): 159)

Мишень #16 Актин М10277

Якорь: дпина=25

СТСАОТССТССССГСЗССГАССТООС (ЗЕр ГО: 160)

Мишень: длина=60

ОАОТССТОТаССАТССАСаАААСТАССТТСААСТССАТСАТОААСТСТбАСО

ТООАСАТС(ЗВрГО:161)

Линкер: длииа=60

САТСАТСААОТбтаАССТООАСАТССАТАСТОАОТОССАСОТАООСАСССОА 6САСТС АО (ЗЕО П): 162)

Защитный фрагмент дпина=75 сатотссасотсасаспсатсатооаоттсаасотаоггтсотссатссса САОСАСТСОСГТОТСТААОТСТО (5ЕР ΙΟ: 163)

Детектирующий линкер: длина=60

ТОСТСТССТТСАСТОГГТСЮАОСТОСАТАСТСАатОАСП-ССТСТСЭОСАТССАС ОАААСТА (8Е() Ю: 164) Фактор ослабления: длина=25

ОАОТССТОТООСАТССАСОАААСТА (ЗЕрШ; 165)

На фиг. 33 показано, что воспроизводимость анализа является высокой, обеспечивая %СУ в пределах примерно от 3 до 13%, когда анализу подвергается 30000 клеток.

На фиг. 34 показано, что чувствительность анализа является высокой, например, РНК-мишени для ΟΑΡΌΗ можно детектировать, когда РНК происходит из пробы, полученной из 1000 анализируемых клеток или меньше.

На фиг. 35 представлен анализ, в основном проведенный по протоколу из примера 25 и с использованием совокупностей и мишеней из примера 27, в котором было показано, что тестируемые мРНКмишени можно детектировать даже, когда РНК происходит из пробы, полученной из 1000 клеток или меньше, и все мишени, даже экспрессированные в низкой концентрации, можно детектировать, когда РНК получена из 1000 клеток или меньше.

Пример 31. Выбор олигонуклеотидных реагентов (см. фиг. 36)

На фиг. 36 схематично представлено несколько типов олигонуклеотидных реагентов, которые можно использовать в способах по изобретению. На фигуре представлены схемы анализа, в которых олигонуклеотидные якоря присоединены к поверхности либо через их 5'-, либо их 3'-концы («инвентирован

- 56 011415 ные»), и в которых олигонуклеотиды имеют два сайта узнавания, которые либо примыкают друг к другу («укороченные»), либо разделены нуклеиновокислотными спейсерами. Каждый квадрат представляет 5 нуклеотидов.

Пример 32. Способы амплификации защитного от нуклеаз фрагмента (см. фиг. 37-39 и 42)

На фиг. 38 представлена амплификация защитного от нуклеаз фрагмента с помощью лигазы. При выборе а' в виде последовательности из 12 оснований из 25 оснований, которые в лигированном а'а связываются с совокупностью, можно выбрать условия гибридизации, при которых возникает возможность связывания только лигированной последовательности из 25 оснований молекул а'а. Узнавание можно улучшить использованием модифицированного нуклеотида(ов) в каждом участке линкер-связывающей области последовательностей а' и а. Если циклы диссоциации под действием тепла разрушают лигазу, ее можно вновь добавить в цикл.

На фиг. 39 показана амплификация защитного от нуклеаз фрагмента с помощью защиты от нуклеаз. Цепь (ДНК), комплементарную (защитному от нуклеаз фрагменту Ь), может включать модифицированные основания, которые гибридизуются при более низкой температуре, чем (РНКа), или (РНКа) можно разрушить перед добавлением (ДНКа). Аналогично (линкер а) для (ДНКа) может содержать модифицированные нуклеотиды, которые гибридизуются при более низкой температуре, чем (защитный фрагмент от нуклеаз Ь) даже, если гибрид (линкер а)/(ДНКа) включает 25 оснований, и (ДНКа)/(защитный фрагмент от нуклеаз Ь) представляет гибрид из 50 пар оснований, особенно, с учетом экспериментальных данных о том, что цепи ДНК в растворе разбавлены, и проходят через высокую, в основном однородную концентрацию (линкера а). Проточное устройство можно заменить планшетом, содержащим совокупность для захвата. Линейную совокупность можно заменить совокупностью 2-Ό или 3-Ό.

На фиг. 42 показана амплификация защитного от нуклеаз фрагмента с помощью полимеразы. После завершения реакции защиты от нуклеаз и диссоциации защитного от нуклеаз фрагмента от РНК, добавляют праймер (а'), который содержит двухцепочечный промотор для РНК-полимеразы (например, Т7полимеразы) и праймер для наращивания по матрице защитного от нуклеаз фрагмента (например, наращивания с помощью обратной транскриптазы (ЯТ) для репликации РНК или ДНК, или Тад-полимеразы для репликации ДНК) так, что после связывания защитного от нуклеаз фрагмента (например, ЯТ- или Тад-полимераза) он будет использоваться в качестве матрицы для образования комплекса двухцепочечной ДНК с двухцепочечным промотором, помещенным на конце последовательности защитного от нуклеаз фрагмента. Добавление лигазы будет лигировать вторую цепь промотора с цепью защитного от нуклеаз фрагмента, за исключением первого основания, которое представляет ошибочно спаренное δΝΡ и, следовательно, во время реакции защиты от нуклеаз δ1 вырежет незащищенное основание. Лигаза не будет лигировать промотор с защитным от нуклеаз фрагментом за счет вырезанного основания. В случае лигирования цепь Ь превращается в наращенную цепь Ь, включающую промотор полимеразы, и амплификацию можно продолжать с использованием полимеразы, и продолжать до добавления ЯТ-праймера Ь'. Промтор/наращенный конец защитного от нуклеаз фрагмента используется для связывания с совокупностью или детектирующим линкером или детектирующим зондом. Для детектирования δΝΡ данную гибридизацию проводят таким образом, что сайт δΝΡ находится примерно в середине последовательности, используемой для гибридизации с совокупностью (детектирующим линкером или детектирующим зондом и т.д.). Совокупность (детектирующий линкер или детектирующий зонд) области гибридизации наращенного защитного от нуклеаз зонда не включает все основания на конце (некоторые из оснований на конце наращенного защитного зонда от нуклеаз могут выступать без наличия последовательности, комплементарной для гибридизации с линкером и т.д.). В вариациях, которые не представлены, отсутствует необходимость в лигировании перед использованием полимеразы (например, Т7), и, следовательно, детектирование δΝΡ проводят при выборе последовательности, располагающей δΝΡ в середине последовательности, гибридизованной с а' и при использовании детектирования δΝΡ, как описано выше. Нет необходимости наращивать цепь а', а вместо этого РНК-полимераза может использовать промотор, гибридизованный с одноцепочечным защитным от нуклеаз фрагментом (пропуская указанное наращение с помощью ЯТ или альтернативную стадию наращивания с помощью Тад-полимеразы) для получения РНК.

Из вышепредставленного описания специалисты в данной области, очевидно, поймут основные признаки настоящего изобретения и, не отступая от его сущности и объема, можно внести изменения и модификации изобретения для его адаптирования для различного применения и условий.

Без дополнительной разработки полагается, что специалисты в данной области смогут с использованием предшествующего описания использовать настоящее изобретении в полной мере. Следовательно, предшествующие предпочтительные конкретные воплощения приводятся только с целью иллюстрации и ни в коей мере не ограничивают изобретение.

Полное раскрытие всех применений, патентов и публикаций, цитированных выше и представленных на фигурах, включено здесь как ссылка.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Раствор для лизиса клеток или придания им проницаемости, содержащий приблизительно от 8 до приблизительно 60% (об./об.) формамида, приблизительно от 0,01 до приблизительно 0,5% (об./об.) додецилсульфата натрия (ЕБЕ) и 0,5-6Х ЕЕС в качестве буфера.
2. Раствор по п.1, содержащий приблизительно от 10 до приблизительно 30% (об./об.) формамида.
3. Раствор по п.1, содержащий приблизительно от 0,03 до приблизительно 0,10% (об./об.) ЕБЕ.
4. Раствор по п.1, содержащий приблизительно 2Х-4Х ЕЕС.
5. Раствор по п.2, содержащий приблизительно от 0,03 до приблизительно 0,10% (об./об.) ЕБЕ.
6. Раствор по п.5, содержащий приблизительно 2Х-4Х ЕЕС.
7. Раствор по п.1, содержащий 3Х ЕЕС.
8. Раствор по п.6, содержащий 3Х ЕЕС.
9. Способ детектирования по меньшей мере одной нуклеиновокислотной мишени, включающий:

а) обеспечение контактирования пробы, которая может включать указанную(ые) мишень(и) с защищающим(ми) от нуклеаз фрагментом(ами), который(е) специфичен(ны) к мишени(ям), и связывается(ются) с указанной мишенью(ями);

б) воздействие на пробу нуклеазы, эффективной для расщепления одноцепочечной нуклеиновой кислоты и обеспечение контактирования полученной пробы с устройством, которое перед добавлением указанной пробы имеет поверхность, включающую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых, по существу, являются одинаковыми, где каждая область включает по меньшей мере два различных локуса олигонуклеотидных якорей, где каждый якорь связан с бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к олигонуклеотидному якорю, и второй участок, который включает зонд, специфичный к указанному(ым) защищающему(им) от нуклеаз фрагменту(ам), в условиях, эффективных для связывания указанного защищающего(их) фрагмента(ов) с указанным устройством, причем якоря, расположенные по меньшей мере в одном локусе, связаны примерно с 2-4 различными бифункциональными линкерами, обладающими различными специфичностями, и где указанную пробу подвергают воздействию раствора по любому из пп.1-8.
10. Способ детектирования по меньшей мере одной нуклеиновокислотной мишени, включающий:

а) обеспечение контактирования пробы, которая может включать указанную(ные) мишень(и) с защищающим(ми) от нуклеаз фрагментом(ами), который(е) специфичен(ны) к мишени(ям) и связывается(ются) с указанной мишенью(ями);

б) воздействие на пробу нуклеазы, эффективной для расщепления одноцепочечной нуклеиновой кислоты и обеспечения контактирования полученной пробы с устройством, которое перед добавлением указанной пробы имеет поверхность, включающую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых, по существу, являются одинаковыми, где каждая область включает по меньшей мере два различных локуса олигонуклеотидных якорей, где каждый якорь связан с бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к олигонуклеотидному якорю, и второй участок, который включает зонд, специфичный к указанному(ым) защищающему(им) от нуклеаз фрагменту(ам), в условиях, эффективных для связывания указанного защищающего(их) защитного фрагмента(ов) с указанным устройством, причем указанную пробу подвергают воздействию раствора по любому из пп.1-8.
11. Способ детектирования по меньшей мере одной нуклеиновокислотной мишени, включающий

а) обеспечение контактирования пробы, которая может включать указанную(ные) мишень(и) с защищающим(ми) от нуклеаз фрагментом(ами), который(е) специфичн(ны) к мишени(ям) и связывается(ются) с указанной мишенью(ями);

б) воздействие на пробу нуклеазы, эффективной для расщепления одноцепочечной нуклеиновой кислоты, и

в) обеспечение контактирования полученной пробы с поверхностью, имеющей включающую зонд, специфичный к указанному(ым) защищающему(им) от нуклеаз фрагменту(ам), в условиях, эффективных для связывания указанного защищающего(их) фрагмента(ов) с указанным устройством, причем указанную пробу подвергают воздействию раствора по п.1.
12. Способ детектирования по меньшей мере одной нуклеиновокислотной мишени, включающий:

а) обеспечение контактирования пробы, которая может включать указанную(ые) мишень(и) с защищающим(ми) от нуклеаз фрагментом(ами), который(е) специфичен(ны) к мишени(ям), и связывается(ются) с указанной мишенью(ями);

б) воздействие на пробу нуклеазы, эффективной для расщепления одноцепочечной нуклеиновой кислоты и обеспечение контактирования полученной пробы с устройством, которое перед добавлением указанной пробы имеет поверхность, включающую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых, по существу, являются одинаковыми, где каждая область включает по меньшей мере два различных локуса олигонуклеотидных якорей, где каждый якорь связан с бифункцио

- 58 011415 нальным линкером, который имеет первый участок, специфичный к олигонуклеотидному якорю, и второй участок, который включает зонд, специфичный к указанному(ым) защищающему(им) от нуклеаз фрагменту(ам), в условиях, эффективных для связывания указанного защищающего(их) фрагмента(ов) с указанным устройством, где указанная проба подвергается воздействию раствора по любому из пп.1-8 при температуре около 105°С или ниже, при которой, по существу, только мРНК, но не ДНК, высвобождается в форме, в которой она связывается с указанным защищающим(ми) фрагментом(ами), и/или подвергается воздействию указанного раствора при температуре около 105°С или выше, при которой как мРНК, так и ДНК, высвобождается в форме, в которой они связываются с указанным защищающим(ми) фрагментом(ами).
13. Способ по п.12, где якоря, расположенные по меньшей мере в одном локусе, связаны примерно с 2-4 различными бифункциональными линкерами, обладающими различными специфичностями.
14. Способ детектирования по меньшей мере одной нуклеиновокислотной мишени, включающий:

а) обеспечение контактирования пробы, которая может включать указанную(ые) мишень(и) с защищающим(ми) от нуклеаз фрагментом(ами), который(е) специфичен(ны) к мишени(ям), и связывается(ются) с указанной мишенью(ями);

б) воздействие на пробу нуклеазы, эффективной для расщепления одноцепочечной нуклеиновой кислоты и обеспечение контактирования полученной пробы с поверхностью, включающую зонд, специфичный к указанному(ым) защищающему(им) от нуклеаз фрагменту(ам), в условиях, эффективных для связывания указанного защищающего(их) фрагмента(ов) с указанной поверхностью, где указанная проба подвергается воздействию раствора по любому из пп.1-8 при температуре около 105°С или ниже, при которой, по существу, только мРНК, но не ДНК, высвобождается в форме, в которой она связывается с указанным защищающим(ми) фрагментом(ами), и/или подвергается воздействию указанного раствора при температуре около 105°С или выше, при которой как мРНК, так и ДНК, высвобождается в форме, в которой они связываются с указанным защищающим(ми) фрагментом(ами).
15. Способ по любому из пп.12-14, где раствор указанной пробы, содержащий раствор по любому из пп.1-8, разбавлен так, что указанный раствор не ингибирует функции указанной нуклеазы в отношении расщепления одноцепочечной нуклеиновой кислоты.