JP2003052377A - 核酸の検出法 - Google Patents
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- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
- C09B23/06—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups three >CH- groups, e.g. carbocyanines
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- C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
- C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
- C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
- C09B11/22—Amino derivatives of triarylmethanes containing OH groups bound to an aryl nucleus and their ethers and esters
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- C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
- C09B57/08—Naphthalimide dyes; Phthalimide dyes
Abstract
(57)【要約】
【課題】 多重鎖核酸を簡便かつ高精度に検出する方法
を提供する。 【解決手段】 プローブ核酸に対して試料核酸を相互作
用させ、該プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイ
ゼーションによりハイブリッド多重鎖核酸を形成させる
工程を含み、上記ハイブリッド多重鎖核酸に対して２種
以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物を相互作用さ
せ、該２種以上の多重鎖核酸親和性化合物間で起こる相
互作用の結果として生じる発光を検出する方法であっ
て、２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物として
それぞれ発光量子収率が０．１〜０．９のクロモフォア
を有する化合物を用いる方法。
を提供する。 【解決手段】 プローブ核酸に対して試料核酸を相互作
用させ、該プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイ
ゼーションによりハイブリッド多重鎖核酸を形成させる
工程を含み、上記ハイブリッド多重鎖核酸に対して２種
以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物を相互作用さ
せ、該２種以上の多重鎖核酸親和性化合物間で起こる相
互作用の結果として生じる発光を検出する方法であっ
て、２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物として
それぞれ発光量子収率が０．１〜０．９のクロモフォア
を有する化合物を用いる方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、多重鎖核酸を簡便
かつ高精度に検出する方法に関する。
かつ高精度に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト遺伝子配列の解析がほぼ終了し、今
後これらの情報を元に遺伝子の機能解明が急速に進むも
のと予想されている。ＤＮＡチップは、スライドガラス
等の固相担体に多数のＤＮＡ分子を整列させたマイクロ
アレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等の同時解
析に非常に有用である。このＤＮＡチップを用いるＤＮ
Ａチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能で
あり、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギ
ーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供する
ものとして期待されている。
後これらの情報を元に遺伝子の機能解明が急速に進むも
のと予想されている。ＤＮＡチップは、スライドガラス
等の固相担体に多数のＤＮＡ分子を整列させたマイクロ
アレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等の同時解
析に非常に有用である。このＤＮＡチップを用いるＤＮ
Ａチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能で
あり、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギ
ーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供する
ものとして期待されている。
【０００３】ＤＮＡチップ技術の具体化は、ＤＮＡの塩
基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーショ
ンによって決定する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案された
ことに始まる（Ｄr m a n ac，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ １１４（１９８
９）），ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定
法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化には至
らなかった。その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べるいわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏｒ，
Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ ７
６７（１９９１）及びＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９５））。
基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーショ
ンによって決定する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案された
ことに始まる（Ｄr m a n ac，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ １１４（１９８
９）），ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定
法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化には至
らなかった。その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べるいわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏｒ，
Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ ７
６７（１９９１）及びＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９５））。
【０００４】しかしながら、ＤＮＡチップ作製技術を実
用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオ
チドを固相担体表面に整列させるためのＤＮＡチップの
作製技術が必要とされるほか、作製されたＤＮＡチップ
上のＤＮＡ断片と試料核酸断片とのハイブリダイゼーシ
ョンを高感度かつ正確に検出する技術も必要となる。一
般的には、試料核酸断片を標識した後にハイブリダイゼ
ーションさせることにより検出が行なわれるが、この標
識工程は各試料毎に行う必要があり、標識反応の他に標
識された核酸と反応せずに残存する標識用化合物とを分
離するための精製工程も必要になるなど煩雑である。
用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオ
チドを固相担体表面に整列させるためのＤＮＡチップの
作製技術が必要とされるほか、作製されたＤＮＡチップ
上のＤＮＡ断片と試料核酸断片とのハイブリダイゼーシ
ョンを高感度かつ正確に検出する技術も必要となる。一
般的には、試料核酸断片を標識した後にハイブリダイゼ
ーションさせることにより検出が行なわれるが、この標
識工程は各試料毎に行う必要があり、標識反応の他に標
識された核酸と反応せずに残存する標識用化合物とを分
離するための精製工程も必要になるなど煩雑である。
【０００５】この煩雑な標識工程を省略する方法とし
て、例えば特開平５−１９９８９８号公報に記載されて
いるように、インターカレーターを用いてハイブリダイ
ゼーションにより形成される多重鎖核酸のみを検出する
方法が提案されている。共有結合による標識が検出対象
核酸を変成させ、正確なハイブリダイゼーションを阻害
してしまう懸念があるのに対して、インターカレーター
を用いる方法は標識工程を不要にするばかりでなく、上
記問題を解消できる可能性があるものと考えられてい
る。
て、例えば特開平５−１９９８９８号公報に記載されて
いるように、インターカレーターを用いてハイブリダイ
ゼーションにより形成される多重鎖核酸のみを検出する
方法が提案されている。共有結合による標識が検出対象
核酸を変成させ、正確なハイブリダイゼーションを阻害
してしまう懸念があるのに対して、インターカレーター
を用いる方法は標識工程を不要にするばかりでなく、上
記問題を解消できる可能性があるものと考えられてい
る。
【０００６】上記特開平５−１９９８９８号公報に記載
されているインターカレーターは検出を電気化学的に行
うものであり、電気化学的な検出のために装置の小型化
が可能であるなどいくつかの有利な点はあるものの、電
気化学的に検出を行うためにプローブ核酸を電極表面に
固定する必要があるため、電極の作成や電極表面への核
酸の固定化などいくつかの新たな難しい課題が生じてし
まう。
されているインターカレーターは検出を電気化学的に行
うものであり、電気化学的な検出のために装置の小型化
が可能であるなどいくつかの有利な点はあるものの、電
気化学的に検出を行うためにプローブ核酸を電極表面に
固定する必要があるため、電極の作成や電極表面への核
酸の固定化などいくつかの新たな難しい課題が生じてし
まう。
【０００７】このような理由から、現在広く行われてい
る蛍光スキャナーを用いて検出を行う方法に適したイン
ターカレーターの開発が望まれている。しかし、これま
でに知られているインターカレーターは多重鎖核酸と相
互作用しうるばかりでなく、試料となる単鎖核酸とも相
互作用し、その選択性が不十分であるという問題を有し
ている。この問題以外にも、多重鎖核酸検出用のインタ
ーカレーターとして具備すべき条件として、高い感度、
高いＳ／Ｎを実現するため、多重鎖核酸へのインターカ
レート効率が高いこと、インターカレートした状態とし
ていない状態とでインターカレーターから発せられるシ
グナル強度が大きく異なることなどが要求される。ま
た、蛍光色素を結合した形のインターカレーターにおい
ては、高い蛍光色素の発光効率のほか、可視領域に吸収
極大を有するなど蛍光スキャナーの励起光源及び検出波
長に適性を有していることが必要であり、波長調節性の
高い色素骨格が望まれている。以上の条件を満たすイン
ターカレーターが強く望まれているが、実用的なレベル
のものが見出されているとは言えない状況にある。
る蛍光スキャナーを用いて検出を行う方法に適したイン
ターカレーターの開発が望まれている。しかし、これま
でに知られているインターカレーターは多重鎖核酸と相
互作用しうるばかりでなく、試料となる単鎖核酸とも相
互作用し、その選択性が不十分であるという問題を有し
ている。この問題以外にも、多重鎖核酸検出用のインタ
ーカレーターとして具備すべき条件として、高い感度、
高いＳ／Ｎを実現するため、多重鎖核酸へのインターカ
レート効率が高いこと、インターカレートした状態とし
ていない状態とでインターカレーターから発せられるシ
グナル強度が大きく異なることなどが要求される。ま
た、蛍光色素を結合した形のインターカレーターにおい
ては、高い蛍光色素の発光効率のほか、可視領域に吸収
極大を有するなど蛍光スキャナーの励起光源及び検出波
長に適性を有していることが必要であり、波長調節性の
高い色素骨格が望まれている。以上の条件を満たすイン
ターカレーターが強く望まれているが、実用的なレベル
のものが見出されているとは言えない状況にある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、多重
鎖核酸の検出方法を提供することにある。より具体的に
は、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡアレイなどの遺伝子解
析に利用可能な多重鎖核酸の検出方法を提供することに
あり、検出シグナルの強度向上と高いＳ／Ｎ比を与える
多重核酸の検出方法を提供することが本発明の課題であ
る。
鎖核酸の検出方法を提供することにある。より具体的に
は、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡアレイなどの遺伝子解
析に利用可能な多重鎖核酸の検出方法を提供することに
あり、検出シグナルの強度向上と高いＳ／Ｎ比を与える
多重核酸の検出方法を提供することが本発明の課題であ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、発光性ク
ロモフォアを有し、単鎖核酸よりも多重鎖核酸に対して
選択的な親和性を有する化合物（以下、単鎖核酸よりも
多重鎖核酸に対して選択的な親和性を有する化合物を
「多重鎖核酸親和性化合物」と称する。）をプローブ核
酸と試料核酸とのハイブリダイゼーションにより生成し
たハイブリッド多重鎖核酸に相互作用させ、該多重鎖核
酸親和性化合物より発せられるシグナルを高いＳ／Ｎ比
で検出する方法について鋭意研究を行った。その結果、
２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物を多重鎖核
酸に相互作用させ、それらの化合物間の相互作用の結果
として生じる発光を検出することにより、高感度に多重
鎖核酸を検出できることを見出した。
ロモフォアを有し、単鎖核酸よりも多重鎖核酸に対して
選択的な親和性を有する化合物（以下、単鎖核酸よりも
多重鎖核酸に対して選択的な親和性を有する化合物を
「多重鎖核酸親和性化合物」と称する。）をプローブ核
酸と試料核酸とのハイブリダイゼーションにより生成し
たハイブリッド多重鎖核酸に相互作用させ、該多重鎖核
酸親和性化合物より発せられるシグナルを高いＳ／Ｎ比
で検出する方法について鋭意研究を行った。その結果、
２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物を多重鎖核
酸に相互作用させ、それらの化合物間の相互作用の結果
として生じる発光を検出することにより、高感度に多重
鎖核酸を検出できることを見出した。
【００１０】上記の方法において、多重鎖核酸を識別し
て高い強度のシグナルを検出するためには、多重鎖核酸
親和性化合物が多重鎖核酸への高い相互作用力を有する
こと、及び高い多重鎖／単鎖識別性を有することのほ
か、高い発光効率を有することも必要と予想された。し
かしながら、上記の予想に反して、２種以上の発光性の
多重鎖核酸親和性化合物として発光量子収率が０．１〜
０．９のクロモフォアを有する化合物を用いた場合に極
めて高い検出感度を達成できることが見出された。本発
明は上記の知見を基にして完成されたものである。
て高い強度のシグナルを検出するためには、多重鎖核酸
親和性化合物が多重鎖核酸への高い相互作用力を有する
こと、及び高い多重鎖／単鎖識別性を有することのほ
か、高い発光効率を有することも必要と予想された。し
かしながら、上記の予想に反して、２種以上の発光性の
多重鎖核酸親和性化合物として発光量子収率が０．１〜
０．９のクロモフォアを有する化合物を用いた場合に極
めて高い検出感度を達成できることが見出された。本発
明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【００１１】すなわち、本発明は、プローブ核酸に対し
て試料核酸を相互作用させ、該プローブ核酸と該試料核
酸とのハイブリダイゼーションによりハイブリッド多重
鎖核酸を形成させる工程を含み、上記ハイブリッド多重
鎖核酸に対して２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化
合物を相互作用させ、該２種以上の多重鎖核酸親和性化
合物間で起こる相互作用の結果として生じる発光を検出
する方法であって、２種以上の発光性の多重鎖核酸親和
性化合物としてそれぞれ発光量子収率が０．１〜０．９
のクロモフォアを有する化合物を用いる方法を提供する
ものである。
て試料核酸を相互作用させ、該プローブ核酸と該試料核
酸とのハイブリダイゼーションによりハイブリッド多重
鎖核酸を形成させる工程を含み、上記ハイブリッド多重
鎖核酸に対して２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化
合物を相互作用させ、該２種以上の多重鎖核酸親和性化
合物間で起こる相互作用の結果として生じる発光を検出
する方法であって、２種以上の発光性の多重鎖核酸親和
性化合物としてそれぞれ発光量子収率が０．１〜０．９
のクロモフォアを有する化合物を用いる方法を提供する
ものである。
【００１２】本発明の好ましい態様によれば、プローブ
核酸が固相担体上に固定されている上記の方法；及び発
光性の多重鎖核酸親和性化合物が下記一般式（Ｉ）： （ＩＣ）−〔(Ｌ)m−(ＳＩＧ)q〕n （式中、ＩＣは多重鎖核酸との親和性を有する基を示
し；Ｌは２価の連結基を示し；ＳＩＧは発光量子収率が
０．１〜０．９のクロモフォアを示し；ｎは２、３、又
は４の整数を示し；ｍは０又は１を示し；ｑは０又は１
を示すが、ただしｎ個の (Ｌ)m−(ＳＩＧ)qにおいてす
べてのｑが０であることはなく、ｎ個の (Ｌ) m−(ＳＩ
Ｇ)qにおいて、それぞれのＬ、ｍ、ＳＩＧ、ｑは同一で
あっても異なっていてもよい）で表される化合物である
上記の方法が提供される。また、別の観点からは、上記
の方法に用いるための上記一般式（Ｉ）で表される化合
物が本発明により提供される。
核酸が固相担体上に固定されている上記の方法；及び発
光性の多重鎖核酸親和性化合物が下記一般式（Ｉ）： （ＩＣ）−〔(Ｌ)m−(ＳＩＧ)q〕n （式中、ＩＣは多重鎖核酸との親和性を有する基を示
し；Ｌは２価の連結基を示し；ＳＩＧは発光量子収率が
０．１〜０．９のクロモフォアを示し；ｎは２、３、又
は４の整数を示し；ｍは０又は１を示し；ｑは０又は１
を示すが、ただしｎ個の (Ｌ)m−(ＳＩＧ)qにおいてす
べてのｑが０であることはなく、ｎ個の (Ｌ) m−(ＳＩ
Ｇ)qにおいて、それぞれのＬ、ｍ、ＳＩＧ、ｑは同一で
あっても異なっていてもよい）で表される化合物である
上記の方法が提供される。また、別の観点からは、上記
の方法に用いるための上記一般式（Ｉ）で表される化合
物が本発明により提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】本明細書において、多重鎖核酸と
は核酸が相補的配列に由来する相互作用により集合した
状態を指している（相互作用による多重鎖核酸の生成過
程を「ハイブリダイゼーション」と呼ぶ場合がある）。
多重鎖核酸は二本鎖、三本鎖、又は四本鎖などの状態を
とることが知られており、本明細書における多重鎖核酸
にはこれらの多重鎖も包含される。核酸としてはＤＮＡ
又はＲＮＡのほか、これらの化学修飾体が数多く知られ
ており、さらにＰＮＡと呼ばれるポリペプチド鎖を主鎖
に有する核酸類縁体なども知られているが、本明細書に
おける多重鎖核酸にはこれらがすべて包含される。本発
明においてより好ましく用いられる核酸はＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、及びこれらの化学修飾体であり、二本鎖、三本鎖、
又は四本鎖の中では二本鎖が好ましい。プローブ核酸と
試料核酸とのハイブリダイゼーションにより生成される
多重鎖核酸を本明細書において「ハイブリッド多重鎖核
酸」と呼ぶ。
は核酸が相補的配列に由来する相互作用により集合した
状態を指している（相互作用による多重鎖核酸の生成過
程を「ハイブリダイゼーション」と呼ぶ場合がある）。
多重鎖核酸は二本鎖、三本鎖、又は四本鎖などの状態を
とることが知られており、本明細書における多重鎖核酸
にはこれらの多重鎖も包含される。核酸としてはＤＮＡ
又はＲＮＡのほか、これらの化学修飾体が数多く知られ
ており、さらにＰＮＡと呼ばれるポリペプチド鎖を主鎖
に有する核酸類縁体なども知られているが、本明細書に
おける多重鎖核酸にはこれらがすべて包含される。本発
明においてより好ましく用いられる核酸はＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、及びこれらの化学修飾体であり、二本鎖、三本鎖、
又は四本鎖の中では二本鎖が好ましい。プローブ核酸と
試料核酸とのハイブリダイゼーションにより生成される
多重鎖核酸を本明細書において「ハイブリッド多重鎖核
酸」と呼ぶ。
【００１４】本発明において用いられる発光性の多重鎖
核酸親和性化合物において、該化合物が有するクロモフ
ォアの発光量子収率は０．１〜０．９の範囲（本明細書
において「〜」で示される数値範囲は上限及び下限の数
値を含む範囲である）であり、好ましくは０．２〜０．
９であり、さらに好ましくは０．３〜０．８５である。
発光量子収率の測定法は、例えばＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅ
ｍ．，６５，２２９〜２３５、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（Ｊ．Ｃ．Ｓｃａｉａｎｏ編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，
Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ刊）、Ｔｒａｎｓ．Ｆａｒａｄａ
ｙ Ｓｏｃ．，５３，６４６〜６５５に記載の方法で行
うことができる。
核酸親和性化合物において、該化合物が有するクロモフ
ォアの発光量子収率は０．１〜０．９の範囲（本明細書
において「〜」で示される数値範囲は上限及び下限の数
値を含む範囲である）であり、好ましくは０．２〜０．
９であり、さらに好ましくは０．３〜０．８５である。
発光量子収率の測定法は、例えばＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅ
ｍ．，６５，２２９〜２３５、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（Ｊ．Ｃ．Ｓｃａｉａｎｏ編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，
Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ刊）、Ｔｒａｎｓ．Ｆａｒａｄａ
ｙ Ｓｏｃ．，５３，６４６〜６５５に記載の方法で行
うことができる。
【００１５】該多重鎖核酸親和性化合物の部分構造であ
るクロモフォア（通常は発光性化合物の残基に相当す
る）の量子収率は、クロモフォアに対応する発光性化合
物を製造してその発光量子収率を測定すればよい。多重
鎖核酸親和性化合物が複数のクロモフォアを有する場合
には、それぞれのクロモフォアに対応する化合物を製造
してそれらの発光量子収率を測定すればよいが、本発明
の方法では、それらの発光量子収率のうちの少なくとも
１つが０．１〜０．９の範囲の範囲に収まればよい。複
数のクロモフォアを有する化合物において、それらのク
ロモフォアが不可分である場合には、それらを１つのク
ロモフォアとして測定を行うことができる。なお、クロ
モフォアの発光量子収率に大きな影響を与える部分構造
が存在しない場合には、多重鎖核酸親和性化合物自体の
発光量子収率を測定してもよい。
るクロモフォア（通常は発光性化合物の残基に相当す
る）の量子収率は、クロモフォアに対応する発光性化合
物を製造してその発光量子収率を測定すればよい。多重
鎖核酸親和性化合物が複数のクロモフォアを有する場合
には、それぞれのクロモフォアに対応する化合物を製造
してそれらの発光量子収率を測定すればよいが、本発明
の方法では、それらの発光量子収率のうちの少なくとも
１つが０．１〜０．９の範囲の範囲に収まればよい。複
数のクロモフォアを有する化合物において、それらのク
ロモフォアが不可分である場合には、それらを１つのク
ロモフォアとして測定を行うことができる。なお、クロ
モフォアの発光量子収率に大きな影響を与える部分構造
が存在しない場合には、多重鎖核酸親和性化合物自体の
発光量子収率を測定してもよい。
【００１６】多重鎖核酸親和性化合物の間の相互作用と
しては、多重鎖核酸親和性化合物が接近した場合に著し
く強度が大きくなる相互作用を利用し、その相互作用の
結果として生じる発光を検出することが好ましい。この
ような相互作用としては、例えば、電子移動又はエネル
ギー移動などを有利に利用できるが、通常はエネルギー
移動による発光を検出することが好ましい。
しては、多重鎖核酸親和性化合物が接近した場合に著し
く強度が大きくなる相互作用を利用し、その相互作用の
結果として生じる発光を検出することが好ましい。この
ような相互作用としては、例えば、電子移動又はエネル
ギー移動などを有利に利用できるが、通常はエネルギー
移動による発光を検出することが好ましい。
【００１７】本発明で特に好ましく用いられる発光性の
多重鎖核酸親和性化合物は上記の一般式（Ｉ）で表され
る。一般式（Ｉ）において、好ましいＩＣとしては平面
３環性構造または平面４環性構造を有する基を挙げるこ
とができる。平面３環性構造の例としては、例えば、ア
ントラセン、アントラキノン、フェナントレン、フェナ
ントロリン、キサンテン、カルバゾール、フェナントリ
ジン、フェナジン、アクリジンなどが挙げられる。平面
４環性構造の例としては、平面３環性構造の例として挙
げたものにさらに平面性の環構造を縮合させたものが挙
げられる。より好ましい構造としては「分析化学」、第
４８巻、１２号、１０９５頁−１１０５頁（１９９９
年）に記載の縫い込み型インターカレーターとして記載
されている骨格が挙げられる。
多重鎖核酸親和性化合物は上記の一般式（Ｉ）で表され
る。一般式（Ｉ）において、好ましいＩＣとしては平面
３環性構造または平面４環性構造を有する基を挙げるこ
とができる。平面３環性構造の例としては、例えば、ア
ントラセン、アントラキノン、フェナントレン、フェナ
ントロリン、キサンテン、カルバゾール、フェナントリ
ジン、フェナジン、アクリジンなどが挙げられる。平面
４環性構造の例としては、平面３環性構造の例として挙
げたものにさらに平面性の環構造を縮合させたものが挙
げられる。より好ましい構造としては「分析化学」、第
４８巻、１２号、１０９５頁−１１０５頁（１９９９
年）に記載の縫い込み型インターカレーターとして記載
されている骨格が挙げられる。
【００１８】Ｌは−Ｃ(Ｒ)(Ｒ')−、−Ｏ−、−Ｎ(Ｒ)
−、−Ｎ+(Ｒ)(Ｒ')−・Ｘ-、−Ｓ(Ｏ) r−、−ＣＯ−、
−Ｓ(＝ＮＲ)t−又はアリーレン基の中から選ばれる２
価の基、又はこれらを組み合わせて得られる２価の基が
好ましい。Ｒ及びＲ'はそれぞれ独立に水素原子、アル
キル基、アリール基、アルコキシ基、アミノ基、ハロゲ
ン原子、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アンモ
ニオ基から選ばれる基などを示す。ｒは０、１、又は２
を表し、ｔは１又は２を示す。
−、−Ｎ+(Ｒ)(Ｒ')−・Ｘ-、−Ｓ(Ｏ) r−、−ＣＯ−、
−Ｓ(＝ＮＲ)t−又はアリーレン基の中から選ばれる２
価の基、又はこれらを組み合わせて得られる２価の基が
好ましい。Ｒ及びＲ'はそれぞれ独立に水素原子、アル
キル基、アリール基、アルコキシ基、アミノ基、ハロゲ
ン原子、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アンモ
ニオ基から選ばれる基などを示す。ｒは０、１、又は２
を表し、ｔは１又は２を示す。
【００１９】ＳＩＧは発光量子収率が０．１〜０．９の
発光性の基を示す。発光性化合物の中では蛍光性色素が
好ましく、蛍光性色素としてはシアニン色素、オキソノ
ール色素、又はキサンテン色素が好ましい。上記一般式
（Ｉ）で表される化合物に好ましく用いられるＳＩＧは
蛍光量子収率が０．２以上であり、さらに好ましくは蛍
光量子収率が０．３以上である。ＳＩＧで表される基を
与える特に好ましい蛍光性の色素化合物としては、例え
ば、モレキュラー・プローブス社のHandbook ofFluores
cent Probes and Research Chemicals 8th Edition（Mo
lecular Probes社刊ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）の中に
記載されている色素化合物や、特開２００１−２７０９
５７号公報に記載の色素化合物、特開２００１−１６３
８９５号公報に記載の化合物の色素部分に相当するも
の、あるいはアマシャム・ファルマシア社から販売され
ているＣｙ３又はＣｙ５などの蛍光性色素が挙げられ
る。
発光性の基を示す。発光性化合物の中では蛍光性色素が
好ましく、蛍光性色素としてはシアニン色素、オキソノ
ール色素、又はキサンテン色素が好ましい。上記一般式
（Ｉ）で表される化合物に好ましく用いられるＳＩＧは
蛍光量子収率が０．２以上であり、さらに好ましくは蛍
光量子収率が０．３以上である。ＳＩＧで表される基を
与える特に好ましい蛍光性の色素化合物としては、例え
ば、モレキュラー・プローブス社のHandbook ofFluores
cent Probes and Research Chemicals 8th Edition（Mo
lecular Probes社刊ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）の中に
記載されている色素化合物や、特開２００１−２７０９
５７号公報に記載の色素化合物、特開２００１−１６３
８９５号公報に記載の化合物の色素部分に相当するも
の、あるいはアマシャム・ファルマシア社から販売され
ているＣｙ３又はＣｙ５などの蛍光性色素が挙げられ
る。
【００２０】本発明の方法の典型的態様は、下記の工
程： (1)プローブ核酸に対して試料核酸を相互作用させ、該
プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイゼーション
によりハイブリッド多重鎖核酸を形成する工程； (2)２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物を該ハ
イブリッド多重鎖核酸に対して相互作用させる工程；及
び (3)上記２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物と
多重鎖核酸とが相互作用することによって生じる該多重
鎖核酸親和性化合物間の相互作用の結果として生じる発
光を検出する工程を含む。
程： (1)プローブ核酸に対して試料核酸を相互作用させ、該
プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイゼーション
によりハイブリッド多重鎖核酸を形成する工程； (2)２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物を該ハ
イブリッド多重鎖核酸に対して相互作用させる工程；及
び (3)上記２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物と
多重鎖核酸とが相互作用することによって生じる該多重
鎖核酸親和性化合物間の相互作用の結果として生じる発
光を検出する工程を含む。
【００２１】プローブ核酸は溶液中に存在していてもよ
いが、固相担体に固定されていることが好ましい。固相
担体としては、疎水性の担体、あるいは親水性の低い担
体が好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の
低いものも好ましく用いることができる。固相担体の材
質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミック
ス若しくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタ
レート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカー
ボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等
のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質
セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕
物、不織布、減紙、短繊維、又はメンブレンフィルター
等の多孔質物質などを拳げることができる。固相担体の
形状及び大きさは特に限定されず、平板状、球状、又は
棒状等であってもよく、ナノメートルオーダーのものか
らセンチメートルオーダーのものであってもよい。多孔
質物質の細孔の大きさは、例えば２〜１０００ｎｍの範
囲にあることが好ましく、２〜５００n mの範囲にある
ことが特に好ましい。表面処理の容易さや電気化学的方
法による解析の容易さの観点から、固相担体の材質はガ
ラス又はシリコンであることが特に好ましい。平板プレ
ート状の固相担体（以下、このような形状の固相担体を
「基板」と呼ぶ場合があり、本発明の好ましい態様とし
て固相担体が基板である場合について説明する場合があ
る）の場合、固相担体の厚さは１００〜２０００μｍの
範囲にあることが好ましい。
いが、固相担体に固定されていることが好ましい。固相
担体としては、疎水性の担体、あるいは親水性の低い担
体が好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の
低いものも好ましく用いることができる。固相担体の材
質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミック
ス若しくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタ
レート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカー
ボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等
のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質
セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕
物、不織布、減紙、短繊維、又はメンブレンフィルター
等の多孔質物質などを拳げることができる。固相担体の
形状及び大きさは特に限定されず、平板状、球状、又は
棒状等であってもよく、ナノメートルオーダーのものか
らセンチメートルオーダーのものであってもよい。多孔
質物質の細孔の大きさは、例えば２〜１０００ｎｍの範
囲にあることが好ましく、２〜５００n mの範囲にある
ことが特に好ましい。表面処理の容易さや電気化学的方
法による解析の容易さの観点から、固相担体の材質はガ
ラス又はシリコンであることが特に好ましい。平板プレ
ート状の固相担体（以下、このような形状の固相担体を
「基板」と呼ぶ場合があり、本発明の好ましい態様とし
て固相担体が基板である場合について説明する場合があ
る）の場合、固相担体の厚さは１００〜２０００μｍの
範囲にあることが好ましい。
【００２２】固相担体上へのプローブ核酸の固定化法
は、核酸断片の種類及び固相担体の種類に応じて適当な
方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素，Ｖ
ｏｌ．４３，Ｎｏ．１３，２００４−２０１１（１９９
８））。例えば、核酸断片がｃＤＮＡやＰＣＲ産物の場
合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリシン、ポリエ
チレンイミン、ポリアルキルアミン等の陽イオンで表面
処理した基板に静電結合させる方法を用いることができ
る。表面処理された基板上に、さらに電荷を有する親水
性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設け
てもよい。また、基板によっては、その基板中に親水性
の高分子等を含ませることも可能であり、このような処
理を施した基板も好ましく用いることができる。表面処
理を行うことによって、疎水性の基板、あるいは親水性
に乏しい基板と核酸断片との静電的な相互作用を促進す
ることができる。このような場合、基板としては、表面
処理の容易さと解析の容易さのため、スライドガラスを
用いることが好ましい。
は、核酸断片の種類及び固相担体の種類に応じて適当な
方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素，Ｖ
ｏｌ．４３，Ｎｏ．１３，２００４−２０１１（１９９
８））。例えば、核酸断片がｃＤＮＡやＰＣＲ産物の場
合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリシン、ポリエ
チレンイミン、ポリアルキルアミン等の陽イオンで表面
処理した基板に静電結合させる方法を用いることができ
る。表面処理された基板上に、さらに電荷を有する親水
性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設け
てもよい。また、基板によっては、その基板中に親水性
の高分子等を含ませることも可能であり、このような処
理を施した基板も好ましく用いることができる。表面処
理を行うことによって、疎水性の基板、あるいは親水性
に乏しい基板と核酸断片との静電的な相互作用を促進す
ることができる。このような場合、基板としては、表面
処理の容易さと解析の容易さのため、スライドガラスを
用いることが好ましい。
【００２３】合成ヌクレオチドを固定する場合には、基
板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合
のための官能基を導入したオリゴマーを合成し、表面処
理した基板に共有結合させる方法を用いることができ
る。官能基としてはアミノ基、アルデヒド基、メルカプ
ト基、ビオチン等を挙げることができる。基板として
は、ガラスやシリコンを用いることが好ましく、ガラス
やシリコンの表面処理には公知のシランカップリング剤
を用いることが好ましい。
板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合
のための官能基を導入したオリゴマーを合成し、表面処
理した基板に共有結合させる方法を用いることができ
る。官能基としてはアミノ基、アルデヒド基、メルカプ
ト基、ビオチン等を挙げることができる。基板として
は、ガラスやシリコンを用いることが好ましく、ガラス
やシリコンの表面処理には公知のシランカップリング剤
を用いることが好ましい。
【００２４】基板上に固定される核酸は検出対象の試料
核酸であってもよいが、以下、便宜上、基板に固定する
核酸をプローブ核酸（以下、プローブ核酸の代表例とし
て「ＤＮＡ断片」について説明する。）とし、該プロー
ブ核酸に相互作用させる核酸を試料核酸として説明す
る。
核酸であってもよいが、以下、便宜上、基板に固定する
核酸をプローブ核酸（以下、プローブ核酸の代表例とし
て「ＤＮＡ断片」について説明する。）とし、該プロー
ブ核酸に相互作用させる核酸を試料核酸として説明す
る。
【００２５】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅して
調製する。ＰＣＲ法によって増幅しないＤＮＡ断片も好
ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多
型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、
変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成
し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列
分析の場合には、４n（ｎは塩基の長さ）種のオリゴヌ
クレオチドを合成したものを使用することが好ましい。
ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によ
って予めその配列が決定されていることが好ましい。Ｄ
ＮＡ断片は、２〜５０量体であることが好ましく、１０
〜２５量体であることが特に好ましい。
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅して
調製する。ＰＣＲ法によって増幅しないＤＮＡ断片も好
ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多
型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、
変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成
し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列
分析の場合には、４n（ｎは塩基の長さ）種のオリゴヌ
クレオチドを合成したものを使用することが好ましい。
ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によ
って予めその配列が決定されていることが好ましい。Ｄ
ＮＡ断片は、２〜５０量体であることが好ましく、１０
〜２５量体であることが特に好ましい。
【００２６】ＤＮＡ断片の固相担体上への点着は、例え
ば、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解又は分散して水性液を
調製し、この水性液を９６穴又は３８４穴プラスチック
プレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等
を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好まし
い。
ば、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解又は分散して水性液を
調製し、この水性液を９６穴又は３８４穴プラスチック
プレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等
を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好まし
い。
【００２７】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片を溶解又は分散させた水性液中に高沸点の物
質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断
片を溶解又は分散させた水性液に溶解し得るものであっ
て、ＤＮＡ断片と試料核酸とのハイブリダイゼーション
を妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質が好ま
しい。このような物質としては、グリセリン、エチレン
グリコール、ジメチルスルホキシド、及び低分子の親水
性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとし
ては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、
ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポ
リマーの分子量は１０3〜１０5の範囲にあることが好ま
しい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチ
レングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセ
リンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度
は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１〜２容量％の範囲に
あることが好ましく、０．５〜１容量％の範囲にあるこ
とが特に好ましい。また、同じ目的のために、ＤＮＡ断
片を点着した後の固相担体を９０％以上の湿度及び２５
〜５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
ＤＮＡ断片を溶解又は分散させた水性液中に高沸点の物
質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断
片を溶解又は分散させた水性液に溶解し得るものであっ
て、ＤＮＡ断片と試料核酸とのハイブリダイゼーション
を妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質が好ま
しい。このような物質としては、グリセリン、エチレン
グリコール、ジメチルスルホキシド、及び低分子の親水
性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとし
ては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、
ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポ
リマーの分子量は１０3〜１０5の範囲にあることが好ま
しい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチ
レングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセ
リンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度
は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１〜２容量％の範囲に
あることが好ましく、０．５〜１容量％の範囲にあるこ
とが特に好ましい。また、同じ目的のために、ＤＮＡ断
片を点着した後の固相担体を９０％以上の湿度及び２５
〜５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００２８】ＤＮＡ断片を固相担体に点着後、紫外線、
水素化ホウ素ナトリウム、又はシッフ試薬などによる後
処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を
組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理など
を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後にイン
キュベーションを行うことも好ましい。インキュベート
後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ま
しい。
水素化ホウ素ナトリウム、又はシッフ試薬などによる後
処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を
組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理など
を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後にイン
キュベーションを行うことも好ましい。インキュベート
後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ま
しい。
【００２９】ＤＮＡ断片の密度は、固相担体表面に対し
て１０2〜１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好まし
い。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０-15モルの範囲であ
り、質量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点
着によって、ＤＮＡ断片の水性液は固相担体表面にドッ
トの形状で固定される。ドットの形状は通常ほとんど円
形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量
的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドッ
ト間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ま
しく、１００〜３００μｍの範囲にあることが特に好ま
しい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μ
ｍの範囲にあることが好ましい。点着する水性液の容量
は１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、１
〜１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
て１０2〜１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好まし
い。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０-15モルの範囲であ
り、質量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点
着によって、ＤＮＡ断片の水性液は固相担体表面にドッ
トの形状で固定される。ドットの形状は通常ほとんど円
形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量
的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドッ
ト間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ま
しく、１００〜３００μｍの範囲にあることが特に好ま
しい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μ
ｍの範囲にあることが好ましい。点着する水性液の容量
は１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、１
〜１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００３０】上記の工程によって作製されたＤＮＡ断片
が固定された固相担体（以下、「ＤＮＡチップ」とい
う）の寿命は、ｃＤＮＡを固定したｃＤＮＡチップでは
数週間、オリゴＤＮＡを固定したオリゴＤＮＡチップで
はさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝
子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多
型解析等に利用できる。
が固定された固相担体（以下、「ＤＮＡチップ」とい
う）の寿命は、ｃＤＮＡを固定したｃＤＮＡチップでは
数週間、オリゴＤＮＡを固定したオリゴＤＮＡチップで
はさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝
子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多
型解析等に利用できる。
【００３１】試料核酸としては、その配列や機能が未知
であるＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を含む試料を用いるこ
とが好ましい。試料核酸は、遺伝子発現を調べる目的で
は、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが
好ましい。試料がゲノムである場合には、赤血球を除く
任意の組織サンプルから試料核酸を単離することができ
る。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液りンパ球、皮
膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮ
Ａの場合には、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから
抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応によ
りｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、
シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）若しくはチミン（Ｔ）
であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り
込ませてｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとし
ては、化学的な安定性の観点からｄＣＴＰを用いること
が好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍ
ＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ
以下であることが好ましい。ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断
片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸は低分子化
しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮ
Ａの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識するこ
とが好ましい。
であるＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を含む試料を用いるこ
とが好ましい。試料核酸は、遺伝子発現を調べる目的で
は、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが
好ましい。試料がゲノムである場合には、赤血球を除く
任意の組織サンプルから試料核酸を単離することができ
る。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液りンパ球、皮
膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮ
Ａの場合には、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから
抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応によ
りｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、
シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）若しくはチミン（Ｔ）
であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り
込ませてｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとし
ては、化学的な安定性の観点からｄＣＴＰを用いること
が好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍ
ＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ
以下であることが好ましい。ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断
片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸は低分子化
しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮ
Ａの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識するこ
とが好ましい。
【００３２】ハイブリダイゼーションは、試料核酸を溶
解又は分散させた水性液を９６穴又は３８４穴プラスチ
ックプレートに分注しておき、上記で作製したＤＮＡチ
ップ上のＤＮＡ断片の位置に点着することによって行う
ことができる。点着すべき水性液の容量は、例えば１〜
１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイ
ゼーションは、通常、室温〜７０℃の温度範囲で６〜２
０時間の範囲で行うことができる。
解又は分散させた水性液を９６穴又は３８４穴プラスチ
ックプレートに分注しておき、上記で作製したＤＮＡチ
ップ上のＤＮＡ断片の位置に点着することによって行う
ことができる。点着すべき水性液の容量は、例えば１〜
１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイ
ゼーションは、通常、室温〜７０℃の温度範囲で６〜２
０時間の範囲で行うことができる。
【００３３】ハイブリダイゼーション終了後、界面活性
剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の
試料核酸を除去することが好ましい。界面活性剤として
は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが
好ましく、緩衝液としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩
衝液、ホウ酸緩衝被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を
用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが
特に好ましい。もっとも、ハイブリダイゼーションに際
して一般式（Ｉ）で表される化合物を共存させ、ハイブ
リッド多重鎖核酸と該化合物とを相互作用させる場合に
は、上記と同様に洗浄を行ってもよいが、蛍光共鳴エネ
ルギー移動現象を利用してエネルギー移動の結果として
生じる発光を検出する場合などには洗浄を行わず、その
まま光学的検出を行うことも可能である。
剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の
試料核酸を除去することが好ましい。界面活性剤として
は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが
好ましく、緩衝液としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩
衝液、ホウ酸緩衝被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を
用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが
特に好ましい。もっとも、ハイブリダイゼーションに際
して一般式（Ｉ）で表される化合物を共存させ、ハイブ
リッド多重鎖核酸と該化合物とを相互作用させる場合に
は、上記と同様に洗浄を行ってもよいが、蛍光共鳴エネ
ルギー移動現象を利用してエネルギー移動の結果として
生じる発光を検出する場合などには洗浄を行わず、その
まま光学的検出を行うことも可能である。
【００３４】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、試料核酸の使用量が非常に少ないことで
ある。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長
や試料核酸の種類によりハイブリダイゼーションの最適
条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低
発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイ
ブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異
の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うこ
とが好ましい。
ョンの特徴は、試料核酸の使用量が非常に少ないことで
ある。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長
や試料核酸の種類によりハイブリダイゼーションの最適
条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低
発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイ
ブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異
の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うこ
とが好ましい。
【００３５】２種以上の多重鎖核酸親和性化合物をハイ
ブリッド多重鎖核酸に対して相互作用させる工程は、上
記ハイブリダイゼーションと同時に行ってもよいが、ハ
イブリダイゼーションのあとに行ってもよい。２種以上
の多重鎖核酸親和性化合物をハイブリダイゼーションの
工程において混合してもよく、あるいはハイブリダイゼ
ーション工程において１種以上の多重鎖核酸親和性化合
物を混合し、ハイブリダイゼーションの後に上記とは異
なる１種以上の多重鎖核酸親和性化合物を混合してもよ
い。相互作用工程の温度は特に限定されないが、ハイブ
リダイゼーションに際して多重鎖核酸親和性化合物を添
加する場合にはすでに説明したハイブリダイゼーション
の温度で行えばよく、ハイブリダイゼーションの後に多
重鎖核酸親和性化合物を添加する場合には、ハイブリッ
ド多重鎖核酸が解離しない温度で行う必要がある。例え
ば、１０℃〜７０℃の範囲が好ましく、２５℃〜６５℃
の範囲がより好ましい。
ブリッド多重鎖核酸に対して相互作用させる工程は、上
記ハイブリダイゼーションと同時に行ってもよいが、ハ
イブリダイゼーションのあとに行ってもよい。２種以上
の多重鎖核酸親和性化合物をハイブリダイゼーションの
工程において混合してもよく、あるいはハイブリダイゼ
ーション工程において１種以上の多重鎖核酸親和性化合
物を混合し、ハイブリダイゼーションの後に上記とは異
なる１種以上の多重鎖核酸親和性化合物を混合してもよ
い。相互作用工程の温度は特に限定されないが、ハイブ
リダイゼーションに際して多重鎖核酸親和性化合物を添
加する場合にはすでに説明したハイブリダイゼーション
の温度で行えばよく、ハイブリダイゼーションの後に多
重鎖核酸親和性化合物を添加する場合には、ハイブリッ
ド多重鎖核酸が解離しない温度で行う必要がある。例え
ば、１０℃〜７０℃の範囲が好ましく、２５℃〜６５℃
の範囲がより好ましい。
【００３６】多重鎖核酸親和性化合物をハイブリッド多
重鎖核酸に対して接触させる際の溶媒としては、水又は
各種緩衝液のほか、水に混和しうる有機溶媒と水との混
合溶媒を適宜用いることができる。水に混和しうる有機
溶媒としてはジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミド、メタノール、エタノール、エチレングリコール、
グリセリンなどが好ましい。また、緩衝液とこれらの有
機溶媒を混合して用いることも好ましい。
重鎖核酸に対して接触させる際の溶媒としては、水又は
各種緩衝液のほか、水に混和しうる有機溶媒と水との混
合溶媒を適宜用いることができる。水に混和しうる有機
溶媒としてはジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミド、メタノール、エタノール、エチレングリコール、
グリセリンなどが好ましい。また、緩衝液とこれらの有
機溶媒を混合して用いることも好ましい。
【００３７】多重鎖核酸親和性化合物の使用量は、用い
るプローブ核酸の種類や塩基数などの条件により異なる
が、プローブ核酸の総塩基数に対して１０-3〜１０7倍
程度、さらに好ましくは１０-2〜１０5倍程度の分子数
を供給するように溶液濃度を調整することが好ましい。
また、本発明の方法において、２種以上の多重鎖核酸親
和性化合物は、それぞれこの範囲で使用することがで
き、それぞれの化合物のクロモフォアの発光量子収率に
合わせて検出感度が最適になるように使用量を調節する
ことができる。
るプローブ核酸の種類や塩基数などの条件により異なる
が、プローブ核酸の総塩基数に対して１０-3〜１０7倍
程度、さらに好ましくは１０-2〜１０5倍程度の分子数
を供給するように溶液濃度を調整することが好ましい。
また、本発明の方法において、２種以上の多重鎖核酸親
和性化合物は、それぞれこの範囲で使用することがで
き、それぞれの化合物のクロモフォアの発光量子収率に
合わせて検出感度が最適になるように使用量を調節する
ことができる。
【００３８】多重鎖核酸親和性化合物をハイブリッド多
重鎖核酸に接触させた後、過剰の多重鎖核酸親和性化合
物を除去するために洗浄を行うことが好ましい。この場
合にはハイブリダイゼーション後の洗浄と同様の操作で
行うことができる。もっとも、本発明の方法ではこの洗
浄を行わなくても光学的検出が可能であり、洗浄操作を
省略することも好ましい。
重鎖核酸に接触させた後、過剰の多重鎖核酸親和性化合
物を除去するために洗浄を行うことが好ましい。この場
合にはハイブリダイゼーション後の洗浄と同様の操作で
行うことができる。もっとも、本発明の方法ではこの洗
浄を行わなくても光学的検出が可能であり、洗浄操作を
省略することも好ましい。
【００３９】多重鎖核酸親和性化合物間の相互作用を光
学的手段により検出することができるが、溶液系でハイ
ブリッド多重鎖核酸を検出する場合には、通常の蛍光光
度計を用いることもでき、あるいは多数同時検出が可能
な点及び感度の点などから蛍光スキャナーを用いて行う
ことも好ましい。また、蛍光量の測定は、ハイブリダイ
ゼーション後の固相担体を乾燥させるか、あるいは水性
溶媒の存在下に、従来の蛍光レーザースキャナー法によ
って行ってもよく、あるいは固相担体を乾燥させないよ
うにカバーガラスで覆い、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）
法によって測定を行ってもよい。
学的手段により検出することができるが、溶液系でハイ
ブリッド多重鎖核酸を検出する場合には、通常の蛍光光
度計を用いることもでき、あるいは多数同時検出が可能
な点及び感度の点などから蛍光スキャナーを用いて行う
ことも好ましい。また、蛍光量の測定は、ハイブリダイ
ゼーション後の固相担体を乾燥させるか、あるいは水性
溶媒の存在下に、従来の蛍光レーザースキャナー法によ
って行ってもよく、あるいは固相担体を乾燥させないよ
うにカバーガラスで覆い、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）
法によって測定を行ってもよい。
【００４０】本発明の方法を行うにあたり、核酸試料を
適宜の手段で標識しておき、多重鎖核酸親和性化合物に
よる検出と組み合わせてハイブリッド多重鎖核酸を検出
してもよい。例えば、核酸試料を蛍光色素で標識してお
いてもよく、あるいはＲＩ法、非ＲＩ法としてビオチン
法又は化学発光法などの標識手段を採用できる。例え
ば、蛍光物質としては核酸の塩基部分と結合できるもの
であれば何れも用いることができるが、シアニン色素
（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５
等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−ア
セチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ
（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
適宜の手段で標識しておき、多重鎖核酸親和性化合物に
よる検出と組み合わせてハイブリッド多重鎖核酸を検出
してもよい。例えば、核酸試料を蛍光色素で標識してお
いてもよく、あるいはＲＩ法、非ＲＩ法としてビオチン
法又は化学発光法などの標識手段を採用できる。例え
ば、蛍光物質としては核酸の塩基部分と結合できるもの
であれば何れも用いることができるが、シアニン色素
（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５
等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−ア
セチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ
（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【００４１】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 （１）ＤＮＡ断片固定スライドの作成 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を３質量％化合物ＶＳ−１
溶液に、１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄
後、１２０℃で１５分間乾燥して、ＶＳ−１被覆スライ
ド（Ｂ）を作成した。
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 （１）ＤＮＡ断片固定スライドの作成 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を３質量％化合物ＶＳ−１
溶液に、１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄
後、１２０℃で１５分間乾燥して、ＶＳ−１被覆スライ
ド（Ｂ）を作成した。
【００４２】
【化１】
【００４３】（２）ハイブリッド多重核酸の検出
３’未端がアミノ基で修飾された配列表の配列番号１に
示すＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に
分散した水性液（１×１０-6Ｍ、１μＬ）を上記（１）
で得たスライド（Ｃ）に点着した。直ちに、点着後のス
ライドを６０℃、湿度９０％にて１時間放置した後、１
２０℃で２０分間加熱した。このスライドを０．１質量
％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２
×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳ
Ｃ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、
０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上
記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ
１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、
室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド
（Ｄ）を得た。
示すＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に
分散した水性液（１×１０-6Ｍ、１μＬ）を上記（１）
で得たスライド（Ｃ）に点着した。直ちに、点着後のス
ライドを６０℃、湿度９０％にて１時間放置した後、１
２０℃で２０分間加熱した。このスライドを０．１質量
％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２
×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳ
Ｃ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、
０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上
記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ
１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、
室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド
（Ｄ）を得た。
【００４４】このスライドに対して先ほどのＤＮＡ配列
と相補的な配列を有する６０m e rのＤＮＡをハイブリ
ダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣおよび１０質量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させ、多重鎖核
酸親和性化合物（比較例１、比較例２、本発明１、及び
本発明２として下記に示した。各々０．１ｍＭのジメチ
ルスルホキシド溶液を１μＬ）を添加して上記で得たス
ライド（Ｄ）に付与し、表面を顕微鏡用カバーガラスで
保護した後、モイスチャンバー内にて６０℃で１０時間
インキュベートした。次いで、このスライドを０．１質
量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液で１０秒間洗浄し
た後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥し
た。
と相補的な配列を有する６０m e rのＤＮＡをハイブリ
ダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣおよび１０質量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させ、多重鎖核
酸親和性化合物（比較例１、比較例２、本発明１、及び
本発明２として下記に示した。各々０．１ｍＭのジメチ
ルスルホキシド溶液を１μＬ）を添加して上記で得たス
ライド（Ｄ）に付与し、表面を顕微鏡用カバーガラスで
保護した後、モイスチャンバー内にて６０℃で１０時間
インキュベートした。次いで、このスライドを０．１質
量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液で１０秒間洗浄し
た後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥し
た。
【００４５】それぞれをスライドガラス表面の蛍光強度
を蛍光スキャニング装置で測定した。励起波長は短波長
側の色素の最大吸収波長にできるだけ近い波長で励起
し、検出波長はフィルターを調節して最大値が得られる
ようにした。また、同様の実験を相補的な配列を有する
６０ｍｅｒを添加しない実験を行った。本発明１及び２
のサンプルではバックグラウンド（相補鎖なしの時の蛍
光強度）が低いレベルを保ったまま高いシグナルを与え
たが、比較例のサンプルでは発光量子収率が低いもの
（比較例１）と高いもの（比較例２）のいずれにおいて
も本発明１及び２のサンプルに比較して劣っていた。な
お、比較例１では比較例１の化合物を励起して該化合物
からの発光を検出しう、本発明１及び本発明２のサンプ
ルにおいては短波長側の化合物を励起し、長波長側の化
合物からの発光を検出した。
を蛍光スキャニング装置で測定した。励起波長は短波長
側の色素の最大吸収波長にできるだけ近い波長で励起
し、検出波長はフィルターを調節して最大値が得られる
ようにした。また、同様の実験を相補的な配列を有する
６０ｍｅｒを添加しない実験を行った。本発明１及び２
のサンプルではバックグラウンド（相補鎖なしの時の蛍
光強度）が低いレベルを保ったまま高いシグナルを与え
たが、比較例のサンプルでは発光量子収率が低いもの
（比較例１）と高いもの（比較例２）のいずれにおいて
も本発明１及び２のサンプルに比較して劣っていた。な
お、比較例１では比較例１の化合物を励起して該化合物
からの発光を検出しう、本発明１及び本発明２のサンプ
ルにおいては短波長側の化合物を励起し、長波長側の化
合物からの発光を検出した。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【化２】
【００４８】
【化３】
【００４９】
【化４】
【００５０】
【化５】
【００５１】例２：ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの検出
例１において、スライドガラス表面に固定した６０ｍｅ
ｒのＤＮＡの代わりに４０ｍｅｒのオリゴデオキシＡを
固定し、相補的な配列としてオリゴＵを使用した以外は
まったく同様の実験を行ったところ、例１と同様の結果
が得られた。
ｒのＤＮＡの代わりに４０ｍｅｒのオリゴデオキシＡを
固定し、相補的な配列としてオリゴＵを使用した以外は
まったく同様の実験を行ったところ、例１と同様の結果
が得られた。
【００５２】
【発明の効果】本発明の方法では、特定の蛍光量子収率
を有するクロモフォアを持つ多重鎖核酸親和性化合物を
２種以上用い、それらの化合物間の相互作用の結果とし
て生じる発光を検出するため、高いシグナル強度が得ら
れる。この結果、発光ＤＮＡチップなどを用いた試料核
酸の検出においてＤＮＡ／ＤＮＡ及びＲＮＡ／ＤＮＡな
どのハイブリッド多重鎖核酸を煩雑な標識操作や洗浄操
作を行わずに高感度に検出できる。
を有するクロモフォアを持つ多重鎖核酸親和性化合物を
２種以上用い、それらの化合物間の相互作用の結果とし
て生じる発光を検出するため、高いシグナル強度が得ら
れる。この結果、発光ＤＮＡチップなどを用いた試料核
酸の検出においてＤＮＡ／ＤＮＡ及びＲＮＡ／ＤＮＡな
どのハイブリッド多重鎖核酸を煩雑な標識操作や洗浄操
作を行わずに高感度に検出できる。
【００５３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co. Ltd.
<120> Method for detecting nucleic acid
<130> A11354M
<160> 1
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
GCTGCTGCTG GGCCAGTGGT TCCTCCATGT CCGGGGAGGA TCAGACACTT CAAGGTCTAG 60
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
// Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ
Ｆターム(参考） 2G054 CA22 GA04 GB02
4B024 AA11 CA05 CA06 HA11 HA12
HA13
4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR08
QR31 QR32 QR42 QR56 QR66
QR82 QS03 QS34 QX02
Claims (4)
- 【請求項１】 プローブ核酸に対して試料核酸を相互作
用させ、該プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイ
ゼーションによりハイブリッド多重鎖核酸を形成させる
工程を含み、上記ハイブリッド多重鎖核酸に対して２種
以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物を相互作用さ
せ、該２種以上の多重鎖核酸親和性化合物間で起こる相
互作用の結果として生じる発光を検出する方法であっ
て、２種以上の発光性の多重鎖核酸親和性化合物として
それぞれ発光量子収率が０．１〜０．９のクロモフォア
を有する化合物を用いる方法。 - 【請求項２】 プローブ核酸が固相担体上に固定されて
いる請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 発光性の多重鎖核酸親和性化合物が下記
一般式（Ｉ）： （ＩＣ）−〔(Ｌ)m−(ＳＩＧ)q〕n （式中、ＩＣは多重鎖核酸との親和性を有する基を示
し；Ｌは２価の連結基を示し；ＳＩＧは発光量子収率が
０．１〜０．９のクロモフォアを示し；ｎは２、３、又
は４の整数を示し；ｍは０又は１を示し；ｑは０又は１
を示すが、ただしｎ個の (Ｌ)m−(ＳＩＧ)qにおいてす
べてのｑが０であることはなく、ｎ個の (Ｌ) m−(ＳＩ
Ｇ)qにおいて、それぞれのＬ、ｍ、ＳＩＧ、ｑは同一で
あっても異なっていてもよい）で表される化合物である
請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 請求項１又は２の方法に用いるための請
求項３に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001247537A JP2003052377A (ja) | 2001-08-17 | 2001-08-17 | 核酸の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001247537A JP2003052377A (ja) | 2001-08-17 | 2001-08-17 | 核酸の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003052377A true JP2003052377A (ja) | 2003-02-25 |
Family
ID=19076855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001247537A Pending JP2003052377A (ja) | 2001-08-17 | 2001-08-17 | 核酸の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003052377A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005012731A1 (ja) | 2003-07-30 | 2005-02-10 | Mitsubishi Heavy Industries, Ltd. | ポンプ |
-
2001
- 2001-08-17 JP JP2001247537A patent/JP2003052377A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005012731A1 (ja) | 2003-07-30 | 2005-02-10 | Mitsubishi Heavy Industries, Ltd. | ポンプ |
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