JP2003052397A

JP2003052397A - 核酸の検出法

Info

Publication number: JP2003052397A
Application number: JP2001247535A
Authority: JP
Inventors: Takemare Nakamura; 剛希中村
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2001-08-17
Filing date: 2001-08-17
Publication date: 2003-02-25

Abstract

(57)【要約】【課題】多重鎖核酸を簡便かつ高精度に検出する方法
を提供する。【解決手段】プローブ核酸に対して試料核酸を相互作
用させ、該プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイ
ゼーションによりハイブリッド多重鎖核酸を形成させる
工程を含み、上記ハイブリッド多重鎖核酸に対して２種
以上の多重鎖核酸親和性化合物（該化合物は単鎖核酸と
多重鎖核酸の識別比が１より大きい）を相互作用させ、
該化合物間の相互作用を検出することによって上記ハイ
ブリッド多重鎖核酸を検出する方法であって、該化合物
のうち少なくとも１種の化合物の上記識別比が５以上で
あるか、または該化合物のうち少なくとも２種の化合物
の上記識別比がそれぞれ３以上である方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、多重鎖核酸を簡便
かつ高精度に検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト遺伝子配列の解析がほぼ終了し、今
後これらの情報を元に遺伝子の機能解明が急速に進むも
のと予想されている。ＤＮＡチップは、スライドガラス
等の固相担体に多数のＤＮＡ分子を整列させたマイクロ
アレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等の同時解
析に非常に有用である。このＤＮＡチップを用いるＤＮ
Ａチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能で
あり、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギ
ーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供する
ものとして期待されている。

【０００３】ＤＮＡチップ技術の具体化は、ＤＮＡの塩
基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーショ
ンによって決定する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案された
ことに始まる（Ｄr m a n ac，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ１１４（１９８
９）），ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定
法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化には至
らなかった。その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べるいわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏｒ，
Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ７
６７（１９９１）及びＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２７０，ｐａｇｅ４６７（１９９５））。

【０００４】しかしながら、ＤＮＡチップ作製技術を実
用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオ
チドを固相担体表面に整列させるためのＤＮＡチップの
作製技術が必要とされるほか、作製されたＤＮＡチップ
上のＤＮＡ断片と試料核酸断片とのハイブリダイゼーシ
ョンを高感度かつ正確に検出する技術も必要となる。一
般的には、試料核酸断片を標識した後にハイブリダイゼ
ーションさせることにより検出が行なわれるが、この標
識工程は各試料毎に行う必要があり、標識反応の他に標
識された核酸と反応せずに残存する標識用化合物とを分
離するための精製工程も必要になるなど煩雑である。

【０００５】この煩雑な標識工程を省略する方法とし
て、例えば特開平５−１９９８９８号公報に記載されて
いるように、インターカレーターを用いてハイブリダイ
ゼーションにより形成される多重鎖核酸のみを検出する
方法が提案されている。共有結合による標識が検出対象
核酸を変成させ、正確なハイブリダイゼーションを阻害
してしまう懸念があるのに対して、インターカレーター
を用いる方法は標識工程を不要にするばかりでなく、上
記問題を解消できる可能性があるものと考えられてい
る。

【０００６】上記特開平５−１９９８９８号公報に記載
されているインターカレーターは検出を電気化学的に行
うものであり、電気化学的な検出のために装置の小型化
が可能であるなどいくつかの有利な点はあるものの、電
気化学的に検出を行うためにプローブ核酸を電極表面に
固定する必要があるため、電極の作成や電極表面への核
酸の固定化などいくつかの新たな難しい課題が生じてし
まう。

【０００７】このような理由から、現在広く行われてい
る蛍光スキャナーを用いて検出を行う方法に適したイン
ターカレーターの開発が望まれている。しかし、これま
でに知られているインターカレーターは多重鎖核酸と相
互作用しうるばかりでなく、試料となる単鎖核酸とも相
互作用し、その選択性が不十分であるという問題を有し
ている。この問題以外にも、多重鎖核酸検出用のインタ
ーカレーターとして具備すべき条件として、高い感度、
高いＳ／Ｎを実現するため、多重鎖核酸へのインターカ
レート効率が高いこと、インターカレートした状態とし
ていない状態とでインターカレーターから発せられるシ
グナル強度が大きく異なることなどが要求される。ま
た、蛍光色素を結合した形のインターカレーターにおい
ては、高い蛍光色素の発光効率のほか、可視領域に吸収
極大を有するなど蛍光スキャナーの励起光源及び検出波
長に適性を有していることが必要であり、波長調節性の
高い色素骨格が望まれている。以上の条件を満たすイン
ターカレーターが強く望まれているが、実用的なレベル
のものが見出されているとは言えない状況にある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、多重
鎖核酸の検出方法を提供することにある。より具体的に
は、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡアレイなどの遺伝子解
析に利用可能な多重鎖核酸の検出方法を提供することに
あり、検出シグナルの強度向上と高いＳ／Ｎ比を与える
多重核酸の検出方法を提供することが本発明の課題であ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決すべく鋭意努力し、単鎖核酸よりも多重鎖核酸に
対して選択的な親和性を有する化合物（以下、この性質
を有する化合物を「多重鎖核酸親和性化合物」と称す
る。）の２種以上を組み合わせてハイブリダイゼーショ
ンにより生成した多重鎖核酸に相互作用させ、これらの
多重鎖核酸親和性化合物の相互作用により発せられるシ
グナルを検出することによって、１種類のみの多重鎖核
酸親和性化合物から得られるシグナルよりも極めて高い
Ｓ／Ｎ比が得られることを見出した。また、上記の組み
合わせにおいて、多重鎖核酸に対して高い識別比を有す
る多重鎖核酸親和性化合物を用いると、さらに高いＳ／
Ｎが得られることを見出した。本発明は上記の知見に基
づいて完成された。

【００１０】すなわち、本発明は、プローブ核酸に対し
て試料核酸を相互作用させ、該プローブ核酸と該試料核
酸とのハイブリダイゼーションによりハイブリッド多重
鎖核酸を形成させる工程を含み、上記ハイブリッド多重
鎖核酸に対して２種以上の多重鎖核酸親和性化合物（該
化合物は単鎖核酸と多重鎖核酸の識別比が１より大き
い）を相互作用させ、該化合物間の相互作用を検出する
ことによって上記ハイブリッド多重鎖核酸を検出する方
法であって、該化合物のうち少なくとも１種の化合物の
上記識別比が５以上であるか、または該化合物のうち少
なくとも２種の化合物の上記識別比がそれぞれ３以上で
ある方法を提供するものである。

【００１１】本発明の好ましい態様によれば、プローブ
核酸が固相担体上に固定されている上記の方法；多重鎖
核酸親和性を有する化合物の少なくとも１種が発光性化
合物である上記の方法；及び多重鎖核酸親和性を有する
化合物の少なくとも１種がインターカレーターである上
記方法が提供される。

【００１２】

【発明の実施の形態】本明細書において、多重鎖核酸と
は核酸が相補的配列に由来する相互作用により集合した
状態を指している（相互作用による多重鎖核酸の生成過
程を「ハイブリダイゼーション」と呼ぶ場合がある）。
多重鎖核酸は二本鎖、三本鎖、又は四本鎖などの状態を
とることが知られており、本明細書における多重鎖核酸
にはこれらの多重鎖も包含される。核酸としてはＤＮＡ
又はＲＮＡのほか、これらの化学修飾体が数多く知られ
ており、さらにＰＮＡと呼ばれるポリペプチド鎖を主鎖
に有する核酸類縁体なども知られているが、本明細書に
おける多重鎖核酸にはこれらがすべて包含される。本発
明においてより好ましく用いられる核酸はＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、及びこれらの化学修飾体であり、二本鎖、三本鎖、
又は四本鎖の中では二本鎖が好ましい。プローブ核酸と
試料核酸とのハイブリダイゼーションにより生成される
多重鎖核酸を本明細書において「ハイブリッド多重鎖核
酸」と呼ぶ。

【００１３】本明細書において多重鎖核酸親和性化合物
について用いられる「単鎖核酸と多重鎖核酸の識別比」
という用語は、多重鎖核酸親和性化合物の単鎖核酸への
親和性に対する該化合物の多重鎖核酸への親和性の比
（すなわち該化合物の単鎖核酸への親和性を１とした場
合の該化合物の多重鎖核酸への親和性）を意味する。本
発明の方法において用いられる多重鎖核酸親和性化合物
は上記の識別比が１より大きい化合物である。

【００１４】上記の識別比は、多重鎖核酸として２本鎖
ＤＮＡを用いる場合には、以下の方法に従って測定する
ことができる。固相担体上に固定した単鎖ＤＮＡに測定
対象の多重鎖核酸親和性化合物を相互作用させ、必要に
応じて洗浄を行った後に信号を検出する。次に別途、先
ほどと同じＤＮＡを固相担体上に固定し、該ＤＮＡに相
補的な配列を有するＤＮＡをハイブリダイゼーションさ
せ、同じ多重鎖核酸親和性化合物を相互作用させて信号
を検出する。識別比は（２本鎖ＤＮＡにおいて検出され
る信号強度）／（単鎖ＤＮＡにおいて検出される信号強
度）で表すことができる。この時の信号検出には、広く
用いられている蛍光スキャナーや特開平５−１９９８９
８号公報に記載された電気化学検出における電流値を用
いることもでき、あるいは特開平１１−３３２５９５号
公報、特開２００１−１８３２９２号公報に記載されて
いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）などの方法を使用す
ることができる。識別比の上限は特に制限されず、大き
ければ大きいほど望ましいが、一般的には１０⁸以下、
好ましくは１０⁶以下程度である。

【００１５】多重鎖核酸親和性化合物の間の相互作用と
しては、多重鎖核酸親和性化合物が接近した場合に著し
く強度が大きくなる相互作用を利用し、その相互作用に
よるシグナルを検出することが好ましい。このような相
互作用としては、例えば、電子移動又はエネルギー移動
などを有利に利用できる。電子移動の場合には、検出す
るシグナルとしてはラジカルや電流値が好ましく、エネ
ルギー移動の場合には発光を検出することが好ましい。
本発明においてはいずれも好ましく用いることができる
が、エネルギー移動による発光を検出することが最も好
ましい。

【００１６】多重鎖核酸親和性化合物としては、例えば
核酸染色剤を挙げることができる。核酸染色剤として
は、臭化エチジウムをはじめとして、モレキュラー・プ
ローブス社のHandbook of Fluorescent Probes and Res
earch Chemicals 8th Edition（Molecular Probes社刊
ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）の中に核酸染色剤として記
載されている種々の化合物が知られている。これらの色
素の多くは核酸が存在しない場合には蛍光強度が小さ
く、核酸との相互作用により高い蛍光強度を示すことが
知られている。

【００１７】本発明で特に好ましく用いられる多重鎖核
酸親和性化合物は以下の一般式（Ｉ）で表される。一般式（Ｉ）：（ＩＣ）−〔(Ｌ)_m−(ＳＩＧ)_q〕_n （式中、ＩＣは多重鎖核酸との親和性を有する基を示
し；Ｌは２価の連結基を示し；ＳＩＧは検出可能なシグ
ナルを発する基を示し；ｎは２、３、又は４の整数を示
し；ｍは０又は１を示し；ｑは０又は１を示すが、ただ
しｎ個の (Ｌ)_m−(ＳＩＧ)_qにおいてすべてのｑが０で
あることはなく、ｎ個の (Ｌ)_m−(ＳＩＧ)_qにおいて、
それぞれのＬ、ｍ、ＳＩＧ、ｑは同一であっても異なっ
ていてもよい）

【００１８】一般式（Ｉ）において、好ましいＩＣとし
ては平面３環性構造または平面４環性構造を有する基を
挙げることができる。平面３環性構造の例としては、例
えば、アントラセン、アントラキノン、フェナントレ
ン、フェナントロリン、キサンテン、カルバゾール、フ
ェナントリジン、フェナジン、アクリジンなどが挙げら
れる。平面４環性構造の例としては、平面３環性構造の
例として挙げたものにさらに平面性の環構造を縮合させ
たものが挙げられる。より好ましい構造としては「分析
化学」、第４８巻、１２号、１０９５頁−１１０５頁
（１９９９年）に記載の縫い込み型インターカレーター
として記載されている骨格が挙げられる。

【００１９】Ｌは−Ｃ(Ｒ)(Ｒ')−、−Ｏ−、−Ｎ(Ｒ)
−、−Ｎ⁺(Ｒ)(Ｒ')−・Ｘ^-、−Ｓ(Ｏ) _r−、−ＣＯ−、
−Ｓ(＝ＮＲ)_t−又はアリーレン基の中から選ばれる２
価の基、又はこれらを組み合わせて得られる２価の基が
好ましい。Ｒ及びＲ'はそれぞれ独立に水素原子、アル
キル基、アリール基、アルコキシ基、アミノ基、ハロゲ
ン原子、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アンモ
ニオ基から選ばれる基などを示す。ｒは０、１、又は２
を表し、ｔは１又は２を示す。

【００２０】ＳＩＧは検出可能なシグナルを発する基を
表すが、発光性化合物の残基であることが最も好まし
い。発光性化合物の中では蛍光性色素が好ましく、蛍光
性色素としてはシアニン色素、オキソノール色素、又は
キサンテン色素が好ましい。ＳＩＧで表される基を与え
る特に好ましい蛍光性の色素化合物としては、例えば、
モレキュラー・プローブス社のHandbook of Fluorescen
t Probes and Research Chemicals 8th Edition（Molec
ular Probes社刊ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）の中に記
載されている色素化合物や、特開２００１−２７０９５
７号公報に記載の色素化合物、特開２００１−１６３８
９５号公報に記載の化合物の色素部分に相当するもの、
あるいはアマシャム・ファルマシア社から販売されてい
るＣｙ３又はＣｙ５などの蛍光性色素が挙げられる。

【００２１】本発明の方法の典型的態様は、下記の工
程： (1)プローブ核酸に対して試料核酸を相互作用させ、該
プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイゼーション
によりハイブリッド多重鎖核酸を形成する工程； (2)２種以上の多重鎖核酸親和性化合物を該ハイブリッ
ド多重鎖核酸に対して相互作用させる工程；及び (3)上記２種以上の多重鎖核酸親和性化合物と多重鎖核
酸とが接近することによって生じる多重鎖核酸親和性化
合物間の相互作用に由来するシグナルを検出する工程を含んでいる。

【００２２】プローブ核酸は溶液中に存在していてもよ
いが、固相担体に固定されていることが好ましい。固相
担体としては、疎水性の担体、あるいは親水性の低い担
体が好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の
低いものも好ましく用いることができる。固相担体の材
質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミック
ス若しくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタ
レート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカー
ボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等
のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質
セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕
物、不織布、減紙、短繊維、又はメンブレンフィルター
等の多孔質物質などを拳げることができる。固相担体の
形状及び大きさは特に限定されず、平板状、球状、又は
棒状等であってもよく、ナノメートルオーダーのものか
らセンチメートルオーダーのものであってもよい。多孔
質物質の細孔の大きさは、例えば２〜１０００ｎｍの範
囲にあることが好ましく、２〜５００n mの範囲にある
ことが特に好ましい。表面処理の容易さや電気化学的方
法による解析の容易さの観点から、固相担体の材質はガ
ラス又はシリコンであることが特に好ましい。平板プレ
ート状の固相担体（以下、このような形状の固相担体を
「基板」と呼ぶ場合があり、本発明の好ましい態様とし
て固相担体が基板である場合について説明する場合があ
る）の場合、固相担体の厚さは１００〜２０００μｍの
範囲にあることが好ましい。

【００２３】固相担体上へのプローブ核酸の固定化法
は、核酸断片の種類及び固相担体の種類に応じて適当な
方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素，Ｖ
ｏｌ．４３，Ｎｏ．１３，２００４−２０１１（１９９
８））。例えば、核酸断片がｃＤＮＡやＰＣＲ産物の場
合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリシン、ポリエ
チレンイミン、ポリアルキルアミン等の陽イオンで表面
処理した基板に静電結合させる方法を用いることができ
る。表面処理された基板上に、さらに電荷を有する親水
性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設け
てもよい。また、基板によっては、その基板中に親水性
の高分子等を含ませることも可能であり、このような処
理を施した基板も好ましく用いることができる。表面処
理を行うことによって、疎水性の基板、あるいは親水性
に乏しい基板と核酸断片との静電的な相互作用を促進す
ることができる。このような場合、基板としては、表面
処理の容易さと解析の容易さのため、スライドガラスを
用いることが好ましい。

【００２４】合成ヌクレオチドを固定する場合には、基
板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合
のための官能基を導入したオリゴマーを合成し、表面処
理した基板に共有結合させる方法を用いることができ
る。官能基としてはアミノ基、アルデヒド基、メルカプ
ト基、ビオチン等を挙げることができる。基板として
は、ガラスやシリコンを用いることが好ましく、ガラス
やシリコンの表面処理には公知のシランカップリング剤
を用いることが好ましい。

【００２５】基板上に固定される核酸は検出対象の試料
核酸であってもよいが、以下、便宜上、基板に固定する
核酸をプローブ核酸（以下、プローブ核酸の代表例とし
て「ＤＮＡ断片」について説明する。）とし、該プロー
ブ核酸に相互作用させる核酸を試料核酸として説明す
る。

【００２６】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅して
調製する。ＰＣＲ法によって増幅しないＤＮＡ断片も好
ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多
型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、
変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成
し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列
分析の場合には、４ⁿ（ｎは塩基の長さ）種のオリゴヌ
クレオチドを合成したものを使用することが好ましい。
ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によ
って予めその配列が決定されていることが好ましい。Ｄ
ＮＡ断片は、２〜５０量体であることが好ましく、１０
〜２５量体であることが特に好ましい。

【００２７】ＤＮＡ断片の固相担体上への点着は、例え
ば、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解又は分散して水性液を
調製し、この水性液を９６穴又は３８４穴プラスチック
プレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等
を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好まし
い。

【００２８】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片を溶解又は分散させた水性液中に高沸点の物
質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断
片を溶解又は分散させた水性液に溶解し得るものであっ
て、ＤＮＡ断片と試料核酸とのハイブリダイゼーション
を妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質が好ま
しい。このような物質としては、グリセリン、エチレン
グリコール、ジメチルスルホキシド、及び低分子の親水
性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとし
ては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、
ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポ
リマーの分子量は１０³〜１０⁵の範囲にあることが好ま
しい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチ
レングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセ
リンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度
は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１〜２容量％の範囲に
あることが好ましく、０．５〜１容量％の範囲にあるこ
とが特に好ましい。また、同じ目的のために、ＤＮＡ断
片を点着した後の固相担体を９０％以上の湿度及び２５
〜５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。

【００２９】ＤＮＡ断片を固相担体に点着後、紫外線、
水素化ホウ素ナトリウム、又はシッフ試薬などによる後
処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を
組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理など
を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後にイン
キュベーションを行うことも好ましい。インキュベート
後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ま
しい。

【００３０】ＤＮＡ断片の密度は、固相担体表面に対し
て１０²〜１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが好まし
い。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０^-15モルの範囲であ
り、質量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点
着によって、ＤＮＡ断片の水性液は固相担体表面にドッ
トの形状で固定される。ドットの形状は通常ほとんど円
形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量
的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドッ
ト間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ま
しく、１００〜３００μｍの範囲にあることが特に好ま
しい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μ
ｍの範囲にあることが好ましい。点着する水性液の容量
は１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、１
〜１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。

【００３１】上記の工程によって作製されたＤＮＡ断片
が固定された固相担体（以下、「ＤＮＡチップ」とい
う）の寿命は、ｃＤＮＡを固定したｃＤＮＡチップでは
数週間、オリゴＤＮＡを固定したオリゴＤＮＡチップで
はさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝
子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多
型解析等に利用できる。

【００３２】試料核酸としては、その配列や機能が未知
であるＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を含む試料を用いるこ
とが好ましい。試料核酸は、遺伝子発現を調べる目的で
は、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが
好ましい。試料がゲノムである場合には、赤血球を除く
任意の組織サンプルから試料核酸を単離することができ
る。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液りンパ球、皮
膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮ
Ａの場合には、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから
抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応によ
りｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、
シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）若しくはチミン（Ｔ）
であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り
込ませてｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとし
ては、化学的な安定性の観点からｄＣＴＰを用いること
が好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍ
ＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ
以下であることが好ましい。ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断
片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸は低分子化
しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮ
Ａの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識するこ
とが好ましい。

【００３３】ハイブリダイゼーションは、試料核酸を溶
解又は分散させた水性液を９６穴又は３８４穴プラスチ
ックプレートに分注しておき、上記で作製したＤＮＡチ
ップ上のＤＮＡ断片の位置に点着することによって行う
ことができる。点着すべき水性液の容量は、例えば１〜
１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイ
ゼーションは、通常、室温〜７０℃の温度範囲で６〜２
０時間の範囲で行うことができる。

【００３４】ハイブリダイゼーション終了後、界面活性
剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の
試料核酸を除去することが好ましい。界面活性剤として
は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが
好ましく、緩衝液としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩
衝液、ホウ酸緩衝被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を
用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが
特に好ましい。もっとも、ハイブリダイゼーションに際
して一般式（Ｉ）で表される化合物を共存させ、ハイブ
リッド多重鎖核酸と該化合物とを相互作用させる場合に
は、上記と同様に洗浄を行ってもよいが、蛍光共鳴エネ
ルギー移動現象を利用して他の化合物からのシグナルを
検出する方法を利用する場合などには洗浄を行わず、そ
のまま光学的検出を行うことも可能である。

【００３５】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、試料核酸の使用量が非常に少ないことで
ある。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長
や試料核酸の種類によりハイブリダイゼーションの最適
条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低
発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイ
ブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異
の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うこ
とが好ましい。

【００３６】２種以上の多重鎖核酸親和性化合物をハイ
ブリッド多重鎖核酸に対して相互作用させる工程は、上
記ハイブリダイゼーションと同時に行ってもよいが、ハ
イブリダイゼーションのあとに行ってもよい。２種以上
の多重鎖核酸親和性化合物をハイブリダイゼーションの
工程において混合してもよく、あるいはハイブリダイゼ
ーション工程において１種以上の多重鎖核酸親和性化合
物を混合し、ハイブリダイゼーションの後に上記とは異
なる１種以上の多重鎖核酸親和性化合物を混合してもよ
い。相互作用工程の温度は特に限定されないが、ハイブ
リダイゼーションに際して多重鎖核酸親和性化合物を添
加する場合にはすでに説明したハイブリダイゼーション
の温度で行えばよく、ハイブリダイゼーションの後に多
重鎖核酸親和性化合物を添加する場合には、ハイブリッ
ド多重鎖核酸が解離しない温度で行う必要がある。例え
ば、１０℃〜７０℃の範囲が好ましく、２５℃〜６５℃
の範囲がより好ましい。

【００３７】多重鎖核酸親和性化合物をハイブリッド多
重鎖核酸に対して接触させる際の溶媒としては、水又は
各種緩衝液のほか、水に混和しうる有機溶媒と水との混
合溶媒を適宜用いることができる。水に混和しうる有機
溶媒としてはジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミド、メタノール、エタノール、エチレングリコール、
グリセリンなどが好ましい。また、緩衝液とこれらの有
機溶媒を混合して用いることも好ましい。

【００３８】多重鎖核酸親和性化合物の使用量は、用い
るプローブ核酸の種類や塩基数などの条件により異なる
が、プローブ核酸の総塩基数に対して１０^-3〜１０⁷倍
程度、さらに好ましくは１０^-2〜１０⁵倍程度の分子数
を供給するように溶液濃度を調整することが好ましい。
また、本発明の方法において、２種以上の多重鎖核酸親
和性化合物は、それぞれこの範囲で使用することがで
き、それぞれの化合物のクロモフォアの分子吸光係数や
発光量子収率に合わせて検出感度が最適になるように使
用量を調節することができる。

【００３９】多重鎖核酸親和性化合物をハイブリッド多
重鎖核酸に接触させた後、過剰の多重鎖核酸親和性化合
物を除去するために洗浄を行うことが好ましい。この場
合にはハイブリダイゼーション後の洗浄と同様の操作で
行うことができる。もっとも、本発明の方法ではこの洗
浄を行わなくても光学的検出が可能であり、洗浄操作を
省略することも好ましい。

【００４０】多重鎖核酸親和性化合物間の相互作用を光
学的手段により検出することができるが、溶液系でハイ
ブリッド多重鎖核酸を検出する場合には、通常の蛍光光
度計を用いることもでき、あるいは多数同時検出が可能
な点及び感度の点などから蛍光スキャナーを用いて行う
ことも好ましい。また、蛍光量の測定は、ハイブリダイ
ゼーション後の固相担体を乾燥させるか、あるいは水性
溶媒の存在下に、従来の蛍光レーザースキャナー法によ
って行ってもよく、あるいは固相担体を乾燥させないよ
うにカバーガラスで覆い、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）
法によって測定を行ってもよい。

【００４１】本発明の方法を行うにあたり、核酸試料を
適宜の手段で標識しておき、多重鎖核酸親和性化合物に
よる検出と組み合わせてハイブリッド多重鎖核酸を検出
してもよい。例えば、核酸試料を蛍光色素で標識してお
いてもよく、あるいはＲＩ法、非ＲＩ法としてビオチン
法又は化学発光法などの標識手段を採用できる。例え
ば、蛍光物質としては核酸の塩基部分と結合できるもの
であれば何れも用いることができるが、シアニン色素
（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５
等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−ア
セチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ
（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。

【００４２】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。例１：ＤＮＡハイブリッドの検出（１）ＤＮＡ断片固定スライドの作成２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を３質量％化合物ＶＳ−１
溶液に、１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄
後、１２０℃で１５分間乾燥して、ＶＳ−１被覆スライ
ド（Ｂ）を作成した。

【００４３】

【化１】

【００４４】（２）ハイブリッド多重核酸の検出３’未端がアミノ基で修飾された配列表の配列番号１に
示すＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に
分散した水性液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）を上記（１）
で得たスライド（Ｃ）に点着した。直ちに、点着後のス
ライドを６０℃、湿度９０％にて１時間放置した後、１
２０℃で２０分間加熱した。このスライドを０．１質量
％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２
×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳ
Ｃ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、
０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上
記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ
１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、
室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド
（Ｄ）を得た。

【００４５】このスライドに対して先ほどのＤＮＡ配列
と相補的な配列を有する６０m e rのＤＮＡをハイブリ
ダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣおよび１０質量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させ、それぞれ
２種ずつの多重鎖核酸親和性化合物（各々０．１ｍＭの
ジメチルスルホキシド溶液を１μＬ）を添加して上記で
得たスライド（Ｄ）に付与し、表面を顕微鏡用カバーガ
ラスで保護した後、モイスチャンバー内にて６０℃で１
０時間インキュベートした。次いで、このスライドを
０．１質量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液で１０秒
間洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で
乾燥した。それぞれをスライドガラス表面の蛍光強度を
蛍光スキャニング装置で測定した。励起波長は短波長側
の色素の最大吸収波長にできるだけ近い波長とし、検出
波長はフィルターを調節して最大値が得られるようにし
た。また、同様の実験を相補的な配列を有する６０ｍｅ
ｒを添加しない実験を行った。

【００４６】表１は相補鎖を添加したときに測定した比
較例１の試料で得られる蛍光強度を１００として相対的
な蛍光強度を数値で示した（いずれの実験も短波長側の
化合物を励起し、長波長側の化合物の発光を検出し
た）。この結果、比較例１では蛍光共鳴エネルギー移動
が起こらないため、洗浄しない場合には全くシグナルが
得られないのに対して、本発明の方法の試料では洗浄し
ない場合でもシグナルを検出することができ、洗浄後に
おいてもバックグラウンドが低く、良好なＳ／Ｎが得ら
れるのに対して、比較例の試料ではバックグラウンドが
高いことがわかる。

【００４７】

【表１】

【００４８】

【化２】

【００４９】

【化３】

【００５０】例２：ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの検出例１において、スライドガラス表面に固定した６０ｍｅ
ｒのＤＮＡの代わりに４０ｍｅｒのオリゴデオキシＡを
固定し、相補的な配列としてオリゴＵを使用した以外は
まったく同様の実験を行ったところ、例１と同様の結果
が得られた。

【００５１】

【発明の効果】本発明の方法では、多重鎖核酸親和性化
合物間の相互作用を検出するため、ＤＮＡチップなどを
用いた試料核酸の検出においてＤＮＡ／ＤＮＡ及びＲＮ
Ａ／ＤＮＡなどのハイブリッド多重鎖核酸を煩雑な標識
操作や洗浄操作を行わずに選択的に検出できる。

【００５２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co. Ltd. <120> Method for detecting nucleic acid <130> A11352M <160> 1 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <400> 1 GCTGCTGCTG GGCCAGTGGT TCCTCCATGT CCGGGGAGGA TCAGACACTT CAAGGTCTAG 60

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プローブ核酸に対して試料核酸を相互作
用させ、該プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイ
ゼーションによりハイブリッド多重鎖核酸を形成させる
工程を含み、上記ハイブリッド多重鎖核酸に対して２種
以上の多重鎖核酸親和性化合物（該化合物は単鎖核酸と
多重鎖核酸の識別比が１より大きい）を相互作用させ、
該化合物間の相互作用を検出することによって上記ハイ
ブリッド多重鎖核酸を検出する方法であって、該化合物
のうち少なくとも１種の化合物の上記識別比が５以上で
あるか、または該化合物のうち少なくとも２種の化合物
の上記識別比がそれぞれ３以上である方法。
【請求項２】プローブ核酸が固相担体上に固定されて
いる請求項１に記載の方法。
【請求項３】多重鎖核酸親和性を有する化合物のうち
少なくとも１種の化合物が発光性化合物である請求項１
又は２に記載の方法。
【請求項４】多重鎖核酸親和性を有する化合物のうち
少なくとも１種の化合物がインターカレーターである請
求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。