CN105385791A - 一种h7n9禽流感病毒检测试剂盒 - Google Patents

一种h7n9禽流感病毒检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其包括：第一反应液，其具有缓冲液、0.1mol/L的NaCl、修饰有第一单链DNA的第一纳米金，所述第一单链DNA具有等量且分别与H7特征基因序列互补的第一上游DNA和第一下游DNA；第二反应液，其具有缓冲液、0.1mol/L的NaCl、修饰有第二单链DNA的第二纳米金，所述第二单链DNA具有等量且分别与N9特征基因序列互补的第二上游DNA和第二下游DNA。本发明其仅需配合使用紫外分光光度计，即能快速、高效的检测出H7N9禽流感病毒，利于对禽流感病毒H7N9亚型及时作出早期诊断、反应和治疗。

Description

一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒。更具体地说，本发明涉及一种基于纳米金的H7N9禽流感病毒检测试剂盒。
背景技术
H7N9型禽流感是一种新型禽流感，是甲型流感病毒的一种，属于高致病性禽流感病毒。该病毒于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现，截至2015年01月25日，全国已确诊133人，37人死亡，76人痊愈。由于该型禽流感病毒具有高致病性、高死亡率的特点，如何快速有效的检测、筛查出人是否感染，对病毒的防控具有重要的意义。
目前，H7N9禽流感病毒主要通过核酸检测来进行，该方法直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。根据所用设备的不同，实时荧光定量PCR仪进行的RT-PCR可用于定量检测，普通PCR基因扩增仪可用于定性检测，另外还有依据H7N9人感染禽流感的核酸特定序列研制的基于引物和探针的PCR检测试剂盒。但上述检测方法均需要专门配备PCR基因扩增仪，检测成本较高，检测时间较长。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其仅需配合使用紫外分光光度计，即能快速、高效的检测出H7N9禽流感病毒，利于对禽流感病毒H7N9亚型及时作出早期诊断、反应和治疗。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其用于检测禽流感病毒中的H7亚型和N9亚型，该试剂盒包括：
第一反应液，其用于检测H7亚型，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和修饰有第一单链DNA的第一纳米金，所述第一单链DNA具有摩尔比为1:1的第一上游DNA和第一下游DNA，其中所述第一上游DNA和第一下游DNA不互补，并分别与所述H7亚型中的特征基因序列互补；
第二反应液，其用于检测N9亚型，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和修饰有第二单链DNA的第二纳米金，所述第二单链DNA具有摩尔比为1:1的第二上游DNA和第二下游DNA，其中所述第二上游DNA和第二下游DNA不互补，并分别与所述N9亚型中的特征基因序列互补；
其中，所述第一纳米金和第二纳米金的粒径范围均在10～50nm内。
在检测前，首先对待检样品进行核酸提取，然后在两份提取液分别加入所述第一反应液和第二反应液，对H7和N9亚型分别进行检测。
当第一反应液加入上述提取液时，纳米金上修饰的与H7亚型中的特征基因序列互补的单链DNA能够迅速结合到目标核酸上，引起纳米金粒子聚集，从而导致纳米金本身紫外光谱的改变，出现新的吸收峰，同时该吸收峰的强度与目标核酸的浓度成正比，该变化能够通过紫外分光光度计灵敏的检测出来，从而定性甚至定量H7亚型的含量。同理，当第二反应液加入上述提取液时，通过DNA分子的互补杂交也会引起纳米金的聚集，使溶液颜色发生变化，从而定性甚至定量N9亚型的含量。综合第一反应液液与第二反应液中的检测结果，只有在两份待检样品提取液中同时检测到信号时，才能确认H7N9禽流感病毒的存在。
优选的是，其中，所述第一纳米金和第二纳米金的粒径相差5～15nm，纳米金的尺寸不同，纳米金聚集后产生的紫外信号也不同，在分别检测N7和H9的反应液中，使用不同尺寸的纳米金，根据紫外信号的不同可直接对N7亚型和H9亚型进行区分，进一步提高了检测结果的可辨识性和直观性。
优选的是，其中，所述第一单链DNA和第二单链DNA的浓度均为0.1～10nmol/L，纳米金表面修饰的单链DNA的浓度对杂交效率有较大影响，单链DNA的浓度过低会降低单链DNA中在纳米金表面的修饰效果，减低杂交效率，但单链DNA的浓度也不能过高，否则较高的空间位阻也会降低杂交效率。
优选的是，其中，所述第一单链DNA通过巯基修饰于第一纳米金，所述第二单链DNA通过巯基修饰于第二纳米金。
优选的是，其中，所述第一纳米金与第一单链DNA之间还具有3～6个第一保护碱基，所述第二纳米金与第二单链DNA之间还具有3～6个第二保护碱基，防止由于空间位阻而妨碍单链DNA与H7、N9之间的配对杂交，提高检测的准确性。
优选的是，其中，所述第一纳米金分别结合在第一上游DNA的5’端和第一下游DNA的3’端，以保证当第一上游DNA和第一下游DNA与H7亚型中的特征基因序列互补配对时，纳米金分别位于杂交核酸序列的两端，同理，第二纳米金分别结合在第二上游DNA的5’端和第二下游DNA的3’端。
优选的是，其中，所述缓冲液选自Tris-HCl、BPS和HEPES中的任意一种。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)本发明具有很高的灵敏度，不需要进行PCR扩增，能够直接在核酸提取液中进行检测，操作简单，筛查速度快，大量节约检测的时间，能够大范围进行H7N9禽流感病毒的筛查；
(2)本发明仅需设备紫外分光光度计即可实现H7N9禽流感病毒的快速检测，检测费用低；
(3)本发明检测技术难度低，便于推广，对H7N9禽流感的早期诊断和防控具有重要的意义。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中H7N9禽流感病毒检测的原理图。
图中：1、纳米金，2、纳米金上修饰的单链DNA，3、靶基因序列。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
图1示出了根据本发明的一种实现形式，本发明试剂盒任一反应液中的纳米金为两种单链DNA修饰后的等量混合物，这两种单链DNA分别为靶基因互补序列的一半，通过单链DNA末端的巯基与纳米金结合，当向反应液中加入靶基因进行杂交后，两种单链DNA分别按照特定顺序与靶基因结合，纳米金离子聚集，溶液颜色发生变化，用以靶基因的定性或定量。
在本发明的另一实例中：
(1)试剂盒第一反应液与第二反应液的配制：
第一反应液含有pH值为7.3的0.1mol/LTris-HCl缓冲液，含有0.1mol/LNaCl，第一纳米金粒径大小为15nm，通过DNA末端的巯基，分别修饰上第一上游DNA5’-SH-CCGATCAGATAATGCTGC-3’和第一下游DNA5’-ATTCCCGCAGATGAGACG-SH-3’两种单链DNA，其中，两种序列的总浓度均为0.5nmol/L，检测的H7亚型中的特征核酸序列为5’-CATCTGCGGGAATGCAGCATTATCT-3’，可以看出，第一上游DNA序列和第一下游DNA序列靠近巯基位置还分别修饰有6个和5个保护碱基，以确保两单链DNA与靶基因序列的杂交效率；
第二反应液含有pH值为7.3的0.1mol/LBPS缓冲液，含有0.1mol/LNaCl，纳米金粒径大小为25nm，通过DNA末端的巯基，分别修饰上第二上游DNA5’-SH-CCGATCAGACAATCCCG-3’和第二下游DNA5’-ACCGAATGACCCAGACGT-SH-3’两种单链DNA，其中，两种序列的总浓度均为6nmol/L，检测的N9亚型中的特征核酸序列为5’-GGGTCATTCGGTCGGGGATTGTCT-3’，可以看出，第二上游DNA序列和第二下游DNA序列靠近巯基位置还均分别修饰有6个保护碱基，以确保两单链DNA与靶基因序列的杂交效率；
其中，第一反应液和第二反应液中纳米金的粒径相差10nm，在两反应液中纳米金聚集后产生的紫外信号也不同，用以提高检测的直观性和可辨识性。
(2)试剂盒的使用
检测前，将待检样品利用DNA提取仪进行提取，然后将提取液分为两份，分别加入第一反应液和第二反应液，混合均匀，孵育5min，然后利用紫外分光光度计进行光谱检测。
观察检测得到所述广谱的紫外吸收峰，当样品中存在目标序列时，通过DNA杂交，带有纳米金的互补序列将杂交在目标序列上，导致纳米金的聚集，会产生新的吸收峰，从而可以定性判断H7、N9亚型是否存在，同时，通过绘制吸收峰强度与H7、N9浓度的对应关系图，还可通过检测得到的吸收峰的强度定量测定H7、N9亚型。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的H7N9禽流感病毒检测试剂盒的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述，本发明具有很高的灵敏度，不需要进行PCR扩增，能够直接在核酸提取液中进行检测，操作简单，筛查速度快，大量节约检测的时间，能够大范围进行H7N9禽流感病毒的筛查；
此外，本发明仅需设备紫外分光光度计即可实现H7N9禽流感病毒的快速检测，检测费用低；
此外，本发明检测技术难度低，便于推广，对H7N9禽流感的早期诊断和防控具有重要的意义。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.一种H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其用于检测禽流感病毒中的H7亚型和N9亚型，其特征在于，包括：
第一反应液，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和修饰有第一单链DNA的第一纳米金，所述第一单链DNA具有摩尔比为1:1的第一上游DNA和第一下游DNA，其中所述第一上游DNA和第一下游DNA不互补，并分别与所述H7亚型中的特征基因序列互补；
第二反应液，其具有0.1mol/L的pH为7.3缓冲液、0.1mol/L的NaCl和修饰有第二单链DNA的第二纳米金，所述第二单链DNA具有摩尔比为1:1的第二上游DNA和第二下游DNA，其中所述第二上游DNA和第二下游DNA不互补，并分别与所述N9亚型中的特征基因序列互补；
其中，所述第一纳米金和第二纳米金的粒径范围均在10～50nm内。
2.如权利要求1所述的H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述第一纳米金和第二纳米金的粒径相差5～15nm。
3.如权利要求1所述的H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述第一单链DNA和第二单链DNA的浓度均为0.1～10nmol/L。
4.如权利要求1所述的H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述第一单链DNA通过巯基修饰于第一纳米金，所述第二单链DNA通过巯基修饰于第二纳米金。
5.如权利要求1所述的H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述第一纳米金与第一单链DNA之间还具有3～6个第一保护碱基，所述第二纳米金与第二单链DNA之间还具有3～6个第二保护碱基。
6.如权利要求1所述的H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述第一纳米金分别结合在第一上游DNA的5’端和第一下游DNA的3’端，第二纳米金分别结合在第二上游DNA的5’端和第二下游DNA的3’端。
7.如权利要求1所述的H7N9禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液选自Tris-HCl、BPS和HEPES中的任意一种。
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