CN104894264A - 一种检测硫酸盐还原菌的新方法 - Google Patents

一种检测硫酸盐还原菌的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及硫酸盐还原菌(SRB)的检测，具体为一种检测硫酸盐还原菌的新方法。利用基于溶菌酶-DNA信号探针，磁性微球-捕获探针对SRB特异性DNA片段进行检测，通过观察反应前后溶液荧光信号强度的变化，实现SRB的检测。本发明基于此信号对硫酸盐还原菌进行检测与传统检测方法相比，该方法特异性强，方法新颖，灵敏度高，具有广泛的应用前景，可实现SRB的定性及定量检测。

Description

一种检测硫酸盐还原菌的新方法
技术领域
本发明涉及硫酸盐还原菌(SRB)的检测，具体为一种检测硫酸盐还原菌的新方法。
背景技术
硫酸盐还原菌(SRB)是海洋环境腐蚀中最重要的微生物之一，它可以通过新陈代谢将硫酸根离子或亚硫酸根离子转化为硫离子并对海洋中的钢铁形成腐蚀。正是因为SRB在各类环境中广泛的存在及它的危害，对环境中SRB的检测和监控显得非常重要。
传统SRB检测方法包括培养法(最大可能数法，MPN)，检测SRB特征化合物(包括三磷酸腺苷，特异性还原酶硫离子等)的方法，基于SRB细胞检测方法(酶联免疫吸附反应、凝集反应等)，而基于SRB遗传标志的检测方法，通过提取不同种类SRB所特有的DNA片段为目标检测物，间接对SRB进行检测，实现了高度的特异性检测。由此，对硫酸盐还原菌的检测可转化为对细菌特异性DNA片段的检测。
荧光DNA生物传感器是对DNA进行检测的一种常用方法。荧光DNA传感器是将探针DNA链与荧光物质相结合，或者用荧光物质进行标记后，当探针与目标物质进行作用时会发生荧光信号的改变，将目标物的信息转换为可检测的荧光信号，实现对目标物质的定性、定量检测。常用的荧光标记物包括荧光基团、荧光聚合物、量子点以及能够引起荧光信号变化的生物分子，例如酶。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测硫酸盐还原菌的新方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测硫酸盐还原菌(SRB)的新方法：利用基于溶菌酶-DNA信号探针，磁性微球-捕获探针对SRB特异性DNA片段进行检测，通过观察反应前后溶液荧光信号强度的变化，实现SRB的检测。
进一步的说是，磁性微球-捕获探针DNA1,溶菌酶-DNA2信号探针,及不同浓度SRB特异性DNA片段按1:1:1的质量比混合,于37-40℃摇床孵育30-60分钟；向孵育后得到的溶液中加入溶菌酶荧光底物混合，于40-50℃，40mM磷酸盐缓冲溶液(pH 5.0)条件下反应10-15小时后加入碳酸盐缓冲液pH 10.4终止反应，将反应得到的溶液进行荧光信号检测。
所述磁性微球-捕获探针DNA1与目标检测物DNA链部分片段结合形成双链，目标检测物DNA单链未结合部分与溶菌酶-DNA2信号探针结合。
具体如下所示：
例如，DNA 1：biotin-AAAAAAAAATACGGATT(5’-3’)，DNA2：TCACTCCTAAAAAAAAA-lysozyme(5’-3’)。
所述基于溶菌酶-DNA2信号探针为溶菌酶与信号探针DNA2杂交获得；所述磁性微球-捕获探针DNA1为将亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DNA1杂交获得。
所述基于溶菌酶-DNA2信号探针为取溶菌酶溶液与sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)按8:1的质量比混合,涡旋5-10分钟后与室温孵育1-2个小时，反应产物用bufferA超滤6-10次，得溶液A待用；
DNA活化，取巯基修饰的信号探针DNA2链与二硫苏糖醇溶液按照1:10-1:100的质量比混合，并在室温反应2-3小时，反应产物再用bufferA超滤6-10次，以出去多余的DTT。
将上述溶液A与活化的DNA按照1:1的体积比混合，并于室温下孵育36-48小时后再次用bufferA超滤6-10次，去除未结合的溶菌酶即得到基于溶菌酶-DNA信号探针，于4℃保存以备使用。
其中，二硫苏糖醇溶液为二硫苏糖醇溶解于磷酸盐缓冲溶液(0.1M,pH8.0)中，浓度为125mM；
溶菌酶溶液为溶菌酶溶解于缓冲液中，浓度为10mg/mL，缓冲液为0.1M NaCl,0.1M磷酸盐缓冲溶液,pH 5.0；
buffer A为0.1M NaCl,0.1M磷酸盐缓冲溶液,pH 7.4。
所述硫酸盐还原菌特异性DNA为对SRB种群在25-40℃，隔绝空气条件下进行富集，然后将SRB进行清洗并利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；
以利用SRB特异性引物对上述提取的细菌基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到特异性DNA片段。
所述聚合酶链式反应用量为模板DNA,5.0-6.0μL；超纯水,10.0-16.0μL；聚合酶缓冲溶液,1.0-3.0μL；三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs),0.5-1.0μL；上游引物,1.0-2.0μL；下游引物,0.5-2.0μL；耐热DNA聚合酶,0.2-0.5μL；或所述上下游引物的用量相反；
反应条件为：复制起始(94℃,5-10min)；35个循环变性(94℃,30-60s),退火处理(55℃,30-60s),延伸(94℃,30-60s)；终止(72℃,7-10min)。
本发明所具有的优点：
基于溶菌酶-DNA连接体作为信号探针对SRB进行检测，方法新颖，灵敏度高，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供了基于溶菌酶-DNA信号探针对SRB进行检测的方案图(A),溶菌酶-DNA2信号探针的构件图(B)。
图2为本发明实施例提供了溶菌酶催化荧光底物的反应机理图。
图3为本发明实施例提供了基于此方法不同浓度SRB的DNA片段检测的荧光光谱图。(Sample a：1×108,b:1×107,c:1×106,d:1×105,e:1×104,f:1×103,g:1×102,h:1×101CFU/mL SRB and Blank,)
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
基于溶菌酶-DNA信号探针检测硫酸盐还原菌(以食氨酸脱硫弧菌为例)
1)提取食氨酸脱硫弧菌的特异性DNA片段
取含有食氨酸脱硫弧菌的水溶液(4～6mL)加入到200mL培养基中，培养3～4天，将细菌进行离心分离(离心速度为8000-10000转/分钟，离心时间8-10分钟)后，将上层液吸出倒掉，取下层SRB细胞沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒处理。提取纯化得到的DNA依次与Taq DNA聚合酶及特异性引物混合进行PCR扩增反应，用量如下：DNA模板,5μL；超纯水,15.8μL；聚合酶缓冲溶液,2.5μL；dNTPs,0.5μL；引物1,0.5μL；引物2,0.5μL；taq聚合酶,0.2μL。热循环温度如下:预变性(94℃,5min)；35循环，变性(94℃,30s),退火(55℃,30s),伸展(94℃,30s)；终止(72℃,7min)。
2)磁性微球-寡聚核苷酸捕获探针的构建
试验中所用到的亲和素修饰的磁性纳米微球(1.02μm,10mg.mL-1)购买于挪威英杰生命科技有限公，所需的人工合成寡聚核苷酸(DNA1,DNA2)由上海生工生物工程有限公司合成。
所述DNA序列为DNA 1：biotin-AAAAAAAAATACGGATT(5’-3’)，DNA2：TCACTCCTAAAAAAAAA-SH(5’-3’)；
首先，取10uL亲和素修饰的磁珠用磁珠清洗溶液重复清洗四次后定容至1mL；其次，将亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DNA 1混合，具体结合比例为：1mL，10mg.mL-1的磁珠对应1mL，5nM的DNA 1，反应条件为25℃,150转摇床2小时。反应结束后，用磁珠清洗溶液重复清洗结合DNA探针的磁珠四次并将其最终定容到1mL反应缓冲溶液中即得到基于磁性微球-寡聚核苷酸捕获探针溶液，于4℃保存以备使用。
3)溶菌酶-DNA2信号探针准备实验
首先，溶菌酶溶液与sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)按8:1的质量比混合,涡旋5分钟后与室温孵育一个小时，反应产物用bufferA超滤八次；对于DNA活化，取巯基修饰的信号探针DNA2链与二硫苏糖醇溶液按照1:10的质量比混合，室温反应2小时，反应产物用buffer A超滤八次以出去多余的DTT；将上述得到的两种产物混合，并于室温下孵育48小时后再次用bufferA超滤八次以除去未结合的溶菌酶即得到基于溶菌酶-DNA信号探针。将得到的产物于4℃保存以备使用。
其中，二硫苏糖醇溶液为二硫苏糖醇溶解于磷酸盐缓冲溶液(0.1M,pH8.0)中，浓度为125mM；
溶菌酶溶液为溶菌酶溶解于缓冲液中，浓度为10mg/mL，缓冲液为0.1M NaCl,0.1M磷酸盐缓冲溶液,pH 5.0；
buffer A为0.1M NaCl,0.1M磷酸盐缓冲溶液,pH 7.4。
4)对食氨酸脱硫弧菌特异性DNA片段的检测实验
10μL磁性微球-捕获探针DNA1,10μL溶菌酶-DNA2信号探针,及不同浓度食氨酸脱硫弧菌特异性DNA片段10μL混合,于37℃摇床孵育30分钟；将孵育后得到的溶液再加入溶菌酶荧光底物(4-Methylumbelliferylβ-D-N,N′,N″-triacetylchitotrioside)混合，于50℃，20mM磷酸盐缓冲溶液(pH 5.0)条件下反应15小时后加入2ml重碳酸盐缓冲液pH10.4终止反应，将得到的溶液利用荧光光谱仪检测，获得荧光信号强度(参见图3)。
图3为不同浓度SRB的DNA片段检测的荧光光谱图。(Sample a：1×108,b:1×107,c:1×106,d:1×105,e:1×104,f:1×103,g:1×102,h:1×101CFU/mL SRB and Blank)，随着菌种浓度的降低，所得的荧光信号值逐渐降低，至5×101CFU/mL SRB达到最低值，可认为5×101CFU/mL SRB为此方法的最低检测浓度。另外，以不同菌种浓度的LOG值为横坐标，对应的荧光检测信号为纵坐标得到标准曲线图如内附图所示，其中标准曲线方程式为Y＝99.655X-46.821(Y＝△FL，X＝CSRB)，R2＝0.9888。

Claims (7)

1.一种检测硫酸盐还原菌(SRB)的新方法，其特征在于：利用基于溶菌酶-DNA信号探针，磁性微球-捕获探针对SRB特异性DNA片段进行检测，通过观察反应前后溶液荧光信号强度的变化，实现SRB的检测。
2.按权利要求1所述的检测硫酸盐还原菌(SRB)的新方法，其特征在于：磁性微球-捕获探针DNA1,溶菌酶-DNA2信号探针,及不同浓度SRB特异性DNA片段按1:1:1的体积比混合,于37-40℃摇床孵育30-60分钟；向孵育后得到的溶液中加入溶菌酶显色底物混合，于40-50℃，40mM磷酸盐缓冲溶液(pH 5.0)条件下反应10-15小时后加入碳酸盐缓冲液pH 10.4终止反应，将反应得到的溶液进行荧光信号检测。
3.按权利要求2所述的检测硫酸盐还原菌(SRB)的新方法，其特征在于：所述溶菌酶-DNA2信号探针为溶菌酶与DNA2信号探针杂交获得；所述磁性微球-捕获探针DNA1为将亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DNA1杂交获得。
4.按权利要求3所述的检测硫酸盐还原菌(SRB)的新方法，其特征在于：所述基于溶菌酶-DNA2信号探针为溶菌酶与信号探针DNA2杂交获得；所述磁性微球-捕获探针DNA1为将亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DNA1杂交获得。
5.按权利要求3所述的通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法，其特征在于：所述基于溶菌酶-DNA2信号探针为取溶菌酶溶液与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)按8:1的质量比混合,涡旋5-10分钟后与室温孵育1-2个小时，反应产物用bufferA超滤6-10次，得溶液A待用；
DNA活化，取巯基修饰的信号探针DNA2链与二硫苏糖醇溶液按照1:10-1:100的质量比混合，并在室温反应2-3小时，反应产物再用bufferA超滤6-10次，以出去多余的DTT；
将上述溶液A与活化的DNA按照1:1的体积比混合，并于室温下孵育36-48小时后再次用bufferA超滤6-10次，去除未结合的溶菌酶即得到基于溶菌酶-DNA信号探针，于4℃保存以备使用；
其中，二硫苏糖醇溶液为二硫苏糖醇溶解于磷酸盐缓冲溶液(0.1M,pH8.0)中，浓度为125mM；
溶菌酶溶液为溶菌酶溶解于缓冲液中，浓度为10mg/mL，缓冲液为0.1M NaCl,0.1M磷酸盐缓冲溶液,pH 5.0；
buffer A为0.1M NaCl,0.1M磷酸盐缓冲溶液,pH 7.4。
6.按权利要求1所述的检测硫酸盐还原菌(SRB)的新方法，其特征在于：
所述硫酸盐还原菌特异性DNA为对SRB种群在25-40℃，隔绝空气条件下进行富集，然后将SRB进行清洗并利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；
以利用SRB特异性引物对上述提取的细菌基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到特异性DNA片段。
7.按权利要求6所述的检测硫酸盐还原菌(SRB)的新方法，其特征在于：所述聚合酶链式反应用量为模板DNA,5.0-6.0μL；超纯水,10.0-16.0μL；聚合酶缓冲溶液,1.0-3.0μL；三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs),0.5-1.0μL；上游引物,1.0-2.0μL；下游引物,0.5-2.0μL；耐热DNA聚合酶,0.2-0.5μL；或所述上下游引物的用量相反；
反应条件为：复制起始(94℃,5-10min)；35个循环变性(94℃,30-60s),退火处理(55℃,30-60s),延伸(94℃,30-60s)；终止(72℃,7-10min)。
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