CN110441277A - 一种检测氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于杂交连锁反应放大的荧光生物传感器。为了解决以上现有技术中检测氨苄青霉素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题。一种基于核酸适配体检测氨苄青霉素的生物传感器，将切刻内切酶Nb.BbcCI与链杂交连锁反应的配合实现循环放大作用，以及硫黄素T与G‑四联体结合产生荧光，均相反应混合液。制备方法：制备金纳米粒子；将Walker与Track修饰到金纳米粒子表面；将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合；超支化杂交连锁反应、荧光检测；利用了核酸适配体的特异型识别，利用核酸适配体对目标物氨苄青霉素的高特异性检测；利用超支化杂交连锁反应放大，实现信号放大的作用。

Description

一种检测氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及一种检测氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
氨苄青霉素 （ampicillin, AMP）是β－内酰胺类抗生素的一种，是在青霉素Ｇ侧链羧基α位引入氨基，改变其极性的半合成青霉素。氨苄青霉素耐酸不耐酶，克服了天然青霉素不宜内服的缺点，因此在畜牧养殖过程中常作为消炎抗感染的首选药物，对革兰氏阴性菌和阳性菌均可产生不同程度的抑制作用。
目前，在氨苄青霉素的分析方法中，常用的 AMP 检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、液相-质谱联用法（LC-MS）等，这些方法存在过程繁琐、仪器昂贵和操作复杂等缺点有必要建立更可靠的快速分析方法；免疫分析法（IAs）近年来应用日趋广泛，但由于 AMP 是小分子化合物，存在抗体质量不稳定、方法特异性差等问题，限制了IAs 法的普及；因此，需要探寻一种快速、准确、灵敏、操作简单、且特异性高的检测方法来检测氨苄青霉素。
适配体（Aptamer）是一类能以较高亲和力与各类靶分子，特异性地结合的单链寡核苷酸 （DNA、RNA、修饰RNA）。Aptamer与各种靶分子结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构，绑定于其靶分子上，从而通常对其靶分子显示出非常高度的亲和力。
发明内容
为了解决以上现有技术中检测氨苄青霉素的方法操作繁琐，费时费力，样品的前处理或浓缩过程繁琐，仪器昂贵难以普及的问题，本发明提供了一种特异性强、亲和力高、结合的目标物质种类多、分子量较小以及合成过程简便的基于DNA Walker的超支化杂交连锁反应用于氨苄青霉素的超灵敏检测的生物传感器，还涉及其制备方法与应用。
一种检测氨苄青霉素的生物传感器，包括底物探针标记的金纳米粒子与均相反应液；
所述的均相反应液包括：灭菌水、目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、10×的缓冲液buffer、切刻内切酶Nb.BbcCI、ThT；
所述的底物探针是由Walkker、Aptamer和Track形成，且Walkker和Track均含-SH；
所述的Walker序列如SEQ No.1所示；
所述的Aptamer序列如SEQ No.2所示；
所述的Track序列如SEQ No.3所示；
所述的HAP1序列如SEQ No.4所示；
所述的HAP2序列如SEQ No.5所示；
所述的HAP3序列如SEQ No.6所示；
所述的HAP4序列如SEQ No.7所示。
上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备金纳米颗粒溶液；
（2）底物探针标记金纳米粒子；
（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合；
（4）杂交连锁反应、荧光检测；
所述步骤（1）的金纳米颗粒溶液的制备步骤如下：
（1）取500μL 0.04g/ml HAuCl4加入200ml超纯水中，搅拌加热煮沸；
（2）搅拌下，快速加入3ml 1%的柠檬酸三钠溶液，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，慢慢冷却至室温，得到金纳米颗粒溶液，至于4℃保存备用；
（3）使用紫外分光光度计，计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM。
所述步骤（2）的底物探针标记金纳米粒子，操作步骤如下：
（1）将Walker与Aptamer按照1：1的比例混合在一起，加入PBS缓冲液，室温下反应2 h。
（2）将上述反应好的含-SH的Walkker和含-SH的Track按照1:20的比例混合，形成底物探针；
（3）浓缩纳米金溶液至3 nM，移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；
（4）按照纳米金与底物探针的浓度比1：5000混合均匀，4 ℃下放置24 h；
（5）分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液；4 ℃放置48 h；
（6）洗脱未标记上的DNA链，既得底物探针标记金纳米粒子。
所述步骤（3）的均相反应液包括：灭菌水、目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、10×的缓冲液buffer、切刻内切酶Nb.BbcCI、ThT。
所述的步骤（4）杂交连锁反应温度为37℃，时间是2 h。
上述生物传感器在检测食品及水体中氨苄青霉素上的应用。
均相中发生的反应主要有：Walker与Aptamer进行碱基互补配对形成双链结构。当有氨苄青霉素存在时，Aptamer与氨苄青霉素进行结合，同时使得Walker释放。释放出的Walker可以与Track的部分进行碱基互补配对，在切刻内切酶Nb.BbcCI存在下进行剪切，Primer片段从双链中剪切下来，同时释放出剩余部分的Track链，Walker又可以进一步与另一个Track结合重复这一步骤。此外，产生的Primer能够打开HAP1，打开的HAP1可以打开HAP2和HAP3，打开的HAP2可以打开HAP1，打开的HAP3可以打开HAP4，打开的HAP4可以打开HAP3，以此延续下去。翘起来的5’和3’可以与硫黄素T结合生成G-四联体序列，并产生荧光信号。
本发明中一共用到了7条DNA链，其序列分别是：
Walker：5’- SH- TTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTT CCGCTATA C CCTCAGC CCGCCCGC-3’
Aptamer : 5’- GCGGGCGGTTGTATAGCGG -3’
Track： 5’ -SH- TTTTTTTTTTCGTCCGT GCTGAGGG ATTCGGACG--3’
HAP1： 5’-CGTCCGAATCCCTCACCCACCCATAACGGGGTCAG CATACTGTGAGG GA-3’
HAP2： 5’- TGAGGGATTCGGACGTCCCTCACAGTATGAAAGTTAC -3’
HAP3： 5’- GGGTGGGTCAGAGTTATC ACTTTGAGATAACTCTGACCC CGTTATGGGTGGG -3’
HAP4： 5’- TCAAAGTGATAACTCTGTAACGGGGTCAGAGTT -3’
Walker的5’端修饰-SH，通过Aμ-S共价键将Walker修饰到纳米金表面，其中的斜体部分序列可以与Aptamer的斜体部分序列互补。
Track的5’端修饰-SH，通过Aμ-S共价键将Track修饰到纳米金表面，其中Track的下划线部分的序列可以与Walker的带有下划线部分的序列互补，并且 Walker 与Track杂交部分中间含有切刻内切酶的切刻序列，可以被切刻内切酶Nb.BbcCI切割，释放出加粗部分（Primer）。Primer 可以打开HAP1中的加粗部分，与之序列互补配对，HAP1的斜体部分可以打开HAP2的斜体部分，与之序列互补配对，HAP2的加粗部分可以与HAP1的加粗部分，与之序列互补配对，，HAP1的下划线部分可以打开HAP3的下划线部分，与之序列互补配对，HAP3的斜体部分可以打开HAP4的斜体部分，与之序列互补配对，HAP4的加粗部分可以打开HAP3的加粗部分，与之序列互补配对。在这个过程中， HAP3的5’和3’端分别都被翘起，在加入硫黄素T后，翘起部分可以与硫黄素T结合生成G-四联体序列，并产生荧光信号。
本发明中氨苄青霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过杂交连锁反应的方式实现信号放大，从而实现氨苄青霉素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
该发明的检测方式是荧光法检测，利用荧光仪。
在检测之前，先通过Aμ-S键将walker与Track修饰到金纳米粒子表面，将均相反应溶液与标记好纳米金粒子混合，其次将目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4与硫黄素T加入到均相溶液，最后加入切刻内切酶Nb.BbcCI，在37℃孵育2h，完成杂交连锁反应放大过程。然后用荧光仪设置激发波长为486nm，检测518 nm处荧光强度。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，Walker在纳米金表面的杂交反应，切刻内切酶Nb.BbcCI的配合的杂交连锁反应放大作用以及G-四联体与硫黄素T结合产生荧光信号构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补氨苄青霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、高特异性、超灵敏性检测
利用了核酸适配体的特异型识别，利用适配体与氨苄青霉素的结合实现了对目标物的高特异性检测；利用了切刻内切酶Nb.BbcCI的切割位点，实现定位切割；利用杂交连锁反应，放大了荧光信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物氨苄青霉素的超灵敏性检测；该方法的检测下限为5 pM。
2、操作简单，检测时间短
该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用荧光法，其检测方法操作简便、检测周期短；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。
3、性能稳定，适合工业化生产
制备方法简单，性能稳定，荧光检测的重复性好，适用于食品安全及水体中氨苄青霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该实验的原理图；
图2为实施例1检测结果图；
图3为实施例2检测结果图；
图4为实施例3检测结果图；
图5为实施例4传感器检测氨苄青霉素的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行金纳米粒子的制备；
（2）将Walkker（含-SH）和Track（含-SH）修饰到金纳米粒子表面；
（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合；
（4）杂交连锁反应、荧光检测。
所述的制备方法，优选纳米金粒子的制备操作步骤如下：
（1）安装好所需仪器，向三口烧瓶中加入200ml超纯水（注意不要让三口烧瓶中落入灰尘）。
（2）取500μL（0.04g/ml）HAuCl4于单个包装的离心管中，用移液枪取500μl与200ml超纯水中，搅拌加热，搅拌速度450转左右，至煮沸。
（3）在搅拌的条件下，取3ml 1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，至于4℃保存备用。
（4）取60μl金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用ΜV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×108M-1cm-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM.。
所述的制备方法，优选将Walkker（含-SH）和Track（含-SH）修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：
（1）将Walker与Aptamer按照1：1的比例混合在一起，加入PBS缓冲液，室温下反应2 h。
（2）将上述反应好的含-SH的Walkker和含-SH的Track按照1:20的比例混合，形成底物探针；
（3）浓缩纳米金溶液至3 nM，移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；
（4）按照纳米金与底物探针的浓度比1：5000混合均匀，4 ℃下放置24 h；
（5）分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液；4 ℃放置48 h；
（6）将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a、将灭菌水、目标物（2 μL）、纳米金溶液（1μL）、HAP1（1 μL）、HAP2（1 μL）、HAP3（3 μL）、HAP4（3 μL）、10×的缓冲液（buffer）（2 μL）、切刻内切酶Nb.BbcCI（2 μL）（浓度分别为20Μml，40Μml，60Μml，80Μml，100Μml，200Μml）、ThT（6 μL），加入到预先准备好的灭菌的EP管中。震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
b、取a步反应后的溶液（10 μL）稀释至100 μL，用荧光仪在488nm处检测荧光。
荧光仪激发波长设置为425nm，发射波长为488nm，检测范围450nm-600nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。
2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
结果见图2，从图中可以看出，随着切刻内切酶Nb.BbcCI量的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在酶量达到100Μml之后，荧光强度基本不变。说明酶修复循环所需切刻内切酶Nb.BbcCI量为2μl （100Μml）。
实施例2
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法：
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行金纳米粒子的制备；
（2）将Walkker（含-SH）和Track（含-SH）修饰到金纳米粒子表面；
（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合。
（4）杂交连锁反应、荧光检测
所述的制备方法，优选纳米金粒子的制备操作步骤如下：
（1）安装好所需仪器，向三口烧瓶中加入200ml超纯水（注意不要让三口烧瓶中落入灰尘）。
（2）取500μL（0.04g/ml）HAuCl4于单个包装的离心管中，用移液枪取500μl与200ml超纯水中，搅拌加热，搅拌速度450转左右，至煮沸。
（3）在搅拌的条件下，取3 ml 1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15 min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，至于4 ℃保存备用。
（4）取60 μl金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用ΜV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519 nm处的摩尔消光系数8.78×108M-1cm-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3 nM.。
所述的制备方法，优选将Walkker（含-SH）和Track（含-SH）修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：
（1）将Walker与Aptamer按照1：1的比例混合在一起，加入PBS缓冲液，室温下反应2 h。
（2）将上述反应好的含-SH的Walkker和含-SH的Track按照1:20的比例混合，形成底物探针；
（3）浓缩纳米金溶液至3 nM，移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；
（4）按照纳米金与底物探针的浓度比1：5000混合均匀，4 ℃下放置24 h；
（5）分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液；4 ℃放置48 h；
（6）将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a、将灭菌水、目标物（2 μL）、纳米金溶液（1μL）、HAP1（1 μL）（终浓度分别为2nM，4nM，6nM，8nM，10nM，12nM）、HAP2（1 μL）、HAP3（1 μL）、HAP4（1 μL）、10×的缓冲液（buffer）（2 μL）、切刻内切酶Nb.BbcCI（2 μL）、ThT（3 μL），加入到预先准备好的灭菌的EP管中。震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
b、取a步反应后的溶液（10 μL）稀释至100 μL，用荧光仪在488nm处检测荧光。
荧光仪激发波长设置为425nm，发射波长为488nm，检测范围450nm-600nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。
2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
结果见图3，从图中可以看出，随着HAP1量的增加，实验得到的荧光强度先增强，后维持不变，在HAP1量达到10nM之后，荧光强度基本不变。说明杂交连锁反应所需HAP1量为1μL （10nM）。
实施例3
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行金纳米粒子的制备；
（2）将Walkker（含-SH）和Track（含-SH）修饰到金纳米粒子表面；
（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合。
（4）杂交连锁反应、荧光检测
所述的制备方法，优选纳米金粒子的制备操作步骤如下：
（1）安装好所需仪器，向三口烧瓶中加入200ml超纯水（注意不要让三口烧瓶中落入灰尘）。
（2）取500μL（0.04g/ml）HAuCl4于单个包装的离心管中，用移液枪取500μl与200ml超纯水中，搅拌加热，搅拌速度450转左右，至煮沸。
（3）在搅拌的条件下，取3ml1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，至于4℃保存备用。
（4）取60μl金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用ΜV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×108M-1cm-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM.。
所述的制备方法，优选将Walkker（含-SH）和Track（含-SH）修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：
（1）将Walker与Aptamer按照1：1的比例混合在一起，加入PBS缓冲液，室温下反应2 h。
（2）将上述反应好的含-SH的Walkker和含-SH的Track按照1:20的比例混合，形成底物探针；
（3）浓缩纳米金溶液至3 nM，移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；
（4）按照纳米金与底物探针的浓度比1：5000混合均匀，4 ℃下放置24 h；
（5）分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液；4 ℃放置48 h；
（6）将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a、将灭菌水、目标物（2 μL）、纳米金溶液（1μL）、HAP1（1 μL）、HAP2（1 μL）、HAP3（1 μL）（终浓度分别为20nM，40nM，60nM，80nM，100nM，120nM）、HAP4（1 μL）、10×的缓冲液（buffer）（2 μL）、切刻内切酶Nb.BbcCI（2 μL）、ThT（3 μL），加入到预先准备好的灭菌的EP管中。震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
b、取a步反应后的溶液（10 μL）稀释至100 μL，用荧光仪在488nm处检测荧光。
荧光仪激发波长设置为425nm，发射波长为488nm，检测范围450nm-600nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。
10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
结果见图4，从图中可以看出，随着HAP3的增加，实验得到的荧光强度先增强，后维持不变，在HAP3达到100μM之后，荧光强度基本不变。说明杂交连锁反应所需HAP3量为1μL（100nM）。
实施例4
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）进行金纳米粒子的制备；
（2）将Walkker（含-SH）和Track（含-SH）修饰到金纳米粒子表面；
（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合。
（4）杂交连锁反应、荧光检测
所述的制备方法，优选纳米金粒子的制备操作步骤如下：
（1）安装好所需仪器，向三口烧瓶中加入200ml超纯水（注意不要让三口烧瓶中落入灰尘）。
（2）取500μL（0.04g/ml）HAuCl4于单个包装的离心管中，用移液枪取500μl与200ml超纯水中，搅拌加热，搅拌速度450转左右，至煮沸。
（3）在搅拌的条件下，取3ml1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，至于4℃保存备用。
（4）取60μl金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用ΜV-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×108-1cm-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM.。
所述的制备方法，优选将Walkker（含-SH）和Track（含-SH）修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：
（1）将Walker与Aptamer按照1：1的比例混合在一起，加入PBS缓冲液，室温下反应2 h。
（2）将上述反应好的含-SH的Walkker和含-SH的Track按照1:20的比例混合，形成底物探针；
（3）浓缩纳米金溶液至3 nM，移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；
（4）按照纳米金与底物探针的浓度比1：5000混合均匀，4 ℃下放置24 h；
（5）分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液；4 ℃放置48 h；
（6）将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a、将灭菌水、目标物（2 μL）（终浓度分别为0，5pM，10pM，50pM，100pM，500pM，1nM，5nM，10nM）、纳米金溶液（1μL）、HAP1（1 μL）、HAP2（1 μL）、HAP3（1 μL）、HAP4（1 μL）、10×的缓冲液（buffer）（2 μL）、切刻内切酶Nb.BbcCI（2 μL）、ThT（3 μL），加入到预先准备好的灭菌的EP管中。震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
b、取a步反应后的溶液（10 μL）稀释至100 μL，用荧光仪在488nm处检测荧光。
荧光仪激发波长设置为425nm，发射波长为488nm，检测范围450nm-600nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。
2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
检测结果如图5所示，图中我们可以看到，当氨苄青霉素浓度在5 pM到10000 pM时荧光值不断增加，反应稳定进行。在氨苄青霉素的浓度在5 pM到10000 pM时，氨苄青霉素浓度的对数与荧光强度值的大小成正比关系，拟合曲线：A = 113.8*logC +224（A是荧光强度值，C是氨苄青霉素的浓度），同时，我们在5 pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于5 pM时，荧光强度与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的吸收峰值的最高点因此可得到该方法的检测下限为5 pM。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ccgctatacc ctcagcccgc ccgc 54
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
gcgggcggtt gtatagcgg 19
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
tttttttttt cgtccgtgct gagggattcg gacg 34
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
cgtccgaatc cctcacccac ccataacggg gtcagcatac tgtgaggga 49
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
tgagggattc ggacgtccct cacagtatga aagttac 37
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
gggtgggtca gagttatcac tttgagataa ctctgacccc gttatgggtg gg 52
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 7
tcaaagtgat aactctgtaa cggggtcaga gtt 33

Claims (7)

1.一种检测氨苄青霉素的生物传感器，其特征在于，包括底物探针标记的金纳米粒子及均相反应液；
所述的均相反应液包括：灭菌水、目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、10×的缓冲液buffer、切刻内切酶Nb.BbcCI、ThT；
所述的底物探针是由Walkker、Aptamer和Track形成，且Walkker和Track均含-SH；
所述的Walker序列如SEQ No.1所示；
所述的Aptamer序列如SEQ No.2所示；
所述的Track序列如SEQ No.3所示；
所述的HAP1序列如SEQ No.4所示；
所述的HAP2序列如SEQ No.5所示；
所述的HAP3序列如SEQ No.6所示；
所述的HAP4序列如SEQ No.7所示。
2.一种权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备金纳米颗粒溶液；
（2）底物探针标记金纳米粒子；
（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合；
（4）杂交连锁反应、荧光检测；
所述步骤（3）的均相反应液包括：灭菌水、目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、10×的缓冲液buffer、切刻内切酶Nb.BbcCI、ThT。
3.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的金纳米颗粒溶液的制备步骤如下：
（1）取500μL 0.04g/ml HAuCl4加入200ml超纯水中，搅拌加热煮沸；
（2）搅拌下，快速加入3ml 1%的柠檬酸三钠溶液，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，慢慢冷却至室温，得到金纳米颗粒溶液，至于4℃保存备用；
（3）使用紫外分光光度计，计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM。
4.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的底物探针标记金纳米粒子，操作步骤如下：
（1）将Walker与Aptamer按照1：1的比例混合在一起，加入PBS缓冲液，室温下反应2 h；
（2）将上述反应好的含-SH的Walkker和含-SH的Track按照1:20的比例混合，形成底物探针；
（3）浓缩纳米金溶液至3 nM，移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；
（4）按照纳米金与底物探针的浓度比1：5000混合均匀，4 ℃下放置24 h；
（5）分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液；4 ℃放置48 h；
（6）洗脱未标记上的DNA链，既得底物探针标记金纳米粒子。
5.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）杂交连锁反应温度为37℃，时间是2 h。
6.权利要求1所述的生物传感器在检测食品及水体中氨苄青霉素上的应用。
7.权利要求2所制备的生物传感器在检测食品及水体中氨苄青霉素上的应用。
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