CN108982483A - 一种基于Walker DNA和放大技术的电化学发光生物传感器及其制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Walker DNA和循环放大技术的电化学发光生物传感器及其制法和应用。本发明的技术方案是通过目标物CEA与其对应适体的特异性结合,释放出trigger DNA,在引物、模板作用下形成三叉DNA结构,在酶的辅助作用下进行聚合剪切、循环放大反应,产生大量的Walker产物链,其中包含DNAzyme的特定序列。当DNA Walker与电极表面的CdSe量子点信号探针杂交,利用Pb2+离子辅助DNAzyme为动力,循环剪切DNA信号探针,引起量子点ECL信号的明显降低。多重的循环和放大提高了反应检测的灵敏度和选择性,通过检测ECL信号的变化,实现对目标物CEA的灵敏检测。该研究思路为实现CEA的灵敏检测提供了新的策略,有望用于肿瘤的早期的诊断中。
Description
技术领域:
本发明涉及一种基于Walker DNA和酶循环放大技术的电化学发光生物传感器;本发明还涉及所述生物传感器的制备方法及其检测CEA的分析应用。
背景技术:
癌胚抗原(CEA)是一种糖蛋白,它是一种与结肠癌、乳腺癌和肺癌相关的广谱肿瘤标志物[Jin W P,Na W,Jang J.Rsc Advances,2016,6(17):14335–14343.][Wen W,HuangJ Y,Bao T,et al.Biosensors&Bioelectronics,2016,83:142–148.]。癌症患者血清中CEA浓度明显高于健康人[Bock L C,Griffin L C,Latham J A,et al.Nature,1992,355(6360):564–566.]。因此,血清中CEA的灵敏检测在癌症早期诊断应用中起着重要的作用。
电化学发光技术具有较低的背景信号、线性范围宽、灵敏度高、选择性好、制备简单以及成本低等优点,在生物医药、肿瘤标志物的检测、食品安全以及环境监测中都引起了广泛的关注。作为高灵敏度和高选择性的检测方法,电致化学发光技术还与其他检测技术结合,应用于流动注射分析[He B.Microchimica Acta,2017,184(1):1–7.]、高效液相色谱分析[Wen W,Huang J Y,Bao T,et al.Biosensors&Bioelectronics,2016,83:142–148.]和毛细管电泳分析[Hong M,Lan W,Yan Z,et al.Biosensors&Bioelectronics,2016,86:83–89.]中。近年来,量子点材料因其较好的激发发射光谱以及稳定的发光性能被广泛应用于ECL传感中,并且在生命科学研究中展示出巨大的学术价值和广阔的应用前景[Li H,SunD E,Liu Y,et al.Sensors&Actuators B Chemical,2015,206(9):531–537][Sun X C,LeiC,Guo L,et al.Microchimica Acta,2016,183(3):1107–1114.]。
适配体是一类从核酸库中通过SELEX过程提取的功能化的单链寡核苷酸[AbnousK,Danesh N M,Alibolandi M,et al.Microchimica Acta,2017,184(4):1151–1159.]。它们可以和包括小分子染料、氨基酸、蛋白质甚至和细菌细胞在内的多种目标物具有高效的亲和力和较强的特异性识别能力[Wang L,Ma R,Jiang L,et al.A novel Biosensors&Bioelectronics,2016,92:390–395.],是一种具有生物分析应用前景的靶向制剂。
另外,将DNA walker引入DNA生物传感器为提高检测灵敏度带来新的亮点,诸多报道已经证明DNA walker可以在DNA传感系统中实现信号的扩增和转导,从而进行信号放大[Golub E,Pelossof G,Freeman R,et al.Analytical Chemistry,2009,81(22):9291–9298.]。采用互补碱基配对的原理来创建静态结构,进一步通过DNA机器进行程序化装配操作,具有“类似机器”功能的DNA walker因其持续性,方向性,可重复性操作,渐进式操作和自主操作等特点而备受关注。杂交链式反应[Ye S,Wu Y,Zhai X,et al.AnalyticalChemistry,2015,87:8242–8249],酶促反应[Zhang Y,Hu J,Zhang C Y.AnalyticalChemistry,2012,84:9544–9549.]和外界环境[Wang F,Freage L,Orbach R,etal.Analytical Chemistry,2013,85:8196–8203.]的刺激等都会为DNA walker沿着特定路径运行提供动力。
本发明设计了一种基于脱氧核酶驱动的Walker DNA和酶循环放大技术的电化学发光生物传感器实现对CEA的灵敏检测。通过目标物CEA与其对应适体的特异性结合,释放出trigger DNA,在引物、模板作用下形成三叉DNA结构,在酶的辅助作用下进行聚合剪切、循环放大反应,产生大量的Walker产物链,其中包含DNAzyme的特定序列。当DNA Walker与电极表面的CdSe量子点信号探针杂交,利用Pb2+离子辅助DNAzyme为动力,循环剪切DNA信号探针,引起量子点ECL信号的明显降低。通过检测ECL信号的变化,实现对目标物CEA的灵敏检测。该研究思路为实现CEA的灵敏检测提供了新的策略,有望用于肿瘤的早期的诊断中。
发明内容:
本发明的目的之一是提供一种ECL发光性能较好的CdSe量子点作为探针,为检测提供较稳定的信号来源。具体包括以下步骤:
步骤1.镉源的制备:在三口烧瓶中加入35.4mmol的油酸,然后将3.3mmol的氧化镉加入油酸里,先通氮气将其中的氧气排除,并做保护气,接着用电加热套加热250℃,并进行搅拌,当溶液中红色的氧化镉消失之后,溶液颜色为无色,这时停止加热,使其在室温下自然冷却,就得到了油酸镉。
步骤2.硒源的制备:在三口烧瓶中加入16mL的十八烯和1.6mmol的硒粉,氮气保护下,195℃加热2h,至硒粉完全溶解,得到一个稳定澄清的淡黄色溶液,作为硒储备液。
步骤3.CdSe量子点的合成:取1.21mL的油酸镉溶液加入到12mL的十八烯中,100℃下通氮气反应1h,然后将加热温度提升至265℃,加入3.6mL的硒储备液,使反应继续进行,生成有机相的CdSe量子点。最后移除加热,适当降温之后,加入等体积的甲苯、异丙醇进行分散,加入甲醇进行沉淀纯化,经离心之后,将沉淀重新分散于甲苯中,洗涤纯化过程至少两次,最后得到的为油酸配体的CdSe量子点。
将有机相的量子点转化成水相的量子点:在0.3mL二次水中加入18μL的巯基乙酸、1.0mL的无水乙醇,之后用氢氧化钠溶液调价pH为11,之后加入5.0mL的有机相量子点溶液,60℃下搅拌反应1h,之后将反应完的溶液离心分离,用丙酮洗涤之后,在加无水乙醇离心纯化,最后将沉淀重新分散在二次水中,4℃备用。
本发明的目的之二是提供一种基于脱氧核酶驱动的Walker DNA和酶放大技术的电化学发光生物传感器,以及利用该生物传感器检测CEA的分析应用。它由以下步骤组成:
生物传感器的制备:
步骤1.传感器的构建:利用合成的纳米金粒子作为电极修饰材料,首先取1mL的纳米金,12000rpm下离心30min,去掉上清液之后,重新加入1mL的二次水之后,将其在超声浴中超声15min。取10μL的纯化后的纳米金溶液滴加到处理好的电极表面,室温下自然晾干,然后取10μL的探针DNA溶液,滴在纳米金修饰的电极表面。在湿润的环境下通过DNA末端的巯基与纳米金形成Au-S键结合,反应16h。之后用二次水小心地冲洗表面未结合的探针,然后利用巯基己醇对电极进行封板30min,使得电极表面的DNA保持直立状态,减少空间位阻,利于后续反应的进行。经过将电极表面未结合的巯基己醇冲洗掉之后,将电极插入到含有Pb2+离子的循环放大的反应液里,进行Pb2+辅助的Walker DNA的识别剪切作用,反应60min之后,最后检测ECL信号。
将表面进行反应完成的电极作为工作电极,三电极体系中进行检测ECL发光信号的强弱。ECL检测液为pH为7.4的PBS溶液(0.1M),其中含有K2S2O8(0.05M)和KCl(0.1M),其中K2S2O8作为共反应剂与量子点发生反应,检测电压范围为0~-1.5V,扫描速率为0.1V/s,光电倍增管的为-800V。
本发明利用ECL发光性能较好的CdSe量子点作为电化学发光信号探针,并采用脱氧核酶驱动的Walker DNA和酶循环放大技术研制了电化学发光生物传感器,成功实现了对CEA高灵敏、高选择性检测。该研究有望用于肿瘤的早期诊断中。
本发明与现有技术相比,主要优点在于:本发明利用制备的CdSe量子点作为电化学发光信号探针,具有较强的电化学发光信号,极大地提高了检测灵敏度;本发明将制备的CdSe量子点信号探针与脱氧核酶驱动的Walker DNA和酶循环放大技术相结合,极大地放大了ECL信号,实现了对CEA的高灵敏、高选择性检测。
本发明的电致化学发光传感器表现出了优良的准确性、高灵敏性、高选择性、稳定性与重现性,分析检测迅速、方便,该生物传感器在生物医学分析检测和早期临床诊断中具有巨大的应用潜力,可用于实际样品的检测。
附图说明:
图1透射电子显微镜(TEM)图:(A)CdSe QDs,(B)Au NPs。紫外吸收光谱图:(C)CdSeQDs,(D)Au NPs。
图2基于脱氧核酶驱动的Walker DNA和酶循环放大技术的电化学发光检测CEA的原理。
图3电泳表征:(a)trigger DNA,(b)trigger DNA结合CEA aptamer,(c)triggerDNA-CEA aptamer与CEA结合,(d)trigger DNA+template DNA+primer DNA(e)trigger DNA+template DNA+primer DNA+phi29聚合酶,(f)trigger DNA+template DNA+primer DNA+phi29聚合酶+Nt.BbvCI内切酶,(g)循环产物+probe DNA,(h)循环产物+probe DNA+Pb2+。
图4传感器构建不同阶段的ECL-时间响应曲线:(a)裸电极,(b)纳米金修饰电极,(c)信号探针修饰电极,(d)铅离子辅助Walker DNA剪切之后的电极信号。
图5不同浓度的CEA对应的ECL信号响应(A)和信号的变化值(B):(a)10-15g/mL,(b)10-14g/mL,(c)10-13g/mL,(d)10-12g/mL,(e)10-11g/mL,(f)10-10g/mL,(g)10-9g/mL,(h)10-8g/mL,(i)10-7g/mL。
图6 ECL信号变化与目标物浓度的关系,插图为CEA检测的标准校正曲线。
图7对不同目标物的ECL响应信号变化值
具体实施方式:
实施例1.电致化学发光生物传感器的制备及对CEA的检测
目标辅助循环放大过程:首先取10μL的适体DNA-trigger DNA反应溶液,加入不同浓度的目标物CEA,置于摇床内反应40min。之后,在反应管里加入10μL的primer DNA,10μL的template DNA,6μL的dNTPs,5U的phi29聚合酶和5U的Nt.BbvCI内切酶以及各自对应的缓冲液,最后将混合的反应溶液置于37℃摇床中反应90min,进行目标辅助的目标循环放大反应以产生Walker DNA。最后将反应管在60℃水浴环境中灭活20min,自然冷却至室温之后置于4℃备用。
制备信号探针过程:先将100μL的水相CdSe QDs与10μL的EDC(0.1M)和10μL NHS(0.025M)充分混合,反应15min,进行量子点表面羧基基团的活化。然后将50μL的probe DNA加入活化好的量子点溶液里面,室温下反应4h,最后将反应结束的溶液在10000rpm下离心20min,除去上层未结合的DNA,再将下层的沉淀分散在二次水中,4℃下保存备用。
电极的预处理:将几支金电极进行编号,方便进行不同浓度检测;之后将电极依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的铝粉进行表面的抛光处理,用二次水冲洗干净表面。然后将电极置于无水乙醇中超声处理10min,最后再用二次水冲洗干净备用。
利用合成的纳米金作为电极修饰材料。首先取1mL纳米金,12000rpm下离心30min,去掉上清液之后,重新加入1mL二次水,超声15min。取10μL纯化的纳米金溶液滴加到处理好的电极表面,室温下自然晾干。然后取10μL探针DNA溶液,滴在电极表面。在湿润的环境下通过巯基DNA与纳米金结合,反应16h。之后用二次水冲洗表面未结合的探针,然后利用巯基己醇对电极封板30min。将电极表面未结合的巯基己醇冲洗掉,将电极插入到含有Pb2+离子的循环放大反应溶液,进行Pb2+辅助的Walker DNA识别剪切,反应60min之后,检测ECL信号。
实施例2.电致化学发光生物传感器的制备及对CEA的检测
将“首先取10μL的适体DNA-trigger DNA反应溶液,加入不同浓度的目标物CEA,置于摇床内反应40min。”改为“首先取10μL的适体DNA-trigger DNA反应溶液,加入不同浓度的目标物CEA,置于摇床内反应60min。”制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对CEA检测的结果同实施例1。
实施例3.电致化学发光生物传感器的制备及对CEA的检测
将“之后,在反应管里加入10μL的primer DNA,10μL的template DNA,6μL的dNTPs,5U的phi29聚合酶和5U的Nt.BbvCI内切酶以及各自对应的缓冲液,最后将混合的反应溶液置于37℃摇床中反应90min,进行目标辅助的目标循环放大反应以产生Walker DNA。”改为“之后,在反应管里加入10μL的primer DNA,10μL的template DNA,6μL的dNTPs,7U的phi29聚合酶和5U的Nt.BbvCI内切酶以及各自对应的缓冲液,最后将混合的反应溶液置于37℃摇床中反应90min,进行目标辅助的目标循环放大反应以产生Walker DNA。”制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对CEA检测的结果同实施例1。
实施例4.电致化学发光生物传感器的制备及对CEA的检测
将“之后,在反应管里加入10μL的primer DNA,10μL的template DNA,6μL的dNTPs,5U的phi29聚合酶和5U的Nt.BbvCI内切酶以及各自对应的缓冲液,最后将混合的反应溶液置于37℃摇床中反应90min,进行目标辅助的目标循环放大反应以产生Walker DNA。”改为“之后,在反应管里加入10μL的primer DNA,10μL的template DNA,6μL的dNTPs,5U的phi29聚合酶和7U的Nt.BbvCI内切酶以及各自对应的缓冲液,最后将混合的反应溶液置于37℃摇床中反应90min,进行目标辅助的目标循环放大反应以产生Walker DNA。”制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对CEA检测的结果同实施例1。
实施例5.电致化学发光生物传感器的制备及对CEA的检测
将“之后,在反应管里加入10μL的primer DNA,10μL的template DNA,6μL的dNTPs,5U的phi29聚合酶和5U的Nt.BbvCI内切酶以及各自对应的缓冲液,最后将混合的反应溶液置于37℃摇床中反应90min,进行目标辅助的目标循环放大反应以产生Walker DNA。”改为“之后,在反应管里加入10μL的primer DNA,10μL的template DNA,6μL的dNTPs,5U的phi29聚合酶和5U的Nt.BbvCI内切酶以及各自对应的缓冲液,最后将混合的反应溶液置于37℃摇床中反应120min,进行目标辅助的目标循环放大反应以产生Walker DNA。”制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对CEA检测的结果同实施例1。
实施例6.电致化学发光生物传感器的制备及对CEA的检测
将“经过将电极表面未结合的巯基己醇冲洗掉之后,将电极插入到含有Pb2+离子的循环放大的反应液里,进行Pb2+辅助的Walker DNA的识别剪切作用,反应60min之后,最后检测ECL信号。”改为“经过将电极表面未结合的巯基己醇冲洗掉之后,将电极插入到含有Pb2+离子的循环放大的反应液里,进行Pb2+辅助的Walker DNA的识别剪切作用,反应120min之后,最后检测ECL信号。”制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对CEA检测的结果同实施例1。
Claims (3)
1.一种基于Walker DNA和循环放大技术的电化学发光生物传感器,其特征是:利用CdSe量子点标记包含DNAzyme特定序列的DNA构建ECL信号探针,通过脱氧核酶驱动WalkerDNA循环放大反应和酶循环剪切DNA信号探针放大技术,构建电致化学发光生物传感器。
2.一种制备权利要求1所述的基于Walker DNA和循环放大技术的电化学发光生物传感器的方法和应用,其特征方法由下列步骤组成:
步骤1.制备信号探针:将100μL的水相CdSe QDs与10μL的EDC(0.1M)和10μL NHS(0.025M)充分混合,反应15min,进行量子点表面羧基基团的活化。然后将50μL的probe DNA加入活化好的量子点溶液里面,室温下反应4h,最后将反应结束的溶液在10000rpm下离心20min,除去上层未结合的DNA,再将下层的沉淀分散在二次水中,4℃下保存备用。
步骤2.电极的处理:将几支金电极进行编号,方便进行不同浓度检测;之后将电极依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的铝粉进行表面的抛光处理,用二次水冲洗干净表面。然后将电极置于无水乙醇中超声处理10min,最后再用二次水冲洗干净备用。
步骤3 生物传感器的制备:利用纳米金作为电极修饰材料。取1mL纳米金,12000rpm下离心30min,去掉上清液之后,重新加入1mL二次水,将其超声15min。取10μL纯化后的纳米金溶液滴加到处理好的电极表面,室温下自然晾干,然后取10μL探针DNA溶液,滴在电极表面。在湿润环境下通过巯基DNA与纳米金形成Au-S键结合,反应16h。之后用二次水小冲洗表面未结合的探针,然后利用巯基己醇对电极进行封板30min,使得电极表面的DNA保持直立状态。将电极表面未结合的巯基己醇冲洗后,将电极插入到含有Pb2+离子的循环放大的反应液里,进行Pb2+辅助的Walker DNA识别剪切作用,反应60min后,检测ECL信号。
3.根据权利要求2所述的癌胚抗原(CEA)检测方法,其特征是:所述的电化学发光测试是将表面进行反应完成的电极作为工作电极,三电极体系中检测ECL信号。ECL检测液为pH为7.4的PBS溶液(0.1M),含有K2S2O8(0.05M)和KCl(0.1M),其中K2S2O8作为共反应剂与量子点发生反应,检测电压范围为0~-1.5V,扫描速率为0.1V/s,光电倍增管的为-800V。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110470714A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-11-19 | 青岛科技大学 | 一种基于dna步行器诱导构象转化和信号放大的电化学发光传感器及其应用 |
CN111996292A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-11-27 | 湖南工程学院 | 基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法 |
CN112626242A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-04-09 | 宁波大学 | 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法 |
CN115494135A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-12-20 | 青岛科技大学 | 一种基于COF薄膜和AgInS2量子点的光电化学生物传感器及检测双目标应用 |
WO2023123806A1 (zh) * | 2021-12-31 | 2023-07-06 | 杭州傲敏生物科技有限公司 | 一种基于DNAzyme辅助信号放大的荧光免疫分析方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106645107A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-05-10 | 青岛科技大学 | 一种基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光生物传感器及其制法和应用 |
CN108226141A (zh) * | 2017-05-27 | 2018-06-29 | 青岛科技大学 | 一种基于原位合成的Ag纳米簇电致化学发光传感器的研制及其应用 |
-
2018
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106645107A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-05-10 | 青岛科技大学 | 一种基于CdSe/ZnS量子点纳米簇的电化学发光生物传感器及其制法和应用 |
CN108226141A (zh) * | 2017-05-27 | 2018-06-29 | 青岛科技大学 | 一种基于原位合成的Ag纳米簇电致化学发光传感器的研制及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
QIAN KUANG 等: "Three-way DNA junction structure combined with zyme-powered cascade amplification for ultrasensitive electrochemiluminescence detection of microRNA via smart DNA walker", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL》 * |
蒲楠平 等: "基于目标物循环放大和DNA分子机器的电致化学发光microRNA传感器的研究", 《化学传感器》 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110470714A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-11-19 | 青岛科技大学 | 一种基于dna步行器诱导构象转化和信号放大的电化学发光传感器及其应用 |
CN110470714B (zh) * | 2019-08-20 | 2022-07-01 | 青岛科技大学 | 一种基于dna步行器诱导构象转化和信号放大的电化学发光传感器及其应用 |
CN111996292A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-11-27 | 湖南工程学院 | 基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法 |
CN111996292B (zh) * | 2020-09-04 | 2023-05-09 | 湖南工程学院 | 基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法 |
CN112626242A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-04-09 | 宁波大学 | 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法 |
CN112626242B (zh) * | 2020-12-11 | 2022-05-24 | 宁波大学 | 基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法 |
WO2023123806A1 (zh) * | 2021-12-31 | 2023-07-06 | 杭州傲敏生物科技有限公司 | 一种基于DNAzyme辅助信号放大的荧光免疫分析方法 |
CN115494135A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-12-20 | 青岛科技大学 | 一种基于COF薄膜和AgInS2量子点的光电化学生物传感器及检测双目标应用 |
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