CN104562215B - 扩增子文库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种扩增子文库的构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集目的片段；以及S2，对富集的目的片段进行片段化文库构建，得到扩增子文库；其中，步骤S1包括以下步骤：S11，对目的片段的扩增模板进行定量；S12，对目的片段的扩增引物的退火温度进行固定；以及S13，利用扩增引物在退火温度下对目的片段进行扩增，得到富集目的片段。上述构建方法通过对来自于不同环境的核酸样本进行准确定量扩增体系中的模板量，使得不同样本间目的片段的扩增效率相当，进而降低测序数据的波动性；通过对所用引物的退火温度进行优化，降低扩增子文库中的非特异扩增子的比例，提高了扩增子文库的合格率。

Description

扩增子文库的构建方法

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种扩增子文库的构建方法。

背景技术

生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。第一代测序仪对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和并行化程度，也难以通过微型化降低测序成本。经过不断的技术开发和改进，21世纪初，以Roche 454技术、illumina公司的Genome Analyzer技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代技术大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确性。其中，illumina公司的第一台测序仪于2006年问世，之后开发出来一系列的测序仪，如Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、Hiseq X等，在准确性、通量、成本和速度方面表现更优秀，而使其成为全球使用量最大的第二代测序仪。在第二代测序平台不断完善的同时，以对单分子DNA进行非PCR测序为主要特征的第三代测序技术也初显端倪。但由于其关键技术问题尚待解决，目前还未得到广泛应用。

环境中微生物的群落结构和多样性是微生物生态学的研究热点。微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。传统研究手段存在实验操作费时费力、不可培养性、无法检测痕量微生物、无法探索未知等的局限性。第二代高通量测序技术，尤其是illumina Miseq高通量测序技术的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地检测环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，精确指导不同环境微生物的构成。

16S rDNA是编码细菌核糖体小亚基的DNA序列，分子大小约1540bp，由9个可变区和10个保守区交叉排列组成。保守区能反映物种间亲缘关系，可变区在不同菌种间存在差异。根据保守区序列设计引物，将可变区扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的细菌种类。研究表明，V4靶基因区域(约300bp)对微生物进行分类较为准确。

ITS1是位于真核生物的18S rRNA和5.8S rRNA之间的内转录区域，ITS2位于真核生物的5.8S rRNA和28S rRNA之间的内转录区域。由于进化相对于18S rRNA、5.8S rRNA和28SrRNA迅速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学研究。根据保守区序列设计引物，将其扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的真菌种类，是目前非常常见的分析真菌方法。

扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，不仅包括16SrDNA测序，还包括18S rDNA测序、ITS测序及功能基因检测等。采用illumina MiSeq第二代高通量测序平台对来源于不同环境的样本进行16S/18S/ITS中某个高变区域深度测序，能灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的变化而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系，环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。

为进行微生物扩增子区域的测序，首先需要对目标样本进行PCR扩增，然后构建适用于二代测序平台的文库。目前的扩增体系主要有20ul和50ul两种，体系中模板量的添加一般为经验值，并没有一个确定的量，波动性较大，对扩增结果也影响较大。同时退火温度则根据引物的不同而不同，一般在50-60℃之间。利用现有扩增技术对上述扩增子进行扩增，合格率低且非特异性条带较多。对于难扩增的ITS1和ITS2区域扩增一般使用的Touchdown技术(65-50℃)，对PCR仪要求较高。

因此，仍需要对现有的针对微生物扩增子的扩增方法进行改进，以降低扩增子文库中非扩增子的含量，提高扩增子文库的合格率，降低文库构建成本。

发明内容

本发明提供了一种微生物扩增子文库的构建方法，以降低扩增子文库中非扩增子的含量，提高扩增子文库的合格率，降低文库构建成本。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种微生物扩增子文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集的目的片段；以及S2，对富集的目的片段进行片段化文库构建，得到扩增子文库；其中，步骤S1包括以下步骤：S11，对目的片段的扩增模板进行定量；S12，对目的片段的扩增引物的退火温度进行固定；以及S13，利用扩增引物在退火温度下对目的片段进行扩增，得到富集目的片段。

进一步地，目的片段为16SV4、ITS1或ITS2。

进一步地，当目的片段为16SV4时，扩增引物为SEQ ID NO:1所示的正向引物：GTGCCAGCMGMWGCGGTAA；以及SEQ ID NO:2所示的反向引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

进一步地，扩增引物的退火温度为48～52℃，优选为50℃。

进一步地，当目的片段为16SV4时，扩增模板为10-20ng。

进一步地，当目的片段为ITS1时，扩增引物为SEQ ID NO:3所示的正向引物：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；以及SEQ ID NO:4所示的反向引物：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。

进一步地，扩增引物的退火温度为55～56℃，优选为55.3℃。

进一步地，当目的片段为ITS1时，扩增模板为20-30ng。

进一步地，当目的片段为ITS2时，扩增引物为SEQ ID NO:5所示的正向引物：GCATCGCATAAGAACGCAGC；以及SEQ ID NO:6所示的反向引物：TCCTCCCCATATTGATATGC；优选扩增引物的退火温度为56～58℃，更优选为57.6℃。

进一步地，当目的片段为ITS2时，扩增模板为15-50ng。

应用本发明的技术方案，通过对来自于不同环境的核酸样本进行准确定量扩增体系中的模板量，使得不同样本间目的片段的扩增效率相当，因而使产生的测序数据的波动性降低；通过对所用引物的退火温度进行优化，实现了利用普通PCR仪，经过简单操作，提供了一种目的片段扩增合格率高、非特异条带少的扩增文库构建方法。本发明的上述方法不仅降低扩增子文库的构建成本，而且降低扩增子文库中的非特异扩增子的比例，提高了扩增子文库的合格率。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的一种典型实施方式中扩增子文库构建的流程示意图；

图2示出了根据本发明的实施例1所提供的16SV4扩增子的电泳检测结果图；

图3示出了根据本发明的实施例2所提供的ITS1扩增子的电泳检测结果图；以及

图4示出了根据本发明的实施例3所提供的ITS2扩增子的电泳检测结果图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

正如背景技术部分所提到的，现有技术的微生物扩增子文库构建方法中，文库构建合格率低且不同样本间测序数据波动性较大的缺陷，为了改善上述状况，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种微生物扩增子文库的构建方法，如图1所示，该构建方法包括以下步骤：S1，对目的片段进行扩增，得到富集目的片段；以及S2，对富集的目的片段进行片段化文库构建，得到扩增子文库；其中，步骤S1包括以下步骤：S11，对目的片段的扩增模板进行定量；S12，对目的片段的扩增引物的退火温度进行固定；以及S13，利用扩增引物在退火温度下对目的片段进行扩增，得到富集目的片段。

在本发明的上述构建方法中，通过对来自于不同环境的核酸样本进行准确定量扩增体系中的模板量，使得不同样本间目的片段的扩增效率相当，因而使产生的测序数据的波动性降低；通过对所用引物的退火温度进行优化，实现了利用普通PCR仪，经过简单操作，提供了一种目的片段扩增合格率高、非特异条带少的扩增文库构建方法。本发明的上述方法不仅降低扩增子文库的构建成本，而且降低扩增子文库中的非特异扩增子的比例，提高了扩增子文库的合格率。

在本发明的上述构建方法中，是一种适用于环境微生物扩增子的高效扩增方法，能在普通的PCR设备上完成扩增，不仅扩增合格率高，而且在扩增中产生的非特异性条带少。上述扩增子即目的片段，根据研究目的的不同，可以是不同的基因或基因组片段。在本发明一优选的实施例中，上述目的片段可以是16SV4、ITS1或ITS2。上述三个目的片段能够根据其片段中的某个高变区来体现环境中微生物的多样性或环境中微生物群落结构随外界环境的变化。

在本发明的上述构建方法中，当目的片段为16SV4时，扩增引物为SEQ ID NO:1所示的正向引物：GTGCCAGCMGMWGCGGTAA；以及SEQ ID NO:2所示的反向引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。上述引物是根据其保守序列进行设计，引物之间扩增的目的片段是不同物种间的可变区，采用上述引物能够将不同环境中的16SV4的可变区都扩增出来，从而得到来源于不同环境不同微生物中的16SV4的可变区，从而可以鉴定环境中微生物的种类。

在本发明的上述构建方法中，当目的片段为16SV4时，采用上述扩增引物进行扩增时，扩增引物的退火温度为48～52℃，优选为50℃。通过对16SV4的上述扩增引物的退火温度进行优化，将其扩增引物的退火温度控制在48～52℃范围内，能够显著降低引物的非特异性，减少16SV4目的片段中的非特异性片段。当将16SV4的上述扩增引物的退火温度设定为50℃时，16SV4目的片段的扩增效率更高，且非特异性片段更少。

在本发明的上述构建方法中，当目的片段为16SV4时，对目的片段的扩增模板进行定量时，可以采用多种方法进行定量，只要能够使扩增模板的量相对均一，进而扩增得到的目的片段的量相对均衡即可。在本发明中，当目的片段为16SV4时，优选将上述扩增模板控制在1-10ng。将来源于不同环境的不同样本中的16SV4扩增的模板控制在10-20ng范围内，如图2所示，能够使各个样本的16SV4扩增量相对均一，进而能够使所构建的扩增子文库产出的测序数据中各样本间的数据均一性较好。

在本发明的上述构建方法中，当目的片段为ITS1时，扩增引物为SEQ ID NO:3所示的正向引物：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；以及SEQ ID NO:4所示的反向引物：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。上述引物是根据ITS1在各微生物菌种中的保守序列进行设计，引物之间扩增的目的片段是能够体现不同物种的可变区，采用上述引物能够将不同环境中的ITS1的可变区都扩增出来，从而得到来源于不同环境的不同微生物中的ITS1的可变区，从而可以鉴定环境中微生物菌种的种类。

在本发明的上述构建方法中，当目的片段为ITS1时，采用上述扩增引物进行扩增时，扩增引物的退火温度为55～56℃，优选为55.3℃。通过对ITS1的上述扩增引物的退火温度进行优化，将原来通过touch down的方式进行扩增，其先在65-50℃15个循环，然后50度10个循环，这该条件下扩增，目的片段的非特异性非常强，扩增效率不高。而将其扩增引物的退火温度控制在55～56℃范围内，能够显著降低引物的非特异性，减少ITS1目的片段中的非特异性片段。当将ITS1的上述扩增引物的退火温度设定为55.3℃时，ITS1目的片段的扩增效率更高，且非特异性片段更少。

在本发明的上述构建方法中，当目的片段为ITS1时，对目的片段的扩增模板进行定量时，可以采用多种方法进行定量，只要能够使扩增模板的量相对均一，进而扩增得到的目的片段的量相对均衡即可。在本发明中，当目的片段为ITS1时，优选将上述扩增模板控制在20-30ng。将来源于不同环境的不同样本中的ITS1扩增的模板控制在20-30ng范围内，如图3所示，能够使各个样本的ITS1扩增量相对均一，进而能够使所构建的扩增子文库产出的测序数据中各样本间的数据均一性较好。

在本发明的上述构建方法中，当目的片段为ITS2时，扩增引物为SEQ ID NO:5所示的正向引物：GCATCGCATAAGAACGCAGC；以及SEQ ID NO:6所示的反向引物：TCCTCCCCATATTGATATGC。上述引物是根据ITS2在各微生物菌种中的保守序列进行设计，引物之间扩增的目的片段是能够体现不同物种的可变区，采用上述引物能够将不同环境中的ITS2的可变区都扩增出来，从而得到来源于不同环境的不同微生物中的ITS2的可变区，从而可以鉴定环境中微生物菌种的种类。

在本发明的上述构建方法中，当目的片段为ITS2时，采用上述扩增引物进行扩增时，扩增引物的退火温度为56～58℃，更优选为57.6℃。通过对ITS2的上述扩增引物的退火温度进行优化，将原来通过touch down的方式进行扩增，其先在65-50℃15个循环，然后50度10个循环，这该条件下扩增，目的片段的非特异性非常强，扩增效率不高。而将其扩增引物的退火温度控制在56～58℃范围内，能够显著降低引物的非特异性，减少ITS2目的片段中的非特异性片段。当将ITS2的上述扩增引物的退火温度设定为57.6℃时，ITS2目的片段的扩增效率更高，且非特异性片段更少。

在本发明的上述构建方法中，当目的片段为ITS2时，对目的片段的扩增模板进行定量时，可以采用多种方法进行定量，只要能够使扩增模板的量相对均一，进而扩增得到的目的片段的量相对均衡即可。在本发明中，当目的片段为ITS2时，优选将上述扩增模板控制在15-50ng。将来源于不同环境的不同样本中的ITS2扩增的模板控制在15-50ng范围内，如图4所示，能够使各个样本的ITS2扩增量相对均一，且扩增合格率能够从原来的50～60％提高到90％以上，进而能够使所构建的扩增子文库产出的测序数据中各样本间的数据均一性较好。

下面将结合具体实施例来进一步说明本发明的有益效果。

实施例1：一种16SV4扩增子文库构建的方法，具体步骤如下：

(1)收集环境微生物样品，并提取样品中的基因组DNA。例如，采用土壤基因组DNA提取试剂盒(DP336，天根)，从土壤样品中提取微生物的DNA。

(2)使用琼脂糖凝胶电泳，检测基因组DNA的完整性、浓度和污染情况。如果样品中存在大量的RNA需要使用RNase消化，如果样本中存在较多杂质(如腐殖酸、有机溶剂等)，可以使用XP磁珠纯化样本，同时结合分光光度计或Qubit对样品进行精确定量。

(3)根据样品的DNA浓度，将样品进行稀释，使其到达合适的浓度。

(4)对16S rDNA的高可变区V4进行扩增(使用引物SEQ ID NO:1：16SV4-F-GTGCCAGCMGMWGCGGTAA；SEQ ID NO:2：16SV4-R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT；并且使每个样本携带特异的标签序列)，扩增反应体系如下(30μl)：

(5)反应程序如下：

(6)每个样品扩增两个技术重复，并在检测前混合成一管。

(7)电泳检测PCR产物。对每个样品取3μl进行产物检测，16S V4区为300bp左右，检测如图2。

(8)对获得的目的片段进行纯化，构建测序文库，测序后分析其物种构成。

多次实验结果表明：与现有技术中未定量的16SV4扩增相比，采用实施例1中的经过定量后的样本以及优化后的退火温度，一次扩增合格率从68％提高到92％。

实施例2：一种ITS1扩增子文库构建的方法，其主要实验步骤如下：

(1)收集环境微生物样品，并提取样品中的基因组DNA。例如，采用土壤基因组DNA提取试剂盒(DP336，天根)，从土壤样品中提取微生物的DNA。

(2)使用琼脂糖凝胶电泳，检测基因组DNA的完整性、浓度和污染情况。如果样品中存在大量的RNA需要使用RNase消化；如果样本中存在较多杂质(如腐殖酸、有机溶剂等)，可以使用XP磁珠纯化样本；同时结合分光光度计或Qubit对样品进行精确定量。

(3)根据样品的DNA浓度，将样品进行稀释，使其到达合适的浓度。

(4)对ITS1进行扩增(使用引物SEQ ID NO:3：ITS1-F-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；SEQ ID NO:4：ITS1-R-GCTGCGTTCTTCATCGATGC；并且使每个样本携带特异的标签序列)，扩增反应体系如下(30μl)：

(5)PCR反应程序如下：

(6)每个样品扩增两个技术重复，并在检测前混合成一管。

(7)电泳检测PCR产物。对每个样品取3μl进行产物检测，ITS1区为200-350bp左右，检测如图3。

(8)对获得的目的片段进行纯化，构建测序文库，测序后分析其物种构成。

按照实施例2所示方法进行多次实验的结果表明；在对模板量和退火温度进行优化以后，相较于以前的touchdown PCR，扩增合格率从前期的30％提高到78％。

实施例3：一种应用于ITS2扩增子文库构建的方法，其主要实验步骤如下：

(1)收集环境微生物样品，并提取样品中的基因组DNA。例如，采用土壤基因组DNA提取试剂盒(DP336，天根)，从土壤样品中提取微生物的DNA。

(2)使用琼脂糖凝胶电泳，检测基因组DNA的完整性、浓度和污染情况。如果样品中存在大量的RNA需要使用RNase消化；如果样本中存在较多杂质(如腐殖酸、有机溶剂等)，可以使用XP磁珠纯化样本。同时结合分光光度计或Qubit对样品进行精确定量。

(3)根据样品的DNA浓度，将样品进行稀释，使其到达合适的浓度。

(4)对ITS2(使用引物SEQ ID NO:5：ITS2-F-GCATCGCATAAGAACGCAGC；SEQ ID NO:6：ITS2-R-TCCTCCCCATATTGATATGC；并且使每个样本携带特异的标签序列)，扩增反应体系如下(30μl)：

(5)反应程序如下：

(6)每个样品扩增两个技术重复，并在检测前混合成一管。

(7)电泳检测PCR产物。对每个样品取3μl进行产物检测，ITS2区为380bp左右，检测如图4。

(8)对获得的目的片段进行纯化，构建测序文库，上机测序后分析其物种构成。

按照实施例3所示方法进行多次实验的结果表明；在对模板量和退火温度进行优化以后，相较于以前的touchdown PCR，扩增合格率从前期的50％提高到90％以上，且扩增效果更好(具体表现为扩增条带明亮单一，无杂带)。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例通过对来自于不同环境的核酸样本通过Qubit或Nanodrop确定其浓度，进而准确定量扩增体系中的模板量：16SV4区域扩增模板量为10-20ng，ITS1区域扩增模板量为20-30ng，ITS2区域扩增模板量为15-50ng；并且针对特定的引物确定特定退火温度，16SV4为50℃，ITS1为55.3℃，ITS2为57.6℃；实现了利用简单操作和普通PCR仪，提供一种目的片段扩增合格率高、非特异条带少的扩增方法。可见，本发明的上述方法是一种高效微生物扩增子的扩增方法，能在最普通的PCR设备上完成扩增，不仅扩增合格率高，而且在扩增中产生的非特异性条带少。

本发明上述方法可以应用于微生物扩增子扩增，合格样本可用于混合文库构建，上机测序后可以用于样本中微生物种群分析。除用于微生物种群多样性的扩增子扩增外(如上文提到的16SV4、ITS1、ITS2以外，还适用于16SV3-4、16SV9、18SV4、18SV9)，同样适用于其它功能基因的扩增，如与水稻籽粒大小密切相关的基因，只需更改扩增引物即可

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种扩增子文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

S1，对目的片段进行扩增，得到富集的目的片段；以及

S2，对所述富集的目的片段进行片段化文库构建，得到所述扩增子文库；

其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：

S11，对所述目的片段的扩增模板进行定量；

S12，对所述目的片段的扩增引物的退火温度进行固定；以及

S13，利用所述扩增引物在所述退火温度下对所述目的片段进行扩增，得到所述富集目的片段；

所述目的片段为16SV4或ITS2,

所述16SV4的所述扩增引物为SEQ ID NO:1所示的正向引物：GTGCCAGCMGMWGCGGTAA；以及SEQ ID NO:2所示的反向引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT；

所述ITS2的所述扩增引物为SEQ ID NO:5所示的正向引物：GCATCGCATAAGAACGCAGC；以及SEQ ID NO:6所示的反向引物：TCCTCCCCATATTGATATGC；

16SV4的所述扩增引物的所述退火温度为48～52℃，所述16SV4的所述扩增模板为10-20ng；

ITS2的所述扩增引物的所述退火温度为56～58℃，所述ITS2的所述扩增模板为15-50ng。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述16SV4的所述扩增引物的所述退火温度为50℃。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述ITS2的扩增引物的所述退火温度为57.6℃。