ES2317928T3 - Metodo de tipaje o secuenciacion de un acido nucleico. - Google Patents

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Abstract

Un método para la tipificación de una o varias moléculas de ácido nucleico, comprendiendo dicho método: hibridar simultáneamente dos o más cebadores de ampliación a dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y realizar las reacciones de ampliación del cebador a partir de éste, uniendo cada cebador en un sitio predeterminado diferente en dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y en el que los nucleótidos son añadidos a la mezcla de reacción secuencialmente en un orden conocido o predeterminado, y determinar el modelo de incorporación de nucleótidos secuenciando por síntesis para obtener un modelo de ensayo para dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico que se compara opcionalmente con uno o varios modelos de referencia para la tipificación de dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico.

Description

Método de tipaje o secuenciación de un ácido nucléico.
Esta invención se refiere a un método de tipificación usando ácidos nucleicos, y, particularmente, a un método mejorado de genotipificación.
La tipificación, por ejemplo la genotipificación, puede ser particularmente ventajosa para los diagnósticos médicos, pronósticos y tratamientos. Por ejemplo, la identificación de los microbios responsables de una infección permite que sea administrado el tratamiento correcto. Se ha demostrado que los microbios pueden ser fácilmente identificados por tipificación (es decir, mediante la identificación de modelos distintivos genómicos característicos de cada microbio particular). La tipificación de una o varias regiones variables en un gen o varios genes u otra secuencia de ácidos nucleicos de un individuo puede revelar marcadores de predisposición a una enfermedad, condición o síndrome particular, y también puede indicar el mejor método de tratamiento de lo anterior. Los métodos de tipificación son también útiles para análisis genómicos (por ejemplo, en la tipificación de polimorfismos o variaciones alélicas), tipificación de tejidos o control medioambiental y ensayos de contaminación, etc.
Se ha publicado sobre la genotipificación a gran escala en Shi (Clinical Chemistry, 47:2, 164-172/2001). En esta publicación se proporciona una revisión de una tecnología reciente tal como la Pyrosequencing^{TM} en la detección de mutaciones y la genotipificación con un foco en la genotipificación de polimorfismos de nucleótido simple (SNP, de sus siglas en inglés "Single Nucleotide Polymorphisms").
Los ensayos convencionales para la detección de especies bacterianas o virales, o para detectar mutaciones o polimorfismos en una secuencia de ADN incluyen la utilización del método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este método se diseña para permitir la ampliación selectiva de una secuencia de ADN diana particular o secuencias, determinadas por la naturaleza de los cebadores de ampliación usados. Para permitir tal ampliación selectiva, se requiere algo de conocimiento previo de la secuencia del ADN, lo que permite la construcción de dos secuencias de cebador de oligonucleótido, conocidas como amplímeros. Un amplímero se hibrida en el extremo 5' o hacia éste de una de las cadenas del ADN diana y el otro amplímero en el extremo 5' o hacia éste de la segunda cadena. En presencia de una ADN polimerasa y de precursores de ADN (es decir, dATP, dCTP, dGTP y dTTP) los cebadores pueden iniciar la síntesis de nuevas cadenas de ADN que son complementarias a las cadenas individuales del segmento de ADN diana. El uso de una polimerasa termoestable permite que el procedimiento sea fácilmente repetido o ciclado. Las cadenas de ADN recién sintetizadas actúan como plantillas para la posterior síntesis de ADN en ciclos subsecuentes. La mezcla de reacción es sometida a una temperatura de aproximadamente 90ºC para separar el ADN bicatenario formado por la polimerasa. La temperatura de reacción se reduce a aproximadamente entre 50ºC y 70ºC para permitir que el ADN monocatenario se hibride a los cebadores, y se realiza otro ciclo de la síntesis de ADN. El ADN sintetizado se extiende entre los extremos de los dos cebadores. Preferentemente, la ADN polimerasa usada es termofílica, es decir, Taq polimerasa. Después de 30 ciclos de síntesis de ADN, los productos de la PCR incluirán aproximadamente 10^{5} copias de la secuencia diana específica. Un ciclo de reacción de la PCR típico es por lo tanto: la síntesis de las cadenas separadas por ampliación del cebador, la separación de cadenas, la hibridación del cebador, la síntesis de nuevas cadenas.
La reacción en cadena puede ser, por lo tanto, perpetuada simplemente aumentando y disminuyendo la temperatura.
La tipificación (por ejemplo, la genotipificación) se realiza usando técnicas basadas en la PCR, por ejemplo, usando cebadores específicos de alelo (Okamoto, et al. 1992, Journal of General Virology, 73,673-679; Widell, A., et al. 1994, Journal of Medical Virology, 44,272-279).
Actualmente, puede usarse PCR múltiple para rastrear muestras de ácidos nucleicos para un panel dado de mutaciones/variaciones dentro de la secuencia de ácidos nucleicos. Este método es, sin embargo, incómodo para el diagnóstico rutinario, ya que es esencial el uso de electroforesis de gel. Los métodos alternativos se basan en el uso de nucleótidos marcados o cebadores, y pueden requerir estrategias o mecanismos de detección complejos. Queda por lo tanto una necesidad de un método de tipificación que pueda analizar ácidos nucleicos con respecto a 2 o más regiones variables o posiciones típicamente sin la necesidad de la electroforesis de gel y preferentemente sin el uso de nucleótidos marcados o cebadores.
Otros métodos para la tipificación incluyen métodos de detección serológicos (Viazov, et al. 1994, Journal of Virological Methods, 48,81-91; Schroter, M., 1999, Journal of Medical Virology, 57,230-234), ensayo de sonda lineal (Stuyver, L., 1993, Journal of General Virology, 74,1093-1102, Stuyver, L., 1996, Transfusion, 36, 552-558), y polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (McOmish et al. 1993, Transfusion, 33,7-13; Buoro, S. 1999, Intervirology, 42,1-8) son conocidos en la técnica. Sin embargo, la secuenciación sigue siendo considerada en la técnica como el método "estándar por excelencia" para la tipificación. En consecuencia, un método de tipificación basado en la secuenciación que evite los inconvenientes mencionados anteriormente representaría un avance considerable en la técnica.
En la publicación de Aldeborn et al. (Genome Research, 10: 1249-1259, 2000) se habla sobre la tipificación de diferentes SNP en paralelo usando la Pirosecuenciación®. Un cebador de secuenciación se hibrida al ácido nucleico diana y se realizan reacciones separadas para dianas diferentes en paralelo usando un instrumento de secuenciación automatizado. Ahmadian et al. (Analytical Biochemistry 280, 103-110, 2000) discuten sobre métodos de alto rendimiento para el análisis de las posiciones del SNP. Los SNP simples son tipificados individualmente usando la técnica de la Pirosecuenciación®.
La PCR también se usa comúnmente en la detección de microbios, es decir bacterias o virus. Sin embargo, los ensayos PCR convencionales están limitados en las aplicaciones diagnósticas, y generalmente sólo indican si un microbio, o una secuencia particular, está presente o no. Para muchas infecciones, por ejemplo, infecciones virales tales como la infección viral por hepatitis C, el microorganismo infectivo puede aparecer en varios subtipos diferentes, por ejemplo al menos siete subtipos (o genotipos) son conocidos del virus HCV. Sería ventajoso en tales circunstancias no sólo determinar que está presente la "clase" general (o género o especie) del microorganismo infectivo (por ejemplo, el virus de HCV), sino también determinar cuál de los subtipos está presente.
Del mismo modo, los estudios genómicos han revelado en la actualidad que muchas otras enfermedades o desórdenes pueden tener que ver con variaciones genéticas (por ejemplo, mutaciones, variaciones alélicas o polimorfismos (por ejemplo, polimorfismos de nucleótido simple, (SNP)), y que la presencia de tales variaciones puede indicar un riesgo o predisposición a una enfermedad o desorden, o puede indicar o hasta predecir cómo un individuo puede responder a un tratamiento particular por aquella enfermedad o desorden (este efecto último se refiere a la "farmacogenómica"). En consecuencia, en la ciencia clínica, el análisis (la tipificación) de tales variaciones puede tener impor-
tancia.
Los subtipos microbianos y los polimorfismos clínicamente informativos (u otras variaciones genéticas) son caracterizados, con frecuencia, mediante combinaciones de variaciones genéticas (es decir, variaciones en posiciones múltiples (es decir, dos o más) o regiones del genoma, etc.). En consecuencia, para fines de tipificación, en tales situaciones, es necesario "tipificar" (o identificar) más de una variación (polimorfismo). En otras palabras, es necesario tipificar (o estudiar o identificar) un modelo polimórfico (un modelo de variaciones genéticas) cuyo modelo pueda cubrir más de una región del genoma que se estudia. (La expresión "modelo polimórfico" se usa en este documento ampliamente para incluir modelos, o combinaciones, de dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) de cualquier tipo de variación genética, por ejemplo, mutaciones, variantes alélicas, polimorfismos de cualquier tipo etc.). Se sobrentiende que la variación puede ser una inserción o deleción de uno o varios residuos de ácidos
nucleicos.
Así, para muchos microorganismos, las enfermedades o la predisposición a la enfermedad, una identificación del tipo exacto del microbio, o variación genética, presentes es necesaria para hacer un diagnóstico apropiado o pronóstico y a fin de conseguir esto es necesario estudiar más de una posición o región de la variante genéticamente. Como se menciona anteriormente, la PCR es un instrumento muy útil para la ampliación y/o la identificación de una secuencia específica del ADN, pero usar técnicas PCR convencionales para determinar el genotipo de una molécula de ácido nucleico basado en variaciones genéticas múltiples requiere que se realice un número repetido y múltiple de reacciones individuales, lo que es incómodo, entretenido y caro de realizar usando tecnologías y procedimientos convencionales tales como, por ejemplo, la electroforesis o tecnologías de marcaje. Hay, por lo tanto, la necesidad de un ensayo de tipificación que sea exacto y fiable, tenga un tiempo de análisis corto y sea rápido y fácil de operar. La presente invención se refiere a esta necesidad.
Particularmente, se ha encontrado ahora que un método simple, fiable y exacto para obtener la información de la tipificación (secuencia) respecto a una pluralidad de sitios variables dentro del ácido nucleico diana, puede ser realizado usando un sistema de reacción de ampliación de cebador usando dos o más cebadores específicos diseñados para unirse en estos sitios variables o cerca de estos, permitiendo que las reacciones de ampliación del cebador sean realizadas en cada cebador hibridado a una secuencia de ácidos nucleicos plantilla, secuencialmente o simultáneamente, y detectando el modelo de incorporación de nucleótidos en dichas reacciones de ampliación del cebador. Proporciona el modelo de incorporación de nucleótidos la información de tipificación sobre dichos sitios variables.
Este nuevo método de la invención combina así un enfoque múltiple (es decir, un enfoque que se basa en el funcionamiento simultáneo o paralelo de reacciones múltiples) con una estrategia particular para detectar el resultado de las extensiones de cebador múltiples, es decir, detectando el modelo de incorporación de nucleótidos.
El método es particularmente adecuado para la automatización, por ejemplo, en sistemas en los que la reacción y las etapas de administración del reactivo ocurren en un formato de placa de microtítulos. Los métodos son particularmente adecuados para identificar especies microbianas y sus subtipos, pero también puede encontrar aplicación en otros procedimientos de tipificación, por ejemplo, la tipificación de polimorfismos, por ejemplo, para la tipificación de tejido o en aplicaciones clínicas.
Como se describe más abajo, la presente invención está ventajosamente basada en un método de "secuenciación por síntesis" (véase, por ejemplo, el documento US-A-4.863.849 de Melamede). Esta es una expresión usada en la técnica para definir métodos de secuenciación que se basan en la detección de la incorporación de nucleótidos durante una reacción de ampliación de la polimerasa dirigida por el cebador. Los cuatro nucleótidos diferentes (es decir, los nucleótidos A, G, T o C) son añadidos cíclicamente o secuencialmente (adecuadamente en una orden conocido), y el acontecimiento de incorporación puede ser detectado de varios modos, directamente o indirectamente. Esta detección revela qué nucleótido se ha incorporado, y a partir de ahí la información de la secuenciación; cuando se añade el nucleótido (base) que forma un par (según las reglas normales del apareamiento de bases, A-T y C-G) con la siguiente base en la secuencia diana de plantilla, será incorporado en la cadena complementaria creciente (es decir, el cebador ampliado) por la polimerasa, y esta incorporación provocará una señal detectable, cuya naturaleza depende de la estrategia de detección seleccionada.
En consecuencia, la presente invención proporciona un método para la tipificación de 1 o más moléculas de ácido nucleico, comprendiendo dicho método:
hibridar simultáneamente dos o más cebadores de ampliación a dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y realizar reacciones de ampliación del cebador a partir de éste, uniendo cada cebador en un sitio predeterminado diferente en dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y determinar el modelo de incorporación de nucleótidos secuenciando por síntesis para obtener un modelo de ensayo (o "huella digital") para dicha molécula de ácido nucleico que es opcionalmente comparado con uno o varios modelos de referencia para la tipificación de dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico.
Preferiblemente, las reacciones de ampliación del cebador ocurren simultáneamente, es decir, ambos o todos los cebadores son hibridados y son capaces de la ampliación del cebador al mismo tiempo. Será, por supuesto, apreciado que cada cebador individual sólo puede ser ampliado si es añadido un nucleótido a la mezcla de reacción que es complementaria con el siguiente nucleótido en la plantilla. Así, para cada adición de nucleótido, no será ampliado realmente cada cebador (o incluso cualquier cebador) y el término "simultáneo" debe ser interpretado con esto en mente.
El método de la invención puede usarse para la tipificación de una molécula de ácido nucleico que contiene dos o más sitios en los cuales su secuencia puede ser variable ("sitios variables") y cada cebador mencionado se une en un sitio que está en un sitio variable o cerca. Pueden ser añadidos diferentes nucleótidos secuencialmente para realizar las reacciones de ampliación del cebador, y son descritos más abajo.
O bien, el método de la invención puede usarse para la tipificación de dos o más moléculas de ácido nucleico que contienen 1 o más sitios en los cuales la secuencia puede ser variable ("sitios variables") y cada cebador se une en un sitio que está en un sitio variable o cerca de éste. Pueden ser añadidos diferentes nucleótidos secuencialmente para realizar las reacciones de ampliación del cebador, y son descritos más abajo. Esta realización puede ser particularmente útil cuando se desea obtener información sobre sitios variables dentro de los genes relacionados, por ejemplo los SNP en el factor V Leiden y la protrombina (FII) que son factores de riesgo genético para el desarrollo de la trombosis venosa.
El término "tipificación" según se usa en este documento incluye cualquier método para analizar la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se analiza (es decir, el ácido nucleico de "ensayo" o diana). Más particularmente, el método de tipificación de la invención incluye métodos para la detección, identificación o análisis de la variación genética o de secuencia (por ejemplo, la variación genómica) en una molécula de ácido nucleico diana o moléculas (como se menciona anteriormente, esto puede ser, por ejemplo, mutación, variaciones alélicas, polimorfismos, etc.). Los métodos de la invención incluyen así métodos para identificar, diferenciar o distinguir una molécula de ácido nucleico o moléculas. Ya que el método de tipificación de la invención se basa en la detección de la variación genética en una molécula de ácido nucleico o moléculas, puede ser considerado como un método de genotipificación. Se sobrentiende que una molécula de ácido nucleico puede ser tipificada y también que un sitio variable dado dentro de una molécula de ácido nucleico puede ser tipificado.
La "genotipificación" según la presente invención implica así determinar el genotipo de la(s) molécula(s) de ácido nucleico diana. En el contexto de esta memoria descriptiva, el "genotipo" puede ser considerado como la combinación particular o el modelo de variaciones genéticas que son estudiadas o analizadas en el método de la invención, que es exhibida (o expresada) por la(s) molécula(s) de ácido nucleico en cuestión. El genotipo puede comprender así la combinación (o modelo) de alelos particulares (es decir, variaciones) que son encontradas en los loci particulares investigados.
En otras palabras, el genotipo es una combinación o un modelo de variaciones genéticas múltiples (o "sitios variables") en el ácido nucleico diana. Las variaciones genéticas que comprenden o comportan el genotipo pueden ser aquellas seleccionadas para el estudio en el método de la invención (a pesar de que otras variaciones genéticas también puedan estar presentes en la molécula, que no sean investigadas). Como se menciona anteriormente, "múltiple", según se usa en este documento, significa 2 o más (o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y las variaciones genéticas ("o sitios variables") pueden ser polimorfismos (por ejemplo, SNP), inserciones, deleciones, mutaciones, regiones hipervariables, motivos variables o variaciones alélicas, etc. Según los métodos de la invención, son investigados simultáneamente 2 o más, preferiblemente 3 o más, por ejemplo, 3-7 sitios variables. A menos que dos de tales sitios variables sean encontrados cerca juntos, por ejemplo, con 50 nucleótidos, preferiblemente con 30 nucleótidos, preferiblemente con 20 nucleótidos, se requerirá un cebador separado a fin de tipificar cada sitio variable. Entonces, cada cebador será responsable de generar la información de tipificación sobre uno o varios sitios variables, un cebador tendrá, por lo tanto, en efecto su(s) "propio(s)" sitio(s) variable(s).
Oportunamente, el ácido nucleico diana puede ser ADN, aunque la tipificación del ARN (por ejemplo, mARN) esté también dentro del ámbito de la invención. Si se desea la tipificación de una muestra de ARN, el método puede incluir además la etapa de generar cDNA a partir de la plantilla de ARN, usando oportunamente la transcriptasa inversa. O bien, de ser deseado, las reacciones de ampliación del cebador pueden ser realizadas directamente en la plantilla de ARN.
El ácido nucleico diana puede ser así cualquier ácido nucleico, aislado o sintético, en cualquier forma deseada o adecuada. Puede ser así ADN genómico, o mARN aislado que puede usarse directamente para análisis por el método de la invención, o que puede ser un producto de ácido nucleico derivado a partir de éste (o el correspondiente a éste), por ejemplo, por síntesis, tal como el cDNA que se menciona anteriormente, o un producto de ampliación (por ejemplo, amplicón PCR), clones o productos de la genoteca etc.
La(s) molécula(s) de ácido nucleico puede(n) ser obtenida(s) o derivada(s) a partir de cualquier fuente adecuada, que puede ser cualquier material que contiene el ácido nucleico, y todas las muestras biológicas y clínicas están incluidas como fuentes posibles, es decir, cualesquiera muestras de células o tejido de un organismo, o cualquier fluido corporal o preparación derivada de éste, así como cultivos celulares, preparaciones celulares, lisados celulares, etc. Las muestras medioambientales, por ejemplo, muestras de suelo y agua o muestras de comida también están incluidas. Las muestras pueden ser nuevamente preparadas o pueden ser tratadas previamente de cualquier modo adecuado, por ejemplo, para su almacenamiento.
Las fuentes representativas de ácido nucleico incluyen así, por ejemplo, productos alimenticios y similares, muestras clínicas y medioambientales. Sin embargo, la fuente será generalmente una muestra biológica, que puede contener cualquier material viral o celular, incluyendo todas la células procarióticas o eucarióticas, virus, bacteriófagos, micoplasmas, protoplastos y orgánulos. Tal material biológico puede comprender así todos los tipos de células de animales mamíferos y no mamíferos, células de planta, algas incluso algas azules-verdes, hongos, bacterias, protozoos, etc. Las fuentes representativas incluyen así sangre entera y productos derivados de la sangre tales como plasma, suero y capa leucocitaria, orina, heces, fluido cerebroespinal o cualquier otro fluido corporal, tejidos, cultivos celulares, suspensiones celulares, etc.
El ácido nucleico puede ser proporcionado para su investigación en cualquier forma adecuada y oportunamente estará contenido en una muestra, por ejemplo, una muestra acuosa (por ejemplo, en un tampón, etc.). El ácido nucleico puede prepararse para el método de tipificación, según se desee, según técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, aislamiento, purificación, clonación, copia, ampliación, etc.
En la realización del método de la invención, se proporcionan dos o más cebadores ("cebadores de ampliación") que se unen al ácido nucleico diana en un sitio predeterminado, siendo diferente cada sitio de unión del cebador, de modo que sean realizadas múltiples y diferentes reacciones de ampliación del cebador. Los cebadores de ampliación son diseñados o seleccionados de modo que sus productos de ampliación sobrelapen (o comprendan) un sitio (por ejemplo, locus o región) de la variabilidad de secuencia (es decir, variación genética) en el ácido nucleico diana. En otras palabras, los cebadores se unen al ácido nucleico diana en, o cerca de, (por ejemplo, entre 1 y 40, entre 1 y 20, entre 1 y 10, o entre 1 y 6 bases de), un sitio variable. Como se menciona anteriormente, tales sitios variables constituyen el genotipo del ácido nucleico diana.
Se requiere que al menos dos cebadores de ampliación realicen el método, preferiblemente al menos tres. Sin embargo, el número de cebadores puede variar según la elección, por ejemplo, según la complejidad del sistema en estudio, y los detalles de información que se deseen obtener. Así, por ejemplo, pueden usarse 3, 4, 5 ó 6, o más cebadores de ampliación (por ejemplo, entre 3 y 15, o 3-10).
Así, la expresión "sitio variable" se refiere a un sitio (por ejemplo, locus o región) de una molécula de ácido nucleico que puede diferenciarse en genotipos diferentes. Como se define arriba, el sitio variable puede ser un polimorfismo o motivo, etc. Los marcadores de ácido nucleico usados para la tipificación normalmente contienen tanto regiones conservadas/semi-conservadas como variables. Así, cada "tipo" comprenderá una región de variación de secuencia, en la que esta región (es decir, la secuencia, o la identidad de base, en aquel sitio) puede ser diferente de otros tipos. En el método de la invención, al menos dos sitios variables potenciales son examinados, y, cuando una molécula de ácido nucleico diana es tipificada, dicha molécula de ácido nucleico contiene así 2 o más (es decir, múltiples) sitios variables. Cuando son tipificadas 2 o más moléculas de ácido nucleico diana, dichas moléculas de ácido nucleico contienen así cada una 1 o más sitios variables.
Se sobrentiende por cualquier persona experta en la técnica que puede ser analizada cualquier combinación deseada de sitios variables por el método de la invención. Los sitios variables no tienen que estar restringidos a un gen único, región codificante, región no codificante o molécula de ácido nucleico, pero pueden ser encontrados en todas las partes en el genoma diana. Se sobrentiende además que el sitio variable puede ser de cualquier longitud, opcionalmente de 1 a 20 nucleótidos, preferiblemente de 1 a 10 nucleótidos de longitud. Típicamente, sin embargo, el sitio variable puede comprender sólo uno solo o unos cuantos nucleótidos (por ejemplo, 1-6, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6) en los que la secuencia del ácido nucleico diana puede ser variable. Así, por ejemplo, un virus tal como el virus de la hepatitis C (HCV) puede contener regiones que son conservadas entre subtipos, pero que sin embargo contienen sitios que pueden variar entre subtipos. Tales sitios variables (que pueden tener típicamente de 1 a 3 nucleótidos de longitud) pueden usarse así para distinguir entre varios subtipos. En HCV, tal región así conservada que contiene sitios variables es la región 5' no traducida (5'UTR), y ésta puede ser oportunamente usada en un método de ensayo de genotipificación de la invención, como se describe después en el Ejemplo 1 más abajo.
Otros microorganismos tendrán análogamente similares tales regiones en sus genomas, conteniendo sitios variables, que pueden ser usados de manera similar en el método de la invención. Para otras aplicaciones de tipificación, por ejemplo, la tipificación de polimorfismos, las regiones de variabilidad de secuencia, conteniendo análogamente sitios polimorfos, pueden ser identificadas de manera similar. Por ejemplo, los SNP en el sistema de renina-angiotensinogena-aldosterona (RAAS) puede ser evaluado usando la posición de cebadores en regiones conservadas de los genes. El cebador puede ser puesto en el sitio de SNP o cerca. La figura 5 muestra la colocación de tres cebadores de ampliación diferentes, en los que el extremo 3' del cebador tiene 4 bases, 5 bases o 10 bases desde la posición de SNP. El SNP es EU6 (ACE T3409C).
Se sobrentiende que a fin de realizar la invención los sitios de unión del cebador deberían estar disponibles en todas las variantes posibles (genotipos) de la(s) molécula(s) de ácido nucleico en estudio. Tales sitios de unión del cebador estarán por lo tanto ventajosamente en regiones que son comunes a, o considerablemente conservadas entre, las variantes diferentes. Esto puede ser fácilmente conseguido seleccionando los sitios de unión del cebador para que estén en regiones conservadas/semi-conservadas como se discute antes.
Las reacciones de ampliación del cebador pueden ser realizadas oportunamente añadiendo secuencialmente los nucleótidos a la mezcla de reacción (es decir, una polimerasa, y mezcla de cebador/plantilla). Ventajosamente se añaden los diferentes nucleótidos en un orden conocido, y preferiblemente en un orden predeterminado. En una realización adecuada de la invención descrita en el Ejemplo 1 más abajo, son añadidos los 4 nucleótidos diferentes (es decir, los nucleótidos A, G, T y C) secuencialmente en un orden predeterminado de adición. Esto forma así un aspecto preferido de la invención que los nucleótidos sean añadidos secuencialmente en un orden predeterminado de adición. Por lo tanto, el orden de adición puede ser adaptado al(a los) ácido(s) nucleico(s) que se tipifica(n) y a los cebadores usados. Se verá por lo tanto que el orden de adición no será necesariamente cíclico, por ejemplo, A T G C A T G C, pero puede ser, por ejemplo, C G C T A G A.
Cuando se añade cada nucleótido, puede ser determinado si ocurre o no la incorporación de los nucleótidos.
Ventajosamente, como se describe más detalladamente abajo, puede ser determinada además la cantidad incorporada de cada nucleótido (es decir, cuántos). De esta manera, puede ser determinado el modelo de incorporación de nucleótidos. En otras palabras, la etapa de determinar el modelo de incorporación de nucleótidos puede comprender la determinación (o detección) tanto si se incorpora o no el nucleótido, y cuál. Ventajosamente, esta etapa también incluye la determinación de la cantidad de cada nucleótido incorporado. Tal realización cuantitativa, en la que la incorporación del nucleótido es determinada cuantitativamente, representa un aspecto preferido de la invención.
De esta manera, un "modelo" o "huella digital" puede ser obtenido para el ácido nucleico diana. Este modelo comprende la identidad de la base (es decir, la secuencia) de los sitios variables particulares identificados para aquella molécula de ácido nucleico. En otras palabras, el modelo corresponde al genotipo del ácido nucleico diana. El genotipo puede ser así fácilmente identificado comparando el modelo obtenido para un modelo de referencia (o un "modelo estándar"), o un panel de modelos de referencia (es decir, uno o varios, por ejemplo, dos o más, por ejemplo, de 1 a 20, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 6 o de 1 a 3). Un modelo de referencia puede ser fácilmente obtenido determinando el modelo de incorporación de nucleótido usando los cebadores de ampliación en cuestión en referencia a las moléculas de ácido nucleico del genotipo conocido (por ejemplo, un subtipo microbiano conocido o un modelo polimórfico conocido).
O bien, el "modelo de referencia" puede ser teóricamente derivado del conocimiento de los sitios variables, como se muestra en los Ejemplos posteriores. Puede no ser necesario entonces comparar realmente el modelo obtenido con un modelo de referencia, la información de tipificación/secuencia deseada puede ser leída a partir del modelo obtenido. Una vez que los cebadores de ampliación para cada sitio variable han sido seleccionados y el orden de adición de nucleótidos ha sido determinado, es posible determinar un rendimiento teórico a partir de una reacción de ampliación del cebador. La figura 6 muestra el rendimiento teórico de secuenciación de dos sitios variables individualmente, y la combinación de la ampliación de ambos cebadores de ampliación simultáneamente. El modelo de referencia teórico se muestra para 2 sitios variables presentes como heterocigotos. Los cebadores usados se unieron a 3' a las secuencias mostradas.
Así, mediante la identificación (o reconocimiento) del modelo obtenido para una molécula de ácido nucleico diana, el genotipo de la molécula puede ser identificado (o reconocido). Oportunamente, los modelos de ensayo y los modelos de referencia pueden ser comparados usando el software de reconocimiento de modelos.
A fin de realizar la invención, puede ser ventajoso o adecuado amplificar primero la molécula de ácido nucleico por cualquier método de ampliación adecuado conocido en la técnica. El ácido nucleico diana sería entonces un amplicón. Las técnicas de ampliación in vitro adecuadas incluyen cualquier proceso que amplifique el ácido nucleico presente en la reacción bajo la dirección de los cebadores apropiados. El método del amplicón puede ser así preferiblemente PCR, o cualquiera de sus diversas modificaciones, por ejemplo, el uso de cebadores anidados, aunque no esté limitado a este método. Los expertos en la técnica apreciarán que también pueden usarse otros procedimientos de ampliación, tales como la replicación autosostenida de secuencia (3SR), NASBA, el sistema de ampliación de Q-beta replicasa y la reacción en cadena de ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Abramson y Myers (1993) Current Opinion in Biotech., 4: 41-47).
Si se usa la PCR para amplificar el ácido nucleico, se diseñan cebadores adecuados, como se dice antes, para asegurarse de que sea amplificada la región de interés dentro de la secuencia de ácidos nucleicos (es decir, la región que contiene los sitios variables). La PCR también puede usarse para la ampliación indiscriminada de todas las secuencias de ADN, permitiendo la ampliación de esencialmente todas las secuencias dentro de la muestra de estudio (es decir, el ADN total). La PCR enlazante-cebador es particularmente adecuada para la ampliación indiscriminada, y usa enlazantes de oligonucleótido bicatenarios con un extremo adecuado sobrelapante, que son unidos a los extremos de los fragmentos del ADN diana. La ampliación se lleva a cabo entonces usando cebadores de oligonucleótido que son específicos para las secuencias del enlazante. O bien, pueden usarse cebadores de oligonucleótidos completamente aleatorios junto con DOP-PCR (oligonucleótido-cebado degenerado) para amplificar todo el ADN dentro de una muestra. Si los sitios variantes que se tipifican por el método de la invención están presentes en áreas distintas del genoma, puede usarse la PCR múltiple para amplificar secuencias de ácidos nucleicos del genoma que contienen los sitios variables. Por lo tanto, pueden ser amplificados múltiples fragmentos en una reacción PCR sola.
En el método de la invención, pueden tener que ser amplificadas varias secuencias, para permitir que sean analizadas varias regiones (por ejemplo, que contienen diferentes sitios variables). Por lo tanto, pueden tener que ser sintetizados varios cebadores de ampliación apropiados para permitir la ampliación selectiva de varias secuencias en el ácido nucleico diana. Se sobrentiende, por lo tanto, que varias moléculas de ácido nucleico diferentes puedan estar presentes en la mezcla de reacción.
Pueden usarse posteriormente como "cebador de ampliación" uno o varios de los cebadores de ampliación usados en la reacción de ampliación, pero aquel será preferiblemente un cebador diferente.
Será apreciado que la secuencia y la longitud de los cebadores de amplificación y ampliación del oligonucleótido que se usan en las etapas de amplificación y ampliación, respectivamente, dependerán de la secuencia del ácido nucleico diana, la longitud deseada del producto de amplificación o ampliación, las funciones adicionales del cebador (es decir, para la inmovilización) y el método usado para la amplificación y/o ampliación. Los cebadores apropiados pueden ser fácilmente diseñados aplicando principios y técnicas conocidas en la técnica.
Ventajosamente, como se menciona anteriormente, los cebadores de ampliación se unirán cerca (por ejemplo, en las bases 1-40, 1-20, 1-10 o 1-6, preferiblemente 1-3), bastante adyacentes o exactamente adyacentes al sitio variable del ácido nucleico diana y serán complementarios a una región conservada o semiconservada del ácido nucleico. En ciertas realizaciones, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 1, todos los cebadores se unirán bastante adyacentes a los sitios variables dentro del ácido nucleico diana (es decir, adyacentes o en las 3 bases del sitio variable). En otras realizaciones, véase, por ejemplo el Ejemplo 3, los cebadores serán escalonados de modo que uno esté muy cerca de su sitio variable, el otro esté a alguna distancia lejos, por ejemplo, 4-10 nucleótidos distante y un tercer cebador esté a 7 o más, por ejemplo, 8-16 nucleótidos distante de su (primer) sitio variable. La figura 7 representa este principio.
Para el método de la invención que se realiza, se requiere el conocimiento de la secuencia de la región conservada o semiconservada a fin de diseñar un cebador de ampliación complementario apropiado. Se proporciona un cebador de ampliación para cada una de las regiones variables, siendo específico cada uno para un sitio en el sitio variable o cerca. La especificidad se consigue en virtud del emparejamiento de bases complementarias. Para todas las realizaciones de la invención, el diseño del cebador puede estar basado en principios conocidos en la técnica. No es necesario para el cebador de amplificación o ampliación tener una complementariedad absoluta con el sitio de unión, pero ésta es preferida para mejorar la precisión de la unión.
El cebador de ampliación puede ser diseñado para que se una a la cadena sentido o antisentido del ácido nucleico diana.
En una realización preferida de la invención, los cebadores de ampliación son diseñados para que se unan al ácido nucleico diana cerca de los sitios variables de tal modo que en la adición de los nucleótidos en una manera predeterminada, la tipificación de cada sitio variable ocurra discretamente. Así, el análisis de un sitio variable dado no es complicado por una señal de incorporación positiva de otras regiones variables o conservadas. Como se muestra en el Ejemplo 1, es posible interpretar el modelo de ensayo y tener señales a partir de la incorporación del nucleótido en más que el cebador, pero preferiblemente cuando un cebador se amplía sobre un sitio variable, los otros cebadores serán silenciados. Así, si la incorporación del nucleótido ocurre en un sitio variable, no hay preferiblemente ninguna incorporación de nucleótidos en el(los) otro(s) sitio(s) variable(s). Por ejemplo, en el modelo teórico mostrado en la Figura 6, los cebadores de ampliación son colocados de tal modo que, bajo la adición secuencial predeterminada de nucleótidos, cada sitio variable es tipificado discretamente, aunque la ampliación del cebador ocurra simultáneamente en otros puntos, por ejemplo, la segunda administración del nucleótido A. En esta realización preferida, sólo el sitio variable es secuenciado cuando una cebador ampliado alcanza su sitio variable; los otros cebadores no son ampliados cuando el nucleótido añadido a la mezcla de reacción no es complementario a la siguiente base en las plantillas para las otras reacciones de ampliación del cebador. Así, los cebadores deben ser diseñados en paralelo con el orden de adición de los nucleótidos. El software de diseño del cebador puede usarse para determinar la secuencia real del cebador una vez que el extremo 3' haya sido fijado. Preferiblemente, se usa el Software de Diseño de Cebadores Pirosecuenciación.
La figura 7 muestra un juego simplificado de reacciones de ampliación del cebador múltiples en el que los cebadores de ampliación son colocados a diferentes distancias del sitio de la variante (mostrado como X). Esto permite que se realice un modelo predeterminado de la adición de nucleótido, en el que el sitio variante es secuenciado en el aislamiento. Como puede ser previsto, las variaciones en la secuencia de nucleótidos corriente arriba de los sitios variables diferentes pueden significar que los cebadores no tienen que hibridarse de una manera tan escalonada pero el modelo de la adición de nucleótido solo puede ser suficiente para asegurar el acercamiento de cebadores (ampliados) y/o la secuencia de sus sitios variables en tiempos diferentes. Así, todos los cebadores pueden hibridarse a distancias similares a partir de los sitios variables (o cuando se usa una reacción de ampliación del cebador para la tipificación de 2 sitios variables, el primer sitio variable) por ejemplo, sustancialmente adyacentes a éstos, pero cuando los nucleótidos inmediatamente corriente arriba de los sitios variables y dentro varían, de modo que el orden de la adición del nucleótido controlará el orden de la ampliación del cebador a través de los sitios variables.
La reacción de "ampliación del cebador" según la invención incluye todas las formas de reacciones de síntesis de ácido nucleico catalizadas por polimerasa dirigidas por plantilla. Las condiciones y los reactivos para las reacciones de ampliación del cebador son conocidos en la técnica, y cualquiera de los métodos estándares, reactivos y enzimas, etc. puede usarse en esta etapa (véase, por ejemplo, Sambrook et al., (editores), Molecular Cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Así, la reacción de ampliación del cebador en su forma más básica, se realiza en presencia del cebador, desoxinucleótidos (dNTP) y una enzima polimerasa adecuada, por ejemplo, T7 polimerasa, Klenow o Sequenase Ver 2.0 (USB EE.UU.), o de hecho cualquier enzima polimerasa disponible y adecuada. Como se menciona anteriormente, para una plantilla de ARN, puede usarse la transcriptasa inversa. Las condiciones pueden ser seleccionadas según la elección, de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica.
El cebador es así sometido a una reacción de ampliación del cebador en presencia de un nucleótido, por lo cual el nucleótido sólo se incorpora si es complementario a la base inmediatamente adyacente (3') a la posición del cebador. El nucleótido puede ser cualquier nucleótido capaz de la incorporación por una enzima polimerasa en una cadena de ácido nucleico o molécula. Así, por ejemplo, el nucleótido puede ser un desoxinucleótido (dNTP, desoxinucleósido trifosfato) o didesoxinucleótido (ddNTP, didesoxinucleósido ditrifosfato). Así, los siguientes nucleótidos pueden usarse en la reacción de extensión del cebador: guanina (G), citosina (C), timina (T) o adenina (A) desoxi- o didesoxi-nucleótidos. Por lo tanto, el nucleótido puede ser dGTP (desoxiguanosina trifosfato), dCTP (desoxicitidina trifosfato), dTTP (desoxitimidina trifosfato) o dATP (desoxiadenosina trifosfato). Como se dice más abajo, los análogos adecuados de dATP, y también para dCTP, dGTP y dTTP también pueden usarse. Los nucleótidos modificados que incluyen un grupo de activación o detectable, nucleótido trifosfatos radio- o fluoroscentemente-marcados también pueden usarse en la etapa de ampliación del cebador. Los didesoxinucleótidos también pueden usarse en la reacción de ampliación del cebador. El término "didesoxinucleótido" según se usa en este documento incluye 2'-desoxinucleótidos en los cuales el grupo hidroxilo 3' es modificado o está ausente. Los didesoxinucleótidos son capaces de la incorporación en el cebador en presencia de la polimerasa, pero no pueden entrar en una reacción de polimerización subsiguiente, y así funcionar como una "terminador de cadena".
Si el nucleótido es complementario a la base diana, el cebador se amplía por un nucleótido, y se libera pirofosfato inorgánico. Como se dice más abajo, en un método preferido, puede ser detectado el pirofosfato inorgánico a fin de detectar la incorporación del nucleótido añadido. Para algunos sitios variables, la adición de un nucleótido será suficiente para generar la información de tipificación. Sin embargo, para la mayoría de los sitios variables, serán necesarios los datos para varios nucleótidos adyacentes. El cebador ampliado puede servir del mismo modo exactamente en un procedimiento repetido para determinar la siguiente base en la región variable, permitiendo así al sitio variable entero ser secuenciado. Diferentes nucleótidos pueden ser añadidos secuencialmente, ventajosamente en el orden conocido, como se discute antes, para revelar los nucleótidos que son incorporados para cada cebador de ampliación. Además, en el caso en el que el sitio variable sea homopolimérico (es decir, contiene 2 o más bases idénticas), el número de nucleótidos incorporados de la base complementaria reflejará el número presente en la región homopolimérica. En consecuencia, la determinación del número de nucleótidos incorporados para cada adición de nucleótido, revelará esta información, y por ello contribuirá al modelo de la incorporación de nucleótido.
Como consecuencia, un protocolo de ampliación de cebador puede implicar la hibridación de un cebador como se describe más arriba, la adición de un nucleótido, la realización de una reacción de ampliación de cebador catalizada por polimerasa, la detección de la presencia o la ausencia de la incorporación de dicho nucleótido (y ventajosamente también la determinación de la cantidad de cada nucleótido incorporado) y la repetición de la adición del nucleótido y las etapas de ampliación del cebador, etc. una o varias veces. Como se discute antes, pueden ser añadidos sucesivamente nucleótidos solos (es decir, individuales) a la misma mezcla de cebador-plantilla, o para separar alícuotas de la mezcla cebador-plantilla, etc. según la elección.
A fin de permitir la adición (iterativa) repetida o sucesiva de nucleótidos en un procedimiento de ampliación de cebador, el nucleótido antes añadido debe ser quitado. Esto puede ser conseguido lavando, o más oportunamente, usando una enzima de degradación de nucleótidos, por ejemplo, como se describe detalladamente en el documento WO98/28440.
En consecuencia, en una realización principal de la presente invención, se usa una enzima que degrada nucleótidos para degradar cualquier nucleótido no incorporado o en exceso. Así, si es añadido un nucleótido que no se incorpora (porque no es complementario a la base diana), o alguno de los nucleótidos añadidos permanece después de un acontecimiento de incorporación (es decir, nucleótidos en exceso) entonces tales nucleótidos no incorporados pueden eliminarse fácilmente usando una enzima de degradación de nucleótidos. Esto se describe detalladamente en el documento WO98/28440.
La expresión "enzima de degradación de nucleótidos", según se usa en este documento, incluye cualquier enzima capaz de degradar nucleótidos específicamente o no específicamente, incluyendo al menos nucleósido trifosfatos (NTP), pero opcionalmente también di- y mono-fosfatos, y cualquier mezcla o combinación de tales enzimas, a condición de que esté presente una nucleósido trifosfatasa u otra actividad de degradación de NTP. Cuando se usa un nucleótido de terminación de cadena (por ejemplo, se usa un didesoxi-nucleótido), la enzima de degradación de nucleótidos también debería degradar a tal nucleótido. Las enzimas de degradación de nucleótidos que tienen actividad de fosfatasa pueden ser oportunamente usadas según la invención, cualquier enzima que tenga cualquier nucleótido o actividad de degradación de nucleósidos puede ser usada, por ejemplo, enzimas que dividen nucleótidos en otras posiciones que las del grupo fosfato, por ejemplo en los residuos de bases o de azúcar. Así, una enzima de degradación de nucleósido trifosfato es esencial para la invención. Las enzimas de degradación de nucleósidos di- y/o mono-fosfato son opcionales y pueden usarse en combinación con una enzima de degradación de nucleósido trifosfato.
La enzima de degradación de nucleótidos preferida es la apirasa, que es tanto nucleósido difosfatasa como trifosfatasa, catalizando las reacciones NTP \rightarrow NDP + Pi y NDP \rightarrow NMP + Pi (donde NTP es un nucleósido trifosfato, NDP es un nucleósido difosfato, NMP es un nucleótido monofosfato y Pi es fosfato inorgánico). La apirasa puede ser obtenida de la Compañía Química Sigma. Otras enzimas de degradación de nucleótidos posibles incluyen la nucleósido trifosfato difosforidrolasa de páncreas de cerdo (Le Bel et al., 1980, J. Biol. Chem., 255, 1227-1233). Se describen otras enzimas en la bibliografía.
La enzima de degradación de nucleótidos puede ser oportunamente incluida durante la etapa de reacción de la polimerasa (es decir, en la ampliación del cebador). Así, por ejemplo, la reacción de la polimerasa puede ser oportunamente realizada en presencia de una enzima de degradación de nucleótidos. Aunque sea menos preferida, tal enzima también puede ser añadida después de que la incorporación del nucleótido (o la no incorporación) haya ocurrido, es decir, después de la etapa de reacción de la polimerasa.
Así, la enzima de degradación de nucleótidos (por ejemplo, la apirasa) puede ser añadida a la mezcla de reacción de la polimerasa (es decir, al ácido nucleico diana, el cebador y la polimerasa) de cualquier modo adecuado, por ejemplo, antes de la iniciación de la reacción o simultáneamente con ésta, o después de que la reacción de la polimerasa haya ocurrido, por ejemplo, antes de la adición de los nucleótidos a la muestra/cebador/polimerasa para iniciar la reacción, o después de que la polimerasa y el nucleótido sean añadidos a la mezcla de muestra/cebador.
Oportunamente, la enzima de degradación de nucleótidos puede ser simplemente incluida en la mezcla de reacción para la reacción de la polimerasa, que puede ser iniciada por la adición del nucleótido.
Según la presente invención, la detección de la incorporación de nucleótidos puede ser realizada de varios modos, tales como, por la incorporación de nucleótidos marcados que pueden ser detectados posteriormente, o usando sondas marcadas que sean capaces de unirse a la secuencia ampliada.
El método se realiza usando un método de secuenciación por síntesis, debido a que las reacciones de ampliación son cuantitativas, es decir, que la incorporación del nucleótido puede ser determinada cuantitativamente. Como se menciona anteriormente, los métodos de secuenciación por síntesis son explicados ampliamente en el documento US-A-4.863.849, que describe varios caminos en los cuales la incorporación del nucleótido activado puede ser determinada o detectada, por ejemplo, espectrofotométricamente o por técnicas de detección fluorescentes, por ejemplo, determinando la cantidad de nucleótido que permanece en la solución madre del nucleótido añadido, después de la etapa de incorporación del nucleótido. En una reacción de secuenciación por síntesis, la determinación del modelo de incorporación del nucleótido ocurre simultáneamente con la ampliación del cebador. Una definición de trabajo de secuenciación por síntesis es un método en el cual un solo nucleótido activado (es decir, marcado) es, o no es, incorporado en una plantilla cebada, siendo detectada la incorporación por cualquier medio adecuado. Esta etapa es repetida por la adición de un nucleótido activado diferente y se detecta otra vez la incorporación. Estas etapas son repetidas y a partir de la suma de los ácidos nucleicos incorporados, la secuencia puede ser deducida. El método preferido de secuenciación por síntesis es, sin embargo, un método basado en la detección de pirofosfato.
Preferiblemente, por lo tanto, la incorporación del nucleótido se detecta midiendo la liberación de PPi, preferiblemente por detección luminométrica, y sobre todo por detección bioluminométrica.
El PPi puede ser determinado mediante muchos métodos diferentes y en la bibliografía se han descrito varios métodos enzimáticos (Reeves et al., (1969), Anal. Biochem., 28, 282-287; Guillory et al., (1971), Anal. Biochem., 39, 170-180; Johnson et al., (1968), Anal. Biochem., 15, 273; Cook et al., (1978), Anal. Biochem. 91,557-565; y Drake et al., (1979), Anal. Biochem. 94,117-120).
Se prefiere usar luciferasa y luciferina, en combinación, para identificar la liberación de pirofosfato ya que la cantidad de luz generada es sustancialmente proporcional a la cantidad de pirofosfato liberado que, a su vez, es directamente proporcional a la cantidad de nucleótido incorporado. La cantidad de luz puede ser fácilmente estimada mediante un dispositivo sensible a la luz adecuado tal como un luminómetro. Así, los métodos luminométricos ofrecen la ventaja de ser capaces de ser cuantitativos.
Las reacciones de luciferina-luciferasa para detectar la liberación de PPi son conocidas en la técnica. Particularmente, se ha desarrollado un método para el control continuo de la liberación de PPi basado en las enzimas ATP sulfurilasa y luciferasa (Nyren y Lundin, Anal. Biochem., 151, 504-509, 1985; Pyren P., "Enzymatic method for continuous monitoring of DNA polymerase activity" (1987) Anal. Biochem, Vol 167 (235-238)) y el llamado ELIDA ("Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection Assay" traducido del inglés como "Ensayo Enzimático Luminométrico para la Detección de Pirofosfato Inorgánico"). El uso del método ELIDA para detectar PPi es el preferido según la presente invención. El método puede ser, sin embargo, modificado, por ejemplo, por el uso de una luciferasa más termoestable (Kaliyama, et al., 1994, Biosci. Biotech. Biochem., 58,1170-1171) y/o ATP sulfurilasa (Onda et al., 1996, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 60: 10, 1740-42). Este método está basado en las reacciones siguientes:
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También puede hacerse referencia a los documentos WO 98/13523 y WO 98/28448, que se refieren a procedimientos de secuenciación basados en la detección de pirofosfato, y describen métodos de detección de PPi que pueden ser de uso en la presente invención.
En una reacción de detección de PPi basada en las enzimas ATP sulfurilasa y luciferasa, la señal (correspondiente al PPi liberado) es vista como una luz. La generación de luz puede ser observada como una curva conocida como un Pyrogram®. La luz es generada por la acción de luciferasa en el producto, ATP (producido por una reacción entre PPi y APS (véase más abajo) mediado por ATP sulfurilasa) y, cuando se usa una enzima de degradación de nucleótidos tal como la apirasa, esta generación de luz es "apagada" entonces por la acción de la enzima de degradación de nucleótidos, degradando el ATP que es el sustrato para la luciferasa. La pendiente de la curva ascendente puede ser vista como indicativa de las actividades de la ADN polimerasa (liberación de PPi) y ATP sulfurilasa (generando ATP a partir del PPi, proporcionando así un sustrato para la luciferasa). La altura de la señal es dependiente de la actividad de luciferasa, y la pendiente de la curva descendente es, como se explica arriba, indicativa de la actividad de la enzima de degradación de nucleótidos. Como se explica más abajo, el Pyrogram® en el contexto de una región homopolimérica, la altura máxima es también indicativa del número de nucleótidos incorporados para una etapa de adición de nucleótidos dada. Entonces, cuando se añade un nucleótido, la cantidad de PPi liberado dependerá de cuántos nucleótidos (es decir, la cantidad) son incorporados, y ésta será reflejada en la altura de la pendiente.
Ventajosamente, por la inclusión de la(s) enzima(s) de detección de PPi (es decir, la enzima o enzimas necesarias para conseguir la detección de PPi según el sistema de detección enzimático seleccionado que, en caso de ELIDA, será ATP sulfurilasa y luciferasa) en la etapa de reacción de la polimerasa, el método de la invención puede ser fácilmente adaptado para permitir que las reacciones de ampliación sean continuamente supervisadas a tiempo real, siendo generada y detectada una señal, cuando cada nucleótido sea incorporado.
Así, las enzimas de detección de PPi (junto con cualquier sustrato enzimático u otros reactivos necesarios para la reacción de detección de PPi) pueden ser simplemente incluidas en la mezcla de reacción de polimerasa.
Un problema potencial que ha sido anteriormente observado con métodos de secuenciación basados en PPi es que el dATP, usado en la reacción de ampliación de cadena, interfiere en la reacción subsecuente de detección basada en luciferasa actuando como un sustrato para la enzima luciferasa. Esto puede ser reducido o evitado usando, en lugar de desoxiadenosina trifosfato (ATP), un análogo de dATP que sea capaz de actuar como un sustrato para una polimerasa, pero que sea incapaz de actuar como un sustrato para una enzima de detección de PPi. Tal modificación es descrita detalladamente en el documento WO98/13523.
La expresión "incapaz de actuar" incluye también análogos que son sustratos pobres para las enzimas de detección, o que son sustancialmente incapaces de actuar como sustratos, tal que no hay sustancialmente ninguna interferencia significativa, o es insignificante, en la reacción de detección de PPi.
Así, otra característica preferida de la invención es el uso de un análogo de dATP que no interfiera en la reacción enzimática de detección de PPi, pero que, sin embargo, pueda ser incorporado normalmente en una cadena de ADN creciente por una polimerasa. Por "normalmente incorporado" se entiende que el nucleótido es incorporado con el apareamiento de bases normal y apropiado. En la realización preferida de la invención, en la que luciferasa es una enzima de detección de PPi, el análogo preferido para uso según la invención es el análogo [1-tio]trifosfato (o \alpha-tiotrifosfato) de desoxi ATP, preferiblemente desoxiadenosina [1-tio]trifosfato, o desoxiadenosina \alpha-tiotrifosfato (dATP\alphaS) que también es conocida. La dATP\alphaS, junto con los análogos \alpha-tio de dCTP, dGTP y dTTP, puede ser comprada en Amersham Pharmacia. Los experimentos han demostrado que la sustitución de dATP con dATP\alphaS permite la incorporación eficiente por la polimerasa con una señal de fondo baja debido a la ausencia de una interacción entre dATP\alphaS y luciferasa. Las señales falsas son disminuidas usando un análogo de nucleótido en lugar de dATP, porque es eliminada la linea de fondo causada por la capacidad del dATP de funcionar como un sustrato para luciferasa. Particularmente, puede ser conseguida una incorporación eficiente con la polimerasa al tiempo que es sustancialmente disminuida la señal de fondo debida a la generación de luz por el sistema luciferina-luciferasa que resulta de la interferencia dATP. Los análogos de dNTP\alphaS de los otros nucleótidos también pueden usarse en lugar de otros dNTP.
Otro problema potencial que ha sido anteriormente observado con métodos de secuenciación por síntesis es que pueden ser generadas señales falsas y que son difíciles de secuenciar con exactitud extensiones homopoliméricas (es decir, CCC). Esto puede ser superado por la adición de una proteína de unión de ácido nucleico monocatenaria (SSB) una vez que los cebadores de ampliación han sido hibridados al ácido nucleico plantilla. Se valora el uso de SSB en la secuenciación por síntesis en el documento WO 00/43540 de Pirosecuenciación AB.
Se sobrentiende que en el método de la invención, pueden estar presentes diferentes cantidades de la plantilla de ácido nucleico cuando deban ser genotipadas múltiples moléculas de ácido nucleico. A fin de ser capaces de cuantificar el número de nucleótidos incorporados bajo la adición en ciertas realizaciones, es preferido diseñar los cebadores y la administración del nucleótido de tal modo que sea generada una señal de referencia para cada cebador que corresponda a un acontecimiento único de incorporación de nucleótido. La señal de referencia es generada en ausencia de la incorporación del nucleótido en las otras reacciones de ampliación del cebador. La señal de referencia permite la calibración de las señales en relación a la misma plantilla. Los picos de referencia son claramente mostrados en la Figura 9, y la altura de la señal del sitio de la variante puede ser correlacionada con la señal de referencia para aumentar la exactitud.
La etapa de detectar la incorporación del nucleótido monitorizando la liberación de PPi causa una señal indicativa de la cantidad de pirofosfato liberado, y a partir de ahí la cantidad de nucleótido incorporado. En el método de la invención, se usan secuencialmente o simultáneamente 2 o más cebadores distintos en una reacción de ampliación del cebador. Así, en el caso de los cebadores simultáneamente añadidos, para cada adición de nucleótido, pueden ser incorporados 0, 1 o más nucleótidos en las cadenas de ADN creciente. La señal generada en la etapa de detección de pirofosfato será por lo tanto indicativa del número de nucleótidos incorporados en la etapa de ampliación del cebador para la combinación de todos los cebadores unidos al ADN de plantilla. El tamaño de la señal (es decir, la altura de cada pico) puede ser, por lo tanto, correlacionada directamente con el número de nucleótidos incorporados. En ciertas realizaciones, el cebador sólo tiene que ser sometido a entre 1 y 20, preferiblemente entre 1 y 10, por ejemplo, entre 1 y 5 y lo más preferiblemente entre 1 y 4 ciclos de adición de nucleótidos.
En una realización de la invención, 2 o más cebadores son hibridados (simultáneamente) en, adyacente o cerca de sitios variables en el ácido nucleico diana. Siendo responsable cada cebador de la tipificación de uno o posiblemente más sitios variables. La ampliación del cebador se realiza entonces como se describe más arriba, y la ampliación del cebador ocurre para cada cebador sólo si el nucleótido añadido es complementario a la base diana. Así, cuando se usan 2 cebadores simultáneamente, pueden ocurrir ninguno, 1, 2 o más (para regiones homopoliméricas) acontecimientos de incorporación de nucleótidos bajo la adición de cualquier nucleótido dado. La reacción de ampliación del cebador se realiza simultáneamente para todos los cebadores hibridados en la mezcla de reacción. Así, la incorporación del nucleótido detectado da un cuadro acumulativo para todos los cebadores hibridados. De esta manera, el modelo de incorporación del nucleótido puede ser directamente determinado. Preferiblemente, cuando una reacción de ampliación se extiende a través de un sitio variable, la incorporación del nucleótido ocurre sólo en aquel sitio.
En una realización adicional particularmente preferida que también se discute más arriba y en los Ejemplos, los cebadores de ampliación son hibridados a la plantilla, y los cebadores son ampliados simultáneamente. Los cebadores se diseñan para permitir que ocurra la ampliación del cebador sobre los sitios variables secuencialmente - es decir, la ampliación del cebador ocurre para cada cebador simultáneamente, pero la ampliación del cebador sobre un sitio variable ocurre a su vez, mientras que los otros cebadores son ampliados sobre una región conservada/semiconservada o más preferiblemente no son ampliados en absoluto debido a la adición de nucleótidos no complementarios. El modelo de adición del nucleótido es preferiblemente predeterminado para permitir que la ampliación de los cebadores ocurra secuencialmente sobre los sitios variables. Los cebadores pueden unir entre 1 y 40, entre 1 y 20, entre 1 y 10, entre 1 y 5 nucleótidos desde, o adyacente a, el sitio variable.
Opcionalmente, una vez que un cebador haya sido ampliado sobre un sitio variable, puede ser añadido un terminador de cadena, tal como un didesoxinucleótido, para terminar expresamente la reacción de ampliación de cadena de aquel cebador. Se sobrentiende que las señales de incorporación del nucleótido serán generadas para todos los cebadores durante la reacción de ampliación del cebador, y contribuirán al modelo obtenido. Sin embargo, las regiones diferentes del modelo estarán relacionadas preferiblemente con sólo uno de los sitios variables.
En todavía una realización más modificada de la invención, pueden emplearse terminadores de cadena en lugar de los dNTP o en combinación con los dNTP, usando simultáneamente cebadores hibridados. En este caso, los cebadores se seleccionan o se diseñan para asegurar que la ampliación del cebador de cada cebador ocurra secuencialmente, es decir, que los nucleótidos sean primero incorporados desde los primeros cebadores, la primera reacción de ampliación se completa, antes de que ocurra la incorporación del nucleótido del siguiente cebador. Esta realización también requiere que los nucleótidos sean añadidos en el orden predeterminado.
De hecho, el llamado diseño "inteligente" del cebador puede usarse para realizar el método de la invención de una manera deseada o preseleccionada (es decir, predeterminada). Esto puede aplicarse tanto al número de cebadores de ampliación empleados, como al diseño de su secuencia. El diseño "inteligente" del cebador se realiza óptimamente con un orden "inteligente" de adición de nucleótidos para permitir que sea realizada la secuenciación de los sitios variables individuales en aislamiento. Tal diseño "inteligente" de cebadores y el orden de la adición del nucleótido son descritos más detalladamente en los Ejemplos.
El método de la invención puede realizarse oportunamente en un matraz de reacción solo. Así, por ejemplo, todos los cebadores de ampliación pueden ser añadidos juntos, en un matraz de reacción solo.
Para que se realice la reacción de ampliación del cebador, la molécula de ácido nucleico, sin tener en cuenta si ha sido amplificada o no, se proporciona oportunamente en un formato de una sola cadena. El ácido nucleico puede ser sometido para la separación de cadena por cualquier técnica adecuada conocida en la técnica (por ejemplo, Sambrook et al., supra), por ejemplo, calentando el ácido nucleico, o calentando en presencia de una sustancia química desnaturalizante tales como formamida, urea o formaldehído, o por uso de un álcali.
Sin embargo, esto no es absolutamente necesario y puede ser usada una molécula de ácido nucleico bicatenaria como plantilla, por ejemplo, con una polimerasa adecuada que tiene actividad de desplazamiento de cadena.
Cuando se usa una etapa de ampliación preliminar, sin tener en cuenta cómo el ácido nucleico haya sido amplificado, todos los componentes de la reacción de ampliación tienen que ser quitados, para obtener el ácido nucleico puro, antes de la realización del ensayo de tipificación de la invención. Por ejemplo, tienen que ser eliminados los nucleótidos no incorporados, cebadores PCR y las sales de la reacción PCR. Los métodos para purificar ácidos nucleicos son conocidos en la técnica (Sambrook et al., supra), sin embargo, un método preferido es inmovilizar la molécula de ácido nucleico, quitando las impurezas vía técnicas de sedimentación y/o lavado.
Opcionalmente, por lo tanto, el ácido nucleico diana puede ser proveído de un medio para la inmovilización, que puede ser introducido durante la ampliación, por las bases del nucleótido o el/los cebador/es usado/s para producir el ácido nucleico amplificado.
Para facilitar la inmovilización, los cebadores de ampliación usados según la invención pueden llevar medios para la inmovilización directamente o indirectamente. Así, por ejemplo, los cebadores pueden llevar secuencias que sean complementarias a secuencias que puedan ser unidas directamente o indirectamente a un soporte inmovilizante o pueden llevar un resto adecuado para la unión directa o indirecta a un soporte inmovilizante a través de una pareja de unión.
Se conocen en la técnica numerosos soportes adecuados para la inmovilización de ADN y métodos de unión de nucleótidos, y están extensamente descritos en la bibliografía. Así, por ejemplo, pueden usarse soportes en forma de pocillos de microtítulo, tubos, varillas de aceite, partículas, fibras o tubos capilares, hechos, por ejemplo, de agarosa, celulosa, alginato, teflón, látex o poliestireno. Ventajosamente, el soporte puede comprender partículas magnéticas, por ejemplo, las perlas superparamagnéticas producidas por Dynal AS (Oslo, Noruega) y vendidas bajo la marca registrada DYNABEADS. Pueden usarse chips como soportes sólidos para proporcionar sistemas experimentales en miniatura como se describe, por ejemplo, en Nilsson et al. (Anal. Biochem. (1995), 224: 400-408).
El soporte sólido puede llevar grupos funcionales tales como grupos hidroxilo, carboxilo, aldehído o amino para unir el cebador o capturar el oligonucleótido. Esto se puede proporcionar en general tratando al soporte para proporcionar un revestimiento superficial de un polímero que lleve a uno de tales grupos funcionales, por ejemplo, poliuretano junto con un poliglicol para proporcionar grupos hidroxilo, o un derivado de celulosa para proporcionar grupos hidroxilo, un polímero o copolímero de ácido acrílico o ácido metacrílico para proporcionar grupos carboxilo o un polímero alquilado de amino para proporcionar grupos amino. La patente de EE.UU. Nº. 4.654.267 describe la introducción de muchos de tales revestimientos superficiales.
O bien, el soporte puede llevar otros restos para la unión, tales como avidina o estreptavidina (uniéndose a biotina en la secuencia de nucleótidos), proteínas de unión de ADN (por ejemplo, la proteína represora de lac I que se une a una secuencia del operador lac que puede estar presente en el cebador o el oligonucleótido), o anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (uniéndose a haptenos, por ejemplo, digoxigenina en la secuencia de nucleótidos). El sistema de unión estreptavidina/biotina es usado muy comúnmente en biología molecular, debido a la facilidad relativa con la cual la biotina puede ser incorporada dentro de las secuencias de nucleótido y, por supuesto, por la disponibilidad comercial de nucleótidos marcados con biotina. Esto representa un método preferido para la inmovilización de moléculas de ácido nucleico diana según la presente invención. Las DYNABEADS revestidas de estreptavidina están comercialmente disponibles de Dynal AS.
Como se menciona anteriormente, la inmovilización puede ocurrir oportunamente después de la ampliación. Para facilitar la inmovilización después de la ampliación, uno o ambos de los cebadores de ampliación son proveídos de medios para la inmovilización. Tales medios pueden comprender como se discute antes, uno de un par de parejas de unión, que se unen a la correspondiente pareja de unión llevada en el soporte. Los medios adecuados para la inmovilización incluyen así biotina, haptenos, o secuencias de ADN (tales como el operador lac) que se unen a las proteínas de unión de ADN.
Cuando no se realiza la inmovilización de los productos de ampliación, los productos de la reacción de ampliación pueden ser simplemente separados, por ejemplo, tomándolos en una solución de formamida (solución desnaturalizante) y separando los productos, por ejemplo, por electroforesis o por análisis usando la tecnología de los biochips. La inmovilización proporciona un modo rápido y simple de generar una plantilla de una sola cadena para la reacción de ampliación. Como una alternativa a la inmovilización, pueden usarse otros métodos, por ejemplo, PCR asimétrica, protocolos de exonucleasa o pueden usarse protocolos de desnaturalizacion/hibridación rápidos en plantillas bicatenarias para generar el ADN monocatenario. Tales técnicas son conocidas en la técnica.
El método de la invención permite la tipificación (por ejemplo, la genotipificación) de una o varias moléculas de ácido nucleico derivadas de un individuo (por ejemplo, un paciente en ensayo clínico, una muestra de tejido para la tipificación, o un microorganismo para la identificación). Así, el método de la invención es capaz de distinguir entre genotipos diferentes dentro de una especie. Esto es particularmente útil en el campo de la identificación de especies microbianas, donde pueden existir muchos genotipos de un microbio, por ejemplo, hay actualmente siete genotipos conocidos del virus de la hepatitis C.
El método de la presente invención es particularmente ventajoso en el diagnóstico de condiciones patológicas caracterizadas por la presencia de ADN específico, particularmente enfermedades infecciosas latentes tales como la infección viral, por ejemplo, por herpes, hepatitis o VIH. También, el método puede usarse para caracterizar o tipificar y cuantificar infecciones bacterianas, protozoarias y fungosas en las que las muestras de un organismo de inyección pueden ser difíciles de obtener o en las que un organismo aislado sea difícil de hacer crecer in vitro para la caracterización subsecuente como en el caso de especies de P. falciparum o Chlamydia. Debido a la simplicidad y la velocidad del método esto también puede usarse para detectar a otros agentes patológicos que causan enfermedades tales como sífilis y meningitis. Incluyendo los casos en que puedan ser fácilmente obtenidas las muestras del organismo de inyección, la velocidad de este método comparado con la incubación de noche de un cultivo puede hacer el método según la invención preferible respecto a las técnicas convencionales.
El método de la presente invención puede usarse para analizar dos o más polimorfismos de nucleótido simple (SNP) dentro de uno o varios genes, o dos o más genes, en un individuo. Muchas enfermedades y condiciones pueden tener que ver con (o están vinculadas a) polimorfismos combinatorios dentro del mismo gen, o dentro de genes distintos. Por ejemplo, en el documento WO 00/22166, se ha sugerido que una combinación de varios SNP dentro de varios genes da un modelo polimórfico que puede usarse para predecir la probabilidad de una enfermedad cardiovascular, proporcionando un pronóstico detallado para un individuo, y prediciendo si un régimen terapéutico particular sería eficaz en la mejora de una condición cardiovascular. Así, el método de la invención puede usarse para dar un pronóstico rápido sobre el genotipo particular de un individuo, permitiendo que sea administrada una terapia adaptada. El ejemplo 2 muestra que la genotipificación múltiple puede ser realizada para varios SNP en el sistema RAAS. En este ejemplo, un ácido nucleico contiene 2 SNP (EU7) y dos ácidos nucleicos adicionales contienen 1 SNP cada uno (EU8 y EU11).
El método de la invención es ventajoso porque determina la secuencia exacta de los sitios variables (es decir, está basado en un procedimiento de secuenciación, lo que evita procedimientos costosos e incómodos, tales como los de la electroforesis, y nucleótidos ventajosamente marcados y/o cebadores, y pueden analizarse números grandes de muestras en un corto periodo de tiempo.
La reacción de ampliación del cebador genera un "modelo" o una "huella digital" indicativa de la incorporación del nucleótido, correlacionada con el nucleótido añadido a la mezcla de reacción. El modelo es un cuadro acumulativo de la incorporación del nucleótido para los cebadores diseñados para detectar la incorporación del nucleótido en 2 o más sitios variables dentro de la(s) molécula(s) de ácido nucleico diana. Para permitir que la(s) molécula(s) de ácido nucleico diana sean tipificadas, se usan modelos de referencia, usando los mismos sitios variables y cebadores de ampliación. Cada genotipo debe producir un modelo diferente, facilitando la identificación por la comparación con el modelo de referencia que puede ser determinado teóricamente.
El método de la invención se basa en el conocimiento de la posición y la naturaleza de los sitios variables, junto con la información de secuencia conocida adicional (por ejemplo, con secuencias conocidas de regiones conservadas/semi-conservadas) a partir de las cuales determinar un sitio de unión del cebador apropiado y diseñar un cebador de ampliación complementario. Usando el método de la invención, puede usarse cualquier combinación de sitios variables en el método de tipificación. Se sobrentiende por aquellos expertos en la técnica que el método de la invención no está limitado con sitios variables múltiples dentro de genes, pero el método es también aplicable a regiones no codificantes. El modelo puede ser obtenido para sitios variables que están en uno o varios del mismo gen, en genes relacionados, en genes dispares, o en regiones no codificantes.
La invención también comprende kits para realizar el método de la invención, particularmente para la tipificación de una o varias moléculas de ácido nucleico que contienen uno o varios sitios variables. Éstas incluirán normalmente uno o varios de los componentes siguientes:
(a) opcionalmente cebador(es) para la ampliación in vitro; (b) dos o más cebadores para la reacción de ampliación del cebador uniendo cada cebador en un sitio predeterminado diferente en una molécula de ácido nucleico, y siendo diseñados dichos cebadores para permitir, cuando dichos cebadores son simultáneamente hibridados, que la ampliación del cebador ocurra sobre dichos sitios variables secuencialmente, bajo la adición de nucleótidos de una manera predeterminada; (c) nucleótidos para la ampliación y/o para la reacción de ampliación del cebador (como se describe más arriba); (d) una enzima polimerasa para la ampliación y/o reacción de ampliación del cebador; y (e) medios para detectar la ampliación del cebador secuenciando por síntesis (p. ej. por medios de detección de la liberación de pirofosfato como se perfila y se define más arriba).
En ciertas realizaciones, el kit también incluirá instrucciones para el orden de adición de los nucleótidos.
La invención será descrita a continuación mediante ejemplos no restrictivos con referencia a los dibujos en los cuales:
La figura 1 muestra esquemáticamente un método para la tipificación de ácido nucleico usando cebadores múltiples (multiplexión) simultáneamente en una reacción de ampliación del cebador;
La figura 2 muestra la secuencia de la región 5' no traducida (5'-UTR) de siete genotipos del virus de la hepatitis C (HCV), en el que las flechas indican las posiciones de los cebadores de amplificación y ampliación, y los nucleótidos destacados en negrita ilustran la región variable que se secuencia por la reacción de ampliación de cebador;
La figura 3 muestra trazas teóricas que serían obtenidas (luz generada (indicando la incorporación del nucleótido) frente al tiempo (y adición del nucleótido)), para los siete genotipos del HCV estudiado. Las condiciones experimentales y los cebadores de ampliación teóricamente usados son descritos en el Ejemplo 1. Tres cebadores de ampliación distintos fueron teóricamente usados simultáneamente en una mezcla de reacción de ampliación del cebador. Se libera pirofosfato inorgánico PPi en la reacción catalizada de una ADN polimerasa si se incorpora un nucleótido. El PPi se monitoriza por reacciones enzimáticas acopladas usando ATP sulfurilasa y luciferasa. La luz generada es medida como resultado por un detector CCD o luminómetro;
La figura 4 muestra trazas (luz generada (indicando la incorporación del nucleótido) frente al tiempo (y adición del nucleótido)), obtenidas para seis muestras que contienen genotipos HCV diferentes. Las condiciones experimentales y los cebadores usados son descritos en el Ejemplo 1. La incorporación de un nucleótido en el cebador de ampliación causa la liberación de PPi, que se detecta usando unas reacciones enzimáticas acopladas usando ATP sulfurilasa y luciferasa. La luz generada a consecuencia de la ampliación hallada se mide por una cámara CCD o luminómetro;
La figura 4a muestra la traza obtenida para el genotipo de HCV 1a;
La figura 4b muestra la traza obtenida para el genotipo de HCV 1b;
La figura 4c muestra la traza obtenida para el genotipo de HCV 2a;
La figura 4a muestra la traza obtenida para el genotipo de HCV 2b;
La figura 4e muestra la traza obtenida para el genotipo de HCV 3a;
La figura 4f muestra la traza obtenida para el genotipo de HCV 3b;
La figura 5 muestra tres potenciales posiciones de unión del cebador para el SNP Eu6 del gen ACE (enzima convertidora de angiotensina). La figura 5a muestra un cebador (nucleótidos enmarcados) unido a la plantilla con su extremo 3' 4 nucleótidos desde la posición SNP, la Figura 5b muestra un cebador unido a la plantilla con 3' y 5 nucleótidos desde la posición SNP y en la Figura 5c el cebador está unido a 10 nucleótidos desde la posición de SNP. En todas las figuras, las 2 variantes potenciales en el sitio de SNP son mostradas (G/A en la cadena plantilla);
La figura 6 muestra el rendimiento teórico a partir de reacciones de Pirosecuenciación® para dos posiciones de SNP. El rendimiento teórico se representa como nucleótido administrado en la reacción frente a la altura del pico (correlacionado para luz emitida a partir de la reacción de Pirosecuenciación®). La figura 6a muestra el rendimiento teórico para la secuenciación G/ACAG, en este caso, el cebador sería adyacente a la posición polimorfa. El rendimiento teórico mostrado es para el heterocigoto (es decir, el individuo tiene una copia del SNP A y una copia del SNP G). La figura 6b muestra el rendimiento teórico para TGAAC/TA. El cebador está así unido a 4 nucleótidos lejos del SNP. Otra vez, el modelo mostrado resultaría de un individuo heterocigoto (C/T). La figura 6c muestra una acumulación de las dos reacciones de secuenciación individuales en una mezcla de reacción de ampliación del cebador;
La figura 7 muestra un análisis múltiple simplificado en el que los cebadores de ampliación son diseñados de tal modo que sus extremos 3' se colocan a distancias diferentes de la posición polimorfa. Esto permite que se determine el diseño de un orden "inteligente" de adición de nucleótidos para permitir que el SNP (X marcado) sea secuenciado en el aislamiento. Así, los cebadores de ampliación deben ser diseñados en paralelo con el orden de administración;
La figura 8 muestra el rendimiento teórico para cinco SNP presentes en el sistema RAAS - Eu4 (G2215A ACE), Eu8 (ATG C521T), Eu10 (ATP T573C), Eu6 (T3409C ACE) y Eu3 (T1237C ACE). Los rendimientos teóricos se representan como en la Figura 7. Los cebadores de ampliación son colocados tal que la secuencia que se analiza para Eu4 es G/A CTGCCTG, Eu8 es CACCA/G TGG, EulO es C/TCCGATAGGGC, Eu6 es ACTTC/TG y Eu3 es AGACA/GGGC;
Las figuras 8a y 8b muestran que el rendimiento teórico esperado sea obtenido cuando los SNPs Eu4 y Eu8 son tipificados en una reacción única del cebador estándar. La posición de incorporación del nucleótido de SNP está enmarcada;
La figura 8a muestra el rendimiento teórico cuando el individuo es heterocigótico (A/G) y la figura 8b muestra el rendimiento esperado cuando el individuo es homocigótico (G/G). La figura 8c muestra el rendimiento esperado cuando dos SNP son secuenciados simultáneamente en la misma reacción (multiplexados). Las posiciones polimórficas están enmarcadas;
Las figuras 8d, 8e y 8f son los resultados teóricos obtenidos de la secuenciación Eu10, Eu6 y Eu3 solos, respectivamente. Los SNP Eu10 y Eu6 son mostrados como heterocigotos (C/T y C/T, respectivamente) y Eu3 como un homocigoto (A/A). Los modelos teóricos para 3 SNP son combinados en la figura 8g, y las posiciones de SNP están enmarcadas;
La figura 9 muestra los resultados obtenidos como trazas (luz generada (indicando la incorporación del nucleótido) frente al tiempo y la incorporación del nucleótido para siete reacciones que contienen plantillas diferentes y combinaciones del cebador. Las condiciones experimentales y los cebadores usados son descritas en el Ejemplo 2. La incorporación de un nucleótido en el cebador de ampliación causa la liberación de PPi, que se detecta usando unas reacciones enzimáticas acopladas usando ATP sulfurilasa y luciferasa. La luz generada a consecuencia de la ampliación encontrada es medida por una cámara CCD o luminómetro;
La figura 9a muestra la traza obtenida para Eu4;
La figura 9b muestra la traza obtenida para Eu8;
La figura 9c muestra la traza obtenida para Eu4 y Eu8 simultáneamente secuenciado;
La figura 9a muestra la traza obtenida para Eu10;
La figura 9e muestra la traza obtenida para Eu6;
La figura 9f muestra la traza obtenida para Eu3;
La figura 9f muestra la traza obtenida para Eu10, Eu6 y Eu3, simultáneamente secuenciada;
La figura 10 muestra el rendimiento teórico para los SNP Eu8, Eu7 y Eu11 presentes en el sistema RAAS. Los rendimientos teóricos se representan como en la Figura 7. Las secuencias analizadas son Eu8 CACCA/GTGGACAG, Eu7 T/CGGCCGGGTCACGAG/TG y Eu11 GAGCA/GTTAG. Por lo tanto, el fragmento Eu7 contiene dos sitios polimórficos;
La figura 10a muestra la traza teórica para Eu8 (G/G);
La figura 10b muestra la traza teórica para Eu7 (C/C y T/T);
La figura 10c muestra la traza teórica para Eu11 (A/G); y
La figura 10a muestra la traza teórica múltiple para Eu7, Eu8 y Eu11;
La figura 11 muestra el resultado obtenido como una traza (luz generada frente a la adición del nucleótido) para la reacción múltiple como se define en el Ejemplo 3. Las posiciones polimórficas están enmarcadas y se muestran los picos de referencia (flechas). El genotipo para el individuo tipificado es Eu8 G/G, Eu7 C/C y T/T Eu11 A/G;
La figura 12 es un esquema que muestra el diseño del cebador para 3 fragmentos de ácido nucleico separados, para el gen del inhibidor del activador del plasminógeno I, el gen de protrombina y el gen del factor V. Las flechas marcadas con un * corresponden a los cebadores de secuenciación y las flechas externas corresponden a los cebadores de PCR. El cebador biotinilado se indica con un B. La posición polimórfica en el gen de interés se marca con una X;
La figura 13 muestra el rendimiento esperado de reacciones de Pirosecuenciación® para los SNP en el inhibidor del activador del plasminógeno I (deleción 4G/5G), protrombina (G20210A) y factor V (G1691A). El rendimiento teórico se muestra como para la Figura 7. La secuencia analizada para PAI1 es (C)ACGTG, protrombina es GCTC/TGCTGA y factor V AGGCA/GAGGAA;
La figura 13a muestra la traza teórica para PAI1 (no deleción de C/C);
La figura 13b muestra la traza teórica para protrombina (C/T);
La figura 13c muestra la traza teórica para el factor V (A/G);
La figura 13d muestra la traza teórica para una combinación de los tres SNP en una reacción múltiple;
La figura 13e muestra la traza teórica para el genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina C/C y factor V G/G;
La figura 13f muestra la traza teórica para la deleción doble del genotipo PAI1, protrombina C/C y factor V A/A;
La figura 13g muestra la traza teórica para el genotipo PAI1 del/C, protrombina T/T y factor V G/G;
La figura 13h muestra la traza teórica para el genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina T/C y factor V G/G;
La figura 13i muestra la traza teórica para el genotipo PAI1 C/del, protrombina C/C y factor V G/G; y
La figura 13j muestra la traza teórica para el genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina C/C y factor V A/G;
La figura 14 muestra los resultados obtenidos como trazas (luz generada frente a la adición del nucleótido) para seis reacciones. Los materiales y los métodos son descritos en el Ejemplo 4;
La figura 14a muestra la traza obtenida para el genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina C/C y factor V G/G y corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13e;
La figura 14b muestra la traza obtenida para la deleción doble del genotipo PAI1, protrombina C/C y factor V A/A y corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13f;
La figura 14c muestra la traza obtenida para el genotipo PAI1 del/C, protrombina T/T y factor V G/G y corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13g;
La figura 14d muestra la traza obtenida para el genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina T/C y factor V G/G y corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13h;
La figura 14e muestra la traza obtenida para el genotipo PAI1 C/del, protrombina C/C y factor V G/G y corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13i; y
La figura 14f muestra la traza obtenida para el genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina C/C y factor V A/G y corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13j;
La figura 15 representa la localización de los cebadores con respecto al gen CYP2D6. Un segmento del gen con polimorfismos destacados particulares puede ser visto en lo alto de esta figura. Los fragmentos 61118 y 2162, según se amplifican por los cebadores PCR anidados están en la parte baja de la figura. Los cebadores de ampliación usados para las reacciones múltiples son mostradas encima de los fragmentos 61118 y 2162;
La figura 16 representa el rendimiento teórico obtenido para dos genotipos del gen CYP2D6. Los trazas fueron calculadas como se describe antes;
La figura 16a muestra el rendimiento teórico para G1934 (A/G), G 1749 C (C/G), T1795 del (ninguna deleción) y G 1846 T (T/g);
La figura 16b muestra el rendimiento teórico para G1934 (A/G), G 1749 C (C/G), T1795 del T/deleción y G1846T (T/G); y
La figura 17 muestra el resultado obtenido del Ejemplo 5 como una traza (luz generada frente a nucleótido añadido). Las condiciones experimentales son descritas en el Ejemplo 5. El genotipo del individuo tipificado es G1934A G/G, G1749C G/G, T1795 del T/T (ninguna deleción) G1846T G/G. También se muestra la gráfica del rendimiento teórico para este genotipo.
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Ejemplo 1
Muestras de suero
Fueron obtenidos 72 sueros de veteranos HCV-positivos del hospital Stanford Veteran. 10 sueros HCV-positivos fueron obtenidos de Irán.
Síntesis y purificación de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos HCV-PCR-OUTF
(5'-CCCTGTGAGGAACTWCTGTCTTCACGC), HCV-PCR-OUTR
(5'-GCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCT), HCV-PCR-INF
(5'-TCTAGCCATGGCGTTAGTAYGAGTGT), BHCV-PCR-INR
(5'-Biotin-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT), HCV-SEQF1
(5'-GGAACCGGTGAGTACACCGGAAT), HCV-SEQF2
(5'-GACYGGGTCCTTTCTTGGA), HCV-SEQF3
(5'-ATTTGGGCGTGCCCCCGC), fueron todos sintetizados y purificados por HPLC por MWG Biotech (High points, NC, EE.UU.).
Extracción de ARN, síntesis y ampliación de cADN
El ARN fue extraído a partir de 100 \mul de sueros de pacientes usando un kit de aislamiento de ARN Totally de Ambion (www.ambion.com, Ambion (Europa) Ltd., Cambridge, Reino Unido). El cADN fue sintetizado usando el kit sistema de Preampliación de Superscript® de Invitrogen (www.invitrogen.com, Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido). La síntesis del cADN monocatenario empleó una mezcla de ARN/cebador que contenía 5 \mul de ARN y 1 \mul de 0,5 \mug/\mul del cebador aleatorio de Oligo (dT) que fue incubada a 70ºC durante 10 minutos y luego fue colocada en hielo durante al menos 1 minuto. Una mezcla de reacción que contenía 2 \mul de tampón 10 x PCR (Tris-HCl 200 mM (pH 8,4), KCl 500 mM), mezcla de 2 \mul de MgCl_{2} 25 mM y dNTP 10 mM y DTT 0,1 M, fue añadida a cada mezcla de ARN/cebador, se mezcló suavemente recogiendo mediante una breve centrifugación y luego fue incubada a 42ºC durante 5 minutos. Doscientas unidades de transcriptasa inversa de Superscript II fueron añadidas a cada tubo, y fueron incubados a 40ºC durante 50 minutos. La reacción fue terminada incubando a 70ºC durante 15 minutos y luego se enfrió en hielo. El ácido nucleico fue recuperado mediante una breve centrifugación. 1 \mul de ARNsa H fue añadido a cada tubo y fue incubado durante 20 min a 37ºC. Fue realizada la PCR externa en 1 \mul de cADN usando la PCR de HCV-PCR-OUTF y HCV PCR-OUTR. La PCR externa fue diluida 500.000 veces y 1 \mul de esto fue usado como plantilla para la PCR interior usando los cebadores HCV-PCR-INF y HCV-PCR-INR.
Preparación de plantilla
Los productos de la PCR biotinilados fueron inmovilizados en perlas superparamagnéticas revestidas de estreptavidina Dynabeads M280-Estreptavidina (Dynal Biotech ASA, Oslo, Noruega). El ADN de una sola cadena fue obtenido desechando el sobrenadante después de la incubación del producto PCR inmovilizado en NaOH 0,10 M durante 3 minutos. Cinco pmol de los cebadores de secuenciación HCV-SEQF1, HCV-SEQF2, y HCV-SEQF3 fueron hibridados a la cadena inmovilizada, Como se describe en Ronaghi et al., 1996, Analytical Biochemistry, 242,
84-89.
Reacción de ampliación del cebador
Las plantillas de ADN cebadas fueron colocadas en una placa de microtítulo que contenía a 0,5 \mug de SSB (Amersham Pharmacia Biotech, EE.UU.), y sustratos de Pirosecuenciación® y los nucleótidos de enzimas (www.pyrosequen-
cing.com Pirosecuenciación® AB, Uppsala, Suecia) fueron administrados usando un instrumento de Pirosecuencia-
ción® PSQ® totalmente automatizado basado en una placa de microtítulo. El procedimiento de secuenciación fue realizado por el alargamiento paso a paso de la cadena del cebador bajo la adición preespecificada de cuatro nucleótidos diferentes. La plantilla fue hibridada con los tres cebadores de ampliación descritos más arriba. El progreso de secuenciación fue seguido a tiempo real usando el software Tag de Pirosecuenciación®, (Pirosecuenciación® AB, Uppsala, Suecia) y el subtipado fue realizado a mano.
Fueron recuperados sueros de sangre positivos de HCV de 89 pacientes diferentes y fue extraído el ARN de HCV como se describe más arriba. Después de la síntesis de cADN, fue realizada la PCR para amplificar una región larga de 236 bases de 5' UR. Uno de los cebadores en la PCR fue biotinilado. Después de la captura de los productos PCR en perlas magnéticas y la preparación de la plantilla, fue realizada la secuenciación por síntesis.
Resultados Principio del método de tipificación de HCV.
El principio del método de tipificación descrito más arriba se perfila en la Figura 1. En este sistema modelo, los cebadores de ampliación son hibridados al ADN de muestra diana, que es inmovilizado en perlas magnéticas.
Los cebadores de ampliación se hibridan expresamente a la región conservada adyacente a la región variable. En este juego de experimentos, fueron usados 3 cebadores de secuenciación para HCV. Los cebadores y su alineamiento con los genomas de HCV son mostrados en la Figura 2.
Las señales que resultan de la ampliación específica de cada cebador son directamente correlacionadas con el número de nucleótidos incorporados. La "huella digital" producida puede usarse por lo tanto para identificar el genotipo del individuo, frente a huellas digitales de referencia, que pueden ser teóricamente deducidas a partir de las secuencias de las regiones variables. Las huellas digitales de referencia calculadas teóricamente a partir de la secuencia de las regiones variables son mostradas en la Figura 3. Éstas pueden usarse para la tipificación de los resultados mostrados en la Figura 4: la Figura 4a es la huella digital para HCV la, la Figura 4b es la huella digital para HCV 1b, la Figura 4c es la huella digital para HCV 2a, la Figura 4d es la huella digital para HCV 2b, la Figura 4e es la huella digital para HCV 3a, y la Figura 4f es la huella digital para HCV 3b. Por lo tanto, usando el método de la invención, fue posible genotipar la infección de HCV. De los 77 sueros analizados por el método de la invención, el 35% fue infectado por HCV 1a, 29% con HCV 1b, 21% con HCV 2a, 4% con HCV 2b, 1% con HCV 3a y 10% con HCV 3b. De las 10 muestras analizadas de Irán, fueron obtenidos los resultados siguientes; 1a, 1; 1b, 3; 2a, 3; 3a, 2 y 3b; 1.
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Ejemplo 2
Tipificación de los SNP en el sistema RAAS Plantillas y cebadores
El ADN genómico fue aislado según métodos estándares, fueron generadas plantillas de PCR con cebadores específicos según la tabla más abajo.
1
Los siguientes cebadores de secuenciación fueron usados en las reacciones múltiples:
2
Amplificación PCR
Las moléculas de ácido nucleico diana fueron amplificadas por PCR, tanto por PCR estándar como por PCR múltiple.
PCR Simplex: una reacción PCR de 50 \mul fue puesta para cada fragmento específico de SNP y muestra. Todos los fragmentos fueron amplificados con el kit de oro AmpliTaq (PE Biosystems) y MgCl_{2} 1,5 mM según el protocolo siguiente. (Tabla 1).
TABLA 1
3
Fueron añadidos 5 \mul de ADN genómico (2 ng/\mul) a una mezcla de 45 \mul de PCR.
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Condiciones de ciclación de la PCR:
95ºC 5 minutos, 50x (95ºC 15 s, 57ºC 30 s, 72ºC 45 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC
PCR múltiple usando 4 cebadores de ampliación: Fue puesta una reacción PCR de 50 \mul usando los fragmentos específicos de SNP Eu4 y Eu8. Todas las muestras fueron amplificadas con el kit de mezcla Master HotStarTaq de Qiagen añadiendo Q-solución y MgCl_{2} a una concentración final de 2,0 mM según el protocolo siguiente (Tabla 3).
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TABLA 3 Concentración de magnesio 2,0 mM
4
Fueron añadidos 10 \mul de ADN genómico (2 ng/\mul) a 40 \mul de mezcla PCR.
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Condiciones de ciclación de la PCR:
95ºC 15 minutos, 35x (94ºC 30 s, 55ºC 1 minuto, 72ºC 2 minutos), 72ºC 10 minutos, 4ºC.
PCR múltiple usando 6 cebadores de ampliación: Fue puesta una reacción PCR de 50 \mul usando los fragmentos específicos de SNP Eu3, Eu6 y Eu10. Todas las muestras fueron amplificadas con el kit de mezcla Master HotStarTaq de Qiagen añadiendo Q-solución y MgCl_{2} a una concentración final de 2,0 mM según el protocolo siguiente (Tabla 4).
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TABLA 4 Concentración de magnesio 2,0 mM
5
Fueron añadidos 10 \mul de ADN genómico (2 ng/\mul) a 40 \mul de mezcla PCR.
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Condiciones de ciclación de la PCR:
95ºC 15 minutos, 35x (94ºC 30 s, 59ºC 1 minuto, 72ºC 2 minutos), 72ºC 10 minutos, 4ºC.
Preparación de la muestra
Fueron inmovilizados 25 \mul del producto PCR (producto múltiple de PCR o producto de PCR estándar reunido) por la adición de 10 \mul de Dynabeads® (Dynal Biotech ASA, supra) (10 \mug/\mul) junto con 25 \mul de tampón 2xBW (Tris-HCl 10 mM, pH 7,57, NaCl 2 M, EDTA 1 mM y Tween 20 al 0,1%). Fueron añadidos 15 pmol de cebador de secuenciación en tampón de hibridación (Tris-acetato 20 mM, pH 7,51, MgAc_{2} 5 mM) y la mezcla fue incubada durante 2 minutos a 80ºC. Se permitió entonces que las muestras se enfriaran a temperatura ambiente. Pueden añadirse en este punto 2,2 \mug de SSB (Amersham Pharmacia Biotech, supra), de ser requerido.
Ampliación del cebador
Las plantillas del ADN cebado fueron colocadas en una placa de microtítulo que contenía sustratos de Pirosecuen-
ciación® y enzimas (placa PSQ96®, Pirosecuenciación® AB, supra). Los nucleótidos fueron administrados usando el instrumento Pirosecuenciación® PSQ® basado en placa de microtítulo totalmente automatizado. El procedimiento de secuenciación fue realizado por el alargamiento paso a paso de la cadena del cebador bajo la adición preespecificada de cuatro nucleótidos diferentes. Las plantillas fueron hibridadas con los cebadores de ampliación mencionados anteriormente. El progreso de secuenciación fue seguido a tiempo real usando el software de Pirosecuenciación®.
Resultados Principio del método de tipificación de SNP
El principio del método de tipificación descrito más arriba es perfilado en la figura siete. En este sistema modelo, los cebadores de ampliación son hibridados al ADN de muestra diana, que se inmoviliza en perlas magnéticas.
En este juego de experimentos, fueron usados 3 cebadores de secuenciación para el sistema RAAS, tanto en el aislamiento para mostrar los "modelos simplex" como en combinación para mostrar los modelos múltiples.
Las señales que resultan de la ampliación específica de cada cebador están directamente correlacionadas con el número de nucleótidos incorporados. La "huella digital" producida puede usarse, por lo tanto, para identificar el genotipo del individuo, frente a las huellas digitales de referencia, que pueden ser teóricamente deducidas a partir de las secuencias de las regiones variables. Las huellas digitales de referencia calculadas teóricamente a partir de la secuencia de los SNP son mostradas en la Figura 8. 8a es el rendimiento teórico para SNP Eu4 (G2215A ACE), 8b es el rendimiento teórico para SNP Eu8 (ATG C521T) y 8c es el rendimiento teórico para el análisis simultáneo de los SNP Eu4 y Eu8, las posiciones polimórficas están enmarcadas. 8d es el rendimiento teórico para SNP Eu10 (ATP T573C), 8e es el rendimiento teórico para SNP Eu6 (T3409C ACE), 8f es el rendimiento teórico para Eu3 (T1237C ACE) y 8g es el rendimiento teórico para el análisis simultáneo de los SNP Eu10, Eu6 y Eu3. Los SNP Eu4, Eu10 y Eu6 son mostrados como heterozigotos, los SNP Eu8 como homozigoto G y SNP Eu3 como homozigoto A. Estos modelos de "referencia" pueden usarse para la tipificación de los resultados mostrados en la Figura 9: 9a es los datos de secuenciación para SNP Eu4 (A/G), 9b es los datos de secuenciación para SNP Eu8 (G/G) y 9c es datos de secuenciación múltiples para la combinación de SNP Eu4 (A/G) y SNP Eu8 (G/G), que guarda correlación con el rendimiento teórico 8c, indicando los marcos las posiciones de SNP. 9d, 9e y 9f son las gráficas de datos de secuenciación para SNP Eu10 (C/T), Eu6 (C/T) y Eu3 (A/A), respectivamente, y 9g es los datos de secuenciación múltiples para la combinación de estos 3 SNP, las posiciones polimórficas son enmarcadas. El modelo 9g guarda correlación con la
Figura 8g.
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Ejemplo 3
La genotipificación triple en los 4 SNP en el Sistema RAAS-Eu7 Eu8 (conteniendo 2 SNP), y Eu11.
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Plantillas y cebadores
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6
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Cebadores de secuenciación
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7
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La ampliación PCR, la preparación de muestra y las reacciones de ampliación del cebador fueron realizadas como se describe en el Ejemplo 2, a excepción de Eu11, que fue amplificado según el protocolo en la Tabla 2.
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TABLA 2
8
Fueron añadidos 5 \mul de ADN genómico (2 ng/\mul) a 45 \mul de mezcla PCR.
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Condiciones de ciclación de la PCR para Eu11:
95ºC 5 minutos, 50x (95ºC 315 s, 52ºC 30 s, 72ºC 45 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC.
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Resultados
En este juego de experimentos, fueron usados 3 cebadores ("ampliación") de secuenciación para el sistema RAAS, y las señales que resultan de la ampliación específica de cada cebador pueden ser directamente correlacionadas con el número de nucleótidos incorporados. Los modelos de referencia teóricos son mostrados en la Figura 10, que puede ser usada para determinar el genotipo mostrado en la figura 11. 10a, 10b y 10c son los rendimientos teóricos obtenidos para los SNP Eu8 (G/G), Eu7 (C/C y T/T) y Eu11 (A/G), con el rendimiento múltiple teórico mostrado en la figura 10a. Esto guarda correlación con los resultados reales obtenidos mostrados en la figura 11. Las posiciones polimórficas están enmarcadas, y el genotipo de este individuo es Eu8 G/G, Eu7 C/C y T/T y Eu11 A/G. El pirograma muestra algo de la incorporación de fondo del nucleótido que puede ser reducida como se discute antes (por ejemplo, se añade SSB después de la hibridación del cebador).
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Ejemplo 4
La tipificación de SNP en el factor de coagulación humano V, protrombina e inhibidor del activador del plasminógeno I.
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Introducción
La trombosis es un rasgo complejo (multifactorial). Los genes implicados son típicamente genes de susceptibilidad, en los que las diferencias no son mutaciones de punto, sino formas particulares (alelos) de polimorfismos. El desorden resulta de la presencia de una mayor frecuencia de alelos específicos en combinaciones desfavorables.
En los diez o quince años pasados, se ha encontrado que la mutación o variación en varios genes tiene que ver con la trombosis venosa. Esto incluye genes como el factor V (FV), protrombina (FII) y inhibidor del activador del plasminógeno I (PAI1).
El factor de coagulación V (FV) y la protrombina (FII) son componentes ambos esenciales en la cascada de coagulación humana, que por último causa la contención de la pérdida de sangre. La protrombina se divide proteolíticamente en la primera etapa de esta cascada que se convierte en la enzima de coagulación trombina. El factor de coagulación V sirve como un cofactor para la activación X-catalizada del factor de coagulación de protrombina a trombina. Las mutaciones de punto en estos genes pueden causar daños en procesos de trombosis y hemostasis. Uno tal es la trombosis venosa, que afecta predominantemente a personas de origen europeo. Las mutaciones, factor V Leiden (FV: G1691A) y la variante de protrombina G20210-A (FII: G20210A), son los dos factores de riesgo genéticos únicos más importantes para desarrollar la trombosis venosa. Esta predisposición europea ha sido explicada hasta cierto punto por la caracterización por estas dos variantes. Además de estos dos factores de riesgo establecidos para la trombosis venosa, el papel de otras variaciones genéticas está todavía bajo investigación (Martnelli et al., 1998; De Stefano et al., 1999; Rees et al., 1999; Hessner et al., 1999).
Varios estudios anteriores han documentado que la capacidad fibrinolítica es un determinante importante del riesgo de la trombosis. Muchos estudios han demostrado de forma convincente que los supervivientes del infarto de miocardio tienen perjudicada la actividad fibrinolítica debido a mayores concentraciones del inhibidor del activador del plasminógeno I (PAI-1) en plasma. Un polimorfismo de inserción/deleción de guanosina único en la región promotora del gen PAI1, comúnmente llamado 4G/5G, se ha demostrado que tiene que ver con la actividad de PAI-1 en plasma (Dawson et al., 1993; Eriksson et al., 1995).
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Cebadores
Fueron diseñados tres juegos de cebadores PCR. El fragmento que atraviesa sobre el exon 10 y el intron 10 del factor de coagulación humana V tenía 162 bp, el fragmento de protrombina que atraviesa sobre el exon 14 e intron 14 tenía 211 bp y el fragmento en la región promotora del gen PAI1 tenía 152 bp. Un cebador en cada juego fue biotinilado a fin de permitir la inmovilización subsecuente a perlas magnéticas/perlas de sefarosa. Además, fueron diseñados tres cebadores de secuenciación para hibridarse en una proximidad cercana al SNP del factor V Leiden, la variante de protrombina G20210A y la deleción 4G/5G de PAI1, véase la Figura 12.
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Cebadores de PCR
9
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Cebadores de secuenciación
10
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Amplificación de PCR
Fue puesta una reacción PCR de 50 \mul usando el kit de mezcla Master de HotStarTaq de QiaGen según el protocolo siguiente (Tabla 5).
TABLA 5 Concentración de magnesio 2,0 mM
11
Fueron añadidos 5 \mul de ADN genómico (2 ng/\mul) a 45 \mul de mezcla PCR.
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Condiciones de ciclación de la PCR:
95ºC 5 minutos, 50x (95ºC 30 s, 67ºC 45 s, 72ºC 60 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC.
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Preparación de muestra y ampliación del cebador
Fueron realizadas como se describe en el Ejemplo 2.
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Resultados
El rendimiento teórico obtenido por la tipificación de cada SNP o deleción individualmente se muestra como las figuras 13a, 13b y 13c, representando el genotipo de PAI1 para la deleción 4G/5G (C/C), SNP G20210A protrombina (C/T) y SNP G1691A factor V Leiden (A/G), respectivamente. El rendimiento teórico múltiple para el ensayo múltiple de estos 3 SNP se muestra como la figura 13d, con la deleción o posición de SNP mostrada. Las figuras 13e a 13j representan el rendimiento teórico esperado para 6 genotipos sobre los cuales los verdaderos datos fueron recuperados entonces, véase la Figura 14. Los pirogramas mostrados en la figura 14 son 6 genotipos posibles que pueden estar presentes en la población humana en estos genes. 14a es los resultados del genotipo PAI1 C/C, protrombina C/C y el factor V G/G, 14b es el genotipo PAI1 del/del, protrombina C/C y el factor V A/A, 14c es PAI1 de genotipo del/C, protrombina T/T y el factor V G/G, 14d es el genotipo PAI C/C, protrombina T/C y el factor V G/G, 14e es PAI1 de genotipo C/del, protrombina C/C, el factor V G/G y 14f es el genotipo PAI1 C/C, protrombina C/C y factor V A/G. La figura 14a corresponde a 13e, 14b a 13f, 14c a 13g, 14d a 13h, 14e a 13i y 14f a 13j.
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Ejemplo 5
Análisis de SNP de CYP2D6.
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Introducción
El gen CYP2D6 es un miembro de la superfamilia de genes de citocromo P450, que en total consiste en nueve familias de genes. Cuatro de estas familias de genes son responsables del metabolismo y la eliminación de la mayoría de los productos químicos ajenos que entran en el cuerpo vía la ingestión. Se mapea el locus CYP2D humano respecto al cromosoma 22ql3. 1 (Gough et al., 1993). El gen CYP2D6 codifica para una enzima, la debrisoquina 4-hidroxilasa, que está implicada en el metabolismo de más de 40 medicinas, entre ellas los neurolépticos, antidepresivos, antiarrítmicos, \beta-bloqueantes y opioides. La enzima se caracteriza por la variabilidad extrema en la actividad (interindividuo e interétnica). El genotipo de CYP2D6 y la función catalítica están estrechamente conectados, y la genotipificación podría ser un instrumento importante para determinar la dosis medicinal para los individuos. Más de 50 alelos han sido identificados, de los cuales muchos codifican para una enzima no funcional. Los alelos se definen por varias variaciones; los SNP, la inserción o deleción de pares de bases solos, deleción del gen completo, y copias del gen. Las secuencias analizadas en este ejemplo son como sigue:
G1846T: GCCAACCACTCC G/T GT
G1934A: G/A GACGCCCCTTCG
T1795del: GCAG (T) GGGTGACCG
G1749C: G/C CTCCACCTTGCG
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Cebadores
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TABLA 6 Cebadores de PCR y cebadores de secuenciación en el método múltiple. Los cebadores se llaman F para una dirección de avance y R para una dirección invertida. P representa un cebador PCR, y S un cebador de secuenciación y B significan biotina marcada en el extremo 5'
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12
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La figura 15 muestra la localización de los cebadores en los fragmentos de ácido nucleico de CYP2D6 para el método múltiple: fragmentos 2162 y 61118.
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Amplificación PCR
Fue realizada una ampliación PCR anidada. Tanto para el primero como para el anidado fue usado el kit de mezcla Master de HotStarTaq con 50 \mul de reacción de QiaGen y fue puesta según el protocolo siguiente (Tabla 7).
TABLA 7 Concentración de magnesio 1,5 mM
13
PCR 1.
1 \mul de ADN genómico (10 ng/\mul) fue añadido a 49 \mul de mezcla PCR.
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Condiciones de ciclación de la PCR:
Método de PCR, PCR primario (fragmento 4142)
95ºC 15 minutos, 25x (95ºC 45 s, 66ºC 45 s, 72ºC 60 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC.
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Método PCR, PCR secundario
95ºC 5 minutos, 20x (95ºC 45 s, T_{A} 45 s, 72ºC 45 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC.
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T_{A}, fragmento
61118 era 61ºC
\quad
2162 era 63ºC
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Preparación de la muestra
Ocurrió como se describe en el ejemplo 2. El SSB fue añadido a la mezcla de cebador/plantilla después de la hibridación. 0,55 \mug de SSB fueron añadidos para el fragmento 2162 y 2,2 \mug para el fragmento 61118. Las cantidades de cebadores de secuenciación eran para el fragmento 2162: 15 pmoles de cada uno, y para el fragmento 61118: 5 pmoles de los cebadores 182 y 183, y 70 pmoles del cebador 143.
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Ampliación del cebador
Fue realizada como se describe para el ejemplo 2.
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Resultados
Dos rendimientos teóricos para el fragmento 61118 en un análisis múltiple se muestran como las figuras 16a y 16b. La 16a muestra el genotipo G_{1934}A (A/G), G_{1749}C (C/G), T_{1795}del (ninguna deleción) y G1_{846}T (T/G) y la figura 16b se diferencia en que T_{1795}del muestra la deleción del residuo T.
La figura 17 muestra que los resultados reales del genotipo establecidos a partir del pirograma son G_{1934}A (G/G), G_{1749}C (G/G), T_{1795}del (ninguna deleción \therefore T/T) y G_{1846}T (G/G). Este es un genotipo diferente a aquellos mostrados en la figura 16.
Esto demuestra que es posible la tipificación de SNP múltiple y la deleción en un fragmento de ácido nucleico usando cebadores de ampliación múltiple.
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Ejemplo 6
Muestras de suero
72 sueros de veteranos HCV-positivos fueron obtenidos del hospital Stanford Veteran. Cinco sueros HCV-positivos fueron obtenidos de Irán.
Síntesis y purificación de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos HCV-PCR-OUTF
(5'-CCCTGTGAGGAACTWCTGTCTTCACGC), HCV-PCR-OUTR
(5'-GCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCT), HCV-PCR-INF
(5'-TCTAGCCATGGCGTTAGTAYGAGTGT), BHCV-PCR-INR
(5'-Biotin-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT), HCV-SEQF1
(5'-GGAACCGGTGAGTACACCGGAAT), HCV-SEQF2
(5'-GACYGGGTCCTTTCTTGGA), HCV-SEQF3
(5'-ATTTGGGCGTGCCCCCGC), fueron todos sintetizados y purificados por HPLC por MWG Biotech (High Points, NC, EE.UU.).
Extracción de ARN, síntesis y amplificación del cADN
El ARN fue extraído a partir de 50 \mul de suero. El cADN fue sintetizado usando transcriptasa inversa de AMV en cADN de HCV obtenido de diferentes pacientes usando BHCV-PCR-INR y HCV-PCR-INF para generar un producto de 270 bases.
Los productos PCR biotinilados fueron inmovilizados en perlas superparamagnéticas revestidas de estreptavidina Dynabeads® M280-estreptavidina (Dynal A. S., Oslo, Noruega). El ADN de una sola cadena fue obtenido quitando el sobrenadante después de la incubación del producto PCR inmovilizado en NaOH 0,10 M durante 3 minutos. Cinco pmol de los cebadores de secuenciación HCV-SEQF1, HCV-SEQF2 y HCV-SEQF3 fueron hibridados a la cadena inmovilizada.
Reacción de ampliación del cebador
La plantilla de ADN cebada fue colocada en una placa de microtítulo que contenía 0,5 \mug de SSB (Amersham Pharmacia Biotech, EE.UU.), y los sustratos de Pirosecuenciación® (www.pyrosequencing.com Pirosecuenciación® AB, Uppsala, Suecia) y las enzimas fueron administradas usando un instrumento de Pirosecuenciación® PSQ® totalmente automatizado basado en una placa de microtítulo. El procedimiento de secuenciación fue realizado por alargamiento paso a paso de la cadena del cebador bajo la adición preespecificada de cuatro nucleótidos diferentes. La plantilla fue hibridada con los tres cebadores de ampliación descritos más arriba. El progreso de secuenciación fue seguido usando el software de SNP Pirosecuenciación® a tiempo real, (Pirosecuenciación® AB, Uppsala, Suecia) y el subtipado fue realizado a mano.
Resultados Principio del método de tipificación.
El principio del método de tipificación descrito más arriba es perfilado en la Figura 1. En este sistema modelo, los cebadores de ampliación son hibridados al ADN de muestra diana, que es inmovilizado en perlas magnéticas.
Los cebadores de ampliación se hibridan expresamente a la región conservada adyacente a la región variable.
Las señales que resultan de la ampliación específica de cada cebador son directamente correlacionadas con el número de nucleótidos incorporados. La "huella digital" producida puede ser usada por lo tanto para identificar el genotipo del individuo, frente a huellas digitales de referencia, que puede ser teóricamente deducido a partir de las secuencias de las regiones variables. Las huellas digitales de referencia calculadas teóricamente a partir de la secuencia de las regiones variables son mostradas en la Figura 3. Éstas pueden usarse para la tipificación de los resultados mostrados en la Figura 4: la Figura 4a es la huella digital para HCV la, la Figura 4b es la huella digital para HCV lb, la Figura 4c es la huella digital para HCV 2a, la Figura 4d es la huella digital para HCV 2b, la Figura 4e es la huella digital para HCV 3a, y la Figura 4f es la huella digital para HCV 3b. Por lo tanto, usando el método de la invención, fue posible genotipar la infección de HCV. De los 77 sueros analizados por el método de la invención. El 35% fue infectado por HCV la, 29% con HCV lb, 21% con HCV 2a, 4% con HCV 2b, 10% con HCV 3a y 1% con HCV 3b.

Claims (15)

1. Un método para la tipificación de una o varias moléculas de ácido nucleico, comprendiendo dicho método:
hibridar simultáneamente dos o más cebadores de ampliación a dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y realizar las reacciones de ampliación del cebador a partir de éste, uniendo cada cebador en un sitio predeterminado diferente en dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y en el que los nucleótidos son añadidos a la mezcla de reacción secuencialmente en un orden conocido o predeterminado, y determinar el modelo de incorporación de nucleótidos secuenciando por síntesis para obtener un modelo de ensayo para dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico que se compara opcionalmente con uno o varios modelos de referencia para la tipificación de dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico.
2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico contiene dos o más sitios variables.
3. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 para obtener información de tipificación sobre una pluralidad de sitios variables dentro del ácido nucleico diana, comprendiendo dicho método hibridar simultáneamente dos o más cebadores de ampliación a dicho ácido nucleico diana, y realizar las reacciones de ampliación del cebador a partir de éste, uniendo cada cebador en un sitio predeterminado diferente en dicho ácido nucleico diana, proporcionando el modelo de incorporación de nucleótidos, determinado a partir de dichas reacciones de ampliación del cebador por secuenciación por síntesis, la información de tipificación sobre dichos sitios variables.
4. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la incorporación del nucleótido es determinada cuantitativamente.
5. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que si la incorporación del nucleótido ocurre en un sitio variable, no hay ninguna incorporación del nucleótido en el(los) otro(s) sitio(s) variable(s).
6. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que un primer cebador de ampliación se une más cerca a su sitio variable que lo hace un segundo cebador a su sitio variable.
7. Un método como se reivindica en la reivindicación 6, en el que el segundo cebador está 10-20 nucleótidos más lejos de su sitio variable que lo está dicho primer cebador.
8. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína de unión de una sola cadena es añadida a la mezcla de reacción después de que los cebadores se hibriden a la plantilla de ácido nucleico.
9. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las reacciones de ampliación del cebador ocurren simultáneamente.
10. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que 3 o más sitios variables son tipificados.
11. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que son realizadas 3 o más reacciones de ampliación del cebador.
12. Un método de diagnóstico de condiciones patológicas caracterizado por la presencia de la(s) molécula(s) de ácido nucleico específica(s), comprendiendo dicho método la tipificación de dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico por un método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el modelo de la incorporación de nucleótidos permite el diagnóstico de dichas condiciones patológicas.
13. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el modelo de incorporación de nucleótidos es determinado simultáneamente con la dicha ampliación del cebador, añadiendo cíclicamente o secuencialmente diferentes nucleótidos a la reacción de ampliación del cebador y detectando tanto si el nucleótido añadido es o no incorporado.
14. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el modelo de incorporación de nucleótidos es determinado detectando la liberación de pirofosfato.
15. Un método como se reivindica en la reivindicación 14, en el que dicha liberación de pirofosfato es detectada usando las enzimas ATP sulfurilasa y luciferasa.
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