ES2317928T3 - Metodo de tipaje o secuenciacion de un acido nucleico. - Google Patents
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Abstract
Un método para la tipificación de una o varias moléculas de ácido nucleico, comprendiendo dicho método: hibridar simultáneamente dos o más cebadores de ampliación a dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y realizar las reacciones de ampliación del cebador a partir de éste, uniendo cada cebador en un sitio predeterminado diferente en dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y en el que los nucleótidos son añadidos a la mezcla de reacción secuencialmente en un orden conocido o predeterminado, y determinar el modelo de incorporación de nucleótidos secuenciando por síntesis para obtener un modelo de ensayo para dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico que se compara opcionalmente con uno o varios modelos de referencia para la tipificación de dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico.
Description
Método de tipaje o secuenciación de un ácido
nucléico.
Esta invención se refiere a un método de
tipificación usando ácidos nucleicos, y, particularmente, a un
método mejorado de genotipificación.
La tipificación, por ejemplo la
genotipificación, puede ser particularmente ventajosa para los
diagnósticos médicos, pronósticos y tratamientos. Por ejemplo, la
identificación de los microbios responsables de una infección
permite que sea administrado el tratamiento correcto. Se ha
demostrado que los microbios pueden ser fácilmente identificados
por tipificación (es decir, mediante la identificación de modelos
distintivos genómicos característicos de cada microbio particular).
La tipificación de una o varias regiones variables en un gen o
varios genes u otra secuencia de ácidos nucleicos de un individuo
puede revelar marcadores de predisposición a una enfermedad,
condición o síndrome particular, y también puede indicar el mejor
método de tratamiento de lo anterior. Los métodos de tipificación
son también útiles para análisis genómicos (por ejemplo, en la
tipificación de polimorfismos o variaciones alélicas), tipificación
de tejidos o control medioambiental y ensayos de contaminación,
etc.
Se ha publicado sobre la genotipificación a gran
escala en Shi (Clinical Chemistry, 47:2,
164-172/2001). En esta publicación se proporciona
una revisión de una tecnología reciente tal como la
Pyrosequencing^{TM} en la detección de mutaciones y la
genotipificación con un foco en la genotipificación de polimorfismos
de nucleótido simple (SNP, de sus siglas en inglés "Single
Nucleotide Polymorphisms").
Los ensayos convencionales para la detección de
especies bacterianas o virales, o para detectar mutaciones o
polimorfismos en una secuencia de ADN incluyen la utilización del
método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este método
se diseña para permitir la ampliación selectiva de una secuencia de
ADN diana particular o secuencias, determinadas por la naturaleza
de los cebadores de ampliación usados. Para permitir tal ampliación
selectiva, se requiere algo de conocimiento previo de la secuencia
del ADN, lo que permite la construcción de dos secuencias de
cebador de oligonucleótido, conocidas como amplímeros. Un amplímero
se hibrida en el extremo 5' o hacia éste de una de las cadenas del
ADN diana y el otro amplímero en el extremo 5' o hacia éste de la
segunda cadena. En presencia de una ADN polimerasa y de precursores
de ADN (es decir, dATP, dCTP, dGTP y dTTP) los cebadores pueden
iniciar la síntesis de nuevas cadenas de ADN que son complementarias
a las cadenas individuales del segmento de ADN diana. El uso de una
polimerasa termoestable permite que el procedimiento sea fácilmente
repetido o ciclado. Las cadenas de ADN recién sintetizadas actúan
como plantillas para la posterior síntesis de ADN en ciclos
subsecuentes. La mezcla de reacción es sometida a una temperatura
de aproximadamente 90ºC para separar el ADN bicatenario formado por
la polimerasa. La temperatura de reacción se reduce a
aproximadamente entre 50ºC y 70ºC para permitir que el ADN
monocatenario se hibride a los cebadores, y se realiza otro ciclo
de la síntesis de ADN. El ADN sintetizado se extiende entre los
extremos de los dos cebadores. Preferentemente, la ADN polimerasa
usada es termofílica, es decir, Taq polimerasa. Después de 30
ciclos de síntesis de ADN, los productos de la PCR incluirán
aproximadamente 10^{5} copias de la secuencia diana específica.
Un ciclo de reacción de la PCR típico es por lo tanto: la síntesis
de las cadenas separadas por ampliación del cebador, la separación
de cadenas, la hibridación del cebador, la síntesis de nuevas
cadenas.
La reacción en cadena puede ser, por lo tanto,
perpetuada simplemente aumentando y disminuyendo la temperatura.
La tipificación (por ejemplo, la
genotipificación) se realiza usando técnicas basadas en la PCR, por
ejemplo, usando cebadores específicos de alelo (Okamoto, et
al. 1992, Journal of General Virology,
73,673-679; Widell, A., et al. 1994,
Journal of Medical Virology,
44,272-279).
Actualmente, puede usarse PCR múltiple para
rastrear muestras de ácidos nucleicos para un panel dado de
mutaciones/variaciones dentro de la secuencia de ácidos nucleicos.
Este método es, sin embargo, incómodo para el diagnóstico rutinario,
ya que es esencial el uso de electroforesis de gel. Los métodos
alternativos se basan en el uso de nucleótidos marcados o
cebadores, y pueden requerir estrategias o mecanismos de detección
complejos. Queda por lo tanto una necesidad de un método de
tipificación que pueda analizar ácidos nucleicos con respecto a 2 o
más regiones variables o posiciones típicamente sin la necesidad de
la electroforesis de gel y preferentemente sin el uso de
nucleótidos marcados o cebadores.
Otros métodos para la tipificación incluyen
métodos de detección serológicos (Viazov, et al. 1994,
Journal of Virological Methods,
48,81-91; Schroter, M., 1999, Journal of
Medical Virology, 57,230-234), ensayo de
sonda lineal (Stuyver, L., 1993, Journal of General Virology,
74,1093-1102, Stuyver, L., 1996,
Transfusion, 36, 552-558), y
polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (McOmish et
al. 1993, Transfusion, 33,7-13;
Buoro, S. 1999, Intervirology, 42,1-8)
son conocidos en la técnica. Sin embargo, la secuenciación sigue
siendo considerada en la técnica como el método "estándar por
excelencia" para la tipificación. En consecuencia, un método de
tipificación basado en la secuenciación que evite los inconvenientes
mencionados anteriormente representaría un avance considerable en
la técnica.
En la publicación de Aldeborn et al.
(Genome Research, 10: 1249-1259, 2000)
se habla sobre la tipificación de diferentes SNP en paralelo usando
la Pirosecuenciación®. Un cebador de secuenciación se hibrida al
ácido nucleico diana y se realizan reacciones separadas para dianas
diferentes en paralelo usando un instrumento de secuenciación
automatizado. Ahmadian et al. (Analytical Biochemistry
280, 103-110, 2000) discuten sobre métodos de alto
rendimiento para el análisis de las posiciones del SNP. Los SNP
simples son tipificados individualmente usando la técnica de la
Pirosecuenciación®.
La PCR también se usa comúnmente en la detección
de microbios, es decir bacterias o virus. Sin embargo, los ensayos
PCR convencionales están limitados en las aplicaciones diagnósticas,
y generalmente sólo indican si un microbio, o una secuencia
particular, está presente o no. Para muchas infecciones, por
ejemplo, infecciones virales tales como la infección viral por
hepatitis C, el microorganismo infectivo puede aparecer en varios
subtipos diferentes, por ejemplo al menos siete subtipos (o
genotipos) son conocidos del virus HCV. Sería ventajoso en tales
circunstancias no sólo determinar que está presente la "clase"
general (o género o especie) del microorganismo infectivo (por
ejemplo, el virus de HCV), sino también determinar cuál de los
subtipos está presente.
Del mismo modo, los estudios genómicos han
revelado en la actualidad que muchas otras enfermedades o desórdenes
pueden tener que ver con variaciones genéticas (por ejemplo,
mutaciones, variaciones alélicas o polimorfismos (por ejemplo,
polimorfismos de nucleótido simple, (SNP)), y que la presencia de
tales variaciones puede indicar un riesgo o predisposición a una
enfermedad o desorden, o puede indicar o hasta predecir cómo un
individuo puede responder a un tratamiento particular por aquella
enfermedad o desorden (este efecto último se refiere a la
"farmacogenómica"). En consecuencia, en la ciencia clínica, el
análisis (la tipificación) de tales variaciones puede tener
impor-
tancia.
tancia.
Los subtipos microbianos y los polimorfismos
clínicamente informativos (u otras variaciones genéticas) son
caracterizados, con frecuencia, mediante combinaciones de
variaciones genéticas (es decir, variaciones en posiciones
múltiples (es decir, dos o más) o regiones del genoma, etc.). En
consecuencia, para fines de tipificación, en tales situaciones, es
necesario "tipificar" (o identificar) más de una variación
(polimorfismo). En otras palabras, es necesario tipificar (o
estudiar o identificar) un modelo polimórfico (un modelo de
variaciones genéticas) cuyo modelo pueda cubrir más de una región
del genoma que se estudia. (La expresión "modelo polimórfico"
se usa en este documento ampliamente para incluir modelos, o
combinaciones, de dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o
más) de cualquier tipo de variación genética, por ejemplo,
mutaciones, variantes alélicas, polimorfismos de cualquier tipo
etc.). Se sobrentiende que la variación puede ser una inserción o
deleción de uno o varios residuos de ácidos
nucleicos.
nucleicos.
Así, para muchos microorganismos, las
enfermedades o la predisposición a la enfermedad, una identificación
del tipo exacto del microbio, o variación genética, presentes es
necesaria para hacer un diagnóstico apropiado o pronóstico y a fin
de conseguir esto es necesario estudiar más de una posición o región
de la variante genéticamente. Como se menciona anteriormente, la
PCR es un instrumento muy útil para la ampliación y/o la
identificación de una secuencia específica del ADN, pero usar
técnicas PCR convencionales para determinar el genotipo de una
molécula de ácido nucleico basado en variaciones genéticas múltiples
requiere que se realice un número repetido y múltiple de reacciones
individuales, lo que es incómodo, entretenido y caro de realizar
usando tecnologías y procedimientos convencionales tales como, por
ejemplo, la electroforesis o tecnologías de marcaje. Hay, por lo
tanto, la necesidad de un ensayo de tipificación que sea exacto y
fiable, tenga un tiempo de análisis corto y sea rápido y fácil de
operar. La presente invención se refiere a esta necesidad.
Particularmente, se ha encontrado ahora que un
método simple, fiable y exacto para obtener la información de la
tipificación (secuencia) respecto a una pluralidad de sitios
variables dentro del ácido nucleico diana, puede ser realizado
usando un sistema de reacción de ampliación de cebador usando dos o
más cebadores específicos diseñados para unirse en estos sitios
variables o cerca de estos, permitiendo que las reacciones de
ampliación del cebador sean realizadas en cada cebador hibridado a
una secuencia de ácidos nucleicos plantilla, secuencialmente o
simultáneamente, y detectando el modelo de incorporación de
nucleótidos en dichas reacciones de ampliación del cebador.
Proporciona el modelo de incorporación de nucleótidos la información
de tipificación sobre dichos sitios variables.
Este nuevo método de la invención combina así un
enfoque múltiple (es decir, un enfoque que se basa en el
funcionamiento simultáneo o paralelo de reacciones múltiples) con
una estrategia particular para detectar el resultado de las
extensiones de cebador múltiples, es decir, detectando el modelo de
incorporación de nucleótidos.
El método es particularmente adecuado para la
automatización, por ejemplo, en sistemas en los que la reacción y
las etapas de administración del reactivo ocurren en un formato de
placa de microtítulos. Los métodos son particularmente adecuados
para identificar especies microbianas y sus subtipos, pero también
puede encontrar aplicación en otros procedimientos de tipificación,
por ejemplo, la tipificación de polimorfismos, por ejemplo, para la
tipificación de tejido o en aplicaciones clínicas.
Como se describe más abajo, la presente
invención está ventajosamente basada en un método de
"secuenciación por síntesis" (véase, por ejemplo, el documento
US-A-4.863.849 de Melamede). Esta es
una expresión usada en la técnica para definir métodos de
secuenciación que se basan en la detección de la incorporación de
nucleótidos durante una reacción de ampliación de la polimerasa
dirigida por el cebador. Los cuatro nucleótidos diferentes (es
decir, los nucleótidos A, G, T o C) son añadidos cíclicamente o
secuencialmente (adecuadamente en una orden conocido), y el
acontecimiento de incorporación puede ser detectado de varios modos,
directamente o indirectamente. Esta detección revela qué nucleótido
se ha incorporado, y a partir de ahí la información de la
secuenciación; cuando se añade el nucleótido (base) que forma un par
(según las reglas normales del apareamiento de bases,
A-T y C-G) con la siguiente base en
la secuencia diana de plantilla, será incorporado en la cadena
complementaria creciente (es decir, el cebador ampliado) por la
polimerasa, y esta incorporación provocará una señal detectable,
cuya naturaleza depende de la estrategia de detección
seleccionada.
En consecuencia, la presente invención
proporciona un método para la tipificación de 1 o más moléculas de
ácido nucleico, comprendiendo dicho método:
hibridar simultáneamente dos o más cebadores de
ampliación a dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y
realizar reacciones de ampliación del cebador a partir de éste,
uniendo cada cebador en un sitio predeterminado diferente en
dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y determinar
el modelo de incorporación de nucleótidos secuenciando por síntesis
para obtener un modelo de ensayo (o "huella digital") para
dicha molécula de ácido nucleico que es opcionalmente comparado con
uno o varios modelos de referencia para la tipificación de
dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico.
Preferiblemente, las reacciones de ampliación
del cebador ocurren simultáneamente, es decir, ambos o todos los
cebadores son hibridados y son capaces de la ampliación del cebador
al mismo tiempo. Será, por supuesto, apreciado que cada cebador
individual sólo puede ser ampliado si es añadido un nucleótido a la
mezcla de reacción que es complementaria con el siguiente
nucleótido en la plantilla. Así, para cada adición de nucleótido, no
será ampliado realmente cada cebador (o incluso cualquier cebador)
y el término "simultáneo" debe ser interpretado con esto en
mente.
El método de la invención puede usarse para la
tipificación de una molécula de ácido nucleico que contiene dos o
más sitios en los cuales su secuencia puede ser variable ("sitios
variables") y cada cebador mencionado se une en un sitio que
está en un sitio variable o cerca. Pueden ser añadidos diferentes
nucleótidos secuencialmente para realizar las reacciones de
ampliación del cebador, y son descritos más abajo.
O bien, el método de la invención puede usarse
para la tipificación de dos o más moléculas de ácido nucleico que
contienen 1 o más sitios en los cuales la secuencia puede ser
variable ("sitios variables") y cada cebador se une en un
sitio que está en un sitio variable o cerca de éste. Pueden ser
añadidos diferentes nucleótidos secuencialmente para realizar las
reacciones de ampliación del cebador, y son descritos más abajo.
Esta realización puede ser particularmente útil cuando se desea
obtener información sobre sitios variables dentro de los genes
relacionados, por ejemplo los SNP en el factor V Leiden y la
protrombina (FII) que son factores de riesgo genético para el
desarrollo de la trombosis venosa.
El término "tipificación" según se usa en
este documento incluye cualquier método para analizar la secuencia
de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que se analiza (es
decir, el ácido nucleico de "ensayo" o diana). Más
particularmente, el método de tipificación de la invención incluye
métodos para la detección, identificación o análisis de la
variación genética o de secuencia (por ejemplo, la variación
genómica) en una molécula de ácido nucleico diana o moléculas (como
se menciona anteriormente, esto puede ser, por ejemplo, mutación,
variaciones alélicas, polimorfismos, etc.). Los métodos de la
invención incluyen así métodos para identificar, diferenciar o
distinguir una molécula de ácido nucleico o moléculas. Ya que el
método de tipificación de la invención se basa en la detección de
la variación genética en una molécula de ácido nucleico o moléculas,
puede ser considerado como un método de genotipificación. Se
sobrentiende que una molécula de ácido nucleico puede ser
tipificada y también que un sitio variable dado dentro de una
molécula de ácido nucleico puede ser tipificado.
La "genotipificación" según la presente
invención implica así determinar el genotipo de la(s)
molécula(s) de ácido nucleico diana. En el contexto de esta
memoria descriptiva, el "genotipo" puede ser considerado como
la combinación particular o el modelo de variaciones genéticas que
son estudiadas o analizadas en el método de la invención, que es
exhibida (o expresada) por la(s) molécula(s) de ácido
nucleico en cuestión. El genotipo puede comprender así la
combinación (o modelo) de alelos particulares (es decir,
variaciones) que son encontradas en los loci particulares
investigados.
En otras palabras, el genotipo es una
combinación o un modelo de variaciones genéticas múltiples (o
"sitios variables") en el ácido nucleico diana. Las
variaciones genéticas que comprenden o comportan el genotipo pueden
ser aquellas seleccionadas para el estudio en el método de la
invención (a pesar de que otras variaciones genéticas también
puedan estar presentes en la molécula, que no sean investigadas).
Como se menciona anteriormente, "múltiple", según se usa en
este documento, significa 2 o más (o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más),
y las variaciones genéticas ("o sitios variables") pueden ser
polimorfismos (por ejemplo, SNP), inserciones, deleciones,
mutaciones, regiones hipervariables, motivos variables o
variaciones alélicas, etc. Según los métodos de la invención, son
investigados simultáneamente 2 o más, preferiblemente 3 o más, por
ejemplo, 3-7 sitios variables. A menos que dos de
tales sitios variables sean encontrados cerca juntos, por ejemplo,
con 50 nucleótidos, preferiblemente con 30 nucleótidos,
preferiblemente con 20 nucleótidos, se requerirá un cebador separado
a fin de tipificar cada sitio variable. Entonces, cada cebador será
responsable de generar la información de tipificación sobre uno o
varios sitios variables, un cebador tendrá, por lo tanto, en efecto
su(s) "propio(s)" sitio(s)
variable(s).
Oportunamente, el ácido nucleico diana puede ser
ADN, aunque la tipificación del ARN (por ejemplo, mARN) esté
también dentro del ámbito de la invención. Si se desea la
tipificación de una muestra de ARN, el método puede incluir además
la etapa de generar cDNA a partir de la plantilla de ARN, usando
oportunamente la transcriptasa inversa. O bien, de ser deseado, las
reacciones de ampliación del cebador pueden ser realizadas
directamente en la plantilla de ARN.
El ácido nucleico diana puede ser así cualquier
ácido nucleico, aislado o sintético, en cualquier forma deseada o
adecuada. Puede ser así ADN genómico, o mARN aislado que puede
usarse directamente para análisis por el método de la invención, o
que puede ser un producto de ácido nucleico derivado a partir de
éste (o el correspondiente a éste), por ejemplo, por síntesis, tal
como el cDNA que se menciona anteriormente, o un producto de
ampliación (por ejemplo, amplicón PCR), clones o productos de la
genoteca etc.
La(s) molécula(s) de ácido
nucleico puede(n) ser obtenida(s) o derivada(s)
a partir de cualquier fuente adecuada, que puede ser cualquier
material que contiene el ácido nucleico, y todas las muestras
biológicas y clínicas están incluidas como fuentes posibles, es
decir, cualesquiera muestras de células o tejido de un organismo, o
cualquier fluido corporal o preparación derivada de éste, así como
cultivos celulares, preparaciones celulares, lisados celulares,
etc. Las muestras medioambientales, por ejemplo, muestras de suelo y
agua o muestras de comida también están incluidas. Las muestras
pueden ser nuevamente preparadas o pueden ser tratadas previamente
de cualquier modo adecuado, por ejemplo, para su almacenamiento.
Las fuentes representativas de ácido nucleico
incluyen así, por ejemplo, productos alimenticios y similares,
muestras clínicas y medioambientales. Sin embargo, la fuente será
generalmente una muestra biológica, que puede contener cualquier
material viral o celular, incluyendo todas la células procarióticas
o eucarióticas, virus, bacteriófagos, micoplasmas, protoplastos y
orgánulos. Tal material biológico puede comprender así todos los
tipos de células de animales mamíferos y no mamíferos, células de
planta, algas incluso algas azules-verdes, hongos,
bacterias, protozoos, etc. Las fuentes representativas incluyen así
sangre entera y productos derivados de la sangre tales como plasma,
suero y capa leucocitaria, orina, heces, fluido cerebroespinal o
cualquier otro fluido corporal, tejidos, cultivos celulares,
suspensiones celulares, etc.
El ácido nucleico puede ser proporcionado para
su investigación en cualquier forma adecuada y oportunamente estará
contenido en una muestra, por ejemplo, una muestra acuosa (por
ejemplo, en un tampón, etc.). El ácido nucleico puede prepararse
para el método de tipificación, según se desee, según técnicas
conocidas en la técnica, por ejemplo, aislamiento, purificación,
clonación, copia, ampliación, etc.
En la realización del método de la invención, se
proporcionan dos o más cebadores ("cebadores de ampliación")
que se unen al ácido nucleico diana en un sitio predeterminado,
siendo diferente cada sitio de unión del cebador, de modo que sean
realizadas múltiples y diferentes reacciones de ampliación del
cebador. Los cebadores de ampliación son diseñados o seleccionados
de modo que sus productos de ampliación sobrelapen (o comprendan)
un sitio (por ejemplo, locus o región) de la variabilidad de
secuencia (es decir, variación genética) en el ácido nucleico
diana. En otras palabras, los cebadores se unen al ácido nucleico
diana en, o cerca de, (por ejemplo, entre 1 y 40, entre 1 y 20,
entre 1 y 10, o entre 1 y 6 bases de), un sitio variable. Como se
menciona anteriormente, tales sitios variables constituyen el
genotipo del ácido nucleico diana.
Se requiere que al menos dos cebadores de
ampliación realicen el método, preferiblemente al menos tres. Sin
embargo, el número de cebadores puede variar según la elección, por
ejemplo, según la complejidad del sistema en estudio, y los
detalles de información que se deseen obtener. Así, por ejemplo,
pueden usarse 3, 4, 5 ó 6, o más cebadores de ampliación (por
ejemplo, entre 3 y 15, o 3-10).
Así, la expresión "sitio variable" se
refiere a un sitio (por ejemplo, locus o región) de una
molécula de ácido nucleico que puede diferenciarse en genotipos
diferentes. Como se define arriba, el sitio variable puede ser un
polimorfismo o motivo, etc. Los marcadores de ácido nucleico usados
para la tipificación normalmente contienen tanto regiones
conservadas/semi-conservadas como variables. Así,
cada "tipo" comprenderá una región de variación de secuencia,
en la que esta región (es decir, la secuencia, o la identidad de
base, en aquel sitio) puede ser diferente de otros tipos. En el
método de la invención, al menos dos sitios variables potenciales
son examinados, y, cuando una molécula de ácido nucleico diana es
tipificada, dicha molécula de ácido nucleico contiene así 2 o más
(es decir, múltiples) sitios variables. Cuando son tipificadas 2 o
más moléculas de ácido nucleico diana, dichas moléculas de ácido
nucleico contienen así cada una 1 o más sitios variables.
Se sobrentiende por cualquier persona experta en
la técnica que puede ser analizada cualquier combinación deseada de
sitios variables por el método de la invención. Los sitios variables
no tienen que estar restringidos a un gen único, región
codificante, región no codificante o molécula de ácido nucleico,
pero pueden ser encontrados en todas las partes en el genoma diana.
Se sobrentiende además que el sitio variable puede ser de cualquier
longitud, opcionalmente de 1 a 20 nucleótidos, preferiblemente de 1
a 10 nucleótidos de longitud. Típicamente, sin embargo, el sitio
variable puede comprender sólo uno solo o unos cuantos nucleótidos
(por ejemplo, 1-6, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6)
en los que la secuencia del ácido nucleico diana puede ser variable.
Así, por ejemplo, un virus tal como el virus de la hepatitis C
(HCV) puede contener regiones que son conservadas entre subtipos,
pero que sin embargo contienen sitios que pueden variar entre
subtipos. Tales sitios variables (que pueden tener típicamente de 1
a 3 nucleótidos de longitud) pueden usarse así para distinguir entre
varios subtipos. En HCV, tal región así conservada que contiene
sitios variables es la región 5' no traducida (5'UTR), y ésta puede
ser oportunamente usada en un método de ensayo de genotipificación
de la invención, como se describe después en el Ejemplo 1 más
abajo.
Otros microorganismos tendrán análogamente
similares tales regiones en sus genomas, conteniendo sitios
variables, que pueden ser usados de manera similar en el método de
la invención. Para otras aplicaciones de tipificación, por ejemplo,
la tipificación de polimorfismos, las regiones de variabilidad de
secuencia, conteniendo análogamente sitios polimorfos, pueden ser
identificadas de manera similar. Por ejemplo, los SNP en el sistema
de
renina-angiotensinogena-aldosterona
(RAAS) puede ser evaluado usando la posición de cebadores en
regiones conservadas de los genes. El cebador puede ser puesto en
el sitio de SNP o cerca. La figura 5 muestra la colocación de tres
cebadores de ampliación diferentes, en los que el extremo 3' del
cebador tiene 4 bases, 5 bases o 10 bases desde la posición de SNP.
El SNP es EU6 (ACE T3409C).
Se sobrentiende que a fin de realizar la
invención los sitios de unión del cebador deberían estar disponibles
en todas las variantes posibles (genotipos) de la(s)
molécula(s) de ácido nucleico en estudio. Tales sitios de
unión del cebador estarán por lo tanto ventajosamente en regiones
que son comunes a, o considerablemente conservadas entre, las
variantes diferentes. Esto puede ser fácilmente conseguido
seleccionando los sitios de unión del cebador para que estén en
regiones conservadas/semi-conservadas como se
discute antes.
Las reacciones de ampliación del cebador pueden
ser realizadas oportunamente añadiendo secuencialmente los
nucleótidos a la mezcla de reacción (es decir, una polimerasa, y
mezcla de cebador/plantilla). Ventajosamente se añaden los
diferentes nucleótidos en un orden conocido, y preferiblemente en un
orden predeterminado. En una realización adecuada de la invención
descrita en el Ejemplo 1 más abajo, son añadidos los 4 nucleótidos
diferentes (es decir, los nucleótidos A, G, T y C) secuencialmente
en un orden predeterminado de adición. Esto forma así un aspecto
preferido de la invención que los nucleótidos sean añadidos
secuencialmente en un orden predeterminado de adición. Por lo
tanto, el orden de adición puede ser adaptado al(a los)
ácido(s) nucleico(s) que se tipifica(n) y a
los cebadores usados. Se verá por lo tanto que el orden de adición
no será necesariamente cíclico, por ejemplo, A T G C A T G C, pero
puede ser, por ejemplo, C G C T A G A.
Cuando se añade cada nucleótido, puede ser
determinado si ocurre o no la incorporación de los nucleótidos.
Ventajosamente, como se describe más
detalladamente abajo, puede ser determinada además la cantidad
incorporada de cada nucleótido (es decir, cuántos). De esta manera,
puede ser determinado el modelo de incorporación de nucleótidos. En
otras palabras, la etapa de determinar el modelo de incorporación de
nucleótidos puede comprender la determinación (o detección) tanto
si se incorpora o no el nucleótido, y cuál. Ventajosamente, esta
etapa también incluye la determinación de la cantidad de cada
nucleótido incorporado. Tal realización cuantitativa, en la que la
incorporación del nucleótido es determinada cuantitativamente,
representa un aspecto preferido de la invención.
De esta manera, un "modelo" o "huella
digital" puede ser obtenido para el ácido nucleico diana. Este
modelo comprende la identidad de la base (es decir, la secuencia)
de los sitios variables particulares identificados para aquella
molécula de ácido nucleico. En otras palabras, el modelo corresponde
al genotipo del ácido nucleico diana. El genotipo puede ser así
fácilmente identificado comparando el modelo obtenido para un modelo
de referencia (o un "modelo estándar"), o un panel de modelos
de referencia (es decir, uno o varios, por ejemplo, dos o más, por
ejemplo, de 1 a 20, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 6 o de 1 a 3). Un
modelo de referencia puede ser fácilmente obtenido determinando el
modelo de incorporación de nucleótido usando los cebadores de
ampliación en cuestión en referencia a las moléculas de ácido
nucleico del genotipo conocido (por ejemplo, un subtipo microbiano
conocido o un modelo polimórfico conocido).
O bien, el "modelo de referencia" puede ser
teóricamente derivado del conocimiento de los sitios variables,
como se muestra en los Ejemplos posteriores. Puede no ser necesario
entonces comparar realmente el modelo obtenido con un modelo de
referencia, la información de tipificación/secuencia deseada puede
ser leída a partir del modelo obtenido. Una vez que los cebadores
de ampliación para cada sitio variable han sido seleccionados y el
orden de adición de nucleótidos ha sido determinado, es posible
determinar un rendimiento teórico a partir de una reacción de
ampliación del cebador. La figura 6 muestra el rendimiento teórico
de secuenciación de dos sitios variables individualmente, y la
combinación de la ampliación de ambos cebadores de ampliación
simultáneamente. El modelo de referencia teórico se muestra para 2
sitios variables presentes como heterocigotos. Los cebadores usados
se unieron a 3' a las secuencias mostradas.
Así, mediante la identificación (o
reconocimiento) del modelo obtenido para una molécula de ácido
nucleico diana, el genotipo de la molécula puede ser identificado
(o reconocido). Oportunamente, los modelos de ensayo y los modelos
de referencia pueden ser comparados usando el software de
reconocimiento de modelos.
A fin de realizar la invención, puede ser
ventajoso o adecuado amplificar primero la molécula de ácido
nucleico por cualquier método de ampliación adecuado conocido en la
técnica. El ácido nucleico diana sería entonces un amplicón. Las
técnicas de ampliación in vitro adecuadas incluyen cualquier
proceso que amplifique el ácido nucleico presente en la reacción
bajo la dirección de los cebadores apropiados. El método del
amplicón puede ser así preferiblemente PCR, o cualquiera de sus
diversas modificaciones, por ejemplo, el uso de cebadores anidados,
aunque no esté limitado a este método. Los expertos en la técnica
apreciarán que también pueden usarse otros procedimientos de
ampliación, tales como la replicación autosostenida de secuencia
(3SR), NASBA, el sistema de ampliación de Q-beta
replicasa y la reacción en cadena de ligasa (LCR) (véase, por
ejemplo, Abramson y Myers (1993) Current Opinion in
Biotech., 4: 41-47).
Si se usa la PCR para amplificar el ácido
nucleico, se diseñan cebadores adecuados, como se dice antes, para
asegurarse de que sea amplificada la región de interés dentro de la
secuencia de ácidos nucleicos (es decir, la región que contiene los
sitios variables). La PCR también puede usarse para la ampliación
indiscriminada de todas las secuencias de ADN, permitiendo la
ampliación de esencialmente todas las secuencias dentro de la
muestra de estudio (es decir, el ADN total). La PCR
enlazante-cebador es particularmente adecuada para
la ampliación indiscriminada, y usa enlazantes de oligonucleótido
bicatenarios con un extremo adecuado sobrelapante, que son unidos a
los extremos de los fragmentos del ADN diana. La ampliación se lleva
a cabo entonces usando cebadores de oligonucleótido que son
específicos para las secuencias del enlazante. O bien, pueden usarse
cebadores de oligonucleótidos completamente aleatorios junto con
DOP-PCR (oligonucleótido-cebado
degenerado) para amplificar todo el ADN dentro de una muestra. Si
los sitios variantes que se tipifican por el método de la invención
están presentes en áreas distintas del genoma, puede usarse la PCR
múltiple para amplificar secuencias de ácidos nucleicos del genoma
que contienen los sitios variables. Por lo tanto, pueden ser
amplificados múltiples fragmentos en una reacción PCR sola.
En el método de la invención, pueden tener que
ser amplificadas varias secuencias, para permitir que sean
analizadas varias regiones (por ejemplo, que contienen diferentes
sitios variables). Por lo tanto, pueden tener que ser sintetizados
varios cebadores de ampliación apropiados para permitir la
ampliación selectiva de varias secuencias en el ácido nucleico
diana. Se sobrentiende, por lo tanto, que varias moléculas de ácido
nucleico diferentes puedan estar presentes en la mezcla de
reacción.
Pueden usarse posteriormente como "cebador de
ampliación" uno o varios de los cebadores de ampliación usados
en la reacción de ampliación, pero aquel será preferiblemente un
cebador diferente.
Será apreciado que la secuencia y la longitud de
los cebadores de amplificación y ampliación del oligonucleótido que
se usan en las etapas de amplificación y ampliación,
respectivamente, dependerán de la secuencia del ácido nucleico
diana, la longitud deseada del producto de amplificación o
ampliación, las funciones adicionales del cebador (es decir, para
la inmovilización) y el método usado para la amplificación y/o
ampliación. Los cebadores apropiados pueden ser fácilmente
diseñados aplicando principios y técnicas conocidas en la
técnica.
Ventajosamente, como se menciona anteriormente,
los cebadores de ampliación se unirán cerca (por ejemplo, en las
bases 1-40, 1-20,
1-10 o 1-6, preferiblemente
1-3), bastante adyacentes o exactamente adyacentes
al sitio variable del ácido nucleico diana y serán complementarios
a una región conservada o semiconservada del ácido nucleico. En
ciertas realizaciones, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 1,
todos los cebadores se unirán bastante adyacentes a los sitios
variables dentro del ácido nucleico diana (es decir, adyacentes o
en las 3 bases del sitio variable). En otras realizaciones, véase,
por ejemplo el Ejemplo 3, los cebadores serán escalonados de modo
que uno esté muy cerca de su sitio variable, el otro esté a alguna
distancia lejos, por ejemplo, 4-10 nucleótidos
distante y un tercer cebador esté a 7 o más, por ejemplo,
8-16 nucleótidos distante de su (primer) sitio
variable. La figura 7 representa este principio.
Para el método de la invención que se realiza,
se requiere el conocimiento de la secuencia de la región conservada
o semiconservada a fin de diseñar un cebador de ampliación
complementario apropiado. Se proporciona un cebador de ampliación
para cada una de las regiones variables, siendo específico cada uno
para un sitio en el sitio variable o cerca. La especificidad se
consigue en virtud del emparejamiento de bases complementarias. Para
todas las realizaciones de la invención, el diseño del cebador
puede estar basado en principios conocidos en la técnica. No es
necesario para el cebador de amplificación o ampliación tener una
complementariedad absoluta con el sitio de unión, pero ésta es
preferida para mejorar la precisión de la unión.
El cebador de ampliación puede ser diseñado para
que se una a la cadena sentido o antisentido del ácido nucleico
diana.
En una realización preferida de la invención,
los cebadores de ampliación son diseñados para que se unan al ácido
nucleico diana cerca de los sitios variables de tal modo que en la
adición de los nucleótidos en una manera predeterminada, la
tipificación de cada sitio variable ocurra discretamente. Así, el
análisis de un sitio variable dado no es complicado por una señal
de incorporación positiva de otras regiones variables o
conservadas. Como se muestra en el Ejemplo 1, es posible interpretar
el modelo de ensayo y tener señales a partir de la incorporación
del nucleótido en más que el cebador, pero preferiblemente cuando un
cebador se amplía sobre un sitio variable, los otros cebadores
serán silenciados. Así, si la incorporación del nucleótido ocurre
en un sitio variable, no hay preferiblemente ninguna incorporación
de nucleótidos en el(los) otro(s) sitio(s)
variable(s). Por ejemplo, en el modelo teórico mostrado en la
Figura 6, los cebadores de ampliación son colocados de tal modo
que, bajo la adición secuencial predeterminada de nucleótidos, cada
sitio variable es tipificado discretamente, aunque la ampliación
del cebador ocurra simultáneamente en otros puntos, por ejemplo, la
segunda administración del nucleótido A. En esta realización
preferida, sólo el sitio variable es secuenciado cuando una cebador
ampliado alcanza su sitio variable; los otros cebadores no son
ampliados cuando el nucleótido añadido a la mezcla de reacción no
es complementario a la siguiente base en las plantillas para las
otras reacciones de ampliación del cebador. Así, los cebadores deben
ser diseñados en paralelo con el orden de adición de los
nucleótidos. El software de diseño del cebador puede usarse para
determinar la secuencia real del cebador una vez que el extremo 3'
haya sido fijado. Preferiblemente, se usa el Software de Diseño de
Cebadores Pirosecuenciación.
La figura 7 muestra un juego simplificado de
reacciones de ampliación del cebador múltiples en el que los
cebadores de ampliación son colocados a diferentes distancias del
sitio de la variante (mostrado como X). Esto permite que se realice
un modelo predeterminado de la adición de nucleótido, en el que el
sitio variante es secuenciado en el aislamiento. Como puede ser
previsto, las variaciones en la secuencia de nucleótidos corriente
arriba de los sitios variables diferentes pueden significar que los
cebadores no tienen que hibridarse de una manera tan escalonada
pero el modelo de la adición de nucleótido solo puede ser suficiente
para asegurar el acercamiento de cebadores (ampliados) y/o la
secuencia de sus sitios variables en tiempos diferentes. Así, todos
los cebadores pueden hibridarse a distancias similares a partir de
los sitios variables (o cuando se usa una reacción de ampliación
del cebador para la tipificación de 2 sitios variables, el primer
sitio variable) por ejemplo, sustancialmente adyacentes a éstos,
pero cuando los nucleótidos inmediatamente corriente arriba de los
sitios variables y dentro varían, de modo que el orden de la adición
del nucleótido controlará el orden de la ampliación del cebador a
través de los sitios variables.
La reacción de "ampliación del cebador"
según la invención incluye todas las formas de reacciones de
síntesis de ácido nucleico catalizadas por polimerasa dirigidas por
plantilla. Las condiciones y los reactivos para las reacciones de
ampliación del cebador son conocidos en la técnica, y cualquiera de
los métodos estándares, reactivos y enzimas, etc. puede usarse en
esta etapa (véase, por ejemplo, Sambrook et al., (editores),
Molecular Cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring
Harbor Laboratory Press). Así, la reacción de ampliación del
cebador en su forma más básica, se realiza en presencia del cebador,
desoxinucleótidos (dNTP) y una enzima polimerasa adecuada, por
ejemplo, T7 polimerasa, Klenow o Sequenase Ver 2.0 (USB EE.UU.), o
de hecho cualquier enzima polimerasa disponible y adecuada. Como se
menciona anteriormente, para una plantilla de ARN, puede usarse la
transcriptasa inversa. Las condiciones pueden ser seleccionadas
según la elección, de acuerdo con los procedimientos conocidos en
la técnica.
El cebador es así sometido a una reacción de
ampliación del cebador en presencia de un nucleótido, por lo cual
el nucleótido sólo se incorpora si es complementario a la base
inmediatamente adyacente (3') a la posición del cebador. El
nucleótido puede ser cualquier nucleótido capaz de la incorporación
por una enzima polimerasa en una cadena de ácido nucleico o
molécula. Así, por ejemplo, el nucleótido puede ser un
desoxinucleótido (dNTP, desoxinucleósido trifosfato) o
didesoxinucleótido (ddNTP, didesoxinucleósido ditrifosfato). Así,
los siguientes nucleótidos pueden usarse en la reacción de
extensión del cebador: guanina (G), citosina (C), timina (T) o
adenina (A) desoxi- o didesoxi-nucleótidos. Por lo
tanto, el nucleótido puede ser dGTP (desoxiguanosina trifosfato),
dCTP (desoxicitidina trifosfato), dTTP (desoxitimidina trifosfato) o
dATP (desoxiadenosina trifosfato). Como se dice más abajo, los
análogos adecuados de dATP, y también para dCTP, dGTP y dTTP también
pueden usarse. Los nucleótidos modificados que incluyen un grupo de
activación o detectable, nucleótido trifosfatos radio- o
fluoroscentemente-marcados también pueden usarse en
la etapa de ampliación del cebador. Los didesoxinucleótidos también
pueden usarse en la reacción de ampliación del cebador. El término
"didesoxinucleótido" según se usa en este documento incluye
2'-desoxinucleótidos en los cuales el grupo
hidroxilo 3' es modificado o está ausente. Los didesoxinucleótidos
son capaces de la incorporación en el cebador en presencia de la
polimerasa, pero no pueden entrar en una reacción de polimerización
subsiguiente, y así funcionar como una "terminador de
cadena".
Si el nucleótido es complementario a la base
diana, el cebador se amplía por un nucleótido, y se libera
pirofosfato inorgánico. Como se dice más abajo, en un método
preferido, puede ser detectado el pirofosfato inorgánico a fin de
detectar la incorporación del nucleótido añadido. Para algunos
sitios variables, la adición de un nucleótido será suficiente para
generar la información de tipificación. Sin embargo, para la mayoría
de los sitios variables, serán necesarios los datos para varios
nucleótidos adyacentes. El cebador ampliado puede servir del mismo
modo exactamente en un procedimiento repetido para determinar la
siguiente base en la región variable, permitiendo así al sitio
variable entero ser secuenciado. Diferentes nucleótidos pueden ser
añadidos secuencialmente, ventajosamente en el orden conocido, como
se discute antes, para revelar los nucleótidos que son incorporados
para cada cebador de ampliación. Además, en el caso en el que el
sitio variable sea homopolimérico (es decir, contiene 2 o más bases
idénticas), el número de nucleótidos incorporados de la base
complementaria reflejará el número presente en la región
homopolimérica. En consecuencia, la determinación del número de
nucleótidos incorporados para cada adición de nucleótido, revelará
esta información, y por ello contribuirá al modelo de la
incorporación de nucleótido.
Como consecuencia, un protocolo de ampliación de
cebador puede implicar la hibridación de un cebador como se
describe más arriba, la adición de un nucleótido, la realización de
una reacción de ampliación de cebador catalizada por polimerasa, la
detección de la presencia o la ausencia de la incorporación de dicho
nucleótido (y ventajosamente también la determinación de la
cantidad de cada nucleótido incorporado) y la repetición de la
adición del nucleótido y las etapas de ampliación del cebador, etc.
una o varias veces. Como se discute antes, pueden ser añadidos
sucesivamente nucleótidos solos (es decir, individuales) a la misma
mezcla de cebador-plantilla, o para separar
alícuotas de la mezcla cebador-plantilla, etc. según
la elección.
A fin de permitir la adición (iterativa)
repetida o sucesiva de nucleótidos en un procedimiento de ampliación
de cebador, el nucleótido antes añadido debe ser quitado. Esto
puede ser conseguido lavando, o más oportunamente, usando una
enzima de degradación de nucleótidos, por ejemplo, como se describe
detalladamente en el documento WO98/28440.
En consecuencia, en una realización principal de
la presente invención, se usa una enzima que degrada nucleótidos
para degradar cualquier nucleótido no incorporado o en exceso. Así,
si es añadido un nucleótido que no se incorpora (porque no es
complementario a la base diana), o alguno de los nucleótidos
añadidos permanece después de un acontecimiento de incorporación
(es decir, nucleótidos en exceso) entonces tales nucleótidos no
incorporados pueden eliminarse fácilmente usando una enzima de
degradación de nucleótidos. Esto se describe detalladamente en el
documento WO98/28440.
La expresión "enzima de degradación de
nucleótidos", según se usa en este documento, incluye cualquier
enzima capaz de degradar nucleótidos específicamente o no
específicamente, incluyendo al menos nucleósido trifosfatos (NTP),
pero opcionalmente también di- y mono-fosfatos, y
cualquier mezcla o combinación de tales enzimas, a condición de que
esté presente una nucleósido trifosfatasa u otra actividad de
degradación de NTP. Cuando se usa un nucleótido de terminación de
cadena (por ejemplo, se usa un didesoxi-nucleótido),
la enzima de degradación de nucleótidos también debería degradar a
tal nucleótido. Las enzimas de degradación de nucleótidos que tienen
actividad de fosfatasa pueden ser oportunamente usadas según la
invención, cualquier enzima que tenga cualquier nucleótido o
actividad de degradación de nucleósidos puede ser usada, por
ejemplo, enzimas que dividen nucleótidos en otras posiciones que
las del grupo fosfato, por ejemplo en los residuos de bases o de
azúcar. Así, una enzima de degradación de nucleósido trifosfato es
esencial para la invención. Las enzimas de degradación de
nucleósidos di- y/o mono-fosfato son opcionales y
pueden usarse en combinación con una enzima de degradación de
nucleósido trifosfato.
La enzima de degradación de nucleótidos
preferida es la apirasa, que es tanto nucleósido difosfatasa como
trifosfatasa, catalizando las reacciones NTP \rightarrow NDP + Pi
y NDP \rightarrow NMP + Pi (donde NTP es un nucleósido
trifosfato, NDP es un nucleósido difosfato, NMP es un nucleótido
monofosfato y Pi es fosfato inorgánico). La apirasa puede ser
obtenida de la Compañía Química Sigma. Otras enzimas de degradación
de nucleótidos posibles incluyen la nucleósido trifosfato
difosforidrolasa de páncreas de cerdo (Le Bel et al., 1980,
J. Biol. Chem., 255, 1227-1233). Se
describen otras enzimas en la bibliografía.
La enzima de degradación de nucleótidos puede
ser oportunamente incluida durante la etapa de reacción de la
polimerasa (es decir, en la ampliación del cebador). Así, por
ejemplo, la reacción de la polimerasa puede ser oportunamente
realizada en presencia de una enzima de degradación de nucleótidos.
Aunque sea menos preferida, tal enzima también puede ser añadida
después de que la incorporación del nucleótido (o la no
incorporación) haya ocurrido, es decir, después de la etapa de
reacción de la polimerasa.
Así, la enzima de degradación de nucleótidos
(por ejemplo, la apirasa) puede ser añadida a la mezcla de reacción
de la polimerasa (es decir, al ácido nucleico diana, el cebador y la
polimerasa) de cualquier modo adecuado, por ejemplo, antes de la
iniciación de la reacción o simultáneamente con ésta, o después de
que la reacción de la polimerasa haya ocurrido, por ejemplo, antes
de la adición de los nucleótidos a la muestra/cebador/polimerasa
para iniciar la reacción, o después de que la polimerasa y el
nucleótido sean añadidos a la mezcla de muestra/cebador.
Oportunamente, la enzima de degradación de
nucleótidos puede ser simplemente incluida en la mezcla de reacción
para la reacción de la polimerasa, que puede ser iniciada por la
adición del nucleótido.
Según la presente invención, la detección de la
incorporación de nucleótidos puede ser realizada de varios modos,
tales como, por la incorporación de nucleótidos marcados que pueden
ser detectados posteriormente, o usando sondas marcadas que sean
capaces de unirse a la secuencia ampliada.
El método se realiza usando un método de
secuenciación por síntesis, debido a que las reacciones de
ampliación son cuantitativas, es decir, que la incorporación del
nucleótido puede ser determinada cuantitativamente. Como se
menciona anteriormente, los métodos de secuenciación por síntesis
son explicados ampliamente en el documento
US-A-4.863.849, que describe varios
caminos en los cuales la incorporación del nucleótido activado
puede ser determinada o detectada, por ejemplo,
espectrofotométricamente o por técnicas de detección fluorescentes,
por ejemplo, determinando la cantidad de nucleótido que permanece en
la solución madre del nucleótido añadido, después de la etapa de
incorporación del nucleótido. En una reacción de secuenciación por
síntesis, la determinación del modelo de incorporación del
nucleótido ocurre simultáneamente con la ampliación del cebador. Una
definición de trabajo de secuenciación por síntesis es un método en
el cual un solo nucleótido activado (es decir, marcado) es, o no
es, incorporado en una plantilla cebada, siendo detectada la
incorporación por cualquier medio adecuado. Esta etapa es repetida
por la adición de un nucleótido activado diferente y se detecta otra
vez la incorporación. Estas etapas son repetidas y a partir de la
suma de los ácidos nucleicos incorporados, la secuencia puede ser
deducida. El método preferido de secuenciación por síntesis es, sin
embargo, un método basado en la detección de pirofosfato.
Preferiblemente, por lo tanto, la incorporación
del nucleótido se detecta midiendo la liberación de PPi,
preferiblemente por detección luminométrica, y sobre todo por
detección bioluminométrica.
El PPi puede ser determinado mediante muchos
métodos diferentes y en la bibliografía se han descrito varios
métodos enzimáticos (Reeves et al., (1969), Anal.
Biochem., 28, 282-287; Guillory et
al., (1971), Anal. Biochem., 39,
170-180; Johnson et al., (1968), Anal.
Biochem., 15, 273; Cook et al., (1978), Anal.
Biochem. 91,557-565; y Drake et
al., (1979), Anal. Biochem.
94,117-120).
Se prefiere usar luciferasa y luciferina, en
combinación, para identificar la liberación de pirofosfato ya que
la cantidad de luz generada es sustancialmente proporcional a la
cantidad de pirofosfato liberado que, a su vez, es directamente
proporcional a la cantidad de nucleótido incorporado. La cantidad de
luz puede ser fácilmente estimada mediante un dispositivo sensible
a la luz adecuado tal como un luminómetro. Así, los métodos
luminométricos ofrecen la ventaja de ser capaces de ser
cuantitativos.
Las reacciones de
luciferina-luciferasa para detectar la liberación de
PPi son conocidas en la técnica. Particularmente, se ha
desarrollado un método para el control continuo de la liberación de
PPi basado en las enzimas ATP sulfurilasa y luciferasa (Nyren y
Lundin, Anal. Biochem., 151, 504-509,
1985; Pyren P., "Enzymatic method for continuous monitoring of
DNA polymerase activity" (1987) Anal. Biochem, Vol
167 (235-238)) y el llamado ELIDA
("Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection
Assay" traducido del inglés como "Ensayo Enzimático
Luminométrico para la Detección de Pirofosfato Inorgánico"). El
uso del método ELIDA para detectar PPi es el preferido según la
presente invención. El método puede ser, sin embargo, modificado,
por ejemplo, por el uso de una luciferasa más termoestable
(Kaliyama, et al., 1994, Biosci. Biotech. Biochem.,
58,1170-1171) y/o ATP sulfurilasa (Onda
et al., 1996, Bioscience, Biotechnology and
Biochemistry, 60: 10, 1740-42). Este
método está basado en las reacciones siguientes:
También puede hacerse referencia a los
documentos WO 98/13523 y WO 98/28448, que se refieren a
procedimientos de secuenciación basados en la detección de
pirofosfato, y describen métodos de detección de PPi que pueden ser
de uso en la presente invención.
En una reacción de detección de PPi basada en
las enzimas ATP sulfurilasa y luciferasa, la señal (correspondiente
al PPi liberado) es vista como una luz. La generación de luz puede
ser observada como una curva conocida como un Pyrogram®. La luz es
generada por la acción de luciferasa en el producto, ATP (producido
por una reacción entre PPi y APS (véase más abajo) mediado por ATP
sulfurilasa) y, cuando se usa una enzima de degradación de
nucleótidos tal como la apirasa, esta generación de luz es
"apagada" entonces por la acción de la enzima de degradación
de nucleótidos, degradando el ATP que es el sustrato para la
luciferasa. La pendiente de la curva ascendente puede ser vista
como indicativa de las actividades de la ADN polimerasa (liberación
de PPi) y ATP sulfurilasa (generando ATP a partir del PPi,
proporcionando así un sustrato para la luciferasa). La altura de la
señal es dependiente de la actividad de luciferasa, y la pendiente
de la curva descendente es, como se explica arriba, indicativa de
la actividad de la enzima de degradación de nucleótidos. Como se
explica más abajo, el Pyrogram® en el contexto de una región
homopolimérica, la altura máxima es también indicativa del número
de nucleótidos incorporados para una etapa de adición de nucleótidos
dada. Entonces, cuando se añade un nucleótido, la cantidad de PPi
liberado dependerá de cuántos nucleótidos (es decir, la cantidad)
son incorporados, y ésta será reflejada en la altura de la
pendiente.
Ventajosamente, por la inclusión de la(s)
enzima(s) de detección de PPi (es decir, la enzima o enzimas
necesarias para conseguir la detección de PPi según el sistema de
detección enzimático seleccionado que, en caso de ELIDA, será ATP
sulfurilasa y luciferasa) en la etapa de reacción de la polimerasa,
el método de la invención puede ser fácilmente adaptado para
permitir que las reacciones de ampliación sean continuamente
supervisadas a tiempo real, siendo generada y detectada una señal,
cuando cada nucleótido sea incorporado.
Así, las enzimas de detección de PPi (junto con
cualquier sustrato enzimático u otros reactivos necesarios para la
reacción de detección de PPi) pueden ser simplemente incluidas en la
mezcla de reacción de polimerasa.
Un problema potencial que ha sido anteriormente
observado con métodos de secuenciación basados en PPi es que el
dATP, usado en la reacción de ampliación de cadena, interfiere en la
reacción subsecuente de detección basada en luciferasa actuando
como un sustrato para la enzima luciferasa. Esto puede ser reducido
o evitado usando, en lugar de desoxiadenosina trifosfato (ATP), un
análogo de dATP que sea capaz de actuar como un sustrato para una
polimerasa, pero que sea incapaz de actuar como un sustrato para una
enzima de detección de PPi. Tal modificación es descrita
detalladamente en el documento WO98/13523.
La expresión "incapaz de actuar" incluye
también análogos que son sustratos pobres para las enzimas de
detección, o que son sustancialmente incapaces de actuar como
sustratos, tal que no hay sustancialmente ninguna interferencia
significativa, o es insignificante, en la reacción de detección de
PPi.
Así, otra característica preferida de la
invención es el uso de un análogo de dATP que no interfiera en la
reacción enzimática de detección de PPi, pero que, sin embargo,
pueda ser incorporado normalmente en una cadena de ADN creciente
por una polimerasa. Por "normalmente incorporado" se entiende
que el nucleótido es incorporado con el apareamiento de bases
normal y apropiado. En la realización preferida de la invención, en
la que luciferasa es una enzima de detección de PPi, el análogo
preferido para uso según la invención es el análogo
[1-tio]trifosfato (o
\alpha-tiotrifosfato) de desoxi ATP,
preferiblemente desoxiadenosina
[1-tio]trifosfato, o desoxiadenosina
\alpha-tiotrifosfato (dATP\alphaS) que también
es conocida. La dATP\alphaS, junto con los análogos
\alpha-tio de dCTP, dGTP y dTTP, puede ser
comprada en Amersham Pharmacia. Los experimentos han demostrado que
la sustitución de dATP con dATP\alphaS permite la incorporación
eficiente por la polimerasa con una señal de fondo baja debido a la
ausencia de una interacción entre dATP\alphaS y luciferasa. Las
señales falsas son disminuidas usando un análogo de nucleótido en
lugar de dATP, porque es eliminada la linea de fondo causada por la
capacidad del dATP de funcionar como un sustrato para luciferasa.
Particularmente, puede ser conseguida una incorporación eficiente
con la polimerasa al tiempo que es sustancialmente disminuida la
señal de fondo debida a la generación de luz por el sistema
luciferina-luciferasa que resulta de la
interferencia dATP. Los análogos de dNTP\alphaS de los otros
nucleótidos también pueden usarse en lugar de otros dNTP.
Otro problema potencial que ha sido
anteriormente observado con métodos de secuenciación por síntesis es
que pueden ser generadas señales falsas y que son difíciles de
secuenciar con exactitud extensiones homopoliméricas (es decir,
CCC). Esto puede ser superado por la adición de una proteína de
unión de ácido nucleico monocatenaria (SSB) una vez que los
cebadores de ampliación han sido hibridados al ácido nucleico
plantilla. Se valora el uso de SSB en la secuenciación por síntesis
en el documento WO 00/43540 de Pirosecuenciación AB.
Se sobrentiende que en el método de la
invención, pueden estar presentes diferentes cantidades de la
plantilla de ácido nucleico cuando deban ser genotipadas múltiples
moléculas de ácido nucleico. A fin de ser capaces de cuantificar el
número de nucleótidos incorporados bajo la adición en ciertas
realizaciones, es preferido diseñar los cebadores y la
administración del nucleótido de tal modo que sea generada una señal
de referencia para cada cebador que corresponda a un acontecimiento
único de incorporación de nucleótido. La señal de referencia es
generada en ausencia de la incorporación del nucleótido en las otras
reacciones de ampliación del cebador. La señal de referencia
permite la calibración de las señales en relación a la misma
plantilla. Los picos de referencia son claramente mostrados en la
Figura 9, y la altura de la señal del sitio de la variante puede
ser correlacionada con la señal de referencia para aumentar la
exactitud.
La etapa de detectar la incorporación del
nucleótido monitorizando la liberación de PPi causa una señal
indicativa de la cantidad de pirofosfato liberado, y a partir de
ahí la cantidad de nucleótido incorporado. En el método de la
invención, se usan secuencialmente o simultáneamente 2 o más
cebadores distintos en una reacción de ampliación del cebador. Así,
en el caso de los cebadores simultáneamente añadidos, para cada
adición de nucleótido, pueden ser incorporados 0, 1 o más
nucleótidos en las cadenas de ADN creciente. La señal generada en la
etapa de detección de pirofosfato será por lo tanto indicativa del
número de nucleótidos incorporados en la etapa de ampliación del
cebador para la combinación de todos los cebadores unidos al ADN de
plantilla. El tamaño de la señal (es decir, la altura de cada pico)
puede ser, por lo tanto, correlacionada directamente con el número
de nucleótidos incorporados. En ciertas realizaciones, el cebador
sólo tiene que ser sometido a entre 1 y 20, preferiblemente entre 1
y 10, por ejemplo, entre 1 y 5 y lo más preferiblemente entre 1 y 4
ciclos de adición de nucleótidos.
En una realización de la invención, 2 o más
cebadores son hibridados (simultáneamente) en, adyacente o cerca de
sitios variables en el ácido nucleico diana. Siendo responsable cada
cebador de la tipificación de uno o posiblemente más sitios
variables. La ampliación del cebador se realiza entonces como se
describe más arriba, y la ampliación del cebador ocurre para cada
cebador sólo si el nucleótido añadido es complementario a la base
diana. Así, cuando se usan 2 cebadores simultáneamente, pueden
ocurrir ninguno, 1, 2 o más (para regiones homopoliméricas)
acontecimientos de incorporación de nucleótidos bajo la adición de
cualquier nucleótido dado. La reacción de ampliación del cebador se
realiza simultáneamente para todos los cebadores hibridados en la
mezcla de reacción. Así, la incorporación del nucleótido detectado
da un cuadro acumulativo para todos los cebadores hibridados. De
esta manera, el modelo de incorporación del nucleótido puede ser
directamente determinado. Preferiblemente, cuando una reacción de
ampliación se extiende a través de un sitio variable, la
incorporación del nucleótido ocurre sólo en aquel sitio.
En una realización adicional particularmente
preferida que también se discute más arriba y en los Ejemplos, los
cebadores de ampliación son hibridados a la plantilla, y los
cebadores son ampliados simultáneamente. Los cebadores se diseñan
para permitir que ocurra la ampliación del cebador sobre los sitios
variables secuencialmente - es decir, la ampliación del cebador
ocurre para cada cebador simultáneamente, pero la ampliación del
cebador sobre un sitio variable ocurre a su vez, mientras que los
otros cebadores son ampliados sobre una región
conservada/semiconservada o más preferiblemente no son ampliados en
absoluto debido a la adición de nucleótidos no complementarios. El
modelo de adición del nucleótido es preferiblemente predeterminado
para permitir que la ampliación de los cebadores ocurra
secuencialmente sobre los sitios variables. Los cebadores pueden
unir entre 1 y 40, entre 1 y 20, entre 1 y 10, entre 1 y 5
nucleótidos desde, o adyacente a, el sitio variable.
Opcionalmente, una vez que un cebador haya sido
ampliado sobre un sitio variable, puede ser añadido un terminador
de cadena, tal como un didesoxinucleótido, para terminar
expresamente la reacción de ampliación de cadena de aquel cebador.
Se sobrentiende que las señales de incorporación del nucleótido
serán generadas para todos los cebadores durante la reacción de
ampliación del cebador, y contribuirán al modelo obtenido. Sin
embargo, las regiones diferentes del modelo estarán relacionadas
preferiblemente con sólo uno de los sitios variables.
En todavía una realización más modificada de la
invención, pueden emplearse terminadores de cadena en lugar de los
dNTP o en combinación con los dNTP, usando simultáneamente cebadores
hibridados. En este caso, los cebadores se seleccionan o se diseñan
para asegurar que la ampliación del cebador de cada cebador ocurra
secuencialmente, es decir, que los nucleótidos sean primero
incorporados desde los primeros cebadores, la primera reacción de
ampliación se completa, antes de que ocurra la incorporación del
nucleótido del siguiente cebador. Esta realización también requiere
que los nucleótidos sean añadidos en el orden predeterminado.
De hecho, el llamado diseño "inteligente"
del cebador puede usarse para realizar el método de la invención de
una manera deseada o preseleccionada (es decir, predeterminada).
Esto puede aplicarse tanto al número de cebadores de ampliación
empleados, como al diseño de su secuencia. El diseño
"inteligente" del cebador se realiza óptimamente con un orden
"inteligente" de adición de nucleótidos para permitir que sea
realizada la secuenciación de los sitios variables individuales en
aislamiento. Tal diseño "inteligente" de cebadores y el orden
de la adición del nucleótido son descritos más detalladamente en los
Ejemplos.
El método de la invención puede realizarse
oportunamente en un matraz de reacción solo. Así, por ejemplo,
todos los cebadores de ampliación pueden ser añadidos juntos, en un
matraz de reacción solo.
Para que se realice la reacción de ampliación
del cebador, la molécula de ácido nucleico, sin tener en cuenta si
ha sido amplificada o no, se proporciona oportunamente en un formato
de una sola cadena. El ácido nucleico puede ser sometido para la
separación de cadena por cualquier técnica adecuada conocida en la
técnica (por ejemplo, Sambrook et al., supra), por
ejemplo, calentando el ácido nucleico, o calentando en presencia de
una sustancia química desnaturalizante tales como formamida, urea o
formaldehído, o por uso de un álcali.
Sin embargo, esto no es absolutamente necesario
y puede ser usada una molécula de ácido nucleico bicatenaria como
plantilla, por ejemplo, con una polimerasa adecuada que tiene
actividad de desplazamiento de cadena.
Cuando se usa una etapa de ampliación
preliminar, sin tener en cuenta cómo el ácido nucleico haya sido
amplificado, todos los componentes de la reacción de ampliación
tienen que ser quitados, para obtener el ácido nucleico puro, antes
de la realización del ensayo de tipificación de la invención. Por
ejemplo, tienen que ser eliminados los nucleótidos no incorporados,
cebadores PCR y las sales de la reacción PCR. Los métodos para
purificar ácidos nucleicos son conocidos en la técnica (Sambrook
et al., supra), sin embargo, un método preferido es
inmovilizar la molécula de ácido nucleico, quitando las impurezas
vía técnicas de sedimentación y/o lavado.
Opcionalmente, por lo tanto, el ácido nucleico
diana puede ser proveído de un medio para la inmovilización, que
puede ser introducido durante la ampliación, por las bases del
nucleótido o el/los cebador/es usado/s para producir el ácido
nucleico amplificado.
Para facilitar la inmovilización, los cebadores
de ampliación usados según la invención pueden llevar medios para
la inmovilización directamente o indirectamente. Así, por ejemplo,
los cebadores pueden llevar secuencias que sean complementarias a
secuencias que puedan ser unidas directamente o indirectamente a un
soporte inmovilizante o pueden llevar un resto adecuado para la
unión directa o indirecta a un soporte inmovilizante a través de
una pareja de unión.
Se conocen en la técnica numerosos soportes
adecuados para la inmovilización de ADN y métodos de unión de
nucleótidos, y están extensamente descritos en la bibliografía. Así,
por ejemplo, pueden usarse soportes en forma de pocillos de
microtítulo, tubos, varillas de aceite, partículas, fibras o tubos
capilares, hechos, por ejemplo, de agarosa, celulosa, alginato,
teflón, látex o poliestireno. Ventajosamente, el soporte puede
comprender partículas magnéticas, por ejemplo, las perlas
superparamagnéticas producidas por Dynal AS (Oslo, Noruega) y
vendidas bajo la marca registrada DYNABEADS. Pueden usarse chips
como soportes sólidos para proporcionar sistemas experimentales en
miniatura como se describe, por ejemplo, en Nilsson et al.
(Anal. Biochem. (1995), 224:
400-408).
El soporte sólido puede llevar grupos
funcionales tales como grupos hidroxilo, carboxilo, aldehído o amino
para unir el cebador o capturar el oligonucleótido. Esto se puede
proporcionar en general tratando al soporte para proporcionar un
revestimiento superficial de un polímero que lleve a uno de tales
grupos funcionales, por ejemplo, poliuretano junto con un
poliglicol para proporcionar grupos hidroxilo, o un derivado de
celulosa para proporcionar grupos hidroxilo, un polímero o
copolímero de ácido acrílico o ácido metacrílico para proporcionar
grupos carboxilo o un polímero alquilado de amino para proporcionar
grupos amino. La patente de EE.UU. Nº. 4.654.267 describe la
introducción de muchos de tales revestimientos superficiales.
O bien, el soporte puede llevar otros restos
para la unión, tales como avidina o estreptavidina (uniéndose a
biotina en la secuencia de nucleótidos), proteínas de unión de ADN
(por ejemplo, la proteína represora de lac I que se une a
una secuencia del operador lac que puede estar presente en el
cebador o el oligonucleótido), o anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo (uniéndose a haptenos, por ejemplo, digoxigenina en la
secuencia de nucleótidos). El sistema de unión
estreptavidina/biotina es usado muy comúnmente en biología
molecular, debido a la facilidad relativa con la cual la biotina
puede ser incorporada dentro de las secuencias de nucleótido y, por
supuesto, por la disponibilidad comercial de nucleótidos marcados
con biotina. Esto representa un método preferido para la
inmovilización de moléculas de ácido nucleico diana según la
presente invención. Las DYNABEADS revestidas de estreptavidina
están comercialmente disponibles de Dynal AS.
Como se menciona anteriormente, la
inmovilización puede ocurrir oportunamente después de la ampliación.
Para facilitar la inmovilización después de la ampliación, uno o
ambos de los cebadores de ampliación son proveídos de medios para
la inmovilización. Tales medios pueden comprender como se discute
antes, uno de un par de parejas de unión, que se unen a la
correspondiente pareja de unión llevada en el soporte. Los medios
adecuados para la inmovilización incluyen así biotina, haptenos, o
secuencias de ADN (tales como el operador lac) que se unen a las
proteínas de unión de ADN.
Cuando no se realiza la inmovilización de los
productos de ampliación, los productos de la reacción de ampliación
pueden ser simplemente separados, por ejemplo, tomándolos en una
solución de formamida (solución desnaturalizante) y separando los
productos, por ejemplo, por electroforesis o por análisis usando la
tecnología de los biochips. La inmovilización proporciona un modo
rápido y simple de generar una plantilla de una sola cadena para la
reacción de ampliación. Como una alternativa a la inmovilización,
pueden usarse otros métodos, por ejemplo, PCR asimétrica,
protocolos de exonucleasa o pueden usarse protocolos de
desnaturalizacion/hibridación rápidos en plantillas bicatenarias
para generar el ADN monocatenario. Tales técnicas son conocidas en
la técnica.
El método de la invención permite la
tipificación (por ejemplo, la genotipificación) de una o varias
moléculas de ácido nucleico derivadas de un individuo (por ejemplo,
un paciente en ensayo clínico, una muestra de tejido para la
tipificación, o un microorganismo para la identificación). Así, el
método de la invención es capaz de distinguir entre genotipos
diferentes dentro de una especie. Esto es particularmente útil en el
campo de la identificación de especies microbianas, donde pueden
existir muchos genotipos de un microbio, por ejemplo, hay
actualmente siete genotipos conocidos del virus de la hepatitis
C.
El método de la presente invención es
particularmente ventajoso en el diagnóstico de condiciones
patológicas caracterizadas por la presencia de ADN específico,
particularmente enfermedades infecciosas latentes tales como la
infección viral, por ejemplo, por herpes, hepatitis o VIH. También,
el método puede usarse para caracterizar o tipificar y cuantificar
infecciones bacterianas, protozoarias y fungosas en las que las
muestras de un organismo de inyección pueden ser difíciles de
obtener o en las que un organismo aislado sea difícil de hacer
crecer in vitro para la caracterización subsecuente como en
el caso de especies de P. falciparum o Chlamydia.
Debido a la simplicidad y la velocidad del método esto también puede
usarse para detectar a otros agentes patológicos que causan
enfermedades tales como sífilis y meningitis. Incluyendo los casos
en que puedan ser fácilmente obtenidas las muestras del organismo
de inyección, la velocidad de este método comparado con la
incubación de noche de un cultivo puede hacer el método según la
invención preferible respecto a las técnicas convencionales.
El método de la presente invención puede usarse
para analizar dos o más polimorfismos de nucleótido simple (SNP)
dentro de uno o varios genes, o dos o más genes, en un individuo.
Muchas enfermedades y condiciones pueden tener que ver con (o están
vinculadas a) polimorfismos combinatorios dentro del mismo gen, o
dentro de genes distintos. Por ejemplo, en el documento WO
00/22166, se ha sugerido que una combinación de varios SNP dentro
de varios genes da un modelo polimórfico que puede usarse para
predecir la probabilidad de una enfermedad cardiovascular,
proporcionando un pronóstico detallado para un individuo, y
prediciendo si un régimen terapéutico particular sería eficaz en la
mejora de una condición cardiovascular. Así, el método de la
invención puede usarse para dar un pronóstico rápido sobre el
genotipo particular de un individuo, permitiendo que sea
administrada una terapia adaptada. El ejemplo 2 muestra que la
genotipificación múltiple puede ser realizada para varios SNP en el
sistema RAAS. En este ejemplo, un ácido nucleico contiene 2 SNP
(EU7) y dos ácidos nucleicos adicionales contienen 1 SNP cada uno
(EU8 y EU11).
El método de la invención es ventajoso porque
determina la secuencia exacta de los sitios variables (es decir,
está basado en un procedimiento de secuenciación, lo que evita
procedimientos costosos e incómodos, tales como los de la
electroforesis, y nucleótidos ventajosamente marcados y/o cebadores,
y pueden analizarse números grandes de muestras en un corto periodo
de tiempo.
La reacción de ampliación del cebador genera un
"modelo" o una "huella digital" indicativa de la
incorporación del nucleótido, correlacionada con el nucleótido
añadido a la mezcla de reacción. El modelo es un cuadro acumulativo
de la incorporación del nucleótido para los cebadores diseñados para
detectar la incorporación del nucleótido en 2 o más sitios
variables dentro de la(s) molécula(s) de ácido
nucleico diana. Para permitir que la(s) molécula(s)
de ácido nucleico diana sean tipificadas, se usan modelos de
referencia, usando los mismos sitios variables y cebadores de
ampliación. Cada genotipo debe producir un modelo diferente,
facilitando la identificación por la comparación con el modelo de
referencia que puede ser determinado teóricamente.
El método de la invención se basa en el
conocimiento de la posición y la naturaleza de los sitios variables,
junto con la información de secuencia conocida adicional (por
ejemplo, con secuencias conocidas de regiones
conservadas/semi-conservadas) a partir de las cuales
determinar un sitio de unión del cebador apropiado y diseñar un
cebador de ampliación complementario. Usando el método de la
invención, puede usarse cualquier combinación de sitios variables
en el método de tipificación. Se sobrentiende por aquellos expertos
en la técnica que el método de la invención no está limitado con
sitios variables múltiples dentro de genes, pero el método es
también aplicable a regiones no codificantes. El modelo puede ser
obtenido para sitios variables que están en uno o varios del mismo
gen, en genes relacionados, en genes dispares, o en regiones no
codificantes.
La invención también comprende kits para
realizar el método de la invención, particularmente para la
tipificación de una o varias moléculas de ácido nucleico que
contienen uno o varios sitios variables. Éstas incluirán normalmente
uno o varios de los componentes siguientes:
(a) opcionalmente cebador(es) para la
ampliación in vitro; (b) dos o más cebadores para la reacción
de ampliación del cebador uniendo cada cebador en un sitio
predeterminado diferente en una molécula de ácido nucleico, y
siendo diseñados dichos cebadores para permitir, cuando dichos
cebadores son simultáneamente hibridados, que la ampliación del
cebador ocurra sobre dichos sitios variables secuencialmente, bajo
la adición de nucleótidos de una manera predeterminada; (c)
nucleótidos para la ampliación y/o para la reacción de ampliación
del cebador (como se describe más arriba); (d) una enzima
polimerasa para la ampliación y/o reacción de ampliación del
cebador; y (e) medios para detectar la ampliación del cebador
secuenciando por síntesis (p. ej. por medios de detección de la
liberación de pirofosfato como se perfila y se define más
arriba).
En ciertas realizaciones, el kit también
incluirá instrucciones para el orden de adición de los
nucleótidos.
La invención será descrita a continuación
mediante ejemplos no restrictivos con referencia a los dibujos en
los cuales:
La figura 1 muestra esquemáticamente un método
para la tipificación de ácido nucleico usando cebadores múltiples
(multiplexión) simultáneamente en una reacción de ampliación del
cebador;
La figura 2 muestra la secuencia de la región 5'
no traducida (5'-UTR) de siete genotipos del virus
de la hepatitis C (HCV), en el que las flechas indican las
posiciones de los cebadores de amplificación y ampliación, y los
nucleótidos destacados en negrita ilustran la región variable que se
secuencia por la reacción de ampliación de cebador;
La figura 3 muestra trazas teóricas que serían
obtenidas (luz generada (indicando la incorporación del nucleótido)
frente al tiempo (y adición del nucleótido)), para los siete
genotipos del HCV estudiado. Las condiciones experimentales y los
cebadores de ampliación teóricamente usados son descritos en el
Ejemplo 1. Tres cebadores de ampliación distintos fueron
teóricamente usados simultáneamente en una mezcla de reacción de
ampliación del cebador. Se libera pirofosfato inorgánico PPi en la
reacción catalizada de una ADN polimerasa si se incorpora un
nucleótido. El PPi se monitoriza por reacciones enzimáticas
acopladas usando ATP sulfurilasa y luciferasa. La luz generada es
medida como resultado por un detector CCD o luminómetro;
La figura 4 muestra trazas (luz generada
(indicando la incorporación del nucleótido) frente al tiempo (y
adición del nucleótido)), obtenidas para seis muestras que
contienen genotipos HCV diferentes. Las condiciones experimentales
y los cebadores usados son descritos en el Ejemplo 1. La
incorporación de un nucleótido en el cebador de ampliación causa la
liberación de PPi, que se detecta usando unas reacciones enzimáticas
acopladas usando ATP sulfurilasa y luciferasa. La luz generada a
consecuencia de la ampliación hallada se mide por una cámara CCD o
luminómetro;
La figura 4a muestra la traza obtenida para el
genotipo de HCV 1a;
La figura 4b muestra la traza obtenida para el
genotipo de HCV 1b;
La figura 4c muestra la traza obtenida para el
genotipo de HCV 2a;
La figura 4a muestra la traza obtenida para el
genotipo de HCV 2b;
La figura 4e muestra la traza obtenida para el
genotipo de HCV 3a;
La figura 4f muestra la traza obtenida para el
genotipo de HCV 3b;
La figura 5 muestra tres potenciales posiciones
de unión del cebador para el SNP Eu6 del gen ACE (enzima
convertidora de angiotensina). La figura 5a muestra un cebador
(nucleótidos enmarcados) unido a la plantilla con su extremo 3' 4
nucleótidos desde la posición SNP, la Figura 5b muestra un cebador
unido a la plantilla con 3' y 5 nucleótidos desde la posición SNP y
en la Figura 5c el cebador está unido a 10 nucleótidos desde la
posición de SNP. En todas las figuras, las 2 variantes potenciales
en el sitio de SNP son mostradas (G/A en la cadena plantilla);
La figura 6 muestra el rendimiento teórico a
partir de reacciones de Pirosecuenciación® para dos posiciones de
SNP. El rendimiento teórico se representa como nucleótido
administrado en la reacción frente a la altura del pico
(correlacionado para luz emitida a partir de la reacción de
Pirosecuenciación®). La figura 6a muestra el rendimiento teórico
para la secuenciación G/ACAG, en este caso, el cebador sería
adyacente a la posición polimorfa. El rendimiento teórico mostrado
es para el heterocigoto (es decir, el individuo tiene una copia del
SNP A y una copia del SNP G). La figura 6b muestra el rendimiento
teórico para TGAAC/TA. El cebador está así unido a 4 nucleótidos
lejos del SNP. Otra vez, el modelo mostrado resultaría de un
individuo heterocigoto (C/T). La figura 6c muestra una acumulación
de las dos reacciones de secuenciación individuales en una mezcla
de reacción de ampliación del cebador;
La figura 7 muestra un análisis múltiple
simplificado en el que los cebadores de ampliación son diseñados de
tal modo que sus extremos 3' se colocan a distancias diferentes de
la posición polimorfa. Esto permite que se determine el diseño de
un orden "inteligente" de adición de nucleótidos para permitir
que el SNP (X marcado) sea secuenciado en el aislamiento. Así, los
cebadores de ampliación deben ser diseñados en paralelo con el
orden de administración;
La figura 8 muestra el rendimiento teórico para
cinco SNP presentes en el sistema RAAS - Eu4 (G2215A ACE), Eu8 (ATG
C521T), Eu10 (ATP T573C), Eu6 (T3409C ACE) y Eu3 (T1237C ACE). Los
rendimientos teóricos se representan como en la Figura 7. Los
cebadores de ampliación son colocados tal que la secuencia que se
analiza para Eu4 es G/A CTGCCTG, Eu8 es CACCA/G TGG, EulO es
C/TCCGATAGGGC, Eu6 es ACTTC/TG y Eu3 es AGACA/GGGC;
Las figuras 8a y 8b muestran que el rendimiento
teórico esperado sea obtenido cuando los SNPs Eu4 y Eu8 son
tipificados en una reacción única del cebador estándar. La posición
de incorporación del nucleótido de SNP está enmarcada;
La figura 8a muestra el rendimiento teórico
cuando el individuo es heterocigótico (A/G) y la figura 8b muestra
el rendimiento esperado cuando el individuo es homocigótico (G/G).
La figura 8c muestra el rendimiento esperado cuando dos SNP son
secuenciados simultáneamente en la misma reacción (multiplexados).
Las posiciones polimórficas están enmarcadas;
Las figuras 8d, 8e y 8f son los resultados
teóricos obtenidos de la secuenciación Eu10, Eu6 y Eu3 solos,
respectivamente. Los SNP Eu10 y Eu6 son mostrados como
heterocigotos (C/T y C/T, respectivamente) y Eu3 como un homocigoto
(A/A). Los modelos teóricos para 3 SNP son combinados en la figura
8g, y las posiciones de SNP están enmarcadas;
La figura 9 muestra los resultados obtenidos
como trazas (luz generada (indicando la incorporación del
nucleótido) frente al tiempo y la incorporación del nucleótido para
siete reacciones que contienen plantillas diferentes y
combinaciones del cebador. Las condiciones experimentales y los
cebadores usados son descritas en el Ejemplo 2. La incorporación de
un nucleótido en el cebador de ampliación causa la liberación de
PPi, que se detecta usando unas reacciones enzimáticas acopladas
usando ATP sulfurilasa y luciferasa. La luz generada a consecuencia
de la ampliación encontrada es medida por una cámara CCD o
luminómetro;
La figura 9a muestra la traza obtenida para
Eu4;
La figura 9b muestra la traza obtenida para
Eu8;
La figura 9c muestra la traza obtenida para Eu4
y Eu8 simultáneamente secuenciado;
La figura 9a muestra la traza obtenida para
Eu10;
La figura 9e muestra la traza obtenida para
Eu6;
La figura 9f muestra la traza obtenida para
Eu3;
La figura 9f muestra la traza obtenida para
Eu10, Eu6 y Eu3, simultáneamente secuenciada;
La figura 10 muestra el rendimiento teórico para
los SNP Eu8, Eu7 y Eu11 presentes en el sistema RAAS. Los
rendimientos teóricos se representan como en la Figura 7. Las
secuencias analizadas son Eu8 CACCA/GTGGACAG, Eu7
T/CGGCCGGGTCACGAG/TG y Eu11 GAGCA/GTTAG. Por lo tanto, el fragmento
Eu7 contiene dos sitios polimórficos;
La figura 10a muestra la traza teórica para Eu8
(G/G);
La figura 10b muestra la traza teórica para Eu7
(C/C y T/T);
La figura 10c muestra la traza teórica para Eu11
(A/G); y
La figura 10a muestra la traza teórica múltiple
para Eu7, Eu8 y Eu11;
La figura 11 muestra el resultado obtenido como
una traza (luz generada frente a la adición del nucleótido) para la
reacción múltiple como se define en el Ejemplo 3. Las posiciones
polimórficas están enmarcadas y se muestran los picos de referencia
(flechas). El genotipo para el individuo tipificado es Eu8 G/G, Eu7
C/C y T/T Eu11 A/G;
La figura 12 es un esquema que muestra el diseño
del cebador para 3 fragmentos de ácido nucleico separados, para el
gen del inhibidor del activador del plasminógeno I, el gen de
protrombina y el gen del factor V. Las flechas marcadas con un *
corresponden a los cebadores de secuenciación y las flechas externas
corresponden a los cebadores de PCR. El cebador biotinilado se
indica con un B. La posición polimórfica en el gen de interés se
marca con una X;
La figura 13 muestra el rendimiento esperado de
reacciones de Pirosecuenciación® para los SNP en el inhibidor del
activador del plasminógeno I (deleción 4G/5G), protrombina (G20210A)
y factor V (G1691A). El rendimiento teórico se muestra como para la
Figura 7. La secuencia analizada para PAI1 es (C)ACGTG,
protrombina es GCTC/TGCTGA y factor V AGGCA/GAGGAA;
La figura 13a muestra la traza teórica para PAI1
(no deleción de C/C);
La figura 13b muestra la traza teórica para
protrombina (C/T);
La figura 13c muestra la traza teórica para el
factor V (A/G);
La figura 13d muestra la traza teórica para una
combinación de los tres SNP en una reacción múltiple;
La figura 13e muestra la traza teórica para el
genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina C/C y factor V
G/G;
La figura 13f muestra la traza teórica para la
deleción doble del genotipo PAI1, protrombina C/C y factor V
A/A;
La figura 13g muestra la traza teórica para el
genotipo PAI1 del/C, protrombina T/T y factor V G/G;
La figura 13h muestra la traza teórica para el
genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina T/C y factor V
G/G;
La figura 13i muestra la traza teórica para el
genotipo PAI1 C/del, protrombina C/C y factor V G/G; y
La figura 13j muestra la traza teórica para el
genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina C/C y factor V
A/G;
La figura 14 muestra los resultados obtenidos
como trazas (luz generada frente a la adición del nucleótido) para
seis reacciones. Los materiales y los métodos son descritos en el
Ejemplo 4;
La figura 14a muestra la traza obtenida para el
genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina C/C y factor V
G/G y corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13e;
La figura 14b muestra la traza obtenida para la
deleción doble del genotipo PAI1, protrombina C/C y factor V A/A y
corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13f;
La figura 14c muestra la traza obtenida para el
genotipo PAI1 del/C, protrombina T/T y factor V G/G y corresponde
al modelo teórico mostrado en la Figura 13g;
La figura 14d muestra la traza obtenida para el
genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina T/C y factor V
G/G y corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13h;
La figura 14e muestra la traza obtenida para el
genotipo PAI1 C/del, protrombina C/C y factor V G/G y corresponde
al modelo teórico mostrado en la Figura 13i; y
La figura 14f muestra la traza obtenida para el
genotipo PAI1 C/C (ninguna deleción), protrombina C/C y factor V
A/G y corresponde al modelo teórico mostrado en la Figura 13j;
La figura 15 representa la localización de los
cebadores con respecto al gen CYP2D6. Un segmento del gen con
polimorfismos destacados particulares puede ser visto en lo alto de
esta figura. Los fragmentos 61118 y 2162, según se amplifican por
los cebadores PCR anidados están en la parte baja de la figura. Los
cebadores de ampliación usados para las reacciones múltiples son
mostradas encima de los fragmentos 61118 y 2162;
La figura 16 representa el rendimiento teórico
obtenido para dos genotipos del gen CYP2D6. Los trazas fueron
calculadas como se describe antes;
La figura 16a muestra el rendimiento teórico
para G1934 (A/G), G 1749 C (C/G), T1795 del (ninguna deleción) y G
1846 T (T/g);
La figura 16b muestra el rendimiento teórico
para G1934 (A/G), G 1749 C (C/G), T1795 del T/deleción y G1846T
(T/G); y
La figura 17 muestra el resultado obtenido del
Ejemplo 5 como una traza (luz generada frente a nucleótido
añadido). Las condiciones experimentales son descritas en el Ejemplo
5. El genotipo del individuo tipificado es G1934A G/G, G1749C G/G,
T1795 del T/T (ninguna deleción) G1846T G/G. También se muestra la
gráfica del rendimiento teórico para este genotipo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Fueron obtenidos 72 sueros de veteranos
HCV-positivos del hospital Stanford Veteran. 10
sueros HCV-positivos fueron obtenidos de Irán.
Los oligonucleótidos
HCV-PCR-OUTF
(5'-CCCTGTGAGGAACTWCTGTCTTCACGC),
HCV-PCR-OUTR
(5'-GCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCT),
HCV-PCR-INF
(5'-TCTAGCCATGGCGTTAGTAYGAGTGT),
BHCV-PCR-INR
(5'-Biotin-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT),
HCV-SEQF1
(5'-GGAACCGGTGAGTACACCGGAAT),
HCV-SEQF2
(5'-GACYGGGTCCTTTCTTGGA),
HCV-SEQF3
(5'-ATTTGGGCGTGCCCCCGC), fueron
todos sintetizados y purificados por HPLC por MWG Biotech (High
points, NC, EE.UU.).
El ARN fue extraído a partir de 100 \mul de
sueros de pacientes usando un kit de aislamiento de ARN Totally de
Ambion (www.ambion.com, Ambion (Europa) Ltd., Cambridge, Reino
Unido). El cADN fue sintetizado usando el kit sistema de
Preampliación de Superscript® de Invitrogen (www.invitrogen.com,
Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido). La síntesis del cADN
monocatenario empleó una mezcla de ARN/cebador que contenía 5 \mul
de ARN y 1 \mul de 0,5 \mug/\mul del cebador aleatorio de
Oligo (dT) que fue incubada a 70ºC durante 10 minutos y luego fue
colocada en hielo durante al menos 1 minuto. Una mezcla de reacción
que contenía 2 \mul de tampón 10 x PCR (Tris-HCl
200 mM (pH 8,4), KCl 500 mM), mezcla de 2 \mul de MgCl_{2} 25 mM
y dNTP 10 mM y DTT 0,1 M, fue añadida a cada mezcla de ARN/cebador,
se mezcló suavemente recogiendo mediante una breve centrifugación y
luego fue incubada a 42ºC durante 5 minutos. Doscientas unidades de
transcriptasa inversa de Superscript II fueron añadidas a cada
tubo, y fueron incubados a 40ºC durante 50 minutos. La reacción fue
terminada incubando a 70ºC durante 15 minutos y luego se enfrió en
hielo. El ácido nucleico fue recuperado mediante una breve
centrifugación. 1 \mul de ARNsa H fue añadido a cada tubo y fue
incubado durante 20 min a 37ºC. Fue realizada la PCR externa en 1
\mul de cADN usando la PCR de
HCV-PCR-OUTF y HCV
PCR-OUTR. La PCR externa fue diluida 500.000 veces
y 1 \mul de esto fue usado como plantilla para la PCR interior
usando los cebadores HCV-PCR-INF y
HCV-PCR-INR.
Los productos de la PCR biotinilados fueron
inmovilizados en perlas superparamagnéticas revestidas de
estreptavidina Dynabeads M280-Estreptavidina (Dynal
Biotech ASA, Oslo, Noruega). El ADN de una sola cadena fue obtenido
desechando el sobrenadante después de la incubación del producto
PCR inmovilizado en NaOH 0,10 M durante 3 minutos. Cinco pmol de
los cebadores de secuenciación HCV-SEQF1,
HCV-SEQF2, y HCV-SEQF3 fueron
hibridados a la cadena inmovilizada, Como se describe en Ronaghi
et al., 1996, Analytical Biochemistry,
242,
84-89.
84-89.
Las plantillas de ADN cebadas fueron colocadas
en una placa de microtítulo que contenía a 0,5 \mug de SSB
(Amersham Pharmacia Biotech, EE.UU.), y sustratos de
Pirosecuenciación® y los nucleótidos de enzimas
(www.pyrosequen-
cing.com Pirosecuenciación® AB, Uppsala, Suecia) fueron administrados usando un instrumento de Pirosecuencia-
ción® PSQ® totalmente automatizado basado en una placa de microtítulo. El procedimiento de secuenciación fue realizado por el alargamiento paso a paso de la cadena del cebador bajo la adición preespecificada de cuatro nucleótidos diferentes. La plantilla fue hibridada con los tres cebadores de ampliación descritos más arriba. El progreso de secuenciación fue seguido a tiempo real usando el software Tag de Pirosecuenciación®, (Pirosecuenciación® AB, Uppsala, Suecia) y el subtipado fue realizado a mano.
cing.com Pirosecuenciación® AB, Uppsala, Suecia) fueron administrados usando un instrumento de Pirosecuencia-
ción® PSQ® totalmente automatizado basado en una placa de microtítulo. El procedimiento de secuenciación fue realizado por el alargamiento paso a paso de la cadena del cebador bajo la adición preespecificada de cuatro nucleótidos diferentes. La plantilla fue hibridada con los tres cebadores de ampliación descritos más arriba. El progreso de secuenciación fue seguido a tiempo real usando el software Tag de Pirosecuenciación®, (Pirosecuenciación® AB, Uppsala, Suecia) y el subtipado fue realizado a mano.
Fueron recuperados sueros de sangre positivos de
HCV de 89 pacientes diferentes y fue extraído el ARN de HCV como se
describe más arriba. Después de la síntesis de cADN, fue realizada
la PCR para amplificar una región larga de 236 bases de 5' UR. Uno
de los cebadores en la PCR fue biotinilado. Después de la captura de
los productos PCR en perlas magnéticas y la preparación de la
plantilla, fue realizada la secuenciación por síntesis.
El principio del método de tipificación descrito
más arriba se perfila en la Figura 1. En este sistema modelo, los
cebadores de ampliación son hibridados al ADN de muestra diana, que
es inmovilizado en perlas magnéticas.
Los cebadores de ampliación se hibridan
expresamente a la región conservada adyacente a la región variable.
En este juego de experimentos, fueron usados 3 cebadores de
secuenciación para HCV. Los cebadores y su alineamiento con los
genomas de HCV son mostrados en la Figura 2.
Las señales que resultan de la ampliación
específica de cada cebador son directamente correlacionadas con el
número de nucleótidos incorporados. La "huella digital"
producida puede usarse por lo tanto para identificar el genotipo
del individuo, frente a huellas digitales de referencia, que pueden
ser teóricamente deducidas a partir de las secuencias de las
regiones variables. Las huellas digitales de referencia calculadas
teóricamente a partir de la secuencia de las regiones variables son
mostradas en la Figura 3. Éstas pueden usarse para la tipificación
de los resultados mostrados en la Figura 4: la Figura 4a es la
huella digital para HCV la, la Figura 4b es la huella digital para
HCV 1b, la Figura 4c es la huella digital para HCV 2a, la Figura 4d
es la huella digital para HCV 2b, la Figura 4e es la huella digital
para HCV 3a, y la Figura 4f es la huella digital para HCV 3b. Por
lo tanto, usando el método de la invención, fue posible genotipar la
infección de HCV. De los 77 sueros analizados por el método de la
invención, el 35% fue infectado por HCV 1a, 29% con HCV 1b, 21% con
HCV 2a, 4% con HCV 2b, 1% con HCV 3a y 10% con HCV 3b. De las 10
muestras analizadas de Irán, fueron obtenidos los resultados
siguientes; 1a, 1; 1b, 3; 2a, 3; 3a, 2 y 3b; 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El ADN genómico fue aislado según métodos
estándares, fueron generadas plantillas de PCR con cebadores
específicos según la tabla más abajo.
Los siguientes cebadores de secuenciación fueron
usados en las reacciones múltiples:
Las moléculas de ácido nucleico diana fueron
amplificadas por PCR, tanto por PCR estándar como por PCR
múltiple.
PCR Simplex: una reacción PCR de 50 \mul fue
puesta para cada fragmento específico de SNP y muestra. Todos los
fragmentos fueron amplificados con el kit de oro AmpliTaq (PE
Biosystems) y MgCl_{2} 1,5 mM según el protocolo siguiente.
(Tabla 1).
Fueron añadidos 5 \mul de ADN genómico (2
ng/\mul) a una mezcla de 45 \mul de PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
95ºC 5 minutos, 50x (95ºC 15 s, 57ºC 30 s, 72ºC
45 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC
PCR múltiple usando 4 cebadores de ampliación:
Fue puesta una reacción PCR de 50 \mul usando los fragmentos
específicos de SNP Eu4 y Eu8. Todas las muestras fueron amplificadas
con el kit de mezcla Master HotStarTaq de Qiagen añadiendo
Q-solución y MgCl_{2} a una concentración final de
2,0 mM según el protocolo siguiente (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron añadidos 10 \mul de ADN genómico (2
ng/\mul) a 40 \mul de mezcla PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
95ºC 15 minutos, 35x (94ºC 30 s, 55ºC 1 minuto,
72ºC 2 minutos), 72ºC 10 minutos, 4ºC.
PCR múltiple usando 6 cebadores de ampliación:
Fue puesta una reacción PCR de 50 \mul usando los fragmentos
específicos de SNP Eu3, Eu6 y Eu10. Todas las muestras fueron
amplificadas con el kit de mezcla Master HotStarTaq de Qiagen
añadiendo Q-solución y MgCl_{2} a una
concentración final de 2,0 mM según el protocolo siguiente (Tabla
4).
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron añadidos 10 \mul de ADN genómico (2
ng/\mul) a 40 \mul de mezcla PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
95ºC 15 minutos, 35x (94ºC 30 s, 59ºC 1 minuto,
72ºC 2 minutos), 72ºC 10 minutos, 4ºC.
Fueron inmovilizados 25 \mul del producto PCR
(producto múltiple de PCR o producto de PCR estándar reunido) por
la adición de 10 \mul de Dynabeads® (Dynal Biotech ASA,
supra) (10 \mug/\mul) junto con 25 \mul de tampón 2xBW
(Tris-HCl 10 mM, pH 7,57, NaCl 2 M, EDTA 1 mM y
Tween 20 al 0,1%). Fueron añadidos 15 pmol de cebador de
secuenciación en tampón de hibridación (Tris-acetato
20 mM, pH 7,51, MgAc_{2} 5 mM) y la mezcla fue incubada durante 2
minutos a 80ºC. Se permitió entonces que las muestras se enfriaran a
temperatura ambiente. Pueden añadirse en este punto 2,2 \mug de
SSB (Amersham Pharmacia Biotech, supra), de ser
requerido.
Las plantillas del ADN cebado fueron colocadas
en una placa de microtítulo que contenía sustratos de
Pirosecuen-
ciación® y enzimas (placa PSQ96®, Pirosecuenciación® AB, supra). Los nucleótidos fueron administrados usando el instrumento Pirosecuenciación® PSQ® basado en placa de microtítulo totalmente automatizado. El procedimiento de secuenciación fue realizado por el alargamiento paso a paso de la cadena del cebador bajo la adición preespecificada de cuatro nucleótidos diferentes. Las plantillas fueron hibridadas con los cebadores de ampliación mencionados anteriormente. El progreso de secuenciación fue seguido a tiempo real usando el software de Pirosecuenciación®.
ciación® y enzimas (placa PSQ96®, Pirosecuenciación® AB, supra). Los nucleótidos fueron administrados usando el instrumento Pirosecuenciación® PSQ® basado en placa de microtítulo totalmente automatizado. El procedimiento de secuenciación fue realizado por el alargamiento paso a paso de la cadena del cebador bajo la adición preespecificada de cuatro nucleótidos diferentes. Las plantillas fueron hibridadas con los cebadores de ampliación mencionados anteriormente. El progreso de secuenciación fue seguido a tiempo real usando el software de Pirosecuenciación®.
El principio del método de tipificación descrito
más arriba es perfilado en la figura siete. En este sistema modelo,
los cebadores de ampliación son hibridados al ADN de muestra diana,
que se inmoviliza en perlas magnéticas.
En este juego de experimentos, fueron usados 3
cebadores de secuenciación para el sistema RAAS, tanto en el
aislamiento para mostrar los "modelos simplex" como en
combinación para mostrar los modelos múltiples.
Las señales que resultan de la ampliación
específica de cada cebador están directamente correlacionadas con
el número de nucleótidos incorporados. La "huella digital"
producida puede usarse, por lo tanto, para identificar el genotipo
del individuo, frente a las huellas digitales de referencia, que
pueden ser teóricamente deducidas a partir de las secuencias de las
regiones variables. Las huellas digitales de referencia calculadas
teóricamente a partir de la secuencia de los SNP son mostradas en
la Figura 8. 8a es el rendimiento teórico para SNP Eu4 (G2215A
ACE), 8b es el rendimiento teórico para SNP Eu8 (ATG C521T) y 8c es
el rendimiento teórico para el análisis simultáneo de los SNP Eu4 y
Eu8, las posiciones polimórficas están enmarcadas. 8d es el
rendimiento teórico para SNP Eu10 (ATP T573C), 8e es el rendimiento
teórico para SNP Eu6 (T3409C ACE), 8f es el rendimiento teórico
para Eu3 (T1237C ACE) y 8g es el rendimiento teórico para el
análisis simultáneo de los SNP Eu10, Eu6 y Eu3. Los SNP Eu4, Eu10 y
Eu6 son mostrados como heterozigotos, los SNP Eu8 como homozigoto G
y SNP Eu3 como homozigoto A. Estos modelos de "referencia"
pueden usarse para la tipificación de los resultados mostrados en
la Figura 9: 9a es los datos de secuenciación para SNP Eu4 (A/G), 9b
es los datos de secuenciación para SNP Eu8 (G/G) y 9c es datos de
secuenciación múltiples para la combinación de SNP Eu4 (A/G) y SNP
Eu8 (G/G), que guarda correlación con el rendimiento teórico 8c,
indicando los marcos las posiciones de SNP. 9d, 9e y 9f son las
gráficas de datos de secuenciación para SNP Eu10 (C/T), Eu6 (C/T) y
Eu3 (A/A), respectivamente, y 9g es los datos de secuenciación
múltiples para la combinación de estos 3 SNP, las posiciones
polimórficas son enmarcadas. El modelo 9g guarda correlación con
la
Figura 8g.
Figura 8g.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La genotipificación triple en los 4 SNP en el
Sistema RAAS-Eu7 Eu8 (conteniendo 2 SNP), y
Eu11.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La ampliación PCR, la preparación de muestra y
las reacciones de ampliación del cebador fueron realizadas como se
describe en el Ejemplo 2, a excepción de Eu11, que fue amplificado
según el protocolo en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron añadidos 5 \mul de ADN genómico (2
ng/\mul) a 45 \mul de mezcla PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de ciclación de la PCR para
Eu11:
95ºC 5 minutos, 50x (95ºC 315 s, 52ºC 30 s, 72ºC
45 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
En este juego de experimentos, fueron usados 3
cebadores ("ampliación") de secuenciación para el sistema RAAS,
y las señales que resultan de la ampliación específica de cada
cebador pueden ser directamente correlacionadas con el número de
nucleótidos incorporados. Los modelos de referencia teóricos son
mostrados en la Figura 10, que puede ser usada para determinar el
genotipo mostrado en la figura 11. 10a, 10b y 10c son los
rendimientos teóricos obtenidos para los SNP Eu8 (G/G), Eu7 (C/C y
T/T) y Eu11 (A/G), con el rendimiento múltiple teórico mostrado en
la figura 10a. Esto guarda correlación con los resultados reales
obtenidos mostrados en la figura 11. Las posiciones polimórficas
están enmarcadas, y el genotipo de este individuo es Eu8 G/G, Eu7
C/C y T/T y Eu11 A/G. El pirograma muestra algo de la incorporación
de fondo del nucleótido que puede ser reducida como se discute
antes (por ejemplo, se añade SSB después de la hibridación del
cebador).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La tipificación de SNP en el factor de
coagulación humano V, protrombina e inhibidor del activador del
plasminógeno I.
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La trombosis es un rasgo complejo
(multifactorial). Los genes implicados son típicamente genes de
susceptibilidad, en los que las diferencias no son mutaciones de
punto, sino formas particulares (alelos) de polimorfismos. El
desorden resulta de la presencia de una mayor frecuencia de alelos
específicos en combinaciones desfavorables.
En los diez o quince años pasados, se ha
encontrado que la mutación o variación en varios genes tiene que
ver con la trombosis venosa. Esto incluye genes como el factor V
(FV), protrombina (FII) y inhibidor del activador del plasminógeno
I (PAI1).
El factor de coagulación V (FV) y la protrombina
(FII) son componentes ambos esenciales en la cascada de coagulación
humana, que por último causa la contención de la pérdida de sangre.
La protrombina se divide proteolíticamente en la primera etapa de
esta cascada que se convierte en la enzima de coagulación trombina.
El factor de coagulación V sirve como un cofactor para la
activación X-catalizada del factor de coagulación de
protrombina a trombina. Las mutaciones de punto en estos genes
pueden causar daños en procesos de trombosis y hemostasis. Uno tal
es la trombosis venosa, que afecta predominantemente a personas de
origen europeo. Las mutaciones, factor V Leiden (FV: G1691A) y la
variante de protrombina G20210-A (FII: G20210A), son
los dos factores de riesgo genéticos únicos más importantes para
desarrollar la trombosis venosa. Esta predisposición europea ha sido
explicada hasta cierto punto por la caracterización por estas dos
variantes. Además de estos dos factores de riesgo establecidos para
la trombosis venosa, el papel de otras variaciones genéticas está
todavía bajo investigación (Martnelli et al., 1998; De
Stefano et al., 1999; Rees et al., 1999; Hessner et
al., 1999).
Varios estudios anteriores han documentado que
la capacidad fibrinolítica es un determinante importante del riesgo
de la trombosis. Muchos estudios han demostrado de forma convincente
que los supervivientes del infarto de miocardio tienen perjudicada
la actividad fibrinolítica debido a mayores concentraciones del
inhibidor del activador del plasminógeno I (PAI-1)
en plasma. Un polimorfismo de inserción/deleción de guanosina único
en la región promotora del gen PAI1, comúnmente llamado 4G/5G, se ha
demostrado que tiene que ver con la actividad de
PAI-1 en plasma (Dawson et al., 1993;
Eriksson et al., 1995).
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron diseñados tres juegos de cebadores PCR.
El fragmento que atraviesa sobre el exon 10 y el intron 10 del
factor de coagulación humana V tenía 162 bp, el fragmento de
protrombina que atraviesa sobre el exon 14 e intron 14 tenía 211 bp
y el fragmento en la región promotora del gen PAI1 tenía 152 bp. Un
cebador en cada juego fue biotinilado a fin de permitir la
inmovilización subsecuente a perlas magnéticas/perlas de sefarosa.
Además, fueron diseñados tres cebadores de secuenciación para
hibridarse en una proximidad cercana al SNP del factor V Leiden, la
variante de protrombina G20210A y la deleción 4G/5G de PAI1, véase
la Figura 12.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Fue puesta una reacción PCR de 50 \mul usando
el kit de mezcla Master de HotStarTaq de QiaGen según el protocolo
siguiente (Tabla 5).
Fueron añadidos 5 \mul de ADN genómico (2
ng/\mul) a 45 \mul de mezcla PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de ciclación de la PCR:
95ºC 5 minutos, 50x (95ºC 30 s, 67ºC 45 s, 72ºC
60 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron realizadas como se describe en el Ejemplo
2.
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento teórico obtenido por la
tipificación de cada SNP o deleción individualmente se muestra como
las figuras 13a, 13b y 13c, representando el genotipo de PAI1 para
la deleción 4G/5G (C/C), SNP G20210A protrombina (C/T) y SNP G1691A
factor V Leiden (A/G), respectivamente. El rendimiento teórico
múltiple para el ensayo múltiple de estos 3 SNP se muestra como la
figura 13d, con la deleción o posición de SNP mostrada. Las figuras
13e a 13j representan el rendimiento teórico esperado para 6
genotipos sobre los cuales los verdaderos datos fueron recuperados
entonces, véase la Figura 14. Los pirogramas mostrados en la figura
14 son 6 genotipos posibles que pueden estar presentes en la
población humana en estos genes. 14a es los resultados del genotipo
PAI1 C/C, protrombina C/C y el factor V G/G, 14b es el genotipo PAI1
del/del, protrombina C/C y el factor V A/A, 14c es PAI1 de genotipo
del/C, protrombina T/T y el factor V G/G, 14d es el genotipo PAI
C/C, protrombina T/C y el factor V G/G, 14e es PAI1 de genotipo
C/del, protrombina C/C, el factor V G/G y 14f es el genotipo PAI1
C/C, protrombina C/C y factor V A/G. La figura 14a corresponde a
13e, 14b a 13f, 14c a 13g, 14d a 13h, 14e a 13i y 14f a 13j.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Análisis de SNP de CYP2D6.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen CYP2D6 es un miembro de la superfamilia
de genes de citocromo P450, que en total consiste en nueve familias
de genes. Cuatro de estas familias de genes son responsables del
metabolismo y la eliminación de la mayoría de los productos
químicos ajenos que entran en el cuerpo vía la ingestión. Se mapea
el locus CYP2D humano respecto al cromosoma 22ql3. 1 (Gough
et al., 1993). El gen CYP2D6 codifica para una enzima, la
debrisoquina 4-hidroxilasa, que está implicada en el
metabolismo de más de 40 medicinas, entre ellas los neurolépticos,
antidepresivos, antiarrítmicos, \beta-bloqueantes
y opioides. La enzima se caracteriza por la variabilidad extrema en
la actividad (interindividuo e interétnica). El genotipo de CYP2D6 y
la función catalítica están estrechamente conectados, y la
genotipificación podría ser un instrumento importante para
determinar la dosis medicinal para los individuos. Más de 50 alelos
han sido identificados, de los cuales muchos codifican para una
enzima no funcional. Los alelos se definen por varias variaciones;
los SNP, la inserción o deleción de pares de bases solos, deleción
del gen completo, y copias del gen. Las secuencias analizadas en
este ejemplo son como sigue:
G1846T: GCCAACCACTCC G/T GT
G1934A: G/A GACGCCCCTTCG
T1795del: GCAG (T) GGGTGACCG
G1749C: G/C CTCCACCTTGCG
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 15 muestra la localización de los
cebadores en los fragmentos de ácido nucleico de CYP2D6 para el
método múltiple: fragmentos 2162 y 61118.
\vskip1.000000\baselineskip
Fue realizada una ampliación PCR anidada. Tanto
para el primero como para el anidado fue usado el kit de mezcla
Master de HotStarTaq con 50 \mul de reacción de QiaGen y fue
puesta según el protocolo siguiente (Tabla 7).
PCR 1.
1 \mul de ADN genómico (10 ng/\mul) fue
añadido a 49 \mul de mezcla PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de ciclación de la PCR:
Método de PCR, PCR primario (fragmento 4142)
95ºC 15 minutos, 25x (95ºC 45 s, 66ºC 45 s, 72ºC
60 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Método PCR, PCR secundario
95ºC 5 minutos, 20x (95ºC 45 s, T_{A} 45 s,
72ºC 45 s), 72ºC 5 minutos, 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
- T_{A}, fragmento
- 61118 era 61ºC
- \quad
- 2162 era 63ºC
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Ocurrió como se describe en el ejemplo 2. El SSB
fue añadido a la mezcla de cebador/plantilla después de la
hibridación. 0,55 \mug de SSB fueron añadidos para el fragmento
2162 y 2,2 \mug para el fragmento 61118. Las cantidades de
cebadores de secuenciación eran para el fragmento 2162: 15 pmoles de
cada uno, y para el fragmento 61118: 5 pmoles de los cebadores 182
y 183, y 70 pmoles del cebador 143.
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Fue realizada como se describe para el ejemplo
2.
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Dos rendimientos teóricos para el fragmento
61118 en un análisis múltiple se muestran como las figuras 16a y
16b. La 16a muestra el genotipo G_{1934}A (A/G), G_{1749}C
(C/G), T_{1795}del (ninguna deleción) y G1_{846}T (T/G) y la
figura 16b se diferencia en que T_{1795}del muestra la deleción
del residuo T.
La figura 17 muestra que los resultados reales
del genotipo establecidos a partir del pirograma son G_{1934}A
(G/G), G_{1749}C (G/G), T_{1795}del (ninguna deleción
\therefore T/T) y G_{1846}T (G/G). Este es un genotipo
diferente a aquellos mostrados en la figura 16.
Esto demuestra que es posible la tipificación de
SNP múltiple y la deleción en un fragmento de ácido nucleico usando
cebadores de ampliación múltiple.
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Ejemplo
6
72 sueros de veteranos
HCV-positivos fueron obtenidos del hospital Stanford
Veteran. Cinco sueros HCV-positivos fueron
obtenidos de Irán.
Los oligonucleótidos
HCV-PCR-OUTF
(5'-CCCTGTGAGGAACTWCTGTCTTCACGC),
HCV-PCR-OUTR
(5'-GCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCT),
HCV-PCR-INF
(5'-TCTAGCCATGGCGTTAGTAYGAGTGT),
BHCV-PCR-INR
(5'-Biotin-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT),
HCV-SEQF1
(5'-GGAACCGGTGAGTACACCGGAAT),
HCV-SEQF2
(5'-GACYGGGTCCTTTCTTGGA),
HCV-SEQF3
(5'-ATTTGGGCGTGCCCCCGC), fueron
todos sintetizados y purificados por HPLC por MWG Biotech (High
Points, NC, EE.UU.).
El ARN fue extraído a partir de 50 \mul de
suero. El cADN fue sintetizado usando transcriptasa inversa de AMV
en cADN de HCV obtenido de diferentes pacientes usando
BHCV-PCR-INR y
HCV-PCR-INF para generar un producto
de 270 bases.
Los productos PCR biotinilados fueron
inmovilizados en perlas superparamagnéticas revestidas de
estreptavidina Dynabeads® M280-estreptavidina
(Dynal A. S., Oslo, Noruega). El ADN de una sola cadena fue obtenido
quitando el sobrenadante después de la incubación del producto PCR
inmovilizado en NaOH 0,10 M durante 3 minutos. Cinco pmol de los
cebadores de secuenciación HCV-SEQF1,
HCV-SEQF2 y HCV-SEQF3 fueron
hibridados a la cadena inmovilizada.
La plantilla de ADN cebada fue colocada en una
placa de microtítulo que contenía 0,5 \mug de SSB (Amersham
Pharmacia Biotech, EE.UU.), y los sustratos de Pirosecuenciación®
(www.pyrosequencing.com Pirosecuenciación® AB, Uppsala, Suecia) y
las enzimas fueron administradas usando un instrumento de
Pirosecuenciación® PSQ® totalmente automatizado basado en una placa
de microtítulo. El procedimiento de secuenciación fue realizado por
alargamiento paso a paso de la cadena del cebador bajo la adición
preespecificada de cuatro nucleótidos diferentes. La plantilla fue
hibridada con los tres cebadores de ampliación descritos más arriba.
El progreso de secuenciación fue seguido usando el software de SNP
Pirosecuenciación® a tiempo real, (Pirosecuenciación® AB, Uppsala,
Suecia) y el subtipado fue realizado a mano.
El principio del método de tipificación descrito
más arriba es perfilado en la Figura 1. En este sistema modelo, los
cebadores de ampliación son hibridados al ADN de muestra diana, que
es inmovilizado en perlas magnéticas.
Los cebadores de ampliación se hibridan
expresamente a la región conservada adyacente a la región
variable.
Las señales que resultan de la ampliación
específica de cada cebador son directamente correlacionadas con el
número de nucleótidos incorporados. La "huella digital"
producida puede ser usada por lo tanto para identificar el genotipo
del individuo, frente a huellas digitales de referencia, que puede
ser teóricamente deducido a partir de las secuencias de las
regiones variables. Las huellas digitales de referencia calculadas
teóricamente a partir de la secuencia de las regiones variables son
mostradas en la Figura 3. Éstas pueden usarse para la tipificación
de los resultados mostrados en la Figura 4: la Figura 4a es la
huella digital para HCV la, la Figura 4b es la huella digital para
HCV lb, la Figura 4c es la huella digital para HCV 2a, la Figura 4d
es la huella digital para HCV 2b, la Figura 4e es la huella digital
para HCV 3a, y la Figura 4f es la huella digital para HCV 3b. Por
lo tanto, usando el método de la invención, fue posible genotipar la
infección de HCV. De los 77 sueros analizados por el método de la
invención. El 35% fue infectado por HCV la, 29% con HCV lb, 21% con
HCV 2a, 4% con HCV 2b, 10% con HCV 3a y 1% con HCV 3b.
Claims (15)
1. Un método para la tipificación de una o
varias moléculas de ácido nucleico, comprendiendo dicho método:
hibridar simultáneamente dos o más cebadores de
ampliación a dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y
realizar las reacciones de ampliación del cebador a partir de éste,
uniendo cada cebador en un sitio predeterminado diferente en
dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, y en el que
los nucleótidos son añadidos a la mezcla de reacción
secuencialmente en un orden conocido o predeterminado, y determinar
el modelo de incorporación de nucleótidos secuenciando por síntesis
para obtener un modelo de ensayo para dicha(s)
molécula(s) de ácido nucleico que se compara opcionalmente
con uno o varios modelos de referencia para la tipificación de
dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico.
2. Un método como se reivindica en la
reivindicación 1, en el que el ácido nucleico contiene dos o más
sitios variables.
3. Un método como se reivindica en la
reivindicación 1 para obtener información de tipificación sobre una
pluralidad de sitios variables dentro del ácido nucleico diana,
comprendiendo dicho método hibridar simultáneamente dos o más
cebadores de ampliación a dicho ácido nucleico diana, y realizar las
reacciones de ampliación del cebador a partir de éste, uniendo cada
cebador en un sitio predeterminado diferente en dicho ácido nucleico
diana, proporcionando el modelo de incorporación de nucleótidos,
determinado a partir de dichas reacciones de ampliación del cebador
por secuenciación por síntesis, la información de tipificación sobre
dichos sitios variables.
4. Un método como se reivindica en cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que la incorporación del
nucleótido es determinada cuantitativamente.
5. Un método como se reivindica en cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 4, en el que si la incorporación del
nucleótido ocurre en un sitio variable, no hay ninguna incorporación
del nucleótido en el(los) otro(s) sitio(s)
variable(s).
6. Un método como se reivindica en cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 5, en el que un primer cebador de
ampliación se une más cerca a su sitio variable que lo hace un
segundo cebador a su sitio variable.
7. Un método como se reivindica en la
reivindicación 6, en el que el segundo cebador está
10-20 nucleótidos más lejos de su sitio variable
que lo está dicho primer cebador.
8. Un método como se reivindica en cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína de unión de una
sola cadena es añadida a la mezcla de reacción después de que los
cebadores se hibriden a la plantilla de ácido nucleico.
9. Un método como se reivindica en cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en el que las reacciones de ampliación
del cebador ocurren simultáneamente.
10. Un método como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 9, en el que 3 o más sitios variables
son tipificados.
11. Un método como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 9, en el que son realizadas 3 o más
reacciones de ampliación del cebador.
12. Un método de diagnóstico de condiciones
patológicas caracterizado por la presencia de la(s)
molécula(s) de ácido nucleico específica(s),
comprendiendo dicho método la tipificación de dicha(s)
molécula(s) de ácido nucleico por un método como se define
en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el modelo de
la incorporación de nucleótidos permite el diagnóstico de dichas
condiciones patológicas.
13. Un método como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el modelo de incorporación
de nucleótidos es determinado simultáneamente con la dicha
ampliación del cebador, añadiendo cíclicamente o secuencialmente
diferentes nucleótidos a la reacción de ampliación del cebador y
detectando tanto si el nucleótido añadido es o no incorporado.
14. Un método como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el modelo de incorporación
de nucleótidos es determinado detectando la liberación de
pirofosfato.
15. Un método como se reivindica en la
reivindicación 14, en el que dicha liberación de pirofosfato es
detectada usando las enzimas ATP sulfurilasa y luciferasa.
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