ES2305099T3 - Metodo de secuenciacion de adn. - Google Patents
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Abstract
Método de identifación de una base en una posición diana en una secuencia ácido nucleica de una muestra, comprendiendo dicho método: someter a un cebador hibridado a dicho ácido nucleico de la muestra inmediatamente adyacente a la posición diana, a una reacción de extensión del cebador de ADN polimerasa en presencia de un nucleótido, resultando el nucleótido así sólo incorporado si es complementario a la base en la posición diana, y determinar si dicho nucleótido se incorpora o no detectando si el PPi es liberado, determinándose la identidad de la base diana a partir de la identidad de cualquier nucleótido que se incorpore, en el que una enzima degradante de nucleótidos, que es la apirasa, está presente durante o después de la etapa de reacción de la ADN polimerasa; y en el que, si dicho nucleótido comprende una base de adenina, se utiliza un análogo alfa-tio trifosfato de dicho nucleótido, y el isómero Rp de dicho análogo y/o los productos de degradación de dicho análogo son eliminados de la etapa de reacción de la ADN polimerasa.
Description
Método de secuenciación de ADN.
La presente invención se refiere a mejoras en
los métodos de secuenciación del ADN, que se basan en la detección
de la incorporación de bases mediante la liberación del pirofosfato
(PPi).
La secuenciación del ADN constituye una
herramienta esencial en el análisis genético molecular. La capacidad
para determinar las secuencias nucleótidas del ADN se ha convertido
cada vez más importante, ya que se han llevado a cabo esfuerzos
para determinar las secuencias de los grandes genomas del hombre y
de otros organismos.
Las técnicas que permiten la rápida detección de
un único cambio en una base del ADN, o de algunos cambios en las
bases, constituyen asimismo herramientas importantes para el
análisis genético, por ejemplo, en situaciones clínicas en el
análisis de enfermedades genéticas o ciertos cánceres. En verdad,
cuantas más y más enfermedades se describen asociadas a cambios a
nivel genético, más especialmente a polimorfismos nucleótidos únicos
(SNP), aumenta la necesidad de métodos, tanto para rastrear SNP u
otras mutaciones o cambios genéticos (mediante la secuenciación de
muestras genómicas representativas), como para clasificar los SNP (u
otras mutaciones/cambios). De esta forma, cuanto más se han
desarrollado nuevas tecnologías de secuenciación para determinar la
secuencia de tramos más largos del ADN, la técnica ha experimentado
también un rápido aumento en el desarrollo de tecnologías para
detectar cambios únicos (o algunos) en las bases. Dichos protocolos
para determinar una información secuencial más limitada, que se
refieren sólo a una o a algunas pocas bases, se denominan de
minisecuenciación.
El método más utilizado habitualmente como base
para la secuenciación del ADN, o para identificar una base diana
del ADN, es el método enzimático de Sanger de finalización de la
cadena. Tradicionalmente, dichos métodos dependieron de la
electroforesis para resolver, según su tamaño, los fragmentos del
ADN producidos a partir de un segmento más grande del ADN. Sin
embargo, recientemente, han evolucionado diversas tecnologías de
secuenciación, que dependen de un conjunto de distintas estrategias
de detección, tales como la espectrometría de masas y de
selección.
Un tipo de métodos de secuenciación que asume
importancia en la técnica, son los que dependen de la detección de
la liberación de PPi como estrategia de detección. Se ha descubierto
que dichos métodos conducen admirablemente ellos mismos a proyectos
genómicos a gran escala o de secuenciación clínica o rastreo, en los
que son necesarias unidades relativamente rentables con un alto
rendimiento.
Se han descrito en la literatura métodos de
secuenciación que se basan en el concepto de detección de
pirofosfato inorgánico (PPi), que se libera durante una reacción
polimerásica, por ejemplo en WO93/23564, WO 89/09283, WO98/13523 y
WO 98/28440). Cuando cada nucleótido se añade a una cadena creciente
del ácido nucleico durante una reacción de la polimerasa, se libera
una molécula de pirofosfato. Se ha encontrado que el pirofosfato
liberado bajo estas condiciones puede detectarse fácilmente, por
ejemplo, enzimáticamente, mediante la generación de luz en la
reacción luciferasa-luciferina. Dichos métodos de
ADN permiten la identificación de una base en una posición diana y
llevar a cabo la secuenciación simple y rápidamente, mientras se
evita la necesidad de la elctroforesis y la utilización de
marcadores.
En su forma más básica, una reacción de
secuenciación basada en PPi implica simplemente llevar a cabo una
reacción polimerásica de alargamiento dirigida por un cebador y la
detección de si el nucleótido se ha o no incorporado, comprobando
si PPi se ha liberado o no. Convenientemente, esta detección de la
liberación de PPi puede obtenerse enzimáticamente, y muy
convenientemente mediante una reacción de detección de la luz,
basada en la luciferasa, que se denomina ELIDA (véase a
continuación).
Se ha encontrado que el dATP añadido como un
nucleótido para incorporación, interfiere con la reacción de la
luciferasa que se utiliza para la detección de PPi. De acuerdo con
esto, una mejoría importante en el método básico de secuenciación
basado en PPi ha sido utilizar, en lugar de dATP, un análogo de dATP
(específicamente, dATP\alphas), que no puede actuar como un
sustrato para la luciferasa, pero que, sin embargo, puede
incorporarse en una cadena nucleótida mediante una enzima
polimerásica (WO98/13523).
Posteriores mejoras para la técnica básica de
secuenciación basada en PPi incluyen la utilización de una enzima
que degrada los nucleótidos tal como la apirasa durante la etapa
polimerásica, de modo que los nucleótidos que se incorporaron son
degradados, tal como se describe en WO98/28440, y la utilización de
una proteína que se une al ácido nucleico monocatenario en la
mezcla de reacción después de la hibridación de los cebadores a la
matriz, se ha encontrado que posee un efecto beneficioso en la
reducción del número de señales falsas, tal como se describe en
WO00/43540.
Sin embargo, incluso con los métodos modificados
y mejorados de secuenciación basados en PPI, anteriormente
mencionados, existe todavía espacio para la mejora, por ejemplo,
aumentar la eficiencia y/o la precisión del procedimiento, o, como
se considera a continuación, aumentar la posible longitud de la
lectura de la secuencia. La presente invención trata de encarar
estas necesidades.
\newpage
En particular, la presente invención se refiere
a métodos de secuenciación basados en PPi que utilizan un
\alpha-tio análogo de desoxi ATP (dATP) (o
didesoxi ATP (ddATP), particularmente un
(1-tío)trifosfato (o \alpha tiofosfato)
análogo del desoxi o didesoxi ATP, preferentemente desoxiadenosina
[1-tio] trifosfato o desoxiadenosina
\alpha-tiotrifosfato (dAT-Pas como
también se conoce. dATP\alphas (como con todos los análogos
\alpha tio nucleótidos), se encuentra como una mezcla de isómeros,
el isómero Rp y el isómero Sp.
Yee et al, Biochemistry 1979, 18 (19),
páginas 4116-4210) es un estudio mecanicista de la
parte de "iniciación" de la reacción de la ARN polimerasa de
E. coli, y concluye que el isómero Sp de ATP\alphaS es un
cebador mejor que el isómero Rp.
Romaniuk et al., J.Biol.Chem, 1982, 257
(13), pág 7684-7688 estudia el mecanismo de acción
de T4 ADN polimerasa eon los isómeros Rp y Sp de dATP\alphaS. Se
encuentra que el isómero Rp es inactivo (es decir, no es un sustrato
para la T4 polimerasa).
Armstrong et al., Biochemistry 1979, 18
(19), págs 4120-4123 es un estudio mecanicista de la
parte del alargamiento de la reacción de la ARN polimerasa de E.
coli. Se informa de que el isómero Rp de dATP\alphaS no
constituye un sustrato para la enzima ARN polimerasa y es un
inhibidor débil.
Cuando dATP\alphaS (y/o otros
\alpha-tio nucleótidos) se utilizan, se ha
encontrado que la eficiencia del método de secuenciación disminuye
cuando el número de ciclos aumenta, y en particular que la longitud
de lectura que puede obtenerse es limitada (por ejemplo, hasta
40-50 bases). Esto se cree que es debido a la
acumulación de sustancias inhibitorias en el sistema reactivo. La
presente invención se refiere particularmente a la reducción o
eliminación de dichos efectos inhibitorios.
Más particularmente, se ha encontrado de modo
sorprendente que la eliminación o exclusión del isómero Rp de los
análogos \alpha-tio nucleótidos y/o de los
productos de degradación de dicho análogo a partir de la mezcla de
polimerización, mejora la eficiencia de los métodos de secuenciación
basados en PPi y, en particular, de dichos métodos basados en la
detección de PPi mediante una reacción ELIDA basada en la
luciferasa.
Sin pretender vincularse a la teoría, se cree
que diversas razones o efectos pueden contribuir a este efecto
beneficioso del isómero Rp y/o a la eliminación de los productos de
degradación de los análogos de los \alpha-tio
nucleótidos en la reacción de secuenciación.
Algunos de estos efectos se explican a
continuación, pero en particular se cree que el isómero Rp y/o los
métodos de degradación del análogo del \alpha-tio
nucleótido pueden inhibir la actividad polimerásica. Por tanto, se
cree que dicho efecto contributivo puede ser debido al efecto del
isómero Rp y/o de los productos de degradación del análogo del
\alpha-tio nucleótido, no apreciado hasta la
fecha, para inhibir la actividad de la polimerasa. Por lo tanto,
excluyendo o eliminando el isómero Rp y/o los productos de
degradación del análogo del \alpha-tio
nucleótido, puede evitarse el efecto inhibitorio, lo que conduce a
una reacción de polimerización más rápida y eficiente, e incluso
más señales generadas en la reacción de detección de PPi. Además,
eliminando o excluyendo el isómero Rp y/o los productos de
degradación del análogo del \alpha-tio
nucleótido, aumenta la fidelidad de la síntesis del ADN, es decir,
el número de eventos de no incorporación disminuye.
En un aspecto, la presente invención proporciona
así, un método para identificar una base en una posición diana en
una secuencia nucleica de la muestra, comprendiendo dicho
método:
- someter un cebador hibridado a dicho ácido nucleico de la muestra, inmediatamente adyacente a la posición de la diana, a una reacción polimerásica de alargamiento del cebador en presencia de un nucleótido, por medio de la cual el nucleótido se incorporará solamente si es complementario a la base en la posición diana, y determinando si dicho nucleótido se incorpora o no, detectando si PPi es liberado, determinándose la identidad de la base diana a partir de la identidad de cualquier nucleótido incorporado,
en el que, si dicho nucleótido comprende una
base de adenina, se utiliza un análogo \alpha-trio
trifosfato de dicho nucleótido, y el isómero Rp de dicho análogo y/o
los productos de degradación de dicho análogo, son eliminados de la
etapa de reacción de la polimerasa.
La utilización del análogo
\alpha-trio fosfato de un nucleótido que comprende
una base de adenina y la eliminación de su isómero Rp y/o la de los
productos de degradación de dicho análogo, constituyen
características esenciales de la presente invención, que no se
relacionan a, por ejemplo, reacciones de minisecuenciación, en las
que sólo nucleótidos que comprenden bases de guanina, timina o
citosina se añaden para incorporación.
Bajo la condición de que cuando el nucleótido
comprende una base de adenina (A), se utiliza un análogo
\alpha-trio trifosfato de dicho nucleótido, el
nucleótido puede ser cualquiera que sea capaz de incorporarse
mediante una enzima polimerásica en una cadena de ácido nucleico o
molécula. Así, por ejemplo, el nucleótido puede ser un
desoxinucleótido (dNTP, dexosinucleósido trifosfato) o
didesoxinucleótido (ddNTP, didesoxinucleósido trifosfato).
Convenientemente, con propósitos secuenciales,
pueden utilizarse los desoxi o didesoxinucleótidos de guanina (G),
citosina (C), timina (T) o adenina (A). Así el nucleótido puede ser
dGTP(desoxiguanosina trifosfato), dCTP (desoxicitidina
trifosfato) o dTTP (desoxitimidina trifosfato) o en lugar de dATP
(desoxiadenosina trifosfato) su análogo
\alpha-trio-trifosfato
dATP\alphas (desoxiadenosina
\alpha-triotrifosfato o desoxiadenosina
[1-tio] trifosfato como también se conoce).
Análogamente, los nucleótidos pueden ser ddGTP, ddCTP, o dTTP, o en
lugar de ddATP, ddATP\alphas.
La presente invención requiere, por tanto, la
utilización de un análogo \alpha-tiotrifosfato de
un nucleótido de adenina, pero para las otras bases (G,T o C),
puede utilizarse un nucleótido original (o verdaderamente cualquier
otro nucleótido, por ejemplo, es deseable utilizar un derivado
nucleótido, siempre que pueda incorporarse mediante una enzima
polimerásica). De este modo, según la presente invención, se utiliza
por lo menos un \alpha-tio análogo de un
nucleótido de adenina.
Sin embargo, puede en ciertos casos ser deseable
asimismo utilizar \alpha-tio análogos de uno u
otros nucleótidos (es decir, de nucleótidos de guanina, citosina o
timina). En dicho caso, allí donde se utilice un
\alpha-tio análogo de un nucleótido, según la
presente invención, entonces, el isómero Rp de dicho análogo es
eliminado de la etapa de la reacción polimerásica. En otras
palabras, en el método de la invención, allí donde el nucleótido es
un \alpha-tio nucleótido, (por ejemplo, desoxi o
didesoxi nucleósido \alpha-tiotrifosfato
(dNTP\alphaS o ddNTP\alphaS)), el isómero Rp de dicho
\alpha-tio nucleótido es eliminado de la etapa de
reacción polimerásica, y/o los productos de degradación de
NTP\alphaS son eliminados.
Por conveniencia, el término "desoxinucleósico
\alpha-tiotrifosfato" (dNTP\alphaS) tal como
se utiliza en la presente memoria, incluye por tanto la
dexosiadenosina \alpha-tiotrifosfato
(dATP\alphaS), desoxicitidina
\alpha-tiotrifosfato (dCTP\alphaS),
desoxiguanosina \alpha-triotrifosfato
(dGTP\alpha) y desoxitimidina
\alpha-tiotrifosfato (dTTP\alphaS).
Análogamente, el término "didesoxi nucleótido
\alpha-tio trifosfato" incluye el equivalente
didesoxi. El término "didesoxinucléotido" tal como se utiliza
en la presente invención, incluye todos los
2'-desoxi-nucleótidos en los que el
grupo 3'-hidroxilo está ausente o modificado y por
tanto, mientras que sea capaz de ser añadido al cebador en
presencia de la polimerasa, y no pueda entrar en una subsiguiente
reacción de polimerización, un didesoxi nucleótido es así un
"finalizador de la cadena", y como bien se conoce en la
técnica, ciertos métodos de secuenciación pueden utilizar dichos
nucleótidos finalizadores de cadena.
El término "NTP\alphaS" (nucleósido
\alpha-tiotrifosfato), tal como se utiliza en la
presente memoria para referirse a todos los análogos
\alpha-tiotrifosfato nucleótidos (es decir,
\alpha-tionucleótidos) que puede utilizarse según
la presente invención, incluye nucleótidos tanto desoxiribo como
didesoxi). Estos incluyen, muy especialmente, dNTP\alphaS y
ddNTP\alphaS.
Cuando se sintetizan, los análogos
\alpha-tio trifosfatos nucleótidos (es decir, dd-
o dNTP\alphaS) se producen típicamente en dos formas isoméricas,
los isómeros Sp y Rp. Un análogo nucleótido
\alpha-tiotrifosfato posee un centro quiral, y,
por tanto, las 2 especies son enantiómeros. El isómero Sp es el
isómero levógiro, también denominado isómero L. El isómero
dextrógiro es el isómero Rp, también conocido como
D-isómero (véase por ejemplo, Eckstein (1985) Ann.
Rev. Biochem., 54 (367-402).
El isómero Rp de NTP\alphaS no actúa como un
sustrato para una enzima polimerásica, tal como se utiliza en la
reacción de alargamiento del cebador. Sorprendentemente, sin
embargo, tal como se ha mencionado anteriormente, se ha encontrado
que el uso del isómero Rp de NTP\alphaS, conduce a la inhibición
de enzimas implicados en las reacciones de secuenciación basadas en
PPi. La naturaleza precisa de estos diversos efectos inhibitorios
no está enteramente clara, pero se cree que el isómero Rp del mismo
NTP\alphaS (y posiblemente también el isómero Rp de NDP\alphaS
y el isómero Rp de NMP\alphas) son responsables de los efectos
inhibitorios observados, incluyendo, como se ha mencionado
anteriormente, la inhibición de la polimerasa. Los productos de
degradación de NTP\alphaS son también responsables de los efectos
inhibitorios apreciados. Los productos de degradación incluyen,
pero no se limitan a NDP\alphaS, NMP\alphaS y a cualquiera de
sus productos de degradación. Se han investigado los efectos
inhibitorios del isómero Rp de dATP\alphaS sobre las enzimas que
degradan los nucleótidos y las enzimas detectoras de PPi (véase el
Ejemplo 2 y las figuras 8I, 8J 8K y 8L) y se ha mostrado que el
isómero Rp y/o los productos de degradación de dATP\alphas inhiben
las enzimas implicadas en la degradación de los nucleótidos y la
detección de la liberación de PPi.
Se apreciará que cuando la base diana (que se
encuentra) inmediatamente en el extremo 3' del cebador, posee allí
una base 3' idéntica y la polimerización se lleva a cabo con un
desoxinucleótido (preferentemente a con un didesoxinucleótido), la
reacción de alargamiento añadirá dos bases al mismo tiempo y, en
verdad, cualquier secuencia de bases idénticas sucesivas en la
muestra conducirá a la incorporación simultánea de bases
correspondientes en el cebador. Sin embargo, la cantidad de
pirofosfato liberada será claramente proporcional al número de bases
incorporadas, de forma que no sea difícil detectar dichas
repeticiones.
Ya que el cebador se propaga mediante una base
única mediante el procedimiento descrito anteriormente (o mediante
una secuencia de bases idénticas), el cebador que se propaga puede
servir de la misma forma exactamente en un procedimiento repetido,
para determinar la próxima base en la secuencia, permitiendo de esta
forma que la totalidad de la muestra sea secuenciada.
El método de la invención puede utilizarse, por
tanto, para determinar la identidad (es decir, la secuencia) de una
base única. Sin embargo, convenientemente, repitiendo las etapas de
la propagación del cebador en presencia de otro nucleótido
(sucesivo), puede revelarse la secuencia (o identidad) de otra base
en la secuencia del ácido nucleico de la muestra. De acuerdo con
esto, el método de la invención puede utilizarse para determinar la
identidad de una o más bases en un ácido nucleico de la muestra
(esto es, para determinar la secuencia de una o más bases en un
ácido nucleico de la muestra).
El método de la invención es útil, por tanto, en
distintos métodos y formatos de secuenciación, incluyendo los
procedimiento de minisecuenciación, por ejemplo, la detección de
cambios de bases únicas (por ejemplo, para detectar mutaciones
puntuales, o polimorfismos, o variaciones alélicas, etc). De acuerdo
con esto, el método de la invención puede utilizarse, por tanto,,
en un procedimiento "completo" de secuenciación, es decir, la
identificación del orden secuencial de las bases en un fragmento de
nucleótidos, así como en procedimientos de detección de bases
únicas.
Por ejemplo, para determinar la información
secuencial en una secuencia nucleótida diana (es decir, de un ácido
nucleico de una muestra de una muestra o diana), pueden añadirse
distintos nucleótidos a alícuotas separadas de una mezcla
cebador-muestra (por ejemplo, cuatro alícuotas, una
por cada una de los cuatro nucleótidos A,T,G o C) o, sucesivamente
a la misma mezcla cebador-muestra y someterla a la
reacción de la polimerasa para indicar qué nucleótido se
incorpora.
Para secuenciar el ácido nucleico de muestra, el
procedimiento puede repetirse una o más veces, es decir,
cíclicamente, como se conoce en la técnica. De esta forma, puede
identificarse la identidad de varias o muchas bases en el ácido
nucleico de la muestra, esencialmente en la misma reacción.
Cuando se utilizan alìcuotas separadas, una vez
se ha identificado qué base se ha incorporado (es decir, en qué
incorporación de la alícuota ha tenido lugar), la base
"incorporada" puede añadirse a las alícuotas "que no han
reaccionado", para propagar el cebador en todas las alícuotas,
antes de repetir el método (ciclación) para secuenciar la base
próxima. En la forma de realización "sucesiva", puede añadirse
sucesivamente un nucleótido distinto, que hasta la incorporación se
indica por la liberación de PPi, con lo cual el procedimiento puede
repetirse.
A partir de ahí, un protocolo de secuenciación
puede implicar la hibridación de un cebador tal como se describe
anteriormente, añadiendo un nucleótido, llevando a cabo una reacción
de alargamiento del cebador catalizada por la polimerasa,
detectando la presencia o ausencia de la incorporación de dicho
nucleótido, detectando cualquier PPi liberado, y repitiendo la
adición del nucleótido y las etapas de alargamiento del cebador,
etc, una o más veces. Tal como se considera anteriormente, los
nucleótidos únicos (es decir, individuales) pueden añadirse
sucesivamente a las misma mezcla matriz-cebador, o a
alícuotas separadas de la mezcla matriz-cebador,
etc, según se seleccione, y la información secuencial que se desee
obtener.
Para permitir la adición repetida o sucesiva
(iterativa) de nucleótidos en un procedimiento de secuenciación de
base múltiple, el nucleótido previamente añadido debe eliminarse.
Esto puede realizarse lavando, o más convenientemente, utilizando
una enzima degradante nucleótida, por ejemplo, tal como se describe
en detalle en el documento WO98/28440.
De acuerdo con esto, en una forma de realización
principal de la presente invención, se utiliza una enzima
degradante de un nucleótido para degradar cualquier nucleótido no
incorporado o que se encuentre en exceso. Así, si se añade un
nucleótido que no está incorporado (a causa de que no es
complementario a la base diana), o cualquier nucleótido añadido
permanece después de un evento de incorporación (es decir,
nucleótidos en exceso), entonces dichos nucleótidos no incorporados
pueden eliminarse fácilmente utilizando una enzima degradante de
nucleótidos. Esto se describe con detalle en el documento
WP98/28440.
Tal como se considerará con mayor detalle a
continuación, se ha observado que los efectos inhibitorios debidos
a la utilización de un \alpha-tio nucleótido
tienen lugar particularmente (o se observan) cuando se utiliza una
enzima degradante nucleótida, y que dichos efectos pueden derogarse
beneficiosamente según la presente invención, mediante los métodos
que se describen en la presente memoria.
El término "enzima degradante de
nucleótidos" tal como se utiliza en la presente invención,
incluye cualquier enzima puede degradar nucleótidos específica o no
específicamente, incluyendo por lo menos nucleósido trifosfatos
(NTP), pero opcionalmente, también di- y monofosfatos, y cualquier
mezcla o combinación de dichas enzimas, siempre que esté presente
una nucleósido trifosfatasa u otra actividad degradante NTP-. Aunque
las enzimas degradantes nucleótidas que tienen una actividad
fosfatásica pueden utilizarse convenientemente según la invención,
puede utilizarse cualquier enzima que tenga cualquier actividad
degradante nucleótida o nucleósida, por ejemplo, enzimas que
fragmentan nucleótidos en posiciones distintas que a los grupos
fosfato, por ejemplo en los residuos de azúcares o en los básicos.
Así, una enzima degradante de un nucleósido trifosfato es esencial
para la invención. Las enzimas degradantes nucleósido di-
y/o-monofosfato son opcionales y puede utilizarse en
combinación con una enzima degradante nucleósido trifosfato. Una
fosfatasa que se utiliza como una enzima degradante nucleótida
según este aspecto de la invención, deberá cumplir distintas
criterios, como que particularmente, la constante inhibitoria (Ki)
para el producto fosfato (Pi) de la acción de la fosfatasa no debe
ser demasiado bajo, de forma que la enzima no sea inhibida por el
fosfato que se acumula. En segundo lugar, la enzima requiere actuar
relativamente rápido y no debe ser demasiado lenta (ciertas enzimas
fosfatásicas pueden actuar demasiado lentamente para ser prácticas)
y, en tercer lugar, deben degradar la totalidad de los cuatro
sustratos nucleótidos (es decir, los sustratos A, T, G y C), con
una eficiencia más o menos igual. Tal como se considera más
adelante, el ATP generado en las reacciones ELIDA se prefiere para
la detección de PPi, y una enzima degradante de un nucleótido útil
en la invención deberá también degradar ATP eficientemente. Esto
conduce a una "salida" de la señal. Se considerará que no
todas las enzimas fosfatásicas (por ejemplo, las fosfatasas
alcalinas que son fuertemente inhibidas por el fosfato producto)
cumplen con estos criterios, y no todas pueden ser apropiadas para
utilizar como una enzima degradante nucleótida según la invención.
Sin embargo, dicha capacidad para ser apropiada, puede fácilmente
evaluarse mediante experimentos rutinarios. La enzima degradante
nucleótida preferida es la apirasa, que es tanto una difosfatasa
nucleósida como trinucleósida, que cataliza las reacciones
(NTP- - - -NDP + Pi y NDP- - -NMP + Pi
(donde NTP es un nucleótido trifosfato, NDP un nucleósido difosfato,
NMP es un nucleósido monofosfato y Pi es fosfato inorgánico). La
apirasa puede obtenerse a partir de la Sigma Chemical Company.
Otros posibles enzimas degradantes de nucleótidos incluyen el
nucleósido trifosfato difosfohidrolasa del Pancreas Porcino (Le Bel
et al., 1980, J. Biol. Chem, 255, 1227-1233).
Otras enzimas se describen en la literatura.
Las enzimas degradantes de nucleótidos pueden
incluirse convenientemente durante la etapa de la reacción
polimerásica (es decir, la propagación o alargamiento del cebador).
Así, por ejemplo, la reacción polimerásica puede llevarse a cabo
convenientemente en presencia de una enzima degradante de
nucleótidos. Aunque menos preferida, dicha enzima puede añadirse
también después de que la incorporación de los nucleótidos (o no
incorporación) haya tenido lugar, es decir, después de la etapa de
la reacción polimerásica.
Así, la enzima degradante de los nucleótidos
(por ejemplo, apirasa), puede añadirse a la mezcla de la reacción
polimerásica (es decir, ácido nucleico de la muestra, cebador y
polimerasa), de cualquier forma conveniente, por ejemplo, antes de
o simultáneamente al inicio de la reacción, o después de que la
reacción polimerásica haya tenido lugar, por ejemplo antes de
añadir nucleótidos a la muestra/cebador/polimerasa para iniciar la
reacción, o después de que la polimerasa y los nucleótidos se añadan
a la mezcla muestra/cebador.
Convenientemente, las enzimas degradantes de los
nucleótidos pueden incluirse simplemente en la mezcla de reacción
para la reacción polimerásica, que puede iniciarse añadiendo el
nucleótido.
Otra característica sorprendente de la presente
invención es la observación de que la utilización del isómero Rp de
los \alpha-tio nucleótidos y/o de los productos de
degradación de dichos \alpha-tio nucleótidos,
conducen a la inhibición de una enzima degradante de nucleótidos de
la presente invención, muy especialmente de la apirasa. Se cree que
el isómero Rp no puede actuar como un sustrato para la apirasa, y,
que, de acuerdo con esto, no es degradado por la actividad
degradante de los nucleótidos de la apirasa. Alternativamente, los
productos de la degradación de NTP\alphaS pueden ser inhibitorios.
Así, puede crearse una situación de acumulación sucesiva del
isómero Rp inhibitorio e inactivo (o de los productos inhibitorios
de degradación) durante el procedimiento de secuenciación. Por
tanto, otro beneficio que puede derivarse de la eliminación del
isómero Rp y/o de los productos de degradación de dichos
\alpha-tio-nucleótidos según la
presente invención, es que la inhibición de la apirasa puede
reducirse o evitarse. Esto posee beneficios muy significativos y
hasta la fecha impredecibles sobre la eficiencia y capacidad de
realización del método de secuenciación, y representa una ventaja
significativa y sorprendente de la presente invención.
La degradación de los nucleótidos no
incorporados por la apirasa beneficia incluso a la producción de
señales de detección de PPi bien definidas (por ejemplo, afiladas o
estrechas/definidas) (véase más adelante). Cuando dicha degradación
es ineficiente, debida a la inhibición de la enzima apirasa, este
beneficio se pierde progresivamente. De este modo, la inhibición de
la apirasa se aprecia, directa o indirectamente, como una tasa de
degradación más lenta del nucleótido, y, en consecuencia, como una
señal de la bien definida detección de PPi "más amplia" o
menos, en los últimos ciclos de la secuenciación. En particular, en
el contexto de la detección ELIDA de la liberación de PPi, que se
describe más adelante, la disminución observada en la señal (luz) se
"aprecia" como una degradación del ATP (generado en las
reacciones ELIDA). Así, "se aprecia" una tasa más lenta de
degradación del ATP. De esto puede deducirse que la tasa de
degradación de nucleótidos no incorporados es también más lenta.
Además, puede producirse un alargamiento no sincronizado. Esto tiene
lugar, ya que la presencia de nucleótidos no incorporados y no
degradados puede conducir a múltiples reacciones de alargamiento que
tengan lugar fuera de fase, y que conduzcan a señales que se
solapan (solapamiento de la señal o señales fuera de fase). Dicho
alargamiento no sincronizado limita, de este modo, el número de
nucleótidos
que pueden ser secuenciados en un procesamiento secuencial dado, por ejemplo, el alcanzable de longitud lectora.
que pueden ser secuenciados en un procesamiento secuencial dado, por ejemplo, el alcanzable de longitud lectora.
La capacidad para secuenciar fragmentos más
largos del ácido nucleico constituye un objetivo deseable en el
ámbito de la secuenciación. Los efectos inhibitorios que resultan de
la utilización de \alpha-tio nucleótidos sobre
las enzimas que se encuentran en los métodos de secuenciación que se
basan en PPI, conduce a una disminución en la fidelidad y a una
prolongación no sincronizada, limitando de este modo el alcance de
la longitud lectora, es decir, la longitud del ácido nucleico que
puede ser secuenciada con éxito. La longitud lectora puede mejorarse
según la presente invención eliminando el isómero Rp del \alpha
tionucleótido y/o el producto de degradación de los
\alpha-tio nucleótidos.
La longitud alcanzable de lectura es, hasta
cierto punto, un parámetro que depende de los criterios de
aceptación que se adopten. Puede perderse la limpieza de la señal,
pero la secuencia puede todavía ser legible para el experto y el
profesional con experiencia. Por tanto, los límites precisos de la
longitud lectora no son siempre entendibles o no pueden aplicarse
generalmente, y pueden depender de las circunstancias. Sin embargo,
en algunos casos se ha encontrado que 50 o más, o incluso 100 o más
(por ejemplo 200 o más) bases, pueden leerse fácilmente según la
presente invención. Los métodos de la invención son pues,
apropiados, para la secuenciación de 100 bases o más. En
particular, la presente invención puede utilizarse ventajosamente en
la secuenciación de 50 o más, 60 o más, 70 o más u 80 o más
bases.
La liberación de PPi puede detectarse según la
presente invención de cualquier forma deseada o conveniente. El PPi
puede determinarse mediante muchos métodos distintos, y en la
literatura se han descrito diversos métodos enzimáticos (Reeves
et al., (1969), Anal. Biochem.,28, 282-287,
Guillory et al.,(1971), Anal Biochem, 39,
170-180; Johnson et al., (1968), Anal
Biochem., 15, 273, Cook et al (1978), Anal Biochem 91,
557-565; y Drake et al (1979), Anal Biochem,
94, 117-120).
Resulta preferida la utilización de una reacción
generadora de luz basada en la luciferasa (por ejemplo, una
luciferina basada en la luciferasa), para detectar la liberación de
pirofosfato, ya que la cantidad de luz generada es sustancialmente
proporcional a la cantidad de pirofosfato liberado, la cual, a su
vez, es directamente proporcional al número de bases que se
incorporan. La cantidad de luz puede estimarse fácilmente mediante
un dispositivo apropiado sensible a la luz, tal como un
luminómetro.
Las reacciones que se basan en la luciferasa
para detectar la liberación de PPi son bien conocidas en la técnica.
En particular, se ha desarrollado por Nyren y Lundin (Anal.
Biochem, 151, 504-509, 1985) un método para detectar
la liberación de PPi, basado en las enzimas ATP sulfurilasa y
luciferasa y denominado ELIDA (Ensayo luminométrico enzimático de
detección del pirofosfato inorgánico). La utilización del método
ELIDA para detectar PPi se prefiere según la presente invención. El
método puede, sin embargo, modificarse, por ejemplo, utilizando una
luciferasa más termoestable (Kaliyama et al, 1994, Biosci.
Biotech. Biochem, 58, 1170-1171) y/o ATP sulfurilasa
(Onda et al., 1996, Bioscience, Biotechnology and
Biochemistry, 60: 10, 1740-42). Este método se basa
en las reacciones siguientes:
De acuerdo con esto, resulta preferido detectar
enzimáticamente la liberación de PPi, y las enzimas de detección
preferidas que se utilizan en la reacción de detección del PPi son
la ATP sulfurilasa y la luciferasa.
En una reacción de detección del PPi que se basa
en las enzimas ATP sulfurilasa y luciferasa, la señal (que
corresponde al PPi liberado) se aprecia como luz. La generación de
la luz puede observarse como una curva que se conoce como un
pirograma. La luz se genera por la acción de la luciferasa sobre el
producto ATP (producido por una reacción entre PPi y APS (véase a
continuación) mediada por la ATP sulfurilasa) y, cuando se utiliza
una enzima degradante de nucleótidos tal como la apirasa, la
generación lumínica "se produce" entonces por la acción de la
enzima degradante del nucleótido, degradando el ATP que es el
sustrato para la luciferasa. La pendiente de la curva ascendente
puede apreciarse como indicativa de las actividades de la ADN
polimerasa (liberación de PPi) y de la ATP sulfurilasa (generando
ATP de PPi, proporcionando entonces un sustrato para la
luciferasa). La altura de la señal depende de la actividad de la
luciferasa, y la pendiente de la curva descendente es indicativa
de, tal como se ha explicado anteriormente, la actividad de la
enzima degradante del nucleótido.
Ventajosamente, incluyendo la enzima o enzimas
de detección del PPi (es decir,la enzima o enzimas necesarias para
alcanzar la detección de PPi según el sistema de detección
enzimático seleccionado, que en el caso de ELIDA será la ATP
sulfurilasa y luciferasa) en la etapa de reacción polimerásica, el
método de la invención puede adaptase fácilmente para permitir que
las reacciones de secuenciación sean controladas continuamente en
tiempo real, siendo generada y detectada una señal cuando cada
nucleótido se incorpora. Los beneficios de dichas consideraciones se
consideran con mayor detalle en el documento WO9813523.
Así, las enzimas de detección de PPi (junto con
cualesquiera sustratos enzimáticos u otros reactivos necesarios para
la reacción de detección del PPi), pueden ser incluidas simplemente
en la mezcla de la reacción polimerásica.
Más particularmente, para llevar a cabo esta
forma de realización del método de la invención, las enzimas de
detección se incluyen en la etapa de reacción polimerásica, es decir
en la etapa de reacción de alargamiento de la cadena. De este modo,
las enzimas de detección se añaden a la mezcla de reacción para la
etapa polimerásica anterior a, simultánea con, o durante la
reacción polimerásica. En el caso de una reacción de detección
ELIDA, la mezcla de reacción para la reacción polimerásica puede
así incluir por lo menos un nucleótido, polimerasa, luciferina,
APS, ATP sulfurilasa y luciferasa. La reacción polimerásica puede
iniciarse añadiendo la polimerasa, o más preferentemente el
nucleótido, y preferentemente las enzimas de detección se encuentran
ya presentes en el momento en el que la reacción se inicia, o
pueden añadirse con el reactivo que inicia la reacción. Si se
utiliza una enzima degradante de nucleótidos tal como la apirasa, se
entenderá, por supuesto, que la adición de la polimerasa no seguirá
a la apirasa, si se encuentran presentes nucleótidos.
La presente invención permite, pues, que la
liberación de PPi sea detectada durante la reacción polimerásica,
proporcionando una señal en tiempo real. Las reacciones de
secuenciación pueden controlarse continuamente en tiempo real.
El isómero Rp y/o los productos de degradación
de NTP\alphaS pueden eliminarse, según la presente invención, de
varias formas, y el término "eliminado" requiere simplemente
que el isómero Rp y/o los productos de degradación sean eliminados
o excluidos de la etapa de la reacción polimerásica. Esto puede
obtenerse de cualquier forma conveniente. Por ejemplo, el isómero
Rp puede excluirse, no encontrándose en la preparación NTP\alphaS
que se añade o se incluye en la mezcla de la reacción polimerásica.
Alternativamente, la preparación NTP\alphaS puede inicialmente
incluir el isómero Rp, pero puede eliminarse antes, durante o
después, de la inclusión en o de la adición a la mezcla de la
reacción polimerásica, por ejemplo, mediante degradación enzimática.
Pueden también utilizarse combinaciones de medios para eliminar el
isómero Rp (por ejemplo, eliminando y excluyendo). Así, el isómero
Rp puede eliminarse o excluirse a partir de la etapa de reacción
polimerásica, a partir de la etapa después de que la polimerización
haya tenido lugar (es decir, la etapa de degradación de los
nucleótidos), o la detección de la etapa de incorporación
nucleótida.
Los productos de degradación de
NTP\alpha-S pueden eliminarse durante la etapa de
polimerización, la etapa de degradación de los nucleótidos o de la
detección de la etapa de incorporación de los nucleótidos. Por
ejemplo, los productos de degradación se eliminan mediante
degradación enzimática.
En una forma de realización de la invención, el
isómero Rp puede, por tanto. ser eliminado utilizando una
preparación de NTP\alphaS que contiene sólo el isómero Sp, por
ejemplo, utilizando sólo el isómero Sp de NTP\alphaS, por
ejemplo, isómero Sp puro. Los isómeros individuales Rp y Sp de
dATP\alphaS están disponibles comercialmente (por ejemplo, en
Biolog Life Science, Bremen, DE). Alternativamente, dichos isómeros
pueden sintetizarse fácilmente
estereo-específicamente, o purificados (separados) a
partir de una mezcla racémica utilizando métodos bien conocidos en
la técnica y que se describen en la literatura (véase por ejemplo,
Eckstein, supra). dATP\alphaS,junto con los
\alpha-tio análogos de dCTP, dGTP y dTTP, pueden
obtenerse de Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, SE).
El isómero Rp puede reducirse en la etapa
reactiva a menos que el 10% del dATP\alphaS total, preferentemente
menos que el 5%, más preferentemente menos que el 3% del isómero
Rp.
En una forma de realización alternativa, el
isómero Rp y/o los productos de degradación del análogo
\alpha-tio nucleótido, pueden ser eliminados
utilizando una enzima que lo degrada, particularmente la fosfatasa
alcalina. En particular, resultados experimentales preliminares nos
llevan a pensar que la fosfatasa alcalina puede degradar ambos
isómeros de NTP\alphaS, incluyendo el isómero Rp y los productos
de degradación de NTP\alphaS. El isómero Rp y los productos de
degradación de NTP\alphaS que se encuentran en la mezcla de
reacción, o en la preparación de NTP\alphaS, pueden eliminarse
fácilmente (degradarse) añadiendo una enzima fosfatasa alcalina.
En una forma de realización más particular,
puede utilizarse una combinación del isómero Sp junto con una enzima
fosfatasa alcalina.
Convenientemente, la fosfatasa alcalina puede
simplemente ser incluida durante la etapa de la reacción
polimerásica. Esto puede obtenerse añadiendo la enzima a la mezcla
de reacción polimerásica antes de, o simultáneamente con, el inicio
de la reacción de la polimerasa, o después de que la reacción
polimerásica haya tenido lugar, por ejemplo, antes de añadir los
nucleótidos a la mezcla muestra/cebador/polimerasa para iniciar la
reacción, o después de que la polimerasa y el nucleótido se añaden a
la mezcla muestra/cebador.
Alternativamente, la fosfatasa alcalina puede
inmovilizarse sobre un soporte sólido, por ejemplo, un soporte
sólido particular (por ejemplo, perlas magnéticas) o un filtro, o
una varilla, etc, y puede añadirse a la mezcla de la reacción
polimerásica en un momento conveniente. Cuando el isómero Rp se ha
degradado, la enzima inmovilizada puede eliminarse de la mezcla de
reacción (por ejemplo, puede retirarse o capturarse, por ejemplo,
magnéticamente, en el caso de perlas magnéticas), antes de que se
añada al próximo nucleótido. El procedimiento puede entonces
repetirse para secuenciar más bases.
La fosfatasa alcalina cataliza la extracción de
los residuos 5'-fosfato a partir de los nucleósidos
tri-, di- y monofosfatos (incluyendo ribo-NTP y
dNTP, y, tal como se ha mencionado anteriormente, los dos isómeros
de NTP\alphaS. De esta forma, no sólo se degradan nucleótidos
(nucleósido trifosfatos), sino también NDP y NMP. Fosfatasas
alcalinas de langostinos, bacterias y/o intestinales de ternero, son
las enzimas preferidas, pero puede utilizarse cualquier enzima
fosfatasa alcalina apropiada en el método de la invención, de
cualquier origen conveniente. La enzima preferida es la del
langostino. Existen muchas fuentes comerciales de enzimas fosfatasa
alcalina, o pueden, si se desea, aislarse a partir de un organismo
productor.
La cantidad de fosfatasa alcalina que se
utilice, dependerá del sistema reactivo preciso empleado, de las
condiciones de la reacción, etc, y puede determinarse fácilmente
mediante experimentos rutinarios. Se ha encontrado que, por ejemplo,
pueden utilizarse concentraciones de 50 mU a 10 U.
Tal como se ha mencionado anteriormente, la
fosfatasa alcalina posee una actividad degradante de NDP y NMP, así
como de NTP. Se beneficia, además, de actuar asimismo sobre
sustratos \alpha-tio modificados, incluyendo, por
lo tanto, no sólo a NTP\alphas, sino también a NDP\alphas y
NMP\alphaS. Esta actividad presta un beneficio ulterior a la
presente invención. Así, se ha observado que la enzima apirasa, y
también la enzima luciferasa utilizadas en el método preferido de
detección de PPi según la presente invención, son inhibidas cuando
un NTP\alphaS es utilizado para la incorporación nucleótida. La
naturaleza exacta de los efectos inhibitorios observados no está
clara, pero puede ser debida al producto NTP\alphaS o a la
inhibición del sustrato. Así, NTP\alphaS puede él mismo ser
inhibitorio, o más probablemente un producto de degradación de
NTP\alphaS (por ejemplo, resultante de la acción de la apirasa),
es inhibitorio. Por ejemplo, se postula que los productos de
degradación de NDP\alphaS y NMP\alphaS (en particular
dADP\alphaS y dAMP\alphaS) producidos por la acción de la
apirasa sobre NTP\alphaS, y que se añaden a la mezcla de la
reacción polimerásica para incorporación, pueden ser inhibitorios.
Más particularmente, se cree que ambos isómeros Sp y Rp de
NDP\alphaS y/o NMP\alphaS inhiben la luciferasa, y también la
enzima apirasa (veáse más adelante en los Ejemplos). Dichas
sustancias inhibitorias pueden eliminarse (o reducirse) por la
acción de la fosfatasa alcalina.
Tal como se ha mencionado anteriormente, la
inhibición de la apirasa es indicada por una tasa de degradación
más lenta de los nucleótidos, y por tanto, por un aumento de la
anchura de la señal. Puede producirse también un alargamiento no
sincronizado, y esto limita la longitud lectora alcanzable. La
inhibición de la luciferasa es indicada por una disminución en la
intensidad de la señal. De este modo, tal como se indica además en
los Ejemplos a continuación, la inhibición de la luciferasa puede
apreciarse cono una disminución equilibrada en la altura del pico
de la señal, ya que los nucleótidos se incorporan en los últimos
ciclos de la secuenciación.
El efecto de la disminución de la intensidad de
la señal (inhibición de la luciferasa) puede combinarse con el
efecto de pérdida de la definición de la señal (por ejemplo, aumento
de la anchura de la señal o señales que se encuentran fuera de
fase) (inhibición de la apirasa) para reducir la eficiencia del
método de secuenciación y, por tanto, la capacidad para
proporcionar longitudes de lectura más largas. La utilización de la
fosfatasa alcalina conjuntamente con la apirasa y dATP\alphaS (y
opcionalmente otros dNTP\alphaS's) posee el beneficio adicional
inesperado de derogar estas fuentes adicionales significativas de la
inhibición (particularmente la inhibición proveniente de la
utilización de NTP\alphaS conjuntamente con la apirasa, por
ejemplo debido a NDP\alphaS y/o NMP\alphaS producidos mediante
la acción de la apirasa).
Otros beneficios de la utilización de la
fosfatasa alcalina pueden también estar disponibles. Así, en ciertas
condiciones o circunstancias, por ejemplo, la secuenciación de
lectura larga (por ejemplo, por encima de 50 ciclos), otros NTP no
tio-modificados, añadidos para incorporación, pueden
constituir asimismo una fuente de inhibición, aunque en un grado
menor que sus análogos \alpha-tio modificados. Por
ejemplo, resultados preliminares sugieren que dATP puede constituir
una fuente de inhibición para la enzima luciferasa (véanse los
Ejemplos a continuación). La acción de la apirasa sobre los NTP no
incorporados da lugar a la acumulación de productos de degradación,
particularmente NDP y NMP (por ejemplo, dADP, dAMP, dCTP, dCMP,
dGDP, dGMP, dTDP, dTMP). En los últimos ciclos de secuenciación,
dichos productos pueden inhibir enzimas utilizadas en las
reacciones de secuenciación y/o de detección de PPi, por ejemplo la
apirasa y/o la luciferasa. Aunque cualquiera de dichos efectos
inhibitorios pueden obtenerse con otros nucleótidos, serán
inferiores que los que provengan de la utilización de NTP\alphaS,
y pueden contribuir todavía, sin embargo, a una disminución en la
eficacia del sistema. Como se ha mencionado antes, cualquier
problema potencial causado por dichas sustancias inhibitorias,
puede eliminarse o reducirse por la acción de la fosfatasa
alcalina.
ATP es generado en la primera etapa de la
reacción ELIDA (catalizada por la enzima ATP sulfurilasa), que se
utiliza como el método preferido para la deteccion de PPi. Dicho
producto ATP (en particular cualquiera de dichos ATP que no se
utilice en la subsiguiente reacción luciferásica), puede también
actuar como un sustrato para la apirasa (u otro enzima degradante
de nucleótidos), y por tanto, puede conducir asimismo a la
generación de productos inhibitorios (por ejemplo, ADP y AMP), que
pueden inhibir la luciferasa, y en un grado menor, también la
apirasa. Otra vez, cualesquiera de dichos productos inhibitorios
puede reducirse o eliminarse mediante la acción de la fosfatasa
alcalina.
Finalmente, la utilización de fosfatasa alcalina
puede tener además un beneficio para reducir cualesquiera problemas
causados por la contaminación quinásica. Las quinasas pueden ser
contaminantes de preparaciones enzimáticas que se utilizan en las
reacciones de secuenciación y de detección de PPi que se describen
en la presente memoria. La acción de las quinasas sobre los
productos de degradación de la apirasa (es decir, NDP o NMP), y el
ATP resultante de la reacción de la ATP sulfurilasa en el
procedimiento ELIDA, pueden generar NTP que pueden deformar la
reacción primaria de secuenciación (es decir, puede incorporarse
mediante la polimerasa) y conducir a un alargamiento no
sincronizado. La fosfatasa alcalina ejerce un efecto beneficioso
degradando sustratos quinásicos potenciales.
El ácido nucleico de la muestra (es decir, el
ácido nucleico diana que va a secuenciarse) puede ser cualquier
secuencia polinucleótida de la que sea deseable obtener información
secuencial. Es decir, puede ser cualquier secuencia polinucleótida,
o verdaderamente oligonucleótida. El ácido nucleico puede ser ADN o
ARN, y puede ser natural o sintético. Así, el ácido nucleico diana
puede ser ADN genómico o cADN, o un producto PCR, u otro amplicón
etc. El ácido nucleico diana (muestra) puede utilizarse en cualquier
forma conveniente, según métodos conocidos en la técnica, por
ejemplo, aislados, clonados, amplificados, etc, y puede prepararse
para la reacción de secuenciación, tal como se desee, según métodos
conocidos en la técnica. El ácido nucleico de la muestra actúa como
matriz para una posible prolongación del cebador basada en la
polimerasa y al que se puede hacer referencia, convenientemente
como "matriz" o "matriz ácido nucleica". El ADN puede
también ser mono o bicatenario, aunque en las reacciones de
secuenciación se ha utilizado tradicionalmente una matriz de ADN
monocatenario, o verdaderamente, en cualquier reacción de
alargamiento del cebador, es posible utilizar una matriz
bicatenaria, un desplazamiento de la cadena, o llevarse a cabo una
apertura localizada de las dos cadenas del ADN, para permitir la
hibridación del cebador y que tenga lugar la acción de la
polimerasa.
En la reacción polimerásica, puede utilizarse
cualquier enzima polimerásica conveniente, según se seleccione, tal
como se describirá con mayor detalle a continuación. En el caso de
una matriz de ARN, dicha enzima polimerásica puede consistir en una
enzima transcriptasa inversa.
Para repetir cíclicamente el método y de ese
modo secuenciar el ADN de la muestra y, ayudar también a la
separación de un ADN monocatenario de la muestra, de su cadena
complementaria, el ADN de la muestra puede inmovilizarse
opcionalmente o proveerse de medios para unirlo a un soporte
sólido.
Además, la cantidad de ADN que se encuentra en
una muestra que va a analizarse, puede ser pequeña, y puede, por
tanto, desearse entonces amplificar el ADN antes de la
secuenciación. Tal como se ha mencionado anteriormente, el ADN de la
muestra puede ser entonces un amplicón.
Puede utilizarse cualquier método de
amplificación in vitro o in vivo que se desee, por
ejemplo PCR (o una variante o modificación suya), o la Replicación
Autosostenida de la Secuencia (3SR), o la reacción en cadena de la
ligasa (LCR), etc. Cualquiera que sea el método utilizado, puede ser
conveniente inmovilizar el ADN amplificado, o proveerlo con medios
para unirlo a un soporte sólido. Por ejemplo, puede inmovilizarse un
cebador PCR, o proveerlo con medios para unirlo a un soporte
sólido.
La inmovilización del ADN amplificado puede
llevarse a cabo como parte de la amplificación PCR en sí misma, si
uno o más cebadores se unen a un soporte, o alternativamente, uno o
más de los cebadores PCR pueden transportar un grupo funcional que
permita la subsiguiente inmovilización, por ejemplo, la biotina o el
grupo tiol. La inmovilización por el extremo 5' de un cebador,
permite que la cadena de ADN que emana de ese cebador, se una a un
soporte sólido y mantenga el extremo 3' lejos del soporte y
dispuesto para la subsiguiente hibridación con el cebador del
alargamiento y la prolongación de la cadena mediante la
polimerasa.
El soporte sólido puede convenientemente tomar
la forma de pocillos de microtitulación. Sin embargo, cualquier
soporte sólido puede utilizarse convenientemente, incluyendo
cualquiera del abundante número que se describe en la técnica, por
ejemplo, para reacciones de separación/inmovilización, o ensayos de
fase sólida. De este modo, el soporte puede también comprender
partículas (por ejemplo, perlas), fibras o capilares fabricados con
agarosa, celulosa, alginato, teflón o poliestireno. Asimismo, pueden
utilizarse como soporte partículas magnéticas, por ejemplo las
perlas superparamagnéticas fabricadas por Dynal AS (Oslo,
Noruega).
El soporte sólido puede transportar grupos
funcionales tales como grupos hidroxilo, carboxilo, aldehído o
amino, u otras fracciones tales como avidina o estreptavidina, para
la unión de moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo, cebadores.
Estos pueden proporcionarse, en general, tratando el soporte para
obtener un revestimiento superficial de un polímero que transporte
uno de dichos grupos funcionales, por ejemplo, poliuretano
conjuntamente con un poliglicol para proporcionar grupos hidroxilo,
o un derivado de la celulosa para proporcionar grupos hidroxilo, un
polímero o copolímero de ácido acrílico o ácido metacrílico para
proporcionar grupos carboxilos, o un polímero aminoalquílico para
proporcionar grupos amino. La patente US nº 4654267 describe la
introducción de muchos de dichos revestimientos superficiales.
Si se desea, la muestra puede lavarse después de
cierto número de ciclos reactivos, por ejemplo,
15-25, según los métodos bien conocidos en la
técnica. El lavado puede ser facilitado inmovilizando la muestra
sobre una superficie sólida. Utilizando una enzima degradadora de
nucleótidos, combinada con la eliminación del isómero Rp
(utilizando fosfatasa alcalina particularmente), sin embargo, los
medios para lavado no son absolutamente necesarios.
La técnica de ensayo es muy simple y rápida,
haciéndose, por tanto, fácil de automatizarla utilizando un
dispositivo robótico, en el que gran número de muestras pueden
analizarse rápidamente. Ya que la detección y cuantificación
preferidas se basan en una reacción luminométrica, ésta puede
seguirse fácilmente espectrofotométricamente. La utilización de
luminómetros es bien conocida en la técnica y está descrita en la
literatura.
El método de la presente invención encaja
particularmente para utilizarlo en un formato de despliegue, en el
que las muestras se distribuyen sobre una superficie, por ejemplo,
un chip microfabricado, y mediante el cual un conjunto ordenado de
muestras puede inmovilizarse en un formato de 2 dimensiones. Pueden
analizarse muchas muestras, por tanto, en paralelo. Utilizando el
método de la invención, muchas matrices inmovilizadas pueden
analizarse de esta forma para permitir la solución que contenga las
enzimas y un nucleótido que fluya sobre la superficie, y detectar
entonces la señal producida por dicha muestra. Este procedimiento
puede entonces repetirse. Alternativamente, varios distintos
oligonucleótidos complementarios a la matriz, pueden distribuirse
por encima de la superficie, seguido por la hibridación de la
matriz. La incorporación de nucleótidos puede controlarse para cada
oligonucleótido mediante la señal producida utilizando los diversos
oligonucleótidos como cebador. Combinando las señales de los
distintas áreas de la superficie, pueden llevarse a cabo análisis
basados en la secuencia, mediante cuatro ciclos de reacciones
polimerásicas utilizando los diversos nucleótidos.
La longitud del cebador de alargamiento no es
crítica, y puede ser según se seleccione. Estará claro para los
expertos en la materia, que el tamaño del cebador del alargamiento y
la estabilidad de la hibridación dependerán en algún grado de la
relación de los emparejamientos de bases
A-T/C-G, ya que en un emparejamiento
C-G, está disponible más enlace de hidrógeno.
Asimismo, el experto en la materia considerará el grado de identidad
secuencial entre el cebador del alargamiento con otras partes de la
secuencia matriz y hará una selección de acuerdo con el grado de
restricción. La guía para dicha experimentación rutinaria puede
encontrarse en la literatura, por ejemplo, Molecular Cloning, a
laboratory manual,by Sambrook, J., Fritsch E.F. y Maniatis, T.
(1989). Puede ser ventajoso asegurar que el cebador de secuenciación
hibrida por lo menos una base interna a partir del extremo 3' de la
matriz, para eliminar la actividad polimerásica del ADN de extremos
romos. Si se utilizan alícuotas separadas (es decir, 4 alícuotas,
una para cada base), el cebador del alargamiento se añade
preferentemente antes de que la muestra se divida en cuatro
alícuotas, aunque puede añadirse separadamente a cada alícuota.
Alternativamente, puede utilizarse un cebador
que contiene un bucle, se retrohibrida sobre sí mismo, tiene un
extremo 5' fosforilado y el extremo 3' de la matriz, monocatenario.
Si el extremo 3' de la matriz tiene la región secuencia denominada
T (matriz), el cebador posee la secuencia siguiente, que empieza a
partir del extremo 5';
P-L-P-T', donde P es
un cebador específico (5 a 30 nuclósidos), L es un bucle
(preferentemente de 4 a 10 nucleótidos), P' es complementario a P
(preferentemente de 5 y 30 nucleótidos) y T' es complementario a la
secuencia matricial en el extremo 3' (T) (por lo menos, 4
nucleótidos). Este cebador puede entonces unirse a la matriz
monocatenaria utilizando una T4 ADN ligasa o una enzima similar.
Esto proporciona un enlace covalente entre la matriz y el cebador
evitando así la posibilidad de que el cebador hibridado sea
expulsado durante el protocolo.
En la reacción polimerásica, puede utilizarse
cualquier enzima conveniente según se seleccione, por ejemplo, la
T7 polimerasa, la Klenow o la Sequanasa Ver 2.0 (USB USA). Cualquier
polimerasa apropiada puede utilizarse convenientemente y muchas se
conocen en la técnica y se informa de ellas en la literatura. Sin
embargo, se sabe que muchas polimerasas muestran una "corrección
de pruebas" (o capacidad de rastreo del error) y que los
extremos 3' que están disponibles para la prolongación de la cadena,
son digeridos a veces por uno o más nucleótidos. Si dicha digestión
tiene lugar en el método según la invención, el nivel de ruido que
antecede, aumenta. Para evitar este problema, puede utilizarse una
polimerasa "sin corrección de pruebas", por ejemplo, una
Klenow polimerasa deficiente en exonucleasa (exo^{-}) y ésta se
prefiere según la presente invención. Alternativamente, pueden
utilizarse sustancias que suprimen la digestión del extremo 3' por
la polimerasa, tales como iones de fluor o nucleótidos monofosfato.
Las condiciones exactas de la reacción, las concentraciones de
reactivos, etc, pueden determinarse fácilmente para cada sistema,
según se seleccione. Sin embargo, puede ser favorable utilizar un
exceso de polimerasa respecto al cebador/matriz, para asegurar que
todos los extremos 3' libres, se prolongan.
En el método de la invención, resulta preferido
utilizar una ADN polimerasa con una alta eficiencia en cada etapa
de la prolongación, debido al rápido aumento de la señal que
antecede que puede tener lugar si las matrices que no se han
prolongado completamente, se acumulan. También es deseable una
fidelidad alta en cada etapa, que puede alcanzarse utilizando
polimerasas con actividad exonucleásica. Sin embargo, esto tiene la
desventaja anteriormente mencionada de que puede tener lugar la
degradación de la cadena que se está prolongando. Aunque la
actividad exonucleásica de la Klenow polimerasa es baja, el extremo
3'del cebador puede degradarse con incubaciones más largas en
ausencia de nucleótidos. Un mecanismo de unión adecuado, inducido en
la etapa de polimerización, selecciona muy eficientemente la unión
del correcto dNTP con una contribución neta hacia la fidelidad de
10^{5}-10^{6}.
Polimerasas exonucleásicas deficientes, tales
como (exo^{-})Klenow o Sequenasa 2.0, catalizaron la
incorporación de un nucleótido que sólo se observó cuando el dNTP
complementario se encontraba presente, confirmando una fidelidad
alta de estas enzimas, incluso en ausencia de actividad
exonucleásica de "corrección de pruebas". La ventaja principal
de utilizar (exo^{-}) Klenow ADN polimerasa, con respecto a la
Sequanasa 2,0, es su Km más baja para los nucleótidos, permitiendo
una alta tasa de incorporación de los nucleótidos, incluso a
concentraciones bajas de éstos. Tal como se ha mencionado
anteriormente, es posible también reemplazar todos los dNTP con
análogos de nucleótidos o con nucleótidos no naturales tales como
dNTP\alphaS, pudiendo preferirse dichos análogos para utilizarlos
con una ADN polimerasa con actividad exonucleásica.
En determinadas circunstancias, por ejemplo con
matrices más largas de las muestras, puede ser ventajoso utilizaron
una polimerasa que tenga una K_{M} más bajo para la incorporación
del nucleótido correcto (emparejado), que para el nucleótido
incorrecto (desemparejado). Esto puede mejorar la exactitud y
eficiencia del método. Dichas enzimas polimerásicas apropiadas
incluyen la \alpha-polimerasa de Drosophila.
En muchas aplicaciones diagnósticas, por
ejemplo, el ensayo genético para portadores de enfermedades
heredadas, la muestra contendrá material heterocigótico, es decir,
que la mitad del ADN tendrá un nucleótido en la posición diana y la
otra mitad tendrá otro nucleótido, Así, si cuatro alícuotas (es
decir, cuatro reacciones paralelas de la misma muestra) se utilizan
en una forma de realización según la invención, dos mostrarán una
señal negativa y dos mostrarán la mitad de la señal positiva. Se
apreciará, por tanto, que es deseable determinar cuantitativamente
la cantidad de señal que se detecte en cada muestra. Asimismo, se
apreciará que si dos o más de las mismas bases se encuentran
adyacentes al extremo 3' del cebador, se producirá una señal
potente. En el caso de una muestra homóloga, estará claro que habrá
tres señales negativas y una positiva, cuando la muestra se divida
en cuatro reacciones paralelas.
Al llevar a cabo el método de la invención,
cualquier posible contaminación de los reactivos, por ejemplo, de
las soluciones de NTP, por PPi, es indeseable, y puede evitarse
fácilmente incluyendo una pirofosfatasa, preferentemente en
cantidades pequeñas, en las soluciones reactivas. Verdaderamente, es
deseable evitar la contaminación de cualquier tipo y resulta
preferida la utilización de reactivos de alta pureza o
cuidadosamente purificados, por ejemplo, para evitar la
contaminación por las quinasas.
La eficiencia de la reacción puede mejorarse
incluyendo iones Mg^{2+} en las soluciones del reactivo (NTP y/o
polimerasa).
Un problema potencial que ha sido observado
previamente con el método de secuenciación basado en PPi, surge
cuando el ADN que va a secuenciarse posee un número de bases
adyacentes idénticas, especialmente tres o más de las mismas.
Además, pueden producirse señales falsas debido al fallo en el
cebado, es decir, que la hibridación del cebador, no se ha
realizado con su complemento diana en el interior de la secuencia
del ADN diana, sino con otra región, que dará lugar a la generación
de "señales de incorporación", que no reflejan la identidad de
la secuencia diana. Tal como se describe en el documento WO00/43540,
esto puede evitarse utilizando proteínas que se unen al ácido
nucleico monocatenario en la mezcla de reacción después de la
hibridación del cebador a la matriz.
Así, otra característica preferida de la
invención es la utilización de una proteína unida al ácido nucleico
monocatenario, que se incluye durante la etapa de la reacción
polimerásica después de la hibridación del cebador.
Como se ha mencionado anteriormente, los
beneficios de la presente invención surgen de la eliminación (por
ejemplo, la eliminación y/o exclusión) de las sustancias de
inhibición de la mezcla de reacción.
De este modo, contemplada desde un punto de
vista distinto, la presente invención proporciona un método para
disminuir la inhibición de la polimerasa en un procedimiento de
secuenciación basado en PPi, que utiliza por lo menos un
NTP\alphaS, comprendiendo dicho método la eliminación del isómero
Rp de NTP\alphaS y/o de los productos de degradación de dicho
NTP\alphaS partir de la mezcla de la reacción de secuenciación (es
decir, la matriz, el cebador, la polimerasa y/o la mezcla
nucleótida).
Además, ya que un efecto similar de inhibición
se ha observado para la enzima apirasa, que puede utilizarse para
degradar nucleótidos no incorporados, la presente invención
proporciona también un método para disminuir la inhibición de la
apirasa cuando se utiliza en un procedimiento de secuenciación
basado en PPi, que utiliza por lo menos un NTP\alphaS,
comprendiendo dicho método la eliminación del isómero Rp de
NTP\alphaSy/o los productos de degradación de dicha NTP\alphaS
a partir de la reacción de secuenciación.
Como se ha mencionado además anteriormente, la
enzima luciferasa que se utiliza preferentemente en la detección de
PPi, puede ser inhibida mediante varias sustancias inhibitorias (por
ejemplo, el isómero Rp y/o los productos de degradación) y éstas
pueden eliminarse ventajosamente mediante la acción de la fosfatasa
alcalina. De acuerdo con esto, en otro aspecto, la presente
invención proporciona un método para disminuir la inhibición de la
luciferasa cuando se utiliza como una enzima de detección en un
procedimiento de secuenciación basado en PPi, comprendiendo dicho
método la inclusión de la fosfatasa alcalina en la mezcla de
secuenciación y/o en la reacción de detección de PPi.
Típicamente, en ciertas formas de realización de
la invención, NTP\alphaS será ATP\alphaS (por ejemplo,
dATP\alphaS o ddATP\alphaS).
La invención comprende asimismo equipos para su
utilización en métodos de la invención, que incluirán normalmente,
por lo menos, los componentes siguientes:
- (a)
- una polimerasa
- (b)
- unos medios para detectar la liberación del pirofosfato (preferentemente unos medios enzimáticos, y más preferentemente la luciferasa y la ATP sulfurilasa, por ejemplo, los componentes reactivos de un ensayo ELIDA (véase anteriormente)
- (c)
- opcionalmente, una enzima degradante de nucleótidos (preferentemente apirasa)
- (d)
- fosfatasa alcalina
- (e)
- uno o más nucleótidos, preferentemente desoxinucleótidos, que incluyen, en lugar de un nucleótido de adenina (por ejemplo, dATP), un análogo \alpha-tiotrifosfato de dicho nucleótido (por ejemplo, dATP\alphaS);
- (f)
- opcionalmente, un cebador específico de prueba, que se hibrida al ácido nucleico de la muestra, de forma que la posición de la diana está muy próxima al extremo 3' del cebador.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra forma de realización del equipo de la
invención, incluirá normalmente, por lo menos, los componentes
siguientes:
- (a)
- una polimerasa
- (b)
- unos medios para detectar la liberación del pirofosfato (preferentemente unos medios enzimáticos, y muy preferentemente la luciferasa y la ATP sulfurilasa, por ejemplo, los componentes reactivos de un ensayo ELIDA (véase anteriormente)
- (c)
- opcionalmente, una enzima degradante de nucleótidos (preferentemente apirasa)
- (d)
- el isómero Sp de un análogo \alpha-tiotrifosfato de un nucleótido de adenina (preferentemente dATP\alphaS) y opcionalmente uno o más isómeros Sp de nucleótidos de timina, citosina o guanina (preferentemente dGTP\alphaS, dCTP\alphaS o dGTP\alpha); y
- (f)
- opcionalmente, un cebador específico de prueba, que se hibrida al ADN del ácido nucleico de la muestra, de forma que la posición de la diana está muy próxima al extremo 3' del cebador.
- (g)
- opcionalmente, uno o más nucleótidos no modificados de timina, citosina o guanina (preferentemente dTTP, dCTP, dGTP);
- (h)
- opcionalmente, fosfatasa alcalina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los beneficios de la presente invención para
reducir los efectos de las sustancias inhibitorias en la
secuenciación basada en PPi, mejoran la eficiencia y la fiabilidad
del método y amplían las aplicaciones en las que puede utilizarse
el método. De este modo, las técnicas que requieren lecturas más
largas tales como la re-secuenciación del genoma,
la secuenciación comparativa EST, el tipado microbiológico y la
confirmación secuencial, pueden todas ser llevadas a cabo mediante
la secuenciación basada en PPi, según la presente invención.
El cebador, si se encuentra en los equipos, se
diseña de forma que se una al ácido nucleico matriz con su extremo
3', de manera próxima al nucleótido diana. "De manera próxima"
significa de 1 a 30 nucleótidos, preferentemente de 1 a 20
nucleótidos, más preferentemente de 1 a 10, muy preferentemente de 1
a 5 nucleótidos, a partir del nucleótido diana.
La invención se describirá a continuación
mediante ejemplos no limitativos haciendo referencia a las figuras,
en las que:
La Figura 1 muestra un trazo (intensidad de la
luz con respecto a adición nucleótida), que se obtiene a partir de
la simulación del efecto de dATP sobre la luciferasa y la apirasa,
utilizando 2 \muM de ATP en la solución nucleótida. En este
experimento, se utilizaron 100 ng de luciferasa, 50 mU de apirasa,
0,1 M Tris-acetato (pH 7,75), 0,5 mM EDTA, 5 mM de
acetato magnésico, albúmina sérica bovina al 0,1%, 1 mM de
ditiotreitol. 0,4 mg/ml de polivinilpirrolidona, (360000) y 100
\mug/ml de D-luciferina
(Bio-Thema). 200 \mul de 0,7 mM nucleótido (dATP)
que contenía 2 \muM ATP, se administraron a la mezcla de reacción,
tal como se describe en el Ejemplo 1. La altura de la curva
ascendente demuestra la actividad de la luciferasa y la pendiente de
la curva descendente demuestra la actividad apirasa. El PPi se
detectó en tiempo real.
La Figura 2 muestra un trazo (intensidad de la
luz con respecto a adición nucleótida), que se obtiene a partir de
la simulación del efecto de dATP\alphaS sobre la luciferasa y la
apirasa, utilizando 2 \muM de ATP en la solución nucleótida. En
este experimento, se utilizaron 100 ng de luciferasa, 50 mU de
apirasa, 0,1 M Tris-acetato (pH 7,75), 0,5 mM EDTA,
5 mM de acetato magnésico, albúmina sérica bovina al 0,1%, 1 mM de
ditiotreitol. 0,4 mg/ml de polivinilpirrolidona, (360000) y 100
\mug/ml de D-luciferina
(Bio-Thema). 200 \mul de 0,7 mM nucleótido
(dATP\alphaS) que contenía 2 \muM ATP, se administraron a la
mezcla de reacción, tal como se describe en el Ejemplo 1. La altura
de la curva ascendente demuestra la actividad de la luciferasa y la
pendiente de la curva descendente demuestra la actividad
apirasa.
La Figura 3 muestra un trazo (intensidad de la
luz con respecto a adición nucleótida), que se obtiene a partir de
la simulación del efecto de dCTP sobre la luciferasa y la apirasa,
utilizando 2 \muM de ATP en la solución nucleótida. En este
experimento, se utilizaron 100 ng de luciferasa, 50 mU de apirasa,
0,1 M Tris-acetato (pH 7,75), 0,5 mM EDTA, 5 mM de
acetato magnésico, albúmina sérica bovina al 0,1%, 1 mM de
ditiotreitol. 0,4 mg/ml de polivinilpirrolidona, (360000) y 100
\mug/ml de D-luciferina
(Bio-Thema). 200 \mul de 0,2 mM nucleótido (dCTP)
que contenía 2 \muM ATP, se administraron a la mezcla de reacción,
tal como se describe en el Ejemplo 1. La altura de la curva
ascendente demuestra la actividad de la luciferasa y la pendiente de
la curva descendente demuestra la actividad apirasa.
La Figura 4 muestra un trazo (intensidad de la
luz con respecto a adición nucleótida), que se obtiene a partir de
la simulación del efecto de dGTP sobre la luciferasa y la apirasa,
utilizando 2 \muM de ATP en la solución nucleótida. En este
experimento, se utilizaron 100 ng de luciferasa, 50 mU de apirasa,
0,1 M Tris-acetato (pH 7,75), 0,5 mM EDTA, 5 mM de
acetato magnésico, albúmina sérica bovina al 0,1%, 1 mM de
ditiotreitol. 0,4 mg/ml de polivinilpirrolidona, (360000) y 100
\mug/ml de D-luciferina
(Bio-Thema). 200 \mul de 0,16 mM nucleótido (dGTP)
que contenía 2 \muM ATP, se administraron a la mezcla de reacción,
tal como se describe en el Ejemplo 1. La altura de la curva
ascendente demuestra la actividad de la luciferasa y la pendiente de
la curva descendente demuestra la actividad apirasa.
La Figura 5 muestra un trazo (intensidad de la
luz con respecto a adición nucleótida), que se obtiene a partir de
la simulación del efecto de dTTP sobre la luciferasa y la apirasa,
utilizando 2 \muM de ATP en la solución nucleótida. En este
experimento, se utilizaron 100 ng de luciferasa, 50 mU de apirasa,
0,1 M Tris-acetato (pH 7,75), 0,5 mM EDTA, 5 mM de
acetato magnésico, albúmina sérica bovina al 0,1%, 1 mM de
ditiotreitol. 0,4 mg/ml de polivinilpirrolidona, (360000) y 100
\mug/ml de D-luciferina
(Bio-Thema). 200 \mul de 0,8 mM nucleótido (dTTP)
que contenía 2 \muM ATP, se administraron a la mezcla de reacción,
tal como se describe en el Ejemplo 1. La altura de la curva
ascendente demuestra la actividad de la luciferasa y la pendiente de
la curva descendente demuestra la actividad apirasa.
La Figura 6 muestra un trazo (intensidad de la
luz con respecto a adición nucleótida), que se obtiene a partir de
la simulación del efecto de dATP\alphaS sobre la luciferasa y la
apirasa, utilizando 2 \muM de ATP en la solución nucleótida, en
presencia de fosfatasa alcalina. En este experimento, se utilizaron
100 ng de luciferasa, 50 mU de apirasa, 0,1 M
Tris-acetato (pH 7,75), 0,5 mM EDTA, 5 mM de acetato
magnésico, albúmina sérica bovina al 0,1%, 1 mM de ditiotreitol. 0,4
mg/ml de polivinilpirrolidona, (360000) y 100 \mug/ml de
D-luciferina (Bio-Thema), y 1U de
fosfatasa alcalina. 200 \mul de 0,7 mM nucleótido (dATP\alphaS)
que contenía 2 \muM ATP, se administraron a la mezcla de reacción,
tal como se describe en el Ejemplo 1. La altura de la curva
ascendente demuestra la actividad de la luciferasa y la pendiente de
la curva descendente demuestra la actividad apirasa.
La Figura 7 muestra tres trazos (intensidad de
la luz con respecto a la adición nucleótida) obtenidos en reacciones
de secuenciación del ADN utilizando 1 pmol de la matriz
oligonucleótida cebadora; el sistema reactivo contenía 10 U Klenow
ADN polimerasa, 25 mU ATP sulfurilasa y 0,1 M
Tris-acetato (pH 7,75) 0,5 mM EDTA, 5 mM de acetato
magnésico, albúmina sérica bovina al 0,1%, 1 mM de ditiotreitol. 0,4
mg/ml de polivinilpirrolidona, (360000) y 100 \mug/ml de
D-luciferina (Bio-Thema); y A) 100
ng de luciferasa y 50 mU de apirasa; B) 100 ng de luciferasa, 50 mU
de apirasa y 2 mU de nucleósido difosfato quinasa; C) 100 ng de
luciferasa, 50 mU de apirasa, 2 mU de nucleósido difosfato quinasa y
2 U de fosfatasa alcalina. Las flechas en B indican las señales
falsas que aparecen como resultado de la actividad quinásica en el
sistema, que se eliminan añadiendo fosfatasa alcalina en el
experimento que se muestra en C.
La Figura 8 presenta trazos (intensidad de la
luz con respecto a la adición nucleótida) que muestran los efectos
de la preincubación de una mezcla de reacción secuenciadora
PP-i (en ausencia de la matriz), con cantidades
variables de dATP\alphaS "normal" (es decir, racémico), que
contenía ambos isómeros Sp y Rp) ((A) 0 \mul; (B) 5 \mul; (C) 10
\mul; (D) 20 \mul)) del isómero Sp puro de dATP\alphaS ((E) 0
\mul; (F) 5 \mul, (G) 10 \mul; (H) 20 \mul)), o el isómero
Rp puro de dATP\alphaS ((I) 0 \mul; (J)5 \mul;
(K)10 \mul; (L) 20 \mul)). Después de la preincubación,
se añadió la matriz y se llevó a cabo la reacción de secuenciación
basada en PPi, tal como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 9 es un trazo (intensidad de la luz
con respecto a la adición nucleótida) que muestra los resultados de
una reacción de secuenciación del ADN sobre una matriz derivada de
pUC19, en la que los cuatro distintos nucleótidos se añaden paso a
paso a la matriz hibridada a un cebador. Se utiliza una mezcla de
los isómeros Rp y Sp de dATP\alphaS. La matriz/cebador se incubó
con 10U (exo^{-}) Klenow y 40 mU de apirasa, y los otros
componentes de la reacción de secuenciación/detección de PPi tal
como se describe en el ejemplo 3. La reacción empezó añadiendo el
primer nucleótido, añadiéndose los (otros) nucleótidos paso a paso.
El PPi liberado, se detectó en tiempo real mediante la
luciferasa.
La Figura 10 es un trazo (intensidad de la luz
con respecto a la adición nucleótida) que muestra los resultados de
una reacción de secuenciación del ADN sobre una matriz derivada de
pUC19, en la que los cuatro distintos nucleótidos se añaden paso a
paso a la matriz hibridada al cebador. Se utilizó sólo el isómero Sp
de d-ATP\alphaS. La matriz/cebador se incubó con
10U (exo^{-}) Klenow y 40 mU de apirasa, y los otros componentes
de la reacción de secuenciación/detección de PPi tal como se
describe en el ejemplo 3. La reacción empezó añadiendo el primer
nucleótido, añadiéndose entonces los (otros) nucleótidos paso a
paso. El PPi liberado, se detectó en tiempo real mediante la
luciferasa.
En este ejemplo se llevó a cabo una serie de 5
experimentos para examinar el efecto inhibitorio de cada uno de 5
nucleótidos (dATP, dATP\alphaS, dCTP, dGTP y dTTP sobre las
enzimas apirasa y luciferasa. Se utilizó un sistema modelo que
simulaba los efectos de estas enzimas en una reacción de
secuenciación basada en PPi. Se añadió cada nucleótido a la mezcla
luciferasa/apirasa/sustrato, junto con ATP (para proporcionar un
sustrato para la luciferasa), y el efecto de cada adición
nucleótida sobre las enzimas se controló observando las señales
luminosas generadas a partir de la reacción de la luciferasa. Dos
experimentos más demostraron, en primer lugar, que los efectos
inhibitorios resultantes de la utilización de dATP\alphaS pueden
ser derogados en el sistema modelo utilizando fosfatasa alcalina,
y, en segundo lugar, que la fosfatasa alcalina posee además un
beneficio adicional contrarrestando los efectos de interferencia de
las enzimas quinásicas sobre el sistema reactivo (tal como se
demuestra en una reacción de secuenciación).
Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura
ambiente en un volumen de 50 \mul en un prototipo de instrumento
automatizado de secuenciación (Pyrosequencer) (amablemente cedido
por Pyrosequencing AB, Uppsala, Suecia). La mezcla de reacción
contenía: 50 mU de apirasa (Sigma Chemical Co., USA), 100 ng de
luciferasa purificada (Biothema, Dalarö, Suecia), 0,1M
Tris-acetato pH 7,75), 0,5 mM EDTA, 5 mM acetato de
magnesio, albúmina sérica bovina al 0,1%, 1 mM ditiotreitol, 0,4
mg/ml de polivinilpirrolidona (360000) y 100 \mug/ml de
D-luciferina (Biothema). Se añadió una
concentración de 2 \muM a los distintos nucleótidos (dATP,
dATP\alphaS, dCTP, dGTP y dTTP), tal como se muestra en las
figuras 1 a 5 para seguir la actividad de la luciferasa y de la
apirasa. Para la investigación del efecto de la fosfatasa alcalina
de los langostinos (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia),
se añadieron dos unidades de esta enzima a la mezcla de reacción
(véase más adelante). En total, se realizaron 50 adiciones de
nucleótidos y de la mezcla de ATP en 50 minutos. La producción de
luz resultante de la incorporación de los nucleótidos, se detectó
mediante una cámara CCD. Los datos se obtuvieron en formato
Excel.
Se llevaron a cabo siete experimentos. Los
experimentos 1 a 5 investigaron los efectos de cada dATP,
dATP\alphaS, dCTP, dGTP y dTTP. El experimento 1 se realizó
utilizando una mezcla de 0,7 mM nucleótido dATP y 2 \muM ATP
suministrados a la mezcla de reacción. El trazo obtenido del
experimento 1 se presenta en la Figura 1. La altura de la curva
ascendente demuestra la actividad de la luciferasa y la curva
descendente indica o demuestra la actividad de la apirasa. Nótese
la disminución relativamente lineal en la intensidad de la señal,
que se debe a la inhibición de la luciferasa, que se cree que es
debida a la acumulación de los productos de degradación de dATP
(por ejemplo, dAMP). Se ha informado anteriormente de que dAMP
inhibe la luciferasa (Ford et al,. 1998, Methods in Mol.
Biol. 102:3-20) o de acuerdo con esto, se deduce de
esto que la sustancia inhibidora puede ser dAMP. Así, se muestra la
inhibición de la luciferasa cuando se utiliza dATP, y esto se cree
debido a los productos de degradación de dAMP (dATP y/o dADP).
El experimento 2 se llevó a cabo utilizando una
mezcla de 0,7 mM nucleótido dATP\alphaS y 2 \muM de ATP,
proporcionados a la mezcla de reacción. Los resultados se muestran
en la Figura 2. La altura de la curva ascendente demuestra la
actividad de la luciferasa, y la pendiente de la curva demuestra la
actividad de la apirasa. Nótese la disminución relativamente lineal
en la intensidad de la señal, que se debe a la inhibición de la
luciferasa, que se cree que es causada por la acumulación de los
productos inhibitorios (por ejemplo, dAMP\alphaS). La disminución
en la intensidad de la señal después de 50 ciclos es un 50% menor
que los datos obtenidos de la degradación de dATP en la figura 1.
De acuerdo con esto, se deduce que es inhibitorio justamente un
isómero de dATP\alphaS, creyéndose que esto se debe al isómero Sp
(o más bien, que los productos del isómero Sp son inhibitorios para
la luciferasa). La apirasa es drásticamente inhibida en los últimos
ciclos, tal como se aprecia por los picos más anchos que se
obtienen. Se cree que el efecto inhibitorio después de cada adición
se debe a la acumulación del isómero Rp de dATP\alphaS y asimismo,
a los productos de degradación del isómero Sp. Se cree que la
apirasa degrada sólo al isómero Sp y no al isómero Rp. Se especula
con que el isómero inactivo de dATP\alphaS (Rp) no es reconocido
por la luciferasa, ya que no es degradado para formar el producto
inhibitorio.
El experimento 3 se llevó a cabo utilizando una
mezcla de 0,2 mM nucleótido dCTP y 2 \muM ATP suministrada a la
reacción. Los resultados se muestran en la Figura 3. La altura de la
curva ascendente demuestra la actividad de la luciferasa y la
pendiente de la curva descendente demuestra la actividad de la
apirasa. Puede apreciarse la intensidad relativamente constante de
la señal, incluso después de 50 ciclos, lo que indica que los
productos de este nucleótido no inhiben a la luciferasa o a la
apirasa bajo las condiciones utilizadas, y dentro del número de
ciclos que se muestran.
El experimento 4 se llevó a cabo utilizando una
mezcla de 0,16 mM nucleótido dGTP y 2 \muM ATP suministrada a la
reacción. Los resultados obtenidos del experimento 4 se muestran en
la Figura 4. La altura de la curva ascendente demuestra la
actividad de la luciferasa y la pendiente de la curva descendente
demuestra la actividad de la apirasa. Nótese la intensidad
relativamente constante de la señal, incluso después de 50 ciclos,
lo que indica que los productos de este nucleótido no inhiben a la
luciferasa o a la apirasa bajo las condiciones utilizadas, y dentro
del número de ciclos que se muestran.
El experimento 5 se llevó a cabo utilizando una
mezcla de 0,8 mM nucleótido dTTP y 2 \muM ATP suministrada a la
reacción. Los resultados se muestran en la Figura 5. La altura de la
curva ascendente demuestra la actividad de la luciferasa y la
pendiente de la curva descendente demuestra la actividad de la
apirasa. Nótese la intensidad relativamente constante de la señal,
incluso después de 50 ciclos, lo que indica que los productos de
este nucleótido no inhiben a la luciferasa o a la apirasa bajo las
condiciones utilizadas, y dentro del número de ciclos que se
muestran.
El experimento 6 investigó la reducción en la
inhibición llevada a cabo mediante la adición de fosfatasa alcalina
a la mezcla de reacción. Este experimento se realizó de modo similar
al Experimento 2, utilizando una mezcla de 0,7 mM nucleótido
dATP\alphaS y 2 \muM ATP suministrado a la mezcla de reacción.
Los resultados se muestran en la Figura 6. La altura del pico
generado demuestra la actividad de la luciferasa y la pendiente de
la curva descendente, demuestra la actividad apirasa. Puede
apreciarse la eficiencia de la degradación nucleótida cuando se
compara con la Figura 2. Puede apreciarse que la anchura de la señal
permanece constante incluso después de 50 ciclos, indicando la
falta de la inhibición apirásica, y por tanto, la alta eficiencia de
la fosfatasa alcalina en la prevención de esta inhibición (que se
cree debida a su acción en la degradación de ambos isómeros (es
decir, los isómeros Rp y Sp) de dATP\alphaS. No se observa la
disminución en la intensidad de la señal, indicando la ausencia de
inhibición de la luciferasa. Se cree que es debido al efecto de la
fosfatasa alcalina en la degradación de los productos de
dATP\alphaS (eliminando de este modo los elementos inhibitorios).
Las condiciones experimentales para las Figuras 2 y 6 son las
mismas, excepto para la adición de 2 U AP en la mezcla de reacción
en el Experimento 6. Así, los resultados del Experimento 6 muestran
que la fosfatasa alcalina puede eliminar las sustancias
inhibitorias del sistema reactivo, mejorando, de este modo, la
actuación de las enzimas luciferasa y apirasa.
El experimento 7 investigó los efectos
inhibitorios de nucleótidos y quinasas sobre una reacción de
secuenciación, y la reducción de estos efectos utilizando la
fosfatasa alcalina. Para la investigación del efecto quinásico, 2
mU de quinasa (Sigma Chemicals) se añadieron a la mezcla de la
reacción de secuenciación que contiene 0,5 pmol de la matriz
sintética cebadora E3PN/NUSPT (Ronaghi et al., Science,
1998), 10 U de Klenow ADN polimerasa deficiente en exonucleasa
(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), 40 mU de apirasa
(Sigma Chemical Co., USA), 100 ng de luciferasa purificada
(BioThema, Dalarö, Suecia), 15 mU de ATP sulfurilasa producida
recombinante, 0,1M Tris-acetato pH 7,75), 0,5 mM
EDTA, 5 mM acetato de magnesio, albúmina sérica bovina al 0,1%, 1
mM ditiotreitol, 5 \muM adenosina 5-fosfosulfato
(APS), 0,4 mg/ml de polivinilpirrolidona (360000) y 100 \mug/ml
de D-luciferina (BioThema). El procedimiento de
secuenciación se llevó a cabo mediante la prolongación paso a paso
del cebador-cadena después de la adición secuencial
de Sp-dATP\alphaS (Biolog LIfe Science, Bremen,
DE), dCTP, dGTP, y dTTP (Amersahm Pharmacia Biotecb) y la
degradación simultánea de nucleótidos por la apirasa. Para estudiar
el efecto de la fosfatasa alcalina en la actividad quinásica, 2 mU
de la enzima quinasa y 2 U de fosfatasa alcalina se añadieron a la
mezcla mencioanda anteriormente. La producción de luz resultante de
la incorporación nucleótida se detectó mediante una cámara CCD. Los
datos se obtuvieron en formato Excel. La Figura 7a muestra los
resultados de la reacción de secuenciación en ausencia de la
quinasa o fosfatasa alcalina añadidas. La Figura 7b muestra un trazo
de los resultados de la reacción de secuenciación en presencia de 2
mU de nucleósido difosfato quinasa. La flecha indica las señales
falsas que se generan.
De este modo, puede apreciarse que la adición de
fosfatasa alcalina a la mezcla de reacción de la polimerización,
elimina las señales falsas generadas por la contaminación quinásica,
eliminando los sustratos para las quinasas a partir de la
solución.
En este ejemplo, el efecto inhibitorio de
dATP\alphaS sobre una reacción de secuenciación basada en PPi,
con la detección ELIDA (conocida como Pirosecuenciación^{TM}, se
investigó preincubando la mezcla de reacción en ausencia de la
matriz, con cantidades variables del dATP\alphaS normal (es decir,
racémico) (que contiene ambos isómeros Rp y Sp), o del isómero Sp
puro de dATP\alphaS. Después de la preincubación, se añadió la
matriz y se realizó una reacción normal de
"Pirosecuenciación".
El dATP\alphaS "normal" se obtuvo del
equipo de Reactivos PSQ 96 SNP suministrado por Pyrosequencing AB
(Uppsala, Suecia). Los isómeros Rp y Sp puros se obtuvieron de
Biolog Life Sciences (Bremen, Alemania). La mezcla de reacción
incluyó también la mezcla enzimática (ADN polimerasa,
ATP-sulfurilasa, apirasa y luciferasa) y la mezcla
de sustratos (luciferina y APS), a partir del equipo de Reactivos
PSQ 96 SNP suministrado por Pyrosequencing AB. La matriz era un
oligonucleótido (Interactiva, Ulm, Alemania), a partir de la cual
pudo leerse la siguiente secuencia, después de la hibridación de un
cebador de secuenciación : CTAAAGGTGCACCATGACTGGGGTTACAGTCATC.
Las muestras isoméricas puras se diluyeron a la
misma concentración que dATP\alphaS en el equipo de Reactivos PSQ
96 SNP. Para la preincubación, 0, 5, 10, ó 20 \mul de cada muestra
A (dATP\alphaS normal o el isómero Rp o Sp), se añadieron a una
mezcla que contenía 5 \mul de la mezcla enzimática, 5 \mul de la
mezcla de sustratos en un volumen total de 45 \mul. La reacción
se llevó a cabo en la placa de 96 pocillos que se había
suministrado con el equipo de Reactivos PSQ 96 SNP. La reacción se
incubó a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante 10 minutos.
Después de esto, se añadieron 1,5 pmol en 5 \mul de la matriz
oligonucleótida hibridada, a cada pocillo y la placa se transfirió
desde el instrumento PSQ 96, donde una reacción
``Pirosecuenciación^{TM} normal se llevó a cabo (omitiendo la
adición de las mezclas enzimática y del sustrato.
Los resultados se muestran en la Figura 8.
Utilizando dATP\alphaS normal (es decir, racémico), puede
apreciarse que la preincubación con 5 \mul (Fig 8B), 10 \mul
(Fig 8C) o 20 \mul (Fig 8D), da lugar a una inhibición
progresivamente severa de la reacción de secuenciación (cuando se
compara con 0 \mul de dATP\alphaS añadido (Fig 8A). Puede
apreciarse alguna pérdida de la intensidad de la señal (altura del
pico) y, más significativamente, la pérdida de la definición de la
señal (por ejemplo, señales más amplias, menos definidas y menos
claras). Así, puede apreciarse que tiene lugar particularmente la
inhibición de la apirasa. Incluso se aprecia una inhibición más
pronunciada cuando se utiliza el isómero Rp (véase la Figura 8J).
Este efecto se redujo significativamente cuando se utilizó el
isómero Sp puro en lugar del dATP\alphaS racémico o del isómero Rp
de dATP\alphaS, como se aprecia en la Figura 8F (5 \mul), Fig
8G (10 \mul) y Fig 8H (20 \mul), (comparado con 0 \mul (Fig
8E)). El isómero Rp puro posee un importante efecto sobre todas las
enzimas implicadas en la detección ELIDA (Figuras 8I y 8J). La
inhibición de la apirasa se indica mediante un aumento en la anchura
de la señal. Esto puede apreciarse claramente en las figuras 8J a
8L, muy claramente se demuestra en la figura 8K. La inhibición de
la luciferasa se indica por una disminución en la intensidad de la
señal. Como puede apreciarse en la figura 8K, la intensidad de la
señal disminuye, en comparación con la figura 8I, que indica que la
luciferasa está siendo inhibida.
Se llevó asimismo a cabo un experimento similar
en el que la preincubación se llevó a cabo comparando dATP\alphaS
"normal" con dCTP, dGTP o dTTP, todos procedentes de un
prototipo para el equipo de Reactivos PSQ 96 SNP. Como control,
sólo se añadió IxTE (tampón de dilución para dNTP). La matriz fue la
misma que antes, pero se añadieron a cada pocillo 2 pmol.
Los resultados obtenidos (no representados)
mostraron claramente que no se producía un efecto negativo en la
preincubación con dCTP, dGTP o dTTP, pero confirmaron un severo
efecto negativo del dATP\alphaS, principalmente sobre la
apirasa.
En este ejemplo, los experimentos de
secuenciación se llevaron a cabo utilizando la misma matriz (un
producto PCR del plásmido estándar de clonación pUC19), con y sin
el isómero Rp de dATP\alphaS (es decir, utilizando en primer
lugar una mezcla racémica del dATP\alphaS, y en segundo,
Sp-dATP\alphaS puro).
El plásmido estándar pUC19 se utilizó para
generar la matriz mediante PCR. Brevemente, los cebadores PCR
GGGATCATGTAACTCGCCTTGA (cebador superior, posición biotinilada
1345) y CGGGAGGGCTTACCATCTGG (cebador inferior, posición 1648)
(donde las posiciones 1648-1345= 303 pares de
bases) se utilizaron en una reacción PCR sobre pUC19 para generar un
fragmento de 303 pares de bases de longitud. 50 microlitros del
producto PCR biotinilado se inmovilizaron sobre 20 \mul de perlas
superparamagnéticas envueltas con estreptoavidina (Dynabeads
M-280-estreptavidina, Dynal AS,
Oslo, Noruega) mediante incubación a 43ºC durante 30 minutos. Se
obtuvo ADN monocatenario incubando el producto PCR inmovilizado en
5 \mul de 0,1 M NaOH durante 4 minutos. La cadena inmovilizada se
resolvió en 8 \mul de H_{2}O más 1 \mul de tampón de
hibridación (100 mM Tris-Ac_{2} (pH 7,75) 20 mM
MgAc2). ADN monocatenario que correspondía a 50 \mul de producto
PCR se hibridizó a 10 pmol del cebador de secuenciación
(TCAG-CAATAAACCAGCCAGCC) a 70ºC durante 3 minutos,
seguido por incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos.
(Después de la hibridación del cebador de la secuenciación, la
longitud de la matriz monocatenaria que queda es de 211 pares de
bases). El producto PCR iniciado se añadió a la mezcla de reacción
"PyrosequencingTM" que contenía: 0,1 M
Tris-Ac_{2} (pH 7,75), Tween 20 al 0,05%, 0 U de
Klenow ADN polimerasa deficiente en exonucleasa (exo^{-}), 40 mU
de apirasa (Sigma Chemical Co., Saint Louis, Mo, USA), 0,8 \mug de
luciferasa purificada (BioThema, Dalarö, Suecia), 15 mU de ATP
sulfurilasa producida recombinante (Karamohamed et al.,1999),
0,5 \mug de proteína unida al ADN monocatenario (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), 0,5 mM EDTA, 5 mM MgAc_{2},
albúmina sérica bovina al 0,1% (BioThema), 1 mM ditiotreitol, 5
\muM adenosina 5'-fosfosulfato (Sigma Chem, Co),
0,4 mg/ml de polivinilpirrolidona (360000) y 100 \mug/ml de
D-luciferina (BioThema), en un volumen total de 50
\mul.
La pirosecuenciación^{TM} se llevó a cabo a
temperatura ambiente en un modelo de prototipo automatizado
Pyrosequencer (Pyrosequencing AB, Uppsala, Suecia;
www.pyrosequencing.com), con una presión de suministro de 600 mbar,
con un tiempo abierto de 8 milisegundos y un tiempo de ciclo de 60
segundos. El procedimiento de secuenciación se llevó a cabo
mediante la prolongación paso a paso de la
cadena-cebador después del suministro cíclico de
los distintos desoxinucleótidos trifosfatos (Amersham Pharmacia
Biotech). En un experimento (que se muestra en la Figura 9), se
utiliza una mezcla racémica de dATP\alphaS (dATP\alphaS
"normal"), (junto con dCTP, dGTP y dTTP), y en el segundo
experimento se utilizó el isómero Sp puro de dATP\alphaS. La
producción de luz, resultante de la incorporación nucleótida, se
detectó mediante un fotomultiplicador. Los datos se obtuvieran en
Microsoft Excel y se muestran en las Figuras 9 y 10.
Observando la Figura 9, puede apreciarse que la
calidad de la señal se deteriora gradualmente con la repetida
adición de los nucleótidos, llevando eventualmente a la pérdida de
la señal que puede leerse (partes 4-6 de la Fig 9).
En la Figura 10, se apreciará que con el isómero Sp puro, la calidad
de la señal se mantiene más, y se obtiene una mayor longitud leíble
antes de que la calidad de la señal se deteriore a niveles
inferiores a los de lectura.
Claims (12)
1. Método de identifación de una base en una
posición diana en una secuencia ácido nucleica de una muestra,
comprendiendo dicho método:
- someter a un cebador hibridado a dicho ácido nucleico de la muestra inmediatamente adyacente a la posición diana, a una reacción de extensión del cebador de ADN polimerasa en presencia de un nucleótido, resultando el nucleótido así sólo incorporado si es complementario a la base en la posición diana, y determinar si dicho nucleótido se incorpora o no detectando si el PPi es liberado, determinándose la identidad de la base diana a partir de la identidad de cualquier nucleótido que se incorpore,
en el que una enzima degradante de nucleótidos,
que es la apirasa, está presente durante o después de la etapa de
reacción de la ADN polimerasa; y en el que, si dicho nucleótido
comprende una base de adenina, se utiliza un análogo
\alpha-tio trifosfato de dicho nucleótido, y el
isómero Rp de dicho análogo y/o los productos de degradación de
dicho análogo son eliminados de la etapa de reacción de la ADN
polimerasa.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el isómero Rp es eliminado utilizando una preparación de un análogo
\alpha-tio trifosfato de un nucleótido de adenina
que contiene sólo su isómero Sp.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
el isómero Rp es eliminado utilizando una preparación de
dATP\alphaS o de ddATP\alphaS que contiene sólo su isómero
Sp.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el isómero Rp y/o los productos de
degradación de dicho análogo son eliminados mediante degradación
enzimática.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
la fosfatasa alcalina se incluye en o se añade a la mezcla de
reacción de la ADN polimerasa.
6, Método según la reivindicación 2 ó 3, en el
que la fosfatasa alcalina se incluye en o se añade a la mezcla de
reacción de la ADN polimerasa.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la reacción de extensión del
cebador se repite en presencia de otros nucleótidos.
8. Método de disminución de la inhibición de la
apirasa, cuando se utiliza en un método de secuenciación basado en
PPi, que utiliza por lo menos un NTP\alphaS, comprendiendo dicho
método la eliminación del isómero Rp de NTP\alphaS y/o los
productos de degradación de dicho análogo de la reacción de
secuenciación.
9. Método de disminución de la inhibición de la
luciferasa, cuando se utiliza en un método de secuenciación basado
en PPi, que utiliza por lo menos un NTP\alphaS, comprendiendo
dicho método la eliminación del isómero Rp de NTP\alphaS y/o los
productos de degradación de dicho análogo de la reacción de
secuenciación.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha liberación de pirofosfato
(PPi) se detecta utilizando las enzimas luciferasa y ATP
sulfurilasa.
11. Kit para su utilización en un método de
identificación de una base en una posición diana en un ácido
nucleico, que comprende:
- (a)
- una ADN polimerasa
- (b)
- unos medios para detectar la liberación de pirofosfato;
- (c)
- una enzima degradante de un nucleótido, que es la apirasa;
- (d)
- fosfatasa alcalina
- (e)
- uno o más nucleótidos, preferentemente desoxinucleótidos, que incluyen, en lugar de un nucleótido de adenina, un análogo \alpha-tiotrifosfato de dicho nucleótido;
- (f)
- opcionalmente un cebador específico de ensayo que se hibride con el ácido nucleico de la muestra, de manera que la posición diana se encuentre muy próxima al extremo 3' del cebador.
12. Kit para su utilización en un método de
identificación de una base en una posición diana en un ácido
nucleico, que comprende:
- (a)
- una ADN polimerasa;
- (b)
- unos medios para detectar la liberación de pirofosfato;
- (c)
- una enzima degradante de un nucleótido, que es la apirasa;
- (d)
- el isómero Sp de un análogo \alpha-tiotrifosfato de un nucleótido de adenina, y opcionalmente, uno o más isómeros Sp de nucleótidos de timina, citosina o guanina; y
- (f)
- opcionalmente, un cebador de ensayo específico que se hibride con el ADN del ácido nucleico de la muestra, de manera que la posición diana se encuentre muy próxima al extremo 3' del cebador;
- (g)
- opcionalmente, uno o más nucleótidos de timina, citosina o guanina no modificados;
- (h)
- opcionalmente, fosfatasa alcalina.
13. Kit según la reivindicación 11 ó 12, en el
que dichos medios para la detección de la liberación del pirofosfato
comprenden luciferasa y ATP sulfurilasa.
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