JP5499037B2 - 遺伝子配列解析法及び試薬 - Google Patents
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Description
真空乾燥した7-デアザヒポキサンチン(1.00g, 7.4×10-3mol, F.W.135.13)にPoCl3 (10mL, 0.11mol, F.W.153.3, 15eq.)を加え115℃のオイルバスで45分間還流した。反応終了後、減圧留去し、残渣に少量の冷水を加えて反応をクエンチした。その溶液をジエチルエーテルに溶かし蒸留水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、吸引濾過し、濾液を減圧留去し、目的物1を得た。
真空乾燥し、アルゴン置換した目的物A1 (140mg, 437μmol, F.W.320.30)、Py BOP(273mg, 524μmol, 1.2eq)、HOBt・H2O(80mg, 524μmol, 1.2eq)をDMF(1ml)で溶解し、そこへDIPEA(761μl, 4.37mmol, 10eq)、2-フェニルエチルアミン(110μl, 1.04mmol, 2.0eq)を加え、室温で3時間撹拌した。反応液を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製を行い、その後逆相の中圧カラムにより再度精製を行い、目的物A2aを得た。
真空乾燥し、アルゴン置換したA1(120mg, 374μmol, F.W.320.30)、Py BOP(234mg, 449μmol, 1.2eq)、HOBt・H2O(68mg, 449μmol, 1.2eq)をDMF(650μl)で溶解し、そこへDIPEA(650μl, 3.74mmol, 10eq)、2-(2-アミノエチル)ピリジン (89μl, 748μmol, 2.0eq)を加え、室温で3時間撹拌した。反応液を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製を行い、その後逆相の中圧カラムにより再度精製を行い、目的物A2bを得た。
真空乾燥し、アルゴン置換したA1(150mg, 468μmol, F.W.320.30)、Py BOP(292mg, 561μmol, 1.2eq)、HOBt・H2O(86mg, 561μmol, 1.2eq)をDMF(817μl)で溶解し、そこへDIPEA(817μl, 4.68mmol, 10eq)、n-プロピルアミン(76μl, 963μmol, 2.0eq)を加え、室温で3時間撹拌した。反応液を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製を行い、その後逆相の中圧カラムにより再度精製を行い、目的物A2cを得た。
ヌクレオシドA1(140mg, 0.44mmol, F.W.320)、ByBOP(274mg, 0.53mmol, F.W.520 1.2e.q.)とHOBt(82mg, 0.53mmol, F.W.153, 1.2e.q.)を一緒にして一晩真空乾燥させた。それを少量のDMFで溶解させ、DIEPA(500μL, 2.95mmol, 6.7eq.)を加え、10秒攪拌させ、すばやく4-(2-アミノエチル)ピリジン(105μL, 0.89mmol, F.W.122, 1.83eq.)を加え室温で1時間攪拌した。反応後、反応液を減圧留去し、残渣をメタノールに溶解させて中圧カラムで精製し、目的物A2dを得た。
つぎに、図3に、B種の合成方法(フロー)を示す。B種の合成方法は、以下の通りである。なお、目的物5の合成までは、先の記述と同じである。
つぎに、図4に、C種の合成方法(フロー)を示す。C種の合成方法は、以下の通りである。なお、目的物4の合成までは、先の記述と同じである。
最後に、図5に、D種の合成方法(フロー)を示す。D種の合成方法は、以下の通りである。
(この定義では、ATPの基質特異性は、1に規格化される。)
合成した核酸基質について、上記の通りにルシフェラーゼに対する基質特異性を測定した結果を、図7に示した。図の左側4点は、それぞれ、ATP、dATP、dATPαS、及びC7dATPの基質特異性(S)を示す。パイロシーケンシングに代表される段階的化学反応による配列決定法では、1塩基の伸長で発生するピロリン酸から生成されるATP量は、ターゲットの全てが伸長したとした場合、反応溶液に存在するターゲット量と等しい。また、複数塩基の伸長については、その複数倍となる。一般的には、配列決定のために1回あたりに分注する核酸基質の量は、解析するターゲット量の約100倍程度が必要である。これは、配列決定部位に同じ塩基が10塩基程度連続している場合が稀にあることと、この配列決定法の反応溶液には、基質分解酵素が共存し、核酸伸長と基質分解が競合して実施されるためである。基質の不足により、伸長が未完となると、それに継続する配列解析が実施できなくなり、解析誤差の拡大や不能を発生する。その予防として、一般的に用いるターゲット量の約100倍程度の基質を、1回あたりに分注することが好ましい。
dATPに替わる核酸基質としては、以下の必要条件がある。
gactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgttggcg taggcaagag tgccttgacgatacagctaa ttc
配列GA(配列番号2):
gactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctagtggcg taggcaagag tgccttgacgatacagctaa ttc
配列CG(配列番号3):
gactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgctggcg taggcaagag tgccttgacgatacagctaa ttc
配列AG(配列番号4):
gactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgatggcg taggcaagag tgccttgacgatacagctaa ttc
配列5T(配列番号5):
acgttttttggcg taggcaagag tgcctt
配列P(配列番号6):
aaggc actct tgcct acgcc a
なお、配列Pは、プライマーである。これは、上記の配列の下線部分に、相補的に結合することが可能である。その他の配列は、プライマーが相補的結合をした場合に、プライマーの3'末端が伸長する場合に取り込まれる塩基の鋳型配列を示している。例えば、配列TGは、プライマーの3'末端の伸長する部位の鋳型塩基、つまりプライマーの結合する部分の5'側に繋がる配列が、TとGであることを示している。また、配列5Tは、同様に、プライマーの結合する部分の5'側に繋がる配列がTの5連結であることを示している。
gatttgggat agaggagcat tagttgccat taatccaggg tgcatgctgg tacttcaaca
配列P2(配列番号8):
tgttgaagta ccagcatgca c
なお、配列P2は、プライマーである。これは、上記の配列S1の下線部分に、相補的に結合することが可能である。また、配列解析に用いた試薬の条件を、表1の条件3に示した。
配列P3(配列番号10):taatggcaac taatgctcct
なお、配列P3は、プライマーである。これは、上記のDNA配列S2の下線部分に、相補的に結合することが可能である。配列解析を実施した結果を、図16〜図20に示した。また、試薬条件を以下の表3に纏めた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (7)
- パイロシーケンシング法において使用するための、請求項3又は4に記載の試薬。
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