CN102471364B - 基因序列分析的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种核酸底物，其具有与dATP相当的核酸底物特性，对于荧光素酶的底物性低，对于互补链合成等酶反应没有不良影响，特别适用于焦磷酸测序法。作为与碱基T互补核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸代替核苷酸α-硫代三磷酸的类似物。

Description

基因序列分析的方法和试剂
技术领域
本发明涉及核酸分析和基因的碱基序列分析的方法，具体涉及基因序列分析、基因多型分析、基因变异分析和基因表达分析的方法。
背景技术
在DNA的碱基序列的确定中，使用凝胶电泳和荧光检测的方法被广泛应用。在该方法中，首先制备许多想要进行序列分析的DNA片段的拷贝。以DNA的5′末端作为起点制备各种长度的荧光标记片段。此外，预先加入根据这些DNA片段的3′末端的碱基种类而波长不同的荧光标记。通过凝胶电泳识别1个碱基差异的长度差，检测每个片段组产生的发光。由发光波长颜色而获知测定中的DNA片段组的DNA末端碱基种类。由于DNA从短的片段组开始依次通过荧光检测部，所以可以通过测量荧光颜色而自短的DNA开始依次获知末端碱基种类。由此进行序列确定。这样的荧光式DNA序列测定仪正在广泛地普及，另外，在人类基因组的分析中也非常活跃。在该方法中，公开了使用许多根内径50μm左右的玻璃细管，进一步利用末端检测等方法，增加每台的分析处理数的技术。
另一方面，利用以焦磷酸测序法为代表的分步的化学反应的序列确定法(例如专利文献1和非专利文献2)，由于处理的简便性而受到关注。图13(1)是表示其工序的例子。概要如下。使引物杂交至作为靶物质的DNA链，顺次将四种互补链合成核酸底物(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)一种一种地加入到反应液中，进行互补链合成反应。图13(1)中，连接于引物的3′末端的核酸底物是与靶物质上的碱基C131互补的dGTP。由此，在其他的核酸底物(dATP、dCTP、dTTP)中不发生延长。加入到反应溶液中、没用于延长的核酸底物，经以腺苷三磷酸双磷酸酶为代表的核酸底物分解酶而被分解。如图13(1)的dGTP注入时那样，如果发生互补链合成反应则DNA互补链延长，生成作为副产物的焦磷酸(PPi)。此时的反应式示于图13(2)。焦磷酸通过共存的酶的作用而转化为ATP，在荧光素和荧光素酶的共存下反应，产生发光(生物发光)。
如果图示每次各底物注入的发光，以图14作为例子。通常，使用该发光曲线，通过分析每次加入的核酸底物时产生的发光，获知加入的互补链合成底物是否被并入DNA链，并且获知互补链的序列信息并因此获知成为靶物质的DNA链的序列信息。
已知：作为1种互补链合成核酸底物，dATP与作为生物发光底物的ATP具有类似的结构，因此作为荧光素酶的底物而起作用。这成为背景发光信号，使得检测灵敏度降低。作为对策，Nyren等人公开了利用dATP的类似物、具体为dATPαS来代替dATP(专利文献1)。
上述Nyren等人的方法减少了焦磷酸测序法中的背景发光，为提高分析时的发光检测性能做出了贡献。但是，使用含有dATPαS的核苷酸α-硫代三磷酸类似物的方法也有缺点。缺点之一是磷酸基部分的Rp异构体引起的酶活性抑制。Nyren等人对此进行了详细地公开(专利文献3和非专利文献2)，Rp异构体可能抑制聚合酶活性，并且Rp异构体不能被腺苷三磷酸双磷酸酶分解。作为对策，Nyren等人公开了首先仅对Sp异构体进行精制而利用的技术。另外，剩余的Sp异构体被腺苷三磷酸双磷酸酶分解为核苷酸α-硫代一磷酸类似物，此后，当其中的一部分通过酶被再合成为核苷酸α-硫代三磷酸类似物时，Sp/Rp异构体的合成确定是各50％，因此针对Rp异构体合成累积的问题，通过碱性磷酸酶分解Rp异构体并除去。Nyren等人公开了可以通过该方法避免由于Rp异构体引起的聚合酶延长抑制。
进一步地，Eriksson等人公开了作为用于代替dATP的核酸底物，使用7-脱氮-2-脱氧腺苷三磷酸(C7dATP)的方法(非专利文献3)。C7dATP是将腺嘌呤基的7位氮替换为碳后的物质。因此，三磷酸结构与dATP相同，容易被腺苷三磷酸双磷酸酶分解。即，与作为现有技术的核苷酸α-硫代三磷酸类似物不同，不存在被考虑为酶抑制的主要因素的光学异构体。由此，Eriksson等人公开了可以没有酶抑制的核酸序列分析。
另一方面，虽然在由焦磷酸生成ATP的反应中使用APS，但这也成为荧光素酶反应的底物，产生背景发光。因此，为了高灵敏度地实施碱基序列确定，期望不使用APS的方法。作为使之成为可能的方法，公开了使用酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)的逆反应，利用AMP和PPi合成ATP的反应的碱基序列确定法(专利文献4)。由于没有使用在现有技术中被指出作为背景发光成分的APS，该方法可以显著地减少背景发光，实现高灵敏度的检测。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开小册子第98/13523号
专利文献2：国际公开小册子第98/28440号
专利文献3：日本特表2004-508054号
专利文献4：日本特开2007-97471号
非专利文献
专利文献1：Anal.Chem.72：15，3423-3430，2000
专利文献2：Anal.Biochem.301，82-90，2002
专利文献3：Nucleosides，Nucleotides & Nucleic Acids，23：10，1583-1594，2004。
发明内容
发明要解决的技术问题
如上所述，在现有的焦磷酸测序法中，实质上必须使用含有dATPαS的核苷酸α-硫代三磷酸类似物。但是，使用含有dATPαS的核苷酸α-硫代三磷酸类似物的缺点也逐渐变得明了。
如上所述，其中之一是核苷酸α-硫代三磷酸类似物的Rp异构体抑制聚合酶活性，Nyren等人提出了对策。其中，仅精制Sp异构体而利用dATPαS(以下，Sp-dATPαS)。
另一方面，来自于本发明人等的研究表明：在使用Sp-dATPαS的核酸延长反应中，核酸底物向DNA的3′末端并入的效率差，本来应该并入的核酸底物没有并入，在互补链合成中，产生了一部分DNA互补链分子没有延长(延长未完)这样的问题。这一部分DNA分子的未延长的发生，特别是在分析对象中含有T的连续碱基即Poly(T)区域的情况下，导致读取碱基长度的缩短等分析准确度的降低。由此可知，必须降低未延长率。
此外，关于使用C7dATP的技术，本发明人等的研究确认：由于C7dATP和ATP的相似性高，C7dATP作为荧光素酶的底物而起作用。因此可以确定，将C7dATP应用于焦磷酸测序法中时，使碱基延长反应的检测灵敏度大大降低。
因此，本发明的技术问题是提供一种核酸底物，其具有与dATP相当的核酸底物特性，对于荧光素酶的底物性低，对于互补链合成等酶反应没有不良影响，特别适用于焦磷酸测序法。
用于解决技术问题的手段
本发明人等不使用dATP的类似物(含有dATPαS的核苷酸α-硫代三磷酸类似物)，而新合成将dATP的腺嘌呤替换为其它的嘌呤异构体后的物质来使用。即，在保留有利于形成氢键的6位氨基结合的结构的条件下，新合成替换为其它的嘌呤异构体的物质，选定不容易成为荧光素酶的底物，可以用于序列分析的物质。结果发现：作为对应于模板核酸试样的碱基T(胸腺嘧啶)的互补核酸底物，通过使用嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸，可以解决上述技术问题。
即，本发明包含以下技术方案。
(1)一种核酸分析方法，其包含如下工序：将核酸试样作为模板，加入对应于碱基AGTC的互补核酸底物进行互补链合成的工序；由在该互补链合成中生成的焦磷酸借助酶而生成ATP的工序；以及检测由荧光素酶反应产生的化学发光来判断互补链合成的有无的工序；作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
(2)根据(1)记载的核酸分析方法，其中，作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用经由亚乙烯基(ethenyl)(C-C双键)、亚乙基(ethylene)(C-C单键)或亚乙炔基(ethynyl)(C-C三键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
(3)根据(2)记载的核酸分析方法，其中，作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用经由亚乙烯基(C-C双键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
(4)根据(1)～(3)中任意一项记载的核酸分析方法，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基团的取代基。
(5)根据(4)记载的核酸分析方法，其中，芳香族基团是碱性芳香族基团。
(6)一种对应于碱基T的互补核酸底物试剂，其含有嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
(7)根据(6)记载的试剂，其中，含有经由亚乙烯基(C-C双键)、亚乙基(C-C单键)或亚乙炔基(C-C三键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
(8)根据(7)记载的试剂，其中，含有经由亚乙烯基(C-C双键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
(9)根据(6)～(8)中任意一项记载的试剂，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基团的取代基。
(10)根据(9)记载的试剂，其中，芳香族基团是碱性芳香族基团。
(11)选自以下式子表示的化合物的化合物：
(12)以下式表示的化合物：
(13)用于焦磷酸测序法中的(6)～(10)中任意一项记载的试剂。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请2009-187917号的说明书和/或附图中记载的内容。
发明的效果
本发明如现有技术那样没有改变三磷酸部分，因此，避免了通过分步的化学反应的序列确定法中的问题，即由于dATP类似物的使用而互补链合成反应进行不充分，未延长的DNA链共存的问题。结果，去除了错误信号产生的影响，因此，分析准确度大大提高。对于含有胸腺嘧啶的连续碱基的核酸试样的序列分析特别有效。
此外，由于提高了反应效率，可以减少未延长的DNA链，因此在通过分步的化学反应的序列确定法中，使得所使用的核酸底物量的减少以及各反应工序中的底物除去过程的简化成为可能。因此，在通过洗涤等除去底物的情况下，可以期待洗涤试剂量的减少。
附图说明
图1表示实施例中合成的11种新颖的候选核酸底物。
图2表示A种核酸底物的合成方法(流程图)。
图3表示B种核酸底物的合成方法(流程图)。
图4表示C种核酸底物的合成方法(流程图)。
图5表示D种核酸底物的合成方法(流程图)。
图6表示作为底物，分注ATP、dATP和dATPαS的情况下的发光量。
图7表示就合成的核酸底物，对相对于荧光素酶的底物特异性进行测定的结果。
图8表示对合成底物与碱基T的亲和性进行评价的结果。
图9表示对dATPαS和A3c的发光曲线进行比较的曲线图。
图10表示就各合成底物，对与其他的碱基(G、C、A)的排他性进行评价的结果。
图11表示对各合成底物向连续碱基T的并入性能进行评价的结果。
图12表示对各合成底物向连续碱基T的并入性能进行评价的结果。
图13表示利用以焦磷酸测序法为代表的分步的化学反应的序列确定法的工序。
图14表示各底物注入时的发光。其中，按ACTG的顺序加入底物。
图15表示在利用分步的化学反应的序列确定法中，对用合成碱基A3d代替dATP的情况与使用dATPαS的情况进行比较的结果。(1)是用合成底物A3d作为dATP的替代物的情况，(2)是用合成底物dATPαS作为dATP的替代物的情况。
图16表示用合成碱基A3d(最终浓度2μM)作为dATP的替代物的情况的序列分析结果。是用合成底物A3d(最终浓度2μM)作为dATP的替代物的情况。
图17表示用底物dATPαS(最终浓度2μM)作为dATP的替代物的情况的序列分析结果。是用dATPαS(最终浓度2μM)作为dATP的替代物的情况。
图18表示用底物C7dATP(最终浓度2μM)作为dATP的替代物的情况的序列分析结果。是用C7dATP(最终浓度2μM)作为dATP的替代物的情况。
图19表示用底物dATPαS(最终浓度4μM)作为dATP的替代物的情况的序列分析结果。是用dATPαS(最终浓度4μM)作为dATP的替代物的情况。
图20表示用底物C7dATP(最终浓度4μM)作为dATP的替代物的情况的序列分析结果。是用C7dATP(最终浓度4μM)作为dATP的替代物的情况。
具体实施方式
本发明的特征在于：在包含将核酸试样作为模板，加入对应于碱基AGTC的互补核酸底物进行互补链合成的工序，通过酶(例如，ATP硫酸化酶和丙酮酸磷酸双激酶)由通过该互补链合成生成的焦磷酸生成ATP的工序，以及检测由荧光素酶反应产生的化学发光而判断互补链合成的有无的工序的核酸分析方法，优选在焦磷酸测序法中，作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。
所谓对应于碱基AGTC的互补核酸底物，是指在作为模板的核酸试样的互补链合成中，对应于模板中的碱基AGTC的每一种、被并入到合成的互补链中的核酸底物。核酸底物中含有脱氧核糖核苷酸三磷酸及其衍生物。通常，作为对应于碱基T的互补核酸底物，可以使用dATP(脱氧腺苷三磷酸)及其异构体，作为对应于碱基A的互补核酸底物，可以使用dTTP(胸苷三磷酸)及其异构体，作为对应于碱基G的互补核酸底物，可以使用dCTP(脱氧胞苷三磷酸)及其异构体，作为对应于碱基C的互补核酸底物，可以使用dGTP(脱氧鸟苷三磷酸)及其异构体。作为核酸底物，除了dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，也可以使用ddNTP。
本发明的特征是，作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。作为嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸，优选为：嘌呤基的6位具有氨基，嘌呤基的7位的氮被碳取代，该碳具有取代基。因此，优选为具有以下式I的结构(式中，X表示取代基)。
此外，作为对应于碱基T的互补核酸底物，优选使用经由亚乙烯基(C-C双键)、亚乙基(C-C单键)或亚乙炔基(C-C三键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。该核酸底物在如下方面是优异的：对于荧光素酶的底物性与ATP相比较低，与核酸的胸腺嘧啶(T)互补，与核酸的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)排他。
经由亚乙烯基(C-C双键)、亚乙基(C-C单键)或亚乙炔基(C-C三键)以取代基修饰嘌呤基的7位后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸中，7位的取代基例如上述式I中的取代基X，分别具有以下式A～C的结构。
式中，波形线指对嘌呤基的结合部位，Y是有机基，优选为可以含有杂原子的取代的或未取代的烃基。作为杂原子，可以举出氧原子、氮原子、硫原子、硅原子、磷原子。作为取代基，例如可以举出选自于氟、氯、溴和碘的卤原子，羟基，取代或未取代的氨基，硝基，氰基，取代或未取代的碳原子数1～10的烷基，取代或未取代的碳原子数2～10的链烯基，取代或未取代的碳原子数3～10的环烷基，取代或未取代的碳原子数1～10的烷氧基，取代或未取代的烷氧羰基或羧基等。
嘌呤基的7位被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸，特别是嘌呤基的7位经由亚乙烯基(C-C双键)而被取代基修饰后的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸(具有上述式A表示的取代基)在如下方面是特别优异的：(1)对荧光素酶的底物性与ATP相比较低，(2)与核酸的胸腺嘧啶(T)互补，(3)与核酸的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)排他，(4)对对应于胸腺嘧啶的连续碱基poly(T)的并入效率良好，(5)并入后，通常可以实施利用分步的化学反应的序列确定法。
嘌呤基的7位存在的取代基，例如作为上述式A～C中的Y，优选为含有芳香族基团的取代基。作为芳香族基团，可以举出取代或未取代的芳香族烃基、取代或未取代的芳香族杂环基。
作为芳香族烃基，可以举出苯基、萘基、菲基、芴基、蒽基、芘基、2，3-二氢化茚基、四氢化萘基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、1，5-二氮杂萘基(naphthyridinyl)、2，3-二氮杂萘基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基(benzothienyl)、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基。
作为芳香族杂环基，可以举出吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、唑基等。
作为芳香族基团的取代基，例如可以举出：选自氟、氯、溴和碘的卤原子，羟基，取代或未取代的氨基，硝基，氰基，取代或未取代的碳原子数1～10的烷基，取代或未取代的碳原子数2～10的链烯基，取代或未取代的碳原子数3～10的环烷基，取代或未取代的碳原子数1～10的烷氧基，取代或未取代的烷氧羰基或羧基等。
作为芳香族基团，优选为碱性芳香族基团。作为碱性芳香族基团，可以举出吡啶基、吡咯基、咪唑基、联吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、中氮茚基、吲哚基、吲唑基、醌基、嘌呤基、吖啶基、菲咯啉基等，优选为吡啶基，特别是4-吡啶基。
在上述式A～C中，Y优选为具有以下式II或III表示的结构。
式中，波形线表示取代基的结合部位，即对亚乙烯基(C-C双键)、亚乙基(C-C单键)或亚乙炔基(C-C三键)的结合部位，R1和R2分别独立地是二价的有机基或直接结合，Z是有机基。
作为二价的有机基，优选地可以举出可以含有杂原子的取代或未取代的二价的烃基。作为二价的烃基，可以举出：链原子1～20、优选为链原子1～10、更优选为链原子1～6的饱和或不饱和的脂肪族烃基，例如链原子2～20、优选为链原子2～10、更优选为链原子2～6的亚烷基，链原子2～20、优选为链原子2～10、更优选为链原子2～6的亚链烯基，以及链原子2～20、优选为链原子2～10、更优选为链原子2～6的亚炔基；链原子3～20、优选为链原子3～10、更优选为链原子3～6的二价的脂环式烃基等。在上述烃基中，一部分碳可以被杂原子所取代。作为杂原子，可以举出氧原子、氮原子、硫原子、硅原子、磷原子。
这里，作为取代基，例如可以举出：选自氟、氯、溴和碘的卤原子，羟基，取代或未取代的氨基，硝基，氰基，取代或未取代的碳原子数1～10的烷基，取代或未取代的碳原子数2～10的链烯基，取代或未取代的碳原子数3～10的环烷基，取代或未取代的碳原子数1～10的烷氧基，取代或未取代的烷氧羰基或羧基等。
作为有机基Z，可以举出：芳香族基团，选自氟、氯、溴和碘的卤原子，羟基，取代或未取代的氨基(例如-NH-CO-CF3、-NH-C(NH)-NH2)，硝基，氰基，取代或未取代的碳原子数1～10的烷基，取代或未取代的碳原子数2～10的链烯基，取代或未取代的碳原子数3～10的环烷基，取代或未取代的碳原子数1～10的烷氧基，取代或未取代的烷氧羰基或羧基等。有机基Z优选为芳香族基团，进一步优选为碱性芳香族基团，特别优选为吡啶基。
具体地，优选为选自以下的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸，特别是A3a～A3d、尤其优选A3d表示的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸。A3a～A3d、特别是A3d表示的7-取代基-脱氧核糖核苷酸三磷酸在如下方面是优异的：(1)对荧光素酶的底物性与ATP相比为1/1000以下，(2)与核酸的胸腺嘧啶(T)互补，(3)与核酸的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)排他，(4)对对应于胸腺嘧啶的连续碱基poly(T)的并入效率良好，(5)并入后，通常可以实施利用分步的化学反应的序列确定法。
使用本发明的上述核酸底物的核酸分析方法，是包含如下工序的核酸分析方法：将核酸试样作为模板，加入对应于碱基AGTC的互补核酸底物进行互补链合成的工序，通过酶由经该互补链合成生成的焦磷酸来生成ATP的工序，以及检测由荧光素酶反应产生的化学发光而判断互补链合成的有无的工序；优选为焦磷酸测序法。
本发明的核酸分析方法，通过由荧光素酶反应产生的化学发光，检测互补链结合至模板核酸试样的引物延长反应时生成的焦磷酸(PPi)。这种由荧光素酶催化的化学发光反应，作为迅速、高灵敏度地测定ATP的方法而为人所知，也被称为荧光素·荧光素酶反应，是依赖ATP的反应。荧光素和ATP发生反应，生成腺苷酸荧光素，该腺苷酸荧光素在荧光素酶的存在下通过氧化脱羧反应被分解，在该反应过程中得到的一部分能量作为发光这样的反应而表现出来。可以通过对这种发光进行定量而对ATP进行定量。
互补链合成的结果产生的焦磷酸(PPi)，通过ATP生成酶被转化为ATP。通过以ATP作为底物并使催化化学发光反应的荧光素酶共存，可以检测与生成的ATP依存的化学发光。
由焦磷酸生成ATP的ATP生成酶，可以使用ATP硫酸化酶、丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)或苯丙氨酸消旋酶。另外，核酸试样可以是DNA、RNA中的任意一种。可以对DNA进行单链、双链的两方的分析，在以双链DNA作为模板的情况下，可以在变性为单链的前处理工序后进行本发明的方法。此外，对于RNA，可以采用本发明的方法对逆转录反应后得到的产物进行分析。使用微量的DNA的情况，可以使用通过PCR反应扩增得到的延长产物(扩增核酸片段)；使用微量的mRNA的情况，可以使用基于PCR的寡聚(G)加尾(PCR-based oligo(G)-tailing)法(Y.Y.Kusov等，Nucleic Acids Res，29，e57(2001))进行反应而得到的产物。以下，记载了本发明的核酸分析方法的顺序的一个例子。
首先，将引物杂交至测定对象的核酸试样，进行互补链合成反应(通常是通过DNA聚合酶进行的互补链合成反应)。此时，依次一种一种地加入作为核酸底物试剂的脱氧核糖核苷酸三磷酸(或其衍生物)溶液，仅在发生互补链合成反应的情况下产生PPi。产生的PPi，在APS(腺苷酰硫酸)存在下通过ATP硫酸化酶，或者在AMP(5′-腺苷酸)和PEP的存在下通过丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)，转化为ATP。转化得到的ATP，在镁离子和O2(氧)存在下，用于利用荧光素酶的荧光素的氧化反应，进行发光。由此，顺次重复加入核酸底物试剂，在检测发光的有无的同时，可以确定每一种碱基的碱基序列(参考Ahmadian A等，Analytical Biochemistry 280(2000)103-110和Zhou G等，Electrophoresis 22(2001)3497-3504)。核酸底物试剂，优选为按照最终浓度为1～10μM、优选为2～4μM添加。
由于互补链合成反应后剩余的核酸底物或其衍生物干扰测定，因此优选通过酶分解等及时除去。作为可用的酶，可以举出腺苷三磷酸双磷酸酶和焦磷酸酶(PPase)等。此外，用于互补链合成的DNA聚合酶，优选为除去了外切酶活性的克列诺片段(Klenow fragment)。从酶活性和互补链合成反应的观点考虑，优选将反应液调整为pH7.0～8.0、温度30～45℃的范围。进一步地，优选预先将微量的焦磷酸酶等酶添加至试剂，事先除去作为背景的原因的试剂中含有的PPi、ATP。
以下通过列举实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例
(实施例1)新颖的核酸底物的合成
就核酸底物dATP而言，在核苷酸三磷酸的核糖的1′具有在6位具有氨基的嘌呤基。这里，将在6位具有氨基的嘌呤基称为腺嘌呤基。腺嘌呤基与胸腺嘧啶基互补地发挥的选择的结合性，是通过涉及嘌呤基的1位的氮和6位的氨基的氢键而形成的。因此考虑：作为可用于核酸延长的候选底物，在嘌呤基的6位必须存在氨基的条件下，对其它部分进行修饰是重要的。进一步地，嘌呤基的1位和6位是对互补链结合作出贡献的部分，因此要在与之远离的部分进行修饰。由此，如下所述，合成了多种在嘌呤基的7位和8位进行了修饰的脱氧核苷酸三磷酸。以下记载了合成方法。
这次，本发明人等合成了图1的11种新颖的候选核酸底物，并评价了其特性。11种各自可以按照如下进行分类。A3a～A3d这4种(以后称为A种)，是经由亚乙烯基(C-C双键)将取代基修饰到嘌呤基的7位的系列。B3～B5这3种(以后称为B种)，是经由亚乙基(C-C单键)将取代基修饰到嘌呤基的7位的系列。C2和C3(以后称为C种)，是经由亚乙炔基(C-C三键)将取代基修饰到嘌呤基的7位的系列。D2和D3(以后称为D种)，是经由亚乙炔基(C-C三键)将取代基修饰到嘌呤基的8位的系列。每种物质各自的合成方法如下所述。
A种的合成方法(流程)示于图2。A种的合成方法如下。
<A1的合成>
将真空干燥过的7-脱氮次黄嘌呤(1.00g，7.4×10-3mol，分子量135.13)加到PoCl3(10mL，0.11mol，分子量153.3，15当量)，在115℃的油浴中回流45分钟。反应完成后，减压蒸馏除去，向残渣中加入少量的冷水，淬灭反应。将该溶液溶于乙醚，以蒸馏水洗涤。有机相以无水硫酸镁干燥后，吸滤，减压蒸馏除去滤液，得到目标物1。
加入干燥的DMF(38mL)使真空干燥过的目标物1(1.03g，6.92mmol，分子量153.57)悬浮，加入N-碘代丁二酰亚胺(1.71g，7.62mmol，1.1当量)的干燥DMF溶液(30mL)，在氩气环境中室温搅拌3小时。减压蒸馏除去反应液后，将残渣溶解于乙酸乙酯(70mL)，以饱和碳酸氢钠水(30mL)洗两次。以无水硫酸镁干燥后，吸滤，减压蒸馏除去滤液。将残渣溶于乙酸乙酯(10mL)，加入二氯甲烷，进行重结晶。对其进行吸滤，得到目标物2。以硅胶柱色谱(硅胶60，40～50μm，0～3％甲醇/乙酸乙酯)精制滤液，得到目标物2。
将真空干燥过的目标物2(1.932g，6.97mmol，分子量279.47)悬浮于干燥的乙腈(100mL)中，在氮气环境下加入氢化钠(60％在油中，7.61mmol，1.1当量)，室温下搅拌30分钟。用20分钟慢慢加入1-(α)-氯-3，5-二-O-(对甲苯酰)-2-脱氧-D-核糖(3.76g，9.69mmol，1.4当量)，室温下搅拌2小时。减压蒸馏除去反应液，将残渣溶于二氯甲烷(200mL)中，以碳酸氢钠水溶液洗涤。有机相以无水硫酸镁干燥后，过滤，减压蒸馏除去滤液。以硅胶柱色谱(硅胶60，40～50μm，25％甲醇/乙酸乙酯)对其进行精制，得到目标物3。
将目标物3(500mg，0.791mmol，分子量631.85)悬浮于饱和铵乙醇(アンモニウムエタノ一ル)溶液，在耐压容器中在65℃搅拌20小时，减压蒸馏除去反应液。将残渣溶于甲醇(30mL)，加入饱和氨水(30mL)，搅拌5小时，减压蒸馏除去反应液。将残渣溶于少量的甲醇，用己烷进行重结晶。对其进行吸滤，得到目标物4。
将真空干燥过的目标物4(300mg，0.780mmol，分子量376.15)溶于干燥的吡啶(5mL)，进行三次共沸，真空干燥一夜。氩置换后溶于干燥的DMF(6mL)，进行脱气。向其中顺次加入丙烯酸甲酯(30mL，0.33mmol，分子量86.09，420当量)、碘化亚铜(CuI，41mg，0.215mmol，0.2当量)、四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4，125mg，0.108mmol，0.1当量)、三乙胺(0.3mL，2.15mmol，2当量)，在65℃搅拌7小时。减压蒸馏除去反应液，以硅胶柱色谱(硅胶60，40～50μm，0～5％甲醇/乙酸乙酯)对其进行精制，得到油状的目标物5。
将目标物5(35mg，104μmol，分子量334.33)溶于1N的NaOH水溶液(4mL)，室温搅拌一夜。反应液以4N的HCl水溶液中和，将析出的结晶进行吸滤，得到目标物A1。
<A3a的合成>
将真空干燥并进行氩置换后的目标物A1(140mg，437μmol，分子量320.30)、Py BOP(273mg，524μmol，1.2当量)、HOBt·H2O(80mg，524μmol，1.2当量)用DMF(1mL)溶解，向其中加入DIPEA(761μl，4.37mmol，10当量)、2-苯乙胺(110μl，1.04mmol，2.0当量)，室温下搅拌3小时。减压蒸馏除去反应液，通过硅胶色谱进行精制，然后通过反相的中压柱再次进行精制，得到目标物A2a。
将核苷A2a(109mg，257μmol，分子量423.47)在DMF(2ml)中共沸后，加入N，N，N′，N′-四甲基-1，8-萘二胺(质子海绵(ProtonSponge)，82mg，385μmol，1.5当量)，干燥一夜。向其中加入磷酸三甲酯(1.5ml)使之溶解后，冷却至0℃。滴入磷酰氯(38μl，411μmol，1.6当量)，在0℃搅拌45分钟。进一步在0℃加入三丁胺(245μl，1.01mmol，4.0当量)和0.5M三丁基焦磷酸铵的DMF溶液(2.57mL，1.28mmol，5.0当量)，将反应液恢复到室温，反应1小时。加入1.0M三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0，4mL)和水(4mL)终止反应，减压蒸馏除去反应液。然后，将残渣溶于水，用乙醚洗2次，水相用DEAE-Sephadex A-25柱通过三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0)的盐浓度梯度(0.3～1.0M)缓冲液进行洗脱。将其以中压柱精制，得到目标物A3a。
<A3b的合成>
将真空干燥并进行氩置换后的A1(120mg，374μmol，分子量320.30)、Py BOP(234mg，449μmol，1.2当量)、HOBt·H2O(68mg，449μmol，1.2当量)用DMF(650μl)溶解，向其中加入DIPEA(650μl，3.74mmol，10当量)、2-(2-氨基乙基)吡啶(89μl，748μmol，2.0当量)，在室温下搅拌3小时。减压蒸馏除去反应液，通过硅胶色谱进行精制，然后通过反相的中压柱再次进行精制，得到目标物A2b。
将核苷A2b(100mg，235μmol，分子量424.45)在DMF(2ml)中共沸后，加入N，N，N′，N′-四甲基-1，8-萘二胺(质子海绵，75mg，352μmol，1.5当量)，干燥一夜。向其中加入磷酸三甲酯(1.5ml)使其溶解后，冷却至0℃。滴入磷酰氯(35μl，376μmol，1.6当量)，在0℃搅拌45分钟。进一步在0℃加入三丁胺(225μl，940μmol，4.0当量)和0.5M三丁基焦磷酸铵的DMF溶液(2.40mL，1.17mmol，5.0当量)，将反应液恢复到室温，反应1小时。加入1.0M三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0，4mL)和水(4mL)终止反应，减压蒸馏除去反应液。然后，将残渣溶于水，用乙醚洗2次，水相用DEAE-SephadexA-25柱通过三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0)的盐浓度梯度(0.3～1.0M)缓冲液进行洗脱。将其以中压柱精制，得到目标物A3b。
<A3c的合成>
将真空干燥并进行氩置换后的A1(150mg，468μmol，分子量320.30)、Py BOP(292mg，561μmol，1.2当量)、HOBt·H2O(86mg，561μmol，1.2当量)用DMF(817μl)溶解，向其中加入DIPEA(817μl，4.68mmol，10当量)、正丙胺(76μl，963μmol，2.0当量)，在室温下搅拌3小时。减压蒸馏除去反应液，通过硅胶色谱进行精制，然后通过反相的中压柱再次进行精制，得到目标物A2c。
将核苷A2c(109mg，301μmol，分子量361.40)在DMF(2ml)中共沸后，加入N，N，N′，N′-四甲基-1，8-萘二胺(质子海绵，97mg，451μmol，1.5当量)，干燥一夜。向其中加入磷酸三甲酯(1.5ml)溶解后，冷却至0℃。滴入磷酰氯(45μl，481μmol，1.6当量)，在0℃搅拌45分钟。进一步在0℃加入三丁胺(288μl，1.20mmol，4.0当量)和0.5M三丁基焦磷酸铵的DMF溶液(3.0mL，1.50mmol，5.0当量)，将反应液恢复到室温，反应1小时。加入1.0M三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0，4mL)和水(4mL)终止反应，减压蒸馏除去反应液。然后，将残渣溶于水，用乙醚洗2次，水相用DEAE-SephadexA-25柱通过三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0)的盐浓度梯度(0.3～1.0M)缓冲液进行洗脱。将其以中压柱精制，得到目标物A3c。
<A3d的合成>
将核苷A1(140mg，0.44mmol，分子量320)、Py BOP(274mg，0.53mmol，分子量520，1.2当量)和HOBt(82mg，0.53mmol，分子量153，1.2当量)一起真空干燥一夜。将其用少量DMF溶解，加入DIEPA(500μl，2.95mmol，6.7当量)，搅拌10秒钟，迅速加入4-(2-氨基乙基)吡啶(105μl，0.89mmol，分子量为122，1.83当量)，室温下搅拌1小时。反应后，减压蒸馏除去反应液，将残渣溶于甲醇，以中压柱进行精制，得到目标物A2d。
将核苷A2d(85mg，0.20mmol，分子量424)在DMF(6ml)中共沸2次，在乙腈(3mL)中共沸3次，真空干燥3小时后，加入N，N，N′，N′-四甲基-1，8-萘二胺(质子海绵，65mg，0.30mmol，1.5当量)，干燥一夜。在氩气环境下向其中加入磷酸三甲酯(1.5ml)溶解后，冷却至0℃。滴入磷酰氯(30μl，0.32mmol，1.6当量)，在0℃搅拌45分钟。进一步在0℃加入三丁胺(0.19mL，0.79mmol，4.0当量)和0.5M三丁基焦磷酸铵的DMF溶液(2.1mL，1.05mmol，5.0当量)，将反应液恢复到室温，反应1小时。加入1.0M三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0，4mL)和水(4mL)终止反应，减压蒸馏除去反应液。然后，将残渣溶于水，用乙醚洗2次，水相用DEAE-Sephadex A-25柱通过三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0)的盐浓度梯度(0.3～1.0M)缓冲液进行洗脱。将其以中压柱精制，得到目标物A3d。
<B种的合成>
以下，B种的合成方法(流程)示于图3。B种的合成方法如下。而且，直到目标物5的合成，和前面的记载相同。
将真空干燥过的目标物5(262mg，0.78mmol，分子量336)溶于干燥的甲醇(30mL)中，加入氧化铂(IV)(10mg，0.044mmol，分子量227.08)，将H2充入气球，吹入的同时在室温下搅拌2小时。反应液自然过滤，减压蒸馏除去滤液，以硅胶柱色谱(硅胶60，40～50μm，10％甲醇/二氯甲烷)进行精制，得到目标物B1。
将核苷B1(36mg，0.11mmol，分子量336.33)和DMAP(1.31mg，0.011mmol，分子量122.17，0.1当量)真空干燥一夜，加入1，6-己二胺(125mg，1.1mmol，10当量)的干燥的甲醇(0.8mL)溶液，在52℃回流24小时。反应完成，因而减压蒸馏除去反应液。接下来，为了尽量除去大量含有的1，6-己二胺，进行再沉淀。将残渣溶于甲醇(1mL)，在冰冷却下搅拌并慢慢滴入乙醚(45mL)，使沉淀析出。对其进行吸滤，得到含有目标物的浅褐色粉末70mg。将该粗生成物的粉末(70mg，0.17mg，分子量420.51)溶于甲醇(1.4mL)，加入三乙胺(0.092mL，0.68mmol，4当量)和三氟醋酸乙酯(0.2mL，1.7mmol，10当量)，在室温下搅拌13.5小时。因为反应未完成，所以补加三氟醋酸乙酯(0.2mL，1.7mmol，10当量)，在室温下搅拌1小时。减压蒸馏除去反应液，以硅胶柱色谱(硅胶60，40～50μm，3～12％甲醇/氯仿)进行精制，得到浅褐色的粉末目标物B2。
将核苷B2(106mg，0.21mmol，分子量516.51)在DMF(6ml)中共沸2次，在乙腈(3mL)中共沸3次，真空干燥3小时后，加入N，N，N′，N′-四甲基-1，8-萘二胺(质子海绵，66mg，0.31mmol，1.5当量)，干燥一夜。在氩环境气体下向其中加入磷酸三甲酯(1.47ml)使之溶解后，冷却至0℃。滴入磷酰氯(31μl，0.33mmol，1.6当量)，在0℃搅拌45分钟。进一步在0℃加入三丁胺(0.20mL，0.82mmol，4.0当量)和0.5M三丁基焦磷酸铵的DMF溶液(2.12mL，1.0mmol，5当量)，将反应液恢复到室温，反应1小时。加入1.0M三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0，4mL)和水(4mL)终止反应，减压蒸馏除去反应液。然后，将残渣溶于水，用乙醚洗2次，水相用DEAE-SephadexA-25柱通过三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0)的盐浓度梯度(0.3～1.0M)缓冲液进行洗脱。将其以中压柱精制，得到目标物B3。
将核苷酸B3(830μL，74.60D260nm，5.0×10-6mol，分子量756.44)加入到4N氨水(5mL)中，在室温下搅拌2小时。反应完成后，减压蒸馏除去反应液，通过中压柱对残渣进行精制，得到目标物B4。
在冷冻干燥过的B4(350D260nm，440μmol，分子量660.45)中加入1.0MTB1/DMF(513μL，0.513mmol，220当量)，进行溶解。加入TEA(0.143mL，1.03mmol，440当量)，在室温下搅拌7小时。反应完成后，减压蒸馏除去反应液，以高效液相色谱进行精制，得到目标物B5。
<C种的合成>
以下，C种的合成方法(流程)示于图4。C种的合成方法如下。而且，直到目标物4的合成，和前面的记载相同。
将真空干燥过的目标物4(100mg，0.27mmol，分子量376.15)和TN2(314mg，1.33mmol，5当量)溶于干燥的DMF(4mL)，以液氮进行冷却，以油泵进行4次脱气。向其中顺次加入碘化亚铜(CuI，64mg，0.37mmol，1.26当量)、四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4，62mg，0.053mmol，0.2当量)、三乙胺(0.074mL，2当量)，在35℃搅拌7小时。减压蒸馏除去反应液，以硅胶柱色谱(硅胶60，40～50μm，3～10％甲醇/二氯甲烷)对其进行精制，减压蒸馏。残渣以中压柱进行精制。以反相柱脱盐，得到目标物C1。
将核苷C1(95mg，0.20mmol，分子量484.4)在DMF(6ml)中共沸2次，在乙腈(3mL)中共沸3次，真空干燥3小时后，加入N，N，N′，N′-四甲基-1，8-萘二胺(质子海绵，63.3mg，0.30mmol，1.5当量)，干燥一夜。在氩环境气体下向其中加入磷酸三甲酯(1.5ml)使之溶解后，冷却至0℃。滴入磷酰氯(29.3μl，0.32mmol，1.6当量)，在0℃搅拌45分钟。进一步在0℃加入三丁胺(0.19mL，0.79mmol，4.0当量)和0.5M三丁基焦磷酸铵的DMF溶液(1.97mL，0.99mmol，5.0当量)，将反应液恢复到室温，反应1小时。加入1.0M三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0，4mL)和水(4mL)终止反应，减压蒸馏除去反应液。然后，将残渣溶于水，用乙醚洗2次，水相用DEAE-SephadexA-25柱通过三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0)的盐浓度梯度(0.3～1.0M)缓冲液进行洗脱。将其以中压柱精制，得到目标物C2。
将核苷酸C2(700μL，700D260nm，4.6×10-6mol，分子量725.44)加入到4N氨水(5mL)中，在室温下搅拌2小时。反应完成后，减压蒸馏除去反应液，通过高效液相色谱对残渣进行精制，得到目标物C3。
<D种的合成>
最后，D种的合成方法(流程)示于图5。D种的合成方法如下。
将真空干燥过的8-溴-2′-脱氧腺嘌呤(100mg，0.30mmol，分子量330.14)和TN2(357mg，1.5mmol，5当量)溶于干燥的DMF(4mL)，以液氮进行冷却，以油泵进行4次脱气。向其中顺次加入碘化亚铜(CuI，72.6mg，0.38mmol，1.26当量)、四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4，70mg，0.06mmol，0.2当量)、三乙胺(0.05mL，2当量)，在35℃搅拌7小时。减压蒸馏除去反应液，以硅胶柱色谱(硅胶60，40～50μm，3～10％甲醇/二氯甲烷)进行精制，减压蒸馏。残渣以中压柱进行精制。以反相柱脱盐，得到目标物D1。
将核苷D1(78mg，0.16mmol，分子量485.4)在DMF(6ml)中共沸2次，在乙腈(3mL)中共沸3次，真空干燥3小时后，加入N，N，N′，N′-四甲基-1，8-萘二胺(质子海绵，51.8mg，0.24mmol，1.5当量)，干燥一夜。在氩环境气体下向其中加入磷酸三甲酯(1.16mL)溶解后，冷却至0℃。滴入磷酰氯(37.4μl，0.40mmol，1.6当量)，在0℃搅拌45分钟。进一步在0℃加入三丁胺(0.16mL，0.64mmol，4.0当量)和0.5M三丁基焦磷酸铵的DMF溶液(1.61mL，0.81mmol，5.0当量)，将反应液恢复到室温，反应1小时。加入1.0M三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0，4mL)和水(4mL)终止反应，减压蒸馏除去反应液。然后，将残渣溶于水，用乙醚洗2次，水相用DEAE-SephadexA-25柱通过三乙基碳酸氢铵水溶液(pH8.0)的盐浓度梯度(0.3～1.0M)缓冲液进行洗脱。将其以中压柱精制，得到目标物D2。
将核苷酸D2(100μL，100D260nm，1.7×10-6mol，分子量725.44)加入到4N氨水(5mL)中，在室温下搅拌2小时。反应完成后，减压蒸馏除去反应液，通过高效液相色谱对残渣进行精制，得到目标物D3。
(实施例2)荧光素酶底物特异性评价
针对合成的核酸底物，按照以下顺序进行是否成为荧光素酶的底物的评价。首先，根据表1所示的条件制备发光试剂。
表1 发光试剂组成
  组成  发光试剂条件1  发光试剂条件2   发光试剂条件3
  Tricine  25mM  25mM   25mM
  EDTA  0.5mM  0.5mM   0.5mM
  醋酸镁(Mg-Acetate)  5mM  5mM   5mM
  DTT  0.5mM  0.5mM   0.5mM
  ATP硫酸化酶  2U/mL  2U/mL   2U/mL
  荧光素酶  262GLU/mL  131GLU/mL   131GLU/mL
  荧光素  0.4mM  0.4mM   0.4mM
  APS  0.002mM  0.002mM   0.002mM
  腺苷三磷酸双磷酸酶  1U/mL  1U/mL   1.5U/mL
将该发光试剂20μL作为反应溶液，向其中注入评价对象核酸底物0.2μL，评价此时产生的发光。图6表示作为底物，分别注入ATP、dATP、C7dATP和dATPαS的情况的发光量。横轴(C)是反应试剂中的最终浓度，例如分注1μM的底物0.2μL时，其最终浓度约为0.01μM。纵轴的发光量(U)，将ATP的0.01μM时的发光量规定为1进行表示。由该图可知，发光量(U)和最终浓度(C)存在比例关系。因此，作为荧光素酶的底物特异性(或底物反应性)，按照如下所述定义为表示每单位浓度的发光量的数值(S)。
底物特异性(S)≡发光量(U)/最终浓度(C)[μM]×0.01
(在该定义中，ATP的底物特异性被规定为1)
关于合成的核酸底物，如上测定的对于荧光素酶的底物特异性的结果示于图7。图的左侧4点分别表示ATP、dATP、dATPαS和C7dATP的底物特异性(S)。在以焦磷酸测序法为代表的利用分步的化学反应进行的序列确定法中，在靶物质全部延长了的情况下，由1个碱基的延长中所产生的焦磷酸生成的ATP的量，与反应溶液中存在的靶物质的量相等。另外，关于多个碱基的延长，将是该多倍。一般地，为了确定序列而每次分注的核酸底物的量，必须是分析的靶物质量的约100倍左右。这样实施的原因是：偶尔会有在序列确定部位连续存在10个碱基左右的相同碱基的情况，并且在该序列确定法的反应溶液中，底物分解酶共存，核酸延长和底物分解竞争。如果由于底物的不足而延长没有完成，则不能实施接下来的序列分析，会产生分析误差的扩大、无法分析。作为预防，一般地，优选每次分注使用的靶物质量的约100倍左右的底物。
如上，为了准确地测定由1个碱基的延长所产生的ATP的发光，分注的核酸底物的底物特异性(S)相对于ATP为1/1000以下是理想的。以往使用的拟核酸底物中，dATPαS具有相对于ATP为1/10000以下的优异底物特异性。另一方面，C7dATP相对于ATP约为1/250左右，不满足理想的条件即1/1000以下。因此，可以预计来自C7dATP的背景发光会影响序列分析的准确度。
下面，对本实施例合成的核酸底物的评价结果进行说明。首先，由图7可知，为了降低对于荧光素酶的底物特异性，作为修饰基，优选使用亚乙烯基(C-C双键)、或亚乙基(C-C单键)。
而且，在本实施例中，以液相色谱对合成的核酸底物进行精制，但是对于合成时混入的焦磷酸的除去，仅采用液相色谱有时不是很充分。这种情况下，本发明人等，通过以焦磷酸分解酶(PPase)对合成核酸底物进行处理，从而分解了焦磷酸。具体地，将合成核酸底物用反应溶液(100mM Tris-醋酸盐(Tris-Acetate)，0.5mM EDTA，5mM醋酸镁(Mg-Acetate)，1mM DTT，pH7.5)稀释为浓度500μM，按照形成0.2mU/μL那样加入PPase，在温度30℃反应30分钟，从而分解了溶液中的焦磷酸。该方法是一个例子，由于确实地分解核酸底物中的焦磷酸，对于正确的底物特异性(S)的评价和准确度良好的序列确定是有效的。而且，对于比较实验中所使用的ATP、dATP、dATPαS和C7dATP，也同样地实施含有的焦磷酸的除去再进行评价。
(实施例3)对核酸的并入性能的评价
作为代替dATP的核酸底物，具有以下必要条件。
(1)可以进行与碱基T的互补的结合(具有亲和性)。
(2)与碱基G、碱基C、碱基A是排他的。
(3)对于碱基T的连续，可以被连续并入。
按照如下那样确认了这些条件。下面记载的是评价中所用的寡聚DNA的序列。序列的左端是5′末端，右端是3′末端。
序列TG(序列号1)：
gactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgttggcg taggcaagag tgccttgacgatacagctaa ttc
序列GA(序列号2)：
gactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctagtggcg taggcaagag tgccttgacgatacagctaa ttc
序列CG(序列号3)：
gactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgctggcg taggcaagag tgccttgacgatacagctaa ttc
序列AG(序列号4)
gactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgatggcg taggcaagag tgccttgacgatacagctaa ttc
序列5T(序列号5)
acgttttttggcg taggcaagag tgcctt
序列P(序列号6)
aaggc actct tgcct acgcc a
这里，序列P是引物。它能够与上述序列的下划线部分互补地结合。其它的序列表示：在引物互补结合了的情况下，在引物的3′末端延长的情况下被并入的碱基的模板序列。例如，序列TG表示引物的3′末端延长的部位的模板碱基，即与引物结合的部分的5′侧连接的序列是T和G。另外，同样地，序列5T表示与引物结合的部分的5′侧连接的序列是5个连接的T。
对于向核酸的并入，按照如下那样评价。将上述序列中的一种作为靶物质，使之与引物互补结合，针对该试样，实施使用各核酸底物的延长实验。合成的核酸底物与碱基T的亲和性(互补性)以及与其它碱基(G、C、A)的排他性是必需的。与碱基T的亲和性，使用序列TG与引物进行了评价。与其它的碱基(G、C、A)的排他性，分别使用序列GA、序列CG、序列AG与引物进行了评价。另外，对于向碱基T的连续并入性能，使用了序列5T。
利用分步的化学反应的序列确定法，如下所述。首先，在5μL的杂交用缓冲液(10mM Tris-醋酸盐，20mM醋酸镁(Mg-Acetate)，pH7.75)中，混合超纯水35μL、分析对象(靶物质)寡聚DNA(10μM)以及引物(20μM)各5μL(试样溶液：最终容量50μL)，在94℃过热20秒后，在引物的Tm温度下反应2分钟。将该试样溶液0.5μL(靶物质0.5pmol，引物1pmol)、表1的条件2所示的发光试剂20μL、以及聚合酶0.2μL(最终浓度：0.05U/μL)混合，作为反应试剂(最终容量20.7μL)。向该反应试剂中注入100μM的核酸底物0.4μL(最终浓度2μM)，在产生了核酸延长时，可以观测来自于其延长反应产物焦磷酸的生物发光。该反应按照图13(2)所示的化学反应式，显示出从反应开始的数秒后具有发光峰，其后逐渐衰减的形状的发光曲线。该发光峰值与产生的焦磷酸的量具有大致成比例关系，因此通过测定峰值，可以评价核酸延长的程度。
图8是使用序列TG作为靶物质，评价合成底物与碱基T的亲和性的结果。靶物质81和引物82，如图8(1)那样进行互补链结合。加入的合成底物，在可以与碱基T84互补地结合的情况下，在引物的3′末端碱基即碱基A83结合、延长。由延长而产生的焦磷酸，通过图13(2)的化学反应转化为ATP，诱导荧光素酶发光。在本实验中，其后，分注dCTP。这是为了确认：反应引物的3′末端因延长而成为合成底物后，分注与相邻的碱基即碱基G85互补的底物即dCTP，底物向合成底物末端的并入是否如通常那样正常进行。图8(2)～(4)是对荧光素酶发光的发光量进行评价的结果。左部分是分注各种合成底物时的发光量，右部分是其后分注dCTP时的发光量。这里，发光量是将使用现有技术dATPαS的情况的1个碱基的发光量811和821设为1，以此为基准来表示的。另外，各底物的背景发光成分，取差分进行校正。使用各合成碱基的情况下的发光，A3a、A3b、A3c和A3d分别为812、813、814和815。此外，向这些试样中继续分注dCTP时的发光量分别为822、823、824和825。
结果，教导了以下的内容。首先，由图8(2)可知，A种的4个合成底物，与使用现有技术dATPαS的情况相同，可以作为对碱基T互补的底物来应用。还可以知道，其中，底物A3c不同于其它的底物，发光量高10～20％左右。这是因为，与其他底物相比，底物A3c的核酸延长反应速度更快。图9是对dATPαS和A3c的发光曲线进行比较的图。虚线91是dATPαS的曲线，实线92是A3c的曲线。为比较方便，将两者的最大值规定为1进行图示。由此可知，A3c的上升曲线陡峭，反应速度快。本反应由于是来自于由核酸延长供给的焦磷酸的发光以及由腺苷三磷酸双磷酸酶分解酶引起的底物分解所导致的消光的竞争反应，因此，上升速度越快则越对抗腺苷三磷酸双磷酸酶分解，发光在竞争中获胜，因此发光最大值变高。其结果，可以看出，A3c发光量比其它的底物高10～20％左右。
下面，由图8(3)可知，与A种同样，底物B种可以作为对应于碱基T的互补的底物来应用，但反应速度比较慢。另外，由图8(4)可以确认，底物C种也同样地可以作为对应于碱基T的互补的底物来应用。最后可知底物D种不延长。虽然还不清楚是不作为对应于碱基T的互补的底物而起作用，还是与3′末端相连的能力低，但不管怎样，其不能作为对应于碱基T的互补的底物来应用是可知的。底物D种是在嘌呤体的8位进行了修饰的合成底物，可以知道8位修饰体不适用于本目的。
下面，关于各合成底物，分别使用序列GA、序列CG、序列AG和引物，评价与其它碱基(G、C、A)的排他性。结果示于图10。各发光量是，将使用与序列GA、序列CG和序列AG分别具有亲和性的底物dCTP 1001、dGTP1002和dTTP 1003时的发光量设为1，以此为基准来表示的。另外，与前面的图相同，背景发光成分取差分进行校正。
结果，得知了以下内容。关于A种，可以看到A3a对全部3种碱基的发光(101、102和103)，A3c对于碱基G的排他性有些差(104)，但是总体良好。碱基A3b(105、106、107)和A3d(108、109、110)排他性优异，好于现有技术的dATPαS。碱基A3b和A3d，两者均是“作为取代基，经由亚乙烯基(C-C双键)将含有碱性的芳香族的取代基修饰在嘌呤基的7位而成的碱基”。B种对于碱基C的排他性稍低，可以看到B4的发光(104)，但总体良好。可知C种和D种排他性良好。但是，关于D种，如前所述，即使是碱基T的情况，亲和性也不好，因此推定碱基本身延长性能低。
下面，使用序列5T，如以下那样评价各合成底物的向连续碱基T的并入性能。反应试剂的制备与前面的评价延长1个碱基时的制备相同，使用序列5T作为靶寡聚物。这种情况下，靶寡聚物111和引物112，如图11(1)那样进行互补链结合。因此，一旦将作为底物的dATP分注到该反应试剂中，则按照连接到引物的3′末端113的方式，每1靶分子连接延长5分子的底物，并释放5分子的焦磷酸。如果不完成全部5个碱基的量的延长，则残留单链状态的碱基T部分。因此，如果再次分注底物dATP，则只有在残存有未延长部分的情况下，该部分产生延长，焦磷酸放出作为发光而被检测出来。这次，为了评价各种合成底物的向连续碱基的连接延长性能，连续3次地实施合成底物(最终浓度2μM)向反应试剂的分注。另外，继续分注2次与碱基G114互补的底物dCTP，进行发光检测，在并入了5个碱基的合成底物的状态下，验证是否也会产生连接延长。其结果示于图11(2)和图11(3)。图11(2)是关于A种合成底物的评价结果。另外，图11(3)是关于B种合成底物的评价结果。纵轴的发光量是，将进行使用dATP作为底物的延长，然后使用dCTP实施碱基G的互补链延长时的dCTP并入延长引起的发光量设为1来规定的。
结果，教导以下的内容。首先，使用底物dATPαS的延长中，即使在第3次的分注中也能检测到来自于未延长的发光。即，可以知道存在以下问题：现有技术的dATPαS在连续并入延长时发生未延长。另一方面，在使用A种的4种合成底物的评价中，在第2次分注时，仍可以看到来自于未延长的发光，但其量与dATPαS的情况相比较小。进一步地，在第3次分注时，几乎看不到来自于未延长的发光。因此可知，通过到第2次的反应，5个连续碱基T部分的延长基本完成。此外可知，其后的dCTP分注时的信号也可以检测1个碱基的量的延长，A种合成底物代替dATP充分发挥作用。另一方面，由图11(3)可知，对于B种，连续并入没有完全进行。具体地，可以推断，分注B种底物时的发光量低，并且其后的dCTP分注时完全看不到发光，因此，对于靶寡聚物中，5个连续碱基完全的互补链延长的序列几乎不存在。结果，A种合成底物能够适于作为dATP的替代物。
下面，使分注的底物的量为上述的2倍量(最终浓度4μM)，进行相同的实验。可以知道，通过使底物分注量为2倍，未延长现象有些缓和。其理由如下。如图13(2)和图13(3)所示，利用分步的化学反应的序列确定法为，底物向靶DNA的并入和由腺苷三磷酸双磷酸酶引起的底物分解在反应试剂中竞争而进行。在如连续碱基那样需要大量碱基的情况下，未延长现象是由于延长完成前进行底物分解而发生的。因此，如果注入的底物量增加，则底物分解所需要的时间也增加，因此底物容易完成。但是，底物量的增加由于增加底物分解的负担，因此容易产生未分解底物的残留，产生新的问题(提前预知(先読み，look-ahead)等)。通常，在本发明人等的试剂条件下，底物分注适合最终浓度2～4μM左右，更多的分注会产生未分解底物的残留。因此，在最终浓度4μM以下经1次分注完成延长是理想的。本实验的结果示于图12。由此教导以下的内容。首先，在使用dATPαS的延长中，尽管使底物量为2倍，但在第3次的分注中，仍检测到来自于未延长的发光。因此可知，现有技术的dATPαS，在5个碱基连续延长中，不可能避免未延长的问题。另一方面，在使用合成底物A种的研究中，可以减少来自于第2次分注时的未延长的发光。即，可以说，A种仅通过第1次分注就可以基本完成5个连续碱基延长。这里，以下式定义未延长率E，将各底物的未延长形成表2。
第1次分注后的未延长率(E1)＝(第2～3次的发光量)/(1～3次的发光量之和)
第2次分注后的未延长率(E2)＝(第3次的发光量)/(1～3次的发光量之和)
表2.5个连续碱基未延长率
由此，A种第1次分注后的未延长率为15％以下，特别是A3a、A3c和A3d这3种第1次分注后的未延长率为4％以下。另外，A3a、A3c和A3d这3种在2次分注的情况下，未延长率可以被抑制到约1％左右。另外，对于A3b，通过2次分注，也可以将未延长率降低至2％左右。因此，可以看出，过去以来成为问题的、使用dATPαS时的延长抑制，可以通过本发明的合成底物得到解决。另外，由图12(2)可知，底物B种在连续延长上仍存在问题。
由以上可以判明，A种，即“经由亚乙烯基(C-C双键)用取代基对嘌呤基的7位进行修饰后的底物”，将背景发光抑制至实用水平，并且作为连续并入时延长性能良好的dATP替代底物是有效的。特别是A3d，在全部的研究中均表现出良好的性能。
以下，利用开发的底物，实际实施碱基序列分析。图15是在利用分步的化学反应的序列确定法中，用合成碱基A3d代替dATP进行序列分析的结果(热解图)。实施了分析的寡聚序列S1和引物P2如下。
序列S1(序列号7)：
gatttgggat agaggagcat tagttgcca ttaatccaggg tgcatgctgg tacttcaaca
序列P2(序列号8)：
tgttgaagta ccagcatgca c
其中，序列P2是引物。它能与上述序列S1的下划线部分互补地结合。另外，用于序列分析的试剂的条件示于表1的条件3。
图15的(1)是使用A3d(最终浓度2μM)的情况。另外，作为比较，使用现有技术的dATPαS(最终浓度2μM)的情况示于(2)。各图的下部表示注入的核酸底物的种类(注入碱基种类)。其中，以“A”表示的底物分别为，(1)为A3d，(2)为dATPαS。另外，上部表示向本寡聚物中并入的碱基种类。即，是在寡聚物序列S1中，自引物P2互补结合的部分(S1序列的下划线部分)起，在上游侧相连的互补链序列。例如，与引物P2的3′末端相连的碱基是序列S1的下划线部分的左侧，成为2个连续的碱基G。因此，该互补链序列形成2个连续的碱基C，如图15，“CC”成为起始。另外，虚线是将得到的发光量转换为碱基量的基准值。例如，上述的“CC”中，可以观测2个碱基的量的发光，由其结果可知，碱基C被并入2个碱基。由图15可知，在本实验中，本发明的底物和现有技术的dATPαS，都可以针对分析对象的寡聚物进行序列分析。该寡聚物，连续碱基最大是2个碱基，因此看不到两者的差异。但是，A3d在连续碱基的并入性能优于dATPαS，因此考虑，碱基T的连续在连续试样的分析中是有效的。
因此，如以下那样，比较具有3个碱基T的连续序列的序列的分析。实施了分析的DNA序列S2和引物P3如下。
DNA序列S2(序列号9)：tgttgaagta ccagcatgca ccatggggga cgctgctcatcttcttaaag atttgatttt tctcccataa aatgtttttt ctctttctggtaggacaaat attggcaaat ttgacatgat ttgggataga ggagcattag ttgccattaa tccaggtgat cgcaaatggt aagtaatttt
序列P3(序列号10)：taatggcaac taatgctcct
其中，序列P3是引物。它能与上述DNA序列S2的下划线部分互补地结合。实施序列分析的结果示于图16～图20。另外，试剂条件汇总于以下的表3。
表3.发光试剂组成(利用PPDK)
  组成   发光试剂条件4
  Tricine   25mM
  EDTA   0.5mM
  醋酸镁(Mg-Acetate)   5mM
  DTT   0.5mM
  PPDK   33.8U/mL
  荧光素酶   523GLU/mL
  荧光素   0.4mM
  AMP   0.4mM
  腺苷三磷酸双磷酸酶   1U/mL
  PEP   0.08mM
在该实验中，作为将PPi转化为ATP的酶系统，如现有技术(专利文献4)记载的那样，利用的是通过PPDK将PPi和AMP转化为ATP的酶系统。图的标记与图15相同。各图的下部表示注入碱基种类，上部表示与分析对象的DNA序列互补地并入的碱基种类。底物按照“碱基A→T→C→G”的顺序分析分析7个循环。如靶序列所示，在本分析中，连续并入3个碱基A的位置存在2处(第4个循环和第7个循环)。因此，可以评价用作碱基A的核酸底物的连续并入性能的差异。以下，进行详细说明。
首先，最终浓度2μM条件下，用3种底物(A3d、dATPαS和C7dATP)，说明序列分析的结果(图16～图20)。图16是用本发明的底物A3d(最终浓度2μM)的序列分析结果。注入碱基种类A(以○圈起来)的分注时，使用A3d。如前面的实验(图7)，底物A3d与dATPαS比较具有高约1位数的底物特异性，因此，可以按照第1个循环的A的信号所示，观测背景发光。因此，背景发光部分的增加总是被碱基A的发光信号所包含。图中的●是与试样的碱基序列一致的延长发光。另一方面，对于与碱基序列不一致的主要的发光，以▽标记。图17是同样地使用dATPαS(最终浓度2μM)的序列分析结果。注入碱基种类A(以○圈起来)的分注时，使用dATPαS。将得到的热解图与试样的碱基序列进行比较。图中的●是与试样的碱基序列一致的延长发光。另一方面，对于与碱基序列不一致的主要的发光，以▽标记。图18是同样地使用底物C7dATP(最终浓度2μM)的序列分析结果。注入碱基种类A(以○圈起来)的分注时，使用C7dATP。如前面的实验(图7)，底物C7dATP与dATPαS比较具有高约2位数的底物特异性，因此，可以按照第1个循环的A的信号所示，观测到大的背景发光。因此，背景发光部分的增加总是被碱基A的发光信号所包含。图中的×是仅有该背景发光的信号。●是与试样的碱基序列一致的延长发光。但是(●)包含来自于延长的发光和背景发光两部分。另一方面，对于与碱基序列不一致的主要的发光，以▽标记。
比较图16～图18，可以得出如下结论。首先，作为第4个循环的3个连续并入性能的区别，可以举出如下几点。(1)在使用dATPαS的实验(图17)中，可以看到第4个循环的3个碱基延长信号的减少，可以类推发生了未延长。其结果，第4个循环的碱基T和第5个循环的碱基G等的信号也减少。进一步地，对于第7个循环的3个连续的碱基A和碱基T，也发生了信号的减少。(2)另一方面，在使用A3d的实验(图16)中，可以知道，虽然发现了几个噪音信号▽，但可以正确地进行直到第7个循环的碱基G的序列分析。(3)此外，在使用C7dATP的实验(图18)中，可以知道来自于底物的背景发光大，正确的序列鉴定很难。另外，第5个循环的碱基G和其后的第7个循环的碱基A(3个连续)等，可以发现被认为是延长不足的信号。
如上，可以知道，在使用dATPαS和C7dATP的实验中，dATPαS在连续碱基并入性能方面有问题，C7dATP在来自于高的背景发光的准确度变差方面有问题。另外，在C7dATP中，在第5个循环以后，也可以看到被认为是未延长的减少。因此，就上面两种底物而言，使仅针对碱基A的底物的最终浓度为2倍(4μM)来进行实验。图19和图20，分别是以最终浓度4μM使dATPαS和C7dATP作为碱基A来进行反应的实验结果。由此可以得出如下结论。
由图19可知，通过使分注的dATPαS为2倍量，可以改善未延长。但是，第5个循环的碱基A的信号接近于2个碱基的量，因此认为未延长没有完全消除，其在某种程度上包含在第5个循环的碱基A的信号中。另外，根据图20，在使C7dATP为2倍量的结果中，第5个循环的碱基G的未延长没有改善，背景发光由于与底物量的比例关系而变为2倍，结论是没有得到良好的结果。
上面的内容显示了在连续并入现象中本发明的核酸底物的有效性。
工业实用性
本发明在基因序列分析中，可以用作通过也利用荧光素酶发光的分步的化学反应的序列确定法的核酸底物试剂。通过也利用荧光素酶发光的分步的化学反应的序列确定法，不使用激发光而能进行分析，因此可适用于小型简易分析装置、大规模并列型分析装置。本发明的物质可用于那些分析装置。此外，本发明还可应用于使用标记的靶物质的DNA芯片分析技术、通过1个碱基延长的多型分析技术等。
符号说明
81：靶物质(核酸试样)
82：引物
83：碱基A
84：碱基T
85：碱基G
812：使用A3a的情况下的发光
813：使用A3b的情况下的发光
814：使用A3c的情况下的发光
815：使用A3d的情况下的发光
822：继续向A3a中分注dCTP时的发光量
823：继续向A3b中分注dCTP时的发光量
824：继续向A3c中分注dCTP时的发光量
825：继续向A3d中分注dCTP时的发光量
91：dATPαS的曲线
92：A3c的曲线
101～103：使用A3a的情况下的发光量
104：使用A3c的情况下的发光量
105～107：使用A3b的情况下的发光量
108～110：使用A3d的情况下的发光量
1001～1003：使用dCTP的情况下的发光量
1004：使用B4的情况下的发光量
111：靶寡聚物
112：引物
113：引物的3′末端
114：碱基G
131：碱基C
将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请原样引入本说明书作为参考。

Claims (5)

1.一种用于非诊断目的的核酸分析方法，其包含如下工序：
将核酸试样作为模板，加入对应于碱基AGTC的互补核酸底物进行互补链合成的工序，
由在该互补链合成中生成的焦磷酸通过酶而生成ATP的工序，以及
检测由荧光素酶反应产生的化学发光来判断互补链合成的有无的工序；
作为对应于碱基T的互补核酸底物，使用选自以下化合物A3a～A3d所示的化合物：
2.一种对应于碱基T的互补核酸底物试剂，其含有选自以下化合物A3a～A3d所示的化合物：
3.选自以下式子所示化合物的化合物：
4.以下式子表示的化合物：
5.用于焦磷酸测序法中的权利要求2记载的试剂。
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