CN1944682A - 碱基测序方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明的课题是，提供除去了在焦磷酸测序中成为问题的背景光的因素，使用微量的DNA样品进行高灵敏度且简便的DNA序列分析的方法。本发明提供了核酸分析方法，其包括：在含有试样核酸的反应液中，以所述试样核酸为模板进行互补链合成的工艺；使所述互补链合成中生成的焦磷酸在丙酮酸磷酸二激酶的共存下与30～800μM AMP反应生成ATP的工艺；以所述ATP作为反应底物进行荧光素酶反应的工艺；检测所述荧光素酶反应中产生的化学发光来判定有无互补链合成的工艺。本发明还提供用于核酸分析的试剂盒。

Description

碱基测序方法及试剂

技术领域

本发明涉及核酸分析方法及核酸分析试剂盒。更详细的是，涉及利用DNA互补链合成的DNA碱基测序及其使用的试剂盒。

背景技术

在DNA碱基测序中，利用凝胶电泳和荧光检测的方法被广泛使用。该方法中，首先将作为序列分析对象的DNA片段进行扩增。接着，以5′端为起点，制作各种长度的DNA片段，在3′端根据碱基种类附加波长不同的荧光标记。然后，通过凝胶电泳识别各荧光标记片段的相差1个碱基的长度的差异，同时由各自的片段组发出的荧光颜色指定3′端的碱基种类。由于DNA是从短片段组开始顺次通过荧光检测部，因此通过计测荧光颜色，就可以从短DNA开始顺次指定末端碱基种类，进行测序。利用该方法的荧光式DNA序列分析仪广泛普及，在人类基因组分析中也发挥了很大作用。

2003年，人类基因组序列分析宣告结束，迎来了将序列信息应用于医疗和各种产业的时代。最近的DNA分析中，不需要将长序列全部分析，只要知道目标特定区段的序列大多情况就足够了。因此，十分需要适于这样的短DNA序列分析的、简便的方法或装置。

作为适应这样的要求而产生的技术有，以焦磷酸测序为代表的利用阶段性互补链合成反应的测序方法。该方法中，使引物与作为靶物质的DNA链杂交，将4种互补链合成核酸底物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的每1种顺次加入反应液中，进行互补链合成反应。互补链合成反应发生时，会生成作为副产物的焦磷酸(PPi)。焦磷酸测序中，PPi在共存的ATP硫酸化酶(sulfurylase)的作用下与APS(腺苷酰硫酸，adenosine 5′-phosphosulfate)反应，生成ATP，该ATP在荧光素酶的共存条件下与荧光素反应，产生发光。因此，通过检测产生的发光，便可得知加入的互补链合成核酸底物被引入到DNA链，从而可以测定作为靶物质的DNA链的序列(参考非专利文献1)。为了使反应中没有被使用的互补链合成核酸底物不影响接下来的反应步骤，用三磷酸腺苷双磷酸酶等酶将其快速分解。但是，互补链合成的核酸底物中，由于dATP与发光底物ATP结构相似，与荧光素反应，成为产生背景光的原因，因此使用非发光底物的dATPαS等dATP衍生物代替ATP。

另一方面，随着DNA分析技术的普及，期待着性价比优良的方法。就降低DNA测序的成本来说，使用简便廉价的装置以及减少试剂成本是重要的。廉价的化学发光检测装置，可以通过使用光二极管作为检测器而实现(参考非专利文献2)。但是，以前的方法中，使用该装置进行DNA测序需要大量的DNA样品和试剂。即，由于使用光二极管的化学发光检测装置的检测界限与使用光电倍增管的系统相比，检测灵敏度低一个数量级，因此在fmol级的ATP检测中必须增加荧光素等发光试剂的量。

焦磷酸测序中，使DNA互补链合成中生成的PPi在ATP硫酸化酶的存在下与APS反应，检测源于所生成ATP的化学发光。但是，存在背景光时，得到的检测灵敏度不一定反映所生成ATP的量。例如，虽然与ATP相比反应效率为1/1000左右，但APS会成为荧光素酶的反应底物而发光。为了将互补链合成中生成的PPi高效地变换为ATP，通常是必须将5μM左右的APS加入到反应液中。反应液的体积为100μl时，5μM的APS会产生相当于500fmol的ATP的发光。所以，焦磷酸测序中，为了进行精度良好的DNA碱基测序，就必须使用皮可摩尔级的DNA样品和与其相适的大量的试剂。

由于荧光素酶浓度增加时发光量也增加，因此在检测微量ATP时为一种提高灵敏度的有效手段，但是对于焦磷酸测序的情况来说，APS或试剂中的杂质引起的背景光也同时变强，因此不能说是有效的方法。另外，由于减少使用的APS的量时，想要测定的信号也减少，因此，只要使用APS就不能降低检测界限，检测界限由APS浓度决定。

与以上的问题相关，作为不使用APS而从PPi生成ATP的方法，已知使用丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的方法。例如报导了在进行PCR时利用AMP和PPDK将生成的PPi变换为ATP后，通过荧光素-荧光素酶反应，检测发光的方法(参考非专利文献3)，或使用PPDK和AMP，通过其生物发光测定PPi，进行SNP分析的方法(参考非专利文献4)。进一步，公开了，生物发光试剂及使用该试剂的腺苷磷酸酯的定量法和参与使用该试剂的ATP变换反应体系的物质的定量法(参考专利文献1)。但是，这些都是使用了大量的DNA样品实施的，使用PPDK和AMP的能够进行微量DNA样品的分析或测序的方法还是未知的。

专利文献1：特开平09-234099号公报

非专利文献1：Electrophoresis 2001，22，3497-3504

非专利文献2：Measurement Science and Technology 13(2002)1779-1785

非专利文献3：K.Karasawa，et al.，2003年日本薬学会 要旨集 発表番号29[P1]-I-204

非专利文献4：E.Munakata，et al.，2004年日本薬学会 要旨集 発表番号29[P2]-I-311

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的课题是提供，除去在焦磷酸测序中成为问题的背景光原因，使用微量的DNA样品进行高灵敏度且简便的DNA测序的方法。

解决问题的技术方案

为了克服上述问题，本发明中，使不会成为荧光素反应底物的AMP在PPDK的存在下与焦磷酸(PPi)反应，生成ATP。进一步，指定试剂中含有的成为背景光原因的物质，使用PPase等酶降低它们引起的背景光。但是，利用化学发光的碱基测序(焦磷酸测序)中，由于4个酶反应是在同一个反应槽中竞争发生的，因此需要考虑这些反应而使条件最适化。例如，必须使反应溶液的pH、影响到几个反应的AMP浓度(由于AMP具有与dATP等相似的结构，因此大量共存时阻碍DNA互补链合成反应)最适化。另外，发明人等对于适用于焦磷酸测序中使用AMP和PPDK生成ATP的反应的最适条件进行了确定，完成了高灵敏度的序列分析方法。

发明的效果

ATP在生成反应后进行一次除去即可，但是由于dNTP的分解，PPi再次生成。发明人等，通过预先向试剂中添加微量的PPase(不妨碍测序的程度的PPase)，在测定前使PPi分解，确认可以实现高灵敏度的测定。另外，在由PPi生成ATP的反应中，通过使用不会成为发光底物的AMP可以大幅降低背景光。由此，使用与通常相比少一个数量级的0.1pmol以下量的DNA就可以进行碱基测序。另外，通过将共存的AMP浓度控制在特定范围内，可以防止对反应的其它妨碍，反复加入核酸底物，连续进行互补链合成而进行测序。由此，可以大幅削减DNA测序中使用的试剂量和费用。

如上，本发明通过使用不会成为荧光素反应的底物的AMP，分解在ATP生成反应和试剂中含有的ATP或PPi等，来除去由它们引起的背景光，实现了高灵敏度的DNA检测。通过由本发明提高检测灵敏度，能够采用使用具有廉价光检测器的DNA检测装置、将微量DNA放入微小反应室中进行DNA测序的微型DNA分析装置、进而使用具有大量微小反应室的大量DNA分析装置进行DNA测序，可实现高效的DNA分析。

附图说明

图1表示的是利用由阶段性互补链合成反应进行DNA碱基测序的原理(上)、以及在由PPi起始的ATP生成反应中使用AMP和PPDK的本发明的方法的概要(下)。

图2表示的是在由PPi起始的ATP生成反应中使用APS的以前的焦磷酸测序的概要。

图3表示的是使用本发明的方法进行测序的具体例子：图中，1碱基水平、2碱基水平、3碱基水平表示每个DNA中被一次引入的碱基的个数。

图4表示的是荧光素酶和PPDK活性的pH依赖性。

图5表示的是荧光素酶和PPDK活性的温度依赖性。

图6表示的是小型DNA测序装置的俯视图。

图7表示的是利用DNA互补链合成中得到的PPi生成ATP，进行荧光素发光反应时得到的信号强度变化和AMP浓度之间关系的图。图的横轴表示AMP在反应液中的浓度。

图8表示的是以前的方法中得到的信号强度和由本发明得到的信号强度的比较：可以得知本发明的方法中背景光非常小。

图9是变化荧光素酶的量时，表示信号强度和背景光信号强度的变化的图。

图10是表示对于微量DNA样品(TPMT基因PCR扩增的物质)，利用本方法进行测序的结果的图。

图11是变化温度条件时表示信号强度变化的图。

图12是对图11的结果的总结。

符号说明

101：焦磷酸测序的原理说明图

102：焦磷酸测序中进行的根据本发明的一系列酶反应

201：互补链延伸前的靶DNA和引物的复合体。引物链的长度为碱基长(n)。

202：互补链延伸反应后的靶DNA和引物的复合体。引物链延伸，成为碱基长(n+1)。

203：反应副产物PPi

301：注入互补链合成的核酸底物时观测到的化学发光的峰。因为注入的dNTP及反应中生成的ATP被三磷酸腺苷双磷酸酶分解，所以观测到的信号为峰状。

401：0.1M MES-NaOH缓冲液

402：0.1M HEPES-NaOH缓冲液

403：0.1M Bis-tris Propane-HCl缓冲液

404：0.1M Tricine-NaOH缓冲液

405：50mM MES-NaOH缓冲液

406：50mM Bis-tris Propane-HCl缓冲液

407：50mM MOPS-NaOH缓冲液

501：使用0.3M Tricine-NaOH缓冲液、pH7.8(含有0.2％BSA和甘油)反应10分钟后的活性

502：使用50mM Bis-tris Propane-HCl缓冲液(pH6.8)

601：控制试剂注入用气体压力管路

602：机架

603：试剂池

604：旋转基座

605：反应室 托盘

701：DNA互补链合成中得到的PPi引起的发光

801：使用以前方法时的信号强度

802：使用本发明的方法时的信号强度

803：使用以前方法时的化学发光的信号强度

901：使用以前方法时的背景光的信号强度

902：使用以前方法时的信号强度(包括背景发光)

903：使用根据本发明方法的体系时的背景光

904：根据本发明的方法的信号强度(包括背景光)

1001：使用5fm的DNA样品时利用本发明的方法的测序结果

1002：使用2.5fm时的利用本发明的方法的测序结果

具体实施方式

本发明涉及核酸分析方法，其包括：在含有试样核酸的反应液中，以所述试样核酸为模板进行互补链合成的工艺；使所述互补链合成中生成的焦磷酸(PPi)在丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的共存下与30～800μM AMP反应生成ATP的工艺；进行以所述ATP作为反应底物的荧光素酶反应的工艺；检测所述荧光素酶反应中产生的化学发光来判定有无互补链合成的工艺。

所述ATP生成工艺中，优选使PPi在AMP浓度为50～600μM的条件下进行反应。

所述互补链合成工艺中，可以将碱基AGTC对应的4种核酸底物或其衍生物的每一种顺次加入，也可以将两种以上同时加入，基于互补链合成的有无可以进行试样核酸的测序。

作为核酸底物，除dNTP外，也可以使用ddNTP。作为衍生物，例如可以举出dATPαS或ddATPαS。

由于互补链合成反应后剩余的核酸底物或其衍生物会妨碍测定，优选通过酶分解等将其快速除去。作为使用的酶，可以举出三磷酸腺苷双磷酸酶或焦磷酸酶(PPase)等。

丙酮酸磷酸二激酶和/或荧光素酶为，优选在40℃以上性能稳定的耐热性酶(例如，作为市售的荧光素酶有，Sigma公司制荧光素酶、キツコ一マン公司制LUC-H 61314(提取剂耐性)、同LUC-C 61313(高相对活性)、同LUC-T 61315(耐热性)，优选キツコ一マン公司制LUC-T 61315(耐热性))。另外，互补链合成中使用的DNA聚合酶优选为除去核酸外切酶活性的克列诺夫片段(Klenow fragment)等。

从酶活性和互补链合成反应的方面考虑，反应液优选调整为pH7.0～8.0，温度30～45℃的范围。

进一步，优选预先向试剂中添加微量的焦磷酸酶等酶，将试剂中含有的成为背景光原因的PPi或ATP分解除去。

本发明还提供了用于上述核酸分析方法的试剂盒。该试剂盒包括：

1)DNA聚合酶；

2)对应于碱基AGTC的4种核酸底物或其衍生物；

3)AMP和磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸磷酸二激酶，及；

4)荧光素酶和荧光素，

并且，包含“使AMP在反应液中以30～800μM与丙酮酸磷酸二激酶反应”的意思的表示。这里，所述表示可以是作为说明书附带在试剂盒，此外也可以记载在包装的表面，还可以以封条的形式贴附在包装的表面。另外，所述表示并不限定于此处记载的表达或使用的语句，只要不变更其内容或主旨，也可以使用不同的表达或使用的语句。

本发明的核酸分析试剂盒中包括的酶等试剂，最好是在上述的适宜范围内提供和使用。

实施例

在使用化学发光的测序中，通过30～60秒结束一个阶段的阶段反应来测序1个碱基。即，向反应液中顺次加入4种核酸底物，检测有无观测到化学发光。已注入的试剂需要在下个试剂注入前除去或分解。这是由于，注入的试剂残存时，产生测序不准确，每个靶DNA互补链合成的进行状况不同等问题。另一方面，为了使反应在短时间内均匀地进行，需要搅拌溶液，因此反应室中安装有振动马达等搅拌装置。背景光的量很大时，需要在试剂分注前预先测定背景光，从反应引起的发光量中将其减去。但是，驱动搅拌马达时，由于其影响，背景光大幅晃动。因此，有时很难正确把握利用搅拌马达时的背景光。所以，为了进行高精度的测定，背景光信号最好是想要测定的DNA信号强度的1/10。

使用0.1pmol DNA试样量也就是以前的DNA试样量1pmol的1/10进行测序时，需要使背景光的量与0.01pmol ATP发出的化学发光的量相等或比它少。以前的使用由APS(腺苷酰硫酸)与PPi的反应生成ATP的步骤的焦磷酸测序中，由于APS成为荧光素酶反应的底物，因此不能使用微量的DNA进行测序。APS和PPi在酶ATP硫酸化酶的作用下变成ATP。一般认为在该步骤中，过量存在的APS与酶首先形成复合体，接着与PPi反应。已知APS与酶形成复合体的反应的米氏常数为Km＝0.56μM，所以为了生产足够量的复合体需要约5μM以上的APS。若想使反应溶液体积为100μl，所需APS量应为500pmol。已知APS作为荧光素酶发光反应的底物时，相对于ATP具有0.6×10^-3的活性，但是焦磷酸测序的条件下，由于使分解dNTP或ATP的酶三磷酸腺苷双磷酸酶共存，因此以ATP作为底物的发光方法的效率降低。考虑到这些问题，将APS的化学发光强度换算成ATP的结果为0.1pmol左右，非常大。即使反应容积缩小为30μl，还是很大。

为了减少这样的背景光，需要采用使用不会成为荧光素酶化学发光的底物的试剂，由PPi生成ATP的步骤。由此，可以用比以前少1～2个数量级的DNA试样实现测序，以及使用廉价的装置实现测序。

以下的实施例中，说明作为上述的步骤，将DNA互补链合成中生成的PPi在酶PPDK的作用下变成ATP，使用荧光素酶检测化学发光，进行DNA碱基测序的方法，但是本发明不被本实施例限定。

实施例1

1.概要和原理

本实施例中，对于借助PPDK使DNA互补链合成中生成的焦磷酸(PPi)变成ATP，使用荧光素酶进行化学发光反应，通过检测产生的化学发光进行DNA碱基测序的方法进行验证。

使用的酶为DNA聚合酶(EXO-Klenow，Ambion(Austin，TX，USA)，Cat#2008)、PPDK(キツコ一マン，PPDK-E 61317)、三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase from Potato，Sigma(St Louis，MO，USA)，A6410)和荧光素酶(Luciferase，Sigma(St Louis，MO，USA)，L1759)。即，可以说它是4个酶反应同时进行的、参与反应的物质相互关联的复杂的反应体系。本发明的反应的概要如图1所示，另外，以前的使用APS(腺苷酰硫酸)的焦磷酸测序反应的概要如图2所示。

以前的焦磷酸测序中，如下式和图2所示，由PPi起始的ATP生成反应是利用APS和ATP硫酸化酶的酶反应进行的。

[化1]

但是，虽然与ATP相比反应效率为1/1000左右，但APS成为荧光素酶的发光底物与荧光素反应，产生化学发光。因此，使用微量DNA的测序中，有时由于APS引起的背景光而使测序不能顺利进行。

本发明的方法中，如下式和图1所示，由PPi起始的ATP生成反应为，使不会成为荧光素酶反应发光底物的AMP在PPDK的存在下与PEP反应。

[化2]

由于上述反应中使用的PEP和反应产物丙酮酸不成为荧光素酶反应的底物，因此可以抑制背景光，实现高灵敏度的测定。结果，利用本发明的方法，使用比以前方法少1个数量级的DNA样品就可以进行测序。

本发明的方法和以前方法的很大的差别是，以前的使用APS的体系中APS用于ATP的生成，只有消耗没有再生成，另外APS在荧光素酶的存在下与荧光素反应产生化学发光，但是本发明的使用PPDK的体系中，作为反应底物的AMP不与荧光素反应。因此，使用本发明的方法能够抑制背景光，以高灵敏度测定DNA序列。

但是，反应中使用的含有AMP的试剂中经常含有ATP或PPi等杂质，它们也是发出背景光而使检测灵敏度下降的原因。因此，最好在使用前向这些试剂中加入三磷酸腺苷双磷酸酶分解ATP，或者加入PPase分解PPi后使用。但是，这些酶在试剂的焦磷酸测序使用时，对各种反应产生影响。为了消除使用时的影响，在进行酶处理后，考虑将加入的酶除去。但是，由于AMP一经放置就慢慢分解，对发光循环产生影响的化合物就会蓄积，因此酶的除去需要在即将作为试剂使用之前进行，实验方法变得烦杂。所以，含有AMP的试剂在使用前或保存时，向试剂中加入不至于影响焦磷酸测序的微量的分解酶，经过长时间(1小时以上)使酶分解。本实施例中，加入PPase调整为1U/L，经过约1天的处理，试剂中预先含有的PPi分解。由于加入酶的量过多时，测定时的影响增加，因此添加酶的优选量为约10U/L以下。

已报道使用的PPDK和AMP的米氏常数Km为5μM。为了使反应高效进行，需要使50μM以上的AMP共存。焦磷酸测序中反应瓶颈是PPi变为ATP的步骤，从这个观点考虑，最好使用高浓度的AMP。

2.材料(酶)

(1)耐热性PPDK

本实施例中使用的耐热性PPDK的特性如表1，另外标准的使用方案(protocol)和反应试剂的组成如表2所示。其中，方案为使用PPDK时的标准方法，多个酶一起使用时，需要根据内容进行后面详述的试剂组成的最适化。

表1：耐热性PPDK的特性

特性

分子量  约230kDa(凝胶过滤)

结构  由约91kDa的2个亚单位构成(SDS-PAGE)

米氏常数  5.0106M(AMP)

          3.8105M(PPi)

          2.8104M(磷酸烯醇丙酮酸)

          2.0104M(ATP)

        1.3104M(丙酮酸)

最适pH  6.5-7.0

稳定pH  6.0-11.0

最适温度  55-60℃

热稳定性  55℃以下

低温稳定，且对冻融有耐性

活化剂  Mg²⁺，Mn²⁺，CO₂抑制剂Zn²⁺，Hg²⁺，Ag⁺

特异性  AMP(100)，UMP(0)，IMP(0)，TMP(0)，CMP(0)，GMP(0)

表2：耐热性PPDK的使用方案

试剂

A.底物溶液

将(NH₄)₂SO₄ 330mg、Na₄P₂O₇·10H₂O 89.2mg，、磷酸烯醇式丙酮酸三钠·H₂O 46.8mg、2-巯基乙醇25μl、5.0mM AMP·Na₂ 2.0ml和0.5M Bis-Trispropane-HCl缓冲液(pH6.8)10ml溶解在80ml的蒸馏水中，用2N HCl调整为pH6.8，用蒸馏水稀释至100ml(20℃保存)。

使用前，向10ml底物溶液中加入1.0M MgSO₄溶液30μl。

B.ATP标准溶液

将2107μmol/ml：CheckLite ATP标准品(2106M)(キツコ一マン社制)用蒸馏水稀释至10000倍容积。

C.酶稀释用缓冲液：将牛血清白蛋白(BSA)0.5g溶解在2-巯基乙醇62.5μl和0.5M Bis-Tris propane缓冲液(pH6.8)50ml的蒸馏水溶液400ml中，用2N HCl调整为pH6.8，用蒸馏水稀释至500ml(20℃保存)

样品

即将测定前，由用冰冷却后的酶稀释用缓冲液(试剂C)将酶标准品稀释为10⁴-10²U/ml。

顺序

1.将0.18ml底物溶液(试剂A)装入试管中

2.在37℃平衡约5分钟

3.加入0.02ml样品，在37℃孵育30分钟

4.静置3分钟，用沸水停止反应

5.对于反应混合液进行离心处理

6.用蒸馏水将所述反应混合液的上清液稀释为10000倍容积

7.向稀释的反应混合液0.1ml中加入CheckLite 250(キツコ一マン社制)0.1ml

8.利用Lumitester C-100检测发光

使用加入酶稀释用缓冲液(试剂C)来代替样品的物质作为空白

ATP标准溶液的测定

1.向0.1ml ATP标准溶液(试剂B)中加入0.1ml的CheckLite 250

2.利用Lumitester C-100检测发光

使用加入蒸馏水代替ATP标准溶液(试剂B)的物质作为空白

(2)耐热性荧光素酶

本实施例中使用的耐热性荧光素酶的特性如表3，另外标准使用方案和反应试剂组成如表4所示。

表3：耐热性荧光素酶的特性

特性

分子量  约60kDa(凝胶过滤)

结构  由约60kDa单体构成(SDS-PAGE)

相对活性  1.41011RLU/mg纯化蛋白

米氏常数  1.9104M(ATP)

          1.5104M(D-荧光素)

最适pH  约7.0-8.5

稳定pH  6.0-9.0

热稳定性  约40℃以下

稳定性(溶液形态)  25℃下最少5天内是稳定的

表4：耐热性荧光素酶的使用方案

试剂

A.Tricine-NaOH缓冲液，50mM；pH 7.8：

将Tricine 4.48g溶解在450ml蒸留水中，用4N NaOH调整为pH7.8，用蒸留水稀释至500ml。

B.ATP溶液，40mM：

将ATP·Na²⁺ 2.42g和Tricine 896mg溶解在90ml蒸留水中，用4N NaOH调整为pH7.8，用蒸留水稀释至100ml。

C.荧光素溶液，5.0mM：

将D-荧光素100mg溶解在Tricine-NaOH缓冲液(试剂A)71.4ml中，用4N NaOH调整为pH7.8。

D.MgSO₄溶液，0.1M：

MgSO₄·7H₂O 2.47g/Tricine-NaOH缓冲液(试剂A)100ml

E.酶稀释用缓冲液：

将Tricine 4.48g，EDTA·Na²⁺·2H₂O 185mg，，2-巯基乙醇31.5μl，甘油25g和牛血清白蛋白(BSA)5g溶解在450ml蒸馏水中，用4N NaOH调整为pH7.8，用蒸留水稀释至500ml。

样品

由用冰冷却后的酶稀释用缓冲液(试剂E)将冻干的酶稀释为11031.5105RLU/ml。

顺序

1.制备下述底物溶液(即将使用前)

2.0ml Tricine-NaOH缓冲液(试剂A)

0.5mlATP溶液(试剂B)

2.0ml荧光素溶液(试剂C)

0.5mlMgSO₄溶液(试剂D)

2.将0.1ml样品装入比色杯中

3.将比色杯放在加热至30℃的光度计中

4.加入底物溶液0.1ml，然后立即测定20秒的发光量

使用加入酶稀释缓冲液(试剂E)代替样品的物质作为空白

3.方法

以下，对于具体的实验顺序进行说明。反应室中含有模板DNA、引物、DNA聚合酶、PPDK、三磷酸腺苷双磷酸酶、荧光素酶、AMP、磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate：PEP)、荧光素。这里，除它们外，反应液中含有各种盐类。使用的反应液的组成如下表所示。

表5：反应液组成

试剂                  浓度

Tricine(pH7.8)        60mM

MgAc                  20mM

PPDK                  15.0U/mL

荧光素酶              200.0GLU/mL

Exo-Klenow            50U/mL

三磷酸腺苷双磷酸酶    2U/mL

荧光素                0.4mM

PEP·3Na              0.08mM

AMP                   0.4mM

将4种核酸底物dNTP(dATPαS、dCTP、dGTP、dTTP)的每一种顺次加入反应室中。该反应中，ATP作为发光反应的底物发挥重要的作用，但是通常作为互补链合成核酸底物使用的dATP的结构与ATP相似，虽然效率低但也具有作为发光反应底物的功能。因此，发光反应和互补链合成反应在同一个反应室中进行时，dATP产生背景光而影响检测灵敏度。所以，使用作为发光底物的能力极低的dATPαS代替dATP。其他的dNTP(dCTP、dGTP、dTTP)作为发光底物的特性弱，对检测灵敏度没有影响，因此可以直接使用。

在反应室中，首先把引物杂交到单链模板DNA上。当向反应室中加入的核酸底物与杂交于模板DNA上的引物的3′端相邻的模板DNA碱基种类互补时，根据加入的核酸碱基进行互补链合成，使引物的长度延伸。这时，作为互补链合成反应的副产物，生成PPi。PPi在先前所述的PPDK反应中，与AMP和PEP反应生成ATP和丙酮酸和磷酸。接着ATP在荧光素酶的作用下，与荧光素反应，生成AMP、PPi、氧化荧光素、二氧化碳和光。用光二极管等检测器可以检测得到的发光。剩余的核酸底物，利用三磷酸腺苷双磷酸酶经20秒左右几乎完全分解为1个磷酸，不再参与以后的互补链合成。

4.结果及条件的最适化

对于各核酸底物，依次反复进行以上工艺的操作，通过监控发光的有无可以指定参加互补链合成的碱基种类，测定DNA序列。图3表示使用本发明方法测序的结果。发光反应中生成的AMP和PPi，在PPDK的作用下再次变成ATP。由于PPi和AMP的反应中再生成的ATP在三磷酸腺苷双磷酸酶的作用下分解，因此发光信号没有长期持续，观察到半幅值为10秒左右的峰状信号。

如上所述，焦磷酸测序中，使所说的DNA聚合酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、PPDK和荧光素酶4种酶同时发挥作用。由于这些酶的最适环境不一定相同，因此需要考虑到它们的特性，使体系整体的条件最适化。

(1)pH

图4和图5表示，各荧光素酶和PPDK根据pH及温度的活性而变化。荧光素酶的最适pH为8.0，而PPDK的最适pH为6.8。当pH8.0时PPDK的活性下降为约20％。本发明中，后述的聚合酶活性和本PPDK活性及荧光素酶活性的平衡是决定测定精度的重要因素，因此不至于产生测定灵敏度不足的范围是，可以期待20％以上的PPDK活性的pH7.0-8.0为最适范围。

(2)温度

另一方面，在低温下PPDK的活性低，在超过60℃的高温则迅速下降。考虑到酶的活性，室温至55℃的范围为宜，最好是30℃至55℃。一般地，市售荧光素酶在超过30℃长期放置时恶化。图11和图12是在各温度条件下进行核酸延伸时测定发光量的结果。可知在温度30℃以上可以进行高效的测定。本实施例中使用了耐热性的荧光素酶，但如图5所示超过40℃时活性下降。考虑到以上的PPDK和荧光素酶的活性的温度依赖性，以30℃至45℃作为最适温度范围。其中，通常的DNA聚合酶的最适温度为37℃左右，在上述范围内。

(3)DNA聚合酶

作为DNA聚合酶可以使用各种类型，但是本实施例中使用的是除去核酸外切酶活性的克列诺夫片段。这是因为，具有核酸外切酶活性时，反应中将加进在互补链合成时切取末端碱基，再次与互补链碱基结合的步骤。因此，在利用阶段性互补链合成的测序方法中，反复读取同样的位置，或者成为互补链合成反应的进行状态对于每一DNA拷贝不同的原因。

(4)互补链合成反应

如上所述，同时向反应室中加入DNA聚合酶、PPDK、三磷酸腺苷双磷酸酶、荧光素酶等进行反应。使模板DNA与引物杂交进行互补链合成，但是温度低的话，有时引物之间或模板DNA之间杂交，或引物部分杂交在与本来应该杂交的位置不同的位置上，从该处开始合成互补链。在这种情况下，有时观测到与靶DNA序列无关的发光，给测序带来阻碍。为了防止这样的问题，互补链合成反应不是在室温下而是在37℃进行。但是，该温度下，通常的荧光素酶活性在短时间内恶化。因此，本实施例中使用了耐热性的荧光素酶和PPDK。其中，虽然与这些酶的最适pH不一致，但还是以互补链合成反应为优先，使pH处于7.0-8.0的范围。

(5)装置

图6是使用本发明的测序装置的例子。如图1所示，将想要测序的DNA、引物、互补链合成酶、AMP、PPDK和发光试剂放入反应室。从外部依次向反应室中加入核酸底物dNTP。该例子中，以dATPαS→dCTP→dGTP→dTTP→dATPαS→…的顺序反复加入核酸底物。各dNTP置于带喷嘴的试剂池上，从喷嘴向反应室中喷雾注入。互补链合成中当核酸底物被引入DNA链中时，在DNA长度延长一个碱基的同时，释放作为副产物的PPi。PPi在上述一系列反应中变为ATP，与荧光素反应，发出光。该化学发光由位于反应室下面的光检测器检测。剩余的dNTP在下一个核酸底物注入前被三磷酸腺苷双磷酸酶分解。

(6)AMP浓度

因为DNA互补链合成反应是在非常短的时间内结束，所以，通常决定反应循环的是将PPi变为ATP的步骤。在使该步骤加快进行的以前的方法中，由于加入了很多APS而使背景光加大，测序中需要lpmol左右的DNA试样。相对地，由于本实施例中没有使用APS因此背景光小。

但是，使用的AMP与互补链合成中使用的dATP或发光底物结构相似，大量存在时，可能对互补链合成等反应室内的酶反应产生不良影响。

图7是使各种浓度的AMP共存时，向反应室中加入DNA得到的发光量的变化的研究结果。加入DNA时得到的发光(DNA互补链合成中得到的PPi引起的发光)从AMP存在开始产生。因为使用ATP进行发光反应，所以发光随着AMP的增加而迅速增大，但是在100μM附近达到峰值后很快转变为减少。提供充分的发光强度的AMP的浓度范围是30～600μM。使用该范围浓度的AMP时，使用0.1pmol的DNA样品就能够进行测序。

(7)由AMP-PPDK生成ATP

图8是使用荧光素-荧光素酶的反应体系，使用AMP和PPDK的本发明的方法和以前的使用APS和ATP硫酸化酶的方法中，得到的信号强度和背景光信号强度的比较结果。加入一定量的PPi或ATP时的发光量，在本发明的体系中和以前的使用APS的体系中没有太大差别，但是背景光在根据本发明的使用AMP和PPDK的体系中减少2个数量级。

(8)荧光素酶

发光量也依赖于荧光素酶的量。图9是对荧光素酶量变化时由APS产生的背景光、本发明方法中产生的背景光和加入ATP时的发光的研究结果。增加荧光素酶的量时，化学发光信号增加，能进行高灵敏度的测定，但是以前的方法中，荧光素酶的量多时，由于背景光增大，超出尺度范围(scaleover)，导致不能进行实质性测定，因此不能增加荧光素酶的量。相对地，本发明的方法中，由于背景光少，即使荧光素酶浓度高也能进行测定，能够使用微量的DNA进行测序。

(9)样品量

图10是，利用本方法，使用181碱基的TPMT基因PCR扩增得到的微量DNA试样进行测序的结果。以前的方法中，DNA测序需要0.5-1pmol的DNA，但是本发明的方法中，确认使用比以前的方法少2个数量级的2.5fmol的DNA试样就能够进行测序。

(10)添加PPase

有时试剂中所含的AMP中含有PPi杂质，影响测定。对此，因为预先加入10U/L以下(优选1U/L)的微量的PPase时，残存的PPi缓慢分解，所以是适宜的。PPase也分解互补链合成反应中生成的PPi，但是因为分解酶PPase的量少，所以不妨碍DNA序列分析。将使用不加PPase的经数日的试剂和加入PPase经数日的试剂的背景光进行比较时，不加PPase经数日的试剂的情况下，观察到dNTP分解产生PPi引起的背景光增加，但是加入PPase经数日的试剂的情况下，由于添加了PPase，PPi减少到可以忽视的程度。即，确认了添加微量的PPase对于除去成为背景光原因的试剂中的PPi是有效的。

如以上说明，本发明的方法中，使用在ATP生成反应中不会成为发光底物的AMP，进一步通过使其浓度最适化，使反应的pH或温度最适化，使用微量的DNA样品就能够进行DNA序列分析。本发明的方法中，测序使用的DNA样品量与以前的方法相比减少1个数量级～2个数量级。因此，也能够控制使用的试剂量，大幅降低测序成本。进一步，由于本发明的方法使用了简便的装置，对于整个测定体系来说其降低成本的效果更是非常大。

产业上应用的可能性

以前的标准的DNA分析方法为使用凝胶电泳的方法，但是装置和试剂都是价格很高的。利用化学发光进行阶段性DNA互补链合成的焦磷酸测序，由于装置价格高，使用大量试剂，因此序列分析所需的成本也是很高的。也可以利用将光二极管等廉价部件用作检测器的简便装置，但是在消耗大量试剂方面并没有变化。消耗大量试剂的以前方法的原因是，为了抑制不参与测序反应的步骤中所产生的背景光的影响。本发明提供了，不使用这样的步骤的序列分析方法，使用比以前少1～2个数量级的试剂量和廉价的装置就能够实现序列分析。本发明的方法，提供了廉价简易的DNA测序方法及用于它的试剂盒，为生物相关领域带来无法估量的利益。其适用范围，不仅限于DNA序列分析，还涉及基因检查、mRNA基因表达分析、食品检查、细菌检查等很多方面。

Claims (13)

1.一种核酸分析方法，其特征为，包括：

在含有试样核酸的反应液中，以所述试样核酸为模板进行互补链合成的工艺；

使所述互补链合成中生成的焦磷酸在丙酮酸磷酸二激酶的共存下与30～800μM AMP反应，而生成ATP的工艺；

以所述ATP作为反应底物进行荧光素酶反应的工艺；

检测所述荧光素酶反应中产生的化学发光，来判定有无互补链合成的工艺。

2.根据权利要求1记载的核酸分析方法，其特征为，所述互补链合成工艺中，将对应于碱基AGTC的4种核酸底物或其衍生物的每一种顺次加入，进行互补链合成，基于所述互补链合成的有无进行试样核酸的测序。

3.根据权利要求1记载的核酸分析方法，其特征为，所述互补链合成工艺中，将对应于碱基AGTC的4种核酸底物或其衍生物的两种以上同时加入进行互补链合成，基于所述互补链合成的有无进行目标部位的测序。

4.根据权利要求1至3的任一项记载的核酸分析方法，其特征为，对剩余的核酸底物或其衍生物进行酶分解。

5.根据权利要求1至4的任一项记载的核酸分析方法，其特征为，所述丙酮酸磷酸二激酶和/或荧光素酶是在40℃以上性能稳定的耐热性酶。

6.根据权利要求1至5的任一项记载的核酸分析方法，其特征为，反应液的pH为7.0～8.0。

7.根据权利要求1至6的任一项记载的核酸分析方法，其特征为，反应液的温度为30～45℃。

8.根据权利要求1至7的任一项记载的核酸分析方法，其特征为，预先用丙酮酸和/或分解ATP的酶对试剂进行处理。

9.根据权利要求8记载的核酸分析方法，其特征为，所述酶是焦磷酸酶。

10.核酸分析试剂盒，其特征为，包括：

1)DNA聚合酶；

2)对应于碱基AGTC的4种核酸底物或其衍生物；

3)AMP和磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸磷酸二激酶；及

4)荧光素酶和荧光素，

使所述AMP在反应液中的浓度为30～800μM，且其用于在所述反应液中与丙酮酸磷酸二激酶反应。

11.核酸分析试剂盒，其特征为，包括：

1)DNA聚合酶；

2)对应于碱基AGTC的4种核酸底物或其衍生物；

3)AMP和磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸磷酸二激酶；及

4)荧光素酶和荧光素，

并包含使所述AMP以在反应液中为30～800μM与丙酮酸磷酸二激酶反应的意思的表示。

12.根据权利要求10或11记载的核酸分析试剂盒，其特征为，所述丙酮酸磷酸二激酶和/或荧光素酶是在40℃以上性能稳定的耐热性酶。

13.根据权利要求10至12的任一项记载的核酸分析试剂盒，其特征为，进一步包含将反应液调整为pH7.0～8.0的意思的表示。

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