CN101555452B - Dna分析装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种DNA分析装置。本发明要解决的问题是：焦磷酸测序中，在短时间内均匀彻底地进行互补链合成反应，并且仅以必需的时间长度来进行发光反应，高精度、高灵敏度地进行序列确定。通过将作为序列确定的靶的DNA固定在固体的载体4表面，将核酸底物从分配器注入载体部位，从而可以基于小的反应体积在短时间内迅速彻底地进行互补链合成。接着，通过将生成物连同载体一起转移到发光反应溶液6中，进行反应，从而将DNA互补链合成反应部位和发光反应部位彻底分离。通过将载体4浸渍在含发光试剂和分解剩余核酸底物的酶的发光反应溶液6中，从而可以进行载体表面的洗涤，也进展到下一阶段反应。

Description

DNA分析装置

技术领域

本发明涉及DNA碱基序列确定装置和DNA碱基的种类鉴定装置等DNA分析装置，以及基因诊断装置。

背景技术

DNA碱基序列确定中，利用凝胶电泳和荧光检测的方法被广泛使用。就该方法来说，首先，大量制作要进行序列解析的DNA片段的复制品。以DNA的5’末端为起点，制作各种长度的荧光标记片段。另外，根据这些DNA片段的3’末端的碱基种类，附加波长不同的荧光标记。通过凝胶电泳，以1碱基的差异识别长度的不同，检测各片段组发出的光。由发光波长获知测定中的DNA片段组的DNA末端碱基种类。因为DNA是从短的片段组开始顺次通过荧光检测部，所以通过计测荧光色，可以由短的DNA开始顺次获知末端碱基种类。由此进行序列确定。这种荧光式DNA测序广泛普及，并且在人类基因组解析中也广泛使用(参照非专利文献1)。另一方面，正如2003年宣告的那样，人类基因组序列解析结束，将序列信息应用于医疗、各种产业的时代已经到来。于是，很多情况是不必解析长DNA的全部而仅知道目标的短DNA序列就足够了。这需要简便廉价的装置。进而，同时对非常多的DNA片段进行序列解析的要求也多起来。这种DNA序列解析需要简便且能够扩张的方法、装置。

作为应对这种要求的方法而产生的技术，有以焦磷酸测序为代表的通过阶段性化学反应进行的序列确定。该方法中，使引物与作为靶的DNA链杂交，将4种互补链合成核酸底物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)1种1种地顺次加入反应液中，进行互补链合成反应。一旦互补链合成反应发生，则DNA互补链延伸，生成作为副产物的焦磷酸(PPi)。焦磷酸在共存的酶的作用下转化成ATP，在萤光素和萤光素酶的共存下进行反应，产生发光。通过检测该光，获知加入的互补链合成底物被组入了DNA链，获知互补链的序列信息，从而获知作为靶的DNA链的序列信息(参照非专利文献2)。最初的焦磷酸测序的方法如下(参照专利文献1)。即，将DNA固定在柱中间，使含互补链合成底物的溶液流过，从而使作为反应生成物的焦磷酸通过几个反应部。在该过程中，焦磷酸转化为ATP，使用采用了萤光素和萤光素酶的发光体系得到发光，对其进行检测(参照非专利文献3)。

另一方面，Nyren等人利用三磷酸腺苷双磷酸酶等酶将反应中没有被使用的互补链合成底物快速分解，以便对接下来的反应步骤没有影响(参照专利文献2、3)。该方法只要简单地将试剂顺次加入反应槽即可，是更简单的方法。萤光素＝萤光素酶发光体系中，不仅ATP，作为互补链合成底物的dATP也作为发光底物发挥作用。因此，正在使用不成为发光底物的类似化合物dATPαS(参照专利文献4、5，非专利文献4)。

进而，本发明人等，通过使用PPDK代替以往使用的ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)来作为由焦磷酸生成ATP的反应相关的酶，采用由焦磷酸和AMP生成ATP的工艺，减少背景发光，开发出了以高灵敏度检测DNA序列的方法(参照专利文献6、非专利文献5)。

另外，该方法也适于将大量DNA样品平行地进行序列解析，报道了设计数万至数百万的反应单元来平行进行序列解析的尝试(参照专利文献7、非专利文献6)。

专利文献1：美国专利第4863849号说明书

专利文献2：美国专利第4971903号说明书

专利文献3：美国专利第6258568号说明书

专利文献4：美国专利第6210891号说明书

专利文献5：日本专利第3510272号公报

专利文献6：日本特开第2007-097471号公报

专利文献7：WO2005/003375

非专利文献1：現代化学，2004年7月号，vol.400，66-69

非专利文献2：Electrophoresis，22，3497-3504(2001)

非专利文献3：Analytical Biochemistry 174，423-436(1988)

非专利文献4：Analytical Biochemistry 242，84-89(1996)

非专利文献5：Analytical Chemistry，78，4482-4489，(2006)

非专利文献6：Nature，437，376-380(2005)

发明内容

发明要解决的问题

焦磷酸测序中，通过使用阶段性互补链合成反应和化学发光反应，检测发光，从而来确定DNA序列。在初期，报道了在不同的反应槽中进行互补链合成和化学发光反应的方法。即，将含有由互补链合成产生的焦磷酸和剩余的核酸底物的反应液从进行互补链合成的反应槽移动到另外的反应槽，进行发光反应。并且，还报道了在使该反应液移动的过程中使其通过固定有分解剩余的核酸底物的酶的区域，将剩余的核酸底物分解后，使焦磷酸转化为ATP，导入化学发光反应槽的方法。但是，该方法中，每加入核酸就需要洗涤互补链合成反应液，更换新的液体，很复杂。因此，提出了使互补链合成反应和剩余的核酸底物的分解反应、ATP生成反应及发光反应共存的简便的方法，并普及起来。

但是，由于使用把dNTP用作反应底物的互补链合成反应和分解除去dNTP的反应共存的不稳定的反应体系，因此带来种种缺点。如果分解酶多，则在充分进行互补链合成反应之前，dNTP就消失了，未反应的DNA模板残留在反应液中。这样的模板每经过阶段反应就被蓄积，不久就产生出具有各种互补链合成末端的延伸互补链，不能通过将由阶段反应的互补链合成得到的焦磷酸转化成ATP并使其发光来进行序列确定。即，原因是：由于产生各种互补链合成末端，因此无论注入那种核酸底物都部分地发生互补链合成，总是能观测到信号。另一方面，如果分解酶少，则在互补链合成中使用的核酸底物dNTP被完全分解之前，就注入下一种核酸底物，它们的混合物存在于反应池中，一次进行多个互补链合成，仍然会产生各种长度的互补链合成产物，存在难以进行DNA碱基序列确定的缺点。另外，为了避免这些情况，需要间隔很长时间来注入核酸底物等操作，过分耗费时间，是不现实的。

进而，作为核酸底物之一的dATP与ATP的结构类似，成为萤光素反应的底物。因此，会产生强度远比使用ATP时弱很多，但在使用分解酶共存的反应体系的序列确定反应中不能忽视的化学发光。即，在dATP由互补链合成反应合成焦磷酸，经ATP合成，利用萤光素酶的发光反应得到信号，到该信号被检测出为止的时间内，dATP极少，但立即与萤光素酶反应，发光的同时产生焦磷酸。焦磷酸，通过酶循环转化成ATP，接着，该ATP再次参与发光反应。需要向反应槽中加入比带来发光信号的由互补链合成生成的焦磷酸制作的ATP的量更大量的作为互补链合成的反应底物的dATP。这样，由于上述反应的时间差，dATP在以往的反应体系中产生相对大的发光，是计测上的阻碍。因此，代替dATP，将不成为化学发光的反应底物的在DNA互补链合成中使用的dATPαS用作为互补链合成底物。但是，该试剂比dATP昂贵，并且，反应速度等作为互补链合成底物的特性比dATP差得多，因此需要在反应时加入大量的dATPαS。

解决问题的手段

为了解决上述问题，本发明中将互补链合成反应部位和发光反应部位在空间上分离。并且采用互补链合成反应结束后，将互补链反应部位浸渍在含有比互补链合成反应液为10倍或其以上的反应液的发光反应液中进行发光反应的方法。

即，本发明的DNA分析装置具有：保持DNA试样的保持部件、将多种互补链合成底物分别供给于保持在保持部件中的DNA试样的底物供给部、装有与由DNA互补链合成反应得到的生成物反应而发光的反应溶液的反应容器、对反应溶液中产生的发光进行检测的光检测器、控制保持部件的位置和来自底物供给部的互补链合成底物的供给的控制部，控制部使保持部件位于反应容器的反应溶液外，从底物供给部进行互补链合成底物的供给，之后，将保持部件移动到反应容器的反应溶液中。作为保持部件，可以使用膜、带状部件、微珠、磁性微珠等。

发明的效果

根据本发明，互补链合成反应时可以减少反应液的体积，并且可在互补链合成相关的酶和试剂的浓度高的状态下促进反应，因此可以在短时间内几乎完全地完成互补链合成反应。因为在模板DNA存在的部位不存在分解酶三磷酸腺苷双磷酸酶，所以反应底物的分解和互补链合成不会发生竞争反应，互补链合成反应充分进行，可以在短时间进行。剩余的dNTP，特别是dATP，通过在互补链合成反应后加入三磷酸腺苷双磷酸酶或者扩散移动到固定有三磷酸腺苷双磷酸酶的区域，被分解。另外，向发光反应部加入三磷酸腺苷双磷酸酶，可以与发光反应平行地进行dNTP分解反应。这时，即使分解需要花费若干时间，在实用上也不产生阻碍，不影响互补链合成。含反应生成物的互补链合成部位浸渍到比互补链合成反应液大大过量的发光反应液中，其中所含的焦磷酸转化为ATP，进行发光反应。另外，在发光反应前使三磷酸腺苷双磷酸酶固定的区域和反应液接触等时，因为dATP被分解，因此不产生大的背景发光。这样完全地进行互补链合成，发光反应也充分进行，因此可以高灵敏度地进行精度高的序列确定。进而，具有可以将以往难以使用的dATP直接作为互补链合成底物来使用的优点。

附图说明

图1是表示在移动台上设置有微小区域的膜的装置的整体构成的图。

图2是阶段的序列确定法的原理图。

图3是表示阶段的序列确定法的酶反应的图。

图4是表示保持膜之前的状态的图。

图5是表示将膜安装于保持器具的状态的图。

图6是表示注入dNTP之前的状态的图。

图7是表示注入dNTP时的状态的图。

图8是表示降低移动台将膜浸入反应容器中使反应容器振动的图。

图9是表示升高移动台将膜从反应容器中取出的状态的图。

图10是表示将毛细管用O形环挤入的状态的图。

图11是表示用挤入夹具挤入毛细管的状态的图。

图12是表示将移动台安装于加热器的状态的截面图。

图13是表示将移动台安装于分散器保持器具来一体化的状态的截面图。

图14是表示本发明的DNA碱基序列确定例子的图。

图15是将三磷酸腺苷双磷酸酶固定于膜周边部的装置的截面图。

图16是从上方看膜的图。

图17是将模板DNA和三磷酸腺苷双磷酸酶固定于带并洗涤的装置的截面图。

图18是重叠膜并固定三磷酸腺苷双磷酸酶的装置的截面图。

图19是将微珠固定于磁石的装置的截面图。

图20是表示将微珠捕捉于微柱的状态的图。

图21是表示将磁石安装于可移动的保持棒时的状态的图。

图22是表示磁石离开保持棒的状态的图。

图23是表示再次将磁石安装于保持棒时的状态的图。

图24是将微珠捕捉于设置在线前端的保持部的装置的截面图。

图25是表示使用微加工器设备的装置的例子的图。

符号说明

1分散器

2毛细管

3移动台

4膜

5反应容器

6发光试剂

7反应容器保持器具

8光二极管

9分散器保持器具

10佩尔蒂元件

71注入的dNTP

72空气间隔层

101O形环

111挤入夹具(絞り治具)

121加热器

171带

172固定了模板DNA的部分

173固定了三磷酸腺苷双磷酸酶的部分

174带支持器具

175洗涤液流入管

176洗涤液流出管

177吸取器具

181固定有模板DNA的膜

182固定有三磷酸腺苷双磷酸酶的膜

191固定有模板DNA的微珠

192磁石

201微柱

202微珠

211磁石

212固定有模板DNA的微珠

213保持棒

241用于收集微珠的线保持器具

具体实施方式

以下，参照附图对本发明的实施方式进行说明。

实施例1

本实施例涉及，将固定有DNA的膜安装在移动台上，通过使移动台上下运动，使DNA模板和反应生成物在互补链合成位置和发光反应位置之间移动，进行DNA序列确定或DNA分析的方法。作为膜，可以使用滤纸、尼龙过滤器等各种物质。

本发明的焦磷酸测序相关的反应和序列确定的原理示于图2，另外，发光反应相关的过程示于图3。序列确定反应后的ATP生成反应中，以往采用使用ATP硫酸化酶和APS的反应，但这里采用使用PPDK(丙酮酸磷酸双激酶：pyruvate phosphate dikinase)和AMP以及PEP(磷酸烯醇丙酮酸：Phosphoenolpyruvic acid)的反应体系。本发明可以应用于任一反应体系。

焦磷酸测序中，使引物与靶DNA杂交，加入DNA聚合酶，顺次向反应液中加入4种核酸底物(dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，进行互补链合成反应，在互补链合成时得到的副产物焦磷酸通过图3所示的反应转化成ATP，在萤光素酶存在下使ATP和萤光素反应，进行发光。如果发生互补链合成，则产生焦磷酸，结果发光，因此通过对其进行监视，可以得知产生互补链合成，即组入的碱基种类。由此确定DNA序列。

最初提出的焦磷酸测序中，反应区域和发光区域通过管相连接，DNA被固定在互补链合成区域，与发光反应相关的萤光素酶被固定在发光反应区域。使反应溶液移动，在到达发光反应部之前，将剩余的dNTP分解(dATP是虽然弱但也是萤光素酶反应的底物，最好除去)，然后将溶液转移到发光反应区域，进行发光反应。

由于该方法的操作复杂，不能发挥充分的性能，因此Nyren等人进行了改良。即为以下方法：使反应区域成为一个，同时进行DNA互补链合成反应、通过分解酶三磷酸腺苷双磷酸酶分解剩余的dNTP的反应、由焦磷酸制作ATP的反应、使用ATP和萤光素以及萤光素酶进行的发光反应等的方法。从而，操作极简单，简单地将核酸底物顺次加入反应区域即可。该方法受到广泛关注，作为实用的序列确定方法而发展起来。但是，由于同时进行多个酶反应，因此存在各反应不充分进行引起的弊端。特别是互补链合成反应中所用的核酸底物通过三磷酸腺苷双磷酸酶而同时并列地被分解，但分解快时产生未合成互补链的DNA链，互补链合成的相位(DNA互补链合成的延伸情况)产生混乱，不久，序列确定变得困难。另一方面，如果核酸底物的分解慢，残留到下一种核酸底物注入时，则会产生以下的问题：在加入的核酸底物之后，残留的核酸底物进一步通过互补链合成而被组入，反应过度进行等。这里使用的酶反应的优化条件根据酶反应而不同，因此在一个反应区域内进行全部的反应时，全部的反应同时优化几乎是不可能的。另外，为了确保发光强度等，不得不一定程度地增大反应区域的体积，因此，还存在互补链合成等难以均匀进行的缺点。

作为解决这种困难的方法，本实施例中，将互补链合成反应的区域限定在膜上的很小的体积区域内，不用将生成的产物与DNA模板分离，而可以将它们同时转移到发光反应区域。即，进行互补链合成时，是在小体积，因而底物浓度高的状态下，迅速均匀地在互补链合成与其他反应分离的状态下进行，在发光反应区域中进行反应部的洗涤(剩余dNTP的分解)、ATP的生成和萤光素酶反应。通过将区域分离，可以在更优化的条件下进行各反应。

首先，参照图1说明本实施例的装置的概要。本实施例中，使进行互补链合成的小区域为膜4，通过其上下移动，将在互补链合成反应部生成的产物送到发光检测部。dNTP通过毛细管从保持于分散器保持器具9的分散器1注入到膜4，进行固定于膜4的DNA的互补链合成。接着，膜4通过移动台3移动到发光反应区域即反应容器5的溶液中。移动台借助上下移动电动机而进行移动。反应容器中发生发光反应，发光用光二极管(Si光二极管S1133-01，滨松光子学株式会社制造)8来检测。光二极管将10^-6勒克斯至10⁵勒克斯的光转换成10^-14A至10^-3A的电流，在11位数这样极广的区域是直线性的。直射日光是1000勒克斯，可以在直射日光下没有破损的条件下进行测定。通常的信号水平是10^-4勒克斯，可以充分测定。

对应于多个反应容器，装置中有多个光二极管，得到的信号在直接连结于各光二极管的扩增器(opA129UB，德州仪器(Texas Instruments)公司制造)中被扩增后，送到多路调制器(Multiplexer)(MAX4051ACSE，美信集成产品公司制造)，将多个信号进行时间划分，转换成AD。在AD转换之前，通过扩增器扩增至所需的信号强度。放大自动设定为×1、×10、×100三个阶段来进行扩增(op07CS，美国模拟器件公司制造)。通过AD转换器(ADS1271PW，德州仪器公司制造)转换为数字信号得到的信号，通过H8微型计算机(HD64F3052BF25，瑞萨科技(Renesas Technology)公司)进行信号处理，输出到个人电脑(personal computer，PC)。H8微型电脑进行阀门控制、移动台3的上下位置控制、搅拌反应容器5中的发光试剂6的振动电动机的控制、温度控制。通过分散器1分散的dNTP的注入量，从储气瓶或设备的配管施加空气压力，用阀门的开关时间来进行控制。移动台3通过上下移动电动机来驱动，温度调整通过用佩尔蒂元件10对反应容器保持器具7进行加热、冷却来进行。

膜4形成为直径3mm的圆形，但尺寸和形状不限于此。作为膜，使用通过共价结合涂敷有链亲合素的膜SAM2(R)生物素捕获膜(Biotin CaptureMembrane)(普洛麦格(promega)公司制造，产品编号V7861)。分散器1具有对应于4种底物的200μL容量的储存器，前端部具备外径360μm、内径50μm的实施了疏水处理的毛细管2。另外，4个储存器的中央贯通了1mm的孔，移动台3通过分散器的中央部的贯通孔。

毛细管2的前端和膜4的间隙按照液滴充分传导且不需要的dNTP不泄露的方式来设定。作为一个例子，该间隙设定为0.5mm±0.2mm。通过这样设定，供给2.3μL的dNTP时，dNTP从毛细管传到膜，不会有问题。间隙的尺寸可以达到0.9mm±0.2mm。如果使液量为1μL，则极限为0.5mm±0.2mm。进而，如果减少液量，则需要使间隙更窄，提高精度。

以上，记载了设置毛细管和膜的间隙的方法，为了提高间隙精度，也可以将透明的薄板作为增强材料装入膜的下侧。或者，也可以将膜装入如图4所示的保持框来使用。图4表示采用将膜夹入两个环的方式，图5是表示将膜安装于保持器具的状态的图。

另外，通过将储存器内减压，在毛细管前端部设置空气间隙，也可以防止dNTP的泄露。首先，使分散器1的前端的毛细管2靠近膜4(图6)，注入dNTP(图7)。如图6所示，在分散器的毛细管前端设置空气层。另外，如图7所示，核酸底物从注入的毛细管供给于膜表面。其他的毛细管没有变化。被注入的dNTP71扩散到膜4。之后，保持原样的状态后，降下移动台3，将膜4浸渍到反应容器5中的发光试剂6(图8)。为了顺利的促进发光反应，使反应容器5振动。在该分散器的前端的毛细管2从膜4分离的区间，将分散器的储存器减压，在前端毛细管部分设置空气的间隔层72。进行发光反应后，通过三磷酸腺苷双磷酸酶，信号充分减弱，因此将移动台3上升，等待下一次注入(图9)。

各分散器的毛细管按照各自的前端部以位于距离直径3mm的膜0.5-1mm上的方式来设置。如果需要，如图10所示地将O环101或如图11所示地将具有与其相同的功能的夹具111附加到分散器保持器具9上，从而毛细管2的前端部按照位于直径3mm的膜上的方式而挤入。

作为将DNA固定在膜上的方法，使用了生物素-亲和素结合，但不限于此。

TPMT-R2引物：

5’-a aaat tact tacc attt gcga tca-3’(序列号1)

模板DNA Biosl-R：

5’-biotin-tttt tttt tttt tttt tttt ca ttag ttgc catt aatc cagg tga tcgc aaat ggta agtaattt tt-3’(序列号2)

解析对象序列：

5’-cctg gatt aatg gcaa ctaa tg-3’(序列号3)

将1μM浓度的模板DNA4μL，即4pmol注入膜。根据产品说明，生物素-亲和素结合所需的时间是30秒以下，因此将模板DNA注入2分钟后，用2×C缓冲液洗涤。2×C缓冲液的组成是，120mM的Tricine、4mM的EDTA、40mM的MgAc2。接着，将1μL的聚合酶Klenow注入到60μL的发光试剂中得到溶液，将膜浸渍在该溶液中。之后，为了除去聚合酶中所含的ATP或PPi，用Apy-PPase溶液洗涤。Apy-PPase溶液的组成是形成Apyrase 1U/mL、PPase1U/mL的浓度的水溶液。用Apy-PPase溶液洗涤后，再一次用2×C缓冲液进行洗涤。

DNA的量是0.5-4pmol，但不限于此。其首先设置在发光反应区域上部，从移动台的上部，通过用毛细玻璃管或微加工设备制作的分散器喷嘴，第1号核酸底物被供给于膜表面。含核酸底物的溶液，在狭窄膜上以很短的时间进行扩散，开始互补链合成反应。注入量是0.5-4μL，但不限于此。关于核酸底物的浓度，使dATP、dCTP、dGTP、dTTP的浓度为125μM，但不限于此。发光反应溶液组成如表1所示。

表1

表1发光试剂的组成

如果发生互补链合成，则核酸底物的一部分被消耗，生成副产物焦磷酸。因为反应迅速进行，所以在几秒后彻底结束。从试剂供给开始10秒后，保持有膜的移动台向下方移动，沉入发光反应槽中。在发光反应槽中装入100μL(多于此或少于此都可以，但多时，溶液组成稳定)的反应液，DNA固定的膜与移动台一同沉入液体中。焦磷酸和剩余的核酸底物等没有固定在膜上的成分立即扩散，广布于发光反应溶液中，进行接下来的反应。为了使反应均匀地进行，也可以将移动台一定程度地上下移动，搅拌发光反应溶液。存在于膜上的焦磷酸扩散，与反应液中存在的PPDK和AMP反应，生成ATP。另一方面，在使用ATP硫酸化酶的体系中，焦磷酸与APS反应，生成ATP。ATP在虫萤光素酶的存在下，与虫萤光素和氧反应，进行发光，因此通过光检测元件对其进行测定。作为光检测元件，可以使用光电倍增管、光二极管或CCD等阵列传感器。存在于膜上的剩余的dNTP扩散到溶液中，通过三磷酸腺苷双磷酸酶等分解酶而被分解，成为不参与互补链合成反应的形式。另外，将膜浸渍到反应溶液中也起到洗涤膜表面的作用。将膜浸渍到发光反应液中，在溶液中保持1分钟左右的时间，将其提起。膜上附着有发光反应液，但不影响以后的互补链合成反应。

另外，互补链合成反应的最适温度，在使用Klenow作为酶的时，为35℃左右，在使用耐热酶Thermo Sequenase DNA polymerase时，为60℃左右。因此，如图12所示，希望将加热器121安装在固定有膜的支持器上，使其也具有控制温度的功能。提起的膜在下一阶段的反应中使用。即，接着，加入下一种核酸底物，互补链合成反应顺次进行下去。

本实施例中，核酸底物由配置于膜上部附近的4个分散器来供给。该分散器1，如图13所示，可以将相对于膜4的相对位置固定，或者也可以按照与膜保持一定距离的方式固定在移动台3上。这时，连接在分散器1上的毛细管2也和膜4一起沉没在反应液6中，因此只要实施疏水处理等来确保前端部的疏水性，在实用上就不会有妨碍。另一方面，也可以用中空的毛细管构成移动台，从与膜接触的根部供给核酸底物。这时，从试剂槽顺次供给4种核酸底物，但为了防止由残留试剂引起的污染，需要采取将试剂注入后供给洗涤液等对策。

本实施例中，将DNA进行生物素标记，固定在膜上，但也可以将DNA聚合酶固定在膜上，于此捕获靶DNA和引物的复合体来使用。得到的测序结果的一个例子如图14所示。横轴表示经过时间和注入的碱基种类。纵轴是发光强度，注入的碱基一旦在互补链合成中被使用，则产生发光。核酸底物的组入为，1个DNA1分子的情况下和2分子的情况下，后者的发光强度为2倍，因此可以得知有多少个被组入。根据这些信息可知顺次组入的核酸碱基的种类，可以读取作为模板的DNA的序列。信号充分强，并且与组入的碱基种类的数量成比例，通过本发明的方法可以进行DNA序列确定。

实施例2

第1实施例中，剩余的核酸底物的除去是通过在发光反应液中加入三磷酸腺苷双磷酸酶来实现的。这也可以通过将三磷酸腺苷双磷酸酶固定在与膜上的DNA固定部位不同的部位来实现。即，第2实施例中，通过将模板DNA固定在膜中央部，将三磷酸腺苷双磷酸酶固定在周边部，从而，在互补链合成反应后，进行剩余核酸底物的分解反应。

图15表示本实施例的装置概要。图16是从上方看膜的图。膜4上，模板DNA固定在中央部的区域152，在其周围的周边部的区域151固定有三磷酸腺苷双磷酸酶。核酸底物，通过分散器被供给于膜大致中央部的区域。被供给的核酸底物，首先在中央部的DNA固定区域151用于互补链合成反应。核酸底物的浓度比通常的焦磷酸测序的条件高，反应可以快速确实地进行。接着，核酸底物流入三磷酸腺苷双磷酸酶固定区域151，剩余的核酸底物被分解。从核酸底物注入开始的数秒后，从相同的分散器供给洗涤液。这时，形成液体从DNA固定部向三磷酸腺苷双磷酸酶固定部流动的构成。其具有分散器的洗涤和使核酸底物移动到周边的三磷酸腺苷双磷酸酶固定区域的效果。

膜4上的反应液，被加入到含发光试剂的溶液6中，与实施例1的情况相同地进行发光反应。可以发光反应的容器5中加入三磷酸腺苷双磷酸酶，也可以只加入分解焦磷酸的酶PPase。在焦磷酸测序中使用的发光反应通过与ATP生成反应组合而成为循环反应，因此一直以该状态持续到萤光素等反应底物耗尽为止。这时的PPase的作用，是通过在反应过程中分解再产生的焦磷酸而使发光反应在一定时间后停止。当然，加入少量的三磷酸腺苷双磷酸酶，也可以分解中间产物ATP，使发光反应停止。反应后将膜提起，进行接下来的互补链合成反应的操作与实施例1记载的操作相同。

第1和第2实施例中，使用的是在保持DNA的载体上具有二维扩展的膜，也可以使用带状的膜、线或微珠作为DNA保持的载体，将它们固定在移动台上来使用。任意情况下，都按照供给的反应试剂的流动是从DNA固定部位向三磷酸腺苷双磷酸酶固定部位的方式来设定供给场所和配置。

图17表示使用带状部件171作为DNA保持的载体的例子。该情形中，将DNA固定在通过带支持具174保持的带的中央部172，将三磷酸腺苷双磷酸酶固定在两末端部173。洗涤液从洗涤液流入管175来供给。这种线的情形中，溶液的保持能力小，因此在端部设置溶液的吸取器具177，液体从中心向端部流动也是有效的。用吸取器具177吸取的洗涤液通过洗涤液流出管176被排出。

而且，也可以是，作为另外的配置，将DNA固定在带状部件的一方的末端侧，将三磷酸腺苷双磷酸酶固定在相反侧的末端侧，含核酸底物的反应液从DNA固定侧向三磷酸腺苷双磷酸酶固定侧移动。

实施例3

第2实施例中，为了分解剩余的核酸底物，与固定有DNA的膜相同地，将三磷酸腺苷双磷酸酶固定在膜或带上，但本实施例中，将两者固定在各自独立的膜或带上，使它们重叠，从而实现将互补链合成中没有使用的剩余的核酸底物进行分解的功能。

本实施例的装置的概要示于图18。这里，以膜的例子来说明。将DNA固定膜181和三磷酸腺苷双磷酸酶固定膜182上下重叠，设置在移动台3上。在接近分散器1的上述配置固定有DNA的膜181，在下部配置固定有三磷酸腺苷双磷酸酶的膜182。两膜可以预先重叠而接触，也可以在供给核酸底物后数秒后将间隙变窄，使两者接触。这里，以两膜预先接触的状态的例子进行说明。另外，核酸底物是由4根分散器1顺次供给的例子，但也可以使用其他的分散器构成。移动台3设置在装入有发光反应溶液6的反应槽5的上部，核酸底物从第1分散器供给到上部膜181上。本实施例中，膜的面积为约0.1cm²，但不限于此。

供给到膜上的核酸底物在膜表面立即扩散，进行DNA互补链合成反应。反应自身在数秒后结束。含核酸底物的溶液，通过扩散也可以移动到下部的膜182上。通过扩散而移动到下部膜182上的核酸底物被三磷酸腺苷双磷酸酶分解。因为移动花费时间，所以互补链合成和分解反应中存在时间上的延迟。从而，可以确保充分的互补链合成，并且可以将剩余的核酸底物分解。因为反应区域窄、反应快速进行，所以通过放置20-30秒，可以将剩余的核酸底物几乎完全分解。但是，作为生成物的焦磷酸不被分解。

通常的焦磷酸测序中，因为dATP是发光反应的底物，因此很难使用，或者不能使用，但本发明中，在到达发光反应槽之前将大多数的dATP分解，所以可以使用。dATP与通常焦磷酸测序中使用的dATPαS不同，作为互补链合成反应底物，是优异的，可以更顺利地进行互补链合成。分解反应后，将移动台3降低，浸入发光反应槽5中，进行ATP的生成以及萤光素酶发光反应。发光反应进行1分钟左右，再次将移动台3提起，加入第2核酸底物，进行互补链合成反应。顺次进行这些反应，反复进行DNA互补链合成和发光反应以及检测，从而进行DNA序列确定。

因为核酸底物等小分子可以容易地通过膜，所以通过扩散从DNA固定区域移动到三磷酸腺苷双磷酸酶固定区域。这里使用的膜的厚度为50μm，但不限于此。

实施例4

实施例1-3中，使用膜或带状部件作为保持DNA的材料。本实施例中，对将DNA固定在磁性微珠表面进行操作的例子进行说明。作为固定DNA的磁性微珠，可以使用1-30μm的小微珠，也可以使用0.1-1mm的大微珠。使用大微珠的例子在实施例5中说明，因此，这里给出使用小微珠的例子(2.8μmDynabeads(商品名))。

将要解析的序列的DNA固定在微珠的表面。固定的方法，使用的是通过PCR制作生物素标记DNA，固定在亲和素标记的磁性微珠上的方法，但不限于此。Dynabeads的量为每1测定约10⁶个。因为1个微珠可以固定10⁶个DNA，所以使用的DNA的量为约1pmol。将固定在磁性微珠上模板DNA浸入含DNA聚合酶和引物的溶液中，将引物杂交，进而使DNA聚合酶与双链部分结合。接着，将这些微珠保持在直径1-2mm的微小的磁石上。磁石与窄细的移动台连结，使用其安装在发光反应槽上部。安装在移动台上的磁石，可以上下移动，浸入发光反应槽中。

图19表示本实施例的装置的概念图。将固定在移动台3的下端的磁石192的表面存在的磁性微珠191，首先沉入发光反应液6中。混入DNA，焦磷酸或ATP等存在时，发生发光反应，通过三磷酸腺苷双磷酸酶，数分钟后，这些消失。将保持有磁性微珠191的移动台3从发光反应槽5提起，在其上部停止。通过分散器1从磁石192的上部顺次供给互补链合成使用的4种核酸底物。首先，供给第1核酸底物dCTP。如果发生互补链合成反应，产生作为副产物的焦磷酸，不反应时，不发生变化。将DNA模板和反应生成物与磁性微珠191一起沉入发光反应槽。生成焦磷酸时，其转化成ATP，进行萤光素酶反应，因此，检测光，可以得知发生了互补链合成。未反应的核酸底物扩散到反应液中，通过三磷酸腺苷双磷酸酶而在1-2分钟以内分解。

安装在移动台3上的磁石192，在发光反应过程中，不需要一直停留在发光反应槽5中，存在于表面的焦磷酸和剩余的核酸底物在扩散到周围的阶段可以移动出来到反应液6之外。如果使磁石192在反应液6中上下振动，则扩散变得更快，可以在5-10秒后可以提起。固定在磁性微珠191上的DNA、引物和DNA聚合酶残存在提起的磁石192的表面上。将第2核酸底物dGTP加到磁石192的表面，将互补链合成底物供给到磁性微珠191，进行同样的操作。以下，顺次添加dATP、dTTP、dCTP、......和核酸底物，反复进行测定。这里，作为核酸底物之一，加入了dATP，但也可以使用dATPαS来代替它。

与在混合有互补链合成反应、ATP生成反应、核酸底物分解反应和发光反应的全部的反应体系中进行的以往的方式相比，本发明的方法中，互补链合成反应的反应体积格外小，因而可以将核酸底物的浓度保持得很高，反应速度也快，因此不需要使用相对于DNA模板为过量的核酸底物。通常，相对于模板为5-8倍量的核酸底物是充分的。以往的焦磷酸测序中，随着反应的进行，核酸底物等分解物堆积，有时会阻碍反应。本发明中，由于互补链合成反应部和发光反应部分离，因此即使发光反应槽的尺寸增大，也不会有互补链合成反应底物的浓度降低等情况，不会对互补链合成反应有影响。通过使用充分量的发光反应液，堆积物的影响变小，能够稳定地进行发光反应。

这里，为了保持磁性微珠，使用了永久磁石，但也可以通过将由磁性材料构成的移动台用于磁性微珠的保持，将磁石从磁性材料上解吸附，对磁性微珠进行操作。另外，使用微珠状的DNA载体时，也可以如图20所示那样，将微珠202保持在微柱201等之间，使带有微柱的板上下移动。这时，作为DNA载体用的微珠，除了磁性微珠以外，也可以使用例如琼脂糖微珠、陶瓷微珠等。另一方面，也可以将微柱等进行塑料成型来制作，对其进行表面处理，按照DNA结合的方式来加工，作为载体使用。

实施例5

本实施例是将DNA保持于大的一个至几十个微珠上的例子。通过生物素-亲和素键将DNA结合在直径0.5mm的微珠上，制成模板DNA。固定于表面的DNA的量为每个微珠约3×10¹⁰分子，如果使用10个微珠，则可以使用相当于0.5pmol的DNA模板。使用光电倍增管作为检测器时，即使一个微珠也可以获得序列确定所必需的信号，使用简便的光二极管等时，使用10个左右的微珠是更合适的。

图21至图23是表示构成本实施例的装置结构的概念图，为了简便，表示了使用1个微珠的例子。固定有DNA的磁微珠212，在引物杂交和附加了DNA聚合酶后，如图21所示，保持在用铁或坡莫合金等磁性材料制造的保持棒213的前端。由分散器1前端的毛细管2将4种核酸底物顺次供给磁微珠的表面。保持棒213与强力磁石211接触，通过磁力将磁微珠212保持在保持棒213的前端。如果供给能够组入固定于磁微珠212的模板DNA的核酸底物，则进行DNA互补链合成反应。DNA互补链合成反应在几秒钟内结束。由此生成焦磷酸。另一方面，加入的核酸底物不是互补的，在互补链合成中没有被使用时，则原样存在于磁微珠212的周围。

接着，如图22所示，如果使磁石211离开保持棒213，则磁微珠212在重力作用下发生下落，沉入发光反应液6中。存在于磁微珠212表面的焦磷酸和剩余的核酸底物扩散到发光反应液中，从磁微珠表面脱离。因为焦磷酸转化为ATP，通过萤光素酶反应而发光，所以由光检测器被检出。剩余的核酸底物通过三磷酸腺苷双磷酸酶而被分解。因为互补链合成反应和ATP生成反应以及发光反应分开进行，所以可以充分进行互补链合成反应。

之后，如果使磁石211与保持棒213接触，则如图23所示，磁微珠212由于磁力而从溶液6中飞出，吸附于保持棒213的前端。保持棒213能够上下移动，浸入发光反应液6中，接近磁微珠212，通过磁力将磁微珠保持在保持棒的前端后提起，但在使用强力的磁石211时，也可以在固定保持棒213的状态下通过磁力而将磁微珠212从发光反应液6中提起。由分散器1供给下一种核酸底物，重复进行互补链合成反应、ATP生成反应和发光反应。

本实施例中公开了以下的例子：利用磁力，将DNA和互补链合成副产物焦磷酸从DNA互补链合成区域转移到ATP生成和发光反应区域。当然，如图24所示，也可以将带、线241或者棒移动到微珠。图24是将微珠捕捉到设置在线前端的保持部的装置的截面图。如果使用这种保持器具，则不需要使用磁力。微珠在互补链合成反应后，与保持部一起浸入反应溶液中。

这里，将微珠保持于保持棒，从另外的分散器将试剂供给到保持棒，也可以使保持棒为管状，从前端供给核酸底物。这时，保持棒成为分散管，每次试剂供给，则从相同的管送出洗涤液，每次都洗涤试剂的流路。

本实施例中，使用磁微珠作为固定DNA的支持物，另外，上述实施例中使用了膜作为固定DNA的支持物，但本发明中为了固定DNA而使用的载体不限于这些材料，可以是多孔质材料、尼龙膜、以及只要是可以固定DNA或DNA聚合酶而保持DNA的材料即可。

另外，也可以使用图25所示的微加工器设备向互补链合成反应部分供给dNTP。图25是使用由微加工器制作的与保持部一体化的分散器来代替由毛细管构成的核酸底物的分散器的例子的概念图。

工业上的应用性

本发明可以广泛用于DNA序列确定、DNA诊断或DNA检查等。特别是进行序列确定是生物领域中的基本，希望简便、廉价的序列确定方法。焦磷酸测序是使用化学发光从光学上检测信号，与荧光检测不同，不需要激发光源，因此有以简便的装置结构就可以实现装置的优点。因此是适应上述要求的可能性高的方法。但是，以往的方法中，由于同时并列进行多个酶反应，因此存在以下缺点：互补链合成反应不能充分进行或者互补链合成反应先过度进行。通过本发明可以解决该缺点，因此可以期待大的发展。并且，由于形成了在互补链合成反应与其他反应独立的状态，并且减小反应体积，可以提高与反应相关的物质的浓度的状态，因此反应在短时间内彻底完成，所以有可以以短的循环完成阶段反应的优点。结果，整体的检测时间被缩短，期待广泛用于在短时间内进行基因检查所需的感染症检查等紧急基因检查等用途。

序列表

<110>株式会社日立制作所

<120>DNA分析装置

<130>H850042

<140>

<141>

<160>3

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>1

aaaattactt accatttgcg atca                                                   24

<210>2

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>2

tttttttttt tttttttttt cattagttgc cattaatcca ggtgatcgca aatggtaagt aattttt    67

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>3

cctggattaa tggcaactaa tg                                                     22

Claims (15)

1.DNA分析装置，其特征在于，具有：

保持DNA试样的保持部件、

将多种互补链合成底物分别供给于保持在所述保持部件中的DNA试样的底物供给部、

装有与DNA互补链合成反应所生成的焦磷酸反应而发光的反应溶液和三磷酸腺苷双磷酸酶的反应容器、

对所述反应溶液中产生的发光进行检测的光检测器、以及

控制所述保持部件的位置和来自所述底物供给部的互补链合成底物的供给的控制部，

所述控制部使所述保持部件位于所述反应容器的反应溶液外，从所述底物供给部进行所述互补链合成底物的供给，之后，将所述保持部件移动到所述反应容器的反应溶液中。

2.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述反应溶液被准备得比从所述底物供给部供给的互补链合成底物大大过量。

3.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述保持部件是膜。

4.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述保持部件是带状部件或微珠。

5.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述控制部通过磁力的开/关来控制所述保持部件的位置。

6.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述DNA试样通过将其自身或互补链合成酶固定于所述保持部件而得以保持。

7.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，由所述底物供给部供给所述互补链合成底物后，将互补链合成底物分解试剂供给于所述DNA试样。

8.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，设置有与所述保持部件的保持有DNA试样的区域相邻且保持有分解所述互补链合成底物的酶的区域。

9.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述保持部件是膜，将保持有DNA试样的膜和保持有分解所述互补链合成底物的酶的膜进行重叠配置。

10.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述保持部件是膜，在所述膜的同一平面上设置有保持有DNA试样的区域和保持有分解所述互补链合成底物的酶的区域。

11.根据权利要求10记载的DNA分析装置，其中，所述膜的中心部配置有保持有DNA的区域，周边部配置有保持有分解所述互补链合成底物的酶的区域。

12.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述保持部件的所述互补链合成底物被供给的上游侧配置有保持有DNA试样的区域，下游侧配置有保持有分解所述互补链合成底物的酶的区域。

13.根据权利要求12记载的DNA分析装置，其具备在从所述底物供给部供给互补链合成底物后，使洗涤液从保持有所述DNA试样的区域向保持有分解所述互补链合成底物的酶的区域流动的设备。

14.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述底物供给部和所述反应容器被相对地固定，所述保持部件相对于所述底物供给部和所述反应容器进行相对地移动。

15.根据权利要求1记载的DNA分析装置，其中，所述底物供给部和所述保持部件被相对地固定，所述底物供给部和所述保持部件相对于所述反应容器进行相对地移动。

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