JP2009502202A - 核酸を増幅し、配列決定する方法 - Google Patents

核酸を増幅し、配列決定する方法 Download PDF

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ジョン エイチ． リーモン，
ユージン ダブリュー． マイヤース，
ジョン ダブリュー． シンプソン，
グレッグ エー． ボルクマー，
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Abstract

迅速なＤＮＡ配列決定、例えばゲノム配列決定を実施するための装置および方法を本明細書に記載する。該方法は以下の工程、即ち、ゲノム配列決定のためのサンプルＤＮＡを調製する工程、調製されたＤＮＡを代表的な様式において増幅する工程、および、唯一のプライマーハイブリダイゼーション工程を用いて増幅されたＤＮＡに対して多重配列決定反応を実施する工程を包む。本発明は、特に大型鋳型ＤＮＡまたは全（もしくは部分）ゲノムＤＮＡから誘導された複数のＤＮＡ配列のライブラリを調製する為の新規な方法を提供する。１本鎖ＤＮＡの配列は、大型鋳型ＤＮＡまたは全もしくは部分ＤＮＡゲノムのサンプルからフラグメント化、ポリッシング、アダプターライゲーション、ニック修復および１本鎖ＤＮＡの単離を経て調製される。

Description

（発明の分野）
本発明はＤＮＡの塩基配列を決定するための方法および装置に関する。より詳細には、本発明はゲノムの塩基配列を自動的または半自動的に増幅して決定することができる方法および装置に関する。
（発明の背景）
自動化ＤＮＡシーケンサーを利用した迅速で高感度の核酸配列決定法の開発は、近代分子生物学に革命をもたらした。植物、カビ、動物、細菌およびウィルスの全ゲノムの分析は、現在では一連の機械および専門家のチームによる共同研究により可能となっている。しかしながら、迅速で自動化または半自動化された短時間ゲノム配列決定の目標は達成されていない。正確なサンプル調製、増幅および配列決定に関わる技術的な問題点はなお存続している。
ゲノムの配列分析の障壁となっている１つの技術的問題点は、短時間に完全なゲノムを包含する多くの核酸サンプルを迅速に調製する能力を研究者等が有していない点であった。
もう１つの技術的問題点は、現在の配列決定方法の感度と適合するレベルにまでゲノムを明確に増幅することが不可能な点である。近代的で経済的に実行可能なシーケンサーは高感度であるものの、配列決定の為にＤＮＡフラグメントの１００万超のコピーをなお必要としている。ＤＮＡ配列決定のための高コピーを提供するための現在の方法には、全ゲノムを経済的に配列決定するために必要な個々のクローンの数（６００，０００以上、およびヒトゲノムに関しては数千万）を増幅することのできないクローニングまたはインビトロ増幅のバリエーションを伴っている。
更に別の技術的な問題点は、オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションあたり最大で１配列決定反応を実施できる現在の配列決定方法の限界である。配列決定プライマーのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡシーケンサーのスループットを制約する律速段階となる場合が多い。
多くの場合において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；非特許文献１；非特許文献２）は、ＤＮＡ配列情報を獲得すること、および配列決定のために十分な濃度を得るために少量の特定ＤＮＡを増幅することにおいて、一体的な役割を果たしている。しかしなお、現在のＰＣＲ技術を、近代遺伝子学の漸増する要求を満足するために規模調節することは、特に完全ゲノム配列決定の必要性が想到される場合には、経費効果的でも効率的でもない。
時間および経費の効率を最大限にする為の努力は典型的には２つの領域、即ち増幅に必要な反応容量の低減、および実施する同時増幅の数の増大に着目している。小型化は少量化されたサンプルおよび試薬の使用、低減された増幅時間および向上したスループット規模調節性の利点をもたらす。
従来のサーモサイクラーは、サーマルマス制限のため比較的長いサイクリング時間を必要とする（非特許文献３）が、より少量の反応容量をより迅速にサイクリングできる。連続フローＰＣＲ装置は、サブマイクロリットルのサンプルレベルにまで反応容量を低減するために固定温度区域とともにエッチングされたマイクロチャンネルを利用している（非特許文献４；非特許文献５）。
ガラスマイクロキャピラリーを空気（非特許文献６）または赤外線（非特許文献７；非特許文献８）により加熱したものもまた、ナノリットル規模の反応のための効率的な容器として機能している。同様の反応容量はまた、微細加工されたシリコンサーモサイクラーによっても達成されている（非特許文献９）。
多くの場合において、これらの小型化は全ＰＣＲ反応時間を、改良型電気加熱エレメント（非特許文献１０；非特許文献１１）およびホットエアサイクラー（非特許文献１２）については３０分未満まで、ならびに一部の赤外線制御反応（非特許文献１３）については２４０秒まで、短縮している。
特定の技術は、Ｓａｓａｋｉら（非特許文献１４）により設計された１５３６ウェルシステムの場合のように増大したスループットと小型化を同時に採用しており、これは反応容量を１μｌ未満に維持している。別の例として、Ｎａｇａｉら（非特許文献１５；非特許文献１６）は、単一のシリコンウエハ中にエッチングされた１００００個の８６ｐｌの反応ピットにおいて単一の試験フラグメントを増幅したことを報告している。残念なことに、これらの方法によるアンプリコンの回収および利用性は問題を含んでいることが解り、選択的透過性膜を通過する蒸発を必要とする。
反応容量およびサイクル時間におけるこのような顕著な向上にも関わらず、従来の方策の何れも、全ヒトゲノムの分析の為に必要なレベルまでスループットを劇的に増大するために必要な大量平行増幅をもたらしていない。ＤＮＡシーケンサーはなお要求されるよりも緩徐であり高経費となっている。純粋に研究上の環境においては、シーケンサーが緩徐で高価であっても恐らくは許容されるであろう。しかしながら、臨床診断環境においてＤＮＡシーケンサーを使用することが望まれる場合は、そのような非効率的な配列決定方法は財政状態のよい施設であっても回避するべきことである。数千ものクローニング増幅された標的の大規模平行配列決定は、時間のかかるサンプル調製プロセスおよび高価で誤差の多いクローニングプロセスを伴うことなく、大規模全ゲノムライブラリ分析を大きく促進する。良好で高容量の固相クローンＤＮＡ増幅は多くの用途に使用できる。従って、ハイブリダイゼーションあたり１配列決定反応という制限を伴わない、配列決定のため、核酸鋳型の増幅のため、および増幅された鋳型核酸の配列決定のためのゲノムまたは大型鋳型核酸の調製がなお必要とされていることは明白である。更に、これらの種々の技術を実現可能な自動または半自動の配列決定機器と結びつけるためのシステムが必要とされている。
Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５，２３０，１３５０−１３５４ Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．，ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．１９８６，５１ Ｐｔ １，２６３−２７３ Ｗｏｏｌｌｅｙ，Ａ．Ｔ．，ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６８，４０８１−４０８６ Ｌａｇａｌｌｙ，Ｅ．Ｔ．，ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，７３，５６５−５７０ Ｓｃｈｎｅｅｇａｓ，Ｉ．，ら、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ−Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，１，４２−４９ Ｋａｌｉｎｉｎａ，Ｏ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，１９９９−２００４ Ｏｄａ，Ｒ．Ｐ．，ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，７０，４３６１−４３６８ Ｈｕｈｍｅｒ，Ａ．Ｆ．およびＬａｎｄｅｒｓ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，５５０７−５５１２ Ｂｕｒｎｓ，Ｍ．Ａ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６，９３，５５５６−５５６１ Ｋｏｐｐ，Ｍ．Ｕ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，２８０，１０４６−１０４８ Ｃｈｉｏｕ，Ｊ．，Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｐ．，Ｓｏｎｉｎ，Ａ．およびＥｈｒｌｉｃｈ，Ｄ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，２０１８−２０２１ Ｋａｌｉｎｉｎａ，Ｏ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，１９９９−２００４ Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｂ．Ｃ．，ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１，２９１，１２４−１３２ Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，ら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．１９９７，４，３８７−３９１ Ｎａｇａｉ，Ｈ．，ら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２００１，１６，１０１５−１０１９ Ｎａｇａｉ，Ｈ．，ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，１０４３−１０４７
（発明の要旨）
本発明は（１）核酸サンプル調製、（２）核酸増幅、および（３）ＤＮＡ配列決定のための新規な方法および新規な装置を含む一体型システムを記載する。
本発明は、特に大型鋳型ＤＮＡまたは全（もしくは部分）ゲノムＤＮＡから誘導された複数のＤＮＡ配列のライブラリを調製する為の新規な方法を提供する。１本鎖ＤＮＡの配列は、大型鋳型ＤＮＡまたは全もしくは部分ＤＮＡゲノムのサンプルからフラグメント化、ポリッシング、アダプターライゲーション、ニック修復および１本鎖ＤＮＡの単離を経て調製される。（ａ）ｓｓＤＮＡ鋳型のライブラリを生成する工程；（ｂ）ｓｓＤＮＡ鋳型を固体支持体に結合する工程；および（ｃ）１つのｓｓＤＮＡ鋳型が結合している固体支持体を単離する工程を含む方法は、固体支持体に連結したｓｓＤＮＡライブラリを生成する工程を提供する。
本発明はまた、例えば複数のＤＮＡサンプルを個別にエマルジョンマイクロカプセル中にカプセル化すること、同時に複数のカプセル化された核酸サンプルの増幅を実施すること、および該増幅された複数のＤＮＡを後の反応の為にマイクロカプセルから放出させることによる、単一の反応試験管中のＤＮＡライブラリの各個別メンバーを増幅する方法を提供する。１つの実施形態において、核酸鋳型種の単コピーをＤＮＡ捕捉ビーズにハイブリダイズし、完全増幅溶液中に懸濁し、マイクロリアクター（ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒ）（典型的には直径１００〜２００ミクロン）中で乳化し、その後、増幅（例えばＰＣＲ）を用いて、初期鋳型種のコピー数を、単一の核酸配列の１，０００，０００コピー超、好ましくは単一の核酸の２００万〜２０００万コピーまでクローン的に増大させる。増幅反応は、例えば反応混合物のマイクロリットルあたり少なくとも３，０００個のマイクロリアクターにおいて同時に実施してよく、単一の１００μｌ容量の試験管（例えばＰＣＲ反応試験管）中、３００，０００超個のマイクロリアクターによって実施してよい。本発明はまた、良好なＤＮＡ増幅事象を含有するビーズを濃縮する（即ちそれ自体に結合したＤＮＡを有さないビーズを除去することによる）ための方法を提供する。
本発明はまた、単一のプライマーハイブリダイゼーション工程による複数のプライマーからの核酸の配列決定の方法を提供する。２つ以上の配列決定プライマーを配列決定すべき鋳型ＤＮＡにハイブリダイズする。次に配列決定プライマー全てを、１つを除いて保護する。未保護プライマーを伸長させることにより配列決定（例えばピロホスフェート配列決定）を再度実施する。伸長を（必要に応じて追加的なポリメラーゼおよびｄＮＴＰを使用して）完了させるか、または、（ポリメラーゼおよびｄｄＮＴＰによって）終了させる。連鎖完了試薬および／または終了試薬を除去する。次に保護されたプライマーの１つを未保護とし、新しく未保護となったプライマーを伸長することにより配列決定を実施する。このプロセスを全ての配列決定プライマーが脱保護化され配列決定されるまで継続する。好ましい実施形態において、２つのプライマー（１つは保護、１つは未保護）を用いて２本鎖核酸の両端を配列決定する。
本発明はまた、ピロホスフェート系の配列決定法を用いて核酸を配列決定する為の装置および方法を提供する。装置は電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ、微小流体チャンバー、サンプルカートリッジホルダー、ポンプおよびフローバルブを有する。装置は検出方法として化学発光を使用し、これはピロホスフェート配列決定に関しては固有の低バックグラウンドを有する。好ましい実施形態において、配列決定用のサンプルカートリッジは「ピコタイタープレート」と称され、各ウェル容量が７５ｐＬである数十万個の極小ウェルを与えるように酸エッチングされた、市販の光ファイバー表面板から形成される。装置は、ピコタイタープレートに流体試薬を供給するための、本明細書に記載したアレイと共に使用するように適合された新規な試薬送達キュベットおよび試薬送達キュベットと接続している試薬送達手段を含む。ピコタイタープレート上の各ウェルに由来する光子を、ＣＣＤカメラ上の特定の画素にチャネリングすることにより、配列決定反応を検出する。
本発明の実施形態は核酸を配列決定するための方法に関し、該方法は（ａ）平坦な表面上の複数のキャビティ内に配設された複数の１本鎖核酸鋳型を提供する工程、ここで各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、平坦な表面は少なくとも１００００の反応チャンバーを有するものであること；（ｂ）核酸鋳型に有効量の配列決定プライマーをアニーリングし、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長させて配列決定生成物、および所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合に配列決定反応副生成物を得ることにより、全ての反応チャンバー上で同時にピロホスフェートに基づく配列決定反応を実施する工程；および、（ｃ）配列決定反応副生成物を同定することにより、各反応チャンバー内の核酸の配列を決定する工程、を含む。
本発明の方法の何れかにおいて、配列決定反応はアピラーゼの存在下に実施してよい。アピラーゼは溶液中に存在してよく、または、アピラーゼは表面（例えば検体チャンバー内）に固定化してもよい。或いは、アピラーゼは、本発明の配列決定反応／方法の検体チャンバーに配設した可動性固体支持体上に固定化してよい。
配列決定を含む本発明の実施形態の何れかにおいて、配列決定はピロホスフェートに基づく配列決定反応により実施してよい。更に、配列決定反応は３４℃〜３６℃で行ってよい。より好ましい実施形態において、配列決定反応は３５℃において行う。この温度は、例えばアピラーゼのような配列決定反応の機能を最適化するために選択される。最も好ましい実施形態において、配列決定反応はアピラーゼの存在下に実施する。
本発明の別の実施形態は、（ａ）大型鋳型核酸分子をフラグメント化することにより、複数のフラグメント化された核酸を発生させる工程；（ｂ）複数の水性マイクロリアクターが、フラグメント化核酸の単一のコピー、フラグメント化核酸に結合できる単一のビーズおよび核酸増幅を実施するために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水エマルジョンにおいて水性マイクロリアクター内にフラグメント化核酸を送達する工程；（ｃ）マイクロリアクター中のフラグメント化核酸を増幅することにより、核酸の増幅されたコピーを形成する工程、および、増幅されたコピーをマイクロリアクター中のビーズに結合させる工程；（ｄ）平坦な表面上の少なくとも１０，０００の反応チャンバーのアレイにビーズを送達する工程、ここで複数の反応チャンバーは１つを超えないビーズを含む；ならびに（ｅ）複数の反応チャンバーの上で同時に配列決定反応を実施する工程を含む核酸を配列決定するための方法に関する。
更にまた、本明細書に記載する方法は以下の追加的な特徴を有する場合がある。即ち、反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有してよい。フラグメント化核酸は３０〜５００塩基長であってよい。複数のビーズは少なくとも１０，０００の増幅コピーに結合する。工程（ｃ）はポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施してよい。配列決定反応はピロホスフェートに基づく配列決定反応であってよい。例えば配列決定反応は以下の工程、即ち（ａ）核酸の増幅されたコピーに有効量の配列決定プライマーをアニーリングさせ、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長させて配列決定生成物、および所定のヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合、配列決定反応副生成物を得る工程；および（ｂ）配列決定反応副生成物を同定することにより、複数の反応チャンバー内の核酸配列を決定する工程を含んでよい。別の例として、配列決定は以下の工程、即ち（ａ）核酸分子の１つまたは複数の１本鎖に２つ以上の配列決定プライマーをハイブリダイズする工程、ここで１つを除く全てのプライマーは可逆的にブロックされたプライマーであること；（ｂ）ブロックされていないプライマーからのポリメラーゼ伸長により核酸分子上に少なくとも１つ塩基を取り込む工程；（ｃ）ブロックされていないプライマーのさらなる伸長を防止する工程；（ｄ）可逆的にブロックされたプライマーの１つを脱ブロック（ｄｅｂｌｏｃｋ）してブロックされていないプライマーとする工程；および（ｅ）可逆的にブロックされたプライマーの少なくとも１つが脱ブロックされて配列の決定の為に使用されるまで工程（ｂ）〜（ｄ）を反復する工程を含んでよい。これらの方法における反応チャンバーは、光ファイバーバンドルの一端をエッチングすることにより形成してよい。
本発明の別の実施形態は、その上に複数のキャビティを有する平坦な表面を含むアレイに関し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、各キャビティーは２０μｍ〜７０μｍの少なくとも１つの寸法の幅を有し、ここで少なくとも１００００の反応チャンバーが存在する。複数の反応チャンバーは１本鎖核酸鋳型の単一種の少なくとも１００，０００コピーを含有してよい。１本鎖核酸鋳型は反応チャンバー内に配設された可動性固体支持体上に固定化してよい。キャビティーは４０〜６０μｍの中心間間隔を有してよく、各キャビティーは２０μｍ〜６０μｍの深さを有してよい。
本発明の別の実施形態は平坦な上面および平坦な底面を含むアレイに関し、ここで平坦な上面はその上に少なくとも１０，０００のキャビティーを有し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成し、平坦な底面は反応チャンバーからの光学シグナルが平坦な底面を通して検出できるように光学的に伝導性であり、ここで、上面と底面の間の距離は５ｍｍ以下であり、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、各チャンバーは２０μｍ〜７０μｍの少なくとも１つの寸法の幅を有する。このアレイにおいては、上面と底面の間の距離は２ｍｍ以下である。アレイ上のキャビティーの数は５０，０００超、１００，０００超であってよい。各反応チャンバーの形状は実質的に六角形である。更に、各キャビティーは少なくとも１つの不規則な壁面を有してよい。更に、キャビティーは平滑な壁面を有してよい。
アレイを溶融光ファイバーバンドル中に形成してよい。これは例えば光ファイバーバンドルの一端をエッチングすることにより行ってよい。各キャビティーは核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含有してよい。アレイは、アレイ一面に渡ってフローチャンバーが形成されるように、平坦なアレイから空間的に隔たり、それと反対側に接している第２の面を含んでよい。
本発明の別の実施形態は、水性環境中で別個の平行した共通の反応を実施するためのアレイ手段に関し、ここでアレイ手段は、試薬と反応できる出発物質を含有する少なくとも１０，０００の個別の反応チャンバーを含む基板を含み、反応チャンバーの各々は、少なくとも１つの試薬を含有する１つ以上の流体が各反応チャンバーに送達された場合、試薬のウェル外部に拡散する拡散時間が、出発物質が試薬と反応して生成物を形成するために必要な時間を超過するような寸法を有する。アレイの各キャビティーは、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含有してよい。アレイは更に反応チャンバー内に配設された可動性固体支持体の集団を含んでよく、各可動性固体支持体はそれ自体に結合した１つ以上の生物活性剤を有する。アレイ内のキャビティーはエッチング、鋳造または微細加工を介して基板に形成してよい。基板は光ファイバーバンドルであってよい。
本発明のアレイにおいて、反応チャンバーの少なくとも５％〜２０％、少なくとも２０％〜６０％、または、少なくとも５０％〜１００％は、それ自体に固定化された少なくとも１つの試薬を有する少なくとも１つの可動性固体支持体を含有してよい。可動性固体支持体上に固定化された試薬はスルフリラーゼ活性を有するポリペプチド、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド、または、固定化されたスルフリラーゼとルシフェラーゼの両方を有するポリペプチドであってよい。複数の反応チャンバーは１本鎖核酸鋳型の単一種の少なくとも１００，０００コピーを含有してよい。アレイは反応チャンバー内に配設された可動性固体支持体上に固定化された１本鎖核酸鋳型を含有してよい。本発明のアレイはパイロシーケンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）反応における使用に適している。
本発明の別の実施形態は、複数の可動性固体支持体をアレイ一面に渡って分散させることを含む、アレイに生物活性剤を送達するための方法に関し、ここで各可動性固体支持体はその上に固定化された少なくとも１つの試薬を有し、ここで試薬は核酸配列決定反応における使用に適しており、ここでアレイはその上に配設された複数の反応チャンバーを有する平坦な表面を含み、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、各反応チャンバーは２０μｍ〜７０μｍの少なくとも１つの寸法の幅を有する。
本発明の別の実施形態は、反応が特定の部位において起こることを示す光に関して、反応チャンバーのアレイを同時にモニタリングするための装置に関し、装置は以下の要素、即ち（ａ）複数のキャビティー形成面を含む平坦基板から形成された反応チャンバーのアレイであって、各キャビティー形成面は検体を含有するように適合された反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、各反応チャンバーは１０〜１５０ｐＬの容量を有し、アレイは１０，０００超の個別の反応チャンバーを含むもの；（ｂ）使用時に特定の反応チャンバーに由来する光が感光性装置の特定の所定領域上に投射されるように配置された感光性装置；（ｃ）所定領域の各々に投射されている光のレベルを測定するための手段；および（ｄ）反応チャンバーの各々に関する経時的な光のレベルの変動を記録する手段、を含む。
本発明の別の実施形態は、以下の要素、即ち（ａ）それ自体の一端に複数のキャビティー形成面を有する光ファイバーの第１のバンドルから形成されたアレイであって、各キャビティー形成面は検体を含有するように適合された反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔、２０〜７０μｍの幅を有し、アレイが１０，０００超の個別の反応チャンバーを含むもの；（ｂ）反応チャンバー内に光を発生させるための酵素的または蛍光的な手段；（ｃ）光捕捉手段および光検出手段に光を伝達するための第２の光ファイバーバンドルを含む光検出手段であって、第２の光ファイバーバンドルは、個々の反応チャンバーにおいて発生した光が光捕捉手段への伝達のための第２の光ファイバーバンドルの別個のファイバーまたは別個のファイバー群により捕捉されるように、アレイと光学的に接触しているもの、を含む分析センサーに関する。このセンサーは生化学アッセイまたは細胞系アッセイにおける使用に適している。光捕捉手段はＣＣＤカメラであってよい。反応チャンバーはその上に固定化された生物活性剤を有する１つ以上の可動性固体支持体を含有してよい。
本発明の別の実施形態は、以下の工程、即ち（ａ）少なくとも１つのアレイに試薬を含有する流体を送達する工程、ここで、アレイは少なくとも１０，０００の個別の反応チャンバーを含む基板を含み、各反応チャンバーは検体を含有するように適合されており、ここで反応チャンバーは１０〜１５０ｐＬの容量を有し、試薬と反応することができる出発物質を含有し、反応チャンバーの各々は各反応チャンバーに流体が送達される場合、試薬のウェル外部に拡散する拡散時間が、出発物質が試薬と反応して生成物を形成するために必要な時間を超過するような寸法を有するものであること；および（ｂ）（ｉ）出発物質が試薬と反応して各反応チャンバー内に生成物を形成した後であるか、または（ｉｉ）反応チャンバーの何れか１つに送達された試薬がその反応チャンバーから何れかの他の反応チャンバー内に拡散するよりも前の時間において、流体をアレイから洗浄する工程を含む、水性環境において別個の平行した共通の反応を実施するための方法に関する。１つの態様において、何れかの１つの反応チャンバーにおいて形成された生成物は、何れかの他の反応チャンバーにおいて形成された生成物とは無関係であるが、１つ以上の共通の試薬を用いて発生される。別の態様において、出発物質は核酸配列であり、流体中の１つ以上の試薬は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。別の態様において、流体は更に核酸配列およびヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログと反応できるポリメラーゼを含む。別の態様において、工程（ａ）および（ｂ）は逐次的に反復してよい。
本発明の別の実施形態は、アレイに核酸配列決定酵素を送達するための方法に関し、アレイはその上に複数のキャビティーを有する平坦な表面を有し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し；該方法は、複数の反応チャンバーが少なくとも１つの可動性固体支持体を含有するように、その上に固定化された１つ以上の核酸配列決定酵素を有する複数の可動性固体支持体をアレイ上に分散させることを含む。核酸配列決定酵素の１つはスルフリラーゼ活性、ルシフェラーゼ活性または両方を有するポリペプチドである。
本発明の別の実施形態は、アレイに複数の核酸鋳型を送達するための方法に関し、アレイはその上に複数のキャビティーを有する平坦な表面を有し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、アレイは少なくとも１０，０００の反応チャンバーを有し；該方法は複数の可動性固体支持体をアレイ上に分散させることを含み、各可動性固体支持体は、その上に固定化された２種以上の核酸鋳型を有さず、分散によって、１つを超えない可動性固体支持体が何れかの１つの反応チャンバー内に配設される。１つの態様において、核酸配列は１本鎖核酸であってよい。別の態様において、核酸鋳型の単一種の少なくとも１００，０００コピーが複数の可動性固体支持体上に固定化されてよい。核酸鋳型の各単一の種をピコリットルプレート上で増幅することにより、反応チャンバーに配設後においてウェルあたり少なくとも２，０００，０００コピーの核酸鋳型を生成する。一例として、増幅はポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応または等温ＤＮＡ増幅により行ってよい。
本発明の別の実施形態は、核酸を配列決定するための方法に関し、該方法は以下の工程、即ち、（ａ）平坦な表面上の複数のキャビティ内に配設された複数の１本鎖核酸鋳型を提供する工程、ここで各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、平坦な表面は少なくとも１００００の反応チャンバーを有するものであること；（ｂ）核酸鋳型に有効量の配列決定プライマーをアニーリングさせ、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長させて配列決定生成物、および所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合に配列決定反応副生成物を得ることにより、全ての反応チャンバー上で同時にピロホスフェートに基づく配列決定反応を実施する工程；ならびに、（ｃ）配列決定反応副生成物を同定することにより、各反応チャンバー内の核酸の配列を決定する工程、を含む。該方法において、配列決定反応副生成物はＰＰｉであってよく、カップリングされたスルフリラーゼ／ルシフェラーゼ反応を用いて検出用の光を発生させてよい。更に、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼの何れかまたは両方を各反応部位に配設された１つ以上の可動性固体支持体上に固定化する。
本発明の別の実施形態は、アレイ上の複数のヌクレオチド塩基配列を決定する方法に関し、該方法は以下の工程、即ち（ａ）平坦な表面上の複数のキャビティー内に、各々別個に配設された少なくとも１０，０００個のＤＮＡ鋳型を提供する工程であって、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔および１０〜１５０ｐＬの容量を有するものであること；（ｂ）各反応チャンバー内の反応混合物に、１つの既知の窒素性塩基の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体を添加する工程であって、各反応混合物は、鋳型指向性のヌクレオチドポリメラーゼおよび鋳型より少なくとも１ヌクレオチド残基の短い相補オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズした１本鎖ポリヌクレオチド鋳型を含むことにより、プライマー鎖の３’末端上への活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下、プライマー鎖の３’末端において各鋳型内に少なくとも１つの対形成していないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の窒素性塩基は鋳型の対形成していないヌクレオチド残基の窒素性塩基と相補的なものであること；（ｃ）ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体がプライマー鎖内に取り込まれたか否かを検出する工程であって、ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の取り込みは、鋳型の対形成していないヌクレオチド残基が取り込まれたヌクレオシド５’−三リン酸前駆体のものに相補的である窒素性塩基組成を有することを示すものであること；（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を逐次的に反復する工程、ここで各逐次的反復は既知の窒素性塩基組成の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の１つの型の取り込みを付加し、検出するものであること；ならびに（ｅ）一連のヌクレオシド前駆体の取り込みから各反応チャンバーの鋳型の対形成していないヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程、を含む。
本発明の別の実施形態は、鋳型ＤＮＡのＤＮＡ配列における標的位置の塩基を同定する方法に関し、ここで（ａ）少なくとも１０，０００の別個のＤＮＡ鋳型が平坦な表面上の複数のキャビティー内に別個に配設され、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、ＤＮＡは反応チャンバー内に配設される前または後の何れかに１本鎖とされ；（ｂ）標的位置に最隣接する位置において固定化された１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーが設けられ；（ｃ）固定化された１本鎖ＤＮＡは、所定のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下にポリメラーゼ反応に付され、ここで所定のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合、配列決定反応副生成物が形成され；および（ｄ）配列決定反応副生成物を同定することにより、１０，０００ＤＮＡ鋳型の各々における標的位置の塩基に相補的なヌクレオチドを決定する。該方法において、デオキシまたはジデオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の代わりに、ポリメラーゼの基質として機能できるが、ＰＰｉ検出酵素の基質としては機能できないｄＡＴＰまたはｄｄＡＴＰアナログを使用してよい。
本発明の別の実施形態は、核酸配列を分析するための装置に関し、装置は以下の要素、即ち（ａ）試薬送達キュベット、ここでキュベットはその上に複数のキャビティーを有する平坦な表面を含むアレイを包含し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、１０，０００超の反応チャンバーが存在し、ここで試薬送達キュベットは配列決定反応において使用するための試薬を含有するものであること；（ｂ）試薬送達キュベットに接続した試薬送達手段；（ｃ）試薬送達チャンバーに接続した画像化システム；および（ｄ）画像化システムに接続したデータ収集システムを含む。
本発明の別の実施形態は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための装置に関し、該装置は、（ａ）平坦な表面上の複数のキャビティーを含有する試薬キュベットであって、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成し、ここで各々が２０〜１００μｍの中心間間隔および１０〜１５０ｐＬの容量を有する１０，０００超の反応チャンバーが存在するもの；（ｂ）各反応チャンバー内における反応混合物への１つの既知の窒素性塩基の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体を各反応チャンバーに同時に添加するための試薬送達手段であって、各反応混合物は、鋳型指向性のヌクレオチドポリメラーゼおよび鋳型より少なくとも１ヌクレオチド残基短い相補オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズした１本鎖ポリヌクレオチド鋳型を含むことにより、プライマー鎖の３’末端上への活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下、プライマー鎖の３’末端において各鋳型内に少なくとも１つの対形成していないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の窒素性塩基は鋳型の対形成していないヌクレオチド残基の窒素性塩基と相補的なもの；（ｃ）ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体がプライマー鎖内に取り込まれたか否かを各反応チャンバーにおいて検出するための手段であって、ここでヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の取り込みは、鋳型の対形成していないヌクレオチド残基が取り込まれたヌクレオシド５’−三リン酸前駆体のものに相補的である窒素性塩基組成を有することを示すもの；（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を逐次的に反復するための手段、ここで各逐次的反復は、既知の窒素性塩基組成の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の１つの型の取り込みを付加し、検出するもの；ならびに（ｅ）一連のヌクレオシド前駆体の取り込みから、各反応チャンバーにおいて同時に鋳型の対形成していないヌクレオチド残基の塩基配列を決定するためのデータ処理手段、を含む。
本発明の別の実施形態は、複数の検体を処理する為の装置に関し、装置は以下の要素、即ち、（ａ）光ファイバーバンドル上に少なくとも５０，０００のキャビティー形成面を含む基板をそれ自体に配設したフローチャンバー、各キャビティー形成面は検体を含有するように適合された反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔および２０〜７０μｍの直径を有するもの；（ｂ）反応チャンバーに配設された検体が試薬に曝露されるように、フローチャンバーに１つ以上のレザバーから処理試薬を送達する為の流体手段；および（ｃ）反応チャンバーの各々の由来の一連の光学シグナルを同時に検出するための検出手段であって、連続的な各光学シグナルは、処理試薬と反応チャンバー内に配設された検体の間の相互作用を示すものであり、ここで検出手段はキャビティー形成面と接続されているものを含む。検出手段はＣＣＤカメラであってよい。検体は核酸であってよい。更に、検体は反応チャンバー内に配設された１つ以上の可動性固体支持体上に固定化されてよい。処理試薬は１つ以上の可動性固体支持体上に固定化されてよい。
本発明の別の実施形態は、以下の工程、即ち（ａ）少なくとも５０，０００の個別の反応部位を有するアレイ中の複数の１本鎖核酸鋳型を提供すること；（ｂ）発光にカップリングされたピロホスフェートに基づく配列決定反応を実施するために必要な試薬に核酸鋳型を接触させる工程；（ｃ）感光性装置の該当部分上の複数の反応部位から放射された光を検出する工程；（ｄ）感光性装置の部分の各々に投射された光を他の反応部位の全てに由来するシグナルと区別される電気シグナルに変換する工程；および（ｅ）対応する電気シグナルに由来する個別の反応部位の各々に関する発光に基づいて、核酸鋳型の配列を決定する工程を含む、核酸を配列決定するための方法に関する。該方法は更に、以下の工程、即ち（ａ）異なる生物学的起源ライブラリ由来のフラグメント化核酸を固有にタグ付けすることにより、異なる検出可能な配列タグを有するフラグメント化核酸のライブラリを作製する工程；ならびに（ｂ）フラグメント化核酸を配列決定する工程、および各タグ付けされた核酸フラグメントから検出可能な配列タグを検出する工程を含んでよい。ライブラリは個々に送達されるか、またはライブラリを混合して同時に送達してよい。検出可能な配列タグは２〜５０塩基のオリゴヌクレオチドを含んでよい。
本発明の別の実施形態は、以下の工程、即ち（ａ）大型鋳型核酸分子をフラグメント化することにより、複数のフラグメント化核酸を発生させる工程；（ｂ）複数のフラグメント化核酸の１鎖を個々にビーズに結合することにより、ビーズに個々に結合した１本鎖核酸を発生させる工程；（ｃ）ビーズに個々に結合した１本鎖フラグメント化核酸の集団を、平坦な表面上の少なくとも１０，０００の反応チャンバーのアレイに送達する工程、ここで複数のウェルは１つの１本鎖フラグメント化核酸を有する１つを超えないビーズを含むものであること；および（ｄ）複数の反応チャンバーに対して同時に配列決定反応を実施する工程、を含む核酸を配列決定するための方法に関する。この方法において、反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有してよい。フラグメント化核酸は３０〜５００塩基長であってよい。更に、フラグメント化核酸を工程（ｄ）の前に反応チャンバーにおいて増幅してよい。増幅はポリメラーゼ連鎖反応を用いて行ってよい。配列決定反応は例えばピロホスフェートに基づく配列決定反応であってよい。別の例として、配列決定反応は以下の工程、即ち、（ｆ）１本鎖フラグメント化核酸鋳型に有効量の配列決定プライマーをアニーリングさせ、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長させて配列決定生成物、および所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合に、配列決定反応副生成物を得る工程；ならびに（ｇ）配列決定反応副生成物を同定することにより、複数の反応チャンバー内の核酸配列を決定する工程、を含んでよい。別の例として、配列決定は以下の工程、即ち（ａ）核酸分子の１つまたは複数の１本鎖に２つ以上の配列決定プライマーをハイブリダイズする工程、ここで１つを除く全てのプライマーは可逆的にブロックされたプライマーであること；（ｂ）ブロックされていないプライマーからのポリメラーゼ伸長により、核酸分子上に少なくとも１つの塩基を取り込む工程；（ｃ）ブロックされていないプライマーのさらなる伸長を防止する工程；（ｄ）可逆的にブロックされたプライマーの１つを脱ブロックして、ブロックされていないプライマーとする工程；および（ｅ）可逆的にブロックされたプライマーの少なくとも１つが脱ブロックされて配列の決定の為に使用されるまで工程（ｂ）〜（ｄ）を反復する工程、を含んでよい。反応チャンバーは、光ファイバーバンドルの一端をエッチングすることにより形成されたキャビティーであってよい。
別の態様において、本発明は、参照核酸配列を参照数配列に変換する工程、ここで参照数配列は理想的なフローグラムを含むものであること；１つ以上のヌクレオチドが標的核酸のフラグメントの１つ以上のコピー上を逐次的に流れる場合にシグナルを検出する工程、ここでシグナルは該フラグメントの核酸配列を示すクエリ数配列に対応し、ここでクエリ数配列はクエリフローグラムを含むものであること；理想的なフローグラムとクエリフローグラムとのおおよそのマッチが得られる理想的なフローグラムの１つ以上の位置において、理想的なフローグラムにクエリフローグラムをアラインする工程；理想的なフローグラムの数配列にクエリフローグラムの数配列を比較して、クオリティスコアを発生させる工程、ここでクオリティスコアはクエリフローグラムと理想的なフローグラムの間のアライメントのクオリティを示すものであること；複数のフラグメントに関して前の工程を反復する工程；最高クオリティアライメントに対応する理想的なフローグラム上の位置において、複数のクエリフローグラムをアンカーする工程；１つ以上のクエリフローグラムにより網羅される理想的なフローグラムの各位置において、１つ以上のクエリフローグラムの配列数を平均することにより、コンセンサスフローグラムを含むコンセンサス数配列を発生させる工程；および、コンセンサスフローグラムを核酸配列に変換するものである工程、を含む標的核酸を配列決定する方法を提供する。
１つの実施形態において、本発明の方法は更に、理想的なフローグラムを所定の長さの重複する理想的なサブフローグラムに分割すること、および、理想的なサブフローグラムを指標化することを含む。他の実施形態において、方法は更に、各クエリフローグラムを、理想的なサブフローグラムの所定の長さに対応する長さを各々が有するクエリサブフローグラムに分割することを含む。更に別の実施形態において、該方法は更に指標化された理想的なサブフローグラムを検索することによりクエリフローグラムを理想的なフローグラムにアラインするための位置を決定することを含む。理想的なサブフローグラム、クエリサブフローグラムまたは両方がバイナリコードされることができる。
本発明はまた、１つ以上のヌクレオチドが、標的核酸のフラグメントの１つ以上のコピー上を逐次的に流れる場合に、シグナルを検出する工程；フラグメントの核酸配列を示すクエリ数配列にシグナルを関連付ける工程、ここでクエリ数配列は、クエリフローグラムを含むものであること；前の工程を反復して、複数のクエリフローグラムを作製する工程；複数のクエリフローグラムを相互に比較して、複数のクエリフローグラムの間の重複領域を同定する工程；重複領域において、複数のクエリフローグラムをアラインする工程；アライメントに基づいてクオリティスコアを発生させる工程、ここでクオリティスコアは、アライメントのクオリティを示するものであること；所定の閾値に合致するクオリティスコアを有するアライメントを決定することにより、ペアワイズ重複クエリフローグラムを同定する工程；ペアワイズ重複クエリフローグラムを１つ以上のユニティグ（ｕｎｉｔｉｇ）にグループ分けする工程；各ユニティグ内の１つ以上のマッチ位置の各々において、クエリフローグラムの配列数を平均して、ユニティグコンセンサスフローグラムを含むコンセンサス数配列を発生させる工程；および、各ユニティグコンセンサスフローグラムをユニティグコンセンサス核酸配列に変換する工程、を含む標的核酸を配列決定する方法を提供する。
１つの実施形態において、本明細書に記載した１つ以上のユニティグは、クエリフローグラムの重複が最大の一致する鎖を含む。別の実施形態において、該方法は更に以下の工程、即ち、ユニティグコンセンサス核酸配列を相互に比較することにより、配列の重複を同定する工程；および、共通の重複配列を有するユニティグコンセンサスを連結することにより、コンティグ核酸配列を含む１つ以上のコンティグを形成する工程、を含む。別の実施形態において、本発明の方法は更に以下の工程、即ち、各コンティグ内の境界を同定する工程、ここで境界はユニティグ配列が共通領域から発散している領域であること；および、前の工程において同定された境界においてコンティグを破断する工程、を含む。更に別の実施形態において、該方法は更に以下の工程、即ち、同じフラグメント核酸配列によりそれ自体の末端が重複している何れか２つのコンティグを連結する工程、ここで場合によりこのようにして連結されたコンティグは、境界が同定される場合に破断されるものであること、を含む。別の実施形態において、本発明の方法は更に以下の工程、即ち、フラグメント核酸配列とコンティグ間の全てのアライメントを同定する工程；ここで場合によりコンティグは４未満のフラグメント核酸配列が、アラインされている何れかの位置において破断されるものであること；前の工程におけるコンティグにアラインされたフラグメント核酸配列に関連するクエリフローグラムの配列数を平均することにより、コンティグコンセンサスフローグラムを計算する工程；および、コンティグコンセンサスフローグラムをコンティグコンセンサス核酸配列に変換する工程、を含む。該方法は更にまた、コンセンサス塩基コールが実質的に変化しなくなるまでコンティグコンセンサス核酸配列を用いながら前の工程を反復することにより、最終コンティグコンセンサス配列を計算する工程を含む。
発明の詳細な説明
３９．５ピコリットル程度の小容量において、３０００００もの個別のＰＣＲ反応（ＰＴＰＣＲ）の同時増幅を可能にする新規のプラットホームを本明細書に記載する。全反応由来のプールされたＰＴＰＣＲ産物を洗浄工程により回収し、リアルタイムＰＣＲにより特定の鋳型の存在および豊富さについてアッセイできる。より興味深い点は、ＰＴＰＣＲ産物を固体支持体に移動させ、２色蛍光プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出し、高容量の固相クローニングＤＮＡ増幅および大規模平行配列決定が可能になることが本明細書において明らかにされる。
本発明は（１）配列決定のための迅速および効率的な様式において核酸（例えばゲノム）を調製すること、（２）代表的な様式において核酸を増幅すること、および（３）１プライマーハイブリダイゼーションのみを用いて多重配列決定反応を実施すること、という目的を満足するゲノム配列決定を実施するための方法および装置に関する。本発明は経費効率的な様式における核酸の小サンプルからの遺伝子タイピング、検出および診断に特に適している。これらの各目的の各々を以下に記載する。
定義：
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的および学術的な用語は、本発明が属する技術の当業者が共通して理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または等価な方法および物質を本発明の実施において使用することができ、例示される適当な方法および物質は、以下に記載する通りである。例えば２つより多い工程を含む方法を記載する場合がある。そのような方法において、所定の目標を達成するために全ての工程が必要となるわけではなく、本発明はこれらの個別の目標を達成するための分離した工程の使用も意図する。全ての公開物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。更に、物質、方法および例示は説明を目的とするのみであり、限定する意図はない。
本明細書においては、「ユニバーサルアダプター」という用語は、ＰＣＲプライミングのためのヌクレオチド配列および配列プライミングのためのヌクレオチド配列を含有するように設計された２つの相補的なアニーリングされたオリゴヌクレオチドを指す。場合により、ユニバーサルアダプターは更に、非反復ヌクレオチド配列（即ちＡＣＧＴ、ＣＡＧＴ等）を有する固有な判別用のキー配列を包含してよい。ユニバーサルアダプターのセットは２本鎖ＤＮＡの末端にライゲーションすることができる２つの固有で区別可能な２本鎖配列を含む。従って、同じユニバーサルアダプターまたは異なるユニバーサルアダプターを、ＤＮＡ分子の何れかの末端にライゲーションすることができる。１本鎖であるより大型のＤＮＡ分子に含まれる場合、または、オリゴヌクレオチドとして存在する場合、ユニバーサルアダプターは１本鎖ユニバーサルアダプターと称してもよい。
「標的ＤＮＡ」とは、その配列が本発明の方法および装置により決定するべきＤＮＡを意味する。
結合対とは、関与する分子の３次元構造に依存している特異的な非共有結合性の相互作用により相互作用する分子の対を意味する。特異的結合相手の典型的な対は、抗原−抗体、ハプテン−抗体、ホルモン−受容体、核酸鎖−相補核酸鎖、基質−酵素、基質アナログ−酵素、阻害剤−酵素、炭水化物−レクチン、ビオチン−アビジンおよびウィルス−細胞受容体を包含する。
本明細書において、「判別用のキー配列」という用語は、４つのデオキシリボヌクレオチド（即ちＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の各々の少なくとも１つよりなる配列を指す。同じ判別用配列をＤＮＡフラグメントの全ライブラリに対して使用できる。或いは、異なる判別用キー配列を用いることにより、異なる生物から誘導されたＤＮＡフラグメントのライブラリを追跡することができる。
本明細書において、「複数の分子」という用語は、同じ起源から単離されたＤＮＡを指しており、このため、異なる生物を同じ方法により別個に調製してよい。１つの実施形態において、複数のＤＮＡサンプルをＤＮＡの大型セグメント、全ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウィルスＤＮＡから、またはウィルスＲＮＡ逆転写物から誘導する。このＤＮＡは何れかの起源、例えば哺乳類（即ち、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類またはイヌ）、植物、鳥類、爬虫類、魚類、カビ、細菌またはウィルスから誘導してよい。
本明細書において、「ライブラリ」という用語は単一のＤＮＡ鋳型、セグメント化または全ゲノムの何れかから発生したより小型のＤＮＡ種のサブセットを指す。
本明細書において、「固有なＰＣＲプライミング領域」のような「固有」という用語は、増幅または配列決定すべきＤＮＡ分子内に存在しないか、または、極めて低コピーレベルにおいて存在する配列を指す。
本明細書において、「適合する」という用語は、アダプター分子を結合してよい２本鎖ＤＮＡの末端（即ち平滑末端または粘着末端）を指す。
本明細書において、「フラグメント化」という用語は、ＤＮＡのより大型の分子をＤＮＡのより小型の小片に変換するプロセスを指す。
本明細書において、「大型鋳型ＤＮＡ」という用語は、２５ｋｂ超、好ましくは５００ｋｂ超、より好ましくは１ＭＢ超、最も好ましくは５ＭＢ超のＤＮＡである。
本明細書において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、相補配列のみが相互にハイブリダイズする条件を指す。
本明細書に記載する本発明は、一般的に核酸を処理する為のシステムおよび方法である。該システムおよび方法は、核酸の配列決定を利用した多くの様式において核酸を処理するために使用できる。そのような配列決定は核酸の配列を同定するため、または、核酸フラグメントにおける１ヌクレオチド多形検出のため、核酸発現プロファイリングのため（２つ以上の状態の間で核酸発現プロファイルを比較すること、例えば疾患と正常組織の間で比較、または未治療の組織と薬剤、酵素、放射線または化学療法で治療した組織との間で比較）、ハプロタイピングのため（ヒト被験体に存在する２つの対立遺伝子の各々に対して遺伝子または遺伝子バリエーションを比較）、カリオタイピングのため（典型的には出生時欠損を検出するために、受胎前の胚／胎仔に由来する試験組織中の１つ以上の遺伝子を、「正常な」カリオタイプの被験体に由来する同じ遺伝子と診断的に比較）、および、遺伝子タイピングのため（種の第１の個体の１つ以上の遺伝子を同じ種の他の個体の同じ遺伝子と比較）の為に実施できる。
システムは多くの要素を有する。これらには（１）処理すべき核酸鋳型、（２）核酸鋳型を含有するピコタイタープレート、（３）核酸が処理されると処理試薬が光を発生する、核酸鋳型上に渡って核酸処理試薬を流動可能とするフローチャンバーおよび流体送達手段、（４）核酸が処理されると光を放射し、捕捉された光をデータに変換する光捕捉手段、および（５）データを処理して処理された核酸に関する意味のある情報を与えるデータ処理手段が包含される。システムのこれらの要素の各々を以下に詳細に考察する。
１．核酸鋳型およびその調製
核酸鋳型
本発明により配列決定できる核酸鋳型、即ち核酸ライブラリは一般的に開環型または閉環型の核酸分子を包含できる。「閉環」とは共有結合的に閉鎖した環状核酸分子、例えば環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。「開環」とは５’ホスフェート基および３’ヒドロキシル基を有する線状の１本鎖核酸分子である。
１つの実施形態において、１本鎖核酸は特定の核酸配列の少なくとも１００コピーを含有し、各コピーは末端から末端に共有結合している。いくつかの実施形態において、開環は線状２本鎖核酸分子からインサイチュで形成される。ある開環核酸分子の末端をＤＮＡリガーゼによりライゲーションできる。開環分子の５’および３’末端における配列は、第２の核酸分子の隣接ヌクレオチドの２つの領域、例えばアンカープライマーのアダプター領域（場合によりアダプターと称する）に対し、または、第２のＤＮＡ分子においてほぼ隣接している２つの領域に対し、相補的である。即ち、開環分子の末端は、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション、または、ギャップ充填反応においてＤＮＡポリメラーゼにより伸長することができる。開環は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＬｉｚａｒｄｉの米国特許５，８５４，０３３に詳細に説明されている。開環は、例えば開環のアンカープライマーへのアニーリングの後にＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡの場合）またはＲＮＡリガーゼの存在下に閉環に変換できる。
所望により、パドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブとして核酸鋳型を提供することができる。パドロックプローブは各末端に位置し、リンカー配列により分離されている標的相補配列を含む線状オリゴヌクレオチドである。リンカーは、例えば物理的に切断されているか、制限エンドヌクレアーゼにより消化されている核酸配列のライブラリのメンバーの末端にライゲーションできる。標的配列へのハイブリダイゼーション時に、これらの線状オリゴヌクレオチドの５’および３’末端領域は並置される。この並置により２つのプローブセグメント（適切にハイブリダイズした場合）は酵素的ライゲーション（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼによる）により共有結合可能となり、即ち、特定の標的配列に結合している閉環型分子にプローブを変換する（例えばＮｉｌｓｓｏｎ，ら、１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：２０８５−２０８８参照）。得られたプローブは、遺伝子配列バリアントに対するそれらの特異性および選択性の両方により（例えばＬｉｚａｒｄｉ，ら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２；Ｎｉｌｓｓｏｎ，ら、１９９７．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：２５２−２５５参照）、および生じる反応生成物が特定の標的配列に局在して残存するという事実により、多くの遺伝子配列の同時分析に適している。更に、多くの異なるプローブの分子内ライゲーションは、プライマーの同種ではない対が無関係の増幅産物を生じさせる可能性のある多重ＰＣＲに基づく方法よりも非特異的交差反応性の影響を受けにくいと予測される（例えばＬａｎｄｅｇｒｅｎおよびＮｉｌｓｓｏｎ，１９９７．Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２９：５８５−５９０参照）。
出発核酸鋳型ライブラリは１本鎖または２本鎖の核酸分子の何れかを含むように構築できるが、ただし、ライブラリ内に存在する場合にアンカープライマー配列へのアニーリングの為に使用できるか、またはアニーリングの為に使用可能とすることができる領域を核酸配列が有さなければならない。例えば、ローリングサークル増幅のための鋳型として使用する場合、２本鎖鋳型の領域は、アンカープライマーの伸長のための鋳型として機能するためには、少なくとも一時的に１本鎖であることが必要である。
ライブラリ鋳型は多数のエレメント、例えば限定しないがアンカープライマーに相補的である１つ以上の領域を包含できる。例えば、鋳型ライブラリは配列決定プライマーに相補的な領域、コントロールヌクレオチド領域および後に特徴付けられる配列決定鋳型を含むインサート配列を包含してよい。後に詳述する通り、コントロールヌクレオチド領域を用いて副生成物の量と取り込まれたヌクレオチドの数の間の関係を較正する。本明細書において、「相補」という用語は、特定のヌクレオチド配列にハイブリダイズしてマッチした２本鎖を形成することができるヌクレオチド配列を指す。
１つの実施形態において、ライブラリ鋳型は（ｉ）アンカープライマーに相補的な２つの区別可能な領域、（ｉｉ）配列決定プライマーに相同な１つの領域、（ｉｉｉ）１つの任意のコントロールヌクレオチド領域、（ｉｖ）配列決定すべき例えば３０〜５００、５０〜２００または６０〜１００ヌクレオチドのインサート配列を包含する。鋳型は当然ながらこれらの特徴の２つ、３つまたは４つ全てを包含できる。
鋳型核酸は核酸の何れかの起源、例えば何れかの細胞、組織または臓器から構築することができ、何れかの当該技術において認められた方法により作製できる。適当な方法は例えばゲノムＤＮＡの超音波処理および１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）による消化により、核酸分子の初期集団から所望の範囲の長さのフラグメントを発生させることを包含する。好ましくは、１つ以上の制限酵素は、区別可能な４塩基認識配列を有する。そのような酵素の例は、例えばＳａｕ３Ａｌ、ＭｓｐＩおよびＴａｑＩを包含する。好ましくは、酵素は、対応する制限酵素に関する認識配列を含有する領域を有するアンカープライマーと連携して使用される。いくつかの実施形態において、アンカープライマーのアダプター領域の一方または両方は、既知の制限酵素認識配列に隣接する追加的配列を含有し、これによりアンカープライマーに対する目的の特定の制限フラグメントの捕捉またはアンカープライマーへのアニーリングを可能にする。別の実施形態において、制限酵素はＩＩＳ型制限酵素と共に使用される。
或いは、鋳型ライブラリはＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリを発生させることにより作製できる。ｃＤＮＡライブラリは、所望により、制限エンドヌクレアーゼにより更に処理することにより、特定のＲＮＡに特徴的な３’末端、内部フラグメントまたは単離ＲＮＡの３’末端を含むフラグメントを得ることができる。アンカープライマーのアダプター領域は、鋳型ライブラリ中に存在すると考えられる目的の配列、例えばエンドヌクレアーゼ消化により発生したフラグメント内の既知または推定される配列多形に相補的であってよい。
１つの実施形態において、指標オリゴヌクレオチド（ｉｎｄｅｘｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を鋳型ライブラリのメンバーに結合することにより、続いて、鋳型核酸と鋳型核酸が由来する核酸の集団との相関付けが可能となる。例えば、出発ＤＮＡ集団の１つ以上のサンプルを、前述した方法の何れか（例えば制限消化、超音波処理）を用いて別個にフラグメント化することができる。各サンプルに対して特異的な指標オリゴヌクレオチドを、フラグメント化集団のメンバーの末端に結合、例えばライゲーションする。指標オリゴヌクレオチドは環化、増幅および場合により配列決定のための領域として機能することができ、これにより、誘導元の出発サンプルを同定できるように核酸を指示またはコードするために使用できるようになる。
複数の識別可能な指標プライマーを用いて作製した区別可能な鋳型ライブラリを共に混合して、後の反応に供することができる。ライブラリのメンバーの配列を決定することにより、指標オリゴヌクレオチドに対応する配列の同定が可能となる。この情報に基づいて、何れかの所定のフラグメントの起源を推定することができる。
本発明は、鋳型核酸に共有結合した複数のアンカープライマーまたはアダプターを含有する固体または移動固体基板アレイをもたらすサンプル調製プロセスを包含する。
鋳型核酸が環状である場合、共有結合したアンカープライマーおよび標的核酸の１つ以上のコピー形成は、好ましくは、アンカープライマーを環状核酸の相補領域にアニーリングし、次にポリメラーゼを用いてアニーリングされたアンカープライマーを伸長させて、環状核酸に相補的な配列の１つ以上のコピーを含有する核酸の形成をもたらすことにより行う。
固体または移動固体基板へのアンカープライマーの結合は、アニーリングされたアンカープライマーの伸長の前、最中または後に行うことができる。即ち、１つの実施形態において、１つ以上のアンカープライマーを固体または移動固体基板に連結し、その後アンカープライマーを標的核酸にアニーリングし、ポリメラーゼの存在下に伸長する。或いは、第２の実施形態において、アンカープライマーを先ず標的核酸にアニーリングし、アニーリングされたアンカープライマーの３’ＯＨ末端を、ポリメラーゼを用いて伸長する。次に伸長されたアンカープライマーを固体または移動固体基板に連結する。アンカープライマーの配列を変動させることにより、核酸の集団中に存在する区別可能な標的核酸を特異的に増幅することが可能である。
以下に、増幅および配列決定反応のための鋳型核酸の調製に関する好ましい実施形態を概説する。本発明は以下の７つの一般的工程、即ち（ａ）大型鋳型ＤＮＡまたは全ゲノムＤＮＡサンプルをフラグメント化することにより、複数の消化ＤＮＡフラグメントを発生させる工程；（ｂ）複数の消化されたＤＮＡ試料の上に適合する末端を作製する工程；（ｃ）ユニバーサルアダプター配列のセットをフラグメント化ＤＮＡ分子の末端上にライゲーションすることにより、複数のアダプターライゲーションＤＮＡ分子を作製する工程、ここで各ユニバーサルアダプター配列は、共通のＰＣＲプライマー配列、共通の配列決定プライマー配列および判別用４塩基キー配列を含む既知で固有な塩基配列を有し、ここで１つのアダプターはビオチンに結合しているものであること；（ｄ）複数のライゲーションＤＮＡフラグメントを分離および単離する工程；（ｅ）複数のライゲーションＤＮＡフラグメントの何れかの部分を除去する工程；（ｆ）複数のライゲーションＤＮＡフラグメントのニック修復および鎖伸長；（ｇ）固体支持体にライゲーションＤＮＡフラグメントの各々を結合する工程；ならびに（ｈ）各末端において固有なアダプターが存在する（即ち指向性を与える）１本鎖アダプターライゲーションＤＮＡフラグメントを含む集団を単離する工程、を含むサンプルＤＮＡを調製するための方法を包含する。
以下の考察は本発明の方法に関与する基本的な工程を総括したものである。工程は特定の順序で説明するが、当該分野で知られる通り、工程の順序を操作して同じ結果を得てもよい。そのような操作は本発明者等が意図することである。更に、いくつかの工程は当該分野で知られる通り最小限としてよい。
フラグメント化
本発明の方法の実施において、ＤＮＡサンプルのフラグメント化は、当該分野で知られた何れかの手段により行うことができる。好ましくは、フラグメント化は、酵素的または機械的手段により実施する。機械的手段は、超音波処理または物理的切断である。酵素的手段は、ヌクレアーゼ（例えばデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ））または１つ以上の制限エンドヌクレアーゼによる消化により行ってよい。好ましい実施形態において、フラグメント化により配列が知られていない末端が生じる。
好ましい実施形態において、酵素的手段はＤＮａｓｅＩである。ＤＮａｓｅＩは２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を非特異的に切断して、５’−ホスホリル化ジ、トリおよびオリゴヌクレオチド産物を放出する汎用酵素である。ＤＮａｓｅＩはＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、およびＣａ２＋を含有するが他の塩は含有しない緩衝液中で最適な活性を示す。ＤＮａｓｅＩ消化工程の目的は、大型ＤＮＡゲノムをフラグメント化してライブラリを含むより小型の種とすることである。ＤＮａｓｅＩの切断特性は、マンガン系緩衝液の存在下で使用した場合に、鋳型ＤＮＡのランダム（即ち配列の偏りが無い）な消化および平滑末端ｄｓＤＮＡフラグメントの優先性をもたらすことになる（Ｍｅｌｇａｒ，Ｅ．およびＤ．Ａ．Ｇｏｌｄｔｈｗａｉｔ．１９６８．Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＩＩ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：４４０９）。ゲノム鋳型のＤＮａｓｅＩ処理後に発生する消化産物の範囲は、３つの要因、即ちｉ）使用酵素量（単位）；ｉｉ）消化温度（℃）；およびｉｉｉ）インキュベーション時間（分）に依存している。以下に記載するＤＮａｓｅＩ消化条件は、５０〜７００塩基対（ｂｐ）のサイズ範囲を有するゲノムライブラリを与えるように最適化されている。
好ましい実施形態において、ＤＮａｓｅＩは大型鋳型ＤＮＡまたは全ゲノムＤＮＡを１〜２分間で消化してポリヌクレオチド集団を発生させる。別の好ましい実施形態において、ＤＮａｓｅＩ消化は１０℃〜３７℃の温度で行う。更に別の実施形態において、消化されたＤＮＡフラグメントは５０ｂｐ〜７００ｂｐ長である。
ポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）
Ｍｎ２＋存在下のＤＮａｓｅＩによるゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）鋳型の消化により、平滑末端であるか、または１もしくは２ヌクレオチド長を有する突出末端を有するＤＮＡのフラグメントが生じる。好ましい実施形態において、漸増数の平滑末端をＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて発生させる。他の実施形態において、平滑末端はより低効率のＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼを用いて発生させることができる。Ｐｆｕ「ポリッシング」または平滑末端形成を用いることにより、ＤＮａｓｅＩによるゲノム鋳型消化後に発生する平滑末端種の量を増大させる。フラグメントポリッシングの為にＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用すると、５’突出末端での埋め合わせが起こる。更に、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡエクステンダーゼ活性を示さないが、アダプターライゲーションに使用できる平滑末端ＤＮＡフラグメントの量を更に増大させる単一および二重のヌクレオチド伸長物の除去をもたらす３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は有している（Ｃｏｓｔａ，Ｇ．Ｌ．およびＭ．Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ．１９９４ａ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ ＰＣＲ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ３（５）：Ｓ９５；Ｃｏｓｔａ，Ｇ．Ｌ．，Ａ．ＧｒａｆｓｋｙおよびＭ．Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ．１９９４ｂ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ３（６）：３３８；Ｃｏｓｔａ，Ｇ．Ｌ．およびＭ．Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ．１９９４ｃ．Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｔ４ ｏｒ Ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１２）：２４２３）。
アダプターライゲーション
核酸のライブラリを固体基板に結合しようとする場合、好ましくは、核酸鋳型は知られた手法を用いてアンカープライマー配列にアニーリングされる（例えばＨａｔｃｈ，ら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０；Ｋｏｏｌの米国特許５，７１４，３２０およびＬｉｚａｒｄｉの米国特許５，８５４，０３３参照）。一般的に鋳型核酸配列へのアンカープライマーのアニーリングのための如何なる手順も、それがアンカープライマーのアダプター領域と鋳型ライブラリに存在する配列との間に特異的な、即ち完全またはほぼ完全な相補性の形成をもたらす限り、適している。
好ましい実施形態において、フラグメント化およびＤＮＡライブラリの平滑末端形成の後、ユニバーサルアダプター配列を各ＤＮＡフラグメントに付加する。４つのデオキシリボヌクレオチド（即ちＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の各々の少なくとも１つよりなる固有な判別用キー配列が場合によって続く、典型的には２０ｂｐ長の固有な配列決定プライミング領域のセットに隣接して位置する、典型的には２０ｂｐ長の固有なＰＣＲプライミング領域のセットを含むようにユニバーサルアダプターを設計する。好ましい実施形態において、判別用キー配列は４塩基長である。別の実施形態において、判別用キー配列は１〜４塩基の組合せであってよい。更に別の実施形態において、各固有なユニバーサルアダプターは４４ｂｐ長である。好ましい実施形態において、ユニバーサルアダプターを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡフラグメントの各末端にライゲーションすることにより、各ＤＮＡフラグメントへの８８ｂｐの総ヌクレオチド付加を発生させる。異なるユニバーサルアダプターが各々のＤＮＡライブラリ調製の為に特別に設計されており、従って、各生物の固有な識別子を与えるものとなる。ユニバーサルアダプターのサイズおよび配列は当該分野で知られる通り変更してよい。
例えば、２つの区別可能なユニバーサルアダプター（即ち「第１」および「第２」）を調製するためには、１本鎖オリゴヌクレオチドを市販品販売元より購入してよい（即ち、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＡまたはＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）。１つの実施形態において、ユニバーサルアダプターオリゴヌクレオチド配列は、５’および３’末端両方におけるホスホジエステル連結の代わりに２または３のホスホロチオエート連結を用いての合成の間に修飾する。未修飾のオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによる急速な分解に供され、従って有用性は限定されている。ヌクレアーゼは、ヌクレオチド塩基間のホスホジエステル連結を切断することによりポリヌクレオチド鎖の加水分解切断を触媒する酵素である。即ち、オリゴヌクレオチド用途における使用のために入手可能な１つの簡素で広範に使用されているヌクレアーゼ耐性の化学的性質は、ホスホロチオエート修飾である。ホスホロチオエートにおいて、イオウ原子がオリゴヌクレオチド骨格の非架橋酸素を置き換え、これにより全ての形態のヌクレアーゼ消化に耐性（即ちエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの両方に対して耐性）とする。各オリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ精製することにより合成オリゴヌクレオチド調製物に夾雑または偽性のオリゴヌクレオチド配列が存在しないようにする。ユニバーサルアダプターは平滑末端のフラグメント化ＤＮＡへの直接的ライゲーションを可能とするように設計される。２本鎖ユニバーサルアダプターの各セットは、平滑末端ＤＮＡフラグメントにはライゲーションすることができず、これらの末端における相互のライゲーションを防止する非相補の５’側４塩基突出末端を含有するＰＣＲプライミング領域を用いて設計する。従って、結合はアダプターの３’末端とＤＮＡフラグメントの５’末端の間において、または、ＤＮＡフラグメントの３’末端とアダプターの５’末端の間においてのみ起こることができる。２本鎖ユニバーサルアダプター配列は、主に相補オリゴヌクレオチドのアニーリングが可能であり、非相補オリゴヌクレオチド間の交差ハイブリダイゼーションを防止することが可能であるようにする配列を用いて設計された１本鎖オリゴヌクレオチドを用いることにより発生させる。１つの実施形態において、ユニバーサルアダプターの９５％が相補オリゴヌクレオチドのアニーリングから形成される。好ましい実施形態において、ユニバーサルアダプターの９７％が相補オリゴヌクレオチドのアニーリングから形成される。より好ましい実施形態において、ユニバーサルアダプターの９９％が相補オリゴヌクレオチドのアニーリングから形成される。最も好ましい実施形態において、ユニバーサルアダプターの１００％が相補オリゴヌクレオチドのアニーリングから形成される。
２つのアダプターの一方を支持体結合部分に連結できる。好ましい実施形態において、５’ビオチンを第１のユニバーサルアダプターに付加することにより、後のｓｓＤＮＡ鋳型の単離およびビオチン結合タンパク質（即ちストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはアビジン）で飽和した固体支持体の表面へのユニバーサルアダプターの非共有結合カップリングを可能にする。他の連結は当該分野で良く知られており、ビオチン−ストレプトアビジンの代わりに使用してよい（例えば抗体／抗原エピトープ、受容体／リガンドおよびオリゴヌクレオチドの対形成または相補性）。１つの実施形態において、固体支持体はビーズ、好ましくはポリスチレンビーズである。１つの好ましい実施形態において、ビーズは約２．８μｍの直径を有する。本明細書において、このビーズは「サンプルプレップビーズ」と称する。
各ユニバーサルアダプターは、２つのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、即ち一方がセンス配列を含有し、第２のものがアンチセンス（相補）配列を含有するものを組合せてアニーリングすることにより調製してよい。ユニバーサルアダプター設計の模式的表示を図２に概説する。
ライゲーション産物の単離
ユニバーサルアダプターライゲーションにより各末端上のアダプター、未結合の単一のアダプターおよびアダプター２量体を有するフラグメント化ＤＮＡの形成が起こる。好ましい実施形態において、アガロースゲル電気泳動を、ライゲーションしていない単一アダプターおよびアダプター２量体集団からアダプター結合型ＤＮＡライブラリ集団を分離および単離するための方法として使用する。他の実施形態において、フラグメントはサイズ排除クロマトグラフィーまたはスクロース沈降により分離してよい。ＤＮＡのＤＮａｓｅＩ消化の手順は典型的には５０〜７００ｂｐの範囲のライブラリ集団をもたらす。好ましい実施形態において、ＤＮＡマーカーの存在下にアガロースゲル電気泳動を実施した場合、８８ｂｐのユニバーサルアダプターセットの付加がＤＮＡライブラリ集団をより大きいサイズにシフトさせ、約１３０〜８００ｂｐのサイズ範囲の移動プロファイルをもたらし；アダプター２量体は８８ｂｐに移動し；ライゲーションしていないアダプターは４４ｂｐに移動する。従って、２００〜８００ｂｐの範囲のサイズの多くの２本鎖ＤＮＡライブラリをアガロースゲルから物理的に単離し、標準的なゲル抽出手法により精製することができる。１つの実施形態において、アダプター結合型ライゲーションＤＮＡライブラリのゲル単離により、２００〜４００ｂｐのサイズの範囲のライブラリ集団が回収されることになる。アダプターライゲーションフラグメントを区別する他の方法は、当業者の知る通りである。
ニック修復
ユニバーサルアダプターに使用するＤＮＡオリゴヌクレオチドは５’ホスホリル化されていないため、リガーゼ処理後のフラグメント化ＤＮＡの３’接合部にはギャップが存在する（図３Ａ参照）。これらの２つの「ギャップ」または「ニック」はニック化されたＤＮＡフラグメントに結合し、鎖置換し、および伸長することができるＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて埋めることができる。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼはニックを認識し、ニック化された鎖を置換し、ニック修復および非ニック化２本鎖ＤＮＡの形成がもたらされるような様式において鎖を伸長させる能力を有している（図３Ｂおよび３Ｃ参照）（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｊ．Ｗ．ＦａｒｃｈａｕｓおよびＭ．Ｃ．Ｄａｖｉｓ．２００１．ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ａｓ ｅｎｇｉｎｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３１：３７０）。
幾つかの修飾用酵素がニック修復工程の為に利用されており、例えば限定しないがポリメラーゼ、リガーゼおよびキナーゼが挙げられる。この用途の為に使用できるＤＮＡポリメラーゼは例えばＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡのｐｏｌＩ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓのｐｏｌＩおよびバクテリオファージｐｈｉ ２９を包含する。好ましい実施形態において、鎖置換酵素Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｐｏｌＩ（ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ）を使用してニック化ｄｓＤＮＡを修復し、非ニック化ｄｓＤＮＡをもたらす（図３Ｄ参照）。別の好ましい実施形態において、リガーゼはＴ４であり、キナーゼはポリヌクレオチドキナーゼである。
１本鎖ＤＮＡの単離
非ニック化ｄｓＤＮＡの発生の後、第１および第２のアダプター分子の両方を含むｓｓＤＮＡは単離しなければならない（所望の集団は以下にアスタリスクを付して示す通りであり；「Ａ」および「Ｂ」は第１および第２のアダプターに対応する）。２本鎖ＤＮＡライブラリは、以下の配置において結合したアダプターを有することになる。
１．ユニバーサルアダプターＡ−ＤＮＡフラグメント−ユニバーサルアダプターＡ
２．ユニバーサルアダプターＢ−ＤＮＡフラグメント−ユニバーサルアダプターＡ＊
３．ユニバーサルアダプターＡ−ＤＮＡフラグメント−ユニバーサルアダプターＢ＊
４．ユニバーサルアダプターＢ−ＤＮＡフラグメント−ユニバーサルアダプターＢ。
ユニバーサルアダプターは、１つのみのユニバーサルアダプターが５’ビオチン部分を有するように設計される。例えばユニバーサルアダプターＢが５’ビオチン部分を有する場合、ストレプトアビジンでコーティングされたサンプルプレップビーズを用いて全ての２本鎖ＤＮＡライブラリ種をユニバーサルアダプターＢに結合させることができる。２つのユニバーサルアダプターＡ種を含有するゲノムライブラリ集団は、５’ビオチン部分を含有せず、ストレプトアビジン含有サンプルプレップビーズに結合せず、このため洗浄除去することができる。ビーズに結合したまま残存することになる種は、ユニバーサルアダプターＡおよびＢおよび２つのユニバーサルアダプターＢ配列を有するもののみである。２つのユニバーサルアダプターＢ配列（即ち各５’末端にビオチン部分）を有するＤＮＡ種は、２本鎖を構成する各鎖が結合することになるため、各末端においてストレプトアビジンでコーティングされたサンプルプレップビーズに結合することになる。ユニバーサルアダプターＡおよびユニバーサルアダプターＢを有する２本鎖ＤＮＡ種は、単一の５’ビオチン部分を含有することになり、このため、１端のみにおいてストレプトアビジンコーティングビーズに結合することになる。サンプルプレップビーズは磁性を有し、従って、サンプルプレップビーズは、磁化されれば固体支持体にカップリングしたまま残存することになる。従って、低塩（「融解」または変性）溶液の存在下、単一のユニバーサルアダプターＡおよび単一のユニバーサルアダプターＢの配列を含有するＤＮＡフラグメントのみが相補未結合鎖を放出することになる。この１本鎖ＤＮＡ集団を、例えばピロホスフェート配列決定、リアルタイム定量的ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動またはキャピラリーゲル電気泳動により収集および定量してよい。
鋳型のビーズへの結合
１つの実施形態において、本発明の方法により作製されたｓｓＤＮＡライブラリを定量することにより、単位体積あたりの分子の数を計算できる。これらの分子を、ｓｓＤＮＡ種のユニバーサルアダプター末端のＰＣＲプライミング領域に相補的なオリゴヌクレオチド捕捉プライマーを含有する固体支持体（ビーズ）にアニーリングする。次に、ビーズを増幅プロトコールに移行させる。次にＤＮＡビーズ上に捕捉された単一種のクローン集団を配列決定する。１つの実施形態において、固体支持体はビーズ、好ましくはセファロースビーズである。本明細書において、このビーズは「ＤＮＡ捕捉ビーズ」と称する。
本発明において使用するビーズは何れかの好都合なサイズのものであり、様々な既知の物質から加工されたものであってよい。そのような物質の例は無機物質、天然ポリマーおよび合成ポリマーを包含する。これらの物質の具体的な例はセルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス；シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドの共重合体、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン等（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６４，３，１３８５−１３９０参照）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然海綿、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン（例えばＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ）およびアガロースゲル（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ）および当該分野で知られた固相支持体を包含する。１つの実施形態において、ＤＮＡ捕捉ビーズの直径は２０〜７０μｍの範囲である。好ましい実施形態において、ＤＮＡ捕捉ビーズの直径は２０〜５０μｍの範囲である。より好ましい実施形態において、ＤＮＡ捕捉ビーズの直径は約３０μｍである。
１つの態様において、本発明は（ａ）本明細書に開示した方法によりｓｓＤＮＡ鋳型の集団を調製すること；（ｂ）固体支持体あたりＤＮＡ１分子となるように、固体支持体に各ＤＮＡ鋳型を結合すること；（ｃ）増幅により、各固体支持体上に各ＤＮＡフラグメントのクローン集団が発生するように、１本鎖鋳型の集団を増幅すること；（ｄ）ビーズのクローン集団を配列決定すること、を含む固体支持体のライブラリを発生させるための方法を包含する。
１つの実施形態において、固体支持体はＤＮＡ捕捉ビーズである。別の実施形態において、ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはウィルスＤＮＡの逆転写物である。ＤＮＡは例えばビオチン−ストレプトアビジン連結、共有結合を介して、または相補オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより、固体支持体に結合してよい。１つの実施形態において、各ＤＮＡ鋳型はユニバーサルアダプターのセットにライゲーションする。別の実施形態において、ユニバーサルアダプター対は共通のＰＣＲプライマー配列、共通の配列決定プライマー配列および判別用キー配列を含む。固有な末端を与えることができる１本鎖ＤＮＡを単離し；次に１本鎖分子を固体支持体に結合し、クローン集団増殖のための増幅手法に供する。ＤＮＡはＰＣＲにより増幅してよい。
別の特徴において、本発明は本明細書に記載した方法により作製された固体支持体のライブラリを提供する。
本方法により調製された核酸鋳型（例えばＤＮＡ鋳型）は多くの分子生物学的な手順、例えば直線状伸長、ローリングサークル増幅、ＰＣＲおよび配列決定の為に使用してよい。本方法は例えばＤＮＡに対するビーズの高モル比を用いることにより連結反応において行うことができる。１本鎖ＤＮＡ分子の捕捉はポアソン分布に従い、ＤＮＡの結合していないビーズのサブセットおよび２分子のＤＮＡが結合しているビーズのサブセットをもたらす。好ましい実施形態において、ＤＮＡ１分子に対して１ビーズとなる。更に、単離されたライブラリの追加的操作の為に有用であるアダプター中の追加的要素を包含することも可能である。
２．核酸鋳型増幅
核酸鋳型を本発明の方法により配列決定するために、コピー数は、光検出手段により検出可能なシグナルが生成するために十分なコピー数の鋳型が発生するように増幅しなければならない。何れかの適当な核酸増幅手段を使用してよい。
多くのインビトロ核酸増幅手法が報告されている。これらの増幅方法を分類すると以下の通り、即ち、（ｉ）温度サイクリング−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えばＳａｉｋｉ，ら、１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５４参照）、リガーゼ連鎖反応（例えばＢａｒａｎｙ，１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１８９−１９３；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，ら、１９９０．Ｇｅｎｅ ８９：１１７−１２２参照）および転写系増幅（例えばＫｗｏｈ，ら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７参照）を必要とするもの、および（ｉｉ）等温増幅系−自己持続性配列複製（例えばＧｕａｔｅｌｌｉ，ら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８参照）；ＱＢレプリカーゼ系（例えばＬｉｚａｒｄｉ，ら、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２参照）；鎖置換増幅、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２ Ａｐｒ １１；２０（７）：１６９１−６；およびＰＮＡＳ １９９２ Ｊａｎ ｌ；８９（ｌ）：３９２−６；およびＮＡＳＢＡ Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９１ Ｄｅｃ；３５（３）：２７３−８６に記載されている方法となる。
１つの実施形態において、等温増幅を使用する。等温増幅はまたローリングサークル系増幅（ＲＣＡ）を包含する。ＲＣＡは例えばＫｏｏｌの米国特許５，７１４，３２０およびＬｉｚａｒｄｉの米国特許５，８５４，０３３；Ｈａｔｃｈ，ら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０に検討されている。ＲＣＡの結果はアンカープライマーの３’末端から伸長する（即ち固体支持体マトリクスに連結している）単一のＤＮＡ鎖であり、、プライマー配列にアニーリングした環状鋳型の多数コピーを含有するコンカテマーを包含する。典型的には、各々が例えば約３０〜５００、５０〜２００または６０〜１００ヌクレオチドサイズ範囲のサイズを有する環状鋳型の１０００〜１００００以上のコピーをＲＣＡで得ることができる。
アンカープライマーへの環状核酸分子のアニーリング後のＲＣＡ増幅の産物を、図１１Ａに模式的に示す。環状鋳型核酸１０２は、それ自体の５’末端において表面１０６に連結されており、伸長のために使用できる遊離の３’ＯＨを有するアンカープライマー１０４にアニーリングされる。環状鋳型核酸１０２は２つのアダプター領域１０８および１１０を有し、これらはアンカープライマー１０４における配列の領域と相補的である。同様に、環状鋳型核酸１０２に包含されるものは、インサート１１２および後述する配列決定反応において使用される配列決定プライマーに相同の領域１１４である。
アニーリングにより、アンカープライマー１０４上の遊離の３’ＯＨは鋳型核酸１０２内部の配列を用いて伸長できる。アンカープライマー１０２は鋳型に沿って多数回伸長することができ、各反復時にはアンカープライマーから伸長する配列に対して環状鋳型核酸に相補的な配列を付加する。４反復、または４ラウンドのローリングサークル複製は、伸長されたアンカープライマーの増幅産物１１４として図１１Ａに示す通りである。アンカープライマーの伸長により、基板１０６に共有結合あるいは物理的に結合した増幅産物がもたらされる。多くのインビトロの核酸増幅手法を利用することによりアンカープライマー配列を伸長してよい。増幅は典型的にはポリメラーゼ、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、および１、２、３または４種のヌクレオチド三リン酸、および場合により副次的結合タンパク質の存在下に行う。一般的に、プライミングされた３’−ＯＨ基を伸長させることができる何れのポリメラーゼも、それが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている限り、使用できる。適当なポリメラーゼは例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、バクテリオファージＴ４およびＴ７、およびＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを包含する。適当なＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼは、例えばトリ骨髄芽球症ウィルス由来の逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウィルス由来逆転写酵素およびヒト免疫不全ウィルスＩ由来逆転写酵素を包含する。
環状鋳型およびアンカープライマーの別の実施形態は、図１１Ｂ〜１１Ｄにおいてより詳細に示す。図１１Ｂは、アンカープライマーの伸長のための鋳型としてライゲーション時に作用するアニーリングされた開環線状基質を示す。配列５’−ｔｃｇ ｔｇｔ ｇａｇ ｇｔｃ ｔｃａ ｇｃａ ｔｃｔ ｔａｔ ｇｔａ ｔａｔ ｔｔａ ｃｔｔ ｃｔａ ｔｔｃ ｔｃａ ｇｔｔ ｇｃｃ ｔａａ ｇｃｔ ｇｃａ ｇｃｃ ａ−３’（配列番号５）を有する鋳型分子を、それ自体の５’末端のビオチンリンカーおよび配列５’−ｇａｃ ｃｔｃ ａｃａ ｃｇａ ｔｇｇ ｃｔｇ ｃａｇ ｃｔｔ−３’（配列番号６）を有するアンカープライマーにアニーリングする。鋳型のアニーリングにより鋳型分子の５’および３’末端が並置される。アンカープライマーの３’ＯＨは環状鋳型を用いて伸長できる。
単一のヌクレオチド多形を同定するための環状鋳型およびアンカープライマーの使用は、図１１Ｃに示す通りである。示されているものは、配列５’−ｇａｃ ｃｔｃ ａｃａ ｃｇａ ｔｇｇ ｃｔｇ ｃａｇ ｃｔｔ-３’（配列番号７）を有する一般のアンカープライマーである。アンカープライマーは、配列５’ - ｔｔｔ ａｔａ ｔｇｔ ａｔｔ ｃｔａ ｃｇａ ｃｔｃ ｔｇｇ ａｇｔ ｇｔｇ ｃｔａ ｃｃｇ ａｃｇ ｔｃｇ ａａｔ ｃｃｇ ｔｔｇ ａｃｔ ｃｔｔ ａｔｃ ｔｔｃ ａ−３’（配列番号８）を有するＳＮＰプローブにアニーリングする。ＳＮＰプローブは、配列５’−ｃｔａ ｇｃｔ ｃｇｔ ａｃａ ｔａｔ ａａａ ｔｇａ ａｇａ ｔａａ ｇａｔ ｃｃｔ ｇ−３’（配列番号９）を有する遺伝子のＳＮＰ含有領域に領域にハイブリダイズする。ＳＮＰプローブ複合体への多形含有核酸配列のハイブリダイゼーションにより、その後のＳＮＰプローブのライゲーションおよび環化が可能となる。ＳＮＰプローブは、その５’および３’末端が、図１１Ｃに示す通り、多形部位の領域内で接するようにゲノム領域にアニーリングするように設計される。環化ＳＮＰプローブはその後、本明細書に記載の方法を用いて伸長および配列決定することができる。多形を有さない核酸は、ＳＮＰプローブの５’および３’末端の並置をもたらすようにはハイブリダイズしない。その場合、ＳＮＰプローブはその後の伸長に必要な環状基質を形成するようにライゲーションすることはできない。
図１１Ｄは環状鋳型分子に沿ったギャップオリゴヌクレオチドの使用を説明する。配列５’−ｇａｃ ｃｔｃ ａｃａ ｃｇａ ｇｔａ ｇｃａ ｔｇｇ ｃｔｇ ｃａｇ ｃｔｔ−３’（配列番号１０）を有するアンカープライマーをビオチンリンカーを介して表面に結合させる。配列５’−ｔｃｇ ｔｇｔ ｇａｇ ｇｔｃ ｔｃａ ｇｃａ ｔｃｔ ｔａｔ ｇｔａ ｔａｔ ｔｔａ ｃｔｔ ｃｔａ ｔｔｃ ｔｃａ ｇｔｔ ｇｃｃ ｔａａ ｇｃｔ ｇｃａ ｇｃｃ ａ−３’（配列番号１１）を有する鋳型分子をアンカープライマーにアニーリングすることにより、２本鎖領域が隣接するアンカープライマーにおける部分的に１本鎖の、またはギャップを有する領域を得る。次に配列５’−ｔｇｃ ｔａｃ−３’を有するギャッピング分子をアンカープライマーにアニーリングする。鋳型分子へのギャップオリゴヌクレオチドの両端のライゲーションによりローリングサークル増幅のための鋳型として機能できる環状核酸分子の形成が起こる。
ＲＣＡは、２本鎖分子の複製が起点において開始する時点で起こることができる。その後、ニックが鎖の１つを開環させ、ニックにより発生した遊離の３’末端ヒドロキシル部分がＤＮＡポリメラーゼの作用により伸長される。新たに合成された鎖は最終的に元の親ＤＮＡ鎖を置き換える。この上記した型の複製は、複製点が環状鋳型鎖を「周回（ローリングアラウンド）」しているものとして想定され、理論的に無制限にそれが続くことから、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）として知られている。更にまた、新たに合成されたＤＮＡ鎖は元の鋳型に共有結合しているため、置き換えられた鎖はその５’末端において元のゲノム配列（例えば遺伝子または他の目的の配列）を保有する。ＲＣＲにおいて、元のゲノム配列は、元の鋳型配列に相補的な、様々な「複製単位」により後続され、ここで各複製単位は元の鋳型配列の継続的な回転により合成される。従って、各々の後の進化により、前の複製サイクルにおいて合成されたＤＮＡが置き換えられる。
ＲＣＡ反応の使用を介して、環化された分子に相補的な多くのタンデムコピーを呈する鎖を発生させてよい。例えば、ＲＣＡは近年、ヒトゲノムＤＮＡサンプルにおける単コピー遺伝子を検出するための環化パドロックプローブのインビトロの等温カスケード増幅反応を行うために利用されている（Ｌｉｚａｒｄｉ，ら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２参照）。更に、ＲＣＡは固相系アッセイにおいて単一のＤＮＡ分子を検出するために使用されているが、この手法をインサイチュハイブリダイゼーションに適用した場合には困難が生じる（Ｌｉｚａｒｄｉ，ら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２参照）。
所望により、ＲＣＡは上昇した温度において、例えば３７℃、４２℃、４５℃、５０℃、６０℃または７０℃より高温において行うことができる。更に、ＲＣＡは先ず低温、例えば室温で行い、次に上昇した温度に移行させることができる。上昇した温度のＲＣＡは、好ましくは熱安定性核酸ポリメラーゼ、および上昇した温度において安定で特異性を伴いながらアニーリングすることができるプライマーを用いて行う。
ＲＣＡはまた天然に存在しないオリゴヌクレオチド、例えばペプチド核酸を用いて実施することもできる。更に、ＲＣＡは１本鎖結合タンパク質のような副次的タンパク質の存在下に行うことができる。
ＲＣＡと称される固体支持体に固定化されている短鎖ＤＮＡ分子を増幅する方法の開発は、近年文献において報告されている（例えばＨａｔｃｈ，ら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０；Ｚｈａｎｇ，ら、１９９８．Ｇｅｎｅ ２１１：２７７−８５；Ｂａｎｅｒ，ら、１９９８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：５０７３−５０７８；Ｌｉｕ，ら、１９９５．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７−１５９４；ＦｉｒｅおよびＸｕ，１９９５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：４６４１−４６４５；Ｎｉｌｓｓｏｎ，ら、１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：２０８５−２０８８参照）。ＲＣＡはハイブリダイゼーションおよびＤＮＡリガーゼ反応を介して特異的ＤＮＡ配列を標的化する。次に環状産物をローリングサークル複製反応における鋳型として後に使用する。
等温増幅系の他の例は、例えば（ｉ）自己持続性配列複製（例えばＧｕａｔｅｌｌｉ，ら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８参照）、（ｉｉ）ＱＢレプリカーゼ系（例えばＬｉｚａｒｄｉ，ら、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２参照）および（ｉｉｉ）核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡＴＭ；Ｋｉｅｖｉｔｓ，ら、１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：２７３−２８６参照）を包含する。
核酸鋳型のＰＣＲ増幅
好ましい実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて鋳型核酸の追加的コピーを発生させる。ＰＣＲ増幅工程はピコタイタープレート上への核酸鋳型の分配の前に行ってよく、または、核酸鋳型がピコタイタープレート上に分配された後に行ってもよい。
ビーズエマルジョンＰＣＲ増幅
好ましい実施形態において、ＰＣＲ増幅工程はピコタイタープレート上への核酸鋳型の分配の前に行う。
特に好ましい実施形態において、本明細書において「ビーズエマルジョン増幅」と称する新規な増幅系は、増幅すべき鋳型核酸（例えばＤＮＡ）を好ましくは全般的に球形のビーズの形態である固体支持体に結合することにより行われる。本発明のサンプル調製方法に従って調製された１本鎖ＤＮＡのライブラリは、本増幅方法において使用されるビーズに結合すべき出発核酸鋳型ライブラリの１つの適当な供給源の例である。
ビーズを、鋳型ＤＮＡのある領域に相補的である多数の単一のプライマー種（即ち図６におけるプライマーＢ）に連結する。鋳型ＤＮＡをビーズ結合プライマーにアニーリングさせる。ビーズを水性反応混合物に懸濁させ、次に油中水エマルジョン中にカプセル化する。エマルジョンは、熱安定性油相に封入された直径約６０〜２００μの個別の水相の微小液滴よりなる。各微小液滴は、好ましくは増幅反応溶液（即ち核酸増幅に必要な試薬）を含有する。増幅の例はＰＣＲ反応混合物（ポリメラーゼ、塩、ｄＮＴＰ）およびＰＣＲプライマー対（プライマーＡおよびプライマーＢ）である。図６Ａを参照。微小液滴集団のサブセットはまた、ＤＮＡ鋳型を含むＤＮＡビーズを含有する。この微小液滴サブセットは増幅の基礎となる。このサブセット内にないマイクロカプセルは鋳型ＤＮＡを有さず、、増幅に関与しない。１つの実施形態において、増幅手法はＰＣＲであり、ＰＣＲプライマーは非対称ＰＣＲを実施するために８：１または１６：１の比（即ち１つのプライマー８または１６に対して第２のプライマー１）で存在する。
この考察において、ＤＮＡはビーズに固定化したオリゴヌクレオチド（プライマーＢ）にアニーリングする。サーモサイクリング中（図６Ｂ）、１本鎖ＤＮＡ鋳型とビーズ上の固定化Ｂプライマーとの間の結合が破断され、鋳型が周囲のマイクロカプセル化された溶液中に放出される。増幅溶液、この場合ＰＣＲ溶液は、追加的な溶液相のプライマーＡおよびプライマーＢを含有する。結合動態は、固定化されたプライマーよりも溶液相のプライマーに対して急速であるため、溶液相Ｂプライマーは鋳型の相補ｂ’領域に容易に結合する。早期のＰＣＲにおいて、ＡおよびＢ鎖の両方が等しく良好に増幅される（図６Ｃ）。
中期のＰＣＲまでに（即ちサイクル１０〜３０）、Ｂプライマーは枯渇し、指数的増幅は停止する。次に反応は非対称増幅に進み、アンプリコンの集団はＡ鎖が優勢となる（図６Ｄ）。後期のＰＣＲにおいて（図６Ｅ）、３０〜４０サイクル後、非対称増幅により溶液中のＡ鎖の濃度が増大する。過剰なＡ鎖はＢプライマーに固定化されたビーズへのアニーリングを開始する。次に熱安定性ポリメラーゼは、鋳型としてＡ鎖を利用することによりアンプリコンの固定化ビーズ結合Ｂ鎖を合成する。
最終相のＰＣＲにおいて（図６Ｆ）、連続熱サイクリングにより強制的にビーズ結合プライマーへの追加的アニーリングを起こす。溶液相増幅はこの段階では最小限であってよいが固定化されたＢ鎖の濃度は増大する。次に、エマルジョンを崩壊させ、相補Ａ鎖を除去する変性（熱、ｐＨ等による）により固定化された産物を１本鎖化する。Ａプライマーを固定化鎖のＡ’領域にアニーリングし、固定化された鎖に配列決定酵素および何れかの必要な補助的タンパク質をロードする。次にビーズを、認識されたピロホスフェート手法を用いて配列決定する（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，２７４，３２０、６，２５８，５６８および６，２１０，８９１に記載されている）。
鋳型設計
好ましい実施形態において、ビーズエマルジョン増幅により増幅すべきＤＮＡ鋳型はＤＮＡの集団、例えばゲノムＤＮＡライブラリまたはｃＤＮＡライブラリであり得る。集団の各メンバーは、第１の末端における共通の核酸配列および第２の末端における共通の核酸配列を有する。これは例えばＤＮＡ集団の１つの末端に第１のアダプターＤＮＡ配列を、第２の末端に第２のアダプターＤＮＡ配列をライゲーションすることにより達成できる。多くのＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラリは、クローニングベクター（例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の性質により、各メンバーＤＮＡの第１の末端における共通の配列および第２の末端における第２の共通の配列を有するというこの説明に適合している。ＤＮＡ鋳型はインビトロ増幅（ＰＣＲおよび非対称ＰＣＲの好ましい増幅手法を包含する）に従う如何なるサイズのものであってもよい。好ましい実施形態において、ＤＮＡ鋳型は約１５０〜７５０ｂｐのサイズ、例えば約２５０ｂｐのサイズである。
捕捉ビーズへの核酸鋳型の結合
第１の工程において、増幅すべき１本鎖核酸鋳型を捕捉ビーズに結合させる。核酸鋳型は、当該分野で知られた何れかの様式において固体支持体捕捉ビーズに結合してよい。好ましい顕微鏡用ビーズのような固体支持体にＤＮＡを結合するための多くの方法が、当該分野に存在している。本発明によれば、ビーズへのＤＮＡの共有結合による化学結合は、ホスホアミデート結合を介してアミンコーティング捕捉ビーズにＤＮＡ上の５’−ホスフェートを連結させる標準的なカップリング剤、例えば水溶性カルボジイミドを用いて行うことができる。別の代替法は、同様の化学特性を用いながら先ず特定のオリゴヌクレオチドリンカーをビーズにカップリングし、次にＤＮＡリガーゼを用いることによりＤＮＡをビーズ上のリンカーに連結することである。ビーズにオリゴヌクレオチドを連結するための他の連結化学特性は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびその誘導体の使用を包含する。そのような方法において、オリゴヌクレオチドの一端は固体支持体と共有結合を形成する反応性の基（例えばアミド基）を含有し、リンカーの他の末端は、固定化すべきオリゴヌクレオチドと結合できる第２の反応性の基を含有する。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは共有結合によりＤＮＡ捕捉ビーズに結合する。しかしながら、非共有結合連結、例えばキレート形成または抗原抗体複合体もまた、ビーズにオリゴヌクレオチドを連結するために使用してよい。
制限酵素部位由来の重複末端、またはバクテリオファージラムダ系クローニングベクターの「粘着末端」のようなＤＮＡフラグメントの末端における固有な配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるが、平滑末端のライゲーションも有益に使用できる。このような方法は米国特許５，６７４，７４３に詳述されている。ビーズを固定化するために使用した何れかの方法を継続することにより本発明の方法の工程を通して固定化されたオリゴヌクレオチドを結合することが好ましい。
１つの実施形態において、各捕捉ビーズは核酸鋳型の一部分を認識する（即ち相補的である）複数の核酸プライマーを有するように設計され、これにより、核酸鋳型は捕捉ビーズにハイブリダイズする。本明細書に記載する方法において、鋳型種のクローン増幅が望ましく、従って、１つのみの固有な核酸鋳型がいずれかの１つの捕捉ビーズに結合することが好ましい。
本発明において使用するビーズは何れかの好都合なサイズのものであり、何れかの数量の既知物質から加工されたものであってよい。そのような物質の例は、無機物質、天然ポリマーおよび合成ポリマーを包含する。これらの物質の具体的な例はセルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス；シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドの共重合体、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン等（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６４，３，１３８５−１３９０参照）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然海綿、シリカゲル、制御細孔ガラス、金属、架橋デキストラン（例えばＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ）アガロースゲル（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ）および当該分野で知られた固相支持体を包含する。好ましい実施形態において、捕捉ビーズは直径約２５〜４０μｍのセファロースビーズである。
乳化
結合した１本鎖鋳型核酸を有する捕捉ビーズは、熱安定性の油中水エマルジョンとして乳化される。エマルジョンは当該分野で知られた何れかの適当な方法に従って形成してよい。エマルジョンを作製する１つの方法を以下に記載するが、エマルジョンを調製するための如何なる方法も使用してよい。そのような方法は当該分野で知られる通りであり、アジュバント法、向流法、逆流法、回転ドラム法および膜法を包含する。更に、マイクロカプセルのサイズは、成分の流量および流速を変動させることにより調節してよい。例えば、滴下において、液滴の大きさおよび送達の総時間は変動してよい。好ましくは、エマルジョンはマイクロリットルあたり約３０００ビーズの密度におけるビーズ「マイクロリアクター」の密度を含有する。
エマルジョンは好ましくは、増幅溶液中に鋳型結合ビーズを懸濁することにより発生させる。本明細書において、「増幅溶液」という用語は鋳型ＤＮＡの増幅を行うために必要な試薬の十分な混合物を意味する。増幅溶液の１例であるＰＣＲ増幅溶液は後述する実施例において提供され、当然ながらＰＣＲ溶液には種々の変更を加えてよい。
１つの実施形態において、ビーズ／増幅溶液混合物は、生体適合性の油状物（例えば軽鉱油、Ｓｉｇｍａ）の高速回転混合物中に滴下し、乳化させる。使用する油状物には生体適合性の乳化安定剤１つ以上を添加してよい。これらの乳化安定剤は、Ａｔｌｏｘ ４９１２、Ｓｐａｎ ８０および他の知られた市販の適当な安定化剤を包含してよい。好ましくは、形成される液滴は５ミクロン〜５００ミクロン、好ましくは約５０〜３００ミクロン、最も好ましくは１００〜１５０ミクロンのサイズ範囲である。
マイクロリアクターのサイズは限定されない。マイクロリアクターは、必要な増幅の程度の為に十分な増幅試薬に対応できるほど十分大型でなければならない。しかしながら、マイクロリアクターは、各々がＤＮＡライブラリを含有するマイクロリアクターの集団が従来の実験装置（例えばＰＣＲサーモサイクリング装置、試験管、インキュベーター等）により増幅できるように十分小さくなければならない。
上記した制約によれば、マイクロリアクターの最適なサイズは直径１００〜２００ミクロンとなる。このサイズのマイクロリアクターは、容量１０ｍｌ未満のマイクロリアクター懸濁液中約６００，０００のメンバーを含むＤＮＡライブラリの増幅を可能とする。例えばＰＣＲが選択された増幅方法であった場合、９６チューブ収容の通常のサーモサイクラーの９６チューブ内に１０ｍｌが適合する。好ましい実施形態において、６００，０００マイクロリアクターの懸濁液は１ｍｌ未満の容量を有する。１ｍｌ未満の懸濁液は従来のＰＣＲサーモサイクラーの約１０チューブにおいて増幅してよい。最も好ましい実施形態において、６００，０００マイクロリアクターの懸濁液は０．５ｍｌ未満の容量を有する。
増幅
カプセル化の後、鋳型核酸を何れかの適当なＤＮＡ増幅法、例えば転写系増幅系（Ｋｗｏｈ Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：１１７３（１９８９）；Ｇｉｎｇｅｒａｓ Ｔ．Ｒ．ら、ＰＣＴ出願ＷＯ ８８／１０３１５；Ｄａｖｅｙ，Ｃ．ら、欧州特許出願３２９，８２２；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．ら、ＰＣＴ出願ＷＯ ８９／０６７００）および「ｒａｃｅ」（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０））および「ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ，Ｏ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６．５６７３−５６７７（１９８９））により増幅してよい。更に別の一般性の低い方法、例えば「ジオリゴヌクレオチド」増幅、等温増幅（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ：（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：３９２−３９６（１９９２））およびローリングサークル増幅（５，７１４，３２０を検討）も本発明において使用してよい。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ増幅はＰＣＲにより行う。本発明によるＰＣＲは、ＰＣＲの為に必要な全ての試薬を含むＰＣＲ溶液を用いてビーズに結合した標的核酸をカプセル化することにより行ってよい。次に、ＰＣＲは、当該分野で知られる何れかの適当なサーモサイクリング様式にエマルジョンを曝露することにより行ってよい。好ましい実施形態において、３０〜５０サイクル、好ましくは約４０サイクルの増幅を実施する。必須ではないが、増幅操作に引き続き、１回以上のハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルを、増幅サイクル後に設けることが望ましい。好ましい実施形態において、１０〜３０サイクル、好ましくは約２５サイクルのハイブリダイゼーションおよび伸長を実施する（例えば実施例に記載）。常套には、ビーズあたり典型的には少なくとも２００万〜５０００万コピー、好ましくは約１０００万〜３０００万コピーの鋳型ＤＮＡが固定化されるまで、鋳型ＤＮＡは増幅される。
エマルジョンの破壊およびビーズの回収
鋳型の増幅の後、エマルジョンを「破壊」（当該分野では「脱エマルジョン」とも称する）する。エマルジョンの破壊には多くの方法があり（例えば米国特許５，９８９，８９２およびその引用文献参照）、業者であれば適切な方法を選択できる。本発明において、エマルジョン破壊の１つの好ましい方法は、追加的油状物をエマルジョンに添加することにより二相に分離させることである。次に油相を除去し、適当な有機溶媒（例えばヘキサン）を添加する。混合の後、油状物／有機溶媒相を除去する。この工程は数回反復してよい。最後にビーズ上の水相を回収する。次にビーズを有機溶媒／アニーリング緩衝液混合物（例えば１つの適当なアニーリング緩衝液は実施例に記載する）で洗浄し、次にアニーリング緩衝液で再度洗浄する。適当な有機溶媒はメタノール、エタノール等のアルコール類を包含する。
増幅された鋳型含有ビーズを次に、例えば既知技術による配列決定反応において使用するために水溶液中に再懸濁してよい（例えばＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５，５４６３−５４６７（１９７７）；Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４，５６０−５６４（１９７７）；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１，３６３，３６５（１９９８）；Ｌｙｓｏｖ，Ｉ．ら、Ｄｏｋｌ Ａｋａｄ Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ ３０３，１５０８−１５１１（１９８８）；Ｂａｉｎｓ Ｗ．＆ Ｓｍｉｔｈ Ｇ．Ｃ．Ｊ．ＴｈｅｏｒＢｉｏｌ １３５，３０３−３０７（１９８８）；Ｄｒｎａｎａｃ，Ｒ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，１１４−１２８（１９８９）；Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｋ．Ｒ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２５６．１１８−１２２（１９８９）；Ｐｅｖｚｎｅｒ Ｐ．Ａ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｄｙｎ７，６３−７３（１９８９）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３，１００８−１０１７（１９９２）参照）。ビーズをピロホスフェートに基づく配列決定反応において使用する場合（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，２７４，３２０、６２５８，５６８および６，２１０，８９１に記載）、ＰＣＲ産物の第２の鎖を除去しビーズに結合している１本鎖鋳型に配列決定プライマーをアニーリングすることが必要である。
慨すれば、第２の鎖を様々な一般的に知られた方法、例えばＮａＯＨ、低イオン（例えば塩）強度、または熱処理を用いて融解脱離させる。この融解工程の後、ビーズをペレット化し、上澄みを廃棄する。ビーズをアニーリング緩衝液に再懸濁し、配列決定プライマーを添加し、標準的なアニーリングサイクルを用いながらビーズ結合１本鎖鋳型にアニーリングする。
ビーズの精製
この時点において、ビーズ上の増幅されたＤＮＡをビーズ上で直接、または異なる反応容器内で配列決定してよい。本発明の実施形態において、ＤＮＡはビーズを反応容器に移し、ＤＮＡを配列決定反応に供することにより、ビーズ上で直接配列決定する（例えばピロホスフェートまたはＳａｎｇｅｒ配列決定）。或いは、ビーズを単離してよく、ＤＮＡを各ビーズから除去して配列決定してよい。何れの場合においても、配列決定工程は各々個々のビーズ上で実施してよい。しかしながら、この方法は経済的に妥当であり、技術的に実行可能であるが、ビーズの多くが陰性ビーズ（結合した増幅ＤＮＡを有さないビーズ）となることから最も効果的とはなりえない。従って、ピコタイタープレート上への分配の前に核酸鋳型を含有しないビーズを除去するために以下の任意のプロセスを用いてよい。
初期のＤＮＡ結合の目的がＤＮＡの２種の異なるコピーを有するビーズを最小限とすることである場合、ビーズの高い割合が「陰性」（即ちそれに結合した増幅核酸を有さない）となる。有用なピロホスフェート配列決定のために、各ビーズはＤＮＡの単一種の多数コピーを含有しなければならない。この要件は、（増幅前に）結合したＤＮＡの単一フラグメントを有するビーズの総数を最大限とすることにより、最も実現可能となる。この目標は数学的モデルの観察により達成できる。
個数Ｍのビーズ内にランダムに分布した個数「Ｎ」のＤＮＡの一般的な場合について、任意の数のＤＮＡを含有する相対的なビーズの集団はＮ／Ｍの比に依存する。Ｎ個のＤＮＡを含有するビーズの割合Ｒ（Ｎ）はポアソン分布：
Ｒ（Ｎ）＝ｅｘｐ−（Ｎ／Ｍ）Ｘ（Ｎ／Ｍ）Ｎ／Ｎ！（式中Ｘは掛け算記号）
を用いて計算してよい。
以下の表１は種々のＮ／Ｍ（平均ＤＮＡフラグメントのビーズに対する比）およびＮ（ビーズに実際に結合しているフラグメントの数）に関するいくつかの計算値を示す。
Figure 2009502202
 表において、上の列は種々の比のＮ／Ｍを示す。Ｒ（０）はＤＮＡを有さないビーズの割合を示し、Ｒ（１）は結合ＤＮＡ１個（増幅前）を有するビーズの割合を示し、Ｒ（Ｎ＞１）は結合ＤＮＡを１つより多く（増幅前）有するＤＮＡの割合を示す。
表は単一のＤＮＡフラグメントを含有するビーズの最大割合が０．３７（３７％）であり、フラグメントのビーズに対する比が１の場合に起こることを示している。この混合物において、ビーズの約６３％は、それらがＤＮＡを有さないか、またはＤＮＡの単一種より多くを有するため、配列決定のためには有用ではない。更に、フラグメントのビーズに対する比を制御することは、複雑な計算を必要とし、変動性により有用なビーズの顕著に低値な割合を有するビーズのバッチが生産される場合がある。
この非効率性は、アンプリコンを含有するビーズ（少なくとも１つのフラグメントの結合により生じる）がアンプリコンを有さないもの（結合フラグメントを有さないビーズから生じる）から分離できる場合、顕著に緩和されると考えられる。アンプリコンはインビボの核酸増幅手法により生成した何れかの核酸分子として定義される。結合は低い平均のフラグメント対ビーズの比（Ｎ／Ｍ＜１）において行われ、結合したＤＮＡが１個より多いビーズの比を最低限とする。分離工程はＤＮＡを有さないビーズの大部分または全てを除去し、増幅したＤＮＡの１種を有するビーズの濃縮された集団をもたらす。これらのビーズは何れかの配列決定法、例えばピロホスフェート配列決定に適用してよい。１アンプリコン（Ｎ＝１）を有するビーズの割合が濃縮されているため、いずれの配列決定法もより効率的となる。
一例として、平均のフラグメントのビーズに対する比が０．１の場合、ビーズの９０％がアンプリコンを有さず、ビーズの９％が１個のアンプリコンを有することで有用となり、ビーズの０．５％が１個より多いアンプリコンを有する。本発明の濃縮プロセスはアンプリコンを含まないビーズの９０％を除去し、配列決定可能な割合（Ｎ＝１）が下記：
１−（０．００５／０．０９）＝９４％
であるビーズの集団をもたらす。
アンプリコン含有ビーズの分離と共にフラグメントをビーズ混合物に希釈することは、濃縮しない最適な方法よりも２．５倍高い濃縮をもたらすことができる。９４％／３７％（上記表Ｎ／Ｍ＝１参照）＝２．５である。本発明の濃縮の手順の追加的な利点は、配列決定可能なビーズの最終的な割合がＮ／Ｍの変動性に対して比較的非感受性であることである。即ち、最適なＮ／Ｍ比を誘導するための複雑な計算は不必要であるか、またはより低い精度で行ってよい。このことは最終的には該手順を低熟練者または自動化による実施により適するものとする。手順の別の利点は、アンプリコンを含まないビーズをリサイクルして再使用してよい点である。リサイクルは必須ではないが、経費および試薬の総量を低減し、本発明の方法を、いくつかの目的、例えばポータブルサンプリング、リモートロボットサンプリング等により適したものとする。更に、該手順の利点の全て（即ち低熟練者、自動化、試薬リサイクル）は、手順の経費を低減することになる。方法は後述において更に詳細に説明する。
濃縮手順は、上記ビーズエマルジョン法において増幅されているビーズを処理するために使用してよい。増幅は、各増幅分子が同じＤＮＡ配列をその３’末端に含有するように設計する。ヌクレオチド配列は２０マーであってよいが、１５塩基以上、例えば２５塩基、３０塩基、３５塩基または４０塩基以上の何れかの配列であってよい。本来より長いオリゴヌクレオチド末端も機能的であるが、それは必要ではない。このＤＮＡ配列は、当業者により増幅されたＤＮＡの末端において導入されてよい。例えばＰＣＲをＤＮＡ増幅の為に使用する場合、配列はＰＣＲプライマー対の１メンバーの部分であってよい。
濃縮プロセスの模式図を図７に示す。ここで、４つの空ビーズと混合されたアンプリコン結合ビーズはフラグメント希釈増幅ビーズ混合物を示す。工程１において、アンプリコンの３’末端に相補的なビオチン化プライマーをアンプリコンにアニーリングする。工程２において、ＤＮＡポリメラーゼおよび４種の天然デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をビーズ混合物に添加し、ビオチン化プライマーを伸長させる。この伸長はビオチン化プライマーとビーズ結合ＤＮＡの間の結合を増強するためのものである。この工程はビオチン化プライマー−ＤＮＡの結合が強力である場合は、省略してよい（例えば高イオン性環境中）。工程３において、磁場による誘引に感受性のストレプトアビジンコーティングビーズ（本明細書において「磁性ストレプトアビジンビーズ」と称する）をビーズ混合物に導入する。磁性ビーズは例えばＤｙｎａｌ（Ｍ２９０）より市販されている。ストレプトアビジン捕捉部分はアンプリコンにハイブリダイズしたビオチンに結合し、次にこれがアンプリコン結合ビーズを磁性ストレプトアビジンビーズに特異的に固定する。
工程５において、磁場（磁石による）を反応混合物近傍に適用し、これにより全ての「磁性ストレプトアビジンビーズ／アンプリコン結合ビーズ複合体」を磁場に最も接近しているチューブの片側に沿って位置付けさせる。結合したアンプリコン結合ビーズを有さない磁性ビーズもまた、同じ側に沿って位置付けさせると予測される。アンプリコンを有さないビーズは溶液中に残存する。ビーズ混合物を洗浄し、磁石により固定化されていないビーズ（即ち空ビーズ）は除去され、廃棄される。工程６において、伸長されたプライマー鎖は、例えば熱またはｐＨ変化により達成される工程である「融解」によりアンプリコン鎖から分離される。熱は低塩条件下（例えば低イオン環境、例えば０．１×ＳＳＣ）６０℃であってよい。ｐＨ変化はＮａＯＨ添加により達成してよい。次に混合物を洗浄し、アンプリコン結合ビーズを含有する上澄みを回収し、この時点で未結合となった磁気ビーズを磁場により保持する。得られる濃縮ビーズをＤＮＡ配列決定の為に使用してよい。ＤＮＡ捕捉ビーズ上のプライマーは上記工程２のプライマーと同様であってよい。この場合、アンプリコン−プライマー相補鎖（伸長または未伸長）のアニーリングが標的−捕捉親和性の根源となる。
ビオチン−ストレプトアビジン対は捕捉体（ｃａｐｔｕｒｅ）−標的対の種々のもので置き換えられる。それ自体の結合が後に切断され、特に達成可能な条件下で非可逆的に結合する２つの範疇が対となる。切断可能な対は、標的−捕捉複合体の切断が望まれる場合、チオール−チオール、ジゴキシゲニン／抗−ジゴキシゲニン、−ＣａｐｔａｖｉｄｉｎＴＭを包含する。
上記した通り、工程２は任意である。工程２を省略する場合は、アンプリコン結合ビーズから磁性ビーズを分離する必要はない。結合磁性ビーズを有するアンプリコン結合ビーズは配列決定の為に直接使用してよい。配列決定をマイクロウェルで実施する場合、アンプリコン結合ビーズ−磁性ビーズ複合体をマイクロウェルの内部に適合させることができる場合、分離は必要ではない。
磁性捕捉ビーズの使用が好都合であるが、捕捉部分は他の表面に結合させることもできる。例えば、ストレプトアビジンはチューブ内面のような表面に化学的に結合させることができる。この場合、増幅されたビーズ混合物を貫流してよい。アンプリコン結合ビーズは「融解」まで保持される傾向を有し、その間、空ビーズが貫流される。この配置はビーズ調製プロセスを自動化する場合に特に好都合である。
上記した実施形態が特に有用であるが、他の方法もビーズ分離の為に意図される。例えば、捕捉ビーズは、標的−捕捉ビーズ複合体を蛍光性とする蛍光部分で標識してよい。標的−捕捉ビーズ複合体は、フローサイトメトリーまたは蛍光セルソーターにより分離してよい。大型の捕捉ビーズを用いると、濾過または他の粒径分離手法による分離が可能となる。捕捉および標的ビーズの両方が多くの他のビーズと複合体を形成できるため、交差結合捕捉標的ビーズの塊を凝集させることが可能である。大型凝集塊は未凝集の空ビーズを単に洗い出すことにより分離を可能とする。記載した方法は、例えばＢａｕｅｒ，Ｊ．；Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７２２（１９９９）５５−６９およびＢｒｏｄｙら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔ．７４（１９９９）１４４−１４６において詳細に説明されている。
上記方法により調製された、核酸鋳型の単一種の多数コピーを含有するＤＮＡ捕捉ビーズは、ここで、ピコタイタープレート上への分配に適するものとなる。
ピコタイタープレート上での核酸増幅
別の実施形態において、核酸鋳型は、増幅前にピコタイタープレート上に分配させ、次にピコタイタープレート上でインサイチュ増幅する。この方法は実施例において詳述する。
３．核酸鋳型の配列決定
ピロホスフェート配列決定を本発明の方法に従って使用することにより、核酸鋳型を配列決定する。この手法は、ＤＮＡ合成の間に放出されたピロホスフェート（Ｐｐｉ）の検出に基づいている。例えばＨｙｍａｎ，１９８８．Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：４２３−３６；Ｒｏｎａｇｈｉ，２００１．Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｅｄｓ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：３−１１を参照。
酵素的反応のカスケードにおいて、可視光は取り込まれたヌクレオチドの数に比例して発生する。カスケードは、ポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みと共に無機のＰｐｉが放出される核酸重合反応と共に開始する。放出されたＰｐｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変換され、これがエネルギーをルシフェラーゼに提供することによりルシフェリンが酸化され、光を発生させる。添加されたヌクレオチドは既知であるため、鋳型の配列を決定することができる。固相ピロホスフェート配列決定は３酵素系において固定化ＤＮＡを利用している（図参照）。ＳＮ比を増大させるため、天然のｄＡＴＰをｄＡＴＰαＳと置き換える。典型的にはｄＡＴＰαＳは２種の異性体（ＳｐおよびＲｐ）の混合物であり；ピロホスフェート配列決定における純粋な２’−デオキシアデノシン−５’−Ｏ’−（１−チオ三リン酸）Ｓｐ異性体の使用は、最大でリード（ｒｅａｄ）長の倍増となるまでの、実質的により長いリードが可能となる。
４．核酸の配列決定のための装置
本発明は核酸を配列決定するための装置を提供し、これは一般的に配列決定反応を実施するための１つ以上の反応チャンバー、反応チャンバーを出入する反応体送達のための手段、および配列決定反応事象を検出するための手段を含む。別の実施形態において、装置は平坦な表面上の複数のキャビティーを含有する試薬送達キュベットを包含する。好ましい実施形態において、装置は装置の個々の要素を制御するため、配列反応事象の検出により得られる情報を格納および／または分析するための少なくとも１つのコンピューターに連結される。
本発明はまた、所定の空間内の配列決定反応における核酸鋳型および反応体の個別の局在化並びに配列決定反応事象の検出を可能にする、「固体支持体」とも本明細書において称する不活性の基板物質上に配置された１つ以上の反応チャンバーを提供する。即ち、本明細書において、「反応チャンバー」または「検体反応チャンバー」という用語は、例えば核酸配列決定反応において反応体の相互作用を促進する基板物質上の局在域を指す。後により十分に詳述するように、本発明の意図する配列決定反応は、好ましくは直列した多くの個々の核酸サンプルに対して、特にゲノムおよび染色体核酸鋳型（例えばＤＮＡ）から誘導した多くの核酸サンプルを同時に配列決定しながら起こる。
従って本発明の装置は、好ましくはそのような多くの個々の配列決定反応を実施するために十分な数量の反応チャンバーを含む。１つの実施形態において、少なくとも１０，０００の反応チャンバー、好ましくは少なくとも５０，０００の反応チャンバー、より好ましくは１００，０００より多い反応チャンバー、更に好ましくは２００，０００より多い反応チャンバーが存在する。
同時配列決定反応の数は反応チャンバーの数により制限されるため、スループットはウェルの漸増密度を含有するプレートを製作することにより増大してよい。以下の表２は、この数列をそれぞれ２５×７５ｍｍおよび４０×７５ｍｍのアレイに由来する１４×４３ｍｍおよび３０×６０ｍｍについて示している。
Figure 2009502202
Figure 2009502202
 アレイ上の反応チャンバーは典型的には基板物質中のキャビティーまたはウェルの形態をとり、幅と深さを有しており、その中に反応体を付着させることができる。典型的には、核酸鋳型を固体支持体またはビーズ１つ以上の上の反応チャンバー内に分布させ；反応体は反応を促進し、反応チャンバーを貫流する媒体中に存在させる。キャビティーまたはウェルとして形成される場合、チャンバーは好ましくは（ｉ）必要な反応体のチャンバー内への導入、（ｉｉ）チャンバー内での反応の実施、および（ｉｉｉ）チャンバー間の反応体混合の抑制、を可能とするために十分な寸法およびオーダーである。ウェルまたはキャビティーの形状は好ましくは、環状または円筒状であるが、環状または円筒状の形状に近似するような多面体であることもできる。１つの好ましい実施形態において、ウェルまたはキャビティーの形状は実質的に六角形である。キャビティーは平滑な壁面を有することができる。別の実施形態において、キャビティーは少なくとも１つ不規則な壁面を有することができる。キャビティーは、平坦な底部または凹型の底部を有することができる。
反応チャンバーは、５μｍ〜２００μｍの間隔とすることができる。間隔は２つの隣接する反応チャンバーの間の中心間距離を測定することにより求める。典型的には、反応チャンバーは１０μｍ〜１５０μｍ間隔、好ましくは２０μｍ〜１００μｍ間隔、最も好ましくは４０〜６０μｍ間隔とする。１つの実施形態において、反応チャンバーは、１つの寸法において０．３μｍ〜１００μｍ、より好ましくは２０μｍ〜７０μｍ、最も好ましくは約３０μｍ〜５０μｍの幅（直径）を有する。反応チャンバーの深さは、好ましくは１０μｍ〜１００μｍ、好ましくは２０μｍ〜６０μｍである。或いは、反応チャンバーは反応チャンバーの１つの寸法において幅の０．２５〜５倍、或いは別の実施形態において、反応チャンバーの１つの寸法において幅の０．３〜１倍の深さを有してよい。
好ましい実施形態において、アレイはスライスされた光ファイバーバンドル（即ち溶融した光ファイバーケーブルのバンドル）から作製し、反応チャンバーは光ファイバーリアクターアレイの１表面をエッチングすることにより形成する。キャビティーもまたエッチング、鋳造または微細加工を介して基板に形成できる。
各キャビティーまたは反応チャンバーは、典型的には１０μｍ〜１００μｍの深さを有し；或いは深さは、キャビティーの幅のサイズの０．２５〜５倍、好ましくはキャビティーの幅のサイズの０．３〜１倍である。
１つの実施形態において、本明細書に記載したアレイは典型的には平坦な上面および平坦な底面を包含し、これは反応チャンバー由来の光学シグナルが底部の平坦な表面を介して検出できるように光学的に伝導性である。これらのアレイにおいて、典型的には上面と底面の間の距離は１０ｃｍ以下、好ましくは２ｃｍ以下、通常は０．５ｍｍ〜５ｍｍ、最も好ましくは約２ｍｍである。
特に好ましい実施形態において、固体支持体はピコタイタープレートとし、反応チャンバーは中心間距離約４３μｍ〜５０μｍ、ウェル直径３８μｍ〜４４μｍ、およびウェル容量１０〜１５０ｐＬ、好ましくは２０〜９０ｐＬ、より好ましくは４０〜８５ｐＬ、最も好ましくは約７５ｐＬを有する。
１つの実施形態において、アレイの各キャビティーまたは反応チャンバーは、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含有する。典型的には、核酸を含有するこれらの反応チャンバーは、核酸単一種（即ち目的の単一配列）のみを含有する（アレイの全反応チャンバーに対する要件ではない）。何れかの特定の反応チャンバーにおいて核酸のこの種の単コピーが存在する場合があり、或いは、多数コピーが存在する場合がある。反応チャンバーは少なくとも１００，０００コピーの核酸鋳型配列、好ましくは少なくとも１，０００，０００コピー、より好ましくは２，０００，０００〜２０，０００，０００コピー、最も好ましくは５，０００，０００〜１５，０００，０００コピーの核酸を含有する。当業者は、何れか１つの反応チャンバーにおける核酸種のコピー数の変化は、パイロシーケンス中に発生する光子の数に影響することになり、必要に応じて光子シグナルを加減するために常套的に調節できることを理解されたい。１つの実施形態において、ＰＣＲ、ＲＣＡ、リガーゼ連鎖反応、他の等温増幅、または他の従来の核酸増幅手段を用いながら核酸種を増幅することにより、所望の数のコピーが得られる。１つの実施形態において、核酸は１本鎖である。
固体支持体物質
何れの物質も、表面がプライマーの安定な結合および核酸配列の検出を可能にする限り、固体支持体物質として使用できる。固体支持体物質は平坦であるか、例えば光ファイバーのキャビティー形成末端の場合のように、または、平坦な表面内部にエッチング、鋳造または微細加工されたマイクロウェルの場合のように、精密電気機械系の構築において一般的に使用されている手法を用いてキャビティー形成されていることができる。例えばＲａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，ＭＩＣＲＯＭＡＣＨＩＮＩＮＧ，ＡＮＤ ＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮ，ＶＯＬＵＭＥ Ｉ：ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，Ｖｏｌｕｍｅ ＰＭ３９，ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｍａｄｏｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９７），Ａｏｋｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．６７：９８−９（１９９２）；Ｋａｎｅら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０：２３６３−７６（１９９９）；Ｄｅｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：３１７６−８０（２０００）；Ｚｈｕら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６：２８３−９（２０００）を参照できる。いくつかの実施形態において、固体支持体は光学的に透明、例えばガラスである。
光学的に透明な固体支持体上の結合部位のアレイは、例えば米国特許５，１４３，８５４，５，４４５，９３４，５，７４４，３０５および５，８００，９９２；Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０−６１４（１９９６）；Ｆｏｄｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６（１９９３）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１ ：７６７−７７３（１９９１）；Ｇｕｓｈｉｎ，ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：２０３−２１１（１９９７）；Ｋｉｎｏｓｉｔａら、Ｃｅｌｌ ９３：２１−２４（１９９８）；Ｋａｔｏ−Ｙａｍａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１９３７５−１９３７７（１９９８）；およびＹａｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ ９３：１１１７−１１２４（１９９８）に記載されている結合のための手法において説明されている電子集積回路の構築において一般的に使用されているリソグラフィー手法を用いて構築することができる。フォトリソグラフィーおよび電子線リソグラフィーは、修飾された生体分子（例えばタンパク質または核酸）の結合を可能にする連結基により、固体支持体または基板を感光性とする。例えばＳｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：２７−２８（１９９９）；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，ＭＩＣＲＯＭＡＣＨＩＮＩＮＧ，ＡＮＤ ＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮ，ＶＯＬＵＭＥ Ｉ：ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，Ｖｏｌｕｍｅ ＰＭ３９，ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照できる。或いは感光性を付与された部位のアレイをＺａｓａｄｚｉｎｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３ ：１７２６−１７３３（１９９４）に記載の通り薄膜法を用いて形成することもできる。
基板物質は、好ましくは反応事象の検出を促進する物質から作製する。例えば、典型的な配列決定反応において、配列決定すべきサンプル核酸へのｄＮＴＰの結合は、配列決定反応中に放出されるホスフェートに対する酵素作用により生じる光子の検出によりモニタリングできる。即ち、基板物質を透明または光伝導性の物質から作製することにより、光子の検出が促進される。
いくつかの実施形態において、固体支持体は、光産物を検出して伝達するために使用される光ファイバーのバンドルにカップリングすることができる。バンドル内の光ファイバーの総数は、配列決定反応中に使用されるアレイ内の個々の反応チャンバーの数に合致するように変動してよい。バンドル内に取り込まれる光ファイバーの数は１：１画像化が可能となるような検出装置の解像度に合致するように設計する。バンドルの全体的サイズは検出装置の使用可能面積が最適化されると同時に反応チャンバー中の望ましい試薬（フロー）特定が維持されるように選択する。即ち、１５μｍ画素の４０９６×４０９６画素ＣＣＤ（電荷結合デバイス）アレイについては、ファイバーバンドルは約６０ｍｍ×６０ｍｍとなるように、または、約９０ｍｍの直径を有するように選択する。所望の数量の光ファイバーを先ずバンドルまたは光ファイバーアレイに融着し、その末端を次に切断研磨することにより所望の厚み（例えば１．５ｍｍ）の「ウエハ」とする。得られた光ファイバーウエハは、ガラス面と同様の取り扱い特性を保有している。個々のファイバーは、何れかの直径であることができる（例えば３μｍ〜１００μｍ）。
いくつかの実施形態において、２つの光ファイバーバンドルを使用し得る：第１のバンドルは検出装置に直接連結（本明細書においてファイバーバンドルまたはコネクターとも称する）し、第２のバンドルは反応チャンバー基板（ウエハまたは基板）として使用する。この場合、２者は、検出装置上に反応中心を画像化するために、場合により光学結合流体を使用しながら、直接接触させるように配置する。ＣＣＤを検出装置として使用する場合、ウエハはＣＣＤ域の使用を最大限とするために僅かに大型とするか、または、典型的な顕微鏡スライドの形式である２５ｍｍ×７５ｍｍに合致するように僅かに小型となる。バンドル内の個々のファイバーの直径は、当該技術レベルの制約の範囲内で検出装置内の単一の画素上に単一の反応が画像化される可能性を最大とするように選択する。例示される直径は、ファイバーバンドルの場合６〜８μｍ、ウエハの場合６〜５０μｍであるが、３〜１００μｍの如何なる直径も使用できる。ファイバーバンドルはＣＣＤカメラ製造元より市販されている。例えばウエハは、Ｉｎｃｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｃｈａｒｌｔｏｎ，ＭＡ）から入手し、光ファイバーの大型の溶融物から切り出して研磨することができ、典型的には２ｍｍ厚みであるが０．５〜５ｍｍの厚みが可能である。ウエハは窓ガラスまたは顕微鏡スライドガラスと同様の取り扱い特性を有している。
反応チャンバーは、光ファイバー物質から作製された基板に形成できる。光ファイバーの表面は、例えば酸を用いてファイバーのバンドルの末端を処理して光ファイバー物質に刻印を形成することにより、キャビティー形成する。即ち、１つの実施形態において、キャビティーは光ファイバーバンドルから形成し、好ましくは、キャビティーは光ファイバーバンドルの一端をエッチングすることにより形成できる。各キャビティー形成表面は反応チャンバーを形成できる。そのようなアレイは、本明細書において光ファイバーリアクターアレイ、即ちＦＯＲＡと称する。刻印は、深さにおいて個々の光ファイバーの直径の約半分からファイバーの直径の２〜３倍までの範囲である。光ファイバーウエハの片側を種々の時間に渡って酸浴中に入れることにより、キャビティーをファイバー末端に導入することができる。時間の長さは所望の反応キャビティーの全体的深さにより変動できる（例えばＷａｌｔ，ら、１９９６．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１８８８参照）。ワイドチャンネルキャビティーは、約１４ｍｍ×４３ｍｍの均質な流速の寸法を有することができる。即ち、概ねこの寸法および約４．８２×１０−４キャビティー／ｕｍ２の密度を用いて、装置は約２９０，０００個の流動上接触可能なキャビティーを有することができる。光ファイバーバンドルの末端にエッチングされたキャビティー内に分子を結合させる（および結合した分子を検出する）ための幾つかの方法が、当該分野で知られている。例えばＭｉｃｈａｅｌ，ら、Ａｎａｌ．Ｇｈｅｎｔ．７０：１２４２−１２４８（１９９８）；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６８１−１６８４（１９９６）；ＨｅａｌｅｙおよびＷａｌｔ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：２２１３−２２１６（１９９７）を参照。反応性の部位のパターンはまた、平坦な支持体上の反応パッドのパターンの形成において使用したものと同様のフォトリソグラフィー法を用いながらマイクロウェル内に形成できる。Ｈｅａｌｅｙ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１０７８−１０８０（１９９５）；ＭｕｎｋｈｏｌｍおよびＷａｌｔ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８：１４２７−１４３０（１９８６），ならびにＢｒｏｎｋ，ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：２７５０−２７５７（１９９５）を参照。
光ファイバーウエハの反対側（即ち非エッチング側）は、典型的には第２の光ファイバーバンドルへの光学的カップリング（例えば油状物または他の光学結合流体に浸積することによる）が可能となるように、高度に研磨される。この第２の光ファイバーバンドルは反応チャンバーを含有する光学ウエハの直径に厳密に合致し、ＣＣＤ画像化システムまたはカメラのような連結された検出装置への光産物の伝達のための導管として機能することができる。
１つの好ましい実施形態において、光ファイバーウエハは、例えば水溶液中１５％Ｈ２Ｏ２／１５％ＮＨ４ＯＨｖ／ｖ中で連続洗浄、次いで脱イオン水で６回すすぎ、次に０．５ＭＥＤＴＡ、次に脱イオン水６回、次に１５％Ｈ２Ｏ２／１５％ＮＨ４ＯＨ、次に脱イオン水６回を用いて十分に洗浄する（各洗浄の間は３０分インキュベーション）。
光ファイバーウエハの表面は、好ましくは配列決定反応におけるその使用を促進するためにコーティングする。コーティングされた表面は好ましくは光学的に透明であり、タンパク質および核酸の容易な結合を可能にし、固定化されたタンパク質の活性に悪影響を及ぼさない。更に、表面は好ましくは高分子の非特異的吸着を最低限にし、連結した高分子（例えば結合した核酸およびタンパク質）の安定性を増大させる。
アレイをコーティングするための適当な物質は、例えばプラスチック（例えばポリスチレン）を包含する。プラスチックは、好ましくはスピンコーティングまたはスパッタリング（０．１μｍ厚み）されることができる。アレイをコーティングするための他の物質は、金の層、例えば長鎖チオールアルカンの吸着自己組立型単層を有する０．１μｍ厚みの２４金を包含する。次にビオチンを表面に共有結合的にカップリングさせ、ビオチン結合タンパク質（例えばストレプトアビジンまたはアビジン）で飽和させる。
コーティング物質は、基板にアンカープライマーを結合させるために使用される系を追加的に包含できる。アミノ、スルヒドリルまたはカルボキシ基を介したタンパク質の直接の共有結合的カップリングを可能にする有機シラン試薬もまた、アレイをコーティングするために使用できる。追加的なコーティング物質は、光反応性リンカー、例えばフォトビオチンを包含する（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ Ａ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｗｉｓｅら、（編），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ｐｐ．８９５９２６，１９９５の中のＡｍｏｓら、“Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”）。
追加的コーティング物質は好ましくは表面または重合後共有結合したポリマー鎖上で直接重合する親水性ポリマーゲル（ポリアクリルアミド、多糖類）（Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３４７，１９１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２，２４７８（１９９０））並びにポリスチレンまたはシラン処理ガラス表面の何れかに特異的に吸着させたプルロニックポリマー（トリブロック共重合体、例えばＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ、Ｆ−１０８としても知られている）（Ｈｏら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １４：３８８９−９４，１９９８）、並びにビオチン結合タンパク質の受動吸着層を包含する。表面はまた、アミン連結を介した試薬のカップリングを可能にするエポキシドでコーティングすることもできる。
更にまた、上記した物質の何れも、６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質および核酸に結合する酵素およびヌクレオチドの固定化の為に、当該分野で一般的に知られている１つ以上の官能基、例えば金属キレート形成基（例えばニトリロトリ酢酸、イミノジ酢酸、ペンタデンテートキレート剤）を用いて誘導体化することができる。
２Ｄ表面の理論的結合容量を超えて、後の処理、例えば酵素の結合（後述）のために使用できる結合部位の数を増大させる表面コーティングを使用できる。
好ましい実施形態において、融着した光ファイバーバンドル／ウエハを形成するために使用される個々の光ファイバーは、直径において、光学画像化システムにおいて使用されるもの（即ち３μｍ）よりも大きい（即ち６μｍ〜１２μｍ）。即ち、光学画像化ファイバーの数種を、単一の反応部位の画像化の為に使用できる。
特に好ましい実施形態において、酸エッチングによりウェル構造が生じている市販の光ファイバー表面板から、「ピコタイタープレート」と称する核酸鋳型配列決定のためのサンプルカートリッジを形成する。各光ファイバーのコアは直径約４４ミクロンであり、２〜３ミクロンの被膜を有し、各ウェルは約６５ｐＬ〜８５ｐＬ、最も好ましくは約７５ｐＬの反応ウェル容量となるように酸エッチングにより形成されている。光ファイバー表面板表面上のエッチングされたウェルの使用は３つの目的、即ち、ｉ）アレイの異なる領域における放出光からのルミネセンスの遅延拡散、ｉｉ）増幅された鋳型分子を含有する反応チャンバー（「試験管」）の隔離、およびｉｉｉ）ＣＣＤへの極めて効率的で高開口数な光学結合を果たす。最後に、ウェル内に固定化される配列決定鋳型の量が多いほど、より多くの光学シグナルが達成できる。
送達手段
反応チャンバーに反応体を送達するための手段の例は、図１３に示す本発明の灌流チャンバーである。灌流チャンバーは透明な上面および下面を有する密封されたコンパートメントを包含する。基板表面全体への溶液の流れを可能とし、試薬の迅速な交換を可能とするように設計されている。即ち、例えば、ピロホスフェート配列決定反応を実施するために適している。チャンバーの形状および寸法は、層流または乱流の様式の何れかにおけるバルクフロー交換、拡散交換または両方を包含するように試薬交換を最適化するために調節することができる。
灌流チャンバーは好ましくは製造中は画像化システムから分離され、配列決定分析の実施中に画像化システムに置くのみとする。１つの実施形態において、固体支持体（即ちＤＮＡチップまたはスライドガラス）は、該固体支持体の置き換えを可能にするように組立分解してよい金属またはプラスチックのハウジングにより定置する。灌流チャンバーの固体支持体の下面は、反応チャンバーアレイを担持しており、伝統的な光学系の焦点系と共に、高開口数の対物レンズを用いて反応中心アレイの画像の焦点をＣＣＤ画像化システムに合わせる。
これにより多くのサンプルを平行して分析できる。本発明の方法を用いれば、酵素および１ヌクレオチドを含有する溶液を表面上に流し、次に各サンプルに対して生成したシグナルを検出することにより、多くの核酸鋳型がこの方法により分析される。次にこの手順を反復する。或いは、鋳型に相補的な数種の異なるオリゴヌクレオチドを表面上に渡って分布させ、その後鋳型のハイブリダイゼーションを行う。デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの取り込みは、各オリゴヌクレオチドにつきプライマーとして種々のオリゴヌクレオチドを使用しながら、発生したシグナルによりモニタリングしてよい。表面の異なる域に由来するシグナルを比較することにより、種々のジデオキシヌクレオチドを用いたポリメラーゼ反応の４サイクルにより配列に基づく分析を実施できる。
支持体が、例えばピコタイタープレートの末端におけるキャビティー形成アレイまたはマイクロウェルの他のアレイの形態の場合、試薬のための適当な送達手段はフローおよび洗浄、および、例えばフロー、スプレー、電気スプレー、インクジェット送達、スタンピング、超音波噴霧（Ｓｏｎｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｔｏｎ，ＮＹ）およびローリングを包含する。スプレーを使用する場合、試薬は工業用タイプのスプレーノズル（Ｓｐｒａｙｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏ．，Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ）または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）において使用されるアトマイザー、例えばＣＡＭＡＧ ＴＬＣ Ｓｐｒａｙｅｒ（Ｃａｍａｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）により形成される均質な薄層としてピコタイタープレートに送達してよい。これらの噴霧器は、試薬を噴霧化して０．３〜１０μｍ範囲の大きさのエアロゾルスプレー粒子とする。
連続的な試薬送達工程は、好ましくは当該分野で知られた手法を用いて洗浄工程により分離する。これらの洗浄は例えば上記した方法、例えばハイフロー噴霧器を用いるか、または、ピコタイタープレートもしくはマイクロウェルアレイ表面に亘る液体のフローにより行うことができる。洗浄は、出発物質が試薬と反応して各反応チャンバー中に生成物を形成した後であるが、何れか１つの反応チャンバーに送達された試薬がその反応チャンバー外に拡散して何れかの他の反応チャンバー内に入るよりも前の任意の時間において行うことができる。１つの実施形態において、何れか１つの反応チャンバーは、如何なる他の反応チャンバーにおいて形成された生成物とは独立しているが、１つ以上の共通の試薬を用いて発生している。
完全な器材の実施形態は図１２に示す通りである。器材は、検出可能な灌流チャンバー２２６に接続した導入管２００を包含する。導入管２００は、複数の配列決定分注試薬容器２１４〜２２４と各々が接続している複数のチューブ２０２〜２１２を介した配列決定試薬の進入を可能とする。
試薬は正のフローを駆動する加圧系またはポンプの何れかを用いながら、管２００を経由して灌流チャンバー２２６内に導入される。典型的には、試薬流量は０．０５〜５０ｍｌ／分（例えば１〜５０ｍｌ／分）であり、容量は０．１００ｍｌ〜連続流（洗浄用）とする。弁をコンピューター制御することによりヌクレオチドおよび洗浄試薬の循環を可能とする。配列決定試薬、例えばポリメラーゼはヌクレオチドと予め混合しておくか、流入添加してよい。マニホールドが全６本のチューブ２０２〜２１２を一纏めにして灌流チャンバーへの供給を行う。即ち、幾つかの試薬送達ポートが灌流チャンバーへの接触を可能としている。例えば、ポートの１つは水性配列決定試薬の投入を可能とし、他のポートはこれらの試薬（および何れかの反応産物）の灌流チャンバーからの回収を可能とするために使用してよい。
好ましい実施形態において、１つ以上の試薬を、可動性固体支持体、例えばビーズもしくはマイクロスフェアの集団に固定化または結合されたアレイに送達する。ビーズまたはマイクロスフェアは球状である必要はなく、不規則な形状のビーズを使用してよい。それらは典型的には多くの物質、例えばプラスチック、ガラスまたはセラミックスから構築され、ビーズの大きさは反応チャンバーの幅に応じてナノメートル〜ミリメートルの範囲となる。種々のビーズ用の化学特性を使用でき、例えばメチルスチレン、ポリスチレン、アクリルポリマー、ラテックス、常磁性体、トリアゾル（ｔｈｏｒｉａ ｓｏｌ）、カーボングラファイトおよびに酸化チタンが挙げられる。ビーズの構築または化学特性は所望の試薬の結合を促進するために選択できる。
別の実施形態において、生物活性剤を先ず合成し、次にビーズに共有結合させる。当該分野で知られるように、これは生物学的活性剤およびビーズの組成に応じて行われる。チオール、アミン、カルボキシル等のような化学的に反応性な基による特定のポリマーのような固体支持体表面の官能性付与は、一般的に当業者の知る通りである。
好ましい実施形態において、核酸鋳型はビーズ上のピコタイタープレートに送達する。ルシフェラーゼおよびスルフリラーゼ酵素も、ＤＮＡポリメラーゼの場合のように、同じくビーズ上の各ウェルに送達される（図参照）。核酸鋳型、ルシフェラーゼおよびスルフリラーゼの１つ以上を各々別個のビーズ上に、または、一緒に同じビーズ上に送達してよい。上昇させた温度でＤＮＡを配列決定するために、本発明者等は，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の熱安定性スルフリラーゼをクローニングして修飾した。本発明者等はまた，固相酵素活性の為にＰ．ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａおよびＰ．ｐｙｒａｌｉｓを包含する幾つかのルシフェラーゼ酵素をクローニングして修飾した。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼは、好ましい実施形態において使用される。
使用者による所望の官能基の結合を促進する表面化学特性を有する「ブランク」ビーズを使用してよい。ブランクビーズに関するこれらの表面化学特性の別の例は、限定しないが、アミノ基、例えば脂肪族および芳香族のアミン、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネートおよびスルフェートを包含する。
これらの官能基は、一般的に知られた化学特性を用いながらビーズに様々な異なる候補薬剤を付加させるために使用できる。例えば、炭水化物を含有する候補薬剤をアミノ官能性付与支持体に結合してよく；炭水化物のアルデヒドを標準的な手法を用いて形成し、次にアルデヒドを表面のアミノ基と反応させる。別の実施形態において、スルフヒドリルリンカーを使用してよい。当該分野で知られている多くのスルフヒドリル反応性リンカーが存在し、例えばＳＰＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチルおよびピリジルジスルフィド（例えば参照により本明細書に組み込まれる１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙのカタログの架橋剤に関する学術部門の１５５〜２００ページを参照）が挙げられ、これらはシステイン含有タンパク質性薬剤を支持体に結合するために使用できる。或いは、候補薬剤上のアミノ基を表面のアミノ基への結合の為に使用してよい。例えば、多数の安定な二官能性の基が当該分野で知られており、例えばホモ二官能性およびヘテロ二官能性のリンカーが挙げられる（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１５５−２００頁参照）。別の実施形態において、カルボキシル基（表面由来または候補薬剤由来）をよく知られたリンカーを用いて誘導体化してよい（Ｐｉｅｒｃｅカタログ参照）。例えばカルボジイミドはアミンのような良好な求核試薬による攻撃に関してカルボキシル基を活性化する（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒｅａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，７（４）：２７５−３０８（１９９１）参照）。タンパク質性の候補薬剤はまた例えばポリマーへの抗体の結合のための当該分野で知られた他の手法を用いて結合してよく；Ｓｌｉｎｋｉｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２：３４２−３４８（１９９１）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら、上述；Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．３：３２３−３２７（１９９２）；Ｋｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１７６−６１８５（１９９４）；およびＷｉｌｂｕｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：２２０−２３５（１９９４）を参照できる。候補薬剤は上記したものを包含する種々の方法において結合させてよいことを理解されたい。好ましくは、結合の様式は候補薬剤の機能性を大きく改変しないものであり；即ち、候補薬剤は標的とのその相互作用を可能にするような柔軟な様式において結合されなければならない。
ビーズ上に酵素を固定するための特定の手法は当業者の知る通りである。１つの場合において、ＮＨ２表面化学特性のビーズを使用する。表面の活性化は６．９のｐＨ（１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ）を与えるリン酸塩緩衝食塩水（１０ｍＭ）中の２．５％グルタルアルデヒドを用いて達成される。この混合物を室温で約２時間、攪拌床上で攪拌する。次にビーズを超純水＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）−０．０２％ですすぎ、ｐＨ７．７ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で再度すすぐ。最後に、好ましくは０．４５μｍ Ａｍｉｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅフィルターを用いて予備濾過した後に、酵素を溶液に添加する。
可動性固体支持体の集団を反応チャンバー内に配設する。いくつかの実施形態において、５％〜２０％の反応チャンバーは、可動性固体支持体を少なくとも１つの試薬をその上に固定化した状態で有することができ、２０％〜６０％の反応チャンバーは、可動性固体支持体を、少なくとも１つの試薬をその上に固定化した状態で有することができ、または、５０％〜１００％の反応チャンバーは、可動性固体支持体を、少なくとも１つの試薬をその上に固定化した状態で有することができる。好ましくは、少なくとも１つの反応チャンバーは少なくとも１つの試薬をその上に固定化して有する可動性固体支持体を有し、試薬は核酸配列決定反応における使用に適している。
いくつかの実施形態において、可動性固体支持体に固定化された試薬はスルフリラーゼ活性を有するポリペプチド、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド、または、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼ活性の両方を有するキメラポリペプチドであることができる。１つの実施形態において、それはＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ融合タンパク質であることができる。スルフリラーゼ反応の産物はルシフェラーゼにより消費されることから、これら２酵素の間の接近は、融合タンパク質の形態で２酵素を共有結合することにより達成してよい。本発明は基板のチャンネリングにおいてのみならず製造コストの低減および潜在的にはストレプトアビジンコーティングビーズ上の結合部位の数の倍増においても有用である。
他の実施形態において、スルフリラーゼは熱安定性ＡＴＰスルフリラーゼである。好ましい実施形態において、熱安定性スルフリラーゼは周囲温度より高温（少なくとも５０℃まで）において活性である。１つの実施形態において、ＡＴＰスルフリラーゼは好熱生物由来である。別の実施形態において、可動性固体支持体は第１の試薬および第２の試薬をそれ自体に固定化して有することができ、第１の試薬はスルフリラーゼ活性を有するポリペプチドであり、第２の試薬はルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである。
別の実施形態において、可動性固体支持体に固定化された試薬は核酸であることができ；好ましくは、核酸は１本鎖コンカテマーである。好ましい実施形態において、核酸は核酸を配列決定する為に、例えばパイロシーケンス反応の為に使用できる。
本発明はまた、可動性固体支持体を使用しながらＡＴＰ活性を検出または定量するための方法を提供し；好ましくは、ＡＴＰは核酸配列決定反応の部分として検出または定量することができる。
それ自体に結合した核酸または試薬酵素の何れかを有する可動性固体支持体により「捕捉」されているピコタイタープレートを図１５に示す。
５．核酸を配列決定する方法
次にピロホスフェートに基づく配列決定を実施する。次にサンプルＤＮＡおよび伸長プライマーをヌクレオチド三リン酸の存在下にポリメラーゼ反応に供することにより、ヌクレオチド三リン酸のみが取り込まれることになり、それが標的位置の塩基に相補的であればピロホスフェート（ＰＰｉ）を放出し、ヌクレオチド三リン酸は別個のサンプル−プライマー混合物アリコート、または、同じサンプル−プライマー混合物に引き続き添加される。次にＰＰｉの放出を検出することによりどのヌクレオチドが取り込まれたかが示される。
１つの実施形態において、配列産物の領域は鋳型核酸の領域に配列決定プライマーをアニーリングし、次に配列決定プライマーをＤＮＡポリメラーゼおよび既知ヌクレオチド三リン酸、即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰまたはこれらのヌクレオチドの１つのアナログと接触させることにより決定される。配列は後述する通り配列反応副生成物を検出することにより決定できる。
配列プライマーは、それが増幅された核酸鋳型の領域に特異的にアニーリングできる限り、如何なる長さまたは如何なる塩基組成のものであることができる。配列決定プライマーについて、それが増幅された鋳型核酸上の領域を特異的にプライミングできる限り、特定の構造は必要とされない。好ましくは、配列決定プライマーは特性化すべき配列とアンカープライマーにハイブリダイズできる配列との間の鋳型の領域に相補的である。配列決定プライマーはＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長されることにより配列産物を形成する。伸長は、１つ以上のヌクレオチド三リン酸、および所望により副次的な結合タンパク質の存在下に行う。
ｄＮＴＰの取り込みは、好ましくは配列決定副生成物の存在に関してアッセイすることにより調べる。好ましい実施形態において、配列決定産物のヌクレオチド配列は、伸長された配列プライマー内にｄＮＭＰが取り込まれる際にヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）から遊離した無機のピロホスフェート（ＰＰｉ）を測定することにより調べる。この配列決定の方法、即ちＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（パイロシーケンス）ＴＭ技術（ＰｙｒｏＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）は、溶液（液相）中において、または固相手法として実施できる。ＰＰｉ系配列決定方法は、一般的に例えばＷＯ９８１３５２３Ａ１，Ｒｏｎａｇｈｉ，ら、１９９６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９，Ｒｏｎａｇｈｉ，ら、１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３−３６５（１９９８）および米国特許出願２００１／００２４７９０に記載されている。ＰＰｉ配列決定のこれらの開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。更に米国特許６，２１０，８９１および６，２５８，５６８も参照でき、各々参照により全体が本明細書に組み込まれる。
これらの条件下に放出されたピロホスフェートは酵素的に（例えばルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の発生により）検出できる。このような方法は、ヌクレオチドを所定の標的位置において同定し、ＤＮＡを簡素かつ迅速に配列決定可能とする一方、電気泳動の必要性および潜在的に危険な放射性同位元素標識の使用を回避する。
ＰＰｉは、多くの異なる方法論により検出でき、種々の酵素的方法が以前に記載されている（例えばＲｅｅｖｅｓ，ら、１９６９．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２８２−２８７；Ｇｕｉｌｌｏｒｙ，ら、１９７１．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１７０−１８０；Ｊｏｈｎｓｏｎ，ら、１９６８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：２７３；Ｃｏｏｋ，ら、１９７８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１：５５７−５６５；およびＤｒａｋｅ，ら、１９７９．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１７−１２０参照）。
ポリメラーゼによるｄＮＴＰの取り込みの結果として放出されたＰＰｉは、例えばＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰに変換できる。この酵素はイオウの代謝に関与していると見なされている。イオウは還元型および酸化型の両方において、植物および動物の成育に対して必須な無機質栄養である（例えばＳｃｈｍｉｄｔおよびＪａｇｅｒ，１９９２．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：３２５−３４９参照）。植物および微生物の両方において、スルフェートの能動的取り込みの後にスルフィドへの還元が起こる。スルフェートは、入手可能な細胞性還元剤と比較して極めて低い酸化／還元電位を有するため、同化の第１工程はＡＴＰ依存性の反応を介したその活性化を必要とする（例えばＬｅｙｈ，１９９３．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：５１５−５４２参照）。ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：スルフェートアデニリルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．７．７．４）は無機スルフェート（ＳＯ４ −２）の代謝における初期の反応を触媒する；例えば、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＬｉｐｍａｎｎ，１９５８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：６８６−６９０；ＨａｗｅｓおよびＮｉｃｈｏｌａｓ，１９７３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５４１−５５０参照。この反応においてＳＯ４ −２が活性化されてアデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）となる。
ＡＴＰスルフリラーゼは数種の供給源、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例えば、ＨａｗｅｓおよびＮｉｃｈｏｌａｓ，１９７３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５４１−５５０参照）；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（例えばＲｅｎｏｓｔｏ，ら、１９９０．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０３００−１０３０８参照）；ラット肝（例えば、Ｙｕ，ら、１９８９．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６９：１６５−１７４参照）；および植物（例えば、ＳｈａｗおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９７２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２７：２３７−２４７；Ｏｓｓｌｕｎｄ，ら、１９８２．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０：３９−４５参照）から高度に精製されている。更に、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子は原核生物（例えば、Ｌｅｙｈ，ら、１９９２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０４０５−１０４１０；ＳｃｈｗｅｄｏｃｋおよびＬｏｎｇ，１９８９．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ２：１８１−１９４；ＬａｕｅおよびＮｅｌｓｏｎ，１９９４．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：３７２３−３７２９参照）；真核生物（例えばＣｈｅｒｅｓｔ，ら、１９８７．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：３０７−３１３；ＭｏｕｎｔａｉｎおよびＫｏｒｃｈ，１９９１．Ｙｅａｓｔ ７：８７３−８８０；Ｆｏｓｔｅｒ，ら、１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９７７７−１９７８６参照）；植物（例えばＬｅｕｓｔｅｋ，ら、１９９４．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：８９７−９０２１６参照）；および動物（例えばＬｉ，ら、１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９４５３−２９４５９参照）からクローニングされている。酵素は、特定の供給源に応じてホモオリゴマーまたはヘテロ２量体である（例えば、ＬｅｙｈおよびＳｕｏ，１９９２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５４２−５４５参照）。
いくつかの実施形態において、熱安定性スルフリラーゼを使用する。熱安定性スルフリラーゼは例えばＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐから得ることができる。熱安定性スルフリラーゼの配列は、データベースアクセッション番号０２８６０６、アクセッション番号Ｑ９ＹＣＲ４およびアクセッション番号Ｐ５６８６３において入手可能である。
ＡＴＰスルフリラーゼは多くの異なる用途、例えば高濃度ＡＴＰにおけるＡＤＰの生物発光検出（例えばＳｃｈｕｌｔｚ，ら、１９９３．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１５：３０２−３０４参照）；ＤＮＡポリメラーゼ活性の連続モニタリング（例えばＮｙｒｂｎ，１９８７．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６７：２３５−２３８参照）；およびＤＮＡ配列決定（例えばＲｏｎａｇｈｉ，ら、１９９６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９；Ｒｏｎａｇｈｉ，ら、１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３−３６５；Ｒｏｎａｇｈｉ，ら、１９９８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６５−７１参照）の為に使用されている。
幾つかのアッセイがフォワードＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出の為に開発されている。比色モリブデン溶解アッセイは、ホスフェート検出に基づいている（例えば、ＷｉｌｓｏｎおよびＢａｎｄｕｒｓｋｉ，１９５８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：９７５−９８１参照）のに対し、連続分光分析モリブデン溶解アッセイはＮＡＤＨ酸化の検出に基づいている（例えばＳｅｕｂｅｒｔ，ら、１９８３．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２５：６７９−６９１；Ｓｅｕｂｅｒｔ，ら、１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３参照）。後者のアッセイは数種の検出酵素の存在を必要とする。更に幾つかの放射性アッセイが文献に記載されている（例えばＤａｌｅｙ，ら、１９８６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７：３８５−３９５参照）。例えば１つのアッセイは３２Ｐ−標識ＡＴＰから放出された３２ＰＰｉの検出に基づいており（例えばＳｅｕｂｅｒｔ，ら、１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３参照）、別のものは［３５Ｓ］−標識ＡＰＳへの３５Ｓの取り込みに基づいており（このアッセイもまたカップリング酵素として精製されたＡＳＰキナーゼを必要とする；例えばＳｅｕｂｅｒｔ，ら、１９８３．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２５：６７９−６９１参照）；および第３の反応は［３５Ｓ］−標識ＡＰＳからの３５ＳＯ４ −２の放出に基づいている（例えばＤａｌｅｙ，ら、１９８６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７：３８５−３９５参照）。
可逆ＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出のためには、連続分光分析アッセイ（例えば、Ｓｅｇｅｌ，ら、１９８７．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：３３４−３４９参照）；生物発光測定アッセイ（例えば、ＢａｌｈａｒｒｙおよびＮｉｃｈｏｌａｓ，１９７１．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：１−１７参照）；３５ＳＯ４ −２放出アッセイ（例えば、Ｓｅｕｂｅｒｔ，ら、１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３参照）；および３２ＰＰｉ取り込みアッセイ（例えば、Ｏｓｓｌｕｎｄ，ら、１９８２．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０：３９−４５参照）が以前に報告されている。
ＡＴＰスルフリラーゼにより生産されるＡＴＰは酵素的反応を用いて加水分解することにより光を発生させることができる。発光化学反応（即ち化学発光）および生物学的反応（即ち生物発光）は、種々の代謝産物の高感度測定の為に、分析生物化学において広範に使用されている。生物発光反応において、光の放出をもたらす化学反応は酵素触媒される。例えばルシフェリン−ルシフェラーゼ系はＡＴＰの特定の試験を可能にし、細菌ルシフェラーゼ−酸化還元酵素系はＮＡＤ（Ｐ）Ｈのモニタリングの為に使用できる。両方の系は共に、ＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生産または利用の関与するカップリングされた反応を用いることにより、多くの物質の分析に拡張されている（例えばＫｒｉｃｋａ，１９９１．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１４７２−１２８１参照）。
新しい試薬の開発はＡＴＰ（例えばＬｕｎｄｉｎ，１９８２．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｉｎ；Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙｓ（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）参照）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（例えばＬｏｖｇｒｅｎ，ら、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ＮＡＤＨ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１０３−１１１参照）の濃度に比例した安定な光の放出を得ることを可能にしている。このように安定した発光試薬を用いれば、エンドポイントアッセイを実施すること、および、既知量のＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの添加により各個々のアッセイを較正することが可能となる。更に、安定な発光系はＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ変換系の連続的モニタリングを可能とする。
ＡＴＰを光に変換するための適当な酵素は、ルシフェラーゼ、例えば昆虫ルシフェラーゼを包含する。ルシフェラーゼは触媒作用の採集産物として光を発生する。最も知られている発光酵素は、ホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（鞘翅類）のものである。対応する遺伝子はクローニングされ、細菌（例えば、ｄｅ−Ｗｅｔ，ら、１９８５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：７８７０−７８７３参照）および植物（例えばＯｗ，ら、１９８６．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：８５６−８５９参照）において、並びに昆虫（例えば、Ｊｈａ，ら、１９９０．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７４：２４−２６参照）および哺乳類細胞（例えばｄｅ Ｗｅｔ，ら、１９８７．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７３；Ｋｅｌｌｅｒ，ら、．１９８７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３２６４−３２６８参照）において発現されている。更にジャマイカコメツキムシ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（鞘翅類）由来のルシフェラーゼ遺伝子の多くが最近クローニングされ、部分的に特性化されている（例えばＷｏｏｄ，ら、１９８９．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：２８９−３０１；Ｗｏｏｄ，ら、１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７００−７０２参照）。異なるルシフェラーゼは場合により異なる波長の光を発生することができ、これは異なる波長における発光の同時モニタリングを可能にする場合がある。従って、これらの上記した特性は独特であり、現在のレポーター系の利用に関して新しい次元を付加するものである。
ホタルルシフェラーゼはルシフェリン、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下に生物発光を触媒し、０．８８の量子収量を与える（例えば、ＭｃＥｌｒｏｙおよびＳｅｌｉｎｇｅｒ，１９６０．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８８：１３６−１４５参照）。ホタルルシフェラーゼ生物発光反応は約１×１０−１３Ｍの検出限界でＡＴＰを検出するためのアッセイとして利用することができる（例えばＬｅａｃｈ，１９８１．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：４７３−５１７参照）。更に、ルシフェラーゼ媒介検出系の感度および簡便さの全体的程度は，ホタルルシフェラーゼ系バイオセンサーの開発においてかなりの利益をもたらしている（例えば，ＧｒｅｅｎおよびＫｒｉｃｋａ，１９８４．Ｔａｌａｎｔａ ３１：１７３−１７６；Ｂｌｕｍ，ら、１９８９．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：５４３−５５０参照）。
上記した酵素を用いながら、ポリメラーゼおよび既知のｄＮＴＰに配列プライマーを曝露する。ｄＮＴＰがプライマー配列の３’末端に取り込まれる場合、ｄＮＴＰは切断されてＰＰｉ分子が放出される。次にＰＰｉはＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変換される。好ましくは、ＡＴＰスルフリラーゼは、ＰＰｉの変換がＰＰｉに関して一次速度的に進行するような十分高い濃度で存在する。ルシフェラーゼの存在下において、ＡＴＰは加水分解して光子を発生する。反応は、好ましくは反応ＡＴＰ→ＡＤＰ＋ＰＯ４ ３−＋光子（光）がＡＴＰに関して一次速度的に進行するような、反応混合物内に存在するルシフェラーゼの十分な濃度を有する。光子は後述する方法および装置を用いながら測定できる。１つの実施形態において、ＰＰｉおよびカップリングスルフリラーゼ／ルシフェラーゼ反応を使用することにより、検出のための光を発生させる。いくつかの実施形態において、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼの何れかまたは両方を、各反応部位に配設された１つ以上の可動性固体支持体に固定化する。
即ち本発明は、ＰＰｉの放出をポリメラーゼ反応中に検出可能とすることによりリアルタイムシグナルを与えるものである。配列決定反応はリアルタイムで連続的にモニタリングしてよい。即ちＰＰｉ放出の迅速検出のための手順が本発明により可能となる。反応は２秒未満のうちに起こると推定されている（ＮｙｒｅｎおよびＬｕｎｄｉｎ上述）。律速段階は、ＡＴＰスルフリラーゼによるＰＰｉからＡＴＰへの変換であるが、ルシフェラーゼ反応は急速であり、０．２秒未満を要すると推定されている。ポリメラーゼに関する取り込み速度もまた種々の方法で推定されており、例えばＫｌｅｎｏｗポリメラーゼの場合は、１塩基の完全取り込みは０．５秒未満を要することが解っている。即ち、１塩基の取り込みおよびこの酵素試験による検出のための推定される総時間は約３秒である。従って極めて迅速な反応が可能であり、リアルタイム検出ができることがわかるであろう。反応時間はより熱安定性のルシフェラーゼを使用することにより更に低減できる。
大部分の用途について、ＡＴＰおよびＰＰｉのような夾雑物質を含有しない試薬を使用することが望ましい。これらの夾雑物は、樹脂に結合したアピラーゼおよび／またはピロホスファターゼを含有する予備カラムを通過させながら、試薬を流すことにより除去してよい。或いは、アピラーゼまたはピロホスファターゼを磁性ビーズに結合させ、試薬中に存在する夾雑ＡＴＰおよびＰＰｉを除去するために使用できる。更に、拡散性の配列決定試薬、例えば未取り込みのｄＮＴＰは、洗浄緩衝液を用いて洗浄除去することが望ましい。ピロホスフェート配列決定に使用する何れの洗浄緩衝液も使用できる。
いくつかの実施形態において、配列決定反応における試薬の濃度は、０．２ｍｌ緩衝液中１ｐｍｏｌ ＤＮＡ、３ｐｍｏｌポリメラーゼ、４０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰを包含する。Ｒｏｎａｇｈｉ，ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９（１９９６）を参照。
配列決定反応は、所望により４種の所定のヌクレオチドの各々を用いて実施できる。「完全な」サイクルは、一般的に所定の順序においてヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）の各々について配列決定試薬を逐次的に投与することを包含する。未取り込みのｄＮＴＰは、ヌクレオチド添加の各々の間において洗浄除去される。或いは未取り込みのｄＮＴＰは、アピラーゼにより分解される（後述参照）。サイクルは、所望量の配列産物の配列が得られるまで所望の回数反復する。いくつかの実施形態において、約１０〜１０００、１０〜１００、１０〜７５、２０〜５０または約３０ヌクレオチドの配列情報が、１つのアニーリングされた配列決定プライマーの伸長から得られる。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドはビオチンのようなハプテンのジスルフィド誘導体を含有するように修飾する。アンカー基板にアニーリングされた初期のプライマーへの修飾ヌクレオチドの付加は、ｉ）修飾がビオチンである例において酵素分子に連結されたアビジンまたはストレプトアビジン結合体部分の逐次的結合、ｉｉ）過剰なアビジンまたはストレプトアビジン連結酵素の洗浄除去、ｉｉｉ）酵素活性に適した条件下における適当な酵素基質の流れ、およびｉｖ）酵素基質反応産物の検出、を包含する重合後の工程により分析する。この実施形態において、還元剤の添加を介してハプテンを除去する。このような方法はヌクレオチドを所定の標的位置において同定可能とし、ＤＮＡを簡素かつ迅速に配列決定可能とする一方、電気泳動の必要性および潜在的に危険な放射性同位元素標識の使用を回避する。
ハプテンを検出するための好ましい酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼである。所望により、洗浄緩衝液を本明細書に記載する種々の反応体の添加の間に使用できる。アピラーゼは、配列決定プライマーを伸長するために使用される未反応のｄＮＴＰを除去するために使用できる。洗浄緩衝液は、場合によりアピラーゼを包含できる。
例示されるハプテン、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光染料分子ｃｙ３およびｃｙ５、ならびにフルオレセインは、伸長ＤＮＡ分子内に種々の効率で取り込まれる。ハプテンの結合はヌクレオチド上の糖、塩基を介した、およびホスフェート部分を介した連結を介して起こることができる。シグナル増幅のための例示される手段は、蛍光、電気化学的および酵素的なものを包含する。酵素的増幅を用いる好ましい実施形態において、酵素、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼは、それに対する光発生基質が知られているものを包含し、これらの光発生（化学発光）基質の検出のための手段はＣＣＤカメラを包含できる。
好ましい様式において、修飾された塩基を添加し、検出を行い、ハプテン結合体部分は、切断または不活性化剤の何れかの使用により除去または不活性化される。例えば、切断可能なリンカーがジスルフィドである場合、切断剤は還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノールであり得る。本発明の他の実施形態は熱、寒冷、化学変性剤、界面活性剤、疎水性試薬および自殺基質を包含する。
ルシフェラーゼはｄＡＴＰを直接加水分解し、同時に光子を放出することができる。これは、伸長された配列決定プライマーへのｄＡＴＰの取り込みとは独立して加水分解が起こるため、偽陽性シグナルをもたらす。この問題を回避するために、ＤＮＡ内に取り込まれたｄＡＴＰアナログを使用することができ、即ち、これはＤＮＡポリメラーゼの基質であるが、ルシフェラーゼの基質ではない。そのようなアナログの１つはα−チオ−ｄＡＴＰである。即ち、α−チオ−ｄＡＴＰの使用は、ｄＡＴＰが成長中の核酸鎖内に取り込まれることなく加水分解される場合に生じることができる疑似的な光子の発生を回避する。
典型的には、ＰＰｉ系の検出は、配列決定プライマー添加直後の配列決定反応混合物へのコントロールヌクレオチドの添加の後に放出される光の測定により較正される。これにより反応条件の正規化が可能となる。連続して２つ以上の同一のヌクレオチドが取り込まれることが、放出された光の量の対応する増加から明らかにされる。即ち、コントロールヌクレオチドと比較した場合、放出された光が倍増していることは、伸長されたプライマー内に２つの連続したｄＮＴＰが取り込まれたことを明らかにするものである。
所望により、アピラーゼは固体支持体表面上を「洗浄」または「流れ」させることにより、配列決定反応混合物内に残存する、あらゆる取り込まれていないｄＮＴＰの分解を促進してよい。アピラーゼはまた、発生したＡＴＰを分解し、これにより反応から生じた光を「消す」。アピラーゼで処理することにより、如何なる残存反応体も洗浄除去され、後のｄＮＴＰインキュベーションおよび光子検出工程の準備が整う。或いは、アピラーゼは固体または可動性固体支持体に結合させてよい。
両端配列決定
好ましい実施形態において、本発明者等は核酸鋳型の両方の末端から配列決定するための方法を提供する。伝統的には２本鎖ＤＮＡ分子の両方の末端の配列決定は、最低でもプライマーのハイブリダイゼーション、一端の配列決定、第２のプライマーのハイブリダイゼーション、およびもう一端の配列決定を必要とする。代替法は２本鎖核酸の個々の鎖を分離し、各鎖を個々に配列決定することである。本発明は最初の２つの方法よりも迅速で低労働集約性の第３の代替法を提供する。
本発明は、多重プライマーからの核酸の逐次的配列決定の方法を可能にする。本出願において、ＤＮＡ配列決定への言及は、配列決定プライマーの成長中の鎖内にヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）が取り込まれる場合、配列が決定されるポリメラーゼを使用した配列決定に関する。この種の配列決定の一例は、パイロシーケンス検出ピロホスフェート法（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，２７４，３２０，６２５８，５６８および６，２１０，８９１参照）である。
１つの実施形態において、本発明は鋳型２本鎖核酸の２つの末端を配列決定するための方法を提供する。２本鎖ＤＮＡは２つの１本鎖ＤＮＡよりなり；これは本明細書において第１の１本鎖ＤＮＡおよび第２の１本鎖ＤＮＡと称する。第１のプライマーは第１の１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、第２のプライマーは第２の１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする。第１のプライマーは未保護であるのに対し、第２のプライマーは保護される。「保護」および「保護された」とは本開示において、プライマーがＤＮＡポリメラーゼによる重合を起こさないようにするプライマー上の反応性の部位への化学基の付加として定義する。更に、そのような化学保護基の付加は可逆的でなければならず、これにより逆転（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）後に、その時点で脱保護されたプライマーは、配列決定プライマーとして再度機能することができるようにする。核酸配列は、ピロホスフェート配列決定のような従来の方法を用いながら、ＤＮＡポリメラーゼにより第１のプライマーを伸長することにより一方向（例えば鋳型の一端から）で決定される。次に第２のプライマーを脱保護し、ＤＮＡポリメラーゼおよびピロホスフェート配列決定のような従来の方法を用いながら、もう１つの方向（例えば鋳型の他のもう１つの端部から）で第２のプライマーを伸長することにより配列を決定する。第１および第２のプライマーの配列は、２本鎖ＤＮＡの２つの末端に、または、鋳型に沿った何れかの位置で、本方法においてハイブリダイズするように特別に設計されている。
別の実施形態において、本発明は多数のプライマーから核酸を配列決定する方法を可能にする。この方法において、多くの配列決定プライマーを配列決定すべき鋳型核酸にハイブリダイズする。配列決定プライマーは、１つを除き全て可逆的に保護される。保護されたプライマーは、ＤＮＡ配列決定反応において一般的に使用されているポリメラーゼおよびｄＮＴＰで伸長できないオリゴヌクレオチドプライマーである。可逆的に保護されたプライマーは、脱保護できる保護されたプライマーである。本発明において言及する全ての保護されたプライマーは、可逆的に保護されている。脱保護の後、可逆的に保護されたプライマーは通常の配列決定プライマーとして機能し、通常の配列決定反応に参加することができる。
本発明は、多数のプライマーから核酸を逐次的に配列決定する方法を可能にする。方法は以下の工程を包含し、即ち、第１に、配列決定すべき１つ以上の鋳型核酸を提供する。第２に複数の配列決定プライマーを鋳型核酸にハイブリダイズする。配列決定プライマーの数は数値ｎにより表すことができ、ここでｎは１より大きい何れかの正の数であることができる。その数は例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上であってよい。プライマーのうちｎ−１個が保護基により保護されてよい。従って、例えばｎが２、３、４、５、６、７、８、９または１０である場合は、ｎ−１はそれぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９となる。残余のプライマー（例えばｎ個のプライマー−（ｎ−１）個の保護プライマー＝１残余プライマー）は未保護になる。第３に、未保護プライマーを伸長し、鋳型ＤＮＡ配列を従来の方法、例えばピロホスフェート配列決定により決定する。第４に、第１のプライマーを配列決定した後、残余の保護プライマーの１つを未保護化する。第５に未保護のプライマーを伸長し鋳型ＤＮＡ配列を従来の方法、例えばピロホスフェート配列決定により決定する。場合により、該方法は、全ての保護プライマーに対して配列決定が実施されるまで反復してよい。
別の態様において、本発明は以下の工程、即ち（ａ）２つ以上の配列決定プライマーを核酸にハイブリダイズする工程、ここで１つを除く全てのプライマーは可逆的に保護されているものであること；（ｂ）未保護プライマーからのポリメラーゼ伸長により、核酸の１鎖の配列を決定する工程；（ｃ）可逆的に保護されたプライマーの１つを脱保護して、未保護プライマーとする工程；（ｄ）可逆的に保護されたプライマーの全てが脱保護されて配列の決定のために使用されるまで工程（ｂ）および（ｃ）を反復する工程を含む、核酸の逐次的配列決定の方法を包含する。１つの実施形態において、この方法は工程（ｂ）と（ｃ）との間に１つの追加的な工程、即ち、未保護プライマーにＤＮＡポリメラーゼおよび１つ以上のヌクレオチド三リン酸またはジデオキシヌクレオチド三リン酸を接触させることにより、未保護プライマーの伸長を終了させる工程を含む。更に別の実施形態において、この方法は更に、工程（ｂ）と（ｃ）との間に追加的な工程、即ち、未保護プライマーにＤＮＡポリメラーゼおよびｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰまたはこれらの組合せのジデオキシヌクレオチド三リン酸を接触させることにより伸長を終了させる工程を含む。
別の態様において、本発明は（ａ）核酸の第１の鎖に未保護プライマーをハイブリダイズする工程；（ｂ）第２の鎖に第２の保護されたプライマーをハイブリダイズする工程；（ｃ）第１の未保護プライマーが、第１の鎖に沿って伸長するように第１および第２の鎖をポリメラーゼに曝露する工程；（ｄ）第１の配列決定プライマーの伸長を完了する工程；（ｅ）第２の配列決定プライマーを脱保護する工程；および（ｆ）第２の配列決定プライマーが、第２の鎖に沿って伸長するように第１および第２の鎖をポリメラーゼに曝露する工程を含む、核酸を配列決定する方法を包含する。好ましい実施形態において、完了にはキャッピングまたは伸長の終了が含まれる。
別の実施形態において、本発明は、第１および第２の１本鎖ＤＮＡを含む鋳型２本鎖核酸の２つの末端を配列決定するための方法を提供する。この実施形態において、第１のプライマーを第１の１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、第２のプライマーを同じ工程において第２の１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする。第１のプライマーは未保護とし、第２のプライマーは保護する。
ハイブリダイゼーションの後、従来の方法、例えばピロホスフェート配列決定を用いながら、ＤＮＡポリメラーゼにより第１のプライマーを伸長することにより１方向（例えば鋳型の一端から）で核酸配列を決定する。好ましい実施形態において、ポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。次に第２のプライマーを脱保護し、その配列を、従来の方法、例えばピロホスフェート配列決定を用いながらＤＮＡポリメラーゼによりもう１つの方向（例えば鋳型の他のもう１つの端部から）で第２のプライマーを伸長することにより決定する。前記した通り、第１のプライマーおよび第２のプライマーの配列は２本鎖ＤＮＡの２つの末端に、または、鋳型に沿った何れかの位置でハイブリダイズするように設計されている。この手法は、それ自体の２つの末端上に固有な配列決定プライマーハイブリダイゼーション部位を含有する多くの鋳型ＤＮＡの配列決定のために特に有用である。例えば、多くのクローニングベクターは、何れかのクローニングされた配列の続く配列決定を促進するためのインサート部位に隣接する固有な配列決定プライマーハイブリダイゼーション部位を与える（例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。
本発明のこの方法の１つの利点は、両方のプライマーを単一の工程においてハイブリダイズさせてよい点である。この方法および他の方法の利点は、ハイブリダイゼーションが通常よりは大きく関与している平行配列決定系において特に有用である。平行配列決定系の例は参照により全体が本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願１０／１０４，２８０に開示されている。
本発明のオリゴヌクレオチドは従来の技術により、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成器を用いて、または、そのようにして合成されたサブフラグメントをライゲーションすることにより合成してよい。
本発明の別の実施形態において、２本鎖標的核酸の長さを決定してよい。２本鎖核酸の長さを決定する方法は当該分野で知られている。長さの決定は、核酸を配列決定する前またはその後に行ってよい。核酸分子長決定の知られた方法には、ゲル電気泳動、パルスフィールドゲル電気泳動、質量スペクトル分析等が包含される。平滑末端２本鎖核酸は、同一の長さの２つの１本鎖よりなるため、核酸の一方の鎖の長さの決定は対応する２本鎖の長さの決定の為に十分なものとなる。
本発明による配列反応はまた、鋳型核酸長の決定を可能にする。第１に、核酸の一端からもう一端への完全な配列は、長さの決定を可能とする。第２に、２つの末端の配列の決定は、２配列を連結している中央で重複する場合がある。完全な配列を決定し、長さを解明してよい。例えば、鋳型が１００ｂｐ長である場合、一端からの配列決定は塩基１〜７５を決定し；もう一端からの配列決定は塩基２５〜１００を決定してよく；即ち塩基２５〜塩基７５までの中央において５１塩基が重複し；その情報から、１〜１００までの完全な配列が決定され、１００塩基の長さが完全な配列により解明される場合がある。
本発明の別の方法は、以下の工程を含む方法に関する。第１に、各々が異なる配列を有する複数の配列決定プライマーを配列決定すべきＤＮＡにハイブリダイズする。配列決定プライマーの数は１より多い何れかの値、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上であってよい。これらのプライマーは１つを除き全て可逆的に保護される。１つの未保護プライマーが配列決定反応において伸長され、配列が決定される。通常はプライマーを完全に伸長する場合は、それは伸長することができず、他のプライマーからの後の配列決定に影響しない。所望により、配列決定されたプライマーは過剰のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いるか、または、ｄｄＮＴＰを用いることにより終止させる。終止工程を行う場合は、終止試薬（ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ）は工程の後に除去しなければならない。次に可逆的に保護されたプライマーの１つを未保護とし、第２のプライマーからの配列決定を進行させる。プライマーを脱保護し、脱保護されたプライマーからの配列決定を行い、場合によりプライマーからの配列決定を終止するという工程は、全保護プライマーが未保護となり、配列決定に使用されるまで反復される。
可逆的に保護されたプライマーは、異なる化学基で保護しなければならない。脱保護の適切な方法を選択することにより、１つのプライマーの脱保護を、他のプライマーの保護基に影響することなく行える。好ましい実施形態において、保護基はＰＯ４である。即ち第２のプライマーをＰＯ４で保護し、脱保護はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（その３’−ホスファターゼ活性を利用）により達成する。別の好ましい実施形態において、保護はチオ基またはホスホロチオール基である。
鋳型核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）であってよい。ＤＮＡは好ましい鋳型であるが、ＲＮＡおよびＰＮＡを知られた手法、例えばランダムプライムＰＣＲ、逆転写、ＲＴ−ＰＣＲまたはこれらの手法の組合せによりＤＮＡに変換してよい。更に本発明の方法は、未知および既知の配列の核酸の配列決定の為に有用である。既知の配列の核酸の配列決定は、例えば合成されたＤＮＡの配列の確認のため、または既知の核酸配列を有する推定病原体の同一性の確認の為に有用である。核酸は１つより多い核酸集団の混合物であってよい。十分な特異性（例えば２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基または５０塩基）を有する配列決定プライマーは長鎖核酸において、または、未関連の核酸の集団において、配列のサブセットを配列決定するために使用される。即ち、例えば、鋳型は１０Ｋｂの１配列、または各々１Ｋｂの１０配列であってよい。好ましい実施形態において、鋳型ＤＮＡは５０ｂｐ〜７００ｂｐ長である。ＤＮＡは１本鎖または２本鎖であることができる。
鋳型核酸が１本鎖である場合は、多くのプライマーを以下の通り鋳型核酸にハイブリダイズしてよい。
Figure 2009502202
 この場合、最初の未保護プライマーは、鋳型の際５’末端においてハイブリダイズするプライマーであることが好ましい。この方向において、プライマー１の伸長は、（鎖置換による）プライマー２、３または４を置き換えることはない。プライマー１からの配列決定が終了すれば、プライマー２が未保護となり、核酸配列決定が開始できる。プライマー２からの配列決定は、プライマー１またはプライマー１の伸長された型を置き換えるが、残余の保護されたプライマー（プライマー３および４）に対して作用を有さないことになる。この順序を用いることにより、各プライマーを逐次的に用い、１つのプライマーからの配列決定反応は続くプライマーからの配列決定には影響しないことになる。
本発明の１つの特徴は、１つ以上の核酸に対して多数の配列プライマーを使用する能力、および、１回のみのハイブリダイゼーション工程を用いて多数のプライマーから配列決定する能力である。ハイブリダイゼーション工程において、全ての配列決定プライマー（例えばｎ個の配列決定プライマー）を同時に鋳型核酸にハイブリダイズしてよい。従来の配列決定において、通常は１ハイブリダイゼーション工程が１プライマーからの配列決定の為に必要であった。本発明の１つの特徴は、ｎ（上記定義）プライマーからの配列決定を単一のハイブリダイゼーション工程により行ってよい点である。これにより、ｎ−１ハイブリダイゼーション工程を効率的に排除する。
好ましい実施形態において、ｎ個のプライマーの配列は、プライマーが交差ハイブリダイズおよび自己ハイブリダイズしない程度に十分異なるものである。交差ハイブリダイゼーションとは、配列の相補性による１つのプライマーの他のプライマーとのハイブリダイゼーションを指す。交差ハイブリダイゼーションの１つの形態は、一般的に「プライマー２量体」と称される。プライマー２量体の場合、２つのプライマーの３’末端は相補的であり、伸長された場合は２つのプライマーの長さの概ね総和となる構造を形成する。自己ハイブリダイゼーションはプライマーの５’末端がそのプライマーの３’末端と相補的である状況を指す。その場合、プライマーは自己ハイブリダイズしてヘアピン様構造を形成する傾向を有する。
プライマーは鋳型分子と特異的に相互作用するか、または会合することができる。「相互作用する」または「会合する」という用語は、本明細書において、２つの基質または化合物（例えばプライマーと鋳型；化学部分とヌクレオチド）が、意図するアッセイが実施できる程度に十分に、相互に結合（例えば連結、結合、ハイブリダイズ、接合、アニーリング、共有結合または会合）することを意味する。「特異的」または「特異的に」という用語は、本明細書において、２成分が相互に選択的に結合することを意味する。特異的相互作用を達成するために必要なパラメーターは、例えば当該分野の従来の方法を用いながら常套的に決定できる。
複雑な混合物の分析において、より高い感度を得るか、または援助的であるために、保護されたプライマーを、明確で固有なシグナルを与えるように設計された化学部分で修飾（例えば誘導体化）することができる。例えば、各々の保護されたプライマーを、鎖のハイブリダイゼーション部分に沿った１つ以上の位置において、アミド結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に結合した異なる天然または合成アミノ酸で誘導体化することができる。化学修飾は当然ながら、標的核酸から切断された後、または、標的核酸と会合している間に検出することができる。各々の保護された標的核酸を区別可能な様式において同定とすることにより、単一のアッセイにおいて多数の異なる標的核酸についてアッセイ（例えばスクリーニング）することが可能である。多くのこのようなアッセイは迅速かつ容易に実施できる。従って、このようなアッセイまたはアッセイのセットは本明細書に定義する高スループット効率で実施できる。
本発明の方法において、第１のプライマーを伸長し、鋳型ＤＮＡの配列を決定した後、第２のプライマーを脱保護し、配列決定する。その時点で未保護となっている第２のプライマーの配列決定反応と第１のプライマーの配列決定反応との間には、第１のプライマーが完全に伸長されるか、または終止しているため、妨害関係は生じない。第１のプライマーが完全に伸長されるため、ピロホスフェート配列決定のような従来の方法を用いた第２のプライマーからの配列決定は、伸長された第１のプライマーの存在による影響を受けない。本発明はまた、第１のプライマーからの何れかの可能性のあるシグナルの夾雑を低減する方法を提供する。シグナルの夾雑とは、第１のプライマーが完全に伸長されない場合の偶発的影響を指す。第１および第２のプライマーの両方の伸長は、ＤＮＡ配列の決定を妨害する場合がある。
好ましい実施形態において、１つのプライマーからの配列決定反応（例えば鎖伸長反応）は、第２のプライマーに対する配列決定反応が開始されるよりも前に、先ず終了または完了される。ＤＮＡの鎖伸長反応は、鋳型ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼおよびジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、例えばｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＣＴＰに接触させることにより終了することができる。終了後、ジデオキシヌクレオチド三リン酸は、ｄｄＮＴＰを含有しない溶液で反応物を洗浄することにより除去してよい。プライマーの余分な伸長を防止する第２の方法は、反応物にヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ、例えばｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＣＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼを添加することにより、完全に伸長していない如何なるプライマーも完全に伸長させることである。完全に伸長した後、次のプライマーを脱保護する前に、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼを除去する。１つのプライマーの完了または終了の後に別のプライマーを脱保護することにより、配列決定反応（例えばピロホスフェート配列決定）のＳＮ比を向上することができる。
（ａ）場合により配列決定を終了または完了する工程、（ｂ）新しいプライマーを脱保護する工程、および（ｃ）脱保護プライマーからの配列決定、の工程を各プライマーの伸長から配列が決定されるまでを反復してよい。この方法において、ハイブリダイゼーション工程は「ｎ」個のプライマーおよび１個の未保護プライマーを含む。未保護プライマーを先ず配列決定し、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を反復してよい。
好ましい実施形態において、ピロホスフェート配列決定は本発明の方法により実施される全ての配列決定の為に使用する。
別の好ましい実施形態において、両端配列決定を図１０に示すプロセスに従って実施する。このプロセスは以下の６工程、即ち（１）捕捉ビーズの作製（図１０Ａ）；（２）ビーズへ向かう（ｄｒｉｖｅ ｔｏ ｂｅａｄ）（ＤＴＢ）ＰＣＲ増幅（図１０Ｂ）；（３）ＳＬレポーター系調製（図１０Ｃ）；（４）第１の鎖の配列決定（図１０Ｄ）；（５）第２の鎖の調製（図１０Ｅおよび１０Ｆ）；および（６）各鎖の分析（図１０Ｇ）に分割してよい。この例示されるプロセスを以下に概説する。
工程１において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−活性化捕捉ビーズ（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）をフォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方にカップリングする。ＮＨＳカップリングにより、第１アミノ基を含有するリガンドとの化学的に安定なアミド結合が形成される。捕捉ビーズはまた、ビオチンにカップリングさせる（図１０Ａ）。ここで使用するビーズ（即ち固体核酸捕捉支持体）は何れかの好都合なサイズであり、様々な既知の物質から加工されたものであってよい。そのような物質の例は、無機物質、天然ポリマーおよび合成ポリマーを包含する。これらの物質の具体的な例は、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス；シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドの共重合体、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン等（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６４，３，１３８５−１３９０参照）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然海綿、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン（例えばＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ）およびアガロースゲル（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ）および当該分野で知られた固相支持体を包含する。好ましい実施形態において、捕捉ビーズは直径約２５〜４０μｍのセファロースビーズである。
工程２において、フォワードおよびリバースプライマーにハイブリダイズしている鋳型ＤＮＡを添加し、ＤＮＡをＰＣＲ増幅法により増幅する（図１０Ｂ）。１つの実施形態において、ＤＮＡはエマルジョンポリメラーゼ連鎖反応、ビーズに向かうポリメラーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅またはループ媒介等温増幅により増幅する。工程３においてストレプトアビジンを添加し、その後ストレプトアビジンにカップリングするスルフリラーゼおよびルシフェラーゼを添加する（図１０Ｃ）。配列決定法の間の副次的酵素の添加に関しては、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願１０／１０４，２８０および米国特許出願１０／１２７，９０６に開示されている。１つの実施形態において、鋳型ＤＮＡは５’および３’末端の両方にライゲーションしたＤＮＡアダプターを有する。好ましい実施形態において、ＤＮＡはＤＮＡ捕捉ビーズ上の相補配列へのＤＮＡアダプターの１つのハイブリダイゼーションによりＤＮＡ捕捉ビーズにカップリングされる。
第１の工程において、増幅すべき１本鎖核酸鋳型を捕捉ビーズに結合する。核酸鋳型は、当該分野で知られた何れかの様式において捕捉ビーズに結合してよい。顕微鏡用ビーズにＤＮＡを結合させるための多くの方法が当該分野に存在している。ビーズへのＤＮＡの共有結合的な化学結合は、標準的なカップリング剤、例えば水溶性カルボジイミドを用いて、ＤＮＡ上の５’−ホスフェートを、ホスホアミデート結合を介してアミンコーティングしたマイクロスフェアに連結することにより達成できる。別の代替法は、同様の化学特性を用いてビーズに先ず特異的オリゴヌクレオチドリンカーをカップリングすること、次にＤＮＡリガーゼを用いることによりビーズ上のリンカーにＤＮＡを連結することである。他の連結化学特性はビーズにオリゴヌクレオチドを接合させるためにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびその誘導体を使用することを包含する。そのような方法において、オリゴヌクレオチドの一端は、固体支持体と共有結合を形成する反応性の基（例えばアミド基）を含有してよく、リンカーのもう１つの端部は固定化すべきオリゴヌクレオチドと結合できる別の反応性の基を含有する。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドを共有結合によりＤＮＡ捕捉ビーズに結合させる。しかしながら、非共有結合連結、例えばキレート形成または抗原−抗体複合体もビーズにオリゴヌクレオチドを接合するために使用してよい。
ＤＮＡフラグメントの末端、例えば制限酵素部位由来の重複末端またはバクテリオファージラムダ系クローニングベクターの「粘着末端」における固有な配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるが、平滑末端ライゲーションもまた有利に使用できる。これらの方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，６７４，７４３に詳細に記載されている。ビーズを固定化するために使用される如何なる方法も、本発明の方法において工程全体に渡り固定化されたオリゴヌクレオチドを結合し続けることが好ましい。好ましい実施形態において、共有結合によりＤＮＡ捕捉ビーズにオリゴヌクレオチドを結合させる。しかしながら、非共有結合連結、例えばキレート形成または抗原−抗体複合体を用いてオリゴヌクレオチドをビーズに接合させてよい。
工程４において、ＤＮＡの第１の鎖は、ピコタイタープレート（ＰＴＰ）上に捕捉ビーズを付着させ、当該分野で知られた方法（例えばピロホスフェート配列決定）により配列決定することにより配列決定される（図１０Ｄ）。配列決定の後、ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰの混合物を添加することにより「キャップ」するか、配列決定プロセスを終了する（図１０Ｅ）。工程５において、ｄｄＮＴＰを除去するためのアピラーゼおよびブロックされたプライマー鎖から３’ホスフェート基を除去するためのポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を添加することにより、核酸の第２の鎖を調製する（図１０Ｆ）。次にポリメラーゼを添加することにより第２の鎖をプライミングし、その後当該分野で知られた標準的な方法により第２の鎖を配列決定する（図１０Ｇ）。工程７において、隣接ＤＮＡ配列が決定されるように、第１および第２の鎖の両方の配列を分析する。
検出手段
固体支持体は、従来の光学部品または光ファイバーバンドルと組合せてＣＣＤ系を包含する画像化システム２３０に光学的に連結する。１つの実施形態において、灌流チャンバー基板は、水性界面近傍で発生した光が光ファイバーを介して直接基板またはチャンバーの外部に伝達されるように光ファイバーアレイウエハを包含する。ＣＣＤ系が光ファイバーコネクタを包含する場合、画像化は灌流チャンバー基板をコネクタに直接接触させて配置することにより達成される。或いは、従来の光学部品を用いて、例えば１−１倍率高開口数レンズ系を用いることにより、光ファイバー基板の外部から直接ＣＣＤセンサー上に、光を画像化することができる。基板が光ファイバーカップリングを与えない場合、上記した通りレンズ系を使用することもでき、その場合、基板または灌流チャンバーカバーの何れかは光学的に透明である。例示されるＣＣＤ画像化システムは上記した通りである。
画像化システム２３０を用いて基板表面上のリアクターから光を収集する。光は例えばＣＣＤ上に、当該分野で知られた高感度低ノイズ装置を用いながら画像化できる。光ファイバー系画像化の場合、光ファイバーをカバーガラス内に直接取り込むこと、または、ＦＯＲＡの場合はマイクロウェルを形成する光ファイバーもまた検出器に光を運ぶ光ファイバーとすることが好ましい。
画像化システムはコンピューター制御およびデータ収集システム２４０に連結する。一般的に、何れかの一般的に入手できるハードウエアおよびソフトウエアのパッケージを使用できる。コンピューター制御およびデータ収集システムはまた、試薬の送達を制御するために管２００に連結される。
ピロホスフェート配列決定反応により発生した光子は、それらが焦点設定装置（例えば光学レンズまたは光ファイバー）を通過してＣＣＤエレメント上に焦点設定される場合にのみＣＣＤにより捕捉される。しかしながら、放出された光子は全ての方向に等しく漏出することになる。それらの後の「捕捉」および平坦なアレイ（例えばＤＮＡチップ）を利用する際の定量を最大限とするために、光子をそれらが発生した地点に可能な限り近傍において、例えば平坦固体支持体において直に収集することが好ましい。これは（ｉ）カバーガラスと伝統的光学レンズまたは光ファイバーバンドルとの間に光学液浸油を使用すること、または、好ましくは（ｉｉ）カバーガラスそのものに直接光ファイバーを組み込むこと、のいずれかにより達成される。同様に、薄膜の光学的に透明な平坦な表面を用いる場合、光ファイバーバンドルはその背面に対向して設置することもでき、これにより反応／灌流チャンバー全体の深さに渡って「画像化」する必要性が排除される。
反応事象、例えばルシフェラーゼにより発生された光子は、種々の検出装置、例えば光電子増倍管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、吸光度測定器、ルミノメーター、電荷注入装置（ＣＩＤ）または他の固体検知器並びに本明細書に記載した装置を用いて検出し、定量してよい。好ましい実施形態において、放出された光子の定量は、溶融光ファイバーバンドルを装着したＣＣＤカメラを用いて行う。別の好ましい実施形態において、放出された光子の定量は、マイクロチャンネルプレート増倍器を装着したＣＣＤカメラを用いて行う。背面薄膜化（ｂａｃｋ−ｔｈｉｎｎｅｄ）ＣＣＤを使用することにより感度を増大させることができる。ＣＣＤ検出器は例えばＢｒｏｎｋｓ，ら、１９９５．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：２７５０−２７５７に記載されている。
例示されるＣＣＤシステムは、Ｌｏｃｋｈｅｅｄ−Ｍａｒｔｉｎ ＬＭ４８５ ＣＣＤチップおよび個々のファイバー直径が６〜８μｍの１−１光ファイバーコネクター（バンドル）を有するＳｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）のシリーズ６００の４ポートカメラである。このシステムは４０９６ｘ４０９６、または１６００万超の画素を有し、量子効率は１０％〜４０％未満の範囲である。即ち、波長に応じて、ＣＣＤセンサ上に画像化された光子の４０％もの多くが検出可能な電子に変換される。
他の実施形態において、蛍光部分を標識として用いることができ、反応事象の検出はレーザーを用いてアレイ表面を走査する共焦点走査電子顕微鏡を用いて行うことができるか、または、他の手法、例えばより小さい光学的解像が可能である操作型近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）を使用することができ、これにより「より稠密なアレイ」の使用が可能となる。例えば、ＳＭＯＮを使用する場合、個々のポリヌクレオチドは、１００ｎｍ、例えば１０ｎｍ×１０ｎｍ未満の距離だけ分離していれば、区別され得る。更に、走査型トンネル顕微鏡（Ｂｉｎｎｉｎｇら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５５：７２６−７３５，１９８２）および原子間力顕微鏡（Ｈａｎｓｗａら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ，２３：１１５−１３９，１９９４）を用いることができる。
ハプロタイプの適用
実質的に如何なる配列決定の適用も、本発明の方法および装置を用いて達成することができる。１つの実施形態において、本発明者等はハプロタイプマッピングを意図している。ヒト遺伝子の多様性は、医薬品に対する患者の応答の変動における重要な要因である。この多様性の最も厳密な尺度はハプロタイプであり、これはそれが染色体上に存在する場合の多形バリエーションの機構である。近年、合衆国、カナダおよび欧州の主要な政府および学術機関のゲノム研究者等は、ハプロタイプが遺伝情報の複雑さを現実的な形態まで低減することができる強力な手段であることに合意している。ハプロタイプは薬剤同定において標的の有効性確認および薬剤スクリーニング研究の結果を向上させるため、薬剤開発において臨床治験の設計および信頼性を向上させるために使用することができる。ハプロタイプマーカーは、新規および認可済みの薬品の有効性および安全性を予測するために使用することができ、臨床マーカー学会のデータベースからの指針を介して正しい用量における正しい薬品に患者をマッチさせる個別化医療の新しい枠組みの基礎として機能する。
多くの経験的研究により、近接するＳＮＰ対立遺伝子は、１つのＳＮＰ対立遺伝子の状態がもう１つの緊密なＳＮＰの対立遺伝子と高度に相関するように相互に連鎖不平衡（ＬＤ）である場合が多いことが示された。これらの相関は、世代から世代に同時伝達される堅固に連結したＳＮＰの共有される歴史の為に存在している。即ちヒト配列バリエーションのパターン（ハプロタイプ）は先祖のＤＮＡセグメントを表している。歴史的減数分裂は堅固に連結したバリアントを除き、先祖染色体上の近隣対立遺伝子から対立遺伝子を緩徐に解離させている。最近のボトルネックを有する始祖集団における連鎖不平衡の程度は、特に嚢胞性線維症（１６）、ハンチントン病（１１）、褶曲性骨形成異常（ＤＴＤ）（８）のような単純なメンデル疾患のクローニングにおいて、多くの研究の対象となっている。これらのクローニング研究は、大きい距離（頻繁にはメガ塩基範囲となる）に亘るＬＤを示す大型の染色体セグメントから利益を被っているが、世界人口におけるヒトゲノムに亘るＬＤに関しては、最近まで実験データは殆ど入手できなかった。
本発明者等はＬＤ（およびハプロタイプ）の大規模調査の３つの最近の例に着目している（例えばＲｅｉｃｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｃａｒｇｉｌｌ，Ｍ．，ＢｏＩｋ，Ｓ．，Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｊ．，Ｓａｂｅｔｉ，Ｐ．Ｃ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｌａｖｅｒｙ，Ｔ．，Ｋｏｕｙｏｕｍｊｉａｎ，Ｒ．，Ｆａｒｈａｄｉａｎ，Ｓ．Ｆ．，Ｗａｒｄ，Ｒ．＆ Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．２００１．Ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４１１，１９９−２０４．２６参照）。本発明者等は、１９の染色体領域をそのＳＮＰ含有量に関してサンプリングした。２〜１６０ｋｂの間隔に亘る高頻度ＳＮＰは、白人サンプルにおいて初めて遺伝子タイピングされた。全領域に渡り、ＬＤは約６０ｋｂの距離において検出可能であり、範囲は１つの遺伝子座では６ｋｂと短く他では１５５ｋｂと長かったため、領域間でかなりの差があった。意外ではないが、ＬＤは推定された局所的組み換え率とかなり相関していた。黒人サンプルで更に分析したところ、この集団におけるより短いＬＤが明らかになったが、短い距離に亘る対立遺伝子組合せは白人サンプルと同様であった。全体として、この作業により、ＬＤの大型ブロックはヒトゲノムに渡って共通であり、疾患遺伝子のゲノムワイドＬＤマッピングは実現可能となることが明らかになった。
キット
本発明はまた以下の成分、即ち（ａ）標的位置がプライマーの３’末端に直接隣接するようにサンプルＤＮＡにハイブリダイズする試験特異的プライマー；（ｂ）ポリメラーゼ；（ｃ）ＰＰｉ放出を同定するための検出酵素手段；（ｄ）ｄＡＴＰの代わりにポリメラーゼに対する基質として作用できるが、上記ＰＰｉ検出酵素に対する基質としては作用できないｄＡＴＰアナログを包含するデオキシヌクレオチド；および（ｅ）場合によりジデオキシヌクレオチド、場合によりポリメラーゼに対する基質として作用できるが、上記ＰＰｉ検出酵素に対する基質としては作用できないｄｄＡＴＰアナログにより置き換えられているｄｄＡＴＰ、の１つ以上を包含できる本発明の方法において使用するためのキットを含む。キットが初回ＰＣＲ増幅と共に使用するためのものである場合、それはまた、以下の成分、即ち（ｉ）ＰＣＲ用プライマー対、ただし少なくとも１つのプライマーは該プライマーの固定化を可能とする手段を有するもの；（ｉｉ）好ましくは熱安定性のポリメラーゼ、例えばＴａｑ１ポリメラーゼ；（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応のための緩衝液；および（ｉｖ）デオキシヌクレオチドもまた、包含することができる。ＰＣＲを評価するために酵素標識を使用する場合は、キットは、酵素に対する基質および検出系の他の成分を好都合に含有することになる。
本発明の１つの実施形態は、核酸を配列決定するための方法に関する。方法は大型鋳型核酸分子をフラグメント化することにより、フラグメント化された核酸複数を発生させることを包含する。次に複数の水性マイクロリアクターが、フラグメント化核酸の単一のコピー、フラグメント化核酸に結合できる単一のビーズおよび核酸増幅を実施するために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水エマルジョンにおいて水性マイクロリアクター内にフラグメント化核酸を送達する。次の工程において、マイクロリアクター中のフラグメント化核酸を増幅することにより核酸の増幅されたコピーを形成し、増幅されたコピーをマイクロリアクター中のビーズに結合させる。次に、平坦な表面上の少なくとも１０，０００反応チャンバーのアレイにビーズを送達し、ここで複数の反応チャンバーは単一より多いビーズを含まない。最後に、複数の反応チャンバー上で同時に配列決定反応を実施する。
本発明の別の実施形態は、その上に複数のキャビティを有する平坦な表面を含むアレイに関し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、各キャビティーは２０μｍ〜７０μｍの少なくとも１つの寸法の幅を有する。更に、アレイには少なくとも１００００の反応チャンバーが存在する。各々の反応チャンバーは１本鎖核酸鋳型の単一種の少なくとも１００，０００コピーを含有してよい。
本発明の別の実施形態は、平坦な上面および平坦な底面を含むアレイに関し、ここで平坦な上面はその上に少なくとも１０，０００のキャビティーを有し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成し、平坦な底面は反応チャンバーからの光学シグナルが平坦な底面を通して検出できるように光学的に伝導性であり、ここで、上面と底面の間の距離は５ｍｍ以下であり、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、各チャンバーは２０μｍ〜７０μｍの少なくとも１つの寸法の幅を有する。１つの実施形態において、上面と底面の間の距離は、２ｍｍ以下である。
本発明の別の実施形態は、水性環境中で別個の平行した共通の反応を実施するためのアレイ手段に関する。アレイ手段は試薬と反応できる出発物質を含有する少なくとも１０，０００の個別の反応チャンバーを含む基板を含み、反応チャンバーの各々は、少なくとも１つの試薬を含有する１つ以上の流体が各反応チャンバーに送達された場合、試薬のウェル外部に拡散する拡散時間が、出発物質が試薬と反応して生成物を形成するために必要な時間を超過するような寸法を有する。
本発明の別の実施形態はアレイに生物学的活性剤を送達するための方法に関する。該方法は複数の可動性固体支持体をアレイ上に渡って分散させることを含み、ここで各可動性固体支持体はその上に固定化された少なくとも１つの試薬を有し、ここで試薬は核酸配列決定反応における使用に適しており、ここでアレイはその上に配設された複数の反応チャンバーを有する平坦な表面を含む。反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、各反応チャンバーは２０μｍ〜７０μｍの少なくとも１つの寸法の幅を有する。
本発明の別の実施形態は、反応が特定の部位において起こっていることを示す光に関して反応チャンバーのアレイを同時にモニタリングするための装置に関する。装置は（ａ）複数のキャビティー形成面を含む平坦基板から形成された反応チャンバーのアレイであって、各キャビティー形成面は検体を含有するように適合された反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、各反応チャンバーは１０〜１５０ｐＬの容量を有し、アレイは１０，０００超の個別の反応チャンバーを含むもの；（ｂ）使用時に特定の反応チャンバーに由来する光が、感光性装置の特定の所定領域上に投射されるように配置された感光性装置；（ｃ）所定領域の各々に投射されている光のレベルを測定するための手段；および（ｄ）反応チャンバーの各々に関する経時的な光のレベルの変動を記録する手段、を含む。
本発明の別の実施形態は、（ａ）それ自体の一端に複数のキャビティー形成面を有する光ファイバーの第１のバンドルから形成されたアレイであって、各キャビティー形成面は検体を含有するように適合された反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔、２０〜７０μｍの幅を有し、アレイが１０，０００超の個別の反応チャンバーを含むもの；（ｂ）反応チャンバー内に光を発生させるための酵素的または蛍光的な手段；（ｃ）光捕捉手段および光検出手段に光を伝達するための第２の光ファイバーバンドルを含む光検出手段であって、第２の光ファイバーバンドルは、個々の反応チャンバーにおいて発生した光が光捕捉手段への伝達のための第２の光ファイバーバンドルの別個のファイバーまたは別個のファイバー群により捕捉されるように、アレイと光学的に接触しているもの、を含む分析センサーに関する。
本発明の別の実施形態は、水性環境において別個の平行した共通の反応を実施するための方法に関する。第１の工程は、アレイに少なくとも１つの試薬を含有する流体を送達する工程を包含し、ここで、アレイは少なくとも１０，０００の個別の反応チャンバーを含む基板を含み、各反応チャンバーは検体を含有するように適合されており、ここで反応チャンバーは１０〜１５０ｐＬの容量を有し、試薬と反応することができる出発物質を含有し、反応チャンバーの各々は各反応チャンバーに流体が送達される場合、試薬のウェル外部に拡散する拡散時間が、出発物質が試薬と反応して生成物を形成するために必要な時間を超過するような寸法を有するものである。第２の工程は、（ｉ）出発物質が試薬と反応して各反応チャンバー内に生成物を形成した後であるか、または（ｉｉ）反応チャンバーの何れか１つに送達された試薬がその反応チャンバーから何れかの他の反応チャンバー内に拡散するよりも前の時間において、流体をアレイから洗浄する工程を含む。
本発明の別の実施形態は、アレイに核酸配列決定酵素を送達するための方法に関する。アレイはその上に複数のキャビティーを有する平坦な表面を有し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有する。該方法は、複数の反応チャンバーが少なくとも１つの可動性固体支持体を含有するように、その上に固定化された１つ以上の核酸配列決定酵素を有する複数の可動性固体支持体をアレイ上に分散させる工程を含む。
本発明の別の実施形態は、複数のアレイに核酸鋳型を送達するための方法に関する。アレイはその上に複数のキャビティーを有する平坦な表面を有してよく、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、アレイは少なくとも１０，０００の反応チャンバーを有する。該方法は、可動性固体支持体複数をアレイ上に分散させる工程を含み、各可動性固体支持体は、その上に固定化された２種以上の核酸鋳型を有さず、分散によって、１つを超えない可動性固体支持体を何れかの１反応チャンバー内に配設させる
本発明の別の実施形態は、核酸を配列決定するための方法に関する。該方法は、平坦な表面上の複数のキャビティ内に配設された複数の１本鎖核酸鋳型を提供する工程を含み、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、平坦な表面は少なくとも１００００の反応チャンバーを有するものである。次の工程は、核酸鋳型に有効量の配列決定プライマーをアニーリングさせ、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長させて配列決定生成物、および所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合に配列決定反応副生成物を得ることにより、全ての反応チャンバー上で同時にピロホスフェートに基づく配列決定反応を実施する工程を包含する。第３の工程は、（ｃ）配列決定反応副生成物を同定することにより、各反応チャンバー内の核酸の配列を決定する工程を包含する。
本発明の別の実施形態は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法に関する。第１の工程は、平坦な表面上の複数のキャビティー内に各々別個に配設された少なくとも１０，０００個のＤＮＡ鋳型を提供する工程を包含し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔および１０〜１５０ｐＬの容量を有するものである。第２の工程は、各反応チャンバー内の反応混合物に１つの既知の窒素性塩基の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体を添加する工程を包含し、各反応混合物は、鋳型指向性のヌクレオチドポリメラーゼおよび鋳型より少なくとも１ヌクレオチド残基の短い相補オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズした１本鎖ポリヌクレオチド鋳型を含むことにより、プライマー鎖の３’末端上への活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下、プライマー鎖の３’末端において各鋳型内に少なくとも１つの対形成していないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の窒素性塩基は鋳型の対形成していないヌクレオチド残基の窒素性塩基と相補的なものである。第３の工程は、ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体がプライマー鎖内に取り込まれたか否かを検出する工程を包含し、ここでヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の取り込みは、鋳型の対形成していないヌクレオチド残基が取り込まれたヌクレオシド５’−三リン酸前駆体のものに相補的である窒素性塩基組成を有することを示すものである。第４の工程は、工程（ｂ）および（ｃ）を逐次的に反復する工程を包含し、ここで各逐次的反復は、既知の窒素性塩基組成の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の１つの型の取り込みを付加し、検出するものである。第５の工程は、一連のヌクレオシド前駆体の取り込みから各反応チャンバーの鋳型の対形成していないヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程を包含する。
本発明の別の実施形態は、鋳型ＤＮＡのＤＮＡ配列における標的位置の塩基を同定する方法に関する。第１の工程では、少なくとも１０，０００の別個のＤＮＡ鋳型が平坦な表面上の複数のキャビティー内に別個に配設され、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、ＤＮＡは反応チャンバー内に配設される前または後の何れかに１本鎖とされる。第２の工程では、標的位置に最隣接する位置において固定化された１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーが設けられる。固定化された１本鎖ＤＮＡは、所定のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下にポリメラーゼ反応に供され、ここで所定のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合、配列決定反応副生成物が形成される。第４の工程では、配列決定反応副生成物を同定することにより、１０，０００ＤＮＡ鋳型の各々における標的位置の塩基に相補的なヌクレオチドを決定する。
本発明の別の実施形態は、核酸配列を分析するための装置に関する。装置は（ａ）試薬送達キュベット、ここでキュベットはその上に複数のキャビティーを有する平坦な表面を含むアレイを包含し、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成しており、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔を有し、１０，０００超の反応チャンバーが存在し、ここで試薬送達キュベットは配列決定反応において使用するための試薬を含有するものであること；（ｂ）試薬送達キュベットに接続した試薬送達手段；（ｃ）試薬送達チャンバーに接続した画像化システム；および（ｄ）画像化システムに接続したデータ収集システムを含む。
本発明の別の実施形態は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための装置に関する。該装置は、（ａ）平坦な表面上の複数のキャビティーを含有する試薬キュベットであって、各キャビティーは検体反応チャンバーを形成し、ここで各々が２０〜１００μｍの中心間間隔および１０〜１５０ｐＬの容量を有する１０，０００超の反応チャンバーが存在するもの；（ｂ）各反応チャンバー内における反応混合物への、１つの既知の窒素性塩基の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体を各反応チャンバーに同時に添加するための試薬送達手段であって、各反応混合物は鋳型指向性のヌクレオチドポリメラーゼおよび鋳型より少なくとも１ヌクレオチド残基短い相補オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズした１本鎖ポリヌクレオチド鋳型を含むことにより、プライマー鎖の３’末端上への活性化オリゴヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下、プライマー鎖の３’末端において各鋳型内に少なくとも１つの対形成していないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、活性化オリゴヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の窒素性塩基は鋳型の対形成していないヌクレオチド残基の窒素性塩基と相補的なもの；（ｃ）ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体がプライマー鎖内に取り込まれたか否かを各反応チャンバーにおいて検出するための手段であって、ここでヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の取り込みは、鋳型の対形成していないヌクレオチド残基が取り込まれたヌクレオシド５’−三リン酸前駆体のものに相補的である窒素性塩基組成を有することを示すもの；（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を逐次的に反復するための手段、ここで各逐次的反復は、既知窒素性塩基組成の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の１つの型の取り込みを付加し、検出するもの；および（ｅ）一連のヌクレオシド前駆体の取り込みから各反応チャンバーにおいて同時に鋳型の対形成していないヌクレオチド残基の塩基配列を決定するためのデータ処理手段、を含む。
本発明の別の実施形態は、複数の検体を処理する為の装置に関する。装置は（ａ）光ファイバーバンドル上に少なくとも５０，０００のキャビティー形成面を含む基板をそれ自体に配設したフローチャンバー、各キャビティー形成面は検体を含有するように適合された反応チャンバーを形成し、ここで反応チャンバーは２０〜１００μｍの中心間間隔および２０〜７０μｍの直径を有するもの；（ｂ）反応チャンバーに配設された検体が試薬に曝露されるように、フローチャンバーに１つ以上のレザバーから処理試薬を送達する為の流体手段；および（ｃ）反応チャンバーの各々の由来の一連の光学シグナルを同時に検出するための検出手段であって、連続的な各光学シグナルは、処理試薬と反応チャンバー内に配設された検体の間の相互作用を示すものであり、ここで検出手段はキャビティー形成面と接続されているものを含む。
本発明の別の実施形態は、核酸を配列決定するための方法に関する。第１の工程は、少なくとも５０，０００の個別の反応部位を有するアレイ中の複数の１本鎖核酸鋳型を提供する工程を包含する。第２の工程は、発光にカップリングされたピロホスフェートに基づく配列決定を実施するために必要な試薬に核酸鋳型を接触させる工程を包含する。第３の工程は、感光性装置の該当部分上の複数の反応部位から放出された光を検出する工程を包含する。第４の工程は、感光性装置の部分の各々に投射された光を、他の反応部位の全てに由来するシグナルと区別される電気シグナルに変換する工程を包含する。第５の工程は、対応する電気シグナルに由来する個別の反応部位の各々に関する発光に基づいて核酸鋳型の配列を決定する工程、を包含する。
本発明の別の実施形態は、核酸を配列決定するための方法に関する。第１の工程は、大型鋳型核酸分子をフラグメント化することにより、複数のフラグメント化核酸を発生させる工程を包含する。第２の工程は、複数のフラグメント化核酸の１鎖を個々にビーズに結合することにより、ビーズに個々に結合した１本鎖核酸を発生させる工程を包含する。第３の工程は、ビーズに個々に結合した１本鎖フラグメント化核酸の集団を平坦な表面上の少なくとも１０，０００の反応チャンバーのアレイに送達する工程を包含し、ここで複数のウェルは１つの１本鎖フラグメント化核酸を有する１つを超えないビーズを含む。第４の工程は、複数の反応チャンバーに対して同時に配列決定反応を実施する工程を包含する。配列決定反応は、（ａ）１本鎖フラグメント化核酸鋳型に有効量の配列決定プライマーをアニーリングさせ、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長させて配列決定生成物、および所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合、配列決定反応副生成物を得る工程；および（ｂ）配列決定反応副生成物を同定することにより、複数の反応チャンバー内の核酸の配列を決定する工程、を有してよい。或いは、配列決定は、（ａ）核酸分子の１つまたは複数の１本鎖に２つ以上の配列決定プライマーをハイブリダイズする工程、ここで１つを除く全てのプライマーは可逆的にブロックされたプライマーであること；（ｂ）ブロックされていないプライマーからのポリメラーゼ伸長により、核酸分子上に少なくとも１つ塩基を取り込む工程；（ｃ）ブロックされていないプライマーのさらなる伸長を防止する工程；（ｄ）可逆的にブロックされたプライマーの１つを脱ブロックしてブロックされていないプライマーとする工程；および（ｅ）可逆的にブロックされたプライマーの少なくとも１つが脱ブロックされて配列の決定の為に使用されるまで工程（ｂ）〜（ｄ）を反復する工程、を含んでよい。
他の物質および方法は、以下の同時係属中の米国特許出願、即ち２００３年１月２９日出願の米国特許出願６０／４４３，４７１，２００３年４月２３日出願の米国特許出願６０／４６５，０７１、２００４年１月２８日出願の米国特許出願１０／７６７，８９４、２００４年１月２８日出願の米国特許出願１０／７６７，８９９および２００４年１月２８日出願の米国特許出願１０／７６８，７２９に記載されている。本開示において引用した全ての特許、特許出願および参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
（実施例１：サンプル調製）
（ＤＮＡサンプル：）
ＤＮＡは、クオリティが高くあるべきであり、夾雑物（例えば、タンパク質、ヌクレアーゼ、脂質および他の化学物質（例えば、調製物由来の残留ＥＤＴＡ）および塩）を含むべきではない。ゲノムＤＮＡは、１．８以上の２６０／２８０比を有すべきことが好ましい。１つの生物体のみのゲノムの配列決定を所望する場合、そのＤＮＡは、混入ＤＮＡが存在していないと確認されたクオリティであるべきである。例えば：ヒトＤＮＡの調製は、細菌のＤＮＡ分子によって汚染されていないと確認するためにＰＣＲによって調査され得る。混入を調査する別の方法は、制限酵素消化のパターンによる方法ならびに特に、制限酵素消化後の生物体（例えば、ヒトまたはマウス）に特異的であると知られている適当なプローブおよび混入している可能性のある生物体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的であると知られている第２のプローブを用いたサザンブロットによる方法である。所望であれば、ＤＮＡは、その生物体の単一クローン（例えば、細菌由来であれば、コロニー）に由来するべきである。
（工程１：ＤＮａｓｅＩ消化）
ＤＮａｓｅＩ消化工程の目的は、大きな一続きのＤＮＡ（例えば、全ゲノムまたはゲノムの大きな部分）を小さく断片化することである。単一のＤＮＡ鋳型から生成されたこの小さい断片にされたＤＮＡ種の集団を「ライブラリ」という。デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）は、二本鎖鋳型ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。ＤＮａｓｅＩの切断の特徴は、鋳型ＤＮＡをランダムに消化することが可能であり（すなわち、最小の配列に偏る）、マンガンベースの緩衝液の存在下で使用するとき、平滑末端の二本鎖ＤＮＡフラグメントがほとんどを占めるようになる（ＭｅｌｇａｒおよびＧｏｌｄｔｈｗａｉｔ １９６８）。ＤＮａｓｅＩによるゲノム鋳型の消化は、３つの因子：ｉ）使用する酵素の量（単位）；ｉｉ）消化温度（℃）；およびｉｉｉ）インキュベーション時間（分）に左右される。以下に概説するＤＮａｓｅＩ消化の条件を、５０〜７００塩基対（ｂｐ）のサイズ範囲のＤＮＡライブラリを得るために最適化した。
１．ＤＮＡを得て、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ，ｐＨ７−８）中、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。この調製には、合計１３４μｌのＤＮＡ（１５μｇ）が必要であった。ＥＤＴＡ含有緩衝液（すなわち、ＴＥ，Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）で希釈したＤＮＡ調製物を使用することは推奨しない。ＥＤＴＡが存在すると、ＤＮａｓｅＩによる酵素消化が阻害される。ＤＮＡ調製物がＥＤＴＡを含む場合、ＤＮＡを溶液から「塩析」して、適切なＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７〜８）またはナノピュア（ｎａｎｏｐｕｒｅ）Ｈ２Ｏ（ｐＨ７〜８）で再構成することが重要である。
２．０．２ｍｌチューブ中で、５０μｌのＴｒｉｓ ｐＨ７．５（１Ｍ）、１０μｌのＭｎＣｌ２（１Ｍ）、１μｌのＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍｌ）および３９μｌの水を含むＤＮａｓｅＩ緩衝液を調製した。
３．別の０．２ｍｌチューブに、１５μｌのＤＮａｓｅＩ緩衝液および１．５μｌのＤＮａｓｅＩ（１Ｕ／ｍｌ）を加えた。反応チューブを、１５℃に設定されたサーマルサイクラーにおいた。
４．１３４μｌのＤＮＡ（０．３ｍｇ／ｍｌ）を、１５℃に設定されたサーマルサイクラーにおいたＤＮａｓｅＩ反応チューブに加えた。蓋を閉め、サンプルを正確に１分間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡを加えて、酵素消化を停止した。
５．消化されたＤＮＡを、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。次いで、消化反応物を４つのアリコートに分け、４本のスピンカラムを使用して、各アリコートを精製した（スピンカラム１本あたり３７．５μｌ）。製造者のプロトコールに従って、各カラムを３０μｌの溶出緩衝液（ＥＢ）で溶出した。次いで、溶出物を併せて、１２０μｌの最終反応体積を得た。
６．消化反応物の３μｌのアリコート１つを、ＢｉｏＡｎａｌｚｙｅｒ ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いた解析用に保存した。
（工程２：Ｐｆｕポリッシング（Ｐｆｕ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ））
ＤＮａｓｅＩによるＤＮＡ鋳型の消化によって、主に平滑末端であるＤＮＡのフラグメントが得られるが、しかしながら、いくつかのフラグメントは、１または２ヌクレオチド長突出した末端を有し得る。Ｐｆｕポリッシングは、５’突出末端を埋めること（すなわち、「平滑末端化」）によって平滑末端種の量を増加させるために使用する。さらに、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、１つおよび２つのヌクレオチドが延びている部分を除去し得る３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。Ｐｆｕポリッシングにより、アダプターライゲーションに利用可能な平滑末端化されたＤＮＡフラグメントの量が増加する（Ｃｏｓｔａ １９９４ａ，１９９４ｂ，１９９４ｃ）。以下のＰｆｕポリッシングプロトコールを使用した。
１．０．２ｍｌチューブにおいて、１１５μｌの精製ＤＮａｓｅＩ消化ＤＮＡフラグメント、１５μｌの１０×クローン化Ｐｆｕ緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）および１５μｌのクローン化Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）を順番に加えた。
２．ポリッシング反応成分を十分に混合し、７２℃で３０分間インキュベートした。
３．インキュベーション後、反応チューブを取り出し、２分間氷上に置いた。
４．次いで、ポリッシング反応混合物を４つのアリコートに分け、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラム（各カラム３７．５μＬ）を用いて精製した。製造者のプロトコールに従って、各カラムを３０μｌの緩衝液ＥＢで溶出した。次いで、溶出物を併せて、１２０μＬの最終反応体積を得た。
５．最終ポリッシング反応物の３μｌのアリコート１つをＢｉｏＡｎａｌｚｙｅｒ ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いた解析用に保存した。
（工程３：断片化ＤＮＡライブラリへのユニバーサルアダプターのライゲーション）
断片化およびゲノムＤＮＡライブラリのポリッシングの後、各ＤＮＡフラグメントの末端にプライマー配列を付加した。これらのプライマー配列は、「ユニバーサルアダプター」と呼ばれ、ＰＣＲ増幅とヌクレオチド配列決定の両方をもたらす特異的なプライミング領域を含む二本鎖オリゴヌクレオチドから構成される。ユニバーサルアダプターは、１組の２０塩基対長の固有の配列決定プライミング領域に隣接して位置する１組の２０塩基対長の固有のＰＣＲプライミング領域の後に、各デオキシリボヌクレオチドの１つ（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）からなる固有の４塩基の「キー」を含むように設計する。固有の各ユニバーサルアダプター（「ユニバーサルアダプターＡ」および「ユニバーサルアダプターＢ」と呼ばれる）は、４４塩基対（４４ｂｐ）長である。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、ＤＮＡフラグメントの各末端にユニバーサルアダプターを連結することにより、各ＤＮＡフラグメントに合計８８ｂｐのヌクレオチドが付加された。様々なユニバーサルアダプターを各ゲノムＤＮＡライブラリ調製物に対して特異的に設計し、それにより、各生物体について独自の識別子が提供されることになる。
ユニバーサルアダプター対を調製するために、一本鎖オリゴヌクレオチドを研究室内（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）で設計し、販売業者を通じて製造する。ユニバーサルアダプターＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ活性から保護するように働く２つのホスホロチオエート結合を各オリゴヌクレオチド末端に含むように設計される（Ｓａｍｉｎｉ，Ｔ．Ｄ．，Ｂ．Ｊｏｌｌｅｓ，およびＡ．Ｌａｉｇｌｅ．２００１．Ｂｅｓｔ ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１１（３）：１２９．この開示は、全体として本明細書中で参考として援用される）。各オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ精製することにより、最終調製物中に夾雑物または偽ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列が存在しないことが保証される。
ユニバーサルアダプターは、平滑末端化された断片化ゲノムＤＮＡに対して定方向ライゲーションが可能になるように設計される。各ユニバーサルアダプター対について、ＰＣＲプライミング領域は、５’４塩基突出末端および平滑末端化３’キー領域を含む。ユニバーサルアダプターの平滑末端側は、平滑末端化ＤＮＡフラグメントに連結するが、アダプターの５’突出末端は、平滑末端化ＤＮＡフラグメントに連結できないので定方向性が達成される。さらに、ユニバーサルアダプターＢに５’ビオチンを付加することにより、その後のｓｓＤＮＡ鋳型の単離（工程８）が可能になる。各ユニバーサルアダプターは、２本の一本鎖相補ＤＮＡオリゴヌクレオチド（すなわち、一方のオリゴがセンス配列を含み、第２のオリゴがアンチセンス配列を含んでいる）を単一チューブ内でアニーリングすることにより調製される。以下のライゲーションプロトコールを使用した。
１．０．２ｍｌチューブにおいて、３９μｌのｎＨ２Ｏ（分子生物学グレードの水）、２５μｌの消化ポリッシュ済みＤＮＡライブラリ、１００μｌの２×Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ反応緩衝液、２０μｌのＭＭＰ１（１０ｐｍ／μｌ）アダプターセット、１００：１比および１６μｌのＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅを順番に加えた。ライゲーション反応物を十分に混合し、室温で２０分間インキュベートした。
２．次いで、ライゲーション反応物を取り出し、ライゲーション反応物の１０μｌアリコートをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで使用するために精製した。Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎ−Ｅｌｕｔｅキットの単一のスピンカラムを使用した。製造者のプロトコールの手順に従って、そのカラムを１０μｌのＥＢで溶出した。ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いて、精製ライゲーション反応物の１μｌアリコートを充填した。未精製ライゲーション反応物が、多量の塩およびＰＥＧ（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒの正しい作動を妨げ得る）を含むときに、この精製工程を推奨する。
３．ライゲーション反応物の残り（１９０μＬ）は、工程４でのゲル単離に使用した。
（工程３ａ：Ｍｉｃｒｏｃｏｎ濾過およびアダプター構築。調製総時間は、約２５分であった。）
ユニバーサルアダプターライゲーション反応には、１００倍過剰量のアダプターを必要とする。これらの過剰量のアダプターの除去を助けるために、二本鎖ｇＤＮＡライブラリをＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００フィルターデバイスに通して濾過する。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００膜を使用することにより、１２５ｂｐより小さい二本鎖ＤＮＡを除去することができる。ゆえに、未結合アダプター（４４ｂｐ）ならびにアダプターダイマー（８８ｂｐ）を、連結ｇＤＮＡライブラリ集団から除去することができる。以下の濾過プロトコールを使用した：
１．工程４からの１９０μＬのライゲーション反応物を、組み立てたＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００デバイスにアプライした。
２．そのデバイスを遠心分離機に入れ、約６分間または膜がほとんど乾くまで５０００×ｇで遠心した。
３．洗浄するために、２００μｌの１×ＴＥを加えた。
４．サンプルを、さらに９分間または膜がほとんど乾くまで５０００×ｇで遠心した。
５．回収するために、容器を新しいバイアルに挿入し、３０００×ｇで３分間遠心した。その容器を廃棄した。回収された容積は、約１０μｌであった。次に、８０μｌのＴＥを加えた。
アダプター（ＡおよびＢ）をＨＰＬＣ精製し、使用する前にホスホロチオエート結合で修飾した。アダプター「Ａ」（１０μＭ）について、１０μｌの１００μＭアダプターＡ（４４ｂｐ，センス）を１０μｌの１００μＭアダプターＡ（４０ｂｐ，アンチセンス）と混合し、３０μｌの１×アニーリング緩衝液（Ｖｆ＝５０μｌ）を混合した。Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ＬａｂサーマルサイクラーのＡＮＮＥＡＬプログラムを用いて、プライマーをアニーリングさせた（以下を参照のこと）。アダプター「Ｂ」（１０μＭ）について、１０μｌの１００μＭアダプターＢ（４０ｂｐ，センス）を１０μｌの１００μＭアダプターＢ（４４ｂｐ，アンチセンス）と混合し、３０μｌの１×アニーリング緩衝液（Ｖｆ＝５０μｌ）を混合した。Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ＬａｂサーマルサイクラーのＡＮＮＥＡＬプログラムを用いて、プライマーをアニーリングさせた。アダプターセットは、使用するまで−２０℃で保存することができた。
プライマーアニーリング用のＡＮＮＥＡＬ−Ａプログラム：
１．９５℃で１分間インキュベーション；
２．０．１℃／秒で温度を１５℃に低下；および
３．１５℃で保持。
ゲノムＤＮＡ挿入フラグメントおよびアダプターに方向性は必要とされなかった。フラグメントは、いずれの末端においても連結できた。４種類の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ユニバーサルアダプターセットに含まれた。各一本鎖オリゴヌクレオチドを１マイクロモルスケールで合成し、ＨＰＬＣ精製した。各一本鎖オリゴヌクレオチドは、各末端において４つのホスホロチオエート結合を含んだ。
（工程４：ゲル電気泳動およびアダプター付加ＤＮＡライブラリの抽出）
ユニバーサルアダプターライゲーションプロトコールにより、以下：１）いずれかの末端にアダプターを有する断片化ＤＮＡ；２）未結合単一アダプター；または３）アダプターダイマーの形成がもたらされる。アガロースゲル電気泳動は、未連結の単一アダプターおよびアダプターダイマー集団からアダプター付加されたＤＮＡライブラリ集団を分離および単離する方法として使用される。ゲノムＤＮＡのＤＮａｓｅＩ消化の手順により、５０〜７００ｂｐの範囲のライブラリ集団が得られる（工程１）。８８−ｂｐユニバーサルアダプターセットが付加されていると、より大きな集団にシフトし、約１３０−８００ｂｐのサイズ範囲の移動プロファイルを生じることになる。アダプターダイマーは、８８ｂｐに移動し、未連結のアダプターは、４４ｂｐに移動する。ゆえに、２００ｂｐ超のサイズ範囲に入るゲノムＤＮＡライブラリは、アガロースゲルから物理的に単離され、標準的なゲル抽出技術を用いて精製され得る。アダプター付加ＤＮＡライブラリのゲル単離により、２００ｂｐ以上のサイズ範囲のライブラリ集団が回収される（ライブラリのサイズ範囲は、用途に応じて変動し得る）。以下の電気泳動および抽出プロトコールを使用した。
１．２％アガロースゲルを調製した。
２．１０μｌの１０×Ｒｅａｄｙ−Ｌｏａｄ Ｄｙｅを、残りの９０μｌのＤＮＡライゲーション混合物に加えた。
３．色素／ライゲーション反応混合物を、ゲル（隣接する４レーンを使用）にロードした（１レーンあたり２５μｌ）。
４．１０μｌの１００ｂｐラダー（０．１μｇ／μｌ）をライゲーション反応物のレーンから２レーン離してロードした。
５．１００Ｖで３時間、ゲル電気泳動を行った。
６．ゲル電気泳動が完了したら、ゲルを、ゲルボックスから取り出し、プラスチックラップを敷いた平面に移した。携帯式長波ＵＶ光機を使用して、ＤＮＡのバンドを可視化した。滅菌された使い捨てメスを用いて、２００〜４００ｂｐのフラグメントをアガロースゲルから切り出した。このアプローチを用いて、任意のサイズ範囲を有するライブラリを単離することができる。２つ以上のサイズ範囲を単離することも可能である。ライブラリサイズ範囲が２００〜９００ｂｐである場合、単一ウェルからいくつかのサイズ範囲（すなわち、２００〜４００ｂｐおよび５００〜７００ｂｐ）を単離することが可能である。
７．アガロースゲルに包埋されているＤＮＡを、製造者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて単離した。簡潔には、緩衝液ＱＧを、チューブ内のアガロースを覆うくらい加えた。そのアガロースを完全に溶解させた。サンプル損失を最小限にするためにＱｉａｇｅｎの指示書に従い、ｐＨを調節することによって緩衝液ＱＧの色を維持した。２本のＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を精製に使用した。溶解アガロースの容量が多い場合は、各カラムへのロードが数回必要であった。そのカラムを、予め５５℃に温めておいた１０μｌの緩衝液ＥＢで溶出した。溶出物を貯めることにより、２０μｌのｇＤＮＡライブラリが得られた。
８．各単離ＤＮＡライブラリの１μＬアリコート１つを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いて解析することにより、ＤＮＡライブラリ集団の正確な分布を評価した。
（工程５：ニック入り二本鎖ＤＮＡライブラリの鎖置換および鎖伸長）
ユニバーサルアダプターについて使用したＤＮＡオリゴヌクレオチドは、リン酸化されていないので、断片化ｇＤＮＡの３’接合点にギャップが存在する。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、これらの２つの「ギャップ」または「ニック」を埋めることができる。このポリメラーゼは、ニックを認識し、ニック入りの鎖を置換し、ニックの修復およびニックの入っていない二本鎖ＤＮＡの形成をもたらす様式で鎖を伸長する。使用した鎖置換酵素は、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントである。
１．０．２ｍｌチューブにおいて、１９μｌのゲル抽出ＤＮＡライブラリ、４０μｌのｎＨ２Ｏ、８μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液、８μｌのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、２μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）および３μｌのＢｓｔＩポリメラーゼ（８Ｕ／μｌ）を順番に加えた。
２．そのサンプルを十分に混合し、サーマルサイクラーに置き、鎖置換インキュベーションプログラム：「ＢＳＴ」を用いてインキュベートした。ニック入り二本鎖ＤＮＡの鎖置換および鎖伸長のためのＢＳＴプログラム：
１．６５℃で３０分間インキュベーション；
２．８０℃で１０分間インキュベーション；
３．５８℃で１０分間インキュベーション；および
４．１４℃で保持。
３．Ｂｓｔ処理ＤＮＡライブラリの１μＬアリコート１つをＢｉｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いて電気泳動した。
（工程６：ストレプトアビジンビーズの調製）
ニックの入っていない二本鎖ゲノムＤＮＡを生成した後、隣接するユニバーサルアダプター配列を含む一本鎖ゲノムＤＮＡを単離する必要がある。この工程は、ストレプトアビジンビーズへのビオチンタグ化二本鎖ＤＮＡの結合によって概説される。ストレプトアビジンビーズを調製するために、以下のプロトコールを使用した。
１．１００μｌのＤｙｎａｌ Ｍ−２７０ストレプトアビジンビーズを、ＭＰＣに磁気ビーズを当てることによって、２００μｌの１×結合緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５）で２回洗浄した。
２．そのビーズを１００μｌの２×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液に再懸濁し、次いで、残りの７９μｌのＢｓｔ処理ＤＮＡサンプル（工程５からのサンプル）および２０μｌの水を加えた。
３．そのビーズ溶液を十分に混合し、室温で２０分間チューブ回転装置にかけた。そのビーズ混合物を、ＭＰＣを使用して１００μｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液で２回洗浄し、次いで、ｎＨ２Ｏで２回洗浄した。Ｂｉｎｄｉｎｇ ＆ Ｗａｓｈｉｎｇ（Ｂ＆Ｗ）緩衝液（２×および１×）：２×Ｂ＆Ｗ緩衝液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２Ｍ ＮａＣｌを混合することによって調製した。この試薬を上で列挙したようにあわせ、完全に混合した。この溶液は、室温で６ヶ月間保存することができる；１×Ｂ＆Ｗ緩衝液は、２×Ｂ＆Ｗ緩衝液とｎＨ２Ｏとを１：１で混合することよって調製した。最終濃度は、上記の半分、すなわち、５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１Ｍ ＮａＣｌであった。
（工程７：ストレプトアビジンビーズを用いた一本鎖ＤＮＡライブラリの単離）
ストレプトアビジンビーズへの二本鎖ｇＤＮＡライブラリの結合の後、連結プールからユニバーサルアダプターＡおよびユニバーサルアダプターＢを含む一本鎖ｇＤＮＡのみを単離することが好ましい（所望の集団は、以下において星印で明示する）。二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントプールは、以下の可能性のある配置で結合したアダプターを有し得る：
ユニバーサルアダプターＡ−ｇＤＮＡフラグメント−ユニバーサルアダプターＡ
ユニバーサルアダプターＢ−ｇＤＮＡフラグメント−ユニバーサルアダプターＡ＊
ユニバーサルアダプターＡ−ｇＤＮＡフラグメント−ユニバーサルアダプターＢ＊
ユニバーサルアダプターＢ−ｇＤＮＡフラグメント−ユニバーサルアダプターＢ
ユニバーサルアダプターＢだけが、５’ビオチン部分を有するので、磁気ストレプトアビジン含有ビーズを使用することにより、ユニバーサルアダプターＢを有するすべてのｇＤＮＡライブラリ種を結合することができる。２つのユニバーサルアダプターＡ種（または連結していない種）を含むゲノムライブラリ集団は、ストレプトアビジン含有ビーズに結合せず、洗浄手順の間に除去される。洗浄後にビーズに結合したままの種としては、ユニバーサルアダプターＡおよびＢを有する種またはユニバーサルアダプターＢ末端を２つ有する種が挙げられる。
２つのビオチン分子を有する２つのユニバーサルアダプターＢ配列を含むゲノムＤＮＡ種は、両端でストレプトアビジン含有ビーズに結合することができる。単一のビオチン分子のみを有する、ＡおよびＢアダプターを有する種は、「Ｂ」末端でのみビーズに結合することができる。一本鎖集団を単離するために、このビーズ結合二本鎖ＤＮＡを、相補ＤＮＡ鎖間の水素結合を妨害するように働く水酸化ナトリウム溶液で処理する。ＤＮＡフラグメントが両端（ユニバーサルアダプターＢ末端）にビオチンを有する場合、得られる両一本鎖がビーズに結合したままである。フラグメントが、単一のビオチン（ユニバーサルアダプターＡおよびＢ）のみを有する場合、相補鎖は、ＤＮＡ−ビーズ複合体から分離する。
得られた一本鎖ゲノムＤＮＡライブラリを液相から回収して、例えば、ピロリン酸配列決定法（パイロシーケンス）またはＲＮＡ Ｐｉｃｏ ６０００ ＬａｂＣｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いることによって、定量化する。単位体積あたりの分子数を計算することによって、一本鎖ゲノムＤＮＡライブラリを定量化する。次いで、ＤＮＡ捕捉プライマー（ＰＣＲプライマーＢ）を含む２５−３０μｍセファロースビーズに一本鎖ｇＤＮＡ分子をアニーリングする（１ビーズあたり１有効コピーを得るために１ビーズあたり半コピーで）。次いで、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応プロトコールを用いて、鋳型を増幅した。その後の配列決定は、公知の手法を用いて行い得る。一本鎖ライブラリの単離のために、以下のプロトコールを使用した。
１．２５０μｌの融解溶液（０．１２５Ｍ ＮａＯＨ，０．１Ｍ ＮａＣｌ）を加えて、上記工程６からのビーズを洗浄した。
２．そのビーズ溶液を十分に混合し、ビーズ混合物を室温で１０分間チューブ回転装置上でインキュベートした。
３．Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（磁気粒子濃縮機）を使用し、ペレットのビーズを慎重に除去し、上清を回収した。２５０−μｌの上清に一本鎖ＤＮＡライブラリが含まれていた。
４．別のチューブにおいて、１２５０μｌのＰＢ（ＱｉａＱｕｉｃｋ精製キットからのもの）を加え、その溶液を、９μｌの２０％酢酸を加えることによって中和した。
５．Ｄｙｎａｌ ＭＰＣを用いて、一本鎖ｇＤＮＡライブラリを含む２５０−μｌの上清からビーズを沈殿させ、上清を慎重に取り出し、新しく調製したＰＢ／酢酸溶液に移した。
６．その１５００μｌ溶液を、単一のＱｉａＱｕｉｃｋ精製スピンカラムを用いて精製した（１ロードあたり７５０μｌで２回同じカラムに通してサンプルをロードした）。一本鎖ＤＮＡライブラリを５０μｌのＥＢで溶出した。
（工程８ａ：ピロリン酸配列決定法を用いた一本鎖ｇＤＮＡ定量。調製総時間は、約１時間であった。）
１．０．２ｍｌチューブにおいて、以下の試薬を順番に加えた：
２５μｌの一本鎖ｇＤＮＡ
１μｌのＭＭＰ２Ｂ配列決定プライマー
１４μｌのライブラリアニーリング緩衝液
合計４０μｌ
２．ＡＮＮＥＡＬ−Ｓプログラムを用いてＤＮＡのアニーリングを行った（下の付表を参照のこと）。
３．サンプルをＰＳＱ（ピロリン酸配列決定ジグ）で電気泳動することにより、各サンプル中の鋳型のピコモル数を測定した（下記を参照のこと）。配列決定の方法は、米国特許第６，２７４，３２０号；同第４，８６３，８４９号；同第６，２１０，８９１号；および同第６，２５８，５６８号に見られ、これらの開示は、全体として本明細書中で参考として援用される。１マイクロリットルあたりの一本鎖ｇＤＮＡ鋳型分子の数を決定するために計算を行った。調製した一本鎖ｇＤＮＡライブラリの残りの２５μＬを増幅およびその後の配列決定に使用した（約１×１０６反応物）。
（工程８ｂ：ＲＮＡ Ｐｉｃｏ ６０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いた一本鎖ｇＤＮＡ定量。調製総時間は、約３０分であった。）
１．ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ソフトウェアバージョン２．１２）において、ｍＲＮＡ Ｐｉｃｏアッセイオプションを選択した。
２．製造者のガイドラインに従って、ＲＮＡ Ｐｉｃｏ ６０００ ＬａｂＣｈｉｐをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにおいて調製した。
３．製造者（Ａｍｂｉｏｎ）の指示に従って、ＲＮＡ ＬａｂＣｈｉｐラダー（ＲＮＡ６０００ラダー）を調製した。簡潔には、溶液中のＲＮＡ ＬａｂＣｈｉｐラダーを２分間７０℃に加熱した。その溶液を５分間氷上で冷却することにより、ラダーを急冷した。その溶液を軽く遠心することにより、チューブ壁から任意の濃縮物を除去した。そのＲＮＡ ＬａｂＣｈｉｐ Ｌａｄｄｅｒを氷上で保存し、１日以内に使用した。
４．解析されるべきｓｓＤＮＡライブラリを、３つの１μｌアリコートを用いて隣接レーンに３つ組で電気泳動した。
５．ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを使用して、各ｓｓＤＮＡライブラリレーンの濃度を計算した（下記の表３および図２４を参照のこと）。３つすべてのレーンの平均を使用し、以下に概説する手順を用いて、ライブラリのＤＮＡ濃度を計算した。
ａ．ピーク積分値の下限ライン（図２４中の大破線）をライブラリピークの前に移動した（以下を参照のこと）。
ｂ．ピーク積分値の上限ライン（図２４中の大破線）をライブラリピークのすぐ後に移動した。このように、低いほうの積分値と高いほうの積分値ラインとを結んだピーク積分値のラインは、バックグラウンドの傾きに従った。
ｃ．マウス矢印を用いて、ピークの平均サイズ（通常、ピークの最高点付近）を決定するか、またはソフトウェアによって選択される規定のピークを使用した。
ｄ．積分値をピークにおける物質の量として使用した。回収されたピコグラムとして得られた値を回収された分子に変換した（下記の表３を参照のこと）。次いで、ライブラリ濃度を決定した（１マイクロリットルあたりの分子）。
Figure 2009502202
 上記表３に示すように、ライブラリ１の濃度は、１６３９ｐｇ／μｌ（欄５）と計算され、平均フラグメントサイズは、４３４ヌクレオチドであった（欄９）。これらの値は、上の工程（ａ）−（ｄ）に記載したようにＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ソフトウェアから得られた。リボヌクレオチドの平均分子量（ＭＷ）は、３２８．２ｇ／ｍｏｌであった（欄１０）。平均フラグメント長（４３４）を平均リボヌクレオチド（３２８．２）と掛けることによって、平均ライブラリフラグメントのＭＷ（１．４２×１０５ｇ／ｍｏｌ、欄１１）を算出した。定量したライブラリ（１６３９ｐｇ／μｌ）をグラム／マイクロリットルに変換した（１．６４×１０−９ｇ／μｌ、欄１２）。グラム／マイクロリットル（１．６４×１０−９ｇ／μｌ、欄１２）をライブラリフラグメントの平均分子量（１．４２×１０５、欄１１）で割ることによって、ｍｏｌ／マイクロリットルの数値（１．１５×１０−１４ｍｏｌ／μｌ、欄１４）を算出した。最終的に、ｍｏｌ／マイクロリットルの値（１．１５×１０−１４ｍｏｌ／μｌ、欄１４）にアボガドロ数（６．０２×１０２３分子／ｍｏｌ）を掛けることによって、分子数／マイクロリットル（６．９３×１０９分子／μｌ、欄１５）を得た。
ライブラリの最終濃度は、１×１０８分子／μｌ超であると予想される。
ライブラリのクオリティについていっそう重要な因子は、アダプターダイマー濃度であった。図２４において、ライブラリピークの高さは、アダプターダイマーピーク（マーカーの後の最初のピーク）よりも約１０倍超高く測定された。良好なクオリティのライブラリは、ダイマーピークよりも少なくとも２倍高いピーク高さを有すると予想される。提供されたＲＮＡ Ｐｉｃｏ ６０００ ＬａｂＣｈｉｐは、一本鎖ｇＤＮＡ濃度の５００％精度内で見積もることに注意されたい。従って、鋳型を漸増させて最初の配列決定試行（ｒｕｎ）を行うことにより、投入ｇＤＮＡのビーズ１個あたりのコピー数（ｃｐｂ）を測定することが重要であった。推奨投入ＤＮＡは、２．５ｃｐｂ、１ｃｐｂ、０．５ｃｐｂおよび０．１ｃｐｂである。この漸増は、１４×４３ＰＴＰ上の４スロットのビーズ充填チャンバーを用いることにより容易に確認された。
（工程９：一本鎖ｇＤＮＡライブラリの希釈および保存）
一本鎖ｇＤＮＡライブラリを溶出し、緩衝液ＥＢ中で定量した。分解を防ぐために、一本鎖ｇＤＮＡライブラリをＥＤＴＡの存在下−２０℃で凍結保存した。定量後、等量の１０ｍＭ ＴＥをライブラリ原液に加えた。以下のすべての希釈をＴＥで行った。収量は以下のとおりであった：
ＰＳＱ解析後のｓｓＤＮＡライブラリの最終残余体積＝２５μｌ。
ＬａｂＣｈｉｐ解析後のｓｓＤＮＡライブラリの最終残余体積＝４７μｌ。
最初の保存用希釈のために、一本鎖ｇＤＮＡライブラリを、１×ライブラリグレード溶出緩衝液で１億分子／μｌに希釈した。一本鎖ｇＤＮＡライブラリのアリコートを通常使用のために調製した。このために、２００，０００分子／μｌを１×ライブラリグレード溶出緩衝液で希釈し、２０μｌアリコートを測定した。使い捨てライブラリアリコートを−２０℃に保存した。
（工程１０：エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応）
ｃｐｂを段階的に増大することが好ましい場合、ビーズエマルジョンＰＣＲを、２００３年６月６日出願の米国特許出願番号０６／４７６，５０４（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されているように行った。
（試薬調製）
停止溶液（５０ｍＭ ＥＤＴＡ）は、１．０ｍｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液が得られるように９００μｌのｎＨ２Ｏと混合した１００μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを含んでいた。１０ｍＭ ｄＮＴＰのために、（１０μｌのｄＣＴＰ（１００ｍＭ）、１０μｌのｄＡＴＰ（１００ｍＭ）、１０μｌのｄＧＴＰ（１００ｍＭ）および１０μｌのｄＴＴＰ（１００ｍＭ）を６０μｌの分子生物学グレードの水と混合した。４つすべての１００ｍＭヌクレオチド原液を氷上で解凍した。次いで、１０μｌの各ヌクレオチドを６０μｌのｎＨ２Ｏと併せることにより、最終体積１００μｌを得て、完全に混合した。次に、１ｍｌアリコートを１．５ｍｌ微量遠心チューブに分注した。原液は、−２０℃で１年間保存可能であった。
１０×アニーリング緩衝液は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）および５０ｍＭ酢酸マグネシウムを含んでいた。この溶液のために、２４．２３ｇのＴｒｉｓを８００ｍｌのｎＨ２Ｏに加え、その混合物をｐＨ７．５に調整した。この溶液に、１０．７２ｇの酢酸マグネシウムを加え、完全に溶解した。この溶液を最終体積１０００ｍｌにして、４℃で１ヶ月間保存可能であった。１０×ＴＥは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいた。これらの試薬を一緒に混合し、完全に混合した。この溶液は、室温で６ヶ月間保存可能であった。
（実施例２：プライマー設計）
上で述べたとおり、以下を含むようにユニバーサルアダプターを設計する：１）代表的には２０ｂｐ長の固有のＰＣＲプライミング領域のセット（２）に隣接）；２）代表的には２０ｂｐ長の固有の配列決定プライミング領域のセット；および３）必要に応じて、それらの後に、４つのデオキシリボヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の各々の少なくとも１つからなる固有の識別キー配列。プライマーと目的ゲノムの意図しない領域との間のクロスハイブリダイゼーションの可能性は、ゲノムサイズが大きくなるにつれ、また、プライマーとの完全マッチの長さが短くなるにつれて、高くなる。しかしながら、このクロスハイブリダイズ領域（ＣＨＲ）との潜在的な相互作用は、以下で説明する理由に対する問題をもたらすと考えられない。
本発明の好ましい実施形態において、一本鎖ＤＮＡライブラリは、ＰＣＲ増幅およびその後の配列決定に利用される。配列決定方法は、所与のゲノムを１５０〜５００塩基対フラグメントにランダム消化した後、そのフラグメントの５’および３’末端に、２種類の固有の２連プライマー（ＰＣＲ領域と配列決定領域の両方から構成される）を連結することが必要である（図２５）。開示されたプロセスは、融解温度（Ｔｍ）、ゲノム内に存在し且つ特定領域または目的遺伝子に近接しているプライマー配列の固有性に基づいてゲノムの既存部分をプライミング部位として選択する代表的なＰＣＲ増幅とは異なり、注意深いデノボプライマー設計を必要とする合成プライミング部位を利用する。
（四量体選択：）
デノボプライマー設計のストラテジーは、ハイブリダイゼーション実験（Ｈｅｎｓｅｌ，Ｍ．およびＤ．Ｗ．Ｈｏｌｄｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ｂｏｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｆｕｎｇｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６．１４２（Ｐｔ５）：ｐ．１０４９−５８；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｒ−ｃｏｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ．ａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９６．１４（４）：ｐ．４５０−６を参照のこと）およびＰＣＲ／ＬＤＲ（ポリメラーゼ連鎖反応／ライゲーション検出反応）ハイブリダイゼーションプライマー（Ｇｅｒｒｙ，Ｎ．Ｐ．ら、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９．２９２：ｐ．２５１−２６２；Ｗｉｔｏｗｓｋｉ，Ｎ．Ｅ．，ら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｍａｒｋｅｒｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００．２９（５）：ｐ．９３６−９４４．を参照のこと）について分子タグを用いて行われた研究に関する、公開された文献に見られる。
ＰＣＲ／ＬＤＲ研究は、特に関連性があり、オリゴヌクレオチド「ジップコード」、すなわち、類似の最終Ｔｍを有する特別に設計された６つの四量体から構成される２４塩基プライマーの設計に注目したものであった（Ｇｅｒｒｙ，Ｎ．Ｐ．ら、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９．２９２：ｐ．２５１−２６２；米国特許第６，５０６，５９４号を参照のこと）。四量体の構成要素は、以下の基準に基づいて選択された：各四量体は、他のものと少なくとも２塩基異なっていること、自己対合（ｓｅｌｆ−ｐａｉｒｉｎｇ）またはヘアピン形成を含む四量体は除外することおよびパリンドロームの四量体（ＡＧＣＴ）または反復性の四量体（ＴＡＴＡ）を除外すること。２５６（４４）個中３６個の可能性のある順列が、必要条件を満たし、次いで、許容可能なＰＣＲプライマー設計に求められるさらなる制限に供された（表４）。
Figure 2009502202
 表４は、Ｇｅｒｒｙら．１９９９．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２９２：２５１−２６２によって概説されている基準に基づいた四量体プライマー構成要素選択を実際に説明した行列を示している。各四量体は、他のすべてのものと少なくとも２塩基異なっている必要があった。四量体は、パリンドロームであることはできないか、または他の任意の四量体と相補的であることができない。３６個の四量体が選択された（太字に下線）；斜体の配列は、この要件から除外されたパリンドロームの四量体を表示している。
（プライマー設計：）
通常のプライマー設計に共通の仕様を満たすようにＰＣＲプライマーを設計し（Ｒｕｂｉｎ，Ｅ．およびＡ．Ａ．Ｌｅｖｙ，Ａ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ａ ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９６．２４（１８）：ｐ．３５３８−４５；Ｂｕｃｋ，Ｇ．Ａ．ら、Ｄｅｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９９．２７（３）：ｐ．５２８−３６を参照のこと）、実際の選択は、コンピュータプログラムＭＭＰによって行った。プライマーは、効率的な合成のために、２連のＰＣＲ／配列決定プライマー全体で２０塩基（５つの四量体）の長さに制限した。各プライマーは、５’末端に２塩基のＧＣクランプおよび３’末端に単一のＧＣクランプを含み（表５）、すべてのプライマーが、類似のＴｍ（＋／−２℃）を共有した（図２７）。プライマー内のヘアピン形成（内部ヘアピンステムΔＧ＞−１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は許容しなかった。二量体形成も制御した；最大３塩基の許容可能ダイマーは許容したが、最終的には３’の６塩基に生じ得、３’ダイマーについて許容可能な最大ΔＧは、−２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。さらに、３’末端が、その群内の他のものと酷似するプライマーにペナルティを課すことにより、一方のプライマーと他方の逆相補鎖との間のクロスハイブリダイゼーションを防いだ。
Figure 2009502202
 表５は、２つの５’Ｇ／Ｃクランプおよび単一の３’Ｇ／Ｃクランプをもたらす３６個の選択された四分子の可能性のある順列を示している。内部に位置するものは、残りの四分子から構成されている。このことから、８×１９×１９×１９×９通りの順列、すなわち４９３，８４８通りの可能性のある組み合わせがもたらされる。図２７は、許容可能なプライマーのうち、Ｔｍに基づく選別をまず通過したものを示しており、４９３，８４８プライマーから６４〜６６℃のＴｍを有する５６，２４６候補に絞られた。
Figure 2009502202
 複雑なサンプル集団におけるミスマッチに対して、ＰＣＲは許容性であると報告されているにもかかわらず、目的ゲノム内に生じる相補的領域の可能性は、プライマー設計プロセスにおいて大きな懸案事項ではなかった（例えば、Ｒｕｂｉｎ，Ｅ．およびＡ．Ａ．Ｌｅｖｙ，Ａ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ａ ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９６．２４（１８）：ｐ．３５３８−４５を参照のこと）。２０塩基プライマーに対する完全マッチが発見される確率が、極めて低くても（４２０）（表６）、不連続の低いマッチが発見される確率は、目的ゲノムのサイズに応じて有意に増大する。結果として、２０塩基中少なくとも１０塩基の完全マッチが発見される確率は、アデノウイルスゲノムについて９９．３５％である。１６塩基の完全マッチが発見される確率は、ＮＣＢＩデータベース内の配列（アデノウイルスゲノムよりも約１００倍大きい）について９７％である。２０塩基のプライマーに対して１７塩基の完全マッチが発見される確率は、ヒトゲノムの配列（３０億塩基）について９９％である。
ゲノムの領域に対するプライマーのクロスハイブリダイゼーションの確率の高さは、ランダムなＤＮＡ消化によって鋳型フラグメントを生成しているので、予想よりもそれほど問題ではない。従って、クロスハイブリダイズ領域（ＣＨＲ）の効果は、かなり良好である。ＣＨＲが、溶液中のＰＣＲプライマーと鋳型との間の完全マッチとうまく競合する可能性は低い。さらに、３’末端にミスマッチを含む任意のプライマーは、競合的に著しい不利益を有し得る。たとえＣＨＲが、意図されるＰＣＲプライマーと競合排除（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）するとしても、配列決定プライマーに対する下流部位を有しない切断型ＰＣＲ産物が生成され得る。その切断型産物を、捕捉ビーズに向かわせ、固定し得る場合、２つの状況のうち一方が生じ得る。ＣＨＲが、液相プライマーを競合排除する場合、固定された産物は、配列決定プライマー結合部位を欠き、空のピコタイタープレート（ＰＴＰ）のウェルが生じ得る。ＣＨＲが、ビーズ結合プライマーを競合排除する場合、配列決定プライマーは、なおも存在し得、短い挿入配列となるだけである。いずれの結果も配列決定のクオリティを過度に損なうことはない。多量のゲノム材料が、サンプル調製プロセスにおいて使用されれば（一般に２５μｇ，３５Ｋｂアデノウイルスゲノムの５．２９×１０１６コピーを含む）、過剰なサンプリングにより、完全なＣＨＲを欠くフラグメントがもたらされ得、対象領域の標準的なＰＣＲ増幅が可能となる。
（実施例３：噴霧化によるサンプル調製）
（噴霧化によるＤＮＡの調製）
噴霧工程の目的は、長い一続きのＤＮＡ（例えば、全ゲノムまたはゲノムの大きな部分）をＤＮＡ配列決定に受け入れられる小さい分子種に断片化することである。単一のＤＮＡ鋳型から生成されたこの小さく断片化されたＤＮＡ種の集団を「ライブラリ」という。噴霧化では、５０〜９００塩基対の範囲の二本鎖鋳型ＤＮＡをフラグメントに剪断する。この剪断されたライブラリは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼと、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとの組み合わせによって末端修復された一本鎖末端を含む。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼとＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼの両方を使用し、それらの５’−３’ポリメラーゼ活性を介してＤＮＡの３’陥凹末端（５’突出末端）を「埋める」。Ｔ４およびＫｌｅｎｏｗポリメラーゼの一本鎖３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により、３’突出末端が除去され、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼのキナーゼ活性により、５’ヒドロキシル末端にリン酸が付加される。
サンプルを以下のとおりに調製した：
１．１５μｇのｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を得て、１０ｍＭ ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．６；本節の後の試薬リストを参照のこと）で最終体積１００μｌに調整した。１．８以上のＯ．Ｄ．２６０／２８０比を測定することによって混入についてそのＤＮＡを解析した。最終ｇＤＮＡ濃度は、約３００μｇ／ｍｌであると予想された。
２．１６００μｌの氷冷噴霧緩衝液（本節の後を参照のこと）をｇＤＮＡに加えた。
３．反応混合物を氷冷噴霧器（ＣＩＳ−ＵＳ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に入れた。
４．１５ｍｌスナップキャップファルコンチューブのキャップを噴霧器の頂部の上に置いた（図２８Ａ）。
５．そのキャップを、適合カバー（ファルコンチューブの蓋のため）および２つのゴムＯ環からなる清潔な噴霧器クランプアセンブリに固定した（図２８Ｂ）。
６．噴霧器の底部を窒素供給元に接続し、デバイス全体をパラフィルムで覆った（図２８Ｃおよび２８Ｄ）。
７．噴霧器を直立に維持しながら（図２８Ｄに示すように）、５０ｐｓｉ（ポンド／平方インチ）の窒素を５分間供給した。濃縮された液体を底部に落とすために数秒ごとに噴霧器の底部を硬い表面上でたたいた。
８．５分後に窒素を止めた。圧力が正常になった後（３０秒）、窒素供給元を噴霧器から取り外した。
９．パラフィルムをはがし、噴霧器頂部をはずした。サンプルを取り出し、１．５ｍｌ微量遠心チューブに移した。
１０．噴霧器頂部を再び設置し、噴霧器を５００ｒｐｍで５分間遠心した。
１１．噴霧器内のサンプルの残りを回収した。回収された合計は、約７００μｌであった。
１２．ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用い、製造者の指示に従って回収サンプルを精製した。容量が大きかったので、カラムへの充填を数回行う必要があった。予め５５℃に温めておいた３０μｌの緩衝液ＥＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ８．５；Ｑｉａｇｅｎキットに付属）でサンプルを溶出した。
１３．サンプルをＵＶ分光法（１：１００希釈用に１９８μｌの水に２μｌ）により定量した。
（酵素的ポリッシング）
ＤＮＡ鋳型の噴霧により、ほつれた末端を有する多くのＤＮＡのフラグメントが得られる。これらの末端を、平滑末端にし、３種類の酵素、すなわち、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用することによってアダプターフラグメントへのライゲーションの準備を整える。
サンプルは、以下のとおりに調製した：
１．０．２ｍｌチューブにおいて、以下の試薬を順番に加えた：
２８μｌの噴霧済み精製ｇＤＮＡフラグメント
５μｌの水
５μｌの１０×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液
５μｌのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）
２μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
５μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（３単位／μｌ）
５０μｌの最終体積
２．工程１の溶液を十分に混合し、ＭＪサーモサイクラー（任意の正確な恒温器を使用してもよい）において２５℃で１０分間インキュベートした。
３．１．２５μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）（５単位／ｍｌ）を加えた。
４．その反応物を十分に混合し、ＭＪサーモサイクラーにおいて２５℃で１０分間、１６℃でさらに２時間インキュベートした。
５．処理したＤＮＡをＱｉａＱｕｉｃｋカラムを用いて精製し、予め５５℃に温めておいた３０μｌの緩衝液ＥＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ８．５）で溶出した。
６．以下の試薬を０．２ｍｌチューブ内で併せた：
３０μｌのＱｉａｇｅｎ精製、ポリッシング、噴霧済みｇＤＮＡフラグメント
５μｌの水
５μｌの１０×Ｔ４ ＰＮＫ緩衝液
５μｌのＡＴＰ（１０ｍＭ）
５μｌのＴ４ ＰＮＫ（１０単位／ｍｌ）
５０μｌの最終体積
７．その溶液を混合し、ＭＪサーマルサイクラーにおき、インキュベーション用のＴ４ ＰＮＫプログラム（３７℃で３０分間、６５℃で２０分間、その後、１４℃で保存）を使用した。
８．ＱｉａＱｕｉｃｋカラムを用いてサンプルを精製し、予め５５℃に温めておいた３０μｌの緩衝液ＥＢで溶出した。
９．ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いた最終ポリッシング反応物の２μｌアリコートを解析に供した（以下を参照のこと）。
（アダプターのライゲーション）
アダプターを連結するための手順を以下のとおりに行った：
１．０．２ｍｌチューブにおいて、以下の試薬を順番に加えた：
２０．６μｌの分子生物学グレードの水
２８μｌの消化、ポリッシング済みｇＤＮＡライブラリ
６０μｌの２×Ｑｕｉｃｋリガーゼ反応緩衝液
１．８μｌのＭＭＰ（２００ｐｍｏｌ／μｌ）ユニバーサルアダプターセット
９．６μｌのＱｕｉｃｋリガーゼ
合計１２０μｌ
上記反応物は、５μｇ用であり、使用するｇＤＮＡの量に応じて調整した。
２．試薬を十分に混合し、２５℃で２０分間インキュベートした。アガロースゲル電気泳動用にゲルが調製されるまで、チューブを氷上に置いた。
（アダプター付加ｇＤＮＡライブラリのゲル電気泳動および抽出）
ゲノムＤＮＡの噴霧により、５０〜９００ｂｐの範囲のライブラリ集団が得られる。８８−ｂｐユニバーサルアダプターセットが付加されると、その集団は、より大きなサイズにシフトし、より大きな範囲のサイズ（約１３０〜９８０ｂｐ）の移動プロファイルを生じることになる。アダプターダイマーは、８８ｂｐに移動し、未連結のアダプターは、４４ｂｐに移動する。ゆえに、２５０ｂｐ以上のサイズ範囲で単離されるゲノムＤＮＡライブラリは、アガロースゲルから物理的に単離され得、標準的なゲル抽出技術を用いて精製され得る。アダプター付加ｇＤＮＡライブラリのゲル単離により、２５０ｂｐ以上のサイズ範囲のライブラリ集団が回収されることになる（ライブラリのサイズ範囲は、用途に応じて変動し得る）。アダプターのライゲーション後のライブラリサイズ範囲は、１３０〜９８０ｂｐである。この手順は、ゲルの様々な領域を切り出すことにより、任意のバンドサイズ範囲（例えば、１３０〜２００ｂｐ、２００〜４００ｂｐ、２５０〜５００ｂｐ、３００〜６００ｂｐ、５００〜７００ｂｐなど）の単離に適合され得ることに注意されたい。以下に記載する手順を使用して、２５０ｂｐ〜５００ｂｐのフラグメントを単離した。
２％アガロース、１×ＴＢＥおよび４．５μｌのエチジウムブロマイド（１０ｍｇ／ｍｌ原液）を含む１５０ｍｌアガロースゲルを調製した。連結ＤＮＡを１０×Ｒｅａｄｙ Ｌｏａｄ Ｄｙｅと混合し、ゲルにロードした。さらに、１０μｌの１００−ｂｐラダー（０．１μｇ／μｌ）をサンプルに隣接するライゲーション反応物から２レーン離してロードした。１００Ｖで３時間、そのゲルの電気泳動を行った。ゲル電気泳動が完了したら、ゲルを、ゲルボックスから取り出し、プラスチックラップを敷いたＧｅｌＤｏｃに移した。ＤＮＡバンドをＰｒｅｐ ＵＶ光を用いて可視化した。滅菌された使い捨てメスを用いて、フラグメントサイズが２５０〜５００ｂｐのライブラリ集団をアガロースゲルから切り出した。このプロセスは、ＤＮＡのニッキングを防ぐためにできるだけ速やかに行った。ゲル片を１５ｍｌファルコンチューブに入れた。Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、アガロースに包埋されたｇＤＮＡライブラリを単離した。Ｂｉｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いて、単離された各ｇＤＮＡライブラリのアリコートを解析して、ｇＤＮＡライブラリ集団の正確な分布を評価した。
（ｇＤＮＡライブラリの鎖置換および鎖伸長ならびにストレプトアビジンビーズを用いた一本鎖ｇＤＮＡライブラリの単離）
Ｂｓｔ処理サンプルをサーマルサイクラーにおいて６５℃で３０分間インキュベートし、必要となるまで氷上に置いたこと以外は実施例１に記載のとおりに、ニック入り二本鎖ｇＤＮＡライブラリの鎖置換および鎖伸長を行った。ストレプトアビジンビーズの調製を、２００μｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液で２回洗浄し、２００μｌのｎＨ２Ｏで２回洗浄することによって最後の洗浄を行ったこと以外は、実施例１に記載のとおり行った。ストレプトアビジンビーズを使用して、以下のとおり一本鎖ｇＤＮＡライブラリを単離した。洗浄したビーズから水を除去し、２５０μｌの融解溶液（以下を参照のこと）を加えた。そのビーズ懸濁液を十分に混合し、チューブ回転装置において、室温で１０分間インキュベートした。別のチューブ中で、１２５０μｌのＰＢ（ＱｉａＱｕｉｃｋ精製キットからのもの）と９μｌの２０％酢酸とを混合した。Ｄｙｎａｌ ＭＰＣを用いて、２５０μｌの融解溶液中のビーズをペレットにし、上清を慎重に取り出し、新しく調製したＰＢ／酢酸溶液に移した。単一のＭｉｎＥｌｕｔｅ精製スピンカラムを用いて、１５００μｌの溶液からＤＮＡを精製した。これは、１ロードあたり７５０μｌで２回同じカラムにサンプルをロードしてカラムに通すことによって行った。一本鎖ｇＤＮＡライブラリを予め５５℃に温めておいた１５μｌの緩衝液ＥＢで溶出した。
（一本鎖ｇＤＮＡの定量および保存）
実施例１に記載のとおり、ＲＮＡ Ｐｉｃｏ ６０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いて一本鎖ｇＤＮＡを定量した。いくつかの場合において、最初のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００定量が正確に行われたかを確かめるために、第２のアッセイによって一本鎖ライブラリを定量した。この目的で、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ定量を記載のとおり行うことによって、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００定量を確かめた（フルオロメトリーによるｓｓＤＮＡ定量）。２つの推定値が３倍超異なる場合、各解析を繰り返した。定量により、２つの手順の間に３倍超の差が示された場合、ビーズに対して範囲の広い方の鋳型を使用した。
一本鎖ｇＤＮＡライブラリの希釈および保存を、実施例１に記載のとおり行った。収量は、以下のとおりであった：
ＬａｂＣｈｉｐ解析後のｓｓＤＮＡライブラリの最終残余体積＝１２μｌ
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ解析後のｓｓＤＮＡライブラリの最終残余体積＝９μｌ
ＴＥ添加後のｓｓＤＮＡライブラリの最終体積＝１８μｌ
等量のＴＥを一本鎖ｇＤＮＡライブラリ原液に加えた。緩衝液ＴＥ中一本鎖ｇＤＮＡライブラリ１×１０８分子／μｌ。原液を、ＴＥ中２００，０００分子／μｌに希釈し（１／５００）、２０μｌアリコートを調製した。
（噴霧後のライブラリフラグメントのサイズ分布）
噴霧およびポリッシング後の物質のうちの１μｌのＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐ解析の代表的な結果を図２９Ａに示す。大部分の生成物のサイズ範囲分布は、約５０〜９００塩基対に入ると予想された。平均サイズ（ピークの頂点）は、約４５０ｂｐであると予想された。アダプターが連結されたライブラリフラグメントのゲル精製の代表的な結果を図２９Ｂに示す。
（試薬）
他に明記されない限り、実施例において列挙される試薬は、商業的に入手可能な標準的な試薬を表している。例えば、Ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、Ｔ４ ＰＮＫ、Ｔ４ ＰＮＫ 緩衝液、Ｑｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ、Ｑｕｉｃｋライゲーション緩衝液、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）およびＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手可能である。ｄＮＴＰ混合物は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。アガロース、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＴＢＥ、ＢｌｕｅＪｕｉｃｅゲルローディング緩衝液およびＲｅａｄｙ−Ｌｏａｄ １００ｂｐＤＮＡラダーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入可能である。エチジウムブロマイドおよび２−プロパノールは、Ｆｉｓｈｅｒ（Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）から購入可能である。ＲＮＡラダーは、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入可能である。他の試薬は、一般に公知であり、および／または下記の表７に列挙する：
Figure 2009502202
 融解溶液は、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１２５ｍＭ ＮａＯＨを含んでいた。列挙した試薬を併せ、完全に混合した。その溶液は、室温で６ヶ月間保存可能であった。．
Figure 2009502202
Figure 2009502202
 ２×Ｂ＆Ｗ緩衝液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２Ｍ ＮａＣｌの最終濃度を含んでいた。列挙した試薬を完全に混合することにより併せた。この溶液は、室温で６ヶ月間保存可能であった。２×Ｂ＆Ｗ緩衝液とピコピュア（ｐｉｃｏｐｕｒｅ）Ｈ２Ｏとを１：１で混合することにより、１×Ｂ＆Ｗ緩衝液を調製した。その最終濃度は、上で列挙した濃度の半分、すなわち、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１Ｍ ＮａＣｌであった。
他の緩衝液は、以下を含んでいた。１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液：５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣ１２、１ｍＭ ジチオトレイトール（２５℃でｐＨ７．９）。ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ。
（特別な試薬調製物：）
Figure 2009502202
 試薬を混合し、その溶液は、室温で６ヶ月間保存可能であった。
Figure 2009502202
 すべての試薬をＳｔｅｒｉｃｕｐに加え（グリセロールを最後に加えた）、十分に混合した。その溶液を標識し、その溶液は、室温で６ヶ月間保存可能であった。
Figure 2009502202
 試薬を混合し、その溶液は、−２０℃で６ヶ月間保存可能であった。
Figure 2009502202
Figure 2009502202
 試薬を混合し、その溶液は、４℃で６ヶ月間保存可能であった。
Figure 2009502202
 １０×アニーリング緩衝液は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）および５０ｍＭ酢酸マグネシウムを含んでいた。この緩衝液に対して、２００ｍｌのＴｒｉｓを５００ｍｌのピコピュアＨ２Ｏに加えた。次に、１０．７２ｇの酢酸マグネシウムをその溶液に加え、完全に溶解した。その溶液を最終体積１０００ｍｌに調整した。その溶液は、４℃で６ヶ月間保存可能であった。ライブラリの混入の可能性を回避するために、緩衝液を単回使用または短期間使用のために分注した。
（アダプター：）
Figure 2009502202
 この溶液の調製のために、１０μｌの１０００ｐｍｏｌ／μｌアダプターＡ（４４ｂｐ、センス）を１０μｌの１０００ｐｍｏｌ／μｌアダプターＡ（４０ｂｐ、アンチセンス）と、２．５μｌの１０×ライブラリアニーリング緩衝液と、２．５μｌの水とを混合した（Ｖｆ＝２５μｌ）。Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ＬａｂサーマルサイクラーにおけるＡＮＮＥＡＬ−Ａプログラム（下記の付表を参照のこと）を用いて、これらのアダプターをアニーリングした。アダプター設計についての詳細は、付表に示す。
Figure 2009502202
Figure 2009502202
 この溶液の調製のために、１０μｌの１０００ｐｍｏｌ／μｌアダプターＢ（４０ｂｐ、センス）を、１０μｌの１０００ｐｍｏｌ／μｌアダプターＢ（４４ｂｐ、アンチセンス）と、２．５μｌの１０×ライブラリアニーリング緩衝液と、２．５μｌの水とを混合した（Ｖｆ＝２５μｌ）。Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ＬａｂサーマルサイクラーにおけるＡＮＮＥＡＬ−Ａプログラム（付表を参照のこと）を用いて、これらのアダプターをアニーリングした。アニーリング後、アダプター「Ａ」およびアダプター「Ｂ」（Ｖｆ＝５０μｌ）を混合した。アダプターセットは、−２０℃で使用するまで保存可能であった。
Figure 2009502202
 この溶液の調製のために、氷酢酸を水に加えた。その溶液は、室温で６ヶ月間保存可能であった。
（アダプターアニーリングプログラム：）
プライマーアニーリング用のＡＮＮＥＡＬ−Ａプログラム：
１．９５℃で１分インキュベート；
２．０．１℃／秒で１５℃に温度低下；および
３．１４℃で保持
末端修復用のＴ４ポリメラーゼ／Ｋｌｅｎｏｗ ＰＯＬＩＳＨプログラム：
１．２５℃で１０分インキュベート；
２．１６℃で２時間インキュベート；および
３．４℃で保持
末端修復用のＴ４ ＰＮＫプログラム：
１．３７℃で３０分インキュベート；
２．６５℃で２０分インキュベート；および
３．１４℃で保持
ニック入り二本鎖ｇＤＮＡの鎖置換および鎖伸長用のＢＳＴプログラム：
１．６５℃で３０分インキュベート；および
２．１４℃で保持
（工程９：一本鎖ＤＮＡライブラリの希釈および保存）
ＥＢ緩衝液中の一本鎖ＤＮＡライブラリ：最終残余体積＝２５μｌ。
最初の原液の希釈を以下のとおり行った。パイロシーケンス（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の結果を用いて、一本鎖ＤＮＡライブラリを１×アニーリング緩衝液中１００Ｍ分子／μＬに希釈した（通常、１：５０希釈した）。
１×アニーリング緩衝液中に２００，０００分子／μＬに希釈し、３０μＬアリコートを調製することによって、一本鎖ＤＮＡライブラリのアリコートを通常の使用のために作製した。−２０℃で保存のこと。サンプルをエマルジョンＰＣＲに利用した。
（試薬調製：）
停止溶液（５０ｍＭ ＥＤＴＡ）：１００μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを９００μｌのｎＨ２Ｏと混合することにより、１．０ｍｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液が得られる。
１０ｍＭ ｄＮＴＰの溶液は、１０μｌのｄＣＴＰ（１００ｍＭ）、１０μｌのｄＡＴＰ（１００ｍＭ）、１０μｌのｄＧＴＰ（１００ｍＭ）および１０μｌのｄＴＴＰ（１００ｍＭ）、６０μｌの分子生物学グレードの水（ｎＨ２Ｏ）を含んでいた。４種類すべての１００ｍＭヌクレオチド原液を氷上で解凍した。１０μｌの各ヌクレオチドを６０μｌのｎＨ２Ｏと併せることにより、最終体積１００μｌを得て、完全に混合した。１ｍｌアリコートを１．５ｍｌ微量遠心チューブに分注し、１年以内は−２０℃で保存した。
アニーリング緩衝液、１０×：１０×アニーリング緩衝液は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）および５０ｍＭ酢酸マグネシウムを含んでいた。この溶液について、２４．２３ｇのＴｒｉｓを８００ｍｌのｎＨ２Ｏに加え、ｐＨ７．５に調整した。これに、１０．７２ｇの酢酸マグネシウムを加え、完全に溶解した。この溶液を最終体積１０００ｍｌにした。その溶液は、４℃で１ヶ月間保存可能であった。
１０×ＴＥ：１０×ＴＥは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいた。これらの試薬を一緒に加え、完全に混合した。その溶液は、室温で６ヶ月間保存可能であった。
（実施例４：ビーズエマルジョンＰＣＲ）
鋳型ＤＮＡの捕捉、ＤＮＡ増幅および増幅した鋳型に結合しているビーズの回収を含む以下の手順を、単一のチューブにおいて行うことができる。エマルジョン形式により、単一のチューブ内で１００〜２００μｍの「マイクロリアクター」中にビーズを物理的に隔離することが確実に行われ、それにより、様々な鋳型のクローン増幅が可能になる。増幅産物の固定は、ＤＮＡ捕捉ビーズに結合したオリゴヌクレオチドに沿った鋳型の伸長により達成される。代表的な固定された鋳型のコピー数は、１ビーズあたり１０００万〜３０００万コピーの範囲である。単一種の多コピーの核酸鋳型が付着したＤＮＡ捕捉ビーズは、ＰＴＰ上への分配の準備ができている。
ＰＴＰ表面にエッチングされた７５ピコリットルの３００，０００個のウェルは、大規模並列処理で、効率的かつ費用効率が高い様式の短ＤＮＡ鋳型の配列決定用の固有のアレイを提供する。しかしながら、これには、各反応ウェル中にかなり大量の（何百万コピーもの）クローン鋳型が必要である。本発明の方法により、ユーザは、標準的なチューブまたはマイクロタイタープレートにおいて行ったＰＣＲ反応を介した一本鎖ゲノム鋳型種をクローン的に増幅することが可能となる。１コピーの鋳型種を、捕捉ビーズと混合し、完全なＰＣＲ増幅溶液に再懸濁し、マイクロリアクター（直径１００〜２００μｍ）に乳化し得た後、ＰＣＲ増幅により、最初の鋳型種の１０７倍の増幅が得られる。この手順は、以前の方法よりも一層簡便かつ費用効率が高い。
（捕捉ビーズへの核酸鋳型の結合）
この実施例では、好ましくは、ビーズに付着したただ１つの固有の核酸鋳型を有するビーズの集団の調製について記載する。クローン増幅の成功は、制御された数の鋳型種（０．５〜１）を各ビーズに送達することに左右される。過剰な種の送達により、意味のある配列データの生成を妨げる混合鋳型集団のＰＣＲ増幅がもたらされ得るが、種が不足すると、配列決定用の鋳型を含むウェルが減少してしまう。これにより、配列決定段階によって提供されるゲノムを網羅する程度が低下し得る。結果として、定量を反復することによって鋳型濃度が正確に決定されていること、および結合プロトコールが以下に概説するとおりに行われることが、好ましい。
（鋳型のクオリティの制御）
エマルジョンＰＣＲ反応の成功は、鋳型種のクオリティに関係する。増幅段階に払われる注意および詳細に関係なく、クオリティが不良な鋳型が、増幅の成功および意味のある配列データの生成を妨害し得る。不必要な時間および金銭の損失を防ぐために、エマルジョンＰＣＲ段階のプロセスを開始する前に鋳型材料の質を検査することが重要である。好ましくは、ライブラリは、エマルジョンＰＣＲに使用される前に２つのクオリティ管理工程を通過するべきである。その濃度およびそれを含む産物の分布を測定すべきである。理想的には、ライブラリは、認識可能なアダプターダイマー（例えば、約９０塩基）をほとんどまたは全く含まないフラグメントの不均一な集団として存在すべきである。また、ＰＣＲプライマーによる増幅が、例えば、３００〜５００ｂｐの範囲の産物のスメアをもたらすべきである。増幅産物が存在しないことは、鋳型へのアダプターの正しい連結が失敗していることを反映し得る一方、任意のサイズの単一バンドが存在していることは、鋳型の混入を反映し得る。
（ＰＣＲ溶液の調製）
この段階に対して主に考慮すべき点は、遊離アンプリコンによるＰＣＲ反応混合物への混入を防ぐことである。残留アンプリコンによるＰＣＲ反応物の汚染は、配列決定の失敗を引き起こし得る重要な問題の１つである。混入の確率を低下するために、研究室で適正な技術を習得しているべきであり、反応混合物の調製は、ＵＶ処理された層流フードにおけるクリーンルームで行われるべきである。
（ＰＣＲ反応混合物：）
２００μｌのＰＣＲ反応混合物について（６００，０００ビーズを増幅するのに十分）、以下の試薬を０．２ｍｌＰＣＲチューブにおいて混合した：
Figure 2009502202
 このチューブを完全にボルテックスし、ビーズを鋳型でアニールするまで氷上に保存した。
（ＤＮＡ捕捉ビーズ：）
１．６００，０００個のＤＮＡ捕捉ビーズをストックチューブから１．５ｍｌ微量遠心チューブに移した。使用する正確な量は、調製される試薬のビーズ濃度に依存する。
２．卓上小型遠心機でビーズを沈殿させ、上清を除去した。
３．工程４〜１１をＰＣＲクリーンルームで行った。
４．ビーズを１ｍＬの１×アニーリング緩衝液で洗浄した。
５．捕捉ビーズを微量遠心機で沈殿させた。そのチューブを１８０°回転して、再度遠心した。
６．約１０μｌの上清以外をビーズを含むチューブから除去した。ビーズは、乱されなかった。
７．１ｍＬの１×アニーリング緩衝液を加え、その混合物を１分間インキュベートした。次いで、工程５と同様にビーズを沈殿させた。
８．約１００μＬの材料以外をチューブから除去した。
９．残っているビーズおよび溶液をＰＣＲチューブに移した。
１０．数回上下にピペッティングすることにより、１．５ｍＬチューブを１５０μＬの１×アニーリング緩衝液で洗浄した。これを、ビーズを含むＰＣＲチューブに加えた。
１１．工程５と同様にビーズを沈殿させ、ビーズペレットを乱さないように注意しながら上清の１０μＬ以外を除去した。
１２．定量した一本鎖鋳型ＤＮＡ（ｓｓｔＤＮＡ）のアリコートを取り出した。最終濃度は、２００，０００−ｓｓｔ ＤＮＡ分子／μｌであった。
１３．ビーズを含むＰＣＲチューブに３μｌの希釈ｓｓｔＤＮＡを加えた。これは、６００，０００コピーのｓｓｔＤＮＡに等しい。
１４．そのチューブを穏やかにボルテックスして、内容物を混合した。
１５．以下のプロトコールを用いて、ＭＪサーモサイクラーのＥＰＣＲフォルダに保存されているプログラム８０Ａｎｎｅａｌによって、ＰＣＲサーモサイクラーにおいてｓｓｔＤＮＡを捕捉ビーズにアニールさせた：
６５℃で５分；
０．１℃／秒で６０℃に低下；
６０℃で１分間保持；
０．１℃／秒で５０℃に低下；
５０℃で１分間保持；
０．１℃／秒で４０℃に低下；
４０℃で１分間保持；
０．１℃／秒で２０℃に低下；および
次の工程の準備ができるまで１０℃で保持
ほとんどの場合において、鋳型結合の後すぐにビーズを増幅に使用した。ビーズをすぐに使用しない場合、必要となるまで、４℃の鋳型溶液中で保存しておくべきである。保存後、ビーズを以下のとおり処理した。
１６．工程６と同様に、ビーズをサーモサイクラーから取り出し、遠心し、ビーズを乱さずにアニーリング緩衝液を除去した。
１７．乳化（実施例２）するまで、ビーズをアイスバケット内に保存した。
１８．捕捉ビーズは、各ビーズに結合した平均０．５〜１コピーのｓｓｔＤＮＡを含んでおり、乳化の準備ができた。
（実施例５：乳化）
この工程における使用に適したＰＣＲ溶液について、以下に記載する。２００μｌのＰＣＲ反応混合物（６０００００個のビーズを増幅するのに十分）について、以下を０．２ｍｌＰＣＲチューブに加えた：
Figure 2009502202
 この実施例では、１マイクロリットルあたり約３，０００個のＰＣＲマイクロリアクターを含む、熱安定性の油中水エマルジョンを作製する方法を記載する。エマルジョンを調製するためのプロトコールを以下に概説する。
１．２００μｌのＰＣＲ溶液を６００，０００ビーズに加える（両方の構成要素とも実施例１から）。
２．溶液を上下に数回ピペッティングしてビーズを再懸濁した。
３．ＰＣＲ−ビーズ混合物を室温にて２分間インキュベートすることにより、ＰＣＲ溶液でビーズを平衡化した。
４．４００μｌのエマルジョンオイルを、ＵＶ照射された２ｍｌ微量遠心チューブに加えた。
５．「アンプリコンを含まない」１／４”磁気攪拌棒をエマルジョンオイルのチューブに加えた。
アンプリコンを含まない攪拌棒を以下のとおり調製した。
大きい攪拌棒を用いて１／４”攪拌棒を保持させた。次いで、その攪拌棒を：
ＤＮＡ−Ｏｆｆで洗浄し（流すか、または噴霧して）；
ピコピュア水ですすぎ；
Ｋｉｍｗｉｐｅの端で乾燥させ；
５分間ＵＶ照射した
６．Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓチューブホルダーの磁気挿入物を取り除いた。エマルジョンオイルのチューブをチューブホルダーに置いた。そのチューブを６００ｒｐｍの撹拌プレートセットの中心においた。
７．そのチューブを徹底的にボルテックスして、ビーズを再懸濁した。これにより、ビーズの集塊が最小であることを確実にした。
８．Ｐ−２００ピペットを使用して、２秒ごとに約１滴の速度で回転しているオイルにＰＣＲ−ビーズ混合物を滴下することにより、各滴が磁気攪拌棒の高さに沈み、次の液滴を加える前に乳化されるようになる。その溶液は、マヨネーズと同様の粘度を有する均一な乳白色の液体になった。
９．一旦、すべてのＰＣＲ−ビーズ混合物が加えられたら、微量遠心チューブを数回はじいて表面に付着している任意のオイルを乳状のエマルジョンと混合した。
１０．撹拌をさらに５分間続けた。
１１．工程９および１０を繰り返した。
１２．大きい攪拌棒でチューブの外側から引っ張ることによって、攪拌棒を乳化材料から取り出した。
１３．１０μＬのエマルジョンを取り出し、顕微鏡用スライドに載せた。そのエマルジョンをカバーガラスで覆い、エマルジョンを５０×の倍率で（１０×接眼レンズおよび５×対物レンズ）観察した。「良好な」エマルジョンは、オイル中のＰＣＲ溶液の分離した液滴（マイクロリアクター）に主に単一のビーズを含んでいると予想された。
１４．エマルジョン安定剤を含む適当なエマルジョンオイル混合物を、以下のとおり作製した。エマルジョン混合物の構成成分を表１９に示す。
Figure 2009502202
 ウォーターバス中でＡｔｌｏｘ４９１２を６０℃に予め温めることによって、エマルジョンオイル混合物を作製した。次いで、４．５グラムのＳｐａｎ８０を９４．５グラムのミネラルオイルに加えることにより、混合物を形成した。次いで、１グラムの予め温めておいたＡｔｌｏｘ４９１２をその混合物に加えた。その溶液を閉鎖系容器に入れ、振盪および反転することにより、混合した。混合物を６０℃に温めることによって、Ａｔｌｏｘが固化または凝固した任意の徴候を緩和し、その後、さらに振盪した。
（実施例６：増幅）
この実施例では、ビーズ−エマルジョン混合物中の鋳型ＤＮＡの増幅を記載する。本発明のこのプロトコールに従って、本プロセスのＤＮＡ増幅の段階は、３〜４時間を要する。増幅が完了した後、ビーズ単離のプロセスを開始する前に、エマルジョンを最大１２時間サーモサイクラーに放置しておくことができる。５０〜１００μｌの乳化された反応混合物を個別のＰＣＲ反応チャンバ（すなわち、ＰＣＲチューブ）に置くことによって、ＰＣＲ熱サイクリングを行った。ＰＣＲを以下のとおり行った：
１．エマルジョンの５０〜１００μＬの量を、単一のピペットチップを用いて、約１０個の別個のＰＣＲチューブまたは９６ウェルプレートに移した。この工程について、油中水エマルジョンは、非常に粘稠性であった。
２．プレートを密封するか、またはＰＣＲチューブの蓋を閉じ、それらの容器を、９６ウェルプレートアダプターの装着ありまたは装着なしでＭＪサーモサイクラーに置いた。
３．以下のプログラムを行うようにＰＣＲサーモサイクラーをプログラムした：
１サイクル（９４℃４分）−ホットスタートで開始；
４０サイクル（９４℃３０秒、５８℃３０秒、６８℃９０秒）；
２５サイクル（９４℃３０秒、５８℃６分）；および
１４℃で保存
４．ＰＣＲ反応の完了後、エマルジョンを破壊して、ビーズを回収するために、増幅材料を取り出した。
（実施例７：エマルジョンの破壊およびビーズの回収）
この実施例では、エマルジョンの破壊および増幅鋳型を有するビーズの回収の方法を記載する。好ましくは、ＰＣＲ後のエマルジョンは、完全な状態のままであるほうがよい。エマルジョンの下相は、目視検査によって、乳白色の懸濁液のままであるほうがよい。溶液が透明である場合、エマルジョンは、部分的に水相および油相に分離した可能性があり、多くのビーズが鋳型の混合物を有する可能性がある。１本または２本のチューブにおいてエマルジョンが破壊された場合、これらのサンプルを他のものと混合してはならない。エマルジョンが、すべてのチューブにおいて破壊されていた場合、本手順を継続してはならない。
１．単一のピペットチップを用いて、元の６００μｌサンプルからのＰＣＲ反応物すべてを単一の１．５ｍｌ微量遠心チューブに併せる。上で述べたように、エマルジョンは、かなり粘稠性であった。いくつかの場合において、各チューブについて、ピペッティングを数回繰り返した。できるだけ多くの材料を１．５ｍｌチューブに移した。
２．各サンプルに５０μｌのＳｉｇｍａミネラルオイルを加えることによって、残りの乳化した材料を各ＰＣＲチューブから回収した。単一のピペットチップを用いて、各チューブを上下に数回ピペッティングして、残りの材料を再懸濁した。
３．この材料を、乳化した材料のバルクを含む１．５ｍｌチューブに加えた。
４．そのサンプルを３０秒間ボルテックスした。
５．そのサンプルを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心機において、卓上微量遠心チューブにて１３２００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
６．エマルジョンは、厚く白い界面を有する二相に分離した。できるだけ多くの上の透明な油相を除去した。濁った材料がチューブに残った。しばしば、白い層が油層と水層とを分離した。ビーズは、チューブの底部にペレットになって観察されることが多かった。
７．ビーズの上の水層を取り出し、解析用（ゲル解析、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００およびＴａｑｍａｎ）に保存した。白色材料の界面が、水層の上に残存していた場合、その下の水層を２０マイクロリットル除去した。これは、ピペットチップで界面材料を貫通して、底部から溶液を回収することによって行った。
８．ＰＴＰ ＦａｂｒｉｃａｔｉｏｎおよびＳｕｒｆａｃｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｏｏｍ Ｆｕｍｅ Ｈｏｏｄにおいて、１ｍｌのヘキサン類をエマルジョンの残りに加えた。
９．そのサンプルを１分間ボルテックスし、１分間最大速度で遠心分離した。
１０．ＰＴＰ ＦａｂｒｉｃａｔｉｏｎおよびＳｕｒｆａｃｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｏｏｍ Ｆｕｍｅ Ｈｏｏｄにおいて、上部の油相／ヘキサン相を除去し、有機廃棄容器に入れた。
１１．１ｍｌの１×アニーリング緩衝液を、８０％エタノール中、残りの水相、界面およびビーズに加えた。
１２．そのサンプルを１分間または白色物質が溶解するまでボルテックスした。
１３．そのサンプルを１分間高速で遠心分離した。そのチューブを１８０°回転して、再度１分間遠心した。その上清を、ビーズペレットを乱さずに除去した。
１４．ビーズを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×アニーリング緩衝液１ｍｌで洗浄し、この工程を繰り返した。
（実施例８：一本鎖の除去およびプライマーアニーリング）
ビーズを、ピロリン酸ベースの配列決定反応に使用する場合、次いで、ＰＣＲ産物の第２の鎖を除去し、配列決定プライマーとビーズに結合している一本鎖鋳型とをアニールする必要がある。この実施例では、それを達成するためのプロトコールを記載する。
１．ビーズを１ｍｌの水で洗浄し、１分間の遠心を２回行った。そのチューブを遠心の間に１８０°回転させた。遠心後、水相を除去した。
２．ビーズを１ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄した。そのチューブを工程１と同様に遠心し、水相を除去した。
３．１ｍｌの０．１２５Ｍ ＮａＯＨを加え、サンプルを８分間インキュベートした。
４．サンプルを軽くボルテックスし、微量遠心機にかけた。
５．６分後、ビーズは、工程１と同様に沈殿しており、できるだけ多くの溶液を除去した。
６．８分間のＮａＯＨインキュベーションが完了したら、１ｍｌの１×アニーリング緩衝液を加えた。
７．サンプルを軽くボルテックスし、ビーズは、工程１と同様に沈殿していた。できるだけ多くの上清を除去し、さらに１ｍｌの１×アニーリング緩衝液を加えた。
８．サンプルを軽くボルテックスし、ビーズは、工程１と同様に沈殿しており、８００μｌの１×アニーリング緩衝液を除去した。
９．ビーズを０．２ｍｌＰＣＲチューブに移した。
１０．ビーズを移し、ビーズを乱さずにできるだけ多くのアニーリング緩衝液を除去した。
１１．１００μｌの１×アニーリング緩衝液を加えた。
１２．４μｌの１００μＭ配列決定プライマーを加えた。サンプルをアニーリングの直前にボルテックスした。
１３．ＭＪサーモサイクラーにおいて、「８０Ａｎｎｅａｌ」プログラムを用いてアニーリングを行った。
１４．ビーズを２００μｌの１×アニーリング緩衝液で３回洗浄し、１００μｌの１×アニーリング緩衝液で再懸濁した。
１５．ビーズをＨａｕｓｓｅｒ Ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒで計数した。代表的には、３００，０００〜５００，０００ビーズを回収した（３，０００〜５，０００ビーズ／μＬ）。
１６．ビーズは４℃で保存し、１週間配列決定に使用できた。
（実施例９：任意の濃縮工程）
以下の手順を用いて、ビーズを含むアンプリコンについてビーズを濃縮し得る。濃縮は、必ずしも必要ではないが、その後の分子生物学手法（例えば、ＤＮＡ配列決定）をより効率的にするために使用することができた。
５０マイクロリットルの１０μＭ（合計５００ｐｍｏｌ）のビオチン−配列決定プライマーを、実施例５からのアンプリコンを含むセファロースビーズに加えた。そのビーズをサーモサイクラーに置いた。プライマーは、実施例２のサーモサイクラーアニーリングプログラムによってビーズ上のＤＮＡにアニールされた。
アニーリング後、セファロースビーズを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有アニーリング緩衝液で３回洗浄した。この時点でビオチン−配列決定プライマーとアニールしたｓｓＤＮＡフラグメントを含んでいるビーズを遠心分離によって濃縮し、２００μｌのＢＳＴ結合緩衝液に再懸濁した。１０マイクロリットルの５０，０００単位／ｍｌのＢｓｔ−ポリメラーゼを再懸濁ビーズに加え、ビーズが入っている容器を５分間遠心分離機にかけた。２マイクロリットルの１０ｍＭｄＮＴＰ混合物（すなわち、１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの各々２．５μｌ）を加え、その混合物を室温でさらに１０分間インキュベートした。ビーズを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有アニーリング緩衝液で３回洗浄し、元の容量のアニーリング緩衝液に再懸濁した。
５０マイクロリットルのＤｙｎａｌストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ；Ｍ２７０またはＭｙＯｎｅＴＭビーズ、１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有アニーリング緩衝液で３回洗浄し、元の容量の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有アニーリング緩衝液に再懸濁した。次いで、Ｄｙｎａｌビーズ混合物を再懸濁セファロースビーズに加えた。その混合物をボルテックスし、室温で１０分間遠心機にかけた。
ビーズは、２３００ｇ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１５Ｄで５００ｒｐｍ）での遠心分離により試験管の底に集まった。そのビーズを元の容量の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有アニーリング緩衝液に再懸濁した。試験管内の混合物を磁気選別機（Ｄｙｎａｌ）にかけた。ビーズを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有アニーリング緩衝液で３回洗浄し、元の量の同じ緩衝液に再懸濁した。アンプリコンを含まないビーズを、先に記載したように洗浄工程によって除去した。適切なＤＮＡフラグメントを含むセファロースビーズだけを保持した。
５００μｌの０．１２５Ｍ ＮａＯＨを加えることによって、磁気ビーズをセファロースビーズから分離した。混合物をボルテックスし、磁気選別により磁気ビーズを除去した。溶液中に残存しているセファロースビーズを別のチューブに移し、ｐＨが７．６に安定するまで４００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸で洗浄した。
（実施例１０：ビーズエマルジョンＰＣＲを用いた核酸配列決定）
以下の実験は、ビーズエマルジョンＰＣＲの効率を調べるために行った。このプロトコールに対して、平均直径が２５〜３５μｍ（製造者から供給されたまま）の６００，０００個のセファロースビーズを、１ビーズあたり３０００〜５０００万コピーの比で捕捉プライマーに共有結合させた。共有結合した捕捉プライマーを有するビーズを、１２０万コピーの一本鎖アデノウイルスライブラリと混合した。ライブラリ構築物は、ビーズ上の捕捉プライマーに相補的な配列を含んでいた。
実施例１に記載の手順を用いて、アデノウイルスライブラリをビーズにアニールさせた。次いで、ビーズを完全なＰＣＲ溶液に再懸濁した。実施例２に記載の手順と同じ手順を用いて、ＰＣＲ溶液およびビーズを２容量の回転させた乳化オイルに乳化した。乳化（カプセル化）ビーズを、実施例３に概説したようなＰＣＲによる増幅に供した。エマルジョンを、実施例４に概説したように破壊した。ビーズ上のＤＮＡを一本鎖にし、実施例５の手順を用いて、配列決定プライマーをアニールした。
次に、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）製のピロリン酸配列分析装置を用いたピロリン酸配列決定により、７０，０００ビーズを同時に配列決定した（本明細書と同時に出願された、同時係属中のＬｏｈｍａｎらの２００３年６月６日出願の表題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”米国特許出願番号６０／４７６，５９２を参照のこと）。７０，０００ビーズの複数回分を配列決定し、そのデータを下の表２０に示す。
Figure 2009502202
 この表は、ピロリン酸配列分析装置から得られた配列をアデノウイルス配列と比較したＢＬＡＳＴ解析から得られた結果を示している。第１欄は、ＢＬＡＳＴプログラムにおいて使用したエラー許容率を示している。最後の欄は、既知配列との直接比較により決定された実際のエラーを示している。
（両端配列決定用のビーズエマルジョンＰＣＲ）
（実施例１１：鋳型のクオリティ管理）
先に示したように、エマルジョンＰＣＲ反応の成功は、一本鎖鋳型種のクオリティに関連することが見出された。それゆえ、エマルジョンＰＣＲプロトコールを開始する前に、鋳型材料のクオリティを２つの別個のクオリティ管理により評価した。第１に、一本鎖鋳型のアリコートを２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｉｅｎｔ）で電気泳動した。ＲＮＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｉｐを使用して、サンプルが、約２００〜５００塩基のサイズの範囲のフラグメントの不均一な集団を含んでいることを確認した。第２に、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ ＦＬ６００プレート蛍光光度計によるＲｉｂｏＧｒｅｅｎ蛍光アッセイを用いて、ライブラリを定量した。５ｎｇ／μｌ未満のＤＮＡ濃度を有すると測定されたサンプルは、使用するのには希釈されすぎているとみなされた。
（実施例１２：ＤＮＡ捕捉ビーズ合成）
１ｍＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）−活性化セファロースＨＰアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に充填されたビーズをカラムから取り出した。３０μｍおよび２５μｍのポアフィルターメッシュ片（Ｓｅｆａｒ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｄｅｐｅｗ，ＮＹ，ＵＳＡ）に連続して通すことにより、３０〜２５μｍの大きさのビーズを選別した。第１のフィルターを通過したが、第２のフィルターに保持されたビーズを回収し、製品資料（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａプロトコール＃７１７００６００ＡＰ）に記載されているように活性化した。増幅されるべき鋳型のセンス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端に対応する２つの異なるアミン標識ＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）長鎖捕捉プライマーを得た（５’−アミン−３ ＨＥＧ スペーサーｇｃｔｔａｃｃｔｇａｃｃｇａｃｃｔｃｔｇｃｃｔａｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇｃｇｔｇｔｃ−３’；配列番号：１２；および５’−アミン−３ ＨＥＧスペーサーｃｃａｔｔｃｃｃｃａｇｃｔｃｇｔｃｔｔｇｃｃａｔｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃ−３’；配列番号：１３）（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）。これらのプライマーは、両端配列決定、すなわち、増幅産物の第１の鎖および第２の鎖を配列決定することを可能にするために増幅産物の両鎖を捕捉するように設計された。これらの捕捉プライマーを２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ８．０に溶解することにより、最終濃度１ｍＭを得た。３マイクロリットルの各プライマーを、ふるいにかけられた３０−２５μｍビーズに結合した。次いで、そのビーズをビーズ保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０２％Ｔｗｅｅｎおよび０．０２％アジ化ナトリウム，ｐＨ８）中で保存した。ビーズを血球計算板（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ，ＵＳＡ）で定量し、必要になるまで４℃で保存した。
（実施例１３：ＰＣＲ反応混合物の調製および作製）
任意の単一分子増幅技術と同様に、他の実験からの外来または残留のアンプリコンによる反応物の汚染は、配列決定試行を干渉し得る。汚染の確率を低下するために、ＰＣＲ反応混合物を、ＰＣＲクリーンルームに配置されたＵＶ処理層流フード内で調製した。各６００，０００ビーズエマルジョンＰＣＲ反応に対して、以下の試薬を１．５ｍｌチューブ中で混合した：２２５μｌの反応混合物（１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、１ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ、０．００３Ｕ／μｌ熱安定ＰＰｉ−ａｓｅ（ＮＥＢ）、０．１２５μＭフォワードプライマー（５’−ｇｃｔｔａｃｃｔｇａｃｃｇａｃｃｔｃｔｇ−３’；配列番号：１４）および０．１２５μＭリバースプライマー（５’−ｃｃａｔｔｃｃｃｃａｇｃｔｃｇｔｃｔｔｇ−３’；配列番号：１５）（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）および０．２Ｕ／μｌＰｌａｔｉｎｕｍ Ｈｉ−Ｆｉ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。２５マイクロリットルの反応混合物を取り出し、ネガティブコントロールとして使用するために個別の２００μｌＰＣＲチューブに保存した。反応混合物とネガティブコントロールの両方を必要になるまで氷上に保存した。
（実施例１４：ＤＮＡ捕捉ビーズへの鋳型種の結合）
配列決定用のクローンＤＮＡ増幅の成功は、各ビーズへの制御された数の鋳型種の送達に関係する。本明細書以下に記載する実験について、代表的な標的鋳型濃度を１捕捉ビーズあたり０．５鋳型コピーと決めた。この濃度では、ポアソン分布により、ビーズの６１％が関係のない鋳型を有し、３０％が鋳型の１つを有し、９％が２つ以上の鋳型種を有すると規定される。過剰量の種の送達は、結合およびその後の単一ビーズ上の混合集団（２種以上）の増幅をもたらし得、意味のある配列データの生成を妨げる。しかしながら、種の送達が少なすぎると、鋳型を含むウェルが少なくなり（１ビーズあたり１種）、配列決定の網羅の程度が低下する。その結果として、一本鎖ライブラリ鋳型濃度は重要であると考えられた。
鋳型核酸分子を、ＵＶ処理層流フード内で行われる以下の方法によってＤＮＡ捕捉ビーズ上の相補的プライマーにアニールした。ビーズ保存緩衝液（上の実施例９を参照のこと）に懸濁した６０万個のＤＮＡ捕捉ビーズを２００μｌＰＣＲチューブに移した。そのチューブを卓上小型遠心機にて１０秒間遠心し、１８０°回転させて、さらに１０秒間遠心することにより、確実にペレット形成させた。上清を除去し、ビーズを２００μｌのアニーリング緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５および５ｍＭ酢酸マグネシウム）で洗浄した。チューブを５秒間ボルテックスすることにより、ビーズを再懸濁し、そのビーズを先のようにペレットにした。ビーズの上の約１０μｌの上清以外すべてを除去し、さらに２００μｌのアニーリング緩衝液を加えた。ビーズを再度５秒間ボルテックスし、１分間放置し、次いで、先のように沈殿させた。１０μｌの上清以外すべてを廃棄した。
次に、１．５μｌの３００，０００分子／μｌ鋳型ライブラリをビーズに加えた。そのチューブを５秒間ボルテックスすることにより内容物を混合し、ＭＪサーモサイクラーに予め作製しておいた、制御された変性／アニーリングプログラムによって、鋳型をビーズにアニールした。そのプログラムにより、８０℃で５分間のインキュベーション、次に０．１℃／秒で７０℃に低下させ、７０℃で１分間インキュベーション、０．１℃／秒で６０℃に低下させ、６０℃で１分間保持、０．１℃／秒で５０℃に低下、５０℃で１分間保持、０．１℃／秒で２０℃に低下させ、２０℃で保持を行うことができた。アニーリングプロセスの完了後、サーモサイクラーからビーズを取り出し、先のように遠心し、アニーリング緩衝液を慎重にデカントした。捕捉ビーズは、各ビーズに結合した平均０．５コピーの一本鎖鋳型ＤＮＡを含んでおり、必要になるまで氷上で保存した。
（実施例１５：乳化）
乳化プロセスにより、１マイクロリットルあたり１０，０００個の分散したＰＣＲマイクロリアクターを含む熱安定性の油中水エマルジョンを作製する。これは、単一分子のためのマトリクスとして働き、標的ライブラリの個別分子のクローン増幅が達成される。単一反応のための反応混合物およびＤＮＡ捕捉ビーズを以下の様式において乳化した。ＵＶ処理した層流フード内で、２００μｌのＰＣＲ溶液（実施例１０から）を、６００，０００個のＤＮＡ捕捉ビーズ（実施例１１から）を含むチューブに加えた。そのビーズを、ピペッティングを繰り返すことにより再懸濁した。この後、ＰＣＲ−ビーズ混合物を室温で少なくとも２分間インキュベートして、ビーズをＰＣＲ溶液で平衡化させた。同時に、４５０μｌのエマルジョンオイル（ライトミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）中、４．５％（ｗ：ｗ）Ｓｐａｎ８０、１％（ｗ：ｗ）Ａｔｌｏｘ４９１２（Ｕｎｉｑｅｍａ，Ｄｅｌａｗａｒｅ））を、１／４インチの滅菌磁気攪拌棒（Ｆｉｓｃｈｅｒ）を含む蓋が平らな２ｍｌ遠心分離チューブ（Ｄｏｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に分注した。次いで、このチューブを特注のプラスチックチューブ保持用ジグに置き、次いで、４５０ＲＰＭに設定されたＦｉｓｈｅｒ Ｉｓｏｔｅｍｐデジタル撹拌ホットプレート（ｄｉｇｉｔａｌ ｓｔｉｒｒｉｎｇ ｈｏｔｐｌａｔｅ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中央に置いた。
ＰＣＲ−ビーズ溶液を１５秒間ボルテックスすることにより、ビーズを再懸濁した。次いで、その溶液を、プラスチック安全注射針（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ）を取り付けた１ｍｌ使い捨てプラスチックシリンジ（Ｂｅｎｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）に引き入れた。そのシリンジを、水平ではなく垂直に向いたアルミニウムベースユニットを備えたシリンジ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）に置いた（図３０）。エマルジョンオイルを含むチューブを、プラスチック注射針の中央下に位置するように撹拌プレート上に並べ、磁気攪拌棒を適性に撹拌した。そのシリンジポンプは、５．５ｍｌ／時で０．６ｍｌに分配するように設定した。ＰＣＲ−ビーズ溶液をエマルジョンオイルに滴下した。回転するオイル中に落ちるときに、液滴がチューブの端に接触しないように注意を払った。
一旦、エマルジョンが形成されたら、乳化プロセスと乳化後の分注工程の両方の間、エマルジョンの振動を最小限にするように多大な注意を払った。ボルテックス、激しいピペッティングまたは過剰な混合は、エマルジョンを破壊し、分散したマイクロリアクターを破壊し得ることが見出された。エマルジョンを形成する際、２種類の溶液は、マヨネーズの粘度を有する均一な乳白色の混合物に変化した。シリンジの内容物を回転するオイル中に添加した。ついで、エマルジョンチューブを保持用ジグから取り出し、エマルジョンの上部の任意の残留油層が消失するまで、人差し指で軽くはじいた。そのチューブを再度、保持用ジグに置き、磁気攪拌棒でさらに１分間撹拌した。磁性回収ツールをチューブの外側に沿って用いて、攪拌棒をエマルジョンから除去し、その攪拌棒を廃棄した。
２０マイクロリットルのエマルジョンを、Ｐ１００ピペッターを用いてチューブの中央から取り出し、顕微鏡用スライドに載せた。大きいピペットチップを使用して、剪断力を最小限にした。エマルジョンを５０×倍率で観察することにより、このエマルジョンが、オイル中において、ＰＣＲ溶液の直径３０〜１５０ミクロンのマイクロリアクターでの単一のビーズによって主に構成されていることを確認した（図３３）。目視検査後、エマルジョンをすぐに増幅した。
（実施例１６：増幅）
エマルジョンを７〜８本の別個のＰＣＲチューブに分注した。各チューブは、約７５μｌのエマルジョンを含んでいた。そのチューブを密閉し、上で記載した２５μｌのネガティブコントロールとともにＭＪサーモサイクラーにおいた。以下のサイクル時間を用いた：９４℃で４分間のインキュベーションを１サイクル（ホットスタートで開始）、９４℃３０秒および６８℃１５０秒のインキュベーションを３０サイクル（増幅）、９４℃３０秒および６８℃３６０秒のインキュベーションを４０サイクル（ハイブリダイゼーションおよび伸長）。ＰＣＲプログラムの完了後、チューブを取り出し、エマルジョンをすぐに破壊するか、反応物を、最長１６時間１０℃で保存し、その後破壊プロセスを開始した。
（実施例１７：エマルジョンの破壊およびビーズの回収）
増幅後、破壊（油相および水相の分離）に対して、乳化物を調べた。破壊されていないエマルジョンを単一の１．５ｍｌ微量遠心チューブに集め、偶発的に破壊されたエマルジョンを廃棄した。エマルジョンサンプルは、かなり粘稠性であったので、かなりの量が各ＰＣＲチューブに残存した。７５μｌのミネラルオイルを各ＰＣＲチューブに加え、混合物をピペッティングすることにより、チューブに残存しているエマルジョンを回収した。この混合物を、乳化材料のバルクを含む１．５ｍｌチューブに加えた。次いで、その１．５ｍｌチューブを３０秒間ボルテックスした。この後、そのチューブを、卓上微量遠心機において１３２００ｒｐｍ（最高速度）で２０分間遠心分離した。
遠心分離後、エマルジョンは、厚く白い界面を有する二相に分離した。透明な上の油相を廃棄し、濁った界面材料をチューブに残した。化学換気フード内で、１ｍｌのヘキサン類を下相および界面層に加えた。その混合物を１分間ボルテックスし、卓上微量遠心機において最高速度で１分間遠心分離した。上の油相／ヘキサン相を除去して廃棄した。この後、１ｍｌの８０％エタノール／１×アニーリング緩衝液を、残存している水相、界面およびビーズに加えた。この混合物を１分間または界面由来の白い物質が溶解するまでボルテックスした。次いで、そのサンプルを、卓上微量遠心機において最高速度で１分間遠心分離した。そのチューブを１８０°回転させ、再度、さらに１分間遠心分離した。次いで、上清を、ビーズペレットを乱さずに慎重に除去した。
白いビーズペレットを１ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有アニーリング緩衝液で２回洗浄した。洗浄溶液を廃棄し、各洗浄後、上に記載したとおりにビーズを沈殿させた。ペレットを１ｍｌのピコピュア水で洗浄した。先に使用した遠心−回転−遠心の方法を用いて、ビーズを沈殿させた。水相を慎重に除去した。次いで、ビーズを、中程度の設定で２秒間軽くボルテックスした後にペレットにして上清を除去する以外は、前と同様に１ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄した。
捕捉ビーズ上に固定されている、増幅されたＤＮＡを処理することにより、一本鎖ＤＮＡを得た。第２の鎖を、塩基性の融解溶液中でインキュベーションにより除去した。続いて、１ｍｌの融解溶液（０．１２５Ｍ ＮａＯＨ、０．２Ｍ ＮａＣｌ）をビーズに加えた。ペレットを、中程度の設定で２秒間ボルテックスすることにより再懸濁し、そのチューブを、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ ＬａｂＱｕａｋｅチューブ回転装置に３分間かけた。次いで、ビーズを上記のようにペレットにし、上清を慎重に除去し、廃棄した。残余融解溶液を、１ｍｌアニーリング緩衝液を加えることによって中和した。この後、ビーズを、中速度で２秒間ボルテックスした。ビーズをペレットにし、上清を前記したとおり除去した。遠心分離後に８００μｌのアニーリング緩衝液を除去すること以外のみ、アニーリング緩衝液による洗浄を繰り返した。ビーズおよび残余アニーリング緩衝液を０．２ｍｌＰＣＲチューブに移した。ビーズをすぐに使用するか、または濃縮プロセスを開始する前に最大４８時間まで４℃で保存した。
（実施例１８：任意のビーズ濃縮）
ビーズの集団は、増幅され、固定されたＤＮＡ鎖を有するビーズおよび空または無効のビーズを含んでいた。先に述べたように、増幅プロセスの間に、６１％のビーズが、鋳型ＤＮＡを有していないと計算された。鋳型ＤＮＡを有するビーズを選択的に単離するために濃縮を使用し、それにより、配列決定効率を最大限にした。濃縮プロセスは、以下に詳細に記載する。
実施例１４からの一本鎖ビーズを、遠心分離−回転−遠心分離方法により沈殿させ、できるだけ多くの上清を、ビーズを乱さずに除去した。１５マイクロリットルのアニーリング緩衝液をビーズに加え、その後、２μｌの１００μＭのビオチン化した４０塩基の濃縮プライマー（５’−ビオチン−テトラ−エチレングリコールスペーサーｃｃａｔｔｃｃｃｃａｇｃｔｃｇｔｃｔｔｇｃｃａｔｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃａｇ−３’；配列番号：１６）を加えた。そのプライマーは、ビーズに固定された鋳型の３’末端における増幅部位および配列決定部位をあわせた部位（各２０塩基長）に相補的であった。その溶液を、中程度の設定で２秒間ボルテックスすることにより混合し、ＭＪサーモサイクラーにおける制御された変性／アニーリングプログラムを用いて、濃縮プライマーを固定されたＤＮＡ鎖にアニールした。そのプログラムは、以下のサイクル時間および温度からなるものであった：６５℃で３０秒間のインキュベーション、０．１℃／秒で５８℃に低下、５８℃で９０秒間のインキュベーションおよび１０℃で保持。
プライマーがアニーリングしている間、穏やかに回転させることにより、Ｄｙｎａｌ ＭｙＯｎｅＴＭストレプトアビジンビーズを再懸濁した。次に、２０μｌのＭｙＯｎｅＴＭビーズを、１ｍｌの増強流体（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆｌｕｉｄ）（２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）を含む１．５ｍｌ微量遠心チューブに加えた。ＭｙＯｎｅビーズ混合物を５秒間ボルテックスし、チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓ磁石に置いた。常磁性ビーズは、微量遠心チューブの側面に沈殿した。ＭｙＯｎｅＴＭビーズを乱さずに、上清を慎重に除去、廃棄した。チューブを磁石から取り出し、１００μｌの増強流体を加えた。チューブを３秒間ボルテックスすることにより、ビーズを再懸濁し、必要になるまで氷上で保存した。
アニーリングプログラムが完了したら、１００μｌのアニーリング緩衝液を、ＤＮＡ捕捉ビーズおよび濃縮プライマーを含むＰＣＲチューブに加えた。そのチューブを５秒間ボルテックスし、内容物を新しい１．５ｍｌ微量遠心チューブに移した。捕捉ビーズに濃縮プライマーがアニールしたＰＣＲチューブを、２００μｌのアニーリング緩衝液で１回洗浄し、洗浄溶液を１．５ｍｌチューブに加えた。ビーズを１ｍｌのアニーリング緩衝液で３回洗浄し、２秒間ボルテックスし、上記のとおり沈殿させた。上清を慎重に除去した。３回洗浄した後、ビーズを１ｍｌの氷冷増強流体で２回洗浄した。ビーズをボルテックスし、ペレットにし、上清を上記のとおり除去した。ビーズを１５０μｌの氷冷増強流体に再懸濁し、ビーズ溶液を、洗浄したＭｙＯｎｅＴＭビーズに加えた。
ビーズ混合物を３秒間ボルテックスし、ＬａｂＱｕａｋｅチューブ回転装置において室温で３分間インキュベートした。ストレプトアビジンコートしたＭｙＯｎｅＴＭビーズを、ＤＮＡ捕捉ビーズ上に固定された鋳型にアニールしたビオチン化濃縮プライマーに結合させた。次いで、ビーズを２，０００ＲＰＭで３分間遠心し、その後、ビーズが再懸濁するまで２秒間のパルスでボルテックスした。再懸濁したビーズを５分間氷上に置いた。この後、５００μｌの冷増強流体をビーズに加え、チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓ磁石に挿入した。ビーズを、６０秒間乱さないまま放置することにより、磁石に対してペレットを生成させた。この後、過剰のＭｙＯｎｅＴＭおよび無効のＤＮＡ捕捉ビーズを含む上清を慎重に除去し、廃棄した。
チューブをＭＰＣ−Ｓ磁石から取り出し、１ｍｌの冷増強流体をビーズに加えた。軽く指ではじいてビーズを再懸濁した。このとき、激しい混合は、ＭｙＯｎｅＴＭとＤＮＡ捕捉ビーズとの間の結合を破壊し得るので、ビーズをボルテックスしないことが重要であった。ビーズを磁石に戻し、上清を除去した。すべての無効な捕捉ビーズを確実に除去するために、この洗浄をさらに３回繰り返した。アニールした濃縮プライマーおよびＭｙＯｎｅＴＭビーズを取り出すために、ＤＮＡ捕捉ビーズを４００μｌの融解溶液に再懸濁し、５秒間ボルテックスし、磁石によりペレットにした。濃縮されたビーズを含む上清を別の１．５ｍｌ微量遠心チューブに移した。濃縮されたビーズを最大限回収するために、融解溶液の第２の４００μｌアリコートを、ＭｙＯｎｅＴＭビーズを含むチューブに加えた。ビーズをボルテックスし、前記のとおりペレットにした。第２の洗浄からの上清を取りだし、濃縮されたビーズの第１の塊とあわせた。使用したＭｙＯｎｅＴＭビーズのチューブを廃棄した。
濃縮されたＤＮＡ捕捉ビーズの微量遠心チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓ磁石に置くことにより、任意の残余ＭｙＯｎｅＴＭビーズを沈殿させた。上清中の濃縮されたビーズを第２の１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、遠心した。上清を除去し、ビーズを１ｍｌのアニーリング緩衝液で３回洗浄することにより、残余融解溶液を中和した。３回目の洗浄の後、８００μｌの上清を除去し、残存しているビーズおよび溶液を０．２ｍｌ ＰＣＲチューブに移した。濃縮されたビーズを２，０００ＲＰＭで３分間遠心し、上清をデカントした。次に、２０μｌのアニーリング緩衝液および３μｌの２つの異なる１００μＭ配列決定プライマー（５’−ｃｃａｔｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃ−３’；配列番号：１７；および５’−ｃｃｔａｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇｃｇｔｇｔｃ−３’リン酸；配列番号：１８）を加えた。チューブを５秒間ボルテックスし、以下の４段階アニーリングプログラムに向けてＭＪサーモサイクラーに置いた：６５℃で５分間のインキュベーション、０．１℃／秒で５０℃に低下、５０℃で１分間インキュベーション、０．１℃／秒で４０℃に低下、４０℃で１分間保持、０．１℃／秒で１５℃に低下および１５℃で保持。
アニーリングプログラムの完了時に、ビーズをサーモサイクラーから取り出し、１０秒間遠心分離することにより、ペレットにした。チューブを１８０°回転させ、さらに１０秒間遠心した。上清をデカントして廃棄し、２００μｌのアニーリング緩衝液をチューブに加えた。５秒間ボルテックスすることにより、ビーズを再懸濁し、上記のとおり、沈殿させた。上清を除去し、ビーズを１００μｌのアニーリング緩衝液に再懸濁した。この時点で、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により、ビーズを定量した。ビーズは、４℃で保存し、少なくとも１週間は安定であった。
（実施例１９：二本鎖配列決定）
二本鎖配列決定に向けて、２種類の異なる配列決定プライマー；無修飾プライマーＭＭＰ７Ａおよび３’リン酸化プライマーＭＭＰ２Ｂｐを使用する。そのプロセスには、複数の工程がある。このプロセスを図３８に模式的に示す。
１．第１の鎖の配列決定。第１の鎖の配列決定は、所定のサイクル数の間、ヌクレオチドを連続的に加えることにより、ＤＮＡポリメラーゼが無修飾プライマーを伸長することを含む。
２．キャッピング：２５ｍＭトリシン、５ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｍａｎｇｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｍｇ／ｍｌ ＰＶＰ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎおよび２μＭの各ジデオキシヌクレオチドおよび２μＭの各デオキシヌクレオチドを含むキャッピング緩衝液を流すことにより、第１の鎖の配列決定を終結させた。
３．洗浄：２５ｍＭトリシン、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｍｇ／ｍｌ ＰＶＰ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎおよび８．５単位／Ｌのアピラーゼを含むアピラーゼ緩衝液を流し込むことにより、残留デオキシヌクレオチドおよび残留ジデオキシヌクレオチドを除去した。
４．切断：５単位／ｍｌの子ウシ腸管のホスファターゼを含む切断緩衝液を流すことにより、第２のブロックされたプライマーを修飾３’リン酸化プライマーの３’末端からリン酸基を除去することによって未ブロックとした。
５．継続：利用可能なプライマー部位すべてを捕捉するために、第２のブロックされていないプライマーを１０００単位／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼを流すことによるポリメラーゼの添加によって活性化した。
６．第２の鎖の配列決定：所定のサイクル数の間、ヌクレオチドを連続的に加えることによってＤＮＡポリメラーゼによる第２の鎖を配列決定した。
上記の方法を用いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡを配列決定した。結果を図３９に示す。第１の鎖の１５７７０リードおよび第２の鎖の１６０１５リードに基づいて、合計３１，７８５リードを得た。これらのうち、合計１１，７９９リードが対を成し、８１８７リードが対を成さなかったことから、総網羅率３８％が得られた。
リード長は、平均９５＋／−９塩基の６０〜１３０の範囲であった（図４０）。ゲノム範囲の分布および各ゲノム範囲のウェルの数を図４１に示す。このゲノム配列決定からの代表的なアライメントストリングを図４２に示す。
（実施例２０：鋳型ＰＣＲ）
３０ミクロンのＮＨＳセファロースビーズを、１ｍＭの以下のプライマーの各々と結合した：
ＭＭＰ１Ａ：ｃｇｔｔｔｃｃｃｃｔｇｔｇｔｇｃｃｔｔｇ（配列番号：１９）
ＭＭＰ１Ｂ：ｃｃａｔｃｔｇｔｔｇｃｇｔｇｃｇｔｇｔｃ（配列番号：２０）
ＰＣＲマスターミックスに１対１の体積比で５０μｌの洗浄されたプライマー結合ビーズを加えることによって、ビーズに向かうＰＣＲをＭＪサーモサイクラーにおいてチューブ中で行った。ＰＣＲマスターミックスは、以下のものを含んでいた：
１×ＰＣＲ緩衝液；
１ｍＭの各ｄＮＴＰ；
０．６２５μＭプライマーＭＭＰ１Ａ；
０．６２５μＭプライマーＭＭＰ１Ｂ；
１μｌの１単位／μｌＨｉＦｉＴａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；および
約５〜１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ（配列決定されるべきＤＮＡ）。
以下：９４℃３分のインキュベーション；９４℃３０秒、５８℃３０秒、６８℃３０秒のインキュベーションを３９サイクル；その後、９４℃３０秒および５８℃１０分のインキュベーション；９４℃３０秒、５８℃３０秒、６８℃３０秒のインキュベーションを１０サイクル；１０℃で保存のためにＭＪサーモサイクラーをプログラムすることによって、ＰＣＲ反応を行った。
（実施例２１：鋳型ＤＮＡ調製および配列決定プライマーのアニーリング）
実施例１からのビーズを蒸留水で２回洗浄し；１ｍＭ ＥＤＴＡで１回洗浄し、０．１２５Ｍ ＮａＯＨとともに５分間インキュベートした。これにより、ビーズに連結していないＤＮＡ鎖が除去された。次いで、そのビーズを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液で１回およびアニーリング緩衝液：２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、５０ｍＭ 酢酸Ｍｇ，ｐＨ７．５で２回洗浄した。次に、５００ｐｍｏｌの配列決定プライマーＭＭＰ７Ａ（ｃｃａｔｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃ；配列番号：２１）およびＭＭＰ２Ｂ−ｐｈｏｓ（ｃｃｔａｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇｃｇｔｇｔｃ；配列番号：２２）をビーズに加えた。そのプライマーをＭＪサーモサイクラーにおいて以下のプログラムでアニーリングした。：６０℃５分のインキュベーション；０．１℃／秒で５０℃に温度低下；５０℃５分のインキュベーション；０．１℃／秒で４℃に温度低下；４０℃５分のインキュベーション；０．１℃／秒で１０℃の温度低下。次いで、標準的なピロリン酸配列決定法を用いて鋳型を配列決定した。
（実施例２２：第１の鎖の配列決定および停止）
ビーズを５５μｍピコタイタープレート（ＰＴＰ）に３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。ＰＴＰを装置に置き、デノボ配列決定を用いて所定のサイクル数の配列決定を行った。第１の鎖をキャッピングすることにより、配列決定を停止した。１００μｌの１×ＡＢ（５０ｍＭ酢酸Ｍｇ，２５０ｍＭトリシン）、１０００単位／ｍｌのＢＳＴポリメラーゼ、０．４ｍｇ／ｍｌの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、１ｍＭのＤＴＴ、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、１０μＭの各ｄｄＮＴＰおよび２．５μＭの各ｄＮＴＰを加えることにより、第１の鎖をキャッピングした。次いで、過剰なヌクレオチドを除去するために、１×ＡＢ、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＶＰ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１２５単位／ｍｌのアピラーゼを加えることにより、アピラーゼを流し、２０分間インキュベートした。
（実施例２３：配列決定に向けた第２の鎖の調製）
１００μｌの１×ＡＢ、０．１単位／ｍｌのポリヌクレオチドキナーゼ、５ｍＭのＤＴＴを加えることによって、第２の鎖を未ブロックとした。標準的なピロリン酸配列決定法（例えば、米国特許第６，２７４，３２０号、同第６２５８，５６８号および同第６，２１０，８９１号（これらは本明細書中で参考として援用される）に記載されているもの）を用いて、得られた鋳型を配列決定した。ピロリン酸配列決定およびこれらの実施例に記載する方法を用いて、１７４ｂｐのフラグメントを両端において配列決定した配列決定法の結果は、図１０Ｆに見ることができる。
（実施例２４：ピコタイタープレート上での核酸の配列解析）
実施例２に記載したように増幅した核酸を含むピコタイタープレートを灌流チャンバーに置いた。次いで、スルフリラーゼ、アピラーゼおよびルシフェラーゼをピコタイタープレートに送達する。
配列決定プライマーにより、図１１Ａ〜１１Ｄに示すような多型を有すると疑われる挿入断片へのＤＮＡ合成伸長が開始される。まず、洗浄溶液、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはαチオｄＡＴＰ（ｄＡＴＰアナログ）のうちの１つを灌流チャンバーに順次送達することによって、配列決定プライマーを伸長した。末端に付着したスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼは、配列決定反応の一部として遊離された任意のＰＰｉを検出可能な光に変換する。存在するアピラーゼは、任意の未反応のｄＮＴＰを分解する。光は、代表的にはファイバーイメージングバンドルに連結されたＣＣＤカメラによって３秒間（しかし、１−１００秒、例えば、２−１０秒も適当である）集め、その後、さらに洗浄溶液を灌流チャンバーに加えることにより、過剰なヌクレオチドおよび副産物を除去した。次いで、次のヌクレオチドをポリメラーゼとともに加えることにより、サイクルを繰り返した。
洗浄の間、集めた光像（ｌｉｇｈｔ ｉｍａｇｅ）をＣＣＤカメラからコンピュータに転送した。光の放射をコンピュータによって解析し、それを用いて、対応するｄＮＴＰが、伸長された配列プライマーに取り込まれたか否かを判定した。多型が疑われる部分を含む挿入断片の領域の配列が得られるまで、ｄＮＴＰおよびピロリン酸配列決定試薬の添加を繰り返した。
（実施例２５：ピコタイタープレート上でのＰＣＲ増幅）
ピコタイタープレート調製：さらなる実施形態において、ビーズに結合した一本鎖ライブラリをピコタイタープレートに直接分配し、次いで、各ビーズ上の核酸鋳型を増幅することにより（ＰＣＲまたは他の公知の増幅技術を用いて）、十分なコピー数の鋳型を生成させ、これらが、本明細書中で開示されるピロリン酸ベースの配列決定法において検出可能なシグナルを生成し得る。
（実施例２６：ＰＴＰ上での核酸の配列解析）
配列解析用およびコントロールとして使用した試薬は、４種類のヌクレオチドであり、０．１μＭのピロリン酸（ＰＰｉ）を基質溶液中に作製した。基質溶液とは、３００μＭのルシフェリンおよび４μＭのアデノシン５’−ホスホ硫酸、すなわちＡＰＳ（これらは、ＰＰｉ、ルシフェラーゼおよびスルフリラーゼを含む反応のカスケードについての基質である）の混合物のことをいう。この基質をアッセイ緩衝液中に作製した。酵素を検査するためおよびチャンバーを通過する試薬のバックグラウンドレベルを決定するために使用したＰＰｉの濃度は、０．１μＭであった。ヌクレオチドｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの濃度は、６．５μＭであり、αｄＡＴＰの濃度は、５０μＭであった。ヌクレオチドの各々をＤＮＡポリメラーゼであるＫｌｅｎｏｗと１００Ｕ／ｍＬの濃度で混合した。
例示した装置のフローチャンバーにＰＴＰを置き、そのフローチャンバーをＣＣＤカメラの表面板に接着させた。基質（３ｍｌ／分、２分）をチャンバーに流し通すことにより、ＰＴＰを洗浄した。この後、チューブが様々な試薬に挿入する位置に切り替えるようにプログラムされたアクチュエーターに接続したポンプにより、一連の試薬をチャンバーに流し通した。試薬の順序、流速およびフロー時間を決定した。カメラを、露光時間＝２．５ｓの高速撮影モードに設定した。
パッドから出力されるシグナルを、パッド内の全ピクセルにおける平均数として決定した。フレーム数は、実験中の経過時間に等しかった。グラフ化することにより、様々な試薬のフローを示した。
（実施例２７：ピコリットルスケールのＰＣＲ反応用のプレートベースのプラットホーム）
（材料および方法）
他に明記しない限り、通常の実験室用の化学物質すべては、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）またはＦｉｓｈｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。
ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ（２５×７５×２ｍｍ）を、以前に報告されている（Ｐａｎｔａｎｏ，Ｐ．ａｎｄ Ｗａｌｔ，Ｄ．Ｒ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １９９６，８，２８３２−２８３５）様式と同様の様式で光ファイバー表面板の異方性エッチングにより作製した。プレートを、３つの異なるマイクロウェルの深さ、すなわち、２６、５０および７６μｍにエッチングした。マイクロウェルの中心間の間隔は、５０μｍであり、ウェルの直径は、３９〜４４μｍ（図１４を参照のこと）の範囲であり、算出されたウェルの密度は、４８０ウェル／ｍｍ２であった。
オリゴヌクレオチドプライマーの固相固定：１ｍｌのＮＨＳ−活性化セファロースＨＰアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に充填されたビーズをカラムから取り出し、製造者の指示書（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａプロトコール＃７１７００６００ＡＰ）に従って、活性化した。２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０中の１ｍＭのアミン−標識ＨＥＧ捕捉プライマー（５’−アミン−３ヘキサエチレングリコールスペーサーｃｃａｔｃｔｇｔｔｇｃｇｔｇｃｇｔｇｔｃ−３’；配列番号：２３）（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）の２５マイクロリットルをビーズに結合した。この後、３６μｍおよび２５μｍポアフィルターメッシュ片（Ｓｅｆａｒ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｄｅｐｅｗ，ＮＹ）に連続して通すことにより、３６〜２５μｍビーズを選別した。第１のフィルターを通過したが、第２のフィルターに保持されたＤＮＡ捕捉ビーズをビーズ保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．０２％Ｔｗｅｅｎ，０．０２％アジ化ナトリウム，ｐＨ８）中に回収し、血球計算板（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）を用いて定量し、必要になるまで４℃で保存した。
試験ＤＮＡフラグメントの生成：増幅試験フラグメントを市販のアデノウイルス血清型５ベクターであるｐＡｄＥａｓｙ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。二連ＰＣＲプライマー（その５’末端は、２０塩基の増幅領域およびアデノウイルスゲノムの特異的な領域に相補的な２０塩基の３’部分を含んでいる）を用いてフラグメントを増幅した。これらのプライマーを用いて、２つのフラグメントをアデノウイルスゲノムの１２９３３〜１３０７０位および５６５９〜５７６７位から増幅し、それぞれフラグメントＡおよびフラグメントＢという標識を割り当てた。
フラグメントＡについてのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列は、以下の通りであった。斜線（／）は、プライマーの２つの領域の間の分かれ目を示している：フォワード（５’−ｃｇｔｔｔｃｃｃｃｔｇｔｇｔｇｃｃｔｔｇ／ｃａｔｃｔｔｇｔｃｃａｃｔａｇｇｃｔｃｔ−３’；配列番号：２４−配列番号：２５）およびリバース（５’−ｃｃａｔｃｔｇｔｔｇｃｇｔｇｃｇｔｇｔｃ／ａｃｃａｇｃａｃｔｃｇｃａｃｃａｃｃ−３’；配列番号：２６−配列番号：２７）。フラグメントＢのプライマーは、以下を含んでいた：フォワード（５’−ｃｇｔｔｔｃｃｃｃｔｇｔｇｔｇｃｃｔｔｇ／ｔａｃｃｔｃｔｃｃｇｃｇｔａｇｇｃｇ−３’；配列番号：２８−配列番号：２９）およびリバース（５’−ｃｃａｔｃｔｇｔｔｇｃｇｔｇｃｇｔｇｔｃ／ｃｃｃｃｇｇａｃｇａｇａｃｇｃａｇ−３’；配列番号：３０−配列番号：３１）。
反応条件は、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１μＭの各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、０．１Ｕ／μｌのＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および５０ｎｍｏｌの鋳型ＤＮＡを含んでいた。９４℃３０秒、５６℃３０秒および７２℃９０秒のインキュベーションを３５サイクルというＰＣＲプログラムによって両方の鋳型を増幅した。ＰＣＲプライマーを含んだ状態の増幅されたフラグメントの全長は、フラグメントＡについて１７８ｂｐであり、フラグメントＢについて１４８ｂｐであった。
蛍光プローブを作製するために、ビオチン化二本鎖蛍光プローブを、上で記載したようにｐＡｄＥａｓｙベクターからＰＣＲ増幅によって調製した。しかしながら、試験フラグメントとプローブプライマー領域との間のハイブリダイゼーションを防止するようにプライマー配列を変更した。さらに、両フラグメントに対するリバースプライマーに、５’ビオチンの後に３×ヘキサエチレングリコールスペーサーを利用することにより、一本鎖プローブの溶出の前にビーズへの生成物の固定が可能になる。
蛍光フラグメントＡプローブについてのフォワードプライマーの配列は、以下のとおりであった。斜線（／）は、プライマーの２つの領域の間の分かれ目を示す（５’−ａｔｃｔｃｔｇｃｃｔａｃｔａａｃｃａｔｇａａｇ／ｃａｔｃｔｔｇｔｃｃａｃｔａｇｇｃｔｃｔ−３’；配列番号：３２−配列番号：３３）。リバースプライマーの配列は、５’−ビオチン−３×ヘキサエチレングリコールスペーサー−ｇｔｔｔｃｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｃｔｃａｃｃｇａ／ａｃｃａｇｃａｃｔｃｇｃａｃｃａｃｃ−３’；配列番号：３４−配列番号：３５であった。フラグメントＢについてのプライマーは、以下のとおりであった：フォワード（５’−ａｔｃｔｃｔｇｃｃｔａｃｔａａｃｃａｔｇａａｇ／ｔａｃｃｔｃｔｃｃｇｃｇｔａｇｇｃｇ−３’；配列番号：３６−配列番号：３７）およびリバース（５’−ビオチン−３×ヘキサエチレングリコールスペーサー−ｇｔｔｔｃｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｃｔｃａｃｃｇａ／ｃｃｃｃｇｇａｃｇａｇａｃｇｃａｇ−３’；配列番号：３８−配列番号：３９）。
蛍光部分は、ヌクレオチド混合物から取り込まれた。このヌクレオチド混合物は、フラグメントＡに対して、０．２ｍＭのｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＣＴＰ、０．１５ｍＭのＴＴＰおよび０．０５ｍＭのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−ｄＵＴＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含んでいた。あるいは、フラグメントＢを増幅するために、０．２ｍＭのｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ＴＴＰ、０．１５ｍＭのｄＣＴＰおよび０．０５ｍＭのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７−ｄＣＴＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって蛍光生成物を精製した。続いて、ビオチン化ＤＮＡを、１×結合洗浄液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、室温にて２時間に亘って、１００μｌ（約８１０万個）のストレプトアビジンセファロース高性能ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させた。インキュベーション後、ビーズをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で３回洗浄し、２５０μｌの融解溶液（０．１２５Ｎ ＮａＯＨ／０．１Ｍ ＮａＣｌ）とともに２分間インキュベートし、一本鎖プローブをビーズから放出させた。
ビーズを卓上遠心機で軽く遠心分離することにより沈殿させ、その上清を、１．９μｌの氷酢酸を含む１．２５ｍｌの緩衝液ＰＢ（Ｑｉａｇｅｎ）で中和した。この混合物をＱｉａＱｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で再精製し、ＢｉｏＲａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてＴａｑＭａｎ定量により、精製プローブの濃度を測定した。
液相ＰＴＰＣＲを以下のとおり行った。単一の１４ｍｍ×４３ｍｍ ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭの個別のウェルにＰＣＲ反応混合物をロードした。このために、５００μｌのＰＣＲ反応混合物（１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）、１μＭのフォワードプライマー（５’−ｃｇｔｔｔｃｃｃｃｔｇｔｇｔｇｃｃｔｔｇ−３’；配列番号：４０）およびリバースプライマー（５’−ｃｃａｔｃｔｇｔｔｇｃｇｔｇｃｇｔｇｔｃ−３’；配列番号：４１）、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０、１Ｕ／μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．００３Ｕ／μｌの熱安定ピロホスファターゼ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）および算定５コピーのフラグメントＢ鋳型／ウェル）を１．５ｍｌ微量遠心チューブ中で混合した。そのチューブを十分にボルテックスし、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ充填カートリッジを組み立てるまで氷上で保存した。
研究室内で作製したＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ充填カートリッジを、２つのプラスチッククリップでＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭに接着させ、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭの表面にしっかりとケイ素カートリッジガスケットを装着した（図２０を参照のこと）。ＰＣＲ反応混合物を１ｍｌの使い捨てシリンジに引き込み、シリンジの口を充填カートリッジのフローチューブに挿入した。流入口がカートリッジの底部に向くように充填カートリッジを末端に置き、ＰＣＲ混合物をゆっくりとチャンバーに充填した。充填している間、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭの透明な裏面を通して検査して、気泡が入らないような送達を確実に行った。
充填後、ＰＣＲ混合物を５分間インキュベートし、その時点で、反応混合物をＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ充填カートリッジから排出した。ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを充填カートリッジから取り出し、すぐに増幅チャンバーに置いた（図２１を参照のこと）。ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭの表面を０．２５ｍｍ厚のＳｉｌｐａｄ Ａ−２０００ ケイ素シート（Ｔｈｅ Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈａｎｈａｓｓｅｎ，ＭＮ）で覆った。この上部に、２５ｍｍ×７５ｍｍの標準的なガラス顕微鏡用スライド（Ｆｉｓｈｅｒ）を置いた。独立気泡発泡断熱パッド（ｃｌｏｓｅｄ ｃｅｌｌ ｆｏａｍ ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ ｐａｄ）（Ｗｉｃｋｓ Ａｉｒｃｒａｆｔ Ｓｕｐｐｌｙ，Ｈｉｇｈｌａｎｄ，ＩＬ）をその顕微鏡用スライドの上に置いた。６本の２５ｍｍのボルトによって、チャンバーの底部にアルミニウム製の蓋を密着させて、増幅チャンバーを密閉した。
密閉したら、Ｆｌａｔ Ｂｌｏｃｋ Ａｌｐｈａ Ｕｎｉｔを装着したサーモサイクラーＭＪ ＰＴＣ ２２５ Ｔｅｔｒａｄ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に増幅チャンバーを置いた。増幅プログラムは、９４℃３分のインキュベーション（ホットスタートで開始）、９４℃１２秒、５８℃１２秒、６８℃１２秒のインキュベーションを４０サイクル、１０℃での最終的な保持を含んでいた。ＰＣＲプログラムの完了後、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを増幅チャンバーから取り出し、充填カートリッジを再度接着させた。使い捨てシリンジを用いて、カートリッジチャンバーを１ｍｌのＨ２Ｏで満たし、室温１０℃で２０分間インキュベートした。
インキュベーションが完了した後、回収溶液を充填カートリッジから引き出し、１．５ｍｌ微量遠心チューブに移した。ｉＣｙｃｌｅｒ ＲｅａｌＴｉｍｅ ＰＣＲユニット（ＢｉｏＲａｄ）およびＦＡＭ標識レポータープローブ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を用いて、ＰＣＲ産物を定量した。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を０．３μＭのフォワードおよびリバースプライマー、０．１５μＭのＦＡＭ標識プローブと混合し、２７μｌの反応混合物を９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに加えた。
精製したフラグメントを用いて、検量線（１×１０９〜１×１０４分子／ウェルの範囲の６つの標準点）（３つ組で行ったもの）を作製した。ＰＣＲ増幅は、以下のパラメータを用いて行った：９４℃５分のインキュベーション（ホットスタート開始）、９４℃１５秒、６８℃４５秒のインキュベーションを６０サイクル、そして最終的に４℃で保持。ｉＣｙｃｌｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓソフトウェアバージョン２．３（ＢｉｏＲａｄ）を用いてデータを解析し、ｉＣｙｃｌｅｒデータおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いてＰＣＲ収量を定量した。
増幅の前に、以下に記載するような遠心分離によってＤＮＡ捕捉ビーズをＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭウェルに充填すること以外は溶相ＰＴＰＣＲと同様に、固相ＰＴＰＣＲを行った。さらに、ビーズ沈殿が完了した後に、ＰＣＲ混合物をマイクロウェルに充填した。洗浄工程の間、捕捉ビーズの保持を促進するために、固相実験では、５０μｍの深さのＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを利用した。そのＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを、研究室内で作製したプレキシガラスビーズ充填ジグに置いた。これは、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭが底部のＰｌｅｘｉｇｌａｓプレートと流入口および流出口を有するジグ上部プレートとの間に挟まれており、シリコンガスケットを介してプラスチックねじで密閉されること以外は、図２０に記載のＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ充填ジグと同様のものである。
１ビーズあたり５コピーの鋳型で８０℃にて３分間インキュベーションすることにより、鋳型ＤＮＡをＤＮＡ捕捉ビーズにプレアニールした後、そのビーズを１５分間室温に冷却した。次いで、ＰＣＲ反応混合物を充填する前に、そのビーズをＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭウェルに沈殿させた。１０万個のセファロースＤＮＡ捕捉ビーズ（ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ３ウェルあたり約１ビーズ）を含むビーズ充填緩衝液（４５０μｌ；１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ ＰＣＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０）を、ピペットを用いて、流入口の１つを介してジグに注入した。次いで、各流入口を環状の粘着性パッド（３Ｍ ＶＨＳ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）で密閉した。ジグは、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭのウェルが上を向くように保持し、ビーズ懸濁液で覆った。これを、マイクロタイターローターを用いたＡｌｌｅｇｒａ ６ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）において、室温にて２０００ｒｐｍで５分間遠心した。
遠心分離後、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭをジグから取り出した。溶相ＰＣＲについて記載したように、ＰＣＲ反応混合物をＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭに充填した。しかしながら、固相ＰＣＲ混合物では、鋳型は、ＤＮＡ捕捉ビーズにプレアニールしているので、鋳型を無視した。固相ＰＣＲ増幅プログラムは、固定プライマーの遅い動力学を補うために、さらなるハイブリダイゼーション／伸長サイクルを含んでいた。そのプログラムは、ホットスタート開始用の９４℃３分のインキュベーション、９４℃１２秒、５８℃１２秒、６８℃１２秒のインキュベーションを４０サイクル、続いて、ハイブリダイゼーションおよび伸長用の９４℃１２秒、６８℃１０分のインキュベーションを１０サイクルそして１０℃での最終的な保持を含んでいた。
ＰＣＲプログラムの完了時に、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを増幅チャンバーから取り出し、液相ＰＣＲについて記載したように１ｍｌのＨ２Ｏで洗浄した。次いで、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを、固定ＰＣＲ産物のハイブリダイゼーション検出のために調製した。
以下のとおり、蛍光標識したプローブを用いたハイブリダイゼーションを行った。ＰＴＰＣＲが完了した後、固定された鎖に相補的な鎖を除去した。このために、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ全体を、０．１２５ＭのＮａＯＨ中で室温にて８分間インキュベートした。この溶液を、５０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸ｐＨ７．５中での５分間の洗浄を２回することによって中和した。次いで、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを特注の８００μｌのハイブリダイゼーションチャンバーに置き、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、３．０％ＳＤＳ、２０×ＳＳＣ緩衝液は、３Ｍ ＮａＣｌ；０．３Ｍのクエン酸Ｎａ３である）で６５℃にて３０分間ブロッキングした。チャンバーの内容物を、プローブ：２０ｎＭ蛍光フラグメントＡ（Ａｌｅｘａ−４８８）およびフラグメントＢ（Ａｌｅｘａ−６４７）を含む新しいハイブリダイゼーション緩衝液で置換した。それらのプローブをそれらの標的にハイブリダイズさせた。オービタルシェーカー（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）上で２００ＲＰＭにて振盪しながらインキュベーションを６５℃で４時間行った。
ハイブリダイゼーション後、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３７℃にて１５分間洗浄し、続いて３７℃にて１×ＳＳＣで１５分間洗浄し、最後に３７℃にて０．２×ＳＳＣ中で１５分間の洗浄を２回行った。ハイブリダイゼーション後の洗浄の後、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを風乾させ、ＦＬＡ−８０００蛍光画像解析装置（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ）に置き、６３５ｎｍおよび４７３ｎｍの波長でスキャンした。得られた１６ビットのｔｉｆｆ画像をＧｅｎｅｐｉｘ４．０（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にインポートした。１００個の解析特徴のブロックを目的の領域に置き、６３５および４７３の蛍光強度を各特徴について記録した。次いで、さらなる解析のためにデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。
コントロールビーズを以下のとおり調製した。ビオチン化された試験鋳型ＡおよびＢを精製し、ストレプトアビジンセファロース高性能ビーズに固定されたｐＡｄＥａｓｙベクターからＰＣＲ増幅により調製し、「蛍光プローブの調製」に記載するように鎖を分離した。しかしながら、蛍光標識されたｄＮＴＰは、ＰＣＲ反応において省略した。沈殿したビーズをＴＥ緩衝液で３回洗浄し、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ上に沈着するまでＴＥ中で４℃にて保存した。
（結果）
ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ１ウェルあたり鋳型算出５コピーを含むＰＣＲマスターミックスをピコタイタープレートに充填することにより、液相増幅を行った。反応は、２６μｍ、５０μｍおよび７６μｍの深さのウェルを有するピコタイタープレートにおいて２つ組で行った。材料および方法に記載したように、ＰＴＰＣＲ増幅を４０サイクル行った。添加物を組み込むことにより、シリカ反応容器について日常的に報告されている有害な表面上の作用（Ｋａｌｉｎｉｎａ，Ｏ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，１９９９−２００４；Ｗｉｔｔｗｅｒ，ＣＴ．およびＧａｒｌｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９１，１０，７６−８３；Ｔａｙｌｏｒ，Ｔ．Ｂ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，３１６４−３１６８）を防止した。
反応混合物中に０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０ を含ませることにより、表面上の作用の軽減に効果的であるだけでなく、増幅も促進された。いずれかの試薬の相対的な濃度を低下させることは、増幅に対して負の作用を有していた。さらに、シリカ表面のポリメラーゼ−不活性化特性に起因して（Ｔａｙｌｏｒ，Ｔ．Ｂ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，３１６４−３１６８；Ｓｈｏｆｆｈｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｈｖｉｃｈｉａ，Ｇ．Ｅ．，Ｋｒｉｃｋａ，ＬＪ．およびＷｉｌｄｉｎｇ，Ｐ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６，２４，３７５−３７９）、高いＴａｑ濃度が有効であると証明された。１Ｕ／μｌ超の濃度が、アンプリコンの収量を増大するために最適であった。
ＰＴＰＣＲ後、各ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭからの溶液を回収し、各溶液の３つ組のサンプルをＴａｑＭａｎアッセイによって定量した。希釈した鋳型の検量線（１×ｌ０９から１０４分子の線形、ｒ２＝０．９９５）を用いて、増幅産物の濃度を決定した。増幅産物の量をＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ中のウェルの総数（３７２，３８０）で割ることにより、１ウェルあたりの増幅分子の数を得た。この数値を１ウェルあたりの開始時の鋳型濃度で割ることにより、１ウェルあたりの増幅量を算出した。ＰＴＰＣＲ増幅は、３９．５ｐｌウェルにおける２．３６×１０６倍から５０ｐｌウェルにおける１．２８×１０９倍の範囲の収量で、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭのすべてにおいて成功していた（下記の表２１を参照のこと）。
Figure 2009502202
 この表は、ＴａｑＭａｎアッセイによって測定されたＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭＰＣＲ増幅を示している。値は、２つ組のピコタイタープレートから得られた３つ組の測定値を反映している。（Ｎ＝６）；ＳＤ＝標準偏差。
収量は、ウェルの体積に影響された。ウェルの深さ５０μｍについて得られた最終生成物の濃度（１．４×１０−４Ｍ）は、ウェルの深さ７６μｍにおいて得られた値（６．５４×１０−５Ｍ）よりも有意に高く（ＡＮＯＶＡについてのｐ値＝０．０２３）、この両方は、ウェルの深さ２６μｍにおいて達成された収量（４．９６×１０−７Ｍ）よりも２桁大きかった。マイクロウェルの深さ５０μｍの収量は、費用と低体積ＰＣＲに関する利点とのバランスが最適であることを示した。この場合において、試薬の有効な濃度を最大限に上げることができ、低熱質量が達成されたが、表面と体積との比がなおも十分低いので、有害な表面上の作用が増幅効率を著しく低下させることを防ぐことができた。
様々なウェルの深さの各々において得られたＰＴＰＣＲ産物の最終濃度（４．９６×１０−７〜１．４×１０−４Ｍ）は、ＰＣＲのプラトー作用が起きる前に達成可能な最大濃度として代表的に報告されている１０−８Ｍの濃度（Ｓａｒｄｅｌｌｉ，Ａ．，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ １９９３，９，１−５）を超えていた。マイクロウェルの低体積から生じるより高い有効濃度のプライマーおよび鋳型分子によって、すべての反応効率が増大し、より高いモル濃度が達成されるまでプラトー相の開始を遅らせた。あるいは、高いポリメラーゼ濃度もまた、プラトー作用を遅延させる際に有用であると示されている（Ｋａｉｎｚ，Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２０００，１４９４，２３−２７；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３００，２８６−２９０）ので、この効果は、ＰＴＰＣＲ反応物中で使用されている高濃度のＴａｑによって引き起こされた。４０サイクルを超える増幅効率は、２６μｍ、５０μｍおよび７６μｍのウェルの深さそれぞれに対して、４４．３％、６８．９％および６７．５％であり、それにより、アンプリコンの高い最終濃度が提供された。最大収量は、５０μｍのウェルの深さで観察された。しかしながら、サイクル数の最適化は成されなかったことを認識しておくべきである；同様の増幅収量がもっと少ないサイクル数で達成された可能性があり、これにより、ＰＴＰＣＲ増幅の効率を増大できた可能性がある。
有効な１コピーの一本鎖ＤＮＡフラグメントから開始し、蛍光プローブハイブリダイゼーションによって検出される、特定のビーズに固定されたＤＮＡアンプリコンで終了するクローン固相ＰＴＰＣＲについての実験上のストラテジーを図２２に示し、下に詳細を記載する：
ステージ１：ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭの各ウェルは、一本鎖鋳型分子（本明細書中に示すように、一本鎖であり、かつ、ＤＮＡ捕捉ビーズに結合しているか、または溶液中に遊離して浮遊している）、溶液中のフォワード「Ｆ」（赤色）プライマーおよびリバース「Ｒ」（青色）プライマー（Ｒプライマーは、ＤＮＡ捕捉ビーズに結合している）からなるＰＣＲ反応混合物を含む。液相プライマーは、Ｆプライマーが過剰な状態で８：１のモル比で存在している。矢印は、５’から３’へのＤＮＡの向きを示している。
ステージ２：最初の熱サイクルにより、ＤＮＡ鋳型が変性し、溶液中のＲプライマーが鋳型分子上の相補的な領域に結合する。熱安定ポリメラーゼより、プライマー部位で伸長を開始し（破線）、次のサイクルにおいて、液相の指数関数的増幅が生じる。ビーズに固定されたプライマーは、このステージでは、増幅に大きく貢献していると考えられない。
ステージ３：初期ＰＣＲ。初期の指数関数的増幅（１〜１０サイクル）の間、溶液中にＦプライマーが過剰に存在しているにもかかわらず、ＦおよびＲプライマーの両方が、鋳型を等しく増幅する。
ステージ４：中間相ＰＣＲ。サイクル１０から３０の間において、Ｒプライマーが枯渇し、指数関数的な増幅が停止する。次いで、反応は、非対称的な増幅相に入り、アンプリコン集団は、急速にＦ鎖が支配するようになる。
ステージ５：後期ＰＣＲ。３０〜４０サイクル後、非対称的な増幅が続き、溶液中のＦ鎖の濃度が上昇する。過剰なＦ鎖は、Ｒ鎖で捕捉されることなく、ビーズに固定されたＲプライマーにアニールし始める。熱安定ポリメラーゼは、アンプリコンの固定されたＲ鎖を合成するための鋳型としてＦ鎖を利用する。
ステージ６：終期ＰＣＲ。熱サイクルを継続することにより、ビーズに結合したプライマーにさらにアニーリングさせる。液相増幅は、このステージでは最小であり得るが、固定されたＲ鎖の濃度は、上昇し続ける。
ステージ７：固定されたＲ鎖に相補的な固定されていないＦ鎖を、アルカリ変性により除去する。その時点で、ＤＮＡ捕捉ビーズは、アンプリコンの一本鎖Ｒ鎖によって占められている。
ステージ８：Ｒ鎖に相補的な蛍光標識されたプローブ（緑色の棒線）は、固定された鎖にアニールする。特定の鎖の配列に特異的なプローブを固有のフルオロフォアで標識することにより、所与のＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭウェル内で増幅された別々の鋳型の数に応じてある範囲の均質および不均質な蛍光シグナルが得られる。
初めに、ビオチン化したフラグメントＡまたはフラグメントＢの試験ＤＮＡフラグメントをストレプトアビジンセファロースビーズに結合し、そのビーズを５０μｍの深さのＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭに遠心分離によって充填し、フラグメントＡおよびフラグメントＢ断片に対して蛍光標識したプローブの混合集団をハイブリダイズすることによって、蛍光標識したプローブの特異性を確かめた。混合シグナルまたは非特異的なハイブリダイゼーションは、観察されなかった；フラグメントＡ生成物を有するビーズは、４８８ｎｍのシグナルを示したのに対し、フラグメントＢビーズは、６３５ｎｍのシグナルを示した（図２３Ａおよび２３Ｂを参照のこと）。図２３Ａおよび２３Ｂを詳しく調べると、フラグメントＢパッドにいくつかのフラグメントＡビーズが存在し、その逆も見られた。シグナルの純度がこれらの遊動ビーズによって示される場合、充填プロセスの間にいくらかの交差汚染の産物であるか、またはその後の洗浄工程の間に一方のパッドから他方に洗浄された可能性がある。
図２３Ｃに示すように、蛍光プローブにより、フラグメントＡ鋳型とフラグメントＢ鋳型の両方の固相ＰＴＰＣＲ増幅がうまく検出された。ハイブリダイズしたプローブによって生成されるシグナルは、プローブ内の色素の取り込みの相対的効率、等しくない量の鋳型ＤＮＡに対する反応物の感度、ならびに各ビーズ上に存在する増幅産物の総量および相対量に依存した。さらに、ＤＮＡ捕捉ビーズ上で生成され、保持される鋳型の量は、ウェルごとに変動する可能性があり、各ビーズに結合している捕捉プライマーの数もビーズの大きさの分布によって変動する可能性がある。結果として、プローブハイブリダイゼーションによって生じた正規化されていない比は、定量的データではなく半定量的データとみなされるべきである。にもかかわらず、ハイブリダイズしたプローブによって生成される蛍光シグナルは、均一なフラグメントＢシグナル（赤色）から均等に同質なフラグメントＡシグナル（緑色）までの範囲であり、２種類のシグナルの不均一な混合（黄色の程度）も同様に明らかであった。
コントロールによって示されるプローブの特異性、ならびにＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ上の相当数の同質の赤色および緑色のビーズに起因して、非特異的なプローブハイブリダイゼーションが不均一なシグナルを生じる可能性は低い。いずれかの鋳型の均質のビーズが近接していることにより、不均一なビーズは、増幅の間にウェル間のアンプリコンの漏出によって生じた可能性は低いことが示唆される；ウェル内のクロストークが原因である場合、いずれかの鋳型の均質なビーズの間に存在する不均一なビーズが見られ、また、通常、均質なシグナルがむらのある分布を示すと考えられる。逆に、鋳型分子が、マイクロウェルに遠心される前に元のビーズから解離し、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭの充填混合物中の新しいビーズに再アニールするか、またはＰＣＲ混合物がＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭに適用されるときに、１つのビーズから別のビーズに洗い流されるという可能性がある。鋳型ビーズの混合の原因に関係なく、ハイブリダイゼーションの結果は、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭのマイクロウェルにおけるＰＣＲ増幅は、十分な量の生成物をＤＮＡ捕捉ビーズにもたらし得ることにより、蛍光プローブハイブリダイゼーションおよび検出を可能にすることを示している。
（考察）
本実施例における結果から、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭベースのＰＣＲにより、ＤＮＡ増幅プロセスに関連する多くの因子（例えば、試薬コストの高さ、反応数の多さおよび反応時間の長さ）が解消され、ＰＣＲ技術における別の「漸進的な飛躍」をもたらしたことが示される。単一のＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ上のマイクロウェルは、最大３７０，０００個の別々の反応容器として機能し得、反応体積が３９．５ピコリットルという少なさであっても高収率（２．３×１０６〜１．２×１０９倍）の増幅が達成される。結果として、処理量が増大し、ＰＴＰＣＲについての総試薬コストが低下する；２６μｍまたは７６μｍの深さのＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ全体に含まれる反応体積は、それぞれ１５．３μｌおよび４３μｌである。ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭのサイズが大きくなると、さらに最大処理量が増大し得る。例えば、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭの面積が４０ｍｍ×７５ｍｍに増大すると、約１．４×１０６個の別々の反応容器がもたらされ、市販の９６ウェルＰＣＲプレート（８５．４７ｍｍ×１２７．８１ｍｍ）と同じ周囲長の面積を有するＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭは、５．２４×１０６ウェルもの数を含み得る。
液相ＰＣＲ増幅は、それが行われる数および体積に関係なく、産物が容易かつ効率的に回収され得ない限り、有用性に限界がある。パラレル（ｐａｒａｌｌｅｌ）ＰＣＲにおけるこれまでの試み（ｅｆｆｏｒｓｔｓ）（Ｎａｇａｉ，Ｈ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，１０４３−１０４７）では、液体の反応混合物の蒸発が必要であり、マイクロリアクターの壁に乾燥したアンプリコンが残存し、その後、さらなる操作のためにそれを回収することができた。本明細書中で開示する方法では、固相増幅の工程を含む、すなわち、ＤＮＡ捕捉ビーズにＰＣＲ産物を固定することによって、産物の回収に関する問題を回避している。従って、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭマイクロウェル反応の産物は、液相ＰＣＲ産物を含む３７０，０００ウェルではなく、固定されたＰＣＲ産物が結合している最大３７０，０００個のビーズである。これらのＰＣＲ産物は、何億に至る塩基を含む全ゲノムを配列決定する大規模な平行アプローチを支える潜在能力を備える、核酸を調べる多数の固相法に適している。開示した方法の単純さにより、大規模なクローニングおよびＰＣＲを維持するためのロボット工学を現在必要とする配列決定および他の応用法に対するコストが劇的に低減し得る。本発明の１つ以上の実施形態の開示は、添付の記述に示す。本明細書中に記載したものと同様であるかまたは等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、好ましい方法および材料を記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は、明細書の説明および特許請求の範囲から明らかである。明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈から明らかに他のものを示していない限り、単数形は、複数の指示物を含む。他に明記しない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。他に明記しない限り、本明細書中で使用または企図される技術は、当業者に周知の標準的な方法である。実施形態の例は、例示目的のみである。本明細書中に引用されるすべての特許および出版物は、参考として援用される。
（実施例２８：Ｒｉｇ配列決定法）
（工程１：ｐＡｄＥａｓｙ ＰＣＲ ＤＮＡビーズの調製）
この手順は、アデノウイルスクローンの３８４ウェルプレートＰＣＲを用いる。ストレプトアビジン−セファロースビーズ（１２ｍｌ）を、ＰＣＲフラグメントとの結合に向けて、２Ｍ ＮａＣｌ溶液で１回洗浄し、２８８ｍｌの２Ｍ ＮａＣｌで再懸濁することによって調製した。洗浄したビーズを、２００μｌビーズ懸濁液／ウェルで１５枚の９６ウェルプレートに移した。Ｔｅｃａｎ ＴｅＭｏロボットを用いて、ＰＣＲ産物（２５μｌ）を３８４深ウェルプレートに移した。固体支持体にＤＮＡを結合するために、Ｔｅｃａｎ ＴｅＭｏロボットを用いてすべての３８４深ウェルプレートの各ウェルに２５μｌのビーズ懸濁液（１５，０００ビーズ）を加え、混合した。結合反応物中のＮａＣｌの最終濃度は、１Ｍであった。結合反応物を室温で３時間、振盪機上で振盪しながらインキュベートした。レザバ上に３８４ウェルプレートを反転させ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ卓上遠心機において１０００ｇで遠心することにより、マイクロタイタープレートの内容物をプールした。プールされたビーズを５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、１０００ｇで遠心し、上清を除去した。
約１００万個のビーズ（可動性固体支持体）を１００μｌの２Ｍ ＮａＣｌで１回洗浄し、続いて蒸留水で２回（各１００μｌ）洗浄した。洗浄したビーズを３００μｌの融解試薬（０．１Ｍ ＮａＣｌおよび０．１２５Ｍ ＮａＯＨ）中で回転装置において１０分間インキュベートすることにより、ビオチン化されていないＤＮＡ鎖を除去した。そのチューブを最大速度で遠心分離することにより、ビーズを沈殿させ、融解溶液を除去し、廃棄した。そのビーズを１００μｌの融解溶液で洗浄し、続いて、１×アニーリング緩衝液で３回以上洗浄した。洗浄後、ビーズを２５μｌの１×アニーリング緩衝液に再懸濁した。
プライマーＰ２（５００ｐｍｏｌ）をビーズ混合物に加え、混合した。チューブ内のビーズ混合物を、以下の温度プロファイルを備えた自動恒温器（この場合、ＰＣＲサーモサイクラー）に置いた：６０℃５分のインキュベーション、０．１℃／秒で５０℃に低下、５０℃５分のインキュベーション、０．１℃／秒で４０℃に低下、４０℃５分のインキュベーション、０．１℃／秒で４℃に低下、４℃での永続的なインキュベーション。
アニーリング後、ビーズを慎重に洗浄し、２００μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ結合溶液に再懸濁した。次いで、１０μｌアリコート（５０，０００ビーズ）のビーズ懸濁液を、以下に記載する装置において配列決定用に処理した。
（工程２：コントロールＤＮＡビーズの調製）
６つのコントロールＤＮＡ配列ＴＦ２，７，９，１０，１２および１５をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターにクローニングし、プラスミドＤＮＡを、アンプリコンの固相固定のために一方のビオチン化プライマーを用いたＰＣＲ用の鋳型として使用した。
以下の試薬を１．７ｍｌチューブに加えることにより、ＰＣＲ混合物を作製した。
Figure 2009502202
 ２０マイクロリットルのプラスミド鋳型ＤＮＡを加え、その混合物を０．２ｍｌＰＣＲチューブに５０μｌずつ分注した。以下のプログラムを熱サイクリングに用いた：９４℃４分のインキュベーション；９４℃１５秒、５８℃３０秒、６８℃９０秒および６８℃１２０秒のインキュベーションを３９サイクル；１０℃で保持。
Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキットを製造者の指示書に従って用いて、各試験フラグメントについて増幅されたＤＮＡを精製した。試験フラグメントＤＮＡの各々の純度および収量を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＤＮＡ ５００試薬キットおよびチップを用いて評価した。ビオチン化ＰＣＲ産物をセファロースストレプトアビジンビーズに１０００万ＤＮＡコピー／ビーズで固定した。
ビーズを２Ｍ ＮａＣｌ溶液で１回洗浄した。この洗浄は、１００μｌを加え、軽くボルテックスしてビーズを再懸濁し、最大速度で１分間遠心することにより、ビーズを沈殿させ、次いで、上清を除去することにより行った。このあと、２Ｍ ＮａＣｌで第２の洗浄を行った。次いで、ビーズを３０μｌの２Ｍ ＮａＣｌに再懸濁した。ＰＣＲ産物をビーズに加えた。混合物をボルテックスすることによりビーズを溶液に再懸濁し、次いで、室温にて１時間速度７のタイタープレート振盪機上のラックに置いた。
ビオチン化されていない第２の鎖を、アルカリ融解溶液（０．１Ｍ ＮａＯＨ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ）とともに、オーバーヘッド回転装置において室温で１０分間インキュベーションすることにより除去した。このあと、ビーズを１００μｌの融解溶液で１回および１００μｌの１×アニーリング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸，ｐＨ７．５；５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で３回洗浄した。最大速度で１分間遠心分離することにより、配列決定プライマーを固定された一本鎖ＤＮＡにアニールさせた。上清を除去し、ビーズを２５μｌの１×アニーリング緩衝液に再懸濁した。次に、５μｌの配列決定プライマーＭＭＰ７Ａ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）をビーズ懸濁液に加え、以下の温度プロファイルを用いて、配列決定プライマーをハイブリダイズさせた：
６０℃５分のインキュベーション；
０．１℃／秒で５０℃に低下；
５０℃５分のインキュベーション；
０．１℃／秒で４０℃に低下；
４０℃５分のインキュベーション；
０．１℃／秒で４℃に低下；および
４℃で保持。
ビーズを１００μｌの１×アニーリング緩衝液で２回洗浄し、次いで、１×アニーリング緩衝液で最終体積２００μｌに再懸濁し、４℃冷蔵庫にて標識されたチューブストリップに１０μｌアリコートで保存した。
（工程３：配列決定化学）
固定された一本鎖ＤＮＡ鋳型およびアニールした配列決定プライマーを有するセファロースビーズを、２００μｌのＢｓｔポリメラーゼ結合溶液（２５ｍＭトリシン ｐＨ７．８；５ｍＭ酢酸マグネシウム；１ｍＭ ＤＴＴ；０．４ｍｇ／ｍｌ ＰＶＰ ＭＷ ３６０，０００）中のＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（５μｌの２．５μｇ／μｌ ｓｓｂ原液／５０，０００ビーズ）および５００Ｕ（１０μｌの５０Ｕ／μｌ）のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）とともに、回転装置上で室温にて３０分間インキュベートした。このあと、ＤＮＡビーズをＳＬビーズと混合し、以下のとおり、ピコタイタープレートのウェルに沈着させた。４５４装置における配列決定に必要な試薬は、１）基質洗浄溶液；２）アピラーゼ含有洗浄溶液；３）１００ｎＭの無機ピロリン酸較正標準；４）個別のヌクレオチド三リン酸溶液を含んでいた。
すべての溶液を、酵素基質（２５ｍＭトリシン ｐＨ７．８；５ｍＭ酢酸マグネシウム；０．４ｍｇ／ｍｌ ＰＶＰ ＭＷ ３６０，０００；０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０；３００μＭ Ｄ−ルシフェリン；４μＭ ＡＰＳ）を含むスルフリラーゼ−ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中に調製した。基質洗浄溶液は、ルシフェラーゼアッセイ緩衝液と同一であった。アピラーゼ含有洗浄溶液は、酵素基質（ＡＰＳおよびＤ−ルシフェリン）を加えない点以外はルシフェラーゼアッセイ緩衝液に基づき、この洗浄液は、最終濃度８．５Ｕ／ｌのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｓ，ＭＯ；Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ，Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を含んでいた。
ピロリン酸ナトリウム（ＰＰｉ）標準液は、ピロリン酸ナトリウム四塩基性十水和物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をルシフェラーゼアッセイ緩衝液に加えて、最終濃度１００ｎＭにすることにより調製した。ヌクレオチド三リン酸（ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰ；最小二リン酸グレード（ｍｉｎｉｍｕｍ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒａｄｅ））（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）をルシフェラーゼアッセイ緩衝液で最終濃度６．５μＭに希釈した。デオキシアデノシン三リン酸アナログである、２’−デオキシアデノシン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、Ｓｐ−異性体（Ｓｐ−ｄＡＴＰ−α−Ｓ，Ｂｉｏｌｏｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をルシフェラーゼアッセイ緩衝液で最終濃度５０μＭに希釈した。
（工程４：Ｈｉｓ６−ＢＣＣＰ−スルフリラーゼおよびＨｉｓ６−ＢＣＣＰ−ルシフェラーゼのクローニング）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＡＴＰスルフリラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．７．４）およびホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１３．１２．７）をＮｈｅ ｌ−ＢａｍＨＩ消化ｐＲＳＥＴ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質）遺伝子のコード配列（ＡｌｉｘＪ．Ｈ．，ＤＮＡ ８（１０），７７９−７８９（１９８９）；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｓ．およびＭｉｚｕｎｏ，Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１０），３９８２（１９８９），Ｊａｃｋｏｗｓｋｉ，Ｓ．ａｎｄ ＡＨｘ，Ｊ．Ｈ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄ．１７２（７），３８４２−３８４８（１９９０）；Ｌｉ，ＳＪ．およびＣｒｏｎａｎ，Ｊ．Ｅ．Ｊｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２），８５５−８６３（１９９２），Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ８０４５８）を用いて、ＰＣＲプライマーを設計することにより、ＢＣＣＰタンパク質のアミノ酸８７−１６５に対応するフラグメントを増幅させた。フォワードプライマーは、５’−ｃｔａｇｃｔａｇｃａｔｇｇａａｇｃｇｃｃａｇｃａｇｃａ−３’；配列番号４２であり、リバースプライマーは、５’−ｃｃｇｇｇａｔｃｃｃｔｃｇａｔｇａｃｇａｃｃａｇｃｇｇｃ−３’；配列番号４３であった。ＰＣＲカクテルを混合物１および混合物２として、各々２５μｌずつ調製した。混合物１は、７５ｐｍｏｌのプライマー、１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡおよび５μｍｏｌのｄＮＴＰを含んでいた。混合物２は、１単位のＦｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ７３２ ６４１）および５μｌの１０×Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｘｐａｎｄ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含んでいた。ＰＣＲホットスタートを可能にするために、混合物１および混合物２を併せる前に、それらを別々に２０秒間９６℃に加熱した。併せた反応物を以下のとおりサイクル反応を行った：９６℃３分のインキュベーション、９６℃３０秒、５５℃１分および６８℃２分のインキュベーションを１０サイクル、次いで、９６℃３０秒、６０℃１分および６８℃２分のインキュベーションを２０サイクル、その後、７２℃７分のインキュベーションのポリッシング工程。ＰＣＲの後、単一の２５０ｂｐフラグメントが得られた。ＢＣＣＰフラグメントをＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ消化ｐＲＳＥＴ−Ａにサブクローニングした。
（工程５：スルフリラーゼおよびルシフェラーゼの発現）
Ｂｓｔ ＡＴＰスルフリラーゼおよびＰ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼオープンリーディングフレームを、それぞれＰｓｔ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位およびＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位（第１の酵素は、５’末端であり、第２の酵素は、３’末端である）を含むプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。これにより、６×ＨｉｓおよびＢＣＣＰドメインとＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼとのＮ−末端融合がもたらされた。これらの酵素を、ビオチン補充増殖培地を用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させることにより、ＢＣＣＰドメインを介したインビボにおけるビオチン化が可能になった。ＩＭＡＣとサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを組み合わせることにより、これらの酵素を均質近くまで精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ２００Ｐｌｕｓチップ上でＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いた電気泳動によって精製を評価した。
（工程６：ルシフェラーゼおよびスルフリラーゼの固相固定）
上記の酵素を、それぞれＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼと１：３混合物のインキュベーションにより、Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０ストレプトアビジンコート磁気微小粒子（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）およびＢａｎｇｓマイクロスフェア（３００ｎｍ）に固定した。この結合は、ＴＡＧＥ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 ｐＨ７．８，２００ｍＭ硫酸アンモニウム，１５％ｖ／ｖ グリセロールおよび３０％ｖ／ｖエチレングリコール）中で、５０μｇのＡＴＰスルフリラーゼおよび１５０μｇのルシフェラーゼと１ｍｇのＤｙｎａｌ Ｍ−２８０ビーズまたは０．６ｍｇのＢａｎｇｓマイクロスフェアとを混合することによって行った。混合物を４℃で１時間、回転装置上でインキュベートした。結合した後、ビーズは、酵素溶液中で３ヶ月間、−２０℃にて保存可能であった。使用前に、ビーズを、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液で十分に洗浄した。固定された酵素の活性をルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて測定した。ＰＴＰスライド上に沈着するまで、洗浄したビーズを氷上で保存した。
（工程７：ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ（ＰＴＰ））
文献の記載と同様の様式で光ファイバー表面板を異方性エッチングすることにより、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ（２５×７５×２ｍｍ）を作製した。プレートを３つの異なるマイクロウェルの深さ、すなわち、２６ｍｍ、５０ｍｍおよび７６ｍｍにエッチングした。マイクロウェルの中心間の間隔は、５０μｍであり、ウェルの直径は、３９〜４４μｍの範囲であり、算出されたウェル密度は、４８０ウェル／ｍｍ２であった。
（工程８：ＰＴＰ充填）
ＤＮＡ鋳型を有するセファロースビーズならびに固定されたスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ酵素を有するＤｙｎａｌ Ｍ−２８０／Ｂａｎｇｓ０．３μｍビーズ混合物を、遠心分離ベースの方法を用いて、ピコタイタープレートの個別のウェルに沈着させた。この手順では、底部のプレート（スライドの位置を決めるペグを有する）、エラストマー密閉ガスケットおよび２つの充填口を有する頂部のプレートを備えた、研究室で作製したポリカーボネート固定具（ジグ）を使用した。ＰＴＰスライドは、エッチングされた側が上向きにした底部のプレート上に置き、頂部プレートを定位置の密閉ガスケットとともにＰＴＰスライドの上に固定した。水密にするために、組み立て物全体を４つのプラスチックねじで固定した。密閉ガスケットは、ビーズ沈着物に対するマスクを形成して、およそ２７０，０００ＰＴＰウェルを網羅する１つの六角形領域（１４×４３ｍｍ）を得るように設計した。
順に層をなすようにビーズを沈着させた。ビーズ洗浄緩衝液中でのインキュベートからＰＴＰを取り出した。ＤＮＡと酵素ビーズとの混合物である層１を沈着させた。遠心分離後、層１の上清をＰＴＰから吸引除去し、Ｄｙｎａｌ酵素ビーズの層２を沈着させた。
１２０μｌのｓｓｂ／Ｂｓｔ ｐｏｌ結合混合物（上記を参照のこと）中の１５０，０００個のＤＮＡ保持セファロースビーズと、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む総体積５００μｌのルシフェラーゼアッセイ緩衝液中の２７０μｌのＤｙｎａｌ−ＳＬおよびＢａｎｇｓ−ＳＬビーズ（両方とも１０ｍｇ／ｍｌ）とを混合することによって、ビーズ懸濁液を調製した。ビーズスラリーをボルテックスし、ピペット口を介してビーズ沈着ジグに流し込んだ。気泡が入らないように注意した。４位置プレートスイングローターを装着したＢｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６遠心分離機において、ジグ／ＰＴＰ組み立て物を２０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。遠心分離後、上清を、ピペットを用いてジグチャンバーから慎重に除去した。Ｄｙｎａｌ−ＳＬビーズのみの第２の層を沈着させた。この層は、１．５ｍｌチューブ内に１２５μｌのＤｙｎａｌ−ＳＬ（１０ｍｇ／ｍｌ）および３７５μｌのビーズ洗浄緩衝液を含んでいた（２．５ｍｇ／ｍｌのＤｙｎａｌビーズ）。Ｄｙｎａｌビーズ混合物をＰＴＰ主活性領域（ｍａｉｎ ａｃｔｉｖｅ ａｒｅａ）にピペットで入れ、２０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。層２の混合物を吸引し、配列分析装置にかける準備が整うまで、ＰＴＰをビーズ洗浄緩衝液（０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび８．５Ｕ／ｌのアピラーゼを含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液）に戻した。
（工程９：配列決定装置）
研究室内の配列決定装置は、３つの主要部：流体サブシステム、ＰＴＰカートリッジ／フローチャンバーおよびイメージングサブシステムを含んでいた。流体サブシステムは、試薬レザバ、試薬入口ライン、多弁多岐管および蠕動ポンプを備えていた。この流体サブシステムにより、フローチャンバーへの試薬の送達、すなわち、１つの試薬を一度に、予めプログラムされた流速および持続時間で送達することが可能となる。ＰＴＰカートリッジ／フローチャンバーは、ＰＴＰを取り付けた後に、ＰＴＰの頂部（エッチングしている側）およびチャンバーの天井との間に３００μｍの空間が存在し得るように設計した。このＰＴＰカートリッジ／フローチャンバーは、試薬およびＰＴＰの温度制御手段ならびに光を通さないハウジングを備えていた。ＰＴＰの研磨側をＰＴＰカートリッジの裏面に曝し、イメージングシステムと直接接触して置いた。イメージングシステムは、１−１イメージングファイバーバンドルを備えたＣＣＤカメラならびにそのカメラ用の極低温冷却システムおよびカメラ制御電子機器から構成された。使用したカメラは、Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ＬＭ４８５ ＣＣＤ（１６００万ピクセル、１５μｍピクセルサイズ）を備えたＳｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）シリーズ６００カメラであった。これをファイバー間隔６μｍでイメージングファイバーバンドルに直接接続した。このカメラを−７０℃に冷却し、フレーム転送モードで操作した。このように、ＣＣＤの中心部分は、イメージングのために使用したのに対し、ＣＣＤの外側の部分は、像の保存および読み出しに使用した。読み出しは、ＣＣＤの各角において４口を通して行った。データ取り込み速度は、３０秒あたり１フレームと設定した。フレーム転送シフト時間は、約０．２５秒であった。すべてのカメラ像を、コンピュータハードドライブ（ＩＢＭ ｅＳｅｒｖｅｒ ｘＳｅｒｉｅｓ ３３５，ＩＢＭ，Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ）上のＵＴＩＦＦ１６形式で保存した。
（工程１０：配列決定の実行条件）
ＰＴＰウェルへの配列決定試薬の周期的な送達およびウェルからの配列決定反応の副産物の洗浄は、流体システムの予めプログラムされた操作により達成された。そのプログラムは、試薬名（Ｗａｓｈ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＰＰｉ標準）、流速および各スクリプト工程の持続時間を特定するＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌスクリプトの形態で記載した。流速は、すべての試薬について３ｍｌ／分と設定し、フローチャンバー内の線速度は、およそのものであった。最初の洗浄工程（５分）に続いて、ＰＰｉ標準液のフロー（２分）、その後、（洗浄−Ｃ−洗浄−Ａ−洗浄−Ｇ−洗浄−Ｔ）を２１サイクルまたは４２サイクル（ここで、各ヌクレオチドのフローは、０．５分であり、洗浄工程は、２分であった）が続いた。ヌクレオチド添加および洗浄のすべてのサイクルの後、第２のＰＰｉ標準液のフロー（２分）を送達し、その後、最後に５分間の工程が続いた。実行総時間は、４時間であった。この実行スクリプトを完了するのに必要な試薬体積は、以下の通りであった：各洗浄溶液３００ｍｌ、各ヌクレオチド溶液５０ｍｌ、ＰＰｉ標準液２０ｍｌ。実行している間、すべての試薬を室温に維持した。フローチャンバーおよびフローチャンバー入口の管状材料が３℃に維持されていたので、フローチャンバーに入るすべての試薬は、３０℃であった。
（実施例２９．開放系微細加工高密度ピコリットルリアクターにおけるゲノム配列決定）
本発明者らは、最新式のキャピラリー電気泳動装置の未加工の処理量よりも著しく多い処理能力を備えた拡張可能で、高度にパラレルな配列決定システムを記載する。この装置は、１，６００，０００個の個別のウェルを含む新規の６０×６０ｍｍ２光ファイバースライドを使用し、２５００万塩基を４時間で９９％以上の精度で（ｐｈｒｅｄ２０）配列決定できる。配列決定鋳型を提供するために、本発明者らは、エマルジョンの液滴中のビーズ上でＤＮＡフラグメントをクローン増幅する。鋳型を有するビーズをウェルに充填することにより、各々をピコリットルスケールの配列決定リアクターに変えた。本発明者らは、固体支持体および小さい開放系のリアクターに最適化されたパイロシーケンスプロトコールを用いた合成により配列決定を行う。本明細書中で、本発明者らは、本装置の１回の試行において、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍゲノムを９６％の網羅率、９９．９６％の精度でショットガン配列決定およびデノボ構築（ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）によって、このシステムの有用性、処理量、精度および堅牢性を示す。
ＤＮＡ配列決定は、生物医学研究および医学の性質を劇的に変化させた。大量のＤＮＡを配列決定するために必要なコスト、複雑性および時間を低減すること（細菌および真核生物のゲノムを配列決定する能力の向上を含む）は、著しい科学的、経済的および文化的な衝撃を有し得る。全ゲノム配列決定を含む大規模配列決定プロジェクトでは、細菌ベクターへのＤＮＡフラグメントのクローニング、個別の鋳型の増幅および精製、その後の蛍光性の鎖停止ヌクレオチドアナログ（Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３３６（１９８７））およびスラブゲルまたはキャピラリー電気泳動のいずれかを用いたＳａｎｇｅｒ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４，５４６３（１９７７））が通常必要であった。現在、ヒトゲノムを配列決定するコストは、１０００万から２５００万ドルかかると見積もられている（ＮＩＨ Ｎｅｗｓ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００４年１０月１４日）。別の配列決定法が、報告されている（Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ，Ｂ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８，１７１（１９９３）；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２，８４（１９９６）；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｋ．Ｂ．ら、ＧＡＴＡ ８，２２３（１９９１）；Ｂａｉｎｓ，Ｗ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｃ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１３５，３０３（１９８８）；Ｊｅｔｔ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ７，３０１（１９８９））が、しかしながら、それらは、配列情報の主な生成元として細菌ベクターおよびＳａｎｇｅｒ配列決定法の使用に置き換わる技術ではなかった。
本明細書において、本発明者らは、集積システムについて記載し、そのシステムの処理量は、日常的に、全ゲノム配列決定を含む何百万塩基の配列情報を必要とする用途を可能にする。本発明者らは、ＤＮＡフラグメントをインビトロで単離および増幅するエマルジョンベースの方法（Ｔａｗｆｉｋ，Ｄ．Ｓ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，６５２（１９９８）；Ｇｈａｄｅｓｓｙ，Ｆ．Ｊ．，Ｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，４５５２（２００１）；Ｄｒｅｓｓｍａｎ，Ｄ．，Ｙａｎ，Ｈ．，Ｔｒａｖｅｒｓｏ，Ｇ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １００，８８１７（２００３））と、ピコリットルサイズのウェル内でピロリン酸ベースの配列決定法（「パイロシークエンシング」；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２，８４（１９９６）’；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．，Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１，３６３（１９９８））を行う加工された基板および装置とを同時に開発することに注目した。
代表的な試行において、本発明者らは、ｐｈｒｅｄ２０以上のクオリティスコア（９９％以上の精度を有すると予測される）で２５００万塩基超を生成する。このｐｈｒｅｄ２０のクオリティの処理量が、キャピラリー電気泳動によるＳａｎｇｅｒ配列決定法の処理量よりも著しく多いが、現在のところ、Ｓａｎｇｅｒ法よりも実質的にリードが短く、個別のリードの平均精度が低い（現在のＳａｎｇｅｒベースのキャピラリー電気泳動配列決定システムでは、１時間で、９６個のＤＮＡ鋳型の各々から９９．４％の平均のリードの精度で最大７００ｂｐの配列情報がもたらされるか、またはｐｈｒｅｄ２０以上のクオリティを有する状態で６７０００塩基／時間で実質的にすべての塩基がもたらされる；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔ，２００４））。本発明者らは、本システムの性能をさらに特徴付け、公知の細菌ゲノムＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（５８０ｋｂｐ）を配列決定し、本発明者らのショットガン配列決定法およびデノボ構築をこのゲノムについて最初に得られていた結果（Ｆｒａｓｅｒ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，３９７（１９９５）と比較することにより、比較的短いリードから新規に細菌ゲノムを構築することが可能であることを証明する。より大きい細菌ゲノム、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｔｅｔｔｅｌｉｎ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３，４９８（２００１）；２．１Ｍｂｐ）のショットガン配列決定およびデノボ構築の結果を表２８に示す。
（エマルジョンベースのサンプル調製）
本発明者らは、ゲノム全体を剪断し、限界希釈により単一のＤＮＡ分子を単離することによって、ＤＮＡフラグメントのランダムライブラリを生成する（補足的方法：ライブラリ調製）。詳細には、本発明者らは、ランダムにゲノム全体を断片化し、特殊な共通のアダプターをそのフラグメントに付加し、個別のフラグメントをクローン増幅する、それそれ自体のビーズ上かつエマルジョンの液滴内で個別のフラグメントを捕捉する（図４３Ａおよび４３Ｂ）。現在の配列決定技術とは異なり、本発明者らのアプローチは、細菌におけるサブクローニングまたは個別のクローンの操作の必要がない；鋳型は、エマルジョン内でまとめて処理される（Ｔａｗｆｉｋ，Ｄ．Ｓ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，６５２（１９９８）；Ｇｈａｄｅｓｓｙ，Ｆ．Ｊ．，Ｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，４５５２（２００１）；Ｄｒｅｓｓｍａｎ，Ｄ．，Ｙａｎ，Ｈ．，Ｔｒａｖｅｒｓｏ，Ｇ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １００，８８１７（２００３））。
（加工されたピコリットルサイズの反応容器内での配列決定）
本発明者らは、少量のウェルを利用するように作られた改変パイロシーケンスプロトコールを用いて、光ファイバースライドの開放系のウェルにおいて同時に合成することにより、配列決定を行った。光ファイバースライドは、光ファイバーの引延および溶融を繰り返すことによって得られる光ファイバーのブロックを薄く切ることによって作製される。各反復時に、個別のファイバーを横断面の大きさが大きくなっていくバンドルに六角形に詰めるにつれて、その個別のファイバーの直径を小さくしていく。各光ファイバーのコアは、２−３μｍのクラッディングで囲まれた直径４４μｍであり；各コアのエッチングにより、中心間の距離が５０μｍで深さ約５５μｍの反応ウェルがもたらされ（図４３Ｃ）、その結果、算出ウェルサイズは、７５ｐＬおよびウェル密度が４８０ウェル／ｍｍ２が生じる。約１６０万ウェルを含むスライド（Ｌｅａｍｏｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２４，３７６９（２００３））を、ビーズで充填し、配列決定試薬が貫流するウェル開口部の上に３００μｍの高さのチャネルを設けるように設計されたフローチャンバーに載せる（図４４、ＡおよびＢ）。スライドのエッチングされていない基板は、ＣＣＤセンサーに連結された第２の光ファイバーイメージングバンドルと光学的に接触しており、個別のウェルの底から放射された光子の捕捉が可能になる（図４４、Ｃおよび補足的方法：イメージングシステム）。
本発明者らは、３ビーズシステムを開発し、固体支持体上での高効率を達成するように成分を最適化した。ピコリットルサイズのウェルの組み合わせ、小さいビーズによって可能にされる酵素充填の均一性および増強された固体支持体化学により、合成による配列決定の有用なリード長を１００ｂｐに伸長する方法を開発することが可能となった（補足的方法：配列決定）。
フローチャンバーでは、周期的に送達される試薬は、ウェルに対して垂直に流れる。この配置により、開放系のウェル内の鋳型を有するビーズ上での同時伸長反応が可能となり、また、対流性および拡散性の輸送に依存することにより、試薬および副産物の添加または除去が制御される。ウェルへの拡散およびウェルからの拡散の時間の尺度は、現在の配置において、およそ１０秒であり、ウェルの深さおよびフローチャネルの高さに依存する。シグナル生成酵素的反応についての時間の尺度は、およそ０．０２〜１．５秒である（補足的方法：ウェル間の拡散）。現在の反応は、質量輸送作用によって支配されており、試薬のより速い送達に基づいた改良が可能である。ウェルの深さは、多くの競合する必要条件に基づいて選択された：（ｉ）ウェルは、ウェルを通り過ぎる対流性の輸送が存在するとき、ＤＮＡを有するビーズがウェル内に残存できる程度の深さである必要がある、（ｉｉ）ウェルは、その中で取り込みが生じているウェルから取り込みが生じていないウェルに副産物が拡散するのに対して適切な隔離を提供するのに十分な深さでなければならない、および（ｉｉｉ）ウェルは、ウェルへのヌクレオチドの迅速な拡散および各フローサイクルの終わりにおける残存ヌクレオチドの迅速な洗浄を可能にすることにより、配列決定処理量を上げ、試薬使用を減少させることができる程度に十分浅くなくてはならない。各ヌクレオチドのフローの後、ヌクレアーゼを含む洗浄液を用いて、次のヌクレオチドが導入される前に、いずれのウェルにもヌクレオチドが残存していないことを確実にする。
（個々のリード長の塩基コール（ｃａｌｌｉｎｇ））
ヌクレオチドの取り込みを、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の付随した放出および光子の生成によって検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２，８４（１９９６）’；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．，Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１，３６３（１９９８））。鋳型を有するビーズを含むウェルは、リードの始めに既知の４ヌクレオチド「キー」配列を検出することによって同定される（補足的方法：イメージ処理）。未加工のシグナルをバックグラウンド減算し、正規化し、補正した。取り込みがある場合、特定のウェルに対する各ヌクレオチドフローにおいて正規化したシグナル強度は、ヌクレオチドの数を示す。このシグナルの直線性は、長さ８の少なくともホモポリマーまで維持される（図５２）。合成による配列決定において、各ビーズ上に極少数の鋳型しか存在しない場合、その鋳型は、同調性を失う（すなわち、配列決定において、他のすべての鋳型を追い抜くか、後れをとるかのいずれかである；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，３（２００１））。この作用は、主に、ウェル内にヌクレオチドが残存すること（「持ち越し」の発生）または不完全な伸長に起因する。代表的には、本発明者らは、１〜２％の持ち越し率および０．１〜０．３％の不完全伸長を観察している。同調性の喪失が、より長いリード長で配列決定のクオリティを低下させる累積性の作用であるので、これらのシフトの補正は、不可欠である。本発明者らは、根底にある物理的現象の詳細なモデルに基づいて、個別のウェルにおいて生じている持ち越しおよび不完全伸長の量を測定し、補正することを可能にする、アルゴリズムを開発した（補足的方法：シグナル処理）。図４５は、１１３ｂｐのリード長により、下記で記載するＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｉｉｍの試行において生成された処理結果を示している。エマルジョンベースのサンプル調製の間に混入される人工産物から独立して、配列決定の性能および補正アルゴリズムの有効性を評価するために、本発明者らは、同一塩基が長く連なった配列決定しにくいストレッチ（ホモポリマー）を含む試験フラグメントを作製した（補足的方法：試験フラグメントおよび図４６）。これらの試験フラグメントを用いて、本発明者らは、個別のリードレベルにおいて、本発明者らが、１００ｂｐを超えるリード長において約９９．４％という塩基コールの精度を達成することを立証した（表２３）。
（ハイクオリティのリードおよびコンセンサスの精度）
塩基コールまたはリードのアライメントの前に、本発明者らは、配列決定されるゲノムまたは鋳型の先験的な知見に依存せずにハイクオリティなリードを選択する（補足的方法：ハイクオリティリード）。この選択は、クオリティの低いリードでは、ヌクレオチドが取り込まれていないフローと１つ以上のヌクレオチドが取り込まれたフローとの間を明確に区別できないシグナルの割合が高いという観察結果に基づく。塩基コールされるとき、個別のリードは、あいまいな値を有するシグナルのために誤りが生じ得る（図５１）。本発明者らのリードの有用性を向上させるために、本発明者らは、現在のＳａｎｇｅｒ配列分析装置によって使用されているｐｈｒｅｄスコア（Ｅｗｉｎｇ，Ｂ．，Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｌ．，Ｗｅｎｄｌ，Ｍ．Ｃ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｐ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８，１７５（１９９８））に類似した、リードの各塩基のクオリティ（または正しい塩基コールの確率）を最初から見積もることができる測定基準も開発した（補足的方法：クオリティスコアおよび図５４）。
より高いクオリティの配列は、本発明者らのシステムがもたらす高過剰なサンプリングを利用することおよびコンセンサス配列を構築することによって達成され得る。各ヌクレオチドフローにおける個別の塩基コールではなくシグナル強度を用いて、互いに対して配列をアラインすることにより、最適なアライメントを決定する（補足的方法：フロー−スペースマッピング；コンセンサス精度およびゲノム網羅率）。次いで、対応するシグナルを平均し、その後、塩基コールを行う。このアプローチにより、配列の精度が大いに向上し（図５３）、コンセンサス塩基のクオリティの推定が提供される。本発明者らは、そのクオリティ尺度をＺ−スコアと呼ぶ；これは、１つの位置におけるシグナルの拡散および平均シグナルと最も近い塩基コールの閾値との間の距離の尺度である。再配列決定およびデノボ配列決定の両方において、最小Ｚ−スコアが上昇するにつれて、コンセンサス精度も上昇するのに対し、網羅率は低下するのに対し；Ｚ−スコアが上昇するにつれて、排除された塩基の約半分が長さ４以上のホモポリマーに属する。Ｓａｎｇｅｒ配列分析装置は、通常、コンセンサス精度９９．９９％を達成するために、３つ以上の任意の塩基における網羅率の深さ（ｄｅｐｔｈ ｏｆ ｃｏｖｅｒａｇｅ）を求める。代表的なゲノムの固有の部分の網羅率９５％の最低３倍を達成するには、約７〜８倍の過剰なサンプリングが必要となる。本発明者らの高い誤判別率に起因して、本発明者らは、ゲノムの類似の部分に亘る比較可能なコンセンサス精度は、４以上の網羅率の深さによって達成されることを観察し、このことから、約１０〜１２倍の過剰なサンプリングが必要となる。
（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（５８０，０６９ｂｐ））
ＭｙｃｏｐｌａｓｍａゲノムＤＮＡを断片化し、上記のような配列決定ライブラリに調製した。（一人の人間によって４時間で完了した。）エマルジョンＰＣＲおよび６０×６０ｍｍ２光ファイバースライド上へのビーズ沈着（このプロセスを行うのに一人の人間で６時間を要した）の後、４ヌクレオチドの４２サイクルを配列決定システムの自動化された４時間の試行でその装置に貫流させた。その結果を表２９．２にまとめた。個別のリードのクオリティを測定するために、本発明者らは、フロー−スペースマッピングおよび他の塩基コール装置の精度を評価する際に以前に使用されたものと同様の基準（Ｅｗｉｎｇ，Ｂ．，Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｌ．，Ｗｅｎｄｌ，Ｍ．Ｃ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｐ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８，１７５（１９９８））を用いて、参照ゲノムに対して７０％のストリンジェンシーで各ハイクオリティリードをアライメントした。配列決定クオリティを評価する際、参照ゲノムにおける固有の位置にマッピングされたリードのみを含んだ。このプロセスは、反復領域を排除するので（ゲノムの部分であり、対応するフローグラムは、互いと７０％類似していた）、選択されたリードは、ゲノムを完全に網羅しなかった。図４６Ａは、この試行についてのリード長の分布を示している。平均リード長は、１１０ｂｐであり（４０倍の過剰なサンプル）、８４，０１１個のリード（２７．４％）が正確であった。図４６Ｂでは、平均誤判読を塩基の位置の関数としてまとめている。非反復領域の網羅率は、偏っていないサンプル調製およびエマルジョンと一致した（図５４）。個別のリードのレベルにおいて、本発明者らは、挿入および欠失エラー率約３．３％を観察し；置換エラーは、およそ０．５％というより低いエラー率を有する。いずれのＺ−スコア制限なしにこれらのリードを使用するとき、本発明者らは、コンセンサス精度９９．９７％で、１０個の隣接領域においてゲノムの９９．９４％を網羅した。ホモポリマーにおけるエラー率は、コンセンサス配列において著しく低い（図５３）。このコンセンサス配列（３６６ｂｐ）によってカバーされなかった塩基のすべてが、除外された反復領域に属していた。最小Ｚ−スコアを４に設定することにより、網羅率は、ゲノムの９８．１％に低下したのに対し、コンセンサス精度は、９９．９９６％に上昇した。本発明者らは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの全ゲノム配列決定をさらに８回繰り返すことにより、本システムの再現性をさらに実証し、８回の別個の装置試行の各々において、ゲノムの４０倍の範囲の網羅を達成した（表２７）。
本発明者らは、単一の試行に由来するＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのリードを平均長２２．４ｋｂｐを有する２５個のコンティグに構築した。これらのコンティグの１つを、６０ｂｐの崩壊したタンデム反復領域に起因して誤構築し、手動で訂正した。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの元の配列決定では、配列決定を完成するために使用したダイレクトシーケンスの前に２８個のコンティグを生じた（Ｆｒａｓｅｒ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，３９７（１９９５））。本発明者らの構築物は、ゲノムの９６．５４％を網羅し、９９．９６％のコンセンサス精度を達成した。解読不能な反復領域は、ゲノムの３％に達する：故に、本発明者らは、ゲノムの固有部分の９９．５％を網羅したことになる。コンティグ間の１６個の切断は、解読不能な反復領域に起因し、２つは、重複リードの失敗（本発明者らのリードフィルターおよびトリマーは、完全ではなく、フローグラムのパターンマッチングを行うために本発明者らが使用するアルゴリズムは、しばしば確かな重複を見逃す）に起因し、残りは、重複リードに失敗したことに起因する。最小Ｚ−スコアを４に設定することにより、網羅率は、ゲノムの９５．２７％（ゲノムの解読可能な部分の９８．２％）に低下したが、コンセンサス精度は、９９．９９４％に上昇した。
（考察）
本発明者らは、本明細書において、新規に開発したインビトロにおけるサンプル調製法および配列決定技術を用いて、本装置の単一の試行において、９６％の平均精度で何十万個の８０〜１２０塩基長の配列リードを同時に取得することを実証した。本発明者らは、カットオフとしてｐｈｒｅｄ２０を用いて、本発明者らの装置が、試験フラグメントから４７００万塩基超をもたらすことができ、ゲノムライブラリから２５００万塩基をもたらすことができることを示す。本発明者らは、試験フラグメントを用いることにより、本発明者らの配列決定技術から本発明者らのサンプル調製法を切り離した。試験フラグメントに対する９９．４％からゲノムライブラリに対する９６％への単一リード精度の低下は、主に、エマルジョン中のゲノム鋳型の一部分におけるクローン性の喪失によるものであり、配列決定技術固有の限界ではない。残存しているエラーのほとんどは、シグナル分布の広がり、特に、大きなホモポリマー（７以上）から生じ、それにより、あいまいな塩基コールをもたらす。配列決定化学およびウェル間のクロストークを訂正するアルゴリズムについての最近の研究では、シグナル分布が狭くなり、エラーが減少し、リード長が伸びると示唆している。エマルジョンプロトコールにおける改善も含むゲノムライブラリを用いた予備実験において、本発明者らは、８４サイクルを用いて、１００ｂｐについて本明細書中で証明した精度と同様の精度で２００ｂｐのリード長を達成することができる。本発明者らは、時々、１６８サイクルにおいて、４００ｂｐ超に亘って１００％の精度の個別リードを生成した。
Ｍ．ｇｅｔｉｉｔａｌｉｕｍを用いて、本発明者らは、短いフラグメントは、先験的に細菌ゲノムのデノボ構築を妨げないことを証明する。実際に、本発明者らのシステムの処理量によって得られる大きな過剰なサンプリングにより、実質的に少ない労力でＳａｎｇｅｒリードより少ないコンティグを有するドラフト配列を生じた。過剰なサンプリングを利用することにより、このゲノムについて９９．９６％超のコンセンサス精度を達成した。構築物をさらにクオリティ選別することにより、ゲノム網羅率がほんの少し低くなるだけで、９９．９９％を超える精度でコンセンサス配列を選択することができる。本発明者らが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの２．１Ｍｂｐのゲノムをショットガンシークエンスし、新規に構築した（Ｔｅｔｔｅｌｉｎ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３，４９８（２００１）；表２８）とき、類似の結果が見られた。細菌よりも複雑なゲノム（哺乳動物ゲノムを含む）のデノボ構築には、これらのゲノムにおける反復配列を網羅し得るペアエンド（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ）ライブラリを調製し、配列決定するためにＳａｎｇｅｒ配列決定法に対して開発された方法と同様の方法の開発が必要となり得る。ペアエンドライブラリの使用を容易にするために、本発明者らは、個別のウェルにおいてゲノム鋳型の両端から配列決定し、本発明者らのアセンブラーにペアエンドリード能の付加を計画する方法を開発した（補足的方法：両端配列決定）。
将来的に処理量が増加し、同時に１塩基あたりのコストが減少すると、光ファイバーのリアクタの小型化を継続していくことにより、単位面積あたりにもたらされる配列が長くなる−これは、この開発サイクルの開始時に集積回路の改良が重要であると予測され得たのと同様のスケーリング特性についてである（Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ３８，Ｎｕｍｂｅｒ ８，Ａｐｒｉｌ １９（１９６５））。
（方法）
エマルジョンベースのクローン増幅。
フラグメントの同時増幅は、油中ＰＣＲ反応混合物エマルジョンの作製を通して作られた別個の約１００μｍの水性の液滴（およそ２×１０６／ｍＬ）中で個別のＤＮＡ保持ビーズを単離することによって達成される。（図４３Ｂおよび補足的方法：ＤＮＡ捕捉ビーズの調製、ＤＮＡ捕捉ビーズへの鋳型種の結合、ＰＣＲ反応混合物調製および作製、乳化および増幅）。その液滴は、平行ＤＮＡ増幅が行われる別個のマイクロリアクターとして働き、１ビーズあたり約１０７コピーの鋳型が得られ；１５０万個のビーズを含む８００μＬのエマルジョンが標準的な２ｍＬチューブ中で調製される。各エマルジョンは、増幅用の８本のＰＣＲチューブに分注される。ＰＣＲ後、増幅された固定ＤＮＡ鋳型を含むビーズおよび空のビーズを含むエマルジョンを破壊することにより、ビーズを放出させる（補足的方法：エマルジョンの破壊およびビーズの回収）。次いで、本発明者らは、鋳型保持ビーズについて濃縮する（補足的方法：ビーズの濃縮）。代表的には、約３０％のビーズがＤＮＡを有しており、１エマルジョン反応あたり４５０，０００個の鋳型保持ビーズがもたらされる。調製されるエマルジョンの数は、ゲノムのサイズおよび適切な過剰なサンプリングを達成するのに必要な期待試行数に依存する。１枚の６０×６０ｍｍ２光ファイバースライド上で配列決定された５８０ｋｂｐのＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍゲノムでは、１．６ｍＬのエマルジョンが必要であった。１０倍の過剰なサンプリングがなされるヒトゲノムでは、約３０００ｍＬのエマルジョンが必要になるであろう。
ピコリットルウェルへのビーズの充填。
濃縮された鋳型保持ビーズを遠心分離によって、６０×６０ｍｍ２の光ファイバースライドの一表面に沿って配置された開放系のウェルに沈着させる（図４３Ｃ）。ビーズ（直径約２８μｍ）は、ほとんどのウェルにたった１個のビーズが確実に納まるような大きさである（ビーズが納まっていたウェルの２〜５％が２個以上のビーズを含んでいたことを本発明者らは観察した）。４５０，０００個のビーズ（１回のエマルジョン調製から）を６０×６０ｍｍ２のプレートの各半分に充填することは、ビーズ占有率をすべてのウェルの約３５％に制限すると経験的に見出されており、それによって、ウェル間の化学的および光学的なクロストークを減少させた。遊離ピロリン酸から光を生成するのに必要な固定されたＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼを有するより小さいビーズの混合物もまたウェルに充填され、個別の配列決定リアクタを形成する（補足的方法：ビーズ沈着、酵素ビーズおよび微小粒子賦形剤の調製）。
画像捕捉
１０００万コピーの鋳型を有するビーズから、ＣＣＤセンサーにおいて取り込まれた１ヌクレオチドあたり約１０，０００個の光子がもたらされる。生成された光は、光ファイバースライドの底を通過し、大型ＣＣＤ（４０９５×４０９６ピクセル）によって検出された。その画像を処理することにより、すべてのビーズ−鋳型保持ウェルについて同時に配列情報が得られた。このイメージングシステムは、多数の小ウェルおよび各ヌクレオチドフローの間に個別のウェルから生じる多数の光学シグナルを蓄積するように設計されていた。一旦載せたら、光ファイバースライドの位置は移動させない；これにより、各配列決定試行の前のピロリン酸溶液の流れの間の発光に基づいて、画像解析ソフトウェアが各ウェルの位置を決定することができるようになる（ＤＮＡ保持ビーズを含んでいるか否かにかかわらず）。単一のウェルは、約９個の１５μｍピクセルによって画像化される。各ヌクレオチドフローについて、特定のウェルを網羅するピクセルによって集められた光強度を合計して、特定のヌクレオチドフローにおいてその特定のウェルについてのシグナルが生成される。ＣＣＤによって捕捉された各画像は、３２メガバイトのデータを生成する。リアルタイムで必要なシグナル処理のすべてを行うために、制御コンピュータは、６００万ゲートのＦＰＧＡ（Ｍｅｈｔａ，Ｋ．，Ｒａｊｅｓｈ，Ｖ．Ａ．，Ｖｅｅｒａｓｗａｍｙ，Ｓ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ｉｎｓｔｒｕｍ．２９，５０７（１９９３）；Ｆａｇｉｎ，Ｂ．，Ｗａｔｔ，Ｊ．Ｇ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｒ．，Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．９，２２１（１９９６）を集積しているアクセサリボードが取り付けられている（補足的方法：フィールドプログラマブルアレイ）。
デノボショットガン配列アセンブラー。
元のフローベースのシグナルトレースに含まれる情報のすべてを捕捉するためにデノボフロー−スペースアセンブラーを開発した。既存のアセンブラーは、８０〜１２０ｂｐリードに最適化されていない、特に、等価なゲノム網羅率を達成するのに必要な配列決定リード数が増加していくのに起因してメモリ管理に関して最適化されていないという事実にも取り組む（７００ｂｐリードで達成されるときと同数の隣接領域（コンティグ）を得るためには、１００ｂｐリードで網羅される完全にランダムなゲノムは、約５０％超のリードが必要となり、リード間の３０ｂｐの重複が必要であると見込まれる）（Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２，２３１（１９８８））。このアセンブラーは、一連のモジュール：リード間の重複を検出および作製するＯｖｅｒｌａｐｐｅｒ、配列リードを重複するより大きいコンティグを構築するＵｎｉｔｉｇｇｅｒ、および各コンティグ内の塩基に対するコンセンサスコールおよびクオリティスコアを生成するＭｕｌｔｉａｌｉｇｎｅｒからなる（補足的方法：デノボ配列アセンブラー）。（ソフトウェアモジュールの名称は、Ｍｙｅｒｓによって開発された他のアセンブラー（Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．，Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２，２７５ １（１９９５）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｊ．Ｗ．Ｆａｒｃｈａｕｓ ａｎｄ Ｍ．Ｃ．Ｄａｖｉｓ．２００１．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３１：３７０における関連機能を行う名称に基づいている）。
Figure 2009502202
Figure 2009502202
 （実施例３０ 補足的な材料および方法）
（ライブラリ調製（図４７））
ＤＮＡ断片化。ゲノムＤＮＡサンプルは、様々な起源（細菌のコロニーから、販売業者から受け取った凍結乾燥サンプルまで及ぶ）から得られた。受け取った時点で、ＯＤ２６０／２８０比１．８〜２．０を用いて、濃度（＞３００μｇ／ｍＬ）を確認した。１５マイクログラムのゲノムＤＮＡを、２．０ｍＬチューブ中で１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．６）の最終体積１００μＬに希釈した。１．６ｍＬの氷冷噴霧緩衝液（５３．１％グリセロール、３７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５．５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）を加えることにより、そのサンプルをさらに希釈し、ピペット操作を繰り返すことにより穏やかに混合した。
研究室の外側に排気しているＰＣＲフード（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ，ＵＳＡ）内で以下に記載するように改変したＡｅｒｏｍｉｓｔ噴霧器（Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｒｕｓｓｌｅｖｉｌｌｅ，ＭＯ）を用いてＤＮＡ溶液を断片化した。簡潔には、１５ｍＬスナップキャップＦａｌｃｏｎチューブからキャップを噴霧器の頂部の上に置いた。噴霧中のサンプル噴霧によって引き起こされる損失を低減するために、シリコーンチューブの０．５０”ＯＤ×０．３１”ＩＤ×１．５”の長い部分からなる噴霧器濃縮チューブを既存の噴霧器供給チューブに取り付けた。ＤＮＡサンプル混合物を噴霧器チャンバーの底部に移し、噴霧器の頂部をチャンバーにしっかりと差し込んだ。ゆるく嵌合する特注のデルリンキャップを、噴霧器の頂部を覆うように設計し、所定の位置でキャップを保持する、サイズ＃３４のｂｕｎａ−ＮＯ−環を固定するための噴霧器の外側に側溝を設けた。次いで、噴霧器アセンブリ全体をパラフィルム（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎ，Ｍｅｎａｓｈａ，ＷＩ）でしっかりと覆った。次いで、その噴霧器を、供給チューブを備えた窒素タンクに接続し、そのチューブの連結をパラフィルムで覆った。
組み立てた噴霧器を、そのユニットの下半分が氷に浸かるようにして、アイスバケット中で直立して置いた。窒素ガスを５分間、５０ｐｓｉで適用した；噴霧器の壁面上の濃縮物をチャンバーの底に時々たたいて落とした。ガスを止め、圧を３０秒間正常に戻してから、チューブを噴霧器から取り外した。その噴霧器を慎重にはずし、サンプルを１．５ｍＬ微量遠心チューブに移した。回収された体積は、代表的には９００μＬを超えていた。
噴霧されたＤＮＡを、製造者の指示書に従って、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に通して遠心分離することにより精製した。大量であったので、ＤＮＡサンプルを同じカラムに数回に分けて充填し、精製した。精製されたＤＮＡを３０μＬの５５℃の緩衝液ＥＢ（Ｑｉａｇｅｎキットに添付のもの）で希釈した。ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐを用いたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ．）において噴霧された材料の２μＬアリコートを分離することによって、噴霧されたフラグメントのサイズ分布を測定した（代表的なトレースについて図４８を参照のこと）。回収された材料は、５０〜９００ｂｐの範囲のサイズを示し、３２５±５０ｂｐの平均フラグメントサイズを有した。
酵素的ポリッシング。ＤＮＡ噴霧により、ほつれた末端を有する多くのフラグメントが生成される（Ｐａｎ，Ｈ．ら、ＧＡＴＡ １１，１８１（１９９４）；Ｂａｎｋｉｅｒ，Ａ．Ｔ．，Ｗｅｓｔｏｎ，Ｋ．Ｍ．ａｎｄ Ｂａｒｒｅｌｌ，Ｂ．Ｇ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５，５１（１９８７））。３つの酵素：Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の活性により、フラグメントを平滑末端にして、リン酸化した。
０．２ｍＬチューブにおいて、精製され、噴霧されたＤＮＡフラグメントの残りの２８μＬを、５μＬの分子生物学グレードの水（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、５μＬの１０×ＮＥ緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、５μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．）および５μＬの３ｕ／μＬ Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と併せた。ポリッシング反応物を十分に混合し、サーモサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において、１０分間２５℃にてインキュベートした。インキュベーション後、１．２５μＬの５ｕ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、反応物を十分に混合し、さらに１０分間２５℃でインキュベートした後、１６℃で２時間インキュベートした。
次いで、ポリッシング反応物をＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラムで精製し、３０μＬの５５℃の緩衝液ＥＢで溶出し、リン酸化に向けて０．２ｍＬチューブに移した。そのＤＮＡを、５μＬの分子生物学グレードの水、５μＬの１０×Ｔ４ ＰＮＫ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、５μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）および５μＬの１０ｕ／μＬ Ｔ４ ＰＮＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えることにより、５０μＬに希釈した。反応物を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした後、６５℃で２０分間インキュベーションした。次いで、リン酸化フラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラムを先と同様に用いて精製し、３０μＬの５５℃の緩衝液ＥＢで溶出した。Ｔｕｒｎｅｒ ＴＢＳ−３８０ Ｍｉｎｉ−蛍光光度計（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて蛍光光度分析により、２μＬアリコート中のＤＮＡ濃度を定量した。
ゲノムＤＮＡライブラリの断片化およびポリッシングの後、プライマー配列をＤＮＡフラグメントの各末端に付加した。４４塩基のプライマー配列（本明細書中で以後、「アダプター」とよぶ）は、５’の２０塩基のＰＣＲ増幅プライマーの後に２０塩基の配列決定プライマーおよび各デオキシリボヌクレオチドの１つから構成される３’の４塩基（非パリンドロームの配列決定「キー」）（例えば、ＡＧＴＣ）から構成される二本鎖オリゴヌクレオチドであった。２種類のアダプター（「アダプターＡ」および「アダプターＢ」とよばれる）を各反応物において使用した。ＡおよびＢアダプターは、両方のヌクレオチド配列において異なっており、Ｂアダプター上には、５’ビオチンタグが存在している。平滑末端の断片化ゲノムＤＮＡに対して定方向性ライゲーションが可能となるようにアダプター対を設計した（アダプターＡ：ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧ 配列番号６１．アダプターＢ：／５ＢｉｏＴＥＧ／ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧ 配列番号：６２）。各アダプター対について、ＰＣＲプライミング領域は、５’４塩基突出末端および平滑末端化３’キー領域を含んでいた。アダプターの３’平滑末端側が平滑末端化ゲノムＤＮＡフラグメントに連結され、５’突出末端は、アダプターのＰＣＲプライマー領域へのライゲーションを防ぐとき、定方向性が達成された。
残りの２８μＬの、噴霧され、ポリッシングされたＤＮＡを０．２ｍＬチューブに移し、２０．６μＬの分子生物学グレードの水、６０μＬの２×Ｑｕｉｃｋリガーゼ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、アダプターＡとＢの１．８μＬの等モル混合物（各アダプター２００ｐｍｏｌ／μＬ）、９．６μＬの２０００Ｕ／μＬ Ｑｕｉｃｋリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と併せた。そのチューブの内容物を十分に混合し、２５℃で２０分間インキュベートし、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラムで２回精製し、各遠心分離後に３０μＬの５５℃の緩衝液ＥＢで溶出した。
ゲル精製。２％アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）／ＴＢＥスラブゲルを、４．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬエチジウムブロマイド原液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を融解アガロース溶液に加えた状態で調製した。３マイクロリットルの１０×Ｒｅａｄｙ−Ｌｏａｄ Ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３０μＬの連結ＤＮＡライブラリに加え、色素／ライゲーション反応物をゲル内の２つの隣接ウェルにロードした（約１６．５μＬ／レーン）。１０マイクロリットル（１μｇ）の１００ｂｐラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ライブラリとラダーサンプルとの間を２レーン空けて、ライブラリサンプルのいずれか側の隣接ウェルに充填した。１００Ｖで３時間ゲル電気泳動を行い、その後、ゲルを、汚染の機会を低減するためにプラスチックラップを敷いたＧｅｌＤｏｃ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）ＵＶボックスに移動させた。滅菌された使い捨てのメスを用いて、各ライブラリサンプルが移動した領域（ＤＮＡラダーの２５０塩基対マーカーと５００塩基対マーカーとの間）を切り出し、次いで、ゲル片を１５ｍＬＦａｌｃｏｎチューブに入れた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）の２本のカラムを用いて各アガロース片からライブラリを１サンプルあたり１つずつ抽出した。このプロセスは、製造者の指示書に従い、以下の改変を加えて行った。溶解したアガロースの体積が大きいので、各ライブラリをいくつかに分けて、それぞれのカラムを通して連続的に処理した。また、エタノールの完全な除去を確実に行うために、緩衝液ＰＥ遠心後の乾燥遠心の時間を（１分ではなく）２分に延ばし、各カラムからの溶出液をライブラリの最終体積２０μＬに達するまで保存した。１マイクロリットルの単離ライブラリをＢｉｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐで解析することにより、ライブラリ集団のサイズ分布が２５０〜５００ｂｐに存在することを確認した。
ニック修復。３’連結の２つのニックをＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼであるラージフラグメントの鎖置換活性によって修復した。サイズ分画されたライブラリの残りの１９μＬを、４０μＬの分子生物学グレードの水、８μＬの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、８μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）および３μＬの８Ｕ／μＬ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と併せ、３０分間６５℃で３０分間インキュベートした。
一本鎖ＡＢアダプター付加ライブラリの単離。１００マイクロリットルの原液Ｍ−２７０ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を、１．５ｍＬ微量遠心チューブ中にて２００μＬの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ）で２回洗浄した。これは、洗浄溶液中でビーズをボルテックスし、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＭＰＣ）（Ｄｙｎａｌ）でビーズを固定して、固定されたビーズから溶液を除去し、それを繰り返すことにより行った。２回目の洗浄後、ビーズを１００μＬの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ）に再懸濁し、次いで、それに８０μＬのＢｓｔポリメラーゼ処理ライブラリおよび２０μＬの分子生物学グレードの水の全体を加えた。次いで、そのサンプルをボルテックスすることにより混合し、チューブ水平回転装置に室温で２０分間かけた。次いで、ビーズ混合物を２００μＬの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄し、次いで、２００μＬの分子生物学グレードの水で２回洗浄した。
最後の水の洗浄液を、ＭＰＣを用いてビーズパックから除去し、２５０μＬの融解溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１２５ｍＭ ＮａＯＨ）を加えた。ビーズを融解溶液に混合することによって再懸濁し、ビーズ懸濁液をチューブ回転装置にて室温で１０分間インキュベートした。
別個の１．５ｍＬ遠心チューブにおいて、１２５０μＬの緩衝液ＰＢ（ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットに添付のもの）を９μＬの２０％酢酸水溶液を加えることによって中和した。Ｄｙｎａｌ ＭＰＣを用いて、融解溶液中のビーズを沈殿させ；２５０μＬの上清（この時点で一本鎖ライブラリを含む）を慎重にデカントし、新しく調製した、中和された緩衝液ＰＢのチューブに移した。
１５００μＬの中和された一本鎖ライブラリを、使用する前に室温に温めたＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）の単一カラムによって濃縮した。体積の制約があるために、サンプルを７５０μＬアリコート２つに分けて充填し、濃縮した。
スピンカラムについての製造者の指示に従い、微量遠心機を使用し、以下の改変を伴って各アリコートの濃縮を行った：緩衝液ＰＥ遠心後の乾燥回転を（１分ではなく）２分に延ばすことにより、エタノールの完全な除去を確実に行い、一本鎖ライブラリサンプルを１５μＬの５５℃の緩衝液ＥＢ（Ｑｉａｇｅｎ）で溶出した。
ライブラリの定量およびクオリティ評価。得られた一本鎖ＤＮＡライブラリの量およびクオリティをＡｇｉｌｅｎｔ ２１００および蛍光プレートリーダーにより評価した。ライブラリは、一本鎖ＤＮＡからなるものであったので、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００用のＲＮＡ Ｐｉｃｏ ６０００ ＬａｂＣｈｉｐを、製造者のガイドラインに従って使用し、調製した。３つ組の１μＬアリコートを解析し、Ａｇｉｌｅｎｔ解析ソフトウェアによって報告された平均値を使用してＤＮＡ濃度を推定した。ライブラリの最終濃度は、代表的には１０８分子／μＬを超えた。必要になるまで、ライブラリサンプルを−２０℃に濃縮された形態で保存した。
（ＤＮＡ捕捉ビーズの調製）
１ｍＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）−活性化セファロースＨＰアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に充填されたビーズを、カラムから取り出し、製品資料（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａプロトコール＃７１７００６００ＡＰ）に記載されているように活性化した。２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ８．０中の２５マイクロリットルの１ｍＭアミン−標識ＨＥＧ捕捉プライマー（５’−アミン−３連続１８−原子ヘキサ−エチレングリコールスペーサーＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＣ−３’配列番号６３）（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）を上記ビーズに結合した後、３６μｍおよび２５μｍのポアフィルターメッシュ片（Ｓｅｆａｒ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｄｅｐｅｗ，ＮＹ，ＵＳＡ）に連続的に通過させることにより、２５〜３６μｍのビーズを選別した。第１のフィルターを通過したが、第２のフィルターに保持されたＤＮＡ捕捉ビーズをビーズ保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．０２％Ｔｗｅｅｎ，０．０２％アジ化ナトリウム，ｐＨ８）中に収集し、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）で定量し、必要になるまで４℃で保存した。
（ＤＮＡ捕捉ビーズへの鋳型種の結合）
鋳型分子を、ＵＶ処理された層流フード内でＤＮＡ捕捉ビーズ上の相補的プライマーにアニールした。ビーズ保存緩衝液に懸濁された１５０万個のＤＮＡ捕捉ビーズを２００μＬ ＰＣＲチューブに移し、卓上小型遠心機にて１０秒間遠心し、チューブを１８０°回転させ、さらに１０秒間遠心することにより、確実にペレットを形成させた。次いで、上清を除去し、ビーズを２００μＬのアニーリング緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５および５ｍＭ酢酸マグネシウム）で洗浄し、５秒間ボルテックスすることにより、ビーズを再懸濁し、上記のように沈殿させた。ビーズの上の約１０μＬの上清以外すべてを除去し、さらに２００μＬのアニーリング緩衝液を加えた。ビーズを再度５秒間ボルテックスし、１分間放置し、次いで、上記のように沈殿させた。１０μＬの上清以外すべてを廃棄し、１．２μＬの２×１０７分子／μＬの鋳型ライブラリをビーズに加えた。そのチューブを５秒間ボルテックスすることにより、内容物を混合した後、ＭＪサーモサイクラーに予めプログラムされた制御された持続時間／アニーリングプログラム（８０℃５分、その後、０．１℃／秒で７０℃に低下、７０℃１分、０．１℃／秒で６０℃に低下、６０℃で１分間保持、０．１℃／秒で５０℃に低下、５０℃で１分間保持、０．１℃／秒で２０℃に低下、２０℃で保持）で鋳型をビーズにアニールさせた。アニーリングプロセスが終了したら、必要になるまでビーズを氷上で保存した。
（ＰＣＲ反応混合物の調製および作製）
汚染の可能性を低減するために、ＰＣＲ反応混合物を、ＰＣＲクリーンルームに存在するＵＶ処理層流フード内で調製した。各１，５００，０００個のビーズエマルジョンＰＣＲ反応物に対して、２２５μＬの反応混合物（１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）、２．５ｍＭ ＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１％アセチル化された分子生物学グレードのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）、０．００３Ｕ／μＬ 熱安定ピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、０．６２５μＭ フォワードプライマー（５’−ＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧ−３’配列番号：６４）および０．０３９μＭリバースプライマー（５’−ＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＣ−３’配列番号：６５）（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１５Ｕ／μＬ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｈｉ−Ｆｉ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を１．５ｍＬチューブ内で調製した。２５マイクロリットルの反応混合物を取り出し、ネガティブコントロールとして使用するために個別の２００μＬ ＰＣＲチューブ中で保存した。反応混合物とネガティブコントロールの両方を必要になるまで氷上で保存した。さらに、すべてのエマルジョンのための、２４０μＬの偽（ｍｏｃｋ）増幅混合物（１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５ｍＭ ＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ）を１．５ｍＬチューブ内で調製し、必要になるまで室温で同様に保存した。
（乳化および増幅）
乳化プロセスにより、１マイクロリットルあたり約１，０００個の別々のＰＣＲマイクロリアクターを含む熱安定性の油中水エマルジョンが作製される。これは、単一分子のためのマトリクスとして働き、標的ライブラリの個別分子のクローン増幅が達成される。反応混合物および単一反応のためのＤＮＡ捕捉ビーズを以下の様式で乳化した：ＵＶ処理層流フード内で、１６０μＬのＰＣＲ溶液を、１，５００，０００個のＤＮＡ捕捉ビーズを含んでいるチューブに加えた。そのビーズを、ピペット操作を繰り返すことにより再懸濁し、その後、ビーズをＰＣＲ溶液で平衡化するために、ＰＣＲ−ビーズ混合物を少なくとも２分間室温に放置した。それと同時に、４００μＬのエマルジョンオイル（６０％（ｗ／ｗ）ＤＣ ５２２５Ｃ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ａｉｄ（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、３０％（ｗ／ｗ）ＤＣ ７４９ Ｆｌｕｉｄ（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）および３０％（ｗ／ｗ）Ａｒ２０シリコーンオイル（Ｓｉｇｍａ）を、蓋が平らな２ｍＬ遠心チューブ（Ｄｏｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｕｒｔｏｎ，ＭＩ）に分注した。次いで、２４０μＬの偽増幅混合物を４００μＬのエマルジョンオイルに加え、チューブの蓋を確実に閉じ、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＭＭ３００（Ｒｅｔｓｃｈ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ，Ｈａａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の２４ウェルＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＡｄａｐｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）においた。エマルジョンを２５振動／秒で５分間均質化することにより、極小のエマルジョンまたは反応物にさらなる安定性をもたらす「ミクロファイン」が得られた。
ビーズとＰＣＲ反応混合物を併せたものを軽くボルテックスし、２分間平衡化させた。ミクロファインが形成した後、増幅混合物、鋳型およびＤＮＡ捕捉ビーズを乳化した材料に加えた。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒの速度を１５振動／秒に低下し、反応混合物を５分間均質化した。低いほうの均質化速度により、オイル混合物中に平均直径１００〜１５０μｍの水滴が生じ、その大きさは、ＤＮＡ捕捉ビーズおよび増幅混合物を含むのに十分大きかった。
エマルジョンの総体積は、１本の蓋が平らな２ｍＬ遠心チューブ中に含まれる約８００μＬであった。そのエマルジョンを、７〜８本の別個のＰＣＲチューブに各々およそ１００μＬ含むように分注した。そのチューブを密閉し、予め作製しておいた２５μｌのネガティブコントロールとともにＭＪサーモサイクラーにかけた。以下のサイクル時間を用いた：１×（９４℃４分）−ホットスタート開始、４０×（９４℃３０秒、５８℃６０秒、６８℃９０秒）−増幅、１３×（９４℃３０秒、５８℃３６０秒）−ハイブリダイゼーション伸長。ＰＣＲプログラムが完了した後、反応物を取り出し、エマルジョンをすぐに破壊するか、（先に記載したように）、または破壊プロセスを開始する前に最長１６時間、反応物を１０℃で保存した。
（エマルジョンの破壊およびビーズの回収）
５０マイクロリットルのイソプロピルアルコール（Ｆｉｓｈｅｒ）を、増幅した材料のエマルジョンを含む各ＰＣＲチューブに加え、１０秒間ボルテックスすることにより、エマルジョンの粘度を低下させた。チューブを微量遠心機にて数秒間遠心することにより、チューブキャップに付着した任意の乳化された材料を除去した。そのエマルジョン−イソプロピルアルコール混合物を、各チューブから尖っていない１６ゲージの尖っていない針（Ｂｒｉｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，ＮＪ）を取り付けた１０ｍＬ ＢＤ−使い捨てシリンジ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に引き抜いた。さらに５０μＬのイソプロピルアルコールを各ＰＣＲチューブに加え、ボルテックスし、先のように遠心し、シリンジの内容物に加えた。シリンジ内の体積は、イソプロピルアルコールを含んで９ｍＬにまで増え、その後、そのシリンジを反転させ、イソプロパノールとエマルジョンとの混合を容易にするために、シリンジに１ｍＬの気泡を引き入れた。尖っていない針を取り外し、１５μｍポアＮｉｔｅｘ Ｓｉｅｖｉｎｇ Ｆａｂｒｉｃ（Ｓｅｆａｒ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｄｅｐｅｗ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含む２５ｍｍ Ｓｗｉｎｌｏｃｋフィルターホルダー（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）をシリンジルアーに密着させ、尖っていない針をＳｗｉｎｌｏｃｋユニットの反対側に取り付けた。
シリンジの内容物を、穏やかであるが完全にＳｗｉｎｌｏｃｋフィルターユニットおよび針に通して漂白剤を含む廃棄容器に排出した。６ミリリットルの新しいイソプロピルアルコールを、尖っていない針およびＳｗｉｎｌｏｃｋフィルターユニットに通してシリンジに引き戻し、そのシリンジを１０回反転させることにより、イソプロピルアルコール、ビーズおよび残留エマルジョン成分を混合した。シリンジの内容物を再度廃棄容器に排出し、各洗浄において、さらに６ｍＬのイソプロピルアルコールを用いて洗浄プロセスを２回繰り返した。６ｍＬの８０％エタノール／１×アニーリング緩衝液（８０％エタノール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５ｍＭ酢酸マグネシウム）を用いて、洗浄工程を繰り返した。次いで、ビーズを、０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１×アニーリング緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，５ｍＭ酢酸マグネシウム）６ｍＬで洗浄し、その後、ピコピュア水を含む６ｍＬの洗浄液で洗浄した。
廃棄容器に最後の洗浄液を排出した後、１．５ｍＬの１ｍＭ ＥＤＴＡをシリンジに引き入れ、Ｓｗｉｎｌｏｃｋフィルターユニットを取り外して置いた。シリンジの内容物を１．５ｍＬ遠心チューブに連続的に移した。そのチューブを微量遠心機において２０秒間、周期的に遠心することにより、ビーズを沈殿させ、上清を除去した後、残存しているシリンジの内容物を遠心チューブに加えた。Ｓｗｉｎｌｏｃｋユニットを再びフィルターに取り付け、１．５ｍＬのＥＤＴＡをシリンジに引き入れた。Ｓｗｉｎｌｏｃｋフィルターを最後に取り外し、ビーズおよびＥＤＴＡを遠心チューブに加え、ビーズを沈殿させ、必要に応じて上清を除去した。
（第２の鎖の除去）
捕捉ビーズに固定された増幅ＤＮＡを、塩基性融解溶液中でインキュベーションして第２の鎖を除去することにより、一本鎖にした。１ｍＬの新しく調製した融解溶液（０．１２５Ｍ ＮａＯＨ、０．２Ｍ ＮａＣｌ）をビーズに加え、ペレットを中程度の設定で２秒間ボルテックスすることにより再懸濁し、チューブを３分間Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ ＬａｂＱｕａｋｅチューブ回転装置にかけた。次いで、ビーズを上記のように沈殿させ、上清を慎重に除去して廃棄した。次いで、残りの融解溶液を、１ｍＬのアニーリング緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸，ｐＨ７．６、５ｍＭ酢酸マグネシウム）を加えることによって希釈し、その後、ビーズを中程度の速度で２秒間ボルテックスし、ビーズを沈殿させ、上清を先のとおり除去した。８００μＬのアニーリング緩衝液だけを遠心分離後に除去すること以外は、アニーリング緩衝液による洗浄を繰り返した。ビーズおよび残存アニーリング緩衝液を０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに移し、すぐに使用するか、または次の濃縮プロセスを続ける前に最長４８時間４℃で保存した。
（ビーズの濃縮）
この時点までに、ビーズ集団は、増幅され固定されたＤＮＡ鎖を有するビーズと増幅産物を有しない空のビーズの両方から構成された。濃縮プロセスを利用して、空のビーズをふるい落としながら配列決定可能な量の鋳型ＤＮＡを有するビーズを選択的に捕捉した。前の工程からの一本鎖ビーズを、卓上小型遠心分離機における１０秒間の遠心分離により沈殿させた後、チューブを１８０°回転させて、さらに１０秒間遠心することにより、ペレット形成を確実に行った。次いで、できるだけ多くの上清を、ビーズを乱さずに除去した。１５マイクロリットルのアニーリング緩衝液をビーズに加え、その後、２μＬの１００μＭのビオチン化４０塩基ＨＥＧ濃縮プライマー（５’ビオチン−１８−原子ヘキサ−エチレングリコールスペーサーＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣ−３’，ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ配列番号：６６）（ビーズに固定された鋳型の３’末端上の増幅部位と配列決定部位を併せた部分（各２０塩基長）に相補的）を加えた。その溶液を中程度の設定で２秒間ボルテックスすることにより混合し、濃縮プライマーを、ＭＪサーモサイクラーにおける制御された変性／アニーリングプログラム（６５℃３０秒、０．１℃／秒で５８℃に低下、５８℃９０秒および１０℃で保持）を用いて固定ＤＮＡ鎖にアニールさせた。
プライマーがアニーリングしている間、ＳｅｒａＭａｇ−３０磁気ストレプトアビジンビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）の原液を穏やかに回転させることにより再懸濁し、２０μＬのＳｅｒａＭａｇビーズを、１ｍＬの増強流体（２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）を含む１．５ｍＬ微量遠心チューブに加えた。ＳｅｒａＭａｇビーズ混合物を５秒間ボルテックスし、チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓ磁石に置いて、微量遠心機チューブの側面に対して常磁性ビーズを沈殿させた。上清を慎重に除去して、ＳｅｒａＭａｇビーズを乱さずに廃棄し、チューブを磁石から取り外し、１００μＬの増強流体を加えた。チューブを３秒間ボルテックスすることにより、ビーズを再懸濁し、チューブを必要になるまで氷上で保存した。
アニーリングプログラムが完了したら、１００μＬのアニーリング緩衝液を、ＤＮＡ捕捉ビーズおよび濃縮プライマーを含むＰＣＲチューブに加え、そのチューブを５秒間ボルテックスし、その内容物を新しい１．５ｍＬ微量遠心チューブに移した。濃縮プライマーを捕捉ビーズにアニールさせたＰＣＲチューブを２００μＬのアニーリング緩衝液で１回洗浄し、洗浄溶液をその１．５ｍＬチューブに加えた。ビーズを１ｍＬのアニーリング緩衝液で３回洗浄し、２秒間ボルテックスし、先のように沈殿させ、上清を慎重に除去した。３回目の洗浄後、ビーズを１ｍＬの氷冷増強流体で２回洗浄し、ボルテックスし、沈殿させ、先のように上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μＬの氷冷増強流体に再懸濁し、ビーズ溶液を洗浄したＳｅｒａＭａｇビーズに加えた。
ストレプトアビジンコートされたＳｅｒａＭａｇビーズを、ＤＮＡ捕捉ビーズ上の固定された鋳型にアニールしたビオチン化濃縮プライマーに結合させている間に、ビーズ混合物を３秒間ボルテックスし、ＬａｂＱｕａｋｅ チューブ回転装置にて室温で３分間インキュベートした。次いで、ビーズを２，０００ＲＰＭで３分間遠心した後、ビーズが再懸濁するまでビーズを軽く「はじいた」。次いで、再懸濁したビーズを５分間氷上に置いた。氷上でのインキュベーションの後、冷増強流体をビーズに加えて、最終体積１．５ｍＬにした。チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓ磁石に挿入し、ビーズを１２０秒間静置することにより、ビーズを磁石に対して沈殿させ、その後、上清（過剰なＳｅｒａＭａｇビーズおよび空のＤＮＡ捕捉ビーズを含む）を慎重に除去して廃棄した。
チューブをＭＰＣ−Ｓ磁石から取り出し、１ｍＬの冷増強流体をビーズに加え、ビーズを軽くはじくことにより再懸濁した。ボルテックスにより、ＳｅｒａＭａｇビーズとＤＮＡ捕捉ビーズとの結合が切断し得るので、ビーズをボルテックスしないことが必須であった。磁石をビーズに戻し、上清を除去した。この洗浄をさらに３回繰り返すことにより、すべての空の捕捉ビーズを確実に除去した。ＤＮＡ捕捉ビーズからアニールした濃縮プライマーおよびＳｅｒａＭａｇビーズを取り出すために、ビーズを１ｍＬの融解溶液に再懸濁し、５秒間ボルテックスし、磁石を用いて沈殿させた。濃縮されたビーズを含む上清を別々の１．５ｍＬ微量遠心チューブに移し、ビーズを沈殿させて、上清を廃棄した。次いで、濃縮ビーズを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×アニーリング緩衝液に再懸濁した。ビーズをＭＰＣで再度沈殿させ、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移して、残存ＳｅｒａＭａｇビーズを最大限除去した。ビーズを遠心し、その後、上清を除去し、ビーズを１ｍＬの１×アニーリング緩衝液で３回洗浄した。３回目の洗浄後、８００μＬの上清を除去し、残りのビーズおよび溶液を０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに移した。濃縮プロセスの平均収率は、エマルジョンに加えた元のビーズの３０％、すなわち１エマルジョン反応あたり約４５０，０００個の濃縮ビーズであった。６０×６０ｍｍ２スライドでは、９００，０００個の濃縮ビーズが必要となるので、２回の１，５００，０００ビーズエマルジョンを上記のとおり処理した。
（配列決定プライマーアニーリング）
濃縮ビーズを２，０００ＲＰＭで３分間遠心し、上清をデカントした後、１５μＬのアニーリング緩衝液および３μＬの１００ｍＭ配列決定プライマー（５’−ＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣ−３’，ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 配列番号：６７）を加えた。次いで、チューブを５秒間ボルテックスし、以下の４段階アニーリングプログラムのためにＭＪサーモサイクラーにかけた：６５℃５分、０．１℃／秒で５０℃に低下、５０℃１分、０．１℃／秒で４０℃に低下、４０℃で１分間保持、０．１℃／秒で１５℃に低下、１５℃で保持。
アニーリングプログラムが完了したら、ビーズをサーモサイクラーから取り出し、１０秒間遠心分離することにより沈殿させ、チューブを１８０°回転させてさらに１０秒間遠心した。上清を廃棄し、２００μＬのアニーリング緩衝液を加えた。ビーズを５秒間ボルテックスすることにより再懸濁し、ビーズを上記のように沈殿させた。上清を除去し、ビーズを１００μＬのアニーリング緩衝液に再懸濁し、その時点で、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いてビーズを定量した。ビーズは、４℃で保存し、少なくとも１週間安定であった。
（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ラージフラグメントおよびＳＳＢタンパク質とのＤＮＡビーズのインキュベーション）
アピラーゼ（Ｂｉｏｔａｇｅ，Ｕｐｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ）（最終活性８．５単位／リットル）を、０．１％ＢＳＡを含む１×アッセイ緩衝液に加えることにより、ビーズ洗浄緩衝液（１００ｍｌ）を調製した。光ファイバースライドをピコピュア水から取り出し、ビーズ洗浄緩衝液中でインキュベートした。予め調製しておいた９００，０００個のＤＮＡビーズを遠心し、上清を慎重に除去した。次いで、０．４ｍｇ／ｍＬポリビニルピロリドン（ＭＷ３６０，０００）、１ｍＭ ＤＴＴ、１７５μｇのＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）および７０００単位のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む１２９０μｌのビーズ洗浄緩衝液中でビーズをインキュベートした。そのビーズを回転装置にて室温で３０分間インキュベートした。
（酵素ビーズおよび微小粒子賦形剤の調製）
ＵｌｔｒａＧｌｏｗ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）およびＢｓｔ ＡＴＰスルフリラーゼをビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）融合物として研究室内で調製した。８７−アミノ酸ＢＣＣＰ領域は、リシン残基を含んでおり、融合タンパク質がＥ．ｃｏｌｉにおいてインビボ発現する間にリシン残基にビオチンが共有結合する。ビオチン化されたルシフェラーゼ（１．２ｍｇ）およびスルフリラーゼ（０．４ｍｇ）を予め混合し、製造者の指示書に従って、４℃において、２．０ｍＬのＤｙｎａｌ Ｍ２８０常磁性ビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ，Ｄｙｎａｌ ＳＡ）に結合させた。その酵素結合ビーズを２０００μＬのビーズ洗浄緩衝液で３回洗浄し、２０００μＬのビーズ洗浄緩衝液に再懸濁した。
Ｓｅｒａｄｙｎ微小粒子（Ｐｏｗｅｒｂｉｎｄ ＳＡ，０．８μｍ，１０ｍｇ／ｍＬ，Ｓｅｒａｄｙｎ Ｉｎｃ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を以下のとおり調製した：１０５０μＬの原液を、０．１％ＢＳＡを含む１０００μＬの１×アッセイ緩衝液で洗浄した。その微小粒子を９３００ｇで１０分間遠心し、上清を除去した。この洗浄を２回以上繰り返して、微小粒子を、０．１％ＢＳＡを含む１０５０μＬの１×アッセイ緩衝液に再懸濁した。ビーズおよび微小粒子を使用するまで氷上に保存した。
（ビーズ沈着）
Ｄｙｎａｌ酵素ビーズおよびＳｅｒａｄｙｎ微小粒子を１分間ボルテックスし、１０００μＬの各々を新しい微量遠心チューブ内で混合し、軽くボルテックスし、氷上に保存した。酵素／Ｓｅｒａｄｙｎビーズ（１９２０μｌ）をＤＮＡビーズ（１３００μｌ）と混合し、最終体積をビーズ洗浄緩衝液で３４６０μＬに調整した。順に層をなすようにビーズを沈着させた。光ファイバースライドをビーズ洗浄緩衝液から取り出し、層１、すなわちＤＮＡと酵素／Ｓｅｒａｄｙｎビーズとの混合物を沈着させた。遠心分離後、層１上清を光ファイバースライドから吸引除去し、層２、すなわちＤｙｎａｌ酵素ビーズを沈着した。この節では、どのように異なる層を遠心分離したかについて詳述する。
層１。６０×６０ｍｍ２の光ファイバースライドの表面における２つの３０×６０ｍｍ２の作用面積をもたらすガスケットをジグ頂部の割り当てられたステンレス鋼合釘に慎重に嵌合した。光ファイバースライドをスライドのエッチングされていない滑らかな側を下にしてジグに置き、ジグ頂部／ガスケットをスライドのエッチングされた側に嵌合した。次いで、ジグ頂部を、反対の端を手で可能な限りしっかりと締めることによって提供されたねじで適切に固定した。ＤＮＡ−酵素ビーズ混合物を、ジグ頂部上に設けられた２つの入口から光ファイバースライド上に充填した。ビーズ混合物を充填する間、気泡が最小限になるように最大の注意を払った。穏やかな連続的なピペットプランジャーの１押しにより各沈着を完了した。組立物全体を、ＧＨ３．８−Ａローターを装着したＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ６遠心分離機にて２８００ｒｐｍで１０分間、遠心した。遠心分離後、上清をピペットで除去した。
層２。Ｄｙｎａｌ酵素ビーズ（９２０μＬ）を２７６０μＬのビーズ洗浄緩衝液と混合し、３４００μＬの酵素−ビーズ懸濁液を、先に記載したように光ファイバースライド上に充填した。スライド組立物を２８００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をデカントした。光ファイバースライドをジグから取り出し、装置に載せる準備が整うまでビーズ洗浄緩衝液中で保存した。
（４５４装置における配列決定）
すべてのフロー試薬は、０．４ｍｇ／ｍＬのポリビニルピロリドン（ＭＷ３６０，０００）、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×アッセイ緩衝液中に調製した。基質（３００μＭ Ｄ−ルシフェリン（Ｒｅｇｉｓ，Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）および２．５μＭアデノシンホスホ硫酸（Ｓｉｇｍａ））は、０．４ｍｇ／ｍＬ ポリビニルピロリドン（ＭＷ３６０，０００）、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×アッセイ緩衝液中に調製した。アピラーゼ洗浄液は、０．４ｍｇ／ｍＬ ポリビニルピロリドン（ＭＷ３６０，０００）、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×アッセイ緩衝液に最終活性８．５単位／リットルでアピラーゼを加えることにより調製する。デオキシヌクレオチドｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）は、基質緩衝液中に最終濃度６．５μＭ、α−チオデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰαＳ，Ｂｉｏｌｏｇ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）およびピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）は、それぞれ最終濃度５０μＭおよび０．１μＭに調製した。
４５４配列決定装置は、３つの主要部：流体サブシステム、光ファイバースライドカートリッジ／フローチャンバーおよびイメージングサブシステムからなる。試薬入口ライン、多弁多岐管および蠕動ポンプは、流体サブシステムの一部を形成している。個別の試薬を適切な試薬入口ラインに接続することにより、１つの試薬を一度に予めプログラムされた流速および持続時間でフローチャンバーに試薬が送達可能になる。光ファイバースライドカートリッジ／フローチャンバーは、スライドのエッチングされた面とフローチャンバーの天井との間に３００μｍの空間を有する。フローチャンバーはまた、試薬および光ファイバースライドの温度制御手段ならびに光を通さないハウジングを備えていた。スライドの研磨された（エッチングされていない）面をイメージングシステムと直接接触させて置いた。
光ファイバースライドウェルへの配列決定試薬の周期的な送達および配列決定反応の副産物のウェルからの洗浄は、流体システムの予めプログラムされた操作により達成された。そのプログラムは、試薬名（Ｗａｓｈ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびＰＰｉ標準液）、流速および各スクリプト工程の持続時間を特定するＩｎｔｅｒｆａｃｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＩＣＬ）スクリプトの形態で記載した。流速は、すべての試薬について４ｍＬ／分と設定し、フローチャンバー内の線速度は、約１ｃｍ／ｓであった。配列決定試薬のフロー順をカーネルに構築し、第１のカーネルは、ＰＰｉフロー（２１秒）、その後の１４秒の基質フロー、２８秒のアピラーゼ洗浄および２１秒の基質フローからなった。第１のＰＰｉフローの後に、２１サイクルのｄＮＴＰフロー（ｄＣ−基質−アピラーゼ洗浄−基質−ｄＡ−基質−アピラーゼ洗浄−基質−ｄＧ−基質−アピラーゼ洗浄−基質−ｄＴ−基質−アピラーゼ洗浄−基質）が続き、ここで、各ｄＮＴＰフローは、４つの個別のカーネルから構成された。各カーネルは、８４秒の長さ（ｄＮＴＰ−２１秒、基質フロー−１４秒、アピラーゼ洗浄−２８秒、基質フロー−２１秒）であり；画像を、２１秒後および６３秒後に捕捉する。ｄＮＴＰフローの２１サイクルの後、ＰＰｉカーネルを導入し、次いで、さらにｄＮＴＰフローの２１サイクルを続けた。配列決定試行の終わりに第３のＰＰｉカーネルを続けた。総試行時間は、２４４分であった。この試行を完了するのに必要な試薬は、以下のとおりである：５００ｍＬの各洗浄溶液、１００ｍＬの各ヌクレオチド溶液。試行の間、すべての試薬を室温で維持した。フローチャンバーおよびフローチャンバー入口チューブの温度は、３０℃に制御し、フローチャンバーに入るすべての試薬は、予め３０℃に加熱した。
（イメージングシステム）
カメラは、１−１イメージングファイバーバンドルに直接連結されたＦａｉｒｃｈｉｌｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ＬＭ４８５ ＣＣＤ（４０９６×４０９６ １５μｍピクセル）を装着したＳｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）シリーズ６００カメラであった。−２０℃に冷却されたこのカメラを２つのモードのいずれかで操作することができる：（ｉ）フレーム移動モード（ｆｒａｍｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｏｄｅ）（ここで、ＣＣＤの中心部分は、イメージングに使用するのに対し、ＣＣＤの外側部分は、画像保存および遅い読み出し（このモードは、小さい光ファイバースライド用に使用する）に使用する）または（ｉｉ）全フレームモード（ｆｕｌｌ ｆｒａｍｅ ｍｏｄｅ）（ここで、ＣＣＤ全体をイメージングに使用し、各フローサイクルの洗浄（すなわち暗い）部分の間に読み出しを行う（このモードは、６０×６０ｍｍ２スライドに使用する）。ＣＣＤの各角において４口を通してデータを読み出した。シグナル統合は、フレーム移動モードにおいてフレームシフト時間約０．２５秒で、１フレームあたり２８秒に設定した；全フレームモードでは、シグナル統合（フレーム持続時間）を２１秒（洗浄捕捉フレーム）および６３秒（ヌクレオチド捕捉フレーム）に設定した。すべてのカメラ画像を、コンピュータハードドライブ（ＩＢＭ ｅＳｅｒｖｅｒ ｘＳｅｒｉｅｓ ３３７，ＩＢＭ，Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ）上にＵＴＩＦＦ１６形式で保存した。
（ウェル間拡散）
１つのウェルから隣接ウェルへの反応副産物の拡散に対する本発明者らのシステムの感度を評価するために、本発明者らは、ウェル間拡散挙動の単純化１次元モデルを開発した。本発明者らは、現在のウェル間距離５０μｍにおいて、ＡＴＰの拡散が、直近のウェルにおいておよそ１０％以下のバックグラウンドシグナルを誘導し得ることを見出した。本発明者らは、このノイズの起源を抑制するために補正コンピュータアルゴリズムを開発した。
本発明者らは、光ファイバー表面板の１次元モデルを作製し（すなわち、線状のウェルのアレイをモデル化）、ここで、それらのウェルを、配列決定反応の間にピロリン酸およびＡＴＰを生成する集中化学リアクタとして表した。各ウェル内において、反応副産物の生成を以下のように一連の結合運動方程式によってモデル化することができる：
Figure 2009502202
 この一連の方程式の数値解法を図４９に示す。
２つの隣接するウェルを考慮するとき、以下の一連の方程式を加えなければならない：
Figure 2009502202
 ウェル間のクロストークは、物質移動係数ｋｃおよび混合比θによって特徴付けられ、フロー条件およびウェルの幾何学によって決定される。これらのパラメータ（ｋｃ，θ）は、有限要素法を用いて完全な３次元の２ウェルの問題を解くことによって得られる；次いで、それらの値を同様のフローおよびウェル配置について複数ウェルのモデル化に拡張した。輸送現象と化学反応現象を分離することにより、配列決定を高い光ファイバー表面板占有数でシミュレートすることおよび隣接ウェル間の化学物質汚染の作用を探査することが可能となる。上記方程式の数値解法は、著しく間隔が狭くなったとしても（８μｍ）、ウェル間の作用が低いままであることを示す（図５０）。
（フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ））
オンボードコンピュータは、６００万ゲートのＶｉｒｔｅｘ ＩＩ ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）チップ（Ｘｉｌｉｎｘ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を搭載しているアクセサリＲＣ２０００ ＰＣＩボード（Ｃｅｌｏｘｉｃａ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）に取り付けられている。本発明者らは、ハードウェアにおいて連続的な画像処理工程を行うアルゴリズムをエンコードするＦＰＧＡバイナリーモジュールにダウンロードするソフトウェアを開発した。Ｈａｎｄｅｌ−Ｃ（Ｃｅｌｏｘｉｃａ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を用いて、ＦＰＧＡハードウェアロジックを作製した。配列決定試行が終わるときに、オンボードコンピュータがすべてのデータを利用できるようになり、最終的なシグナル調整を行い、フラグメントを特定のゲノムにアラインするか、またはショットガン構築を行う。ＦＰＧＡが存在しない場合、本明細書中に記載の配列決定試行に対する画像処理には、オンボードコンピュータにおいてさらに６時間を要する。
（画像処理）
一旦、イメージングシステムに載せられると、光ファイバースライドの位置は、移動しない；これにより、各配列決定試行の前のＰＰｉ標準液のフローの間の発光に基づいて、画像解析ソフトウェアが各ウェルの位置（ＣＣＤピクセル座標における）を決定することができるようになる。操作中に、このカメラによってスライド全体が同時に画像化される。単一のウェルは、約９ピクセルによって画像化される。データ処理の第１の工程は、各ピクセルについて局所的なバックグラウンドを自動的に決定する「収縮−膨張」アルゴリズムを用いてピクセルレベルで各取得画像についてバックグラウンド減算を行うことである。次いで、各ヌクレオチドフローについて、フローの持続時間全体に亘って特定のウェルを網羅するピクセルごとに収集した光強度を合計することによって、その特定のフローにおける特定のウェルについてシグナルを生成した。本発明者らは、光学的な漏出（光ファイバーのクラッディングは、完全に非透過ではなく、ウェル内で生成された微量の光が隣接ウェルに透過する）に起因するウェル間のクロストークおよび１つのウェルからさらに下流の別のウェルへの（合成中に生成された）ＡＴＰまたはＰＰｉの拡散を排除するために取得した画像を補正した。この補正を行うために、本発明者らは、低占有条件下でのクロストークの程度を経験的に決定し、逆畳み込み（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）行列を導くことにより、隣接ウェルに由来する寄与を各ウェルのシグナルから除去した。各ウェル中の酵素保持ビーズの数のばらつきおよび各ビーズに結合している鋳型コピーの数のばらつきを説明するために、２種類の正規化を行う：（ｉ）配列決定試行のＰＰｉ標準液のフローの前後を基準にすることによってまず未加工のシグナルを正規化し、（ｉｉ）これらのシグナルを、各鋳型に含まれる既知「キー」配列の最初の３塩基の取り込みの間に測定したシグナルを基準にすることによってさらに正規化する。
（シグナル処理）
本発明者らは、各フローおよび各ウェルにおいて測定したシグナルを補正することにより、持ち越しおよび不完全な伸長を説明した。直接、任意の既知配列に対する同調性喪失の程度を計算し、所与のレベルの持ち越しおよび不完全な伸長を仮定する。モデル計算の結果である表２５は、配列決定精度に対するこれらの作用の影響を示している；表２５は、補正が行われないと仮定するときに、様々なリード長におけるリード精度が約９９％を達成するために許容され得る不完全な伸長および持ち越しの程度を示している。あるいは、同調性の喪失に対して未加工のシグナルを補正するために逆変換を使用することによって、より高い精度が、類似の値の不完全な伸長および持ち越しにより達成され得るか、またはより高レベルの不完全な伸長および持ち越しは、シグナルを補正することによって同レベルの精度で適応され得る。持ち越しおよび不完全な伸長の量ならびに基礎を成す配列は、経験的に未知であるので、本発明者らのアプローチは、反復性の技術および測定されたシグナルとモデルの結果との間で最小二乗法適合を達成するための二次元最小化に基づく。これらの誤りの累積的な影響に起因して、特にリードの終わりに向かって、持ち越しおよび不完全な伸長の影響をこうむる。
（試験フラグメント）
本発明者らは、同一塩基が徐々に長くなり、かつ短くなっていく配列（ホモポリマー）（２Ｎ，３Ｎ，４Ｎ，５Ｎ，６Ｎ，５Ｎ，４Ｎ，３Ｎ，２Ｎ）（単一ヌクレオチドが組み入れられている）を含む配列決定が困難なフラグメントを作製することにより、本装置の配列決定の性能を調査した。これらのフラグメントにより、付加的エラーを引き起こし得る任意のサンプル調製またはエマルジョンＰＣＲの人工産物を本発明者らの評価から排除することが可能となる。配列決定全体の精度を表２５に示し、図５１ではホモポリマーによって崩壊された精度を示している。
（試験フラグメントプラスミドＤＮＡの精製）
個別の試験フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物にトランスフェクトし、必要になるまでグリセロール中で−８０℃にて保存した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の個別のバイアル（各々は、６つの個別試験フラグメントのうちの１つを含んでいる）を播種し、ＬＢ Ａｍｐ／Ｘ−ｇａｌ寒天ペトリ皿上で生育した。プラスミドを含むコロニーをブルー／ホワイトスクリーニングにより選択し、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で３７℃にて一晩、飽和に達するまで生育した。プラスミドを回収し、ＱｉａＦｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の指示書に従って２５ｍＬの培地から精製した。精製プラスミドを１×ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）中に１０ｎｇ／μＬに希釈し−２０℃で保存した。
（試験フラグメントのＰＣＲ増幅）
ＰＣＲプライマー対（その一方が５’ビオチンを含んでいる）を用いて増幅することにより、試験フラグメントをビオチン化した。９８０マイクロリットルのＰＣＲマスターミックス（１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）、２．５ｍＭ ＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＭフォワードプライマー（５’−ＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧ−３’配列番号：６８）および１μＭビオチン化リバースプライマー（５’−ビオチン−３連続１８−原子ヘキサ−エチレングリコールスペーサーＣＣＡＴＣＴＧＴＴ ＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＣ−３’配列番号：６９）（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．０２Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｈｉ−Ｆｉ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．５ｍＬチューブ中で調製し、ボルテックスすることにより十分に混合し、５０μＬのネガティブコントロールを取り出した。２０マイクロリットルの所与の試験フラグメントを残りに加え、その溶液を混合し、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに５０μＬずつ分注した。残り５つの試験フラグメントについてこのプロセスを繰り返した。ＰＣＲ反応物および対応するネガティブコントロールをＭＪサーモサイクラーにかけ、以下の条件下で増幅した：９４℃での４分間のホットスタート開始、その後、９４℃１５秒、５８℃３０秒、６８℃９０秒から構成される３９増幅サイクルおよび単一の６８℃１２０秒の伸長。１０℃で無限に保持することにより増幅を終結した。各試験フラグメントについて作製した各９５０μＬのＰＣＲ反応物を６本のＭｉｎＥｌｕｔｅカラムにわけ、最後の工程の後に併せたこと以外は製造者の指示書に従って、ビオチン化ＰＣＲフラグメントを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて処理することにより精製した。ＰＣＲ産物の量およびクオリティを、製造者のガイドラインに従って調製したＤＮＡ５００ ＬａｂＣｈｉｐを用いたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにより評価した。３つ組の１μＬアリコートを解析した；精製ＰＣＲ産物の濃度は、代表的には１〜３ｐｍｏｌ／μｌであった。
ビオチン化ＰＣＲ産物のストレプトアビジンビーズへの結合。ビオチン化ＰＣＲ産物を、ふるいにかけられたセファロースストレプトアビジンコート粒子（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に以下の通り１０００万ＤＮＡコピー／ビーズで固定した。セファロースストレプトアビジン粒子の５０ｍＬボトル５本を２８μｍのＮ／２８／１７／６５ナイロンメッシュ（Ｓｅｆａｒ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｄｅｐｅｗ，ＮＹ，ＵＳＡ）に通してふるいにかけることにより、大きいビーズを排除した。次いで、このフィルターを通過したビーズを、２５μｍのポアサイズを有するＮ２５／１９／５５ナイロンメッシュ（Ｓｅｆａｒ Ａｍｅｒｉｃａ）に通した。次いで、フィルターに保持されたビーズ、すなわち、直径２７〜３２μｍの範囲の大きさを示すビーズをＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ）で定量し、続いて、ビオチン化試験フラグメントに結合させるために使用した。ふるいにかけられたビーズの７００，０００個のアリコートを１００μＬの２Ｍ ＮａＣｌ溶液で１回洗浄し、軽くボルテックスすることにより再懸濁し、次いで、Ｍｉｎｉｆｕｇｅにおいて最高速度で１分間遠心することにより、ビーズを沈殿させた。次いで、上清を除去した後、ビーズを２Ｍ ＮａＣｌで再度洗浄し、３０μＬの２Ｍ ＮａＣｌに再懸濁した。合計１１．６ｐｍｏｌのビオチン化ＰＣＲ産物をビーズに加え、ボルテックスすることにより、ビーズを溶液に再懸濁し、タイタープレート振盪機上で、速度７にて室温で１時間、ストレプトアビジンビーズに結合させた。室温で１０分間、水平チューブ回転装置にてアルカリ融解溶液（０．１Ｍ ＮａＯＨ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中でインキュベーションすることにより、ビオチン化されていない第２の鎖を除去した。変性したビオチン化されていない鎖を含む上清を廃棄し、ビーズを１００μＬの融解溶液で１回、１００μＬの１×アニーリング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸，ｐＨ７．５；５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で３回洗浄した。次いで、そのビーズをＭｉｎｉｆｕｇｅにおいて最高速度で１分間遠心し、上清を廃棄し、そのビーズを２５μＬの１×アニーリング緩衝液に再懸濁した。５マイクロリットルの１００μＭ配列決定プライマー（５’−ＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣ−３’，ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 配列番号：７０）をビーズ懸濁液に加えた。次いで、ビーズ／プライマー混合物を５秒間ボルテックスし、ＭＪサーモサイクラーにおける以下の４段階アニーリングプログラムにかけた：６０℃５分、０．１℃／秒で５０℃に低下、５０℃１分、０．１℃／秒で４０℃に低下、４０℃で１分間保持、０．１℃／秒で１５℃に低下、１５℃で保持。アニーリング工程の後、ビーズを１００μＬの１×アニーリング緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５および５ｍＭ酢酸マグネシウム）で２回洗浄し、１×アニーリング緩衝液で最終体積２００μＬに再懸濁した。そのビーズを、標識したチューブストリップ中に１０μＬアリコートで必要になるまで４℃冷蔵庫にて保存した。
（ハイクオリティリード）
各ウェルにおける各フローにより、取り込み無しまたは１個、２個もしくは３個などのヌクレオチドの取り込みが生じる。任意の配列決定試行について、これらの群の各々についてのシグナル強度のヒストグラムをコンパイルすることができる（既知配列を扱うとき）。図５２に示されるように、様々な群のシグナル強度がわずかに重複する。一般に、良好なリード（すなわち、エラーがほとんどなく参照ゲノムにそのリードがマッピングされる）では、シグナルの大部分が取り込まれたヌクレオチドの数に等しい整数値に近似のシグナルを有する。図５３は、連続長のホモポリマーについて測定されたすべてのシグナルの平均が、ホモポリマー長とともに非常に高い程度の精度に直線的に増大していることを示している。本発明者らは、ネガティブフロー（ヌクレオチドが取り込まれないフロー）とポジティブフロー（少なくとも１個のヌクレオチドが取り込まれるフロー）との間の重複領域（０．５＜シグナル＜０．７）に相当な数のシグナルが集まるリードは、２つ以上の鋳型のコピーを保持しているビーズが起源であることがほとんどであるので、そのようなリードは、不良なクオリティ（すなわち、ゲノムのどの部分にもマッピングされないか、または多数のエラーを含んだままマッピングされる）であることを見出した。これにより、本発明者らは、「ハイクオリティリード」を選別するための経験的なフィルター（各リードについて、本発明者らは、重複領域に入るフロー数を計数し、そのようなフローの数がフローの総数の５％未満であるリードだけを選択する）を開発できた。この基準を満たさないリードについて、本発明者らは、その基準を満たす（不確定領域内のフローの数が残りのフローの５％未満になる）までかまたは、フローの数が８４未満（２１サイクル）（リードがハイクオリティリードのプールから取り除かれたと考えられる時点）に減少するまで、リードの終わりからフローを排除することによって段々にそのリードを削っていく。
（塩基コール）
原則として、観察されたシグナルの強度が、取り込まれたヌクレオチドの数を直接示す。しかしながら、図５２に示されるように、様々なホモポリマーのシグナル強度の分布がわずかに重複する。この重複がなければ、シグナルの任意の所与の配列を明確に塩基コールが可能になる。ピロリン酸ベースの配列決定法において、２種類の直接的なエラーは、オーバーコール（ゲノム内に実際に存在する塩基よりもコールされる塩基が１個多い）であるか、またはアンダーコール（ゲノム内に実際に存在する塩基よりもコールされる塩基が１個少ない）である。塩基は、１つの既知ヌクレオチドの付加によって一度に決定されるので、塩基の同一性は、問題にならない。置換エラー（１つの塩基が別の塩基としてコールされること）は、２つの連続したエラーが発生すること（アンダーコールの後のオーバーコールまたはその逆）によって生じるがゆえに、かなりまれである。本発明者らは、試験フラグメントリードに対してよりもライブラリリードに対してのほうが単一のリードレベルにおける平均エラー率が、高いことを観察した（図５１と図５４とを比較のこと）。本発明者らは、ライブラリを配列決定するとき、いくつかのビーズが２つ以上の鋳型のコピーを保持するという仮説と、本発明者らの測定値および高いエラー率とが矛盾していないことを確証する予想シグナルのコンピュータモデルを開発した。これらのリードのほとんどは、上述した選別プロセスによって排除されるようになる。しかしながら、混合物が１つの鋳型を著しく好むリードは、排除され得ず、また、エラー率全体に大きく寄与し得ない。
個別のリードレベルにおいて、表２５および表２６は、アラインされた塩基の総数を基準にしたエラー率を報告している。これらの数値は、現在の配列分析装置によって報告されるエラー率に類似している；しかしながら、エラーは、ネガティブフローの間に起こり得るので、これらの数値は、本装置の固有の性能を最もよく特徴付けているわけではない。ネガティブフローであるか、またはポジティブフローであるかに関わらず、各フローは、エラー率を割り当てられ得る。例えば、表２６において解析されている２３８，０６６個のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのリードについて、フローの総数に対する挿入率は、１．５３％である（アラインされた塩基の数を基準とするときの２．０１％と比較）；同様に、フローの総数を基準とした欠失エラー率は、１．４８％である（アラインされた塩基の数を基準とするときの１．９４％と比較）。
（クオリティスコア）
所与のシグナル値に関連する任意の特定の塩基コールにおける信頼度（またはその「クオリティ」）は、そのシグナルが、所与のホモポリマー長に対するシグナルの分布に入る関数である。本発明者らが、様々な既知ゲノム（アデノウイルス、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）ならびに試験フラグメントを配列決定し、得られたリードをマッピングした多数の試行に基づいて、本発明者らは、ネガティブフローが対数正規分布をとるのに対し、すべてのポジティブフローが平均値および基礎をなすホモポリマー長に比例した標準偏差で正規分布する（図５３）ことを決めた；さらにこれらの分布は、様々なゲノムおよび試験フラグメントに亘って顕著に変わらなかった。この観察結果から、個別の塩基コールについてクオリティスコアが算出され得る。特定の塩基コールに対するクオリティスコアを評価するために、測定されたシグナルがコールされた長さと少なくとも等しい長さのホモポリマーが起源である確率を決めなければならない。例えば、２つのＡが特定のシグナルについてコールされる場合、２番目のＡについてのクオリティスコアは、観察されたシグナルが２以上の長さのホモポリマーから起きた確率によって与えられる。シグナルを測定する確率（ホモポリマー長が与えられている場合）は、経験的に確立されているので、ベイズの定理を用いて、以下の通り、特定のホモポリマー長が観察されるシグナルを生成した確率を決定することができる：
Figure 2009502202
 式中、ｓは、観察されたシグナルであり、ｎは、シグナルを生成したホモポリマーの長さである。上述したように、長さｎのホモポリマーが与えられているときのシグナルｓを測定する確率Ｐ（ｓ｜ｎ）は、ガウス分布する。ランダムなヌクレオチド配列について、長さｎのホモポリマーに遭遇する確立Ｐ（ｎ）は、単純に１／４ｎである（乗法正規化定数は無視する）。次いで、各フラグメントに対してコールされた各塩基に割り当てられたクオリティスコアは、以下の変換を用いてｐｈｒｅｄの等価物として報告され得る：
Figure 2009502202
 本発明者らは、シグナルの分布を確立するために使用したゲノム以外の既知ゲノムを配列決定して、算出ｐｈｒｅｄスコアおよび観察ｐｈｒｅｄスコアを関連付けることによって、このアプローチの正当性を検証した（図５６）。本発明者らの関連付けは、ｐｈｒｅｄ５０まで優れた対応を示し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法およびキャピラリー電気泳動に対して確立されたｐｈｒｅｄと比べて遜色ない（Ｌｉ，Ｍ．，Ｎｏｒｄｂｏｒｄ，Ｍ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｌ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，５１８３（２００４））。
（フロー−スペースマッピング、コンセンサス精度およびゲノム網羅率）
ヌクレオチドが流れる順序が与えられるとき、所与の参照ゲノムが、理想的シグナル値の既知の連続物を意味する。この理想的なフローグラムは、非常に高速な検索を可能にするために、連続的な重複している特定の長さの指標化したサブフローグラムに分割される（デフォルトの長さは、２４フローである）（各サブフローグラムがポジティブフローで開始する）。標的に対してクエリフローグラムをマッピングするために、本発明者らは、指標化工程において使用される長さを有するスライディングサブフローグラムにクエリフローグラムを分割し、指標化した理想的なサブフローグラムのスペースを検索する。完全マッチは、参照ゲノムに対してクエリフローグラムをアンカーする。次いで、５’末端から始めてリード長全体に動いて、リードのアライメントを評価した。ユーザが特定した総ミスマッチ閾値を満たす最長のセグメントを選択し、その点において、アライメントが終結し、そのリードを切断する。変異または他のゲノムのバリエーションを検出するために、そのリードを非常に低いレベルのストリジェンシーで参照に対してアラインする。一旦、そのようなアライメントが行われると、標的中の同じ位置に対応する様々なリードからのすべてのフローシグナルが、算術的に平均され、その後、個別の塩基コールが行われる。図５４に示されるように、この手順は、エラー率の低下に極めて効果的である；それが、デノボ構築物を再度配列決定することまたはコンセンサス塩基コールすることのいずれであっても同等に適用可能である。本発明者らは、対応するホモポリマーに対する最も近いシグナル閾値からの距離の絶対値を測定し、特定のゲノムの位置において測定されたすべてのシグナルの正規化された標準偏差でその絶対値を割り算することによって（基礎を成す配列の知見に頼ることなく）、平均シグナルのクオリティを評価する。本発明者らは、この比をＺ−スコアと呼ぶ。観察された変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の信頼性を増大させるために、ハイクオリティコンセンサス配列を生じる最小Ｚ−スコアを課することによってコンセンサス配列を選別する。正確な既知配列を使用することによって、本発明者らは、コンセンサスコールのクオリティおよび最小Ｚ−スコアとコンセンサス精度との間の相関の評価をもたらすエラーの数を決定する。本発明者らは、コンセンサス配列の精度が９９．９９％以上である領域に基づいて、ゲノム網羅率を報告し、それは、代表的には、４に等しい最小Ｚ−スコアを選別することによって達成される。Ｚ−スコアによる制限がない場合、当然、本発明者らは、わずかに低いコンセンサス精度でより大きい網羅率を達成する。
（デノボ配列アセンブラー）
本発明者らは、ハイクオリティなリード（上述の通り）を選別することにより、処理されるべきフローグラムが、もとのサンプルからの配列データからなる可能性が最も高いことを確かにした。Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｒは、完全な総当り（ａｌｌ−ａｇａｉｎｓｔ−ａｌｌ）フラグメント比較を行うことにより、フラグメント間のすべての可能性のある重複を同定した。本装置によって生成されたリードフラグメントを構築するために、Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｒは、各リードのフローグラムを直接比較することによってリードの類似度を評価する；本発明者らは、スカラー積を一般に使用することにより、フローグラム間の類似度を評価する：
スコア＝ΣｉＳ１ｉ・Ｓ２ｉ
式中、Ｓ１ｉおよびＳ２ｉは、シグナル強度（各「ベクター」の長さが１に等しくなるように正規化される）であり、推定重複領域に亘ってその合計が行われる。本発明者らは、０．８５−０．９０の閾値が最適な予測性および選択性をもたらすことを見出した。２つのフローグラム領域間で観察された重複スコアが、選択された最小ストリンジェンシー値を超える場合、重複フラッグ（ｆｌａｇ）は、このリード対に対して設定される（重複判定は、同様に逆相補のリードの確率を考慮する）。有効性を増大するために、Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｒは、可能性のある重複候補としてみなされ得るフラグメントを迅速に同定するハッシュインデックス法を使用する。Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｒによって決定されたリード間のすべてのペアワイズ重複のセットが与えられている場合、Ｕｎｉｔｉｇｇｅｒモジュールは、これらのリードをユニティグに分類する。ユニティグは、その相互間の重複が、一致しており、ユニティグの外部のリードによって争われる余地がないリードの集団である。ユニティグの端は、構築されるゲノム中の反復領域からか、または完全に配列決定されていない領域からの入口または出口を表す。ユニティグは、最大深さの重複（すなわち、互いに重複が最大であるペアワイズリード）で一致する（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ）鎖から構築される。最終的に、Ｍｕｌｔｉａｌｉｇｎｅｒは、ユニティグを構成するすべてのリードを得て、そのすべてのリードシグナルをアラインする。Ｍｕｌｔｉａｌｉｇｎｅｒは、実際の塩基コールを行うために使用する単一の平均シグナルを得るために所与の位置についてシグナルをまず平均することによってコンセンサスコールを行う。
次いで、Ｍｕｌｔｉａｌｉｇｎｅｒによって生成されたユニティグを、コンティグ最適化プロセスを通して送り、ここで、重複検出または最大深さの重複の鎖の使用における欠損によって引き起こされる切断が修復される。Ｍｕｌｔｉａｌｉｇｎｅｒユニティグは、その端が、重複が最大の鎖を破断し得る１つ以上の誤ったリードによって反復領域または複数のコンティグに「破断」された領域に伸びているという特性を有する。そのコンティグ最適化プロセスは、２つの工程を包含する。第１工程は、総当りユニティグ比較を行い、ユニティグ間で検出された任意の重複を連結する。ヌクレオチドスペースにおいて行われるこの比較の後、コンティグ配列が共通の領域から分岐する位置に基づいて反復領域境界を同定する分岐点解析が行われる。コンティグをそれらの境界で破断し、５００塩基より大きい任意の非反復コンティグを出力する。
コンティグ最適化プロセスの第２工程は、第１ステップからのコンティグを得て、２つのコンティグ端にまたがる任意のリードを用いてそれらのコンティグを連結する「再び綴じる工程」を行う。第１工程と同様に、これはヌクレオチドスペースにおいて行い、分岐点解析装置を用いて、任意の反復領域の連結を同定する。最終工程は、クオリティ管理工程であり、ここで、得られたコンティグ配列にすべてのリードをマッピングし、４リードより短いコンティグを切断し、５００塩基より大きいコンティグだけを出力する工程である。
最終的に、コンセンサス再生工程を行うことにより、最終的なコンティグコンセンサスを計算した。この工程は、反復手順を行うこと以外は、先の節で記載した同じフロースペースマッピングおよびコンセンサス生成工程を使用するが、ここで、４以上のＺ−スコアを有する塩基が変化しなくなるまで、新しいコンセンサスをインプットとしてこの手順に対して再使用する。次いで、得られたコンティグおよびコンセンサス配列をアセンブラープロセスによって出力する。
（両端配列決定）
個別のウェル内の単一鋳型の両端から配列決定（「両端配列決定」）を行うために、セファロースＤＮＡ捕捉ビーズに付着した２つのオリゴヌクレオチドプライマー（各方向に１つずつ）を用いてエマルジョンＰＣＲ手順を変更する。２つの固有の配列決定プライマーが、ライブラリフラグメントに取り込まれるように、ｓｓＤＮＡライブラリ調製に使用したアダプター配列を構築する（各鎖について１つずつ）。両端配列決定において、２つの配列決定プライマーを用い、第２の配列決定プライマーは、３’リン酸によって保護されている。単一端配列決定で１方向において配列決定を行う。２５ｍＭトリシン、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｍｇ／ｍＬ ＰＶＰ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎおよび２μＭの各ジデオキシヌクレオチドおよび２μＭの各デオキシヌクレオチドを含むキャッピング緩衝液を流すことによって、第１の鎖の配列決定を終結した。２５ｍＭトリシン、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｍｇ／ｍＬ ＰＶＰ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎおよび８．５単位／Ｌのアピラーゼを含むアピラーゼ緩衝液を流すことによって、残存デオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドを除去した。２５ｍＭトリシン中の５単位／ｍＬの子ウシ腸管アルカリホスファターゼ、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｍｇ／ｍＬ ＰＶＰ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎを含む切断緩衝液を流すことによって、第２のブロックされたプライマーを修飾３’リン酸化プライマーの３’末端からリン酸基を除去することにより未ブロックする。第２の未ブロックされたプライマーを、１０００単位／ｍＬのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ラージフラグメントを流すことにより、ポリメラーゼを加えることによって活性化し、利用可能なプライマー部位すべてを捕捉する。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ラージフラグメントによる第２の鎖の配列決定は、単一端の配列決定とまったく同じように所定のサイクル数に対してヌクレオチドを連続的に加えることにより進めた。実証実験において、本発明者らは、両端配列決定が、対をなした端のリードをもたらし、第２の鎖について配列決定クオリティを有意に喪失しないことを証明した。図５７は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＣＯＬの両端配列決定試行における増幅フラグメントからのマッピングされた対をなしたリードのリード長を示している（ｄｅ Ｌｅｎｃａｓｔｒｅ，Ｈ．，Ｔｏｍａｓｚ，Ａ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８，２５９０（１９９４））２１ サイクルの後、２１サイクルが続く）；表２６では、両方のリードについて、個別のリードレベルにおける配列決定統計学的結果をまとめている。
Figure 2009502202
Figure 2009502202
 すべての試行（４２サイクル）を６０×６０ｍｍ２光ファイバースライド上で行った。明確にするために、Ｚ≧４のコンセンサス配列についての統計学的結果のみを示している。断片化し、アダプター連結したゲノムＤＮＡの単一の起源から開始して、本発明者らは、１試行あたり２つのビーズエマルジョンを作製した。８回の配列決定試行により、平均３２，５０４，２６０塩基（ＣＶ＝２．４％）の平均２９２，７５５個のハイクオリティリード（ＣＶ＝２．２％）がもたらされ、そのうち、平均２５，２９６，６６３個（ＣＶ＝３．５％）がｐｈｒｅｄ２０以上のクオリティであった。１箇所にマッピングされた平均２２６，６１９個のリード（ＣＶ＝２．５６％）において、平均２６，３３９，０２７個の塩基がマッピングされた（ＣＶ＝２．５％）。最小Ｚ−スコアを４に設定することにより、平均コンセンサス精度が９９．９９６％（ＣＶ＝０．００１％）の平均網羅率９８．１５％（ＣＶ＝０．０８％）であった。
Figure 2009502202
 第１の試行では、１１０，５１６個の完全なリードが得られ（４０．８％）、第２の試行では、８８，０６８個の完全なリードが得られた（３４．１％）。個別のリードエラー率は、マッピングされたリードにおける塩基の総数を基準にしている。１２個の誤構築されたコンティグが存在し（３個は、崩壊したタンデム反復によるものであり、９個は、別個のゲノム領域を誤って連結したものであった）；構築の結果を評価する前にこれらを手動で訂正した。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍと同様に、カバーされていない塩基の大部分（８８％）は、このゲノムの７％を網羅する解読不能なゲノムの反復領域に属していた。最小Ｚ−スコア４で本発明者らが塩基を選択したとき、ゲノムの９０．４４％をコンセンサス精度９９．９９２％で網羅した。比較として、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの元の配列決定では、１．５ｋｂｐ超の３９０個のコンティグが生成された（Ｔｅｔｔｅｌｉｎ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３，４９８（２００１））。
図１は鋳型ＤＮＡフラグメント化（図１Ａ）、末端ポリッシング（図１Ｂ）、アダプターライゲーション（図１Ｃ）、ニック修復、鎖伸長およびゲル単離（図１Ｄ）の工程を包含するライブラリ調製の全プロセスの模式的表示を示す。図１Ｅは鋳型ＤＮＡの増幅および配列決定のための段階の模式的表示を示す（図１Ｅ）。 図１は鋳型ＤＮＡフラグメント化（図１Ａ）、末端ポリッシング（図１Ｂ）、アダプターライゲーション（図１Ｃ）、ニック修復、鎖伸長およびゲル単離（図１Ｄ）の工程を包含するライブラリ調製の全プロセスの模式的表示を示す。図１Ｅは鋳型ＤＮＡの増幅および配列決定のための段階の模式的表示を示す（図１Ｅ）。 図１は鋳型ＤＮＡフラグメント化（図１Ａ）、末端ポリッシング（図１Ｂ）、アダプターライゲーション（図１Ｃ）、ニック修復、鎖伸長およびゲル単離（図１Ｄ）の工程を包含するライブラリ調製の全プロセスの模式的表示を示す。図１Ｅは鋳型ＤＮＡの増幅および配列決定のための段階の模式的表示を示す（図１Ｅ）。 図１は鋳型ＤＮＡフラグメント化（図１Ａ）、末端ポリッシング（図１Ｂ）、アダプターライゲーション（図１Ｃ）、ニック修復、鎖伸長およびゲル単離（図１Ｄ）の工程を包含するライブラリ調製の全プロセスの模式的表示を示す。図１Ｅは鋳型ＤＮＡの増幅および配列決定のための段階の模式的表示を示す（図１Ｅ）。 図１は鋳型ＤＮＡフラグメント化（図１Ａ）、末端ポリッシング（図１Ｂ）、アダプターライゲーション（図１Ｃ）、ニック修復、鎖伸長およびゲル単離（図１Ｄ）の工程を包含するライブラリ調製の全プロセスの模式的表示を示す。図１Ｅは鋳型ＤＮＡの増幅および配列決定のための段階の模式的表示を示す（図１Ｅ）。 図１Ｆは本発明の方法による１８０〜３５０塩基対アデノウィルスＤＮＡライブラリのサンプル調製物を含有する代表的なアガロースゲルを示す。 図１Ｇはライブラリの調製、増幅および配列決定の詳細な模式的表示を示す。 図２Ａは本発明によるユニバーサルアダプター設計の模式的表示を示す。各ユニバーサルアダプターはＰＣＲプライミング用の２０ｂｐヌクレオチド配列、配列プライミング用の２０ｂｐヌクレオチド配列および非反復ヌクレオチド配列の固有な４ｂｐ判別配列（即ちＡＣＧＴ、ＣＡＧＴ等）を含有するように設計された２つの相補ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドから発生する。図２Ｂは本発明において使用するための代表的なユニバーサルアダプター配列対を示す。アダプターＡセンス鎖：配列番号１；アダプターＡアンチセンス鎖：配列番号２；アダプターＢセンス鎖：配列番号３；アダプターＢアンチセンス鎖：配列番号４。図２Ｃは本発明において使用するためのユニバーサルアダプター設計の模式的表示を示す。 図３は本発明によるニック化２本鎖ＤＮＡフラグメントの鎖置換および伸長を示す。合成オリゴヌクレオチドから発生させたユニバーサルアダプターのライゲーションの後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ処理の後に２つのニック化領域を含有する２本鎖ＤＮＡフラグメントが発生することになる（図３Ａ）。鎖置換酵素（即ちＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ）の付加によりニックが結合し（図３Ｂ）、ニック化鎖が鎖置換され、鎖のヌクレオチド伸長が完了（図３Ｃ）することにより非ニック化２本鎖ＤＮＡフラグメントが生成する（図３Ｄ）。 図４はストレプトアビジンコーティングビーズを用いた本発明による直接ライゲーションされた１本鎖ＤＮＡの単離を示す。ユニバーサルアダプターＡおよびＢ（２種の異なるアダプターは場合により「第１」および「第２」のユニバーサルアダプターとも称する）とのライゲーションの後、２本鎖ＤＮＡは４種の可能な組合せ：ＡＡ、ＢＢ、ＡＢおよびＢＡにおいてアダプターを含有することになる。ユニバーサルアダプターＢが５’−ビオチンを含有する場合は、磁性ストレプトアビジンコーティング固体支持体を用いてＡＢ、ＢＡおよびＢＢ集団を捕捉して単離する（集団ＡＡは洗浄除去される）。ＢＢ集団は、２本鎖ＤＮＡの各末端がビーズに結合して放出されないため、ビーズ上に保持される。しかしながら低塩緩衝液の存在下に洗浄される場合、集団ＡＢおよびＢＡのみが結合した鎖に相補的である１本鎖ＤＮＡフラグメントを放出することになる。１本鎖ＤＮＡフラグメントを上澄みから単離し、その後の増幅および配列決定のための鋳型として使用する。この方法は後に詳述する。 図５はＤＮＡ捕捉ビーズの構造の模式図を示す。 図６Ａはビーズ乳化増幅プロセスの１実施形態の模式図を示す。 図６Ｂはビーズ乳化増幅プロセスの１実施形態の模式図を示す。 図７はそれ自体に結合しているＤＮＡを有さないビーズを除去するための濃縮プロセスの模式図を示す。 図８Ａは本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 図８Ｂは本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 本発明による両端配列決定反応の模式的表示を示す。 図９は本発明によるパイロシーケンス装置上の両端配列決定デモンストレーションを示す。 図１０Ａは例示される両端配列決定プロセスを示す。配列番号：４４：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇｔ；配列番号：４５：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇ；配列番号：４６：ａｔｇｃｃａｃｃｇａｃｃｔａｇｔｃｔｃａａａｃｔｔ。 図１０Ｂは例示される両端配列決定プロセスを示す。配列番号：４４：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇｔ；配列番号：４５：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇ；配列番号：４６：ａｔｇｃｃａｃｃｇａｃｃｔａｇｔｃｔｃａａａｃｔｔ。 図１０Ｃは例示される両端配列決定プロセスを示す。配列番号：４４：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇｔ；配列番号：４５：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇ；配列番号：４６：ａｔｇｃｃａｃｃｇａｃｃｔａｇｔｃｔｃａａａｃｔｔ。 図１０Ｄは例示される両端配列決定プロセスを示す。配列番号：４４：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇｔ；配列番号：４５：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇ；配列番号：４６：ａｔｇｃｃａｃｃｇａｃｃｔａｇｔｃｔｃａａａｃｔｔ。 図１０Ｅは例示される両端配列決定プロセスを示す。配列番号：４４：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇｔ；配列番号：４５：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇ；配列番号：４６：ａｔｇｃｃａｃｃｇａｃｃｔａｇｔｃｔｃａａａｃｔｔ。 図１０Ｆは例示される両端配列決定プロセスを示す。配列番号：４４：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇｔ；配列番号：４５：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇ；配列番号：４６：ａｔｇｃｃａｃｃｇａｃｃｔａｇｔｃｔｃａａａｃｔｔ。 図１１Ａはアンカープライマーを用いたローリングサークル系増幅の模式的説明図を示す。 図１１Ｂはアンカープライマーを用いたローリングサークル系増幅の模式的説明図を示す。パネルＢにおいて、配列は以下の通り、即ちｇａｃｃｔｃａｃａｃ ｇａｔｇｇｃｔｇｃａ ｇｃｔｔ（配列番号：７１）およびｔｃｇｔｇｔｇａｇｇ ｔｃｔｃａｇｃａｔｃ ｔｔａｔｇｔａｔａｔ ｔｔａｃｔｔｃｔａｔ ｔｃｔｃａｇｇｔｇｃ ｃｃａａｇｃｔｇｃａ ｇｃｃａ（配列番号：７２）である。 図１１Ｃはアンカープライマーを用いたローリングサークル系増幅の模式的説明図を示す。パネルＣにおいて、配列は以下の通り、即ちｇａｃｃｔｃａｃａｃ ｇａｔｇｇｃｔｇｃａ ｇｃｔｔ（配列番号：７１）、ａｃｔｔｃｔａｔｔｃ ｔｃａｇｔｔｇｃｃｔ ａａｇｃｔｇｃａｇｃ ｃａｔｔｇｔｇｔｇａ ｇｇｔｃｔｃａｇｃａ ｔｃｔｔａｔｇｔａｔ ａｔｔｔ（配列番号：７３）、およびｇｔｃｃｔａｇａａｔ ａｇａａｇｔａａａｔ ａｔａｃａｔｇｃｔｃ ｇａ（配列番号：７４）である。 図１１Ｄはアンカープライマーを用いたローリングサークル系増幅の模式的説明図を示す。パネルＤにおいて、配列は以下の通り、即ちｇａｃｃｔｃａｃａｃ ｇａｇｔａｇｃａｔｇ ｇｃｔｇｃａｇｃｔｔ（配列番号：７５）、ｔｃｇｔｇｔｇａｇｇ ｔｃｔｃａｇｃａｔｃ ｔｔａｔｇｔａｔａｔ ｔｔａｃｔｔｃｔａｔ ｔｃｔｃａｇｔｔｇｃ ｃｔａａｇｃｔｇｃａ ｇｃｃａ（配列番号：７６）、およびｔｇｃｔａｃ（配列番号：７７）である。 図１２は本発明による配列決定装置の図面を示す。 図１３は本発明による試薬送達／灌流チャンバーの図面を示す。 図１４は本発明のＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭと称するキャビティー形成光ファイバーバンドルの顕微鏡写真を示す。 図１５はその上に固定化されたＤＮＡ鋳型およびその上に固定化されたスルフリラーゼおよびルシフェラーゼを有するビーズで被覆されたピコタイタープレートの顕微鏡写真を示す。 図１６は試薬フローチャンバーおよびＦＯＲＡ（ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ）の模式的説明図を示す。 図１７は本発明の分析装置のダイアグラムを示す。 図１８はＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ内の顕微鏡的平行配列決定反応の模式的説明図を示す。 図１９は単一ウェル反応の顕微鏡写真である。 図２０はＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭローディングカートリッジを示す。「Ａ」は、カートリッジ内部に面しているマイクロウェルを有するＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを指し、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭウェルの開口側とローディングカートリッジの壁面との間の距離は０．３ｍｍであり；「Ｂ」はシリコンシーリングガスケットを指し；「Ｃ」は入口ポートを指し；「Ｄ」は入口ローディングチューブを指し；「Ｅ」は出口ポートを指し、「Ｆ」は出口チューブを指す。ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭはプラスチッククランプを用いてカートリッジ内に保持する。液体は、入口ローディングチューブＤを介して充填し、入口ポートＣを経由してＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭウェルの開口側とローディングカートリッジの壁面との間の空間に進入する。 図２１は分解図におけるＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭ増幅チャンバーを示す。「Ａ」は６個の保持ボルトを有する増幅チャンバー蓋を指し；「Ｂ」は閉鎖細胞泡沫絶縁パッドを指し；「Ｃ」は２５ｍｍ×７５ｍｍの標準的な顕微鏡スライドガラスを指し；「Ｄ」は厚み０．２５ｍｍのシリコンシートを指し；「Ｅ」はＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭを指し；「Ｆ」は増幅チャンバー基部を指し；「Ｇ」は第２の厚み０．２５ｍｍのシリコンシートを指す。 図２２は固相ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭＰＣＲの模式的ダイアグラムを示す。円筒状の構造は個々のＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅＴＭウェルを象徴化している。灰色の球形は固定化されたプライマーを有するビーズを象徴化している。フォワード「Ｆ」（赤）およびリバース「Ｒ」（青）プライマーを矢印で示す通り５’から３’方向に示す。フォワードおよびリバースプライマーに相補的な、合成された配列は、暗赤色（Ｆ相補鎖）および暗青色（Ｒ相補鎖）のバーで示す。１本鎖鋳型ＤＮＡは灰色実線で、新規に合成されたＤＮＡ鎖は灰色破線で示す。蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブは緑色のバーで示す。 図２３Ａ〜Ｃはビーズ固定化被験ＤＮＡフラグメントへの蛍光プローブハイブリダイゼーションを示す。図２３Ａ（左上）および２３Ｂ（右上）は、それぞれ対照ビーズに固定化されたフラグメントＡおよびフラグメントＢにハイブリダイズしたプローブの混合集団の特異性を示す。フラグメントＢのビーズはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７シグナル（赤色）を呈し、フラグメントＡのビーズはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８シグナル（緑色）を呈した。図２３Ｃ（下のパネル）はＰＴＰＣＲ後のＤＮＡ捕捉ビーズ由来のプローブ蛍光を示す。ビーズは多様な程度の黄色として示される均質なフラグメントＡおよびフラグメントＢ、並びに鋳型混合物のシグナルを示した。 図２４は１本鎖ＤＮＡライブラリの分析に由来する代表的なＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒの出力を示す。 図２５はＰＣＲプライマーおよび配列決定プライマーが隣接するインサートを示す。 図２６は交差ハイブリダイゼーション領域（ＣＨＲ）におけるＰＣＲプライマーのミスマッチにより生成した切断産物を示す。 図２７は融点に基づくプライマー候補に関する計算を示す。 図２８Ａ〜Ｄは本発明の方法の為に使用する噴霧器の組立を示す。チューブキャップを噴霧器の上端に設置し（図７Ａ）、キャップを噴霧器クランプアセンブリを用いて固定する（図７Ｂ）。噴霧器の底部は窒素供給源に連結し（図７Ｃ）、装置全体をパラフィルムで包装する（図７Ｄ）。 図２９Ａは噴霧化およびポリッシング後の１本鎖ＤＮＡライブラリのＬａｂＣｈｉｐ分析の代表的な結果を示す。 図２９Ｂは噴霧化、ポリッシングおよびゲル精製後のアダプターライゲーション１本鎖ＤＮＡライブラリに関する代表的サイズ分布結果を示す。 図３０は垂直シリンジポンプ下の攪拌プレート上にチューブを保持するために使用するジグを示す。ジグはビーズエマルジョン増幅反応混合物の３セットを保持するように改変されている。シリンジにはＰＣＲ反応混合物およびビーズを投入している。 図３１は垂直シリンジポンプの最適設置およびシリンジ出口下部のエマルジョンチューブの方向を示す。 図３２はシリンジプランジャーに対抗するシリンジポンププッシャーブロックの最適設置および攪拌プレート上のジグの最適な方向を示す。この配置を用いてシリンジの内容物を攪拌されたエマルジョンオイル内に吐出した。 図３３は本発明の方法による個々のマイクロリアクター内に懸濁されたビーズ（矢印参照）を示す。 図３４はＤＮＡ鋳型の両端の配列が決定されることを表している両端配列決定の結果を示す。配列番号：４４：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇｔ；配列番号：４５：ａｔｇｃａｃａｔｇｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｇｇ；配列番号：４６：ａｔｇｃｃａｃｃｇａｃｃｔａｇｔｃｔｃａａａｃｔｔ。 図３５Ａ〜Ｃは２本鎖配列決定のための２つのオリゴヌクレオチド配列を含むビーズのカプセル化を示す。 図３５Ａ〜Ｃは２本鎖配列決定のための２つのオリゴヌクレオチド配列を含むビーズのカプセル化を示す。 図３５Ａ〜Ｃは２本鎖配列決定のための２つのオリゴヌクレオチド配列を含むビーズのカプセル化を示す。 図３６は溶液相ＰＣＲおよびビーズ操作法への経路、即ち両端配列決定の好ましい実施形態における工程を示す。 図３７Ａ〜Ｅはビーズ上の増幅された鋳型ＤＮＡの乳化破断および回収、即ち両端配列決定の好ましい実施形態における工程を示す。 図３８は２本鎖配列決定の好ましい方法の模式的表示を示す。 図３９Ａ〜ＢはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのゲノムの配列決定の結果を示す。 図４０は両端配列決定を包含する１つの実験の平均リード長を示す。 図４１は両端配列決定実験における各ゲノム範囲に関するウェル数を示す。 図４２は両端配列決定操作法に由来する典型的なアウトプットおよびアライメントストリングスを示す。配列は上から下に配列番号４７〜配列番号６０である。 図４３Ａ〜Ｃはサンプル調製を示す。（Ａ）左上から時計回りに、（ｉ）ゲノムＤＮＡを単離し、フラグメント化し、アダプターにライゲーションし、１本鎖に分離し；（ｉｉ）ビーズあたり１フラグメントに好都合な条件下でフラグメントをビーズに結合させ、ビーズを油中ＰＣＲ反応混合物のエマルジョンの液滴内に捕捉させ、ＰＣＲ増幅を各液滴内で行うことにより固有なＤＮＡ鋳型の１０００万コピーを各々が担持したビーズとし；（ｉｉｉ）エマルジョンを破壊してＤＮＡ鎖を変性し、１本鎖ＤＮＡクローンを担持したビーズを光ファイバースライドのウェル内に付着させ；（ｉｖ）ピロホスフェート配列決定のために必要な固定化酵素を担持したより小さなビーズを、各ウェル内に付着させる。（Ｂ）ビーズを含有する液滴および空の液滴の両方を示すエマルジョンの顕微鏡写真。細い矢印は２８μｍのビーズを指しており、太い矢印は約１００μｍの液滴を指している。（Ｃ）光ファイバースライドの部分のＳＥＭ写真であり、ビーズ付着の前の光ファイバークラッディングおよびウェルを示している。 図４４は配列決定機器を示す。配列決定機器は以下の主要なサブシステム、即ち流体アセンブリ（Ａ）、ウェル含有光ファイバースライドを包含するフローチャンバー（Ｂ）、ＣＣＤカメラ系の画像化アセンブリ（Ｃ）および必要なユーザーインターフェースおよび機器の制御を与えるコンピューターよりなる。 図４５はＭ・ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの試行から得られた１１３塩基のリードのフローグラムである。ヌクレオチドはＴ、Ａ、Ｃ、Ｇの順序でフローする。配列はフローグラムの上に示す。種々のホモポリマーに相当するシグナル値間隔を右側に示す。最初の４塩基（赤色、フローグラム上）はＤＮＡ担持ビーズを含有するウェルを同定するために使用される「キー」配列を構成する。 図４６Ａは、Ｍ・ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのデータである。（Ａ）Ｍ・ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ配列決定試行の３０６，１７８のハイクオリティリードに関するリード長分布。この分布は個々の配列決定鋳型の塩基組成を反映する。 図４６Ｂは、Ｍ・ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのデータである。（Ｂ）同じ試行の２３８，０６６マッピングリードに関する塩基位置の関数としての単回リードレベルにおける平均のリード精度。 図４７は、非ホスホリル化ＡおよびＢアダプターをホスホリル化されポリッシングされた２本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントの末端にライゲーションする。ＡおよびＢのアダプターは両方のヌクレオチド配列およびＢアダプター上の５’ビオチンタグの存在において異なっている。ニックはアダプターの各々の３’接合部に存在し、ライブラリフラグメントはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性により充填される。ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を用いることによりホモ接合アダプターセット（Ａ／ＡおよびＢ／Ｂ）が隣接するフラグメントを除去し、１本鎖ライブラリ鋳型を生成させる。フラグメントをストレプトアビジンビーズに結合し；（ホモ接合のＡ／Ａアダプターセットを構成し、ビオチンを欠失している）未結合物を洗浄除去する。次に固定化されたフラグメントを変性し；Ｂ／Ｂフラグメントの両方の鎖はビオチン化Ｂアダプターを介して固定化されたまま残存させるが、Ａ／Ｂフラグメントは洗浄遊離させ、後の配列決定工程において使用する。複製のライブラリ調製はＣＶ５％以下でゲノム網羅率および過剰なサンプルをもたらすことがわかった。 図４８は噴霧化ＤＮＡサンプルのサイズ分布を示す。並存しているシャープなピークは上下の参照マーカーである。 図４９は単一ウェルの動的モデリングを示す。推定：１ビーズあたり１０００万ＤＮＡコピー、［ＤＮＡ］＝０．３μＭ。 図５０は化学的クロストークモデリングを示す。ｔ＝０において、［ＤＮＡ］ウェル１＝０．３μＭ、［ＤＮＡ］ウェル２＝０。 図５１はホモポリマー長の関数としての６つの被験フラグメントの混合物の配列決定における詳細な誤差率を示す。１塩基誤差率を、配列決定された単一塩基の総数と照合する。各ホモポリマーに関し、誤差率をその長さのホモポリマーに属する配列決定された塩基の総数と照合する。 図５２は負および正のフローに関するシグナル強度の典型的なヒストグラムを示す。 図５３は論文において考察されている、Ｍ・ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの試行のマッピングされたリードに関する種々のホモポリマーに帰属されたフローシグナルの平均を示す。 図５４はホモポリマー長の関数としてのＭ・ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍライブラリの配列決定における詳細な誤差率。試験フラグメントに関しては、１塩基誤差率を配列決定された単一塩基の総数と照合し；ホモポリマーに関しては、誤差率を各長さのホモポリマーに属する配列決定された塩基の総数と照合する。誤差率は、個々のリードについて、Ｚスコア制限を伴うことなく全てのリードを用いてコンセンサス配列を形成した後に示される。 図５５はＭ・ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの試行についてゲノム位置の関数としての網羅率の深さを示す。単離された領域における僅かに低値の網羅率はマッピングから除外された反復領域の存在による。 図５６はＣ・ｊｅｊｕｎｉの配列決定試行に関するクオリティスコア（データ示さず）の予測値と観察値の間の相関を示す。 図５７は対になった末端のリードのリード長を示す。これは２１サイクル試行に対するものであり、このため平均長はより少数のサイクルに相応していることに留意すべきである。

Claims (13)

  1. 標的核酸を配列決定する方法であって、
    ａ）参照核酸配列を参照数配列に変換する工程であって、ここで該参照数配列は理想的なフローグラムを含む、工程；
    ｂ）１つ以上のヌクレオチドが、該標的核酸のフラグメントの１つ以上のコピー上を逐次的に流れる場合にシグナルを検出する工程であって、該シグナルは該フラグメントの核酸配列を示すクエリ数配列に対応し、該クエリ数配列はクエリフローグラムを含む、工程；
    ｃ）該理想的なフローグラムと該クエリフローグラムとのおおよそのマッチが得られる該理想的なフローグラムの１つ以上の位置において、該理想的なフローグラムに該クエリフローグラムをアラインする工程；
    ｄ）該クエリフローグラムの数配列を該理想的なフローグラムの数配列と比較して、クオリティスコアを発生させる工程であって、ここで該クオリティスコアは該クエリフローグラムと該理想的なフローグラムとの間のアライメントのクオリティを示す、工程；
    ｅ）複数のフラグメントに関して工程ｂ）〜ｄ）を反復する工程；
    ｆ）最高のクオリティアライメントに対応する該理想的なフローグラム上の位置において、複数のクエリフローグラムをアンカーする工程；
    ｇ）１つ以上のクエリフローグラムにより網羅される該理想的なフローグラムの各位置において、１つ以上のクエリフローグラムの配列数を平均することにより、コンセンサスフローグラムを含むコンセンサス数配列を発生させる工程；そして
    ｈ）該コンセンサスフローグラムを核酸配列に変換する工程；
    を包含する、方法。
  2. 前記理想的なフローグラムを所定の長さの重複する理想的なサブフローグラムに分割し、該理想的なサブフローグラムを指標化する工程を更に包含する、請求項１記載の方法。
  3. 各クエリフローグラムを、前記理想的なサブフローグラムの所定の長さに対応する長さを各々が有するクエリサブフローグラムに分割する工程を更に包含する、請求項２記載の方法。
  4. 前記指標化した理想的なサブフローグラムを検索して、前記クエリフローグラムを前記理想的なフローグラムにアラインするための位置を決定する工程を更に包含する、請求項３記載の方法。
  5. 前記理想的なサブフローグラムがバイナリコードされる、請求項２記載の方法。
  6. 前記クエリサブフローグラムがバイナリコードされる、請求項３記載の方法。
  7. 標的核酸を配列決定する方法であって、
    ａ）１つ以上のヌクレオチドが、該標的核酸のフラグメントの１つ以上のコピー上を逐次的に流れる場合にシグナルを検出する工程；
    ｂ）該フラグメントの核酸配列を示すクエリ数配列に該シグナルを関連付ける工程であって、該クエリ数配列はクエリフローグラムを含む、工程；
    ｃ）工程ａ）〜ｂ）を反復して、複数のクエリフローグラムを作製する工程；
    ｄ）該複数のクエリフローグラムを相互に比較して、該複数のクエリフローグラム間の重複領域を同定する工程；
    ｅ）該重複領域において、該複数のクエリフローグラムをアラインする工程；
    ｆ）該アライメントに基づいてクオリティスコアを発生させる工程であって、該クオリティスコアは該アライメントのクオリティを示す、工程；
    ｇ）所定の閾値に合致するクオリティスコアを有するアライメントを決定することにより、ペアワイズ重複クエリフローグラムを同定する工程；
    ｈ）該ペアワイズ重複クエリフローグラムを１つ以上のユニティグにグループ分けする工程；
    ｉ）各ユニティグ内の１つ以上のマッチする位置の各々において、該クエリフローグラムの配列数を平均して、ユニティグコンセンサスフローグラムを含むコンセンサス数配列を発生させる工程；そして
    ｊ）各ユニティグコンセンサスフローグラムをユニティグコンセンサス核酸配列に変換する工程；
    を包含する、方法。
  8. 工程ｈ）の前記１つ以上のユニティグが、前記クエリフローグラムの重複が最大の一致する鎖を含む、請求項７記載の方法。
  9. ｋ）ユニティグコンセンサス核酸配列を相互に比較して、配列の重複を同定する工程；及び、
    ｌ）共通の重複配列を有するユニティグコンセンサスを連結することにより、コンティグ核酸配列を含む１つ以上のコンティグを形成する工程；
    を更に包含する、請求項７記載の方法。
  10. ｍ）各コンティグ内の境界を同定する工程であって、ここで境界はユニティグ配列が共通領域から発散している領域である、工程；及び、
    ｎ）工程ｍ）において同定された境界において、コンティグを破断する工程；
    を更に包含する、請求項９記載の方法。
  11. ｏ）同じフラグメント核酸配列により、それ自体の末端が重複した何れかの２つのコンティグを連結する工程であって、ここで場合により、このようにして連結されたコンティグは、境界が同定される場合に破断される、工程；
    を更に包含する、請求項１０記載の方法。
  12. ｐ）フラグメント核酸配列と前記コンティグ間の全てのアライメントを同定する工程であって；ここで場合により、該コンティグは、４未満のフラグメント核酸配列がアラインされている何れかの位置において破断される、工程；
    ｑ）工程ｐ）におけるコンティグにアラインされたフラグメント核酸配列に関連するクエリフローグラムの配列数を平均することにより、コンティグコンセンサスフローグラムを計算する工程；そして、
    ｒ）該コンティグコンセンサスフローグラムをコンティグコンセンサス核酸配列に変換する工程；
    を更に包含する、請求項１１記載の方法。
  13. コンセンサス塩基コールが実質的に変化しなくなるまで、前記コンティグコンセンサス核酸配列を用いながら工程ｐ）〜ｒ）を反復することにより、最終コンティグコンセンサス配列を計算する工程を更に包含する、請求項１２記載の方法。
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