JP7095031B2 - シークエンシングによって評価されるゲノムワイドでバイアスのないＤＳＢの同定（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ） - Google Patents

Description

優先権の主張
本出願は、２０１４／０６／２３に出願された、米国仮特許出願第６２／０１５，９１
１号明細書；２０１４／１１／１０に出願された、第６２／０７７，８４４号明細書；２
０１４／１１／１２に出願された、第６２／０７８，９２３号明細書；および２０１４／
１２／５に出願された、第６２／０８８，２２３号明細書の利益を主張する。前述のもの
の全内容は、参照により本明細書によって組み込まれている。

連邦政府による資金提供を受けた研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって与
えられた助成金第ＤＰ１ＧＭ１０５３７８号の下で、政府の支援を受けて行われた。政府
は、本発明において一定の権利を有する。

技術分野
生細胞において改変ヌクレアーゼの切断部位の位置を同定するための、高感度なバイア
スのないゲノムワイドな方法が提供される。

ヒトの薬の長い間保持されてきた目標は、遺伝性の遺伝疾患を治療することである。ゲ
ノム編集は、疾患を治癒させるまたは予防するために内在性遺伝子内の変異を直接に修正
するという強力な概念を包含する。このアプローチの新しい例は、ＨＩＶのコレセプター
である、ＣＣＲ５を破壊するように改変されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
治療薬の臨床試験である（１）。このｅｘ ｖｉｖｏ自己細胞療法アプローチは、ＣＣＲ
５におけるホモ変異を有する個体からの骨髄細胞を移植された「ベルリンの患者」、Ｔｉ
ｍｏｔｈｙ ＢｒｏｗｎにおけるＨＩＶの治癒の成功を再現することを試みるものである
。もう１つの最近の例は、６ヶ月齢の対象に由来する造血幹細胞におけるＺＦＮでの遺伝
子ターゲティングによるＸ連鎖重症複合免疫不全症の修正である（２）。

以下の４つの主なクラスの改変ヌクレアーゼがある：１）メガヌクレアーゼ、２）ジン
クフィンガーヌクレアーゼ、３）転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ
Ｎ）、および４）クラスター化された規則的な間隔の短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）
Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）。

しかし、これらの新しい治療および研究のツールの採用は、それらの特異性の実証に依
存しうる。ヒトおよび他の真核細胞におけるオフターゲット作用を理解および同定するこ
とは、これらのヌクレアーゼが研究および治療的適用のために広範に使用される場合には
決定的に不可欠であろう。

ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、改変ヌクレアーゼによって誘発される変異、例えば、オフター
ゲット変異を検出するための、バイアスのないゲノムワイドかつ高感度な方法を可能にす
る。したがって、該方法は、哺乳動物生細胞においてゲノムワイドな規模で変異を評価す
るための最も包括的でバイアスのない方法を可能にする。該方法は、ヌクレアーゼで誘発
されたＤＳＢの中にｄｓＯＤＮが効率良く捕捉されうるいかなる細胞型において利用され
てもよい。

したがって、一態様では、本発明は、細胞のゲノムＤＮＡ内の、二本鎖切断（ＤＳＢ）
、例えば、外来性の改変ヌクレアーゼによって誘発された、例えば、オフターゲットＤＳ
Ｂを検出するための方法を提供する。該方法は、細胞を二本鎖オリゴデオキシヌクレオチ
ド（ｄｓＯＤＮ）と接触させるステップであって、好ましくは、ｄｓＯＤＮが１５および
７５ｎｔの間の長さ、例えば、１５～５０ｎｔ、５０～７５ｎｔ、３０～３５ｎｔ、６０
～６５ｎｔ、または５０～６５ｎｔの長さであり、ｄｓＯＤＮの両鎖が細胞のゲノムにオ
ルソロガスであり、好ましくは、ｄｓＯＤＮの５’末端がリン酸化されており、さらにま
た好ましくは、ホスホロチオエート結合が両方の３’末端に存在する、または２つのホス
ホロチオエート結合が両方の３’末端および両方の５’末端に存在する、ステップ、
細胞内で外来性の改変ヌクレアーゼを、ヌクレアーゼが細胞のゲノムＤＮＡ内にＤＳＢを
誘発するのに十分な時間、かつ細胞がＤＳＢを修復して、１つまたは複数のＤＳＢにおい
てｄｓＯＤＮを組み込むのに十分な時間、発現または活性化させるステップ、
組み込まれたｄｓＯＤＮを含むゲノムＤＮＡの一部を増幅するステップ、および
ゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステップ
を含み、それによって細胞のゲノムＤＮＡ内のＤＳＢを検出する。

一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡの一部を増幅するステップは、
例えば切断によって、ＤＮＡを断片化すること、
細胞からの断片化されたゲノムＤＮＡの末端をユニバーサルアダプターでライゲーション
すること、
組み込まれたｄｓＯＤＮと相補的なプライマー（プライマーＡ）およびユニバーサルアダ
プターと相補的なプライマー（プライマーＢ）を用いて、ライゲーションされたＤＮＡに
対して１回目のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、
次いで、プライマーＡと相補的な３’ネステッドプライマー（プライマーＣ）、プライマ
ーＢと相補的な３’ネステッドプライマー（プライマーＤ）、およびプライマーＤと相補
的なプライマー（プライマーＥ）を使用して２回目のＰＣＲを行うこと
を含む。一部の実施形態では、プライマーＥは、
精製または結合配列、例えば、フローセル結合配列、および
同定配列、例えば、バーコードまたは無作為の分子インデックス
のうちの１つまたは複数を含む。

一部の実施形態では、改変ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌク
レアーゼ、転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスタ
ー化された規則的な間隔の短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌ
クレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＧＮ）からなる群から選択される。

別の態様では、本発明は、複数のガイドＲＮＡのうちのいずれが最も特異的であるか、
すなわち、最も少ないオフターゲットＤＳＢを誘発するかを決定するための方法を提供す
る。該方法は、第１の細胞の集団を第１のガイドＲＮＡおよび二本鎖オリゴデオキシヌク
レオチド（ｄｓＯＤＮ）と接触させるステップであって、好ましくは、ｄｓＯＤＮが１５
および７５ｎｔの間の長さ、例えば、１５～５０ｎｔ、５０～７５ｎｔ、６０～６５ｎｔ
、３０～３５ｎｔまたは５０～６５ｎｔの長さであり、ｄｓＯＤＮの両鎖が細胞のゲノム
にオルソロガスであり、好ましくは、ｄｓＯＤＮの５’末端がリン酸化されており、さら
にまた好ましくは、ホスホロチオエート結合が両方の３’末端に存在する、または２つの
ホスホロチオエート結合が両方の３’末端および両方の５’末端に存在する、ステップ、
第１の細胞の集団内で外来性のＣａｓ９改変ヌクレアーゼを、ヌクレアーゼが細胞のゲノ
ムＤＮＡ内にＤＳＢを誘発するのに十分な時間、かつ細胞がＤＳＢを修復して、１つまた
は複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むのに十分な時間、発現または活性化させる
ステップ、
組み込まれたｄｓＯＤＮを含む、第１の細胞の集団からのゲノムＤＮＡの一部を増幅する
ステップ、および
第１の細胞の集団からのゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステップ、
ｄｓＯＤＮが第１の細胞の集団のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数を決定するステ
ップ、
第２の細胞の集団を第２のガイドＲＮＡおよび二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓ
ＯＤＮ）と接触させるステップであって、好ましくは、ｄｓＯＤＮが１５および７５ｎｔ
の間の長さ、例えば、１５～５０ｎｔ、５０～７５ｎｔ、３０～３５ｎｔ、６０～６５ｎ
ｔ、または５０～６５ｎｔの長さであり、ｄｓＯＤＮの両鎖が細胞のゲノムにオルソロガ
スであり、好ましくは、ｄｓＯＤＮの５’末端がリン酸化されており、さらにまた好まし
くは、２つのホスホロチオエート結合が両方の３’末端および両方の５’末端に存在する
、ステップ、
第２の細胞の集団内で外来性のＣａｓ９改変ヌクレアーゼを、ヌクレアーゼが第２の細胞
の集団のゲノムＤＮＡ内にＤＳＢを誘発するのに十分な時間、細胞がＤＳＢを修復して、
１つまたは複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むのに十分な時間、発現または活性
化させるステップ、
組み込まれたｄｓＯＤＮを含む、第２の細胞の集団からのゲノムＤＮＡの一部を増幅する
ステップ、および
第２の細胞の集団からのゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステップ、
ｄｓＯＤＮが第２の細胞の集団のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数を決定するステ
ップ、
ｄｓＯＤＮが第１の細胞の集団のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数を、ｄｓＯＤＮ
が第２の細胞の集団のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数と比較するステップ
を含み、より少ない（オフターゲット）部位で組み込まれたｄｓＯＤＮがより特異的であ
る。該方法は、第３、第４、第５、第６、またはそれより多種の細胞の集団について繰り
返されてもよい。「より少ない」オフターゲット部位とは、より少ない数のＤＳＢ部位お
よび／または（１つまたは複数の）個別の部位におけるＤＳＢの発生の頻度の低下の両方
を含みうる。

本明細書においてさらに、本明細書に記載の末端保護されたｄｓＯＤＮの使用によって
目的の短鎖ｄｓＤＮＡをＤＳＢの部位の中に効率良く組み込むための方法が提供される。

一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。

一部の実施形態では、改変ヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼであり、方法は、Ｃａ
ｓ９ヌクレアーゼをゲノム内の標的配列に導くガイドＲＮＡ、例えば、単一のガイドまた
はｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ対を細胞内で発現させるステップも含む。

一部の実施形態では、ｄｓＯＤＮはビオチン化され、例えば、共有結合でｄｓＯＤＮに
付加されたビオチンを含む、かつ／または無作為化されたＤＮＡバーコードまたはＣｒｅ
もしくはＬｏｘ部位を含む。ｄｓＯＤＮがビオチン化される、上記の請求項のいずれかの
方法。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ゲノムｇＤＮＡを断片に切断するステ
ップ、およびｄｓＯＤＮを含む断片をビオチンへの結合によって単離するステップを含む
。

一部の実施形態では、ｄｓＯＤＮは、平滑末端であるまたは５’末端に１、２、３、も
しくは４ｎｔのオーバーハンギングを有する、５’末端でリン酸化されている、および／
または３’末端でホスホロチオエート化されている。

一部の実施形態では、ｄｓＯＤＮは、平滑末端であり、５’末端でリン酸化されており
、３’末端でホスホロチオエート化されている。

一部の実施形態では、ｄｓＯＤＮは、無作為化されたＤＮＡバーコード、Ｌｏｘ認識部
位、制限酵素認識部位、および／またはタグ配列を含む。

一部の実施形態では、方法は、ゲノムｇＤＮＡを断片に切断するステップ、および断片
を、末端修復／ａテーリング／シークエンシングアダプター、例えば、単一テールのシー
クエンシングアダプターのライゲーションによってシークエンシング、例えば、ハイスル
ープットシークエンシング用に調製するステップを含む。

一部の実施形態では、ＤＳＢは、（例えば、脆弱な部位での）バックグラウンドのゲノ
ムのＤＳＢまたは鍵となる細胞タンパク質の小分子阻害因子によって引き起こされるＤＳ
Ｂである。

他に定めがない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的な用語は、
本発明が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載されている；他の、当技
術分野において知られている好適な方法および材料も使用されうる。材料、方法、および
例は、単に例示的なものであって限定することを意図するものではない。本明細書中で言
及されているすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および
他の参照は、参照によりその全体が組み込まれている。矛盾する場合には、定義を含めて
、本明細書が優先されることになる。

本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態および図面から、な
らびに特許請求の範囲から明らかであろう。

図１Ａ－Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼを介したｄｓＯＤＮ捕捉の最適化を示した図である。（ａ）使用される短鎖オリゴヌクレオチドタグの配列が示されている。使用されるすべてのオリゴヌクレオチドは、５’リン酸化される。タグオリゴヌクレオチドは、ＲＦＬＰによる組み込み頻度の評価を可能にする診断用のＮｄｅＩ制限部位も含む。（ｂ）下のグラフは、ＲＦＬＰによる短鎖ｄｓＯＤＮの組み込み（％）を示す。５’および３’ホスホロチオエート結合の両方を有するｄｓＯＤＮ（各セットにおける左側のバー）についての組み込み率が、５’ホスホロチオエート結合のみを有するｄｓＯＤＮ（各セットにおける中央のバー）およびｄｓＯＤＮなしの対照（各セットにおける右側のバー）と比較される。 図２Ａ．ＶＥＧＦ部位１についての組み込みの特徴付けを示した図である。（ａ）ＲＦＬＰアッセイは、ＶＥＧＦ部位１について示されており、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動機器上で解析されるように、ＮｄｅＩ制限部位を有するｄｓＯＤＮの好結果の組み込みを実証している。 図２Ｂ．ＶＥＧＦ部位１についての組み込みの特徴付けを示した図である。（ｂ）サンガーシークエンシングデータは、目的のＶＥＧＦ部位１標的部位でのｄｓＯＤＮ組み込みについて示されている。ｄｓＯＤＮ配列は、灰色で強調されている。ＶＥＧＦＡ部位１を標的としたガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体によって認識される部位は太字で、隣接したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列は下線で強調されている。この部位でＣａｓ９によって誘発される、予想される二本鎖切断の位置は、小さな黒色の矢印で示されている。 例示的なＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ法の概要を示した図である。 図４Ａ．１ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法によって発見されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓオフターゲット切断部位を示した図である。データは、４つの部位、ＶＥＧＦ部位１～３、およびＥＭＸ１について示されている。標的部位配列に対するミスマッチが強調されている。小さな中実の黒色の矢印は、目的のオンターゲット部位を示すために使用されているのに対して、小さな破線の矢印は、以前の研究（Fu et al., 2013）において検出されていた既知のオフターゲット部位に印をつけるために使用されている。 図４Ｂ．ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法によって発見されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓオフターゲット切断部位を示した図である。データは、４つの部位、ＶＥＧＦ部位１～３、およびＥＭＸ１について示されている。標的部位配列に対するミスマッチが強調されている。小さな中実の黒色の矢印は、目的のオンターゲット部位を示すために使用されているのに対して、小さな破線の矢印は、以前の研究（Fu et al., 2013）において検出されていた既知のオフターゲット部位に印をつけるために使用されている。 図４Ｃ.ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法によって発見されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓオフターゲット切断部位を示した図である。データは、４つの部位、ＶＥＧＦ部位１～３、およびＥＭＸ１について示されている。標的部位配列に対するミスマッチが強調されている。小さな中実の黒色の矢印は、目的のオンターゲット部位を示すために使用されているのに対して、小さな破線の矢印は、以前の研究（Fu et al., 2013）において検出されていた既知のオフターゲット部位に印をつけるために使用されている。 図４Ｄ.ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法によって発見されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓオフターゲット切断部位を示した図である。データは、４つの部位、ＶＥＧＦ部位１～３、およびＥＭＸ１について示されている。標的部位配列に対するミスマッチが強調されている。小さな中実の黒色の矢印は、目的のオンターゲット部位を示すために使用されているのに対して、小さな破線の矢印は、以前の研究（Fu et al., 2013）において検出されていた既知のオフターゲット部位に印をつけるために使用されている。 図４Ｅ.ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法によって発見されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓオフターゲット切断部位を示した図である。データは、４つの部位、ＶＥＧＦ部位１～３、およびＥＭＸ１について示されている。標的部位配列に対するミスマッチが強調されている。小さな中実の黒色の矢印は、目的のオンターゲット部位を示すために使用されているのに対して、小さな破線の矢印は、以前の研究（Fu et al., 2013）において検出されていた既知のオフターゲット部位に印をつけるために使用されている。 図５Ａ－Ｂ．例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の設計、最適化および適用を示した図である。 （ａ）例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の図式的概要。 （ｂ）ヒト細胞におけるＲＧＮで誘発されたＤＳＢの中へのｄｓＯＤＮ組み込みの最適化。ＲＦＬＰアッセイによって測定されるような、異なる修飾オリゴヌクレオチドについての組み込みの割合が示されている。対照反応物は、ＲＧＮをコードしているプラスミドのみでトランスフェクトされた（すなわち、ｄｓＯＤＮなし）。 図５Ｃ．例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の設計、最適化および適用を示した図である。 （ｃ）ゲノム配列の読みのマッピングによりＤＳＢ部位の同定が可能とされる方法の図式的例示。二方向のマッピングの読みまたは同じ方向へのマッピングであるが異なるプライマーによって増幅された読みは、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑアッセイにおけるＤＳＢのサインである。図１Ａも参照されたい。 図５Ｄ－１．例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の設計、最適化および適用を示した図である。（ｄ１～ｄ３）ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑに基づいた、ＲＧＮで誘発されたＤＳＢの同定。ゲノムにマップされたＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読みの開始部位により、数塩基対以内までのＤＳＢのマッピングが可能とされる。本発明者らがＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって評価した１０種のＲＧＮのオンターゲット部位についてのマップされた読みが示されている。すべての場合において、標的部位配列は、２０ｂｐのプロトスペーサー配列がｘ軸上の左側に、かつＰＡＭ配列が右側に示されている。すべての場合において、最も高いピークが、ＲＧＮ切断事象の予想される部位である、ＮＧＧ ＰＡＭ配列の５’端の３から４ｂｐ以内に入る方法に留意されたい。 図５Ｄ－２．例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の設計、最適化および適用を示した図である。（ｄ１～ｄ３）ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑに基づいた、ＲＧＮで誘発されたＤＳＢの同定。ゲノムにマップされたＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読みの開始部位により、数塩基対以内までのＤＳＢのマッピングが可能とされる。本発明者らがＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって評価した１０種のＲＧＮのオンターゲット部位についてのマップされた読みが示されている。すべての場合において、標的部位配列は、２０ｂｐのプロトスペーサー配列がｘ軸上の左側に、かつＰＡＭ配列が右側に示されている。すべての場合において、最も高いピークが、ＲＧＮ切断事象の予想される部位である、ＮＧＧ ＰＡＭ配列の５’端の３から４ｂｐ以内に入る方法に留意されたい。 図５Ｄ－３．例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の設計、最適化および適用を示した図である。（ｄ１～ｄ３）ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑに基づいた、ＲＧＮで誘発されたＤＳＢの同定。ゲノムにマップされたＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読みの開始部位により、数塩基対以内までのＤＳＢのマッピングが可能とされる。本発明者らがＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって評価した１０種のＲＧＮのオンターゲット部位についてのマップされた読みが示されている。すべての場合において、標的部位配列は、２０ｂｐのプロトスペーサー配列がｘ軸上の左側に、かつＰＡＭ配列が右側に示されている。すべての場合において、最も高いピークが、ＲＧＮ切断事象の予想される部位である、ＮＧＧ ＰＡＭ配列の５’端の３から４ｂｐ以内に入る方法に留意されたい。 図５Ｅ－Ｆ．例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の設計、最適化および適用を示した図である。 （ｅ）本研究において解析された１０種のＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定された既知および新規のオフターゲット切断部位の数。４種のＲＧＮについてのすべての既知のオフターゲット切断は、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって同定された。 （ｆ）本報告の１０種のＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって検出されたオフターゲット部位の総数に対するヒトゲノム（ｙ軸）に直交性のオンターゲット部位の散乱プロット。直交性は、オンターゲット部位に対して相対的に１から６つのミスマッチを有するヒトゲノム内の部位の総数として算出された。 図５Ｇ．例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の設計、最適化および適用を示した図である。 （ｇ）本報告の１０種のＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって検出されるオフターゲット部位の総数に対するオンターゲット部位ＧＣ含量（ｙ軸）の散乱プロット。 図５Ｈ－Ｉ．例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の設計、最適化および適用を示した図である。 （ｈ）ＥＭＸ１を標的とするＲＧＮについてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オンターゲットおよびオフターゲット部位の染色体イデオグラム。残りのＲＧＮについてのさらなるイデオグラムは、図１３の中で見出すことができる。 （ｉ）本研究において調査された１０種のＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたオフターゲット切断部位のゲノム位置。 図６Ａ．１０種のＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたオフターゲット部位の配列を示した図である。各ＲＧＮについて、目的の標的配列が一番上の行に示され、切断された部位が下に示され、オンターゲット部位に対するミスマッチが示されかつ色で強調されている。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑシークエンシングの読み数は、それぞれの部位の右側に示されている。オンターゲット部位は四角形でかつ既知のオフターゲット部位はひし形で印がつけられている。データは、以下の部位を標的とするＲＧＮについて示されている：（ａ）ＶＥＧＦＡ部位１。オフターゲット部位は、ＲＮＦ２部位を標的とするＲＧＮでは見出されなかった。 図６Ｂ．１０種のＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたオフターゲット部位の配列を示した図である。各ＲＧＮについて、目的の標的配列が一番上の行に示され、切断された部位が下に示され、オンターゲット部位に対するミスマッチが示されかつ色で強調されている。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑシークエンシングの読み数は、それぞれの部位の右側に示されている。オンターゲット部位は四角形でかつ既知のオフターゲット部位はひし形で印がつけられている。データは、以下の部位を標的とするＲＧＮについて示されている：（ｂ）ＶＥＧＦＡ部位２。オフターゲット部位は、ＲＮＦ２部位を標的とするＲＧＮでは見出されなかった。 図６Ｃ－Ｅ．１０種のＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたオフターゲット部位の配列を示した図である。各ＲＧＮについて、目的の標的配列が一番上の行に示され、切断された部位が下に示され、オンターゲット部位に対するミスマッチが示されかつ色で強調されている。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑシークエンシングの読み数は、それぞれの部位の右側に示されている。オンターゲット部位は四角形でかつ既知のオフターゲット部位はひし形で印がつけられている。データは、以下の部位を標的とするＲＧＮについて示されている：（ｃ）ＶＥＧＦＡ部位３、（ｄ）ＥＭＸ１、（ｅ）ＦＡＮＣＦ。オフターゲット部位は、ＲＮＦ２部位を標的とするＲＧＮでは見出されなかった。 図６Ｆ－Ｊ．１０種のＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたオフターゲット部位の配列を示した図である。各ＲＧＮについて、目的の標的配列が一番上の行に示され、切断された部位が下に示され、オンターゲット部位に対するミスマッチが示されかつ色で強調されている。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑシークエンシングの読み数は、それぞれの部位の右側に示されている。オンターゲット部位は四角形でかつ既知のオフターゲット部位はひし形で印がつけられている。データは、以下の部位を標的とするＲＧＮについて示されている：（ｆ）ＨＥＫ２９３部位１、（ｇ）ＨＥＫ２９３部位２、（ｈ）ＨＥＫ２９３部位３、（ｉ）ＨＥＫ２９３部位４、（ｊ）ＲＮＦ２。オフターゲット部位は、ＲＮＦ２部位を標的とするＲＧＮでは見出されなかった。 図７Ａ．ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ切断部位が真正のＲＧＮオフターゲット変異部位であることを示した図である。 （ａ）ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ切断部位におけるインデル変異を確認するために使用される、ＡＭＰに基づいたシークエンシング法の図式的概要が、図の上半分に示されている。マップされたインデル変異のヒストグラムプロットは、３種のＲＧＮオンターゲット部位について示されている。欠失はＸ軸の上に示されているのに対して、挿入は下に示されている。標的部位全体（すなわち、プロトスペーサーおよびＰＡＭ配列）の境界は点線で示され、かつプロトスペーサーとＰＡＭ配列との間の境界は他の２本の間の点線として示されている。ＲＧＮ切断は、プロトスペーサーの５’端から３から４ｂｐに生じると予測される。 図７Ｂ－Ｆ．ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ切断部位が真正のＲＧＮオフターゲット変異部位であることを示した図である。 （ｂ）～（ｆ）以下を標的としたＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定された切断部位についてのインデル頻度（ｘ軸）およびＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑシークエンシングの読み数（ｙ軸）の散乱プロット：ＶＥＧＦＡ部位１、ＶＥＧＦＡ部位２、ＶＥＧＦＡ部位３、ＥＭＸ１、およびＦＡＮＣＦ。 図８Ａ－Ｅ．ＲＧＮで誘発されるオフターゲット配列特性の解析を示した図である。 （ａ）（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって検出されるように）切断される特定の数のミスマッチを有する潜在的なＲＧＮオフターゲット部位の画分。 （ｂ）特定の数のミスマッチを有するＲＧＮオフターゲット切断部位についてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読み数のプロット（対数目盛） （ｃ）ＲＧＮオフターゲット部位についてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読み数に対する、プロトスペーサー内のミスマッチ部位の影響。塩基は、１から２０の番号が付けられ、２０はＰＡＭに隣接した塩基である。 （ｄ）線形回帰解析によって推定される、ゆらぎトランジション、非ゆらぎトランジション、およびトランスバージョンのミスマッチの影響。 （ｅ）ミスマッチ数、ミスマッチ型、ミスマッチ部位、ＰＡＭ密度、発現レベル、およびゲノム位置（遺伝子間／エクソン／イントロン）の影響についての個別の一変量解析によって説明されるＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読み数相違の割合。 図９Ａ．ＲＧＮオフターゲット部位を同定するためのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑとコンピュータ予測またはＣｈＩＰ－Ｓｅｑ法との比較を示した図である。 （ａ）９種のＲＧＮについてのＭＩＴ ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ ＴｏｏｌおよびＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって予測されるオフターゲット部位間の重複を例示しているベン図。 図９Ｂ．ＲＧＮオフターゲット部位を同定するためのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑとコンピュータ予測またはＣｈＩＰ－Ｓｅｑ法との比較を示した図である。 （ｂ）９種のＲＧＮについてのＥ－ＣＲＩＳＰコンピュータ予測プログラムおよびＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって予測されるオフターゲット部位間の重複を例示しているベン図。 図９Ｃ－Ｄ．ＲＧＮオフターゲット部位を同定するためのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑとコンピュータ予測またはＣｈＩＰ－Ｓｅｑ法との比較を示した図である。 （ｃ）ＭＩＴ ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌによって予測される、予測されない、および考慮されない、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定される真正のＲＧＮオフターゲット部位の数を示しているヒストグラム。ＭＩＴ ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌによって予測される部位は、プログラムによって提供されるスコアに基づく五分位群に分けられる。各バーは、オンターゲット部位に対してミスマッチの数に基づいて細分類された部位を有する。バルジ部位は、スキップされた塩基部位をｇＲＮＡ－プロトスペーサーＤＮＡ境界面に有するものである。 （ｄ）Ｅ－ＣＲＩＳＰコンピュータ予測ツールによって予測される、予測されない、および考慮されない、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定される真正のＲＧＮオフターゲット部位の数を示しているヒストグラム。部位は、（ｃ）に記載のように再分割される。 図９Ｅ－Ｆ．ＲＧＮオフターゲット部位を同定するためのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑとコンピュータ予測またはＣｈＩＰ－Ｓｅｑ法との比較を示した図である。 （ｅ）ＣｈＩＰ－Ｓｅｑによって同定されたｄＣａｓ９結合部位とＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたＲＧＮオフターゲット切断部位との間の重複を例示しているベン図。 （ｆ）目的のオンターゲット部位に対して配列におけるミスマッチの数によって分類された、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたＲＧＮオフターゲット部位およびＣｈＩＰ－Ｓｅｑによって同定されたｄＣａｓ９結合部位のヒストグラムプロット。ＧＵＩＤＥ－ＳｅｑおよびＣｈＩＰ－Ｓｅｑミスマッチのカーネル密度評価が示されている。点線は、各クラスの部位についてのミスマッチの平均数を示す。 図１０Ａ．ＲＧＮによって誘発される大規模な構造変化を示した図である。 （ａ）転座を検出するためのＡＭＰ戦略の図式的概要。さらなる詳細は方法に。 図１０Ｂ．ＲＧＮによって誘発される大規模な構造変化を示した図である。 （ｂ）ＲＧＮによって誘発される構造的バリエーションのＣｉｒｃｏｓプロット。５種のＲＧＮおよび細胞の対照についてのデータが示されている。染色体は円に配置されており、転座は２つの染色体位置間の弧として示されている。長さが１ｋｂを超える欠失または逆位は、直線として示される。オンターゲット、オフターゲット、または切断点ホットスポット以外の部位は、「その他」として分類されている。 図１０Ｃ．ＲＧＮによって誘発される大規模な構造変化を示した図である。 （ｃ）第６染色体上のＶＥＧＦＡ部位１オンターゲット部位と第１７染色体上のオフターゲット部位との間で検出される転座の例。４つすべての可能な相互転座が、ＡＭＰを使用して検出された。 図１０Ｃ－Ｄ．ＲＧＮによって誘発される大規模な構造変化を示した図である。 （ｄ）ＡＭＰによって検出されるＶＥＧＦＡ部位２における２つのオフターゲット部位間の大きな欠失および逆位の例。 （ｅ）５種のＲＧＮで観察される、ＲＧＮ誘発性およびＲＧＮ非依存性の異なる構造的バリエーションのまとめの表。Ｃａｓ９のみ、ｄｓＯＤＮオリゴのみ、および細胞のみでの対照も示されている。 図１０Ｆ．ＲＧＮによって誘発される大規模な構造変化を示した図である。 （ｆ）Ｕ２ＯＳおよびＨＥＫ２９３細胞における切断点ホットスポットの位置を例示している染色体イデオグラム。２つのホットスポットは染色体１および１０のセントロメア領域において重複する。 図１１Ａ－Ｂ．ｔｒｕ－ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑプロファイルを示した図である。 （ａ）適合された全長ｇＲＮＡおよびトランケートされたｇＲＮＡによってＶＥＧＦＡ部位１、ＶＥＧＦＡ部位３、およびＥＭＸ１標的部位に指向されるＲＧＮについて同定された既知および新規のオフターゲット切断部位の数。全長ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮについてのデータは、図１ｅに示されているものと同じであり、比較の容易性のためにここにまた示されていることに留意されたい。 （ｂ）適合された全長ｇＲＮＡおよびトランケートされたｇＲＮＡによってＶＥＧＦＡ部位１、ＶＥＧＦＡ部位３、およびＥＭＸ１標的部位に指向されるＲＧＮについてのオンターゲットおよびオフターゲット部位を示している染色体イデオグラム。全長ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮについてのイデオグラムは、図１ｈおよび図１３Ａ～Ｂに示されているものと同じであり、比較の容易性のためにここにまた示されていることに留意されたい。 図１１Ｃ－Ｄ．ｔｒｕ－ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑプロファイルを示した図である。 （ｃ）～（ｄ）適合された全長ｇＲＮＡおよびトランケートされたｇＲＮＡによってＶＥＧＦＡ部位１、ＶＥＧＦＡ部位３、およびＥＭＸ１標的部位に指向されるＲＧＮについてのオンターゲットおよびオフターゲット部位を示している染色体イデオグラム。全長ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮについてのイデオグラムは、図１ｈおよび図１３Ａ～Ｂに示されているものと同じであり、比較の容易性のためにここにまた示されていることに留意されたい。 図１１Ｅ．ｔｒｕ－ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑプロファイルを示した図である。 （ｅ）ｔｒｕ－ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮによって誘発されるＤＳＢのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑに基づいた同定。本発明者らがＧＵＩＤＥＳｅｑによって評価したｔｒｕ－ｇＲＮＡによって指向される３種のＲＧＮのオンターゲット部位についてのマップされた読みが示されている。すべての場合において、標的部位配列は、２０ｂｐのプロトスペーサー配列がｘ軸上の左側に、かつＰＡＭ配列が右側に示されている。ＲＧＮが全長ｇＲＮＡによって指向されるので、最も高いピークが、ＲＧＮ切断事象の予想される部位である、ＮＧＧ ＰＡＭ配列の５’端の３から４ｂｐ以内に入る方法に留意されたい。 図１１Ｆ－Ｈ．ｔｒｕ－ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑプロファイルを示した図である。 （ｆ）～（ｈ）ｔｒｕ－ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたオフターゲット部位の配列。各ＲＧＮについて、目的の標的配列が一番上の行に示され、切断された部位が下に示され、オンターゲット部位に対するミスマッチが示されかつ色で強調されている。ＧＵＩＤＥＳｅｑシークエンシングの読み数は、それぞれの部位の右側に示されている。目的のオンターゲット部位は四角形で印がつけられており、全長ｇＲＮＡおよびｔｒｕ－ｇＲＮＡの両方によって指向されるＲＧＮの既知のオフターゲット部位は濃い灰色のひし形で印がつけられており、かつｔｒｕ－ｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮのみで見出される既知のオフターゲット部位は薄い灰色のひし形で印がつけられている。既知のオフターゲット部位は、以前の報告FU et al., Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014))において０．１％以上の変異生成頻度を有することが示されていたものであった。データは、ｔｒｕ－ｇＲＮＡによって（ｆ）ＶＥＧＦＡ部位１、（ｇ）ＶＥＧＦＡ部位３、および（ｈ）ＥＭＸ１標的部位に指向されるＲＧＮについて示されている。 ｄｓＯＤＮ挿入およびインデル変異の検証のためのＧＵＩＤＥ－ＳｅｑおよびＡＭＰに基づいたシークエンシングの詳細な図式的概要を示した図である。両方のプロトコールについての詳細は、方法の中で見出すことができる。 図Ａ－Ｃ．ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって評価された１０種すべてのＲＧＮについてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オンターゲットおよびオフターゲット部位の染色体イデオグラムを示した図である。 図Ｄ－Ｆ．ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって評価された１０種すべてのＲＧＮについてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オンターゲットおよびオフターゲット部位の染色体イデオグラムを示した図である。 図Ｇ－Ｉ．ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって評価された１０種すべてのＲＧＮについてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オンターゲットおよびオフターゲット部位の染色体イデオグラムを示した図である。 図Ｊ．ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって評価された１０種すべてのＲＧＮについてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オンターゲットおよびオフターゲット部位の染色体イデオグラムを示した図である。 ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読み数に対する因子の独立した影響を示すための多重因子線形回帰モデルを示した図である。 図１５Ａ．オフターゲット切断部位として以前に特徴付けされた７つのＣｈＩＰ－Ｓｅｑ結合部位についてのマップされたインデル変異のヒストグラムプロットである。実験試料および対照試料が各部位について並べて示されている。 図１５Ｂ．オフターゲット切断部位として以前に特徴付けされた７つのＣｈＩＰ－Ｓｅｑ結合部位についてのマップされたインデル変異のヒストグラムプロットである。実験試料および対照試料が各部位について並べて示されている。 図１５Ｃ．オフターゲット切断部位として以前に特徴付けされた７つのＣｈＩＰ－Ｓｅｑ結合部位についてのマップされたインデル変異のヒストグラムプロットである。実験試料および対照試料が各部位について並べて示されている。 図１５Ｄ．オフターゲット切断部位として以前に特徴付けされた７つのＣｈＩＰ－Ｓｅｑ結合部位についてのマップされたインデル変異のヒストグラムプロットである。実験試料および対照試料が各部位について並べて示されている。 図１６Ａ．ＥＧＦＰに対して標的化されたＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、およびＲＦＮを使用した、３つの型のｄｓＯＤＮの組み込み頻度を示しているグラフである。ｄｓＯＤＮのすべてが５’リン酸化されていた。ｄｓＯＤＮは、表示されている通り、無作為化された５’もしくは３’の４ｂｐのオーバーハングを有していたまたは平滑末端であった。 図１６Ｂ－Ｃ．Ｕ２ＯＳ細胞における２つの内在性標的部位、ＣＣＲ５およびＡＰＣでＴＡＬＥＮによって誘発される二本鎖切断（ＤＳＢ）の中への、平滑末端の、５’リン酸化された、３４ｂｐの二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）（ｏＳＱＴ６８５／６８６）の効率的な組み込みを示しているグラフである。（１６Ｂ）ＲＦＬＰ解析により、２つの内在性部位、ＣＣＲ５およびＡＰＣでＴＡＬＥＮによって誘発されるＤＳＢの中へのｄｓＯＤＮタグｏＳＱＴ６８５／６８６の組み込み（％）が示されている。（１６Ｃ）累積の変異生成頻度は、これらの２つの内在性標的部位におけるＴ７Ｅ１アッセイによって測定される。 図１７Ａ－Ｂ．異なるｄｓＯＤＮ末端保護の比較を示している棒グラフである；この実験において使用されたｄｓＯＤＮは、リン酸化されかつ平滑末端であって、かつ５’および３’ホスホロチオエート修飾の両方、または３’ホスホロチオエート修飾のみのいずれかを有していた。１７Ａ、ヒトＵ２ＯＳ細胞におけるＲＦＮ；１７Ｂ、マウスＥＳ細胞におけるＣａｓ９。 図１８Ａ－Ｂ．マウスＥＳ細胞における３’ホスホロチオエート修飾されたオリゴの異なる濃度での実験を示しているグラフである。１８Ａ、Ｎａｎｏｇ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９；１８Ｂ、Ｐｈｃ１ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９。ｄｓＯＤＮは、リン酸化されかつ平滑末端であって、かつ５’および３’ホスホロチオエート修飾の両方、または３’ホスホロチオエート修飾のみのいずれかを有していた。実験は、ヒトＵ２ＯＳ細胞においてダイマーＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼで（図１８Ａ）、またはマウスＥＳ細胞において標準Ｃａｓ９で（図１８Ｂ）行われた。 図１８Ｃ．マウスＥＳ細胞における３’ホスホロチオエート修飾されたオリゴの存在下での破壊の割合のＴ７Ｅ１解析を示しているグラフである。 図１９Ａ－Ｂ．Ｕ２ＯＳ細胞における３つの内在性標的部位、ＶＥＧＦＡ３、ＥＭＸ１、およびＦＡＮＣＦ１でＣａｓ９によって誘発される二本鎖切断（ＤＳＢ）の中へのビオチン化されたｄｓＯＤＮタグの効率的な組み込みを示す図である。（１９Ａ）ＲＦＬＰ解析により、Ｕ２ＯＳ細胞における３つの内在性標的部位、ＶＥＧＦＡ３、ＥＭＸ１、およびＦＡＮＣＦ１でＣａｓ９によって誘発されるＤＳＢの中への標準ｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ６８５／６８６）と比較した、ビオチン化されたｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ１２６１／１２６２）の組み込み率（％）が示される。（１９Ｂ）Ｔ７ＥＩにより、Ｕ２ＯＳ細胞における３つの内在性標的部位、ＶＥＧＦＡ３、ＥＭＸ１、およびＦＡＮＣＦ１での標準ｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ６８５／６８６）と比較した、ビオチン化されたｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ１２６１／１２６２）での推定される変異生成頻度（％）が示される。 図２０Ａ－Ｂ．より長いｄｓＯＤＮタグは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で誘発されるＤＳＢの部位において効率良く組み込むために最適化されうることを示す図である。（２０Ａ）ＲＦＬＰ解析により、７５、５０、または２５ｐｍｏｌでトランスフェクトされるときの６０ｂｐのｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ１２５５／１２５６、ｏＳＱＴ１２５７／１２５８、およびｏＳＱＴ１２５９／１２６０）の組み込み率（％）が示される。Ｕ２ＯＳ細胞において２つの内在性部位、ＥＭＸ１およびＦＡＮＣＦ１で試験された。（２０Ｂ）Ｔ７ＥＩにより、７５、５０、または２５ｐｍｏｌでトランスフェクトされるときの６０ｂｐのｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ１２５５／１２５６、ｏＳＱＴ１２５７／１２５８、およびｏＳＱＴ１２５９／１２６０の推定ＮＨＥＪ率（％）が示される。Ｕ２ＯＳ細胞において２つの内在性部位、ＥＭＸ１およびＦＡＮＣＦ１で試験された。 異なるｓｇＲＮＡを使用した改変ＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントについてのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって同定されたオフターゲット切断部位の数を示しているグラフである。 オフターゲット部位での野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９バリアントの間の特異性における、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑで検出される変化をまとめているグラフである。Ｄ１１３５Ｅについての読み数のない部位での特異性における推定される増加（倍）は、プロットされていない。 図２３Ａ－Ｂ．以下を示しているグラフである。（２３Ａ）制限断片長多型解析によって推定される、オンターゲット部位でのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑオリゴタグ組み込みの平均頻度。エラーバーは、平均値の標準誤差、ｎ＝４を表す；（２３Ｂ）ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験のためにＴ７Ｅ１によって検出されるオンターゲット部位における平均変異生成頻度。エラーバーは、平均値の標準誤差、ｎ＝４を表す。

本明細書に記載のシークエンシングによって評価されるゲノムワイドでバイアスのない
ＤＳＢの同定（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ）法は、生細胞、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ
）修復経路が有効な細胞において改変ヌクレアーゼ切断部位の位置を同定するための高感
度な、バイアスのない、かつゲノムワイドな方法を可能にする。一部の実施形態では、該
方法は、ヌクレアーゼで誘発された切断の中への短い二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド
（ｄｓＯＤＮ）の捕捉（ＮＨＥＪ経路によって媒介されると推定されるプロセス）および
次いでゲノムの挿入の部位を同定するための挿入されたｄｓＯＤＮ配列の使用、例えば、
挿入されたｄｓＯＤＮ配列を使用してハイスループットシークエンシングのためのゲノム
挿入の部位を選択的に増幅する、ＰＣＲに基づいたディープシークエンシングアプローチ
を使用すること、または、例えば、溶液ハイブリッド捕捉を使用して、付加されたタグ、
例えば、ビオチンなどを使用して、挿入されたｄｓＯＤＮを含むゲノム断片を選択的にプ
ルダウンすること、に依存する。本明細書に記載されているのは、培養ヒト細胞における
ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の開発および検証である；本明細書に記載されている一般的なアプ
ローチは、すべての哺乳動物細胞においておよびＮＨＥＪ経路が活性であるまたは活性で
あると推定されるあらゆる細胞型または生物において有効なはずである。

この最初のシークエンシングプロセスによって同定される潜在的なオフターゲット部位
は、ヌクレアーゼ成分だけが発現される細胞におけるＮＨＥＪ修復のインデル変異特性に
ついて解析される可能性もある。これらの実験は、増幅およびその後のディープシークエ
ンシングを使用して行われてもよく、それぞれのヌクレアーゼによって誘発されるオフタ
ーゲット変異の頻度のさらなる確認および定量を可能にするはずである。

二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）
本明細書に記載の方法において、天然に存在しないｄｓＯＤＮは、細胞内で発現される
。本方法において、ｄｓＯＤＮの両鎖は、細胞のゲノムにオルソロガスである（すなわち
、細胞のゲノム内に存在しないまたは細胞のゲノム内に存在する配列に相補的である、す
なわち、細胞のゲノム内に存在する配列に１０％、２０％、３０％、４０％、または５０
％以下の同一性を有する）。ｄｓＯＤＮは、好ましくは１５および７５ｎｔの間の長さ、
例えば、１５～５０ｎｔ、５０～７５ｎｔ、３０～３５ｎｔ、６０～６５ｎｔ、もしくは
５０～６５ｎｔの長さ、または１５および５０ｎｔの間の長さ、例えば、２０～４０もし
くは３０～３５、例えば、３２～３４ｎｔの長さでありうる。ｄｓＯＤＮの各鎖は、固有
のＰＣＲプライミング配列を含んでいなければならない（すなわち、ｄｓＯＤＮは、それ
ぞれの鎖上に１つずつ、２つのＰＣＲプライマー結合部位を含む）。一部の実施形態では
、ｄｓＯＤＮは、制限酵素認識部位、好ましくは、細胞のゲノムにおいて相対的にまれな
部位を含む。

ｄｓＯＤＮは、好ましくは修飾される；好ましくは、ｄｓＯＤＮの５’末端は、リン酸
化される；さらにまた好ましくは、２つのホスホロチオエート結合が、両方の３’末端お
よび両方の５’末端上に存在する。好ましい実施形態では、ｄｓＯＤＮは、平滑末端であ
る。一部の実施形態では、ｄｓＯＤＮは、５’または３’末端上に無作為な多様な１、２
、３、４つまたはそれより多くのヌクレオチドオーバーハングを含む。

ｄｓＯＤＮは、１つまたは複数のさらなる修飾、例えば、当技術分野において知られて
いるまたはＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６０４９３に記載されているようなものも含んでい
てもよい。例えば、一部の実施形態では、ｄｓＯＤＮは、ビオチン化される。ＧＵＩＤＥ
－ｓｅｑ ｄｓＯＤＮタグのビオチン化バージョンは、ゲノムのＤＳＢの部位の中への組
み込みのための基質として使用される。ビオチンは、ｄｓＯＤＮに対して内側のどこにあ
ってもよいが（例えば、修飾されたチミジン残基（ビオチン－ｄＴ）、またはビオチンア
ジドを使用する）、５’または３’末端上にあってはならない。実施例４に示されている
ように、こうしたオリゴを効率良く組み込むことが可能である。これは、ＧＵＩＤＥ－ｓ
ｅｑ ｄｓＯＤＮタグを含む断片を回収する代替の方法を可能にする。一方、一部の実施
形態では、これらの配列は、ネステッドＰＣＲによって検索および同定され、このアプロ
ーチでは、これらは、ビオチンを使用することによって、例えば、ストレプトアビジンコ
ーティング付き磁気ビーズに結合させることによって、または溶液ハイブリッド捕捉を使
用して、物理的にプルダウンされる；例えば、Gnirke et al., Nature Biotechnology 27
, 182 - 189 (2009)を参照されたい。主な利点は、両方のフランキング配列の検索であり
、これは、オフターゲット切断部位を同定するために参照ゲノムに配列をマップすること
への依存性を低下させる。

改変ヌクレアーゼ
以下の４つの主なクラスの改変ヌクレアーゼがある：１）メガヌクレアーゼ、２）ジン
クフィンガーヌクレアーゼ、３）転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ
Ｎ）、および４）クラスター化された規則的な間隔の短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）
Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）。例えば、Gaj et al., Trends Biotechno
l. 2013 Jul;31(7):397-405を参照されたい。ヌクレアーゼは、当技術分野において知ら
れている方法を使用して、細胞内で一過的にまたは安定に発現されてもよい；典型的には
、発現を得るために、タンパク質をコードしている配列は、直接的な転写のためのプロモ
ーターを含む発現ベクター中にサブクローニングされる。好適な真核発現系は、当技術分
野においてよく知られかつ、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laborato
ry Manual (4th ed. 2013)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory M
anual (2006)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds.
, 2010)に、記載されている。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準的な技術（例
えば、上記の参考文献およびMorrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curti
ss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照され
たい）によって行われる。

ホーミングメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、多様な生物、例えば、細菌、酵母、藻類および植物の細胞小器官
などに由来している配列特異的エンドヌクレアーゼである。内在性メガヌクレアーゼは、
１２から３０塩基対の認識部位を有する；１８ｂｐおよび２４ｂｐの長さのメガヌクレア
ーゼ認識部位を有するカスタマイズされたＤＮＡ結合部位が記載されており、いずれかが
本方法およびコンストラクトにおいて使用されてもよい。例えば、Silva, G., et al., C
urrent Gene Therapy, 11:11-27, (2011)；Arnould et al., Journal of Molecular Biol
ogy, 355:443-58 (2006)；Arnould et al., Protein Engineering Design & Selection,
24:27-31 (2011)；およびStoddard, Q. Rev. Biophys. 38, 49 (2005)；Grizot et al.,
Nucleic Acids Research, 38:2006-18 (2010)を参照されたい。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ
近年の研究は、クラスター化された、規則的な間隔の、短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰ
Ｒ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（Wiedenheft et al., Nature 482, 331-338
(2012)；Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010)；Terns et al., Curr Opin Mi
crobiol 14, 321-327 (2011)）が、細菌、酵母およびヒト細胞において、ならびに全生物
、例えば、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびマウスなどにおいてｉｎ ｖｉｖ
ｏで、ゲノム編集を行うための簡単かつきわめて効率的な方法の基礎として役に立ちうる
ことを実証している（Wang et al., Cell 153, 910-918 (2013)；Shen et al., Cell Res
(2013)；Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013)；Jiang et al., Nat Biotechnol
31, 233-239 (2013)；Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013)；Hwang et al., Nat Biot
echnol 31, 227-229 (2013)；Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)；Mali et al.
, Science 339, 823-826 (2013c)；Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013)；G
ratz et al., Genetics 194(4):1029-35 (2013)）。化膿レンサ球菌（S. pyogenes）から
のＣａｓ９ヌクレアーゼ（以下、簡単にＣａｓ９）は、１７～２０ヌクレオチドの改変ガ
イドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（例えば、単一ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮ
Ａ対）とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例えば、ＰＡＭは配列ＮＧＧまたは
ＮＡＧに合致している）の隣にある目的の標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖との間の単純な
塩基対相補性を介して誘導されうる（Shen et al., Cell Res (2013)；Dicarlo et al.,
Nucleic Acids Res (2013)；Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)；Jinek
et al., Elife 2, e00471 (2013)；Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013)
；Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)；Mali et al., Science 339, 823-826 (2
013c)；Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013)；Jinek et al., Science 337,
816-821 (2012)）。

一部の実施形態では、本システムは、細菌においてコードされるようなまたは哺乳動物
細胞における発現のためにコドン最適化されたいずれかの、化膿レンサ球菌（S. pyogene
s）または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）からの野生型またはバリアントのＣ
ａｓ９タンパク質を利用する。ガイドＲＮＡは、細胞内でＣａｓ９と一緒に発現される。
ガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼのいずれか、または両方は、細胞内で一過的にまたは安
定に発現されうる。

ＴＡＬエフェクター反復配列
キサントモナス属（Xanthomonas）の中の植物病原性細菌のＴＡＬエフェクターは、宿
主ＤＮＡを結合することおよびエフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって
、疾患において重要な役割を果たす、または防御を始動させる。特異性は、エフェクター
可変数の、不完全な、典型的には約３３～３５アミノ酸の反復に依存する。多型は、主に
リピート部位１２および１３に存在し、これは、本明細書において反復可変二残基（ＲＶ
Ｄ）と呼ばれる。ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、それらの標的部位においてヌクレオチ
ドに、直接的、直線的な様式で、１つのＲＶＤが１つのヌクレオチドに、一部は縮重で、
かつ見かけ上の前後関係の依存性なく、対応する。一部の実施形態では、ヌクレオチド特
異性を付与する多型領域は、三残基またはトリプレットとして発現されうる。

それぞれのＤＮＡ結合反復は、標的ＤＮＡ配列において塩基対の認識を決定するＲＶＤ
を含みうる。ここで、それぞれのＤＮＡ結合反復は、標的ＤＮＡ配列内の１つの塩基対を
認識する役割を果たす。一部の実施形態では、ＲＶＤは、以下のうちの１つまたは複数：
Ｃを認識するためのＨＡ；Ｃを認識するためのＮＤ；Ｃを認識するためのＨＩ；Ｇを認識
するためのＨＮ；Ｇを認識するためのＮＡ；ＧまたはＡを認識するためのＳＮ；Ｔを認識
するためのＹＧ；およびＧを認識するためのＮＫ、ならびに以下のうちの１つまたは複数
を含みうる：Ｃを認識するためのＨＤ；Ｔを認識するためのＮＧ；Ａを認識するためのＮ
Ｉ；ＧまたはＡを認識するためのＮＮ；ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮ
Ｓ；ＣまたはＴを認識するためのＮ^＊、ここで、^＊は、ＲＶＤの第２の部位内のギャップ
を表す；Ｔを認識するためのＨＧ；Ｔを認識するためのＨ^＊、ここで、^＊は、ＲＶＤの第
２の部位内のギャップを表す；およびＴを認識するためのＩＧ。

ＴＡＬＥタンパク質は、ゲノム工学において（例えば、植物において生物燃料または生
物再生可能材料に有用な形質を付加または促進するために）相同組換えを促進することが
できる標的化されたキメラヌクレアーゼとして研究およびバイオテクノロジーにおいて有
用でありうる。これらのタンパク質は、例えば、転写因子としても有用でありえ、かつ特
に、非限定的な例として病原体（例えば、ウイルス）に対する療法のように、きわめて高
いレベルの特異性を必要とする治療的適用のためにも有用でありうる。

改変ＴＡＬＥ配列を作製するための方法は、当技術分野において知られており、例えば
、米国特許出願公開第６１／６１０，２１２号明細書、およびReyon et al., Nature Bio
technology 30,460-465 (2012)に記載されている高速のライゲーションに基づいた自動化
可能な固相ハイスループット（ＦＬＡＳＨ）システム；ならびにBogdanove & Voytas, Sc
ience 333, 1843-1846 (2011)；Bogdanove et al., Curr Opin Plant Biol 13, 394-401
(2010)；Scholze & Boch, J. Curr Opin Microbiol (2011)；Boch et al., Science 326,
1509-1512 (2009)；Moscou & Bogdanove, Science 326, 1501 (2009)；Miller et al.,
Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011)；Morbitzer et al., T. Proc Natl Acad Sci U S A
107, 21617-21622 (2010)；Morbitzer et al., Nucleic Acids Res 39, 5790-5799 (201
1)；Zhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)；Geissler et al., PLoS ONE 6
, e19509 (2011)；Weber et al., PLoS ONE 6, e19722 (2011)；Christian et al., Gene
tics 186, 757-761 (2010)；Li et al., Nucleic Acids Res 39, 359-372 (2011)；Mahfo
uz et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2623-2628 (2011)；Mussolino et al., Nuc
leic Acids Res (2011)；Li et al., Nucleic Acids Res 39, 6315-6325 (2011)；Cermak
et al., Nucleic Acids Res 39, e82 (2011)；Wood et al., Science 333, 307 (2011)
；Hockemeye et al. Nat Biotechnol 29, 731-734 (2011)；Tesson et al., Nat Biotech
nol 29, 695-696 (2011)；Sander et al., Nat Biotechnol 29, 697-698 (2011)；Huang
et al., Nat Biotechnol 29, 699-700 (2011)；およびZhang et al., Nat Biotechnol 29
, 149-153 (2011)に記載されている方法を参照されたい；これらのすべては、参照により
本明細書にその全体が組み込まれている。

ジンクフィンガー
ジンクフィンガータンパク質は、独立に折りたたまれた亜鉛を含むミニドメインである
、１つまたは複数のジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合タンパク質であり、その構造は、
当技術分野においてよく知られており、かつ、例えば、Miller et al., 1985, EMBO J.,
4:1609；Berg, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:99；Lee et al., 1989, Science
. 245:635；およびKlug, 1993, Gene, 135:83に定義されている。ＤＮＡに結合したジン
クフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８およびそのバリアントの結晶構造は、半分保存され
た相互作用のパターンを示し、そこでは、典型的にはジンクフィンガーのアルファヘリッ
クスからの３つのアミノ酸が、ＤＮＡ内の３つの隣接した塩基対すなわち「サブサイト」
と接触する（Pavletich et al., 1991, Science, 252:809；Elrod-Erickson et al., 199
8, Structure, 6:451）。したがって、Ｚｉｆ２６８の結晶構造により、ジンクフィンガ
ーＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーとＤＮＡ配列内の３塩基対「サブサイト」と
の間の１対１の相互作用を有するモジュールの様式で機能する可能性があることが示唆さ
れる。天然に存在するジンクフィンガー転写因子において、複数のジンクフィンガーは、
典型的には、直列の配列内に一緒に結合されて、連続したＤＮＡ配列の配列特異的認識を
達成する（Klug, 1993, Gene 135:83）。

複数の研究は、ＤＮＡ結合に関与するアルファヘリックスの部位においてアミノ酸を無
作為化することおよびファージディスプレイのような選択方法を使用して目的のＤＮＡ標
的部位に結合する能力のある望ましいバリアントを同定することによって個々のジンクフ
ィンガーのＤＮＡ結合特性を人為的に改変することが可能であることを示している（Reba
r et al., 1994, Science, 263:671；Choo et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
91:11163；Jamieson et al., 1994, Biochemistry 33:5689；Wu et al., 1995 Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 92: 344）。こうした組換えジンクフィンガータンパク質は、機能ド
メイン、例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、メチル化ドメイン、およびヌクレアー
ゼと融合させて、遺伝子発現を調節し、ＤＮＡメチル化を変化させ、モデル生物、植物、
およびヒト細胞のゲノム内に標的とする変化を導入することができる（Carroll, 2008, G
ene Ther., 15:1463-68；Cathomen, 2008, Mol. Ther., 16:1200-07；Wu et al., 2007,
Cell. Mol. Life Sci., 64:2933-44）。

「モジュール集合体」として知られている、ジンクフィンガー配列を改変するための１
つの既存の方法は、予め選択されたジンクフィンガーモジュールを配列内に単純に一緒に
連結することを提唱している（Segal et al., 2003, Biochemistry, 42:2137-48；Beerli
et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20:135-141；Mandell et al., 2006, Nucleic Acids
Res., 34:W516-523；Carroll et al., 2006, Nat. Protoc. 1:1329-41；Liu et al., 20
02, J. Biol. Chem., 277:3850-56；Bae et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:275-280
；Wright et al., 2006, Nat. Protoc., 1:1637-52）。いかなる研究者によって実施され
るのにも十分に簡単であるにもかかわらず、近年の報告は、この方法のために、特に、ジ
ンクフィンガーヌクレアーゼの文脈において、高い失敗率（Ramirez et al., 2008, Nat.
Methods, 5:374-375；Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88）、いずれの所与の
標的遺伝子のためにもきわめて多数のジンクフィンガータンパク質の構築および細胞に基
づいた試験を典型的には必要とするという制限（Kim et al., 2009, Genome Res. 19:127
9-88）を示している。

無作為化されたライブラリーからジンクフィンガー配列を同定する、組合せの選択に基
づいた方法は、モジュール集合体よりも高い成功率を有することが示されている（Maeder
et al., 2008, Mol. Cell, 31:294-301；Joung et al., 2010, Nat. Methods, 7:91-92
；Isalan et al., 2001, Nat. Biotechnol., 19:656-660）。好ましい実施形態では、ジ
ンクフィンガー配列は、国際公開第２０１１／０１７２９３号パンフレットおよび国際公
開第２００４／０９９３６６号パンフレットに記載されている、またはこれらに記載され
ているように作製される。さらなる好適なジンクフィンガーＤＢＤは、米国特許第６，５
１１，８０８号明細書、第６，０１３，４５３号明細書、第６，００７，９８８号明細書
、および第６，５０３，７１７号明細書ならびに米国特許出願公開第２００２／０１６０
９４０号明細書に記載されている。

細胞
本明細書に記載の方法は、ゲノムＤＮＡにおいてＤＳＢを修復する能力のあるいかなる
細胞においても使用されうる。真核細胞における２つの主要なＤＳＢ修復経路は、相同組
換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。好ましくは、該方法は、ＮＨＥ
Ｊの能力のある細胞において行われる。ＮＨＥＪ活性を検出するための方法は、当技術分
野において知られている；ＮＨＥＪの標準経路および副経路の概要については、Liu et a
l., Nucleic Acids Res. Jun 1, 2014; 42(10):6106-6127を参照されたい。

シークエンシング
本明細書中で使用される場合、「シークエンシング」は、核酸の配列を決定するいかな
る方法をも含む。鎖終結（サンガー）シークエンシングおよび色素終結シークエンシング
を含む、シークエンシングのいかなる方法も本方法において使用されうる。好ましい実施
形態では、何千または何百万ものシークエンシング反応を並行に行うハイスループットシ
ークエンシング技術である、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）が使用される。異なるＮ
ＧＳプラットフォームは異なるアッセイ化学を使用するが、これらはすべて、多数の鋳型
上で同時に行われる多数のシークエンシング反応から配列データを生成する。典型的には
、配列データは、スキャナーを使用して収集され、次いで、バイオインフォマティクス的
に集結および解析される。したがって、シークエンシング反応は、並行に、実施、読み取
り、集結、および解析される；例えば、米国特許第２０１４０１６２８９７号明細書、な
らびにVoelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；およびMacLean et al
., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296 (2009)を参照されたい。ＮＧＳ法には、鋳型増
幅を必要とするものもあり、必要としないものもある。増幅を必要とする方法は、ピロシ
ークエンシング（例えば、米国特許第６，２１０，８９号明細書および第６，２５８，５
６８号明細書を参照されたい；Ｒｏｃｈｅによって商品化されている）；Ｓｏｌｅｘａ／
Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（例えば、米国特許第６，８３３，２４６号明細書、
第７，１１５，４００号明細書、および第６，９６９，４８８号明細書を参照されたい）
；ならびに補助されたオリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出（ＳＯＬｉＤ）プラ
ットフォーム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；例えば、米国特許第５，９１２
，１４８号明細書および第６，１３０，０７３号明細書を参照されたい）を含む。増幅を
必要としない方法（例えば、一分子シークエンシング法）は、ナノポアシークエンシング
、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（米国特許第第７，１６９，５６０号明細書；第７，２８２，３３
７号明細書；第７，４８２，１２０号明細書；第７，５０１，２４５号明細書；第６，８
１８，３９５号明細書；第６，９１１，３４５号明細書；および第７，５０１，２４５号
明細書）；合成によるリアルタイムシークエンシング（例えば、米国特許第７，３２９，
４９２号明細書を参照されたい）；ゼロモード導波路（ＺＭＷ）を使用した一分子リアル
タイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシークエンシング法；ならびに、米国特許第７，１７０，０５
０号明細書；第７，３０２，１４６号明細書；第７，３１３，３０８号明細書；および第
７，４７６，５０３号明細書に記載されているものを含む）、他の方法。例えば、米国特
許出願公開第２０１３／０２７４１４７号明細書；米国特許出願公開第２０１４／００３
８８３１号明細書；Metzker, Nat Rev Genet 11(1): 31-46 (2010)を参照されたい。

代替的に、ハイブリダイゼーションに基づいたシークエンス法または他のハイスループ
ットな方法、例えば、マイクロアレイ解析、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、
または他のシークエンシングプラットフォームも使用されてもよい。
実施例

本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるが、これは、特許請求の範囲に記載
の本発明の範囲を限定するものではない。

最初の実験では、ヌクレアーゼで誘発された二本鎖切断（ＤＳＢ）の中にｄｓＯＤＮカ
セットを組み込むプロセスを最適化した。以前に公表された実験は、５’末端に２つのホ
スホロチオエート結合修飾を有しているｄｓＯＤＮを、哺乳動物細胞においてジンクフィ
ンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）で誘発されたＤＳＢの中に捕捉できたことを実証している
（Orlando et al., Nucleic Acids Res. 2010 Aug;38(15):e152）。しかし、こうしたｓ
ｓＯＤＮの捕捉を使用してきわめて低頻度のＤＳＢでも同定するために、こうした切断の
中へのその捕捉の割合を改良するためにｄｓＯＤＮの特性を最適化した。当初の努力は、
化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）からのクラスター化された規則的な間隔の短
鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＣａｓ９によって誘発された
ＤＳＢ中にｄｓＯＤＮを捕捉することに焦点を当てた。Ｃａｓ９は、平滑末端を有するＤ
ＳＢを誘発することが報告されており、したがって、ｄｓＯＤＮバリアントは、平滑末端
化されるように設計した。最適化実験は、両方の５’末端のリン酸化および（５’末端上
のものに加えて）両方の３’末端上の２つのホスホロチオエート結合の導入により、Ｃａ
ｓ９で誘発されたＤＳＢの中へのｄｓＯＤＮの捕捉の割合の大幅な上昇が導かれたことを
示した（図１Ａ～Ｂ）。サンガーシークエンシングより、この特定のＤＳＢ中にｄｓＯＤ
Ｎを成功裏に捕捉したことが検証された（図２Ａ～Ｂ）。

Ｃａｓ９で誘発されたＤＳＢ中にｄｓＯＤＮが効率良く組み込まれうることが確立され
たので、次の実験では、次世代ディープシークエンシング法を哺乳動物細胞のゲノム内の
ｄｓＯＤＮ組み込み部位の捕捉、増幅および同定に使用し得るかどうかを決定することが
求められた。これを行うために、（それぞれの鎖上に１つの）２つのＰＣＲプライマー結
合部位を含む３４ｂｐのｄｓＯＤＮを利用した；これらの配列が選択された理由は、それ
らがヒトゲノムにそれぞれオルソロガスであるためである。

使用しｄｓＯＤＮの配列を、表１に示す：

このｄｓＯＤＮを、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、および異なる内在性ヒト遺伝子
配列（ＥＭＸ１およびＶＥＧＦＡ部位１、２、および３）にそれぞれ標的化された、４種
の異なる標的特異的ｇＲＮＡのうちの１種をコードするプラスミドと共にヒトＵ２ＯＳ細
胞内にトランスフェクトした。これら４種の特定ｇＲＮＡは、これらのそれぞれについて
真正のオフターゲット部位が以前に同定されていた（Fu et al., Nat Biotechnol. 2013;
Table 1）という理由で選択した。トランスフェクションは、以下のように行った：ｄｓ
ＯＤＮを、ＳＴＥ（１００ｍＭ ＴｒｉｓＨｃｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）中でそれぞれ１００ｕＭの濃度でアニールさせる。Ｕ２ＯＳ細胞では、２Ｅ５細
胞を溶液ＳＥおよびプログラムＤＮ－１００でヌクレオフェクトするために、５００ｎｇ
のＣａｓ９発現プラスミド、２５０ｎｇのｇＲＮＡ発現プラスミド、および１００ｐｍｏ
ｌのｄｓＯＤＮを使用した。

トランスフェクション３日後にゲノムＤＮＡを採取し（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕ
ｒｅ ＸＰ）、ｄｓＯＤＮにコードされた制限部位の存在に基づいて、ｄｓＯＤＮがこれ
らの細胞内のオンターゲット部位の中に効率良く組み込まれていることを検証するために
、ＰＣＲベースの制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイを使用した。

トランスフェクトされた細胞のゲノム内のｄｓＯＤＮ組み込みの位置を包括的に同定す
るために、これらの挿入部位を選択的に増幅してさらにそれらが次世代シークエンシング
技術を使用してシークエンスされるのを可能にするＰＣＲベースの方法を使用した。この
戦略の一般的な概要を図３に示す。ゲノムＤＮＡは、Ｃｏｖａｒｉｓ Ａｄａｐｔｉｖｅ
Ｆｏｃｕｓｅｄ Ａｃｏｕｓｔｉｃ（ＡＦＡ）焦点式超音波発生装置で５００ｂｐの平
均長に切断した。切断されたｇＤＮＡを末端修復し（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、Ａテール
付加して（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、切断されたＤＮＡの末端に半機能的シークエンシン
グアダプター（米国特許第２０１３０３０３４６１号明細書）を連結した（Ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｃｓ）。これらの酵素的ステップのそれぞれを精製するために、固相可逆固定法（Ｓ
ＰＲＩ）磁気ビーズ精製を使用した（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＸＰ）。

ｄｓＯＤＮ配列を有するＤＮＡ断片は、次いで、ｄｓＯＤＮに特異的なプライマーを、
シークエンシングアダプターにアニールするプライマーと一緒に使用して増幅した。（上
記のようにそれぞれの鎖上に１つの）２つの潜在的なプライミング部位がｄｓＯＤＮ内に
あるので、望ましい配列を選択的に増幅するために以下のように２つの独立したＰＣＲ反
応を行った。

標的化されたシークエンシングライブラリーを作製するために、２ラウンドのネステッ
ドＰＣＲを行った。第一ラウンドのＰＣＲは、組み込みｄｓＯＤＮと相補的なプライマー
（プライマーＡ）およびユニバーサルアダプターと相補的なプライマー（プライマーＢ）
を使用して行った。第二ラウンドのＰＣＲは、プライマーＡと相補的な３’ネステッドプ
ライマー（プライマーＣ）、プライマーＢと相補的な３’ネステッドプライマー（プライ
マーＤ）、ならびに、シークエンシングのために用意のできた「完全な」分子を作製する
ためにフローセル結合配列および無作為な分子インデックスを付加した、プライマーＤと
相補的なプライマー（プライマーＥ）を使用して行った。各ラウンドのＰＣＲを精製する
ために、ＳＰＲＩ磁気ビーズを使用した。（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ）

このアプローチによるｄｓＯＤＮ含有ゲノム配列の増幅は、ゲノムＤＮＡの無作為な切
断によって誘発された切断にシークエンシングアダプターがライゲーションされるので、
挿入地点に隣接したフランキング配列に依存することもそれによってバイアスされること
もない。ｄｓＯＤＮに最も近い末端上に次世代シークエンシングアダプター配列およびイ
ンデクシングバーコードを付加するためにさらなるラウンドのＰＣＲを行い、結果として
、次世代シークエンシング用に準備できた断片のライブラリーを得た。この一般的な方法
は、本明細書において、シークエンシングによって評価されるゲノムワイドでバイアスの
ないＤＳＢの同定（Genomewide Unbiased Identification of DSBs Evaluated by Sequen
cing）として、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑと呼ぶ。

ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを使用して構築されたライブラリーのディープシークエンシングに
より、共発現された４種のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼのそれぞれの存在下において
ｄｓＯＤＮが挿入されるようになった広範囲のゲノム座位が明らかにされた。生のディー
プシークエンシングデータの解析において、挿入の真正の部位が、両方向での少なくとも
１つの読みによってカバーされたゲノム座位として同定されうることは理にかなっていた
。ｄｓＯＤＮがいずれの方向においても挿入できたためおよびｄｓＯＤＮ配列内の一方ま
たは他方のいずれかの鎖に特異的なプライマーを使用して増幅が行われたためという両方
の理由により、両方向での読みが可能であった。調査した４種のｇＲＮＡについて、この
基準を満たした合計４６５のゲノム座位を同定した。これらの４６５座位のうちの３６％
では、使用したｇＲＮＡのオンターゲット部位と同様であり、かつ、オンターゲット部位
に対して相対的に６つものミスマッチを有する、挿入地点の２５ｂｐ以内の配列も同定さ
れた（図４Ａ～Ｅ）。この方法は、ここで調査された４種すべてのｇＲＮＡについて、す
べての既知の真正オフターゲット部位（図４に示されている既知のオフターゲット部位の
すべては、Fu et al., Nat Biotechnol. 2013からの表１にも示されている)ならびにこれ
までに知られていない多くのさらなるオフターゲット部位の発見にも成功した。

カスタマイズ可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）は、
広範囲の研究および潜在的な臨床の適用を有する強力な、カスタマイズ可能なゲノム編集
試薬である^１、２；しかし、ヒトにおけるＲＧＮの治療的使用には、有害な結末のリスク
を最小限にするためにこれらのオフターゲット作用についての完全な知識が必要とされる
ことになる。化膿レンサ球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるＤＮＡ切断は
、プログラム可能な約１００ｎｔのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって指向される^３。タ
ーゲティングは、ｇＲＮＡの５’末端にある１７～２０ｎｔによって介され、これは、５
’－ＮＧＧ型のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣にある「プロトスペーサー
」ＤＮＡ部位と相補的である。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による、プロトスペーサー内
のＣａｓ９で誘発されたＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復は、可変長の挿入／欠失変異
（インデル）を誘発しうる。本発明者らのグループおよび他は、ＲＧＮで誘発された意図
されていないインデルが、プロトスペーサー内の５つもの部位によって異なるオフターゲ
ット切断部位で生じうること、または代替のＰＡＭ配列を有することを以前に示している
^４～７。染色体転座は、ＲＧＮで誘発されたオンターゲットおよびオフターゲットの切断
事象の連結によって生じうる^８～１１。ＲＧＮを使用するｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ－ｖ
ｉｖｏでの治療戦略には、きわめて大きな細胞集団の修飾が必要とされることが予想され
るので、臨床的適用では、低頻度であっても変化の同定は、決定的に重要であろう。こう
した変化は好ましくない臨床的結末をもたらしうるので、細胞クローンのたとえまれなサ
ブセットにおいてでも癌化の誘導（例えば、腫瘍抑制遺伝子の変異を不活性化することま
たは腫瘍形成性染色体転座の形成）が特に懸念される。

ゲノム内のどこにでも生じうるインデルまたは高次ゲノム再配列の包括的な同定は、簡
単には対処されない課題であり、残念なことに、生細胞におけるバイアスのない、ゲノム
ワイドな、ＲＧＮで誘発されたオフターゲット変異の同定のための高感度の方法はまだ記
載されていない^{１２、１３}。全ゲノム再シークエンシングは、編集された単一細胞クロー
ンにおけるＲＧＮオフターゲット変化を同定するための試みに使用されてきた^{１４、１５}
。しかし、きわめて多数のゲノムをシークエンスする高いコストにより、この方法は、細
胞集団における低頻度の事象を見つけるのには非実用的とされる^１２。本発明者らおよび
他者は、オンターゲット部位に対する配列類似性^４、５または部分的に変性した結合部位
ライブラリーからのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択^６のいずれかによって同定される潜在的なオフ
ターゲット部位におけるインデル変異を同定するために、焦点式ディープシークエンシン
グを使用してきた。しかし、これらのアプローチは、オフターゲット配列の性質について
の仮定を作るものであり、したがって、ゲノム内の他の場所の他の変異部位を見落とす可
能性がある。ＣｈＩＰ－Ｓｅｑも、触媒的に不活性の（dead）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と
複合体形成したｇＲＮＡについてのオフターゲット結合部位を同定するために使用されて
きたが、公表された研究の大多数は、これらの部位のうち、活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼに
よる切断のオフターゲット部位であるものは、たとえあるとしても、きわめて少ないこと
を示唆している^{１６～１９}。

ここで、本発明者らは、ヒト生細胞における異なる１０種のＲＧＮについての最初の包
括的な特異性ランドスケープの作製を可能にする、シークエンシングによって評価される
ゲノムワイドでバイアスのないＤＳＢの同定（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ）のための新規な方法
の開発を記載する。これらのプロファイルにより、オフターゲットＤＳＢの総数は、個々
のＲＧＮについて広範に変化したことが明らかにされ、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）
または他の種からのＲＧＮの特異性についての広い結論は、大規模な調査に基づいていな
ければならず、少数のｇＲＮＡだけに基づいていてはならないことが示唆された。本発明
者らの発見は、オフターゲット作用がそこで生じうる配列の範囲および性質を拡大もさせ
た。直接的な比較により、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、ＲＧＮオフターゲット部位を同定する
ための２つの広範に使用されるコンピュータのアプローチおよびＣｈＩＰ－Ｓｅｑ法より
も実質的に優れていたことが実証された。予想外なことに、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、ＲＧ
Ｎで誘発されたＤＳＢと一緒に、転座などの高次ゲノム変化に関与しうるＲＧＮ非依存性
のＤＮＡ切断点ホットスポットも同定した。最後に、本発明者らは、直接的な比較におい
て、ｇＲＮＡの相補性領域をトランケートすることにより、それらのゲノムワイドなオフ
ターゲットＤＳＢプロファイルが大きく改良されることを示しており、ＲＧＮの特異性を
改良するために設計された向上を評価するためのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの有用性を実証して
いる。ここに概説される実験は、ＲＧＮの特異性を評価するためにこれまでに記載された
中で、ならびに、治療的使用のために考慮されうる、プラットフォームに対するあらゆる
改良の中で、最も精密な戦略を提供する。

方法
以下の材料および方法がこの実施例において使用された。

ヒト細胞培養およびトランスフェクション
Ｕ２ＯＳおよびＨＥＫ２９３細胞は、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補った
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５％のＣＯ_２
と共に３７℃で培養した。Ｕ２ＯＳ細胞（プログラムＤＮ－１００）およびＨＥＫ２９３
細胞（プログラムＣＭ－１３７）は、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４－Ｄ上
で製造業者の説明書に従って２０μｌの溶液ＳＥ中でトランスフェクトした。ｄｓＯＤＮ
組み込み率は、ＮｄｅＩを使用した制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイによって評価し
た。切断産物は、以前に記載されているように（Tsai et al., Nat. Biotechnol 32, 569
-576 (2014)）、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動機器（Ｑｉａｇｅｎ）によって泳
動および定量化した。

ＧＵＩＤＥ－ＳｅｑのためのゲノムＤＮＡの単離および調製
ゲノムＤＮＡは、固相可逆固定法磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃ
ｅ）を使用して単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２００超音波発生装置で５００ｂｐの平均長
に切断し、末端修復し、Ａテール付加し、８ｎｔの無作為な分子インデックスを組み込ん
でいる半機能的アダプターにライゲーションした。標的濃縮のために、オリゴタグと相補
的なプライマーでの、２ラウンドのネステッドアンカードＰＣＲを使用した。例示的なＧ
ＵＩＤＥ－Ｓｅｑプロトコールの全詳細は、本明細書中で見出すことができる。

シークエンシングの読みの加工および統合
配列の最初の６つの同じ塩基ならびに同一の８ｎｔの分子インデックスを共有する読み
は、それらが同じ起源のプレＰＣＲ鋳型断片に由来するとみなされるので、一緒にビニン
グされる。これらの読みは、各部位において大多数の塩基を選択することによって単一の
コンセンサスの読みに統合した。ノーコール（Ｎ）塩基は、１０％より高い不一致の読み
を有する状況で割り当てた。塩基クオリティスコアは、予め統合された読みの間で最も高
くなるようにした。統合された読みは、ＢＷＡ－ＭＥＭ（Li and Durbin, Bioinformatic
s 26, 589-595 (2010)）を使用してヒトゲノム参照（ＧｒＣｈ３７）にマップした。

オフターゲット切断部位の同定
マッピングのクオリティ≧５０を有する読みの開始マッピング部位を表にし、１０ｂｐ
のスライド式ウィンドウを使用して近くに開始マッピング部位を有する領域をグループ化
した。組み込まれたｄｓＯＤＮを有するゲノムウィンドウは、以下の判定基準のうちの１
つによって同定した：１）参照配列内の逆鎖に位置する２つ以上の固有の分子インデック
ス付加された読み、または２）フォワードおよびリバースプライマーによって増幅された
２つ以上の固有の分子インデックス付加された読み。推定された切断点の両側の側方の２
５ｂｐの参照配列を目的の標的部位に対してアライメントし、目的の標的配列から８つ以
下のミスマッチを有するＲＧＮオフターゲット部位を判定した。ＳＮＰおよびインデルは
、これらの部位において、分子インデックスおよびＳＡＭｔｏｏｌｓに基づいたカスタム
ビンコンセンサスバリアント判定アルゴリズムによって判定し、参照配列と異なったオフ
ターゲット配列は、対応する細胞特異的な配列と置き換えた。

ＡＭＰに基づいたシークエンシング
ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑで検出されたＤＳＢのＡＭＰ検証のために、プライマーは、以前に
記載されているように（Zheng, Z. et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-
generation sequencing. Nat Med 2014 Nov 10. doi: 10.1038/nm.3729 (2014)）、推定
された二本鎖切断点の側方の領域に設計し、８ｎｔの分子インデックスを付加した。可能
な場合には、本発明者らは、各ＤＳＢの側方に位置するように２つのプライマーを設計し
た。

ＡＭＰ検証データの解析
平均クオリティスコア＞３０を有する読みは、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑで推定されたＤＳＢ
部位とオーバーラップした挿入、欠失、および組み込みについてＰｙｔｈｏｎを使用して
解析した。ＰＣＲまたはシークエンシングの誤りからのノイズが入るのを最小限にするた
めに、１ｂｐのインデルは、それらが予測されたＤＳＢ部位の１ｂｐ以内であった場合の
みに含めた。組み込みおよびインデルの頻度は、統合された分子インデックス付加された
読みに基づいて算出した。

構造的バリエーション
転座、大きな欠失、および逆位は、スプリットＢＷＡ－ＭＥＭアライメントに基づいた
カスタムアルゴリズムを使用して同定した。同一染色体上の５０塩基以内の候補の融合切
断点は、Ｃａｓ９切断部位の周囲の潜在的な切断を含むようにグループ化した。融合事象
は、独自にマップされた少なくとも３つのスプリットの読みで判定し、パラメーターもｓ
ｅｇｅｍｅｈｌツールにより使用した（Hoffmann, Genome biology, 2014)）。マッピン
グストランデッドネスは、２つの関与しているＤＳＢの間の相互融合の同定のため、およ
び欠失または逆位を決定するために維持した。１ｋｂの染色体部位内にＤＳＢを含む融合
は、単一のＣａｓ９切断によって引き起こされる大きなインデルが考えられるために無効
とした。残りの融合ＤＳＢは、以下の４つのカテゴリーに分類した：ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ
に基づく「オンターゲット」、「オフターゲット」もしくは「バックグラウンド」、また
は他に「その他」。

ＧＵＩＤＥ－ＳｅｑおよびＣｈＩＰ－Ｓｅｑによって検出される部位ならびにコンピュー
タ上での予測の比較
本発明者らは、ＭＩＴ ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌを使用して、１０種す
べてのＲＧＮについての潜在的なオフターゲット部位を同定した。このツールは、それぞ
れの潜在的なオフターゲット部位に、対応する百分位数を定める。本発明者らは、次いで
、これらの百分位数を可視化目的で五分位群にグループ化した。Ｅ－ＣＲＩＳＰツールは
オフターゲットをランク付けしないので、本発明者らは、単純に、Ｅ－ＣＲＩＳＰによっ
て正確に予測されたＧＵＩＤＥ－ｓｅｑオフターゲットを見つけた。これらのＧＵＩＤＥ
－Ｓｅｑ対コンピュータ上での予測の両方について、本発明者らは、さらに、コンピュー
タ上での方法によって予測されなかったＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ結果を、ＭＩＴツール（最大
４つ）およびＥＣＲＩＳＰＲ（最大３つ）の範囲内のミスマッチ数を有するオフターゲッ
ト、ならびにこれらの予測ツールの閾値を超えるミスマッチ数を有するものに分割した。
ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ予測とのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑオフターゲットの比較において、同じ技術
を使用し、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑによって正確に予測されたＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑオフターゲッ
トを見つけた。これらの比較のそれぞれについて、なされたすべてのグループ化は、オフ
ターゲットミスマッチ数によって再分割し、正しくおよび誤って予測されたＲＧＮオフタ
ーゲットの特性をより良好に特徴付けした。

オフターゲット切断率に対する、ミスマッチ、ＤＮＡアクセシビリティおよび局所的ＰＡ
Ｍ密度の影響の解析
本発明者らは、推定される切断率に適合した線形回帰モデルを使用して、４つ以下のミ
スマッチを有する潜在的なオフターゲット部位において特異性に対する、ミスマッチ部位
、ミスマッチ型およびＤＮＡアクセシビリティの影響を評価した。ミスマッチ部位の共変
動は、ＰＡＭの上流のオーバーラップしていない５つの４ｂｐのウィンドウのそれぞれの
中のミスマッチされた塩基の数として定義した。ミスマッチ型の共変動は、ｉ）（標的Ｔ
がＣによって置き換えられ、標的ＧがＡによって置き換えられた）ゆらぎ対形成を結果と
して生じるミスマッチの数、ｉｉ）（標的ＣがＴによって置き換えられ、標的ＡがＧによ
って置き換えられた）非ゆらぎプリン－ピリミジン塩基対形成を結果として生じるミスマ
ッチの数、およびｉｉｉ）プリン－プリンまたはピリミジン－ピリミジン対形成を結果と
して生じるミスマッチとしての数と定義した。

３つの因子のそれぞれは、別々のモデルにおいて、ｌｏｇ_２（１＋ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ
読み数）によって推定される、相対切断率の予測因子として使用した。作用の大きさの推
定は、標的部位間変動性のために調整した。各因子によって説明されるサイト内切断率変
動性の比率は、回帰平方和（ＳＳ）に基づく偏イータ二乗統計：η^２ _ｐ＝ＳＳ_{ｆａｃｔｏ
ｒ}／（ＳＳ_{ｆａｃｔｏｒ}＋ＳＳ_{ｅｒｒｏｒ}）によって評価した。一因子モデルに加えて、
本発明者らは、３つすべての因子、発現レベル、および１ｋｂのウィンドウ内のＰＡＭ密
度を含む組み合わされた線形回帰モデルも適合させて、オフターゲット切断可能性に対す
るそれらの独立した寄与を評価した。

Ｇｕｉｄｅ－ｓｅｑライブラリー調製のための例示的な試薬および装置
室温で保存
品目 販売会社
Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０マイクロチューブ、 Ｃｏｖａｒｉｓ
エタノール、２００プルーフ（１００％） Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ
ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェルプレート Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ
ヌクレアーゼ非含有Ｈ_２Ｏ Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｑｕｂｉｔアッセイチューブ、５００チューブ／パック Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＢＲキット－５００アッセイ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
ＴＭＡＣバッファー、５Ｍ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ
－ 塩化テトラメチルアンモニウム
１×ＴＥバッファー／１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（Ｇｉｂｃｏ）（４×１００ｍ
Ｌ） Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ

４℃で保存
品目 販売会社
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ － ６０ｍＬ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ

－２０℃で保存
品目 カタログ＃
２５ｍＭ ｄＮＴＰ溶液ミックス Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．
Ｓｌｏｗライゲーションバッファー Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．
末端修復ミックス（低濃度） Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．
－ １０× Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（Ｓｌｏｗライゲーションバッファ
ー）
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ
－ １０× ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ_２なし）
－ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２
ｑＰＣＲ Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー定量化キット ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｉｎｃ．

機器
９６ウェルプレート磁気スタンド Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計２．０ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ－２ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｕｌｔｒａ－ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（商標）
機器 Ｃｏｖａｒｉｓ
卓上遠心分離機 Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
卓上ボルテクサー Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
サーモサイクラー Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
Ｍｉｓｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａ

ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑライブラリー調製のための例示的なプロトコール
Ｙアダプター調製
Ｙアダプターは、Ｍｉｓｅｑ共通オリゴを試料バーコードアダプター（Ａ０１からＡ１
６、表３を参照されたい）のそれぞれとアニールすることによって作製される。アダプタ
ーは、８ｍｅｒのＮＮＷＮＮＷＮＮ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｗ＝ＡまたはＴ）分子
インデックスも含む。
１×ＴＥバッファー ８０．０μＬ
Ａ＃＃（１００μＭ） １０．０μＬ
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｍｍｏｎ Ａｄａｐｔｅｒ＿ＭＩ（１００μＭ） １０．０μＬ
合計 １００．０μＬ
アニーリングプログラム：９５℃１秒間；６０℃１秒間；４℃まで緩徐な傾斜の低下（
約－２℃／分）；４℃で維持する。－２０℃で保存する。

インプット定量化および切断
１． ｄｓＤＮＡは、Ｑｕｂｉｔによって定量化され、１×ＴＥバッファーを使用して
４００ｎｇが１２０ｕｌの最終容量にされる。
２． 各試料は、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２のための標準操作プロトコールに従って５００
ｂｐの平均長に切断される。
３． １２０ｕｌのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズ（１×比率）での精製は、製
造業者のプロトコールに従って行い、１５ｕｌの１×ＴＥバッファー中に溶出される。

末端修復、Ａ－テーリングおよびライゲーション
末端修復
４． ２００μＬのＰＣＲチューブまたは９６プレート中のウェルに、以下を（反応ごと
に）添加する：
ヌクレアーゼ非含有Ｈ_２Ｏ ０．５μＬ
ｄＮＴＰミックス、５ｍＭ １．０μＬ
ＳＬＯＷライゲーションバッファー、１０× ２．５μＬ
末端修復ミックス（低濃度） ２．０μＬ
Ｔａｑポリメラーゼ用のバッファー、１０×（Ｍｇ２＋なし） ２．０μＬ
Ｔａｑポリメラーゼ（非ホットスタート） ０．５μＬ
合計 ８．５μＬ
＋（前のステップからの）ＤＮＡ試料 １４．０μＬ
合計 ２２．５μＬ
末端修復サーモサイクラープログラム：１２℃１５分間、３７℃１５分間；７２℃１５
分間；４℃で維持する

アダプターライゲーション
５． 試料反応チューブまたはウェルに、以下の試薬を順番に添加する（ピペッティング
によって混合する）：
アニールされたＹ ａｄａｐｔｅｒ＿ＭＩ（１０μＭ） １．０μＬ
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ ２．０μＬ
＋（前のステップからの）ＤＮＡ試料 ２２．５μＬ
合計 ２５．５μｌ
アダプターライゲーションサーモサイクラープログラム：１６℃３０分間、２２℃３０
分間、４℃で維持する
６． ０．９× ＳＰＲＩ ｃｌｅａｎ（２２．９５ｕｌ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ）
、１２ｕＬの１×ＴＥバッファー中に溶出

ＰＣＲ
ＰＣＲ１（オリゴタグプライマー［発見］または大規模なプライマープール［ディープシ
ークエンシング検証］）
７． 以下のマスターミックスを調製する：
ヌクレアーゼ非含有Ｈ_２Ｏ １１．９μＬ
Ｔａｑポリメラーゼ用のバッファー、１０×（ＭｇＣｌ_２なし） ３．０μＬ
ｄＮＴＰミックス、１０ｍＭ ０．６μＬ
ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ １．２μＬ
Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ ０．３μＬ
ＧＳＰ１プライマー（１０ｕＭ）／プライマープール（^＊） １．０μＬ^＊
ＴＭＡＣ（０．５Ｍ） １．５μＬ
Ｐ５＿１、１０μＭ ０．５μＬ
合計 ２０．０μＬ
＋（ステップ６からの）ＤＮＡ試料 １０．０μＬ
合計 ３０．０μＬ
^＊発見用には、＋／（センス）および－／（アンチセンス）反応について別々のマ
スターミックスを作製して、別々のＰＣＲ反応を行う。
^＊ディープシークエンシング検証用には、１種のマスターミックスが作製されうる
。プライマープールは、３０ｕｌの反応物中に３０ｐｍｏｌの総量に標準化されるべきで
ある。
発見サーモサイクラープログラム（タッチダウン）：
９５℃５分間、
１５サイクルの［９５℃３０秒間、７０℃（－１℃／サイクル）２分間、７２℃３０
秒間］、
１０サイクルの［９５℃３０秒間、５５℃１分間、７２℃３０秒間］、
７２℃５分間、
４℃維持
検証サーモサイクラープログラム：
９５℃５分間、
１４サイクルの［９５℃３０秒間、２０％の傾斜で６５℃まで下げる、６５℃５分間
］、
７２℃５分間、
４℃維持
８． １．２× ＳＰＲＩ ｃｌｅａｎ（３６．０ｕＬ）、１５ｕｌの１×ＴＥバッファ
ー中に溶出

ＰＣＲ２（オリゴタグプライマー［発見］または大規模なプライマープール［ディープシ
ークエンシング検証］）
９． 以下のマスターミックスを調製する：
ヌクレアーゼ非含有Ｈ_２Ｏ ５．４μＬ
Ｔａｑポリメラーゼ用のバッファー、１０×（Ｍｇ２＋なし） ３．０μＬ
ｄＮＴＰミックス、１０ｍＭ ０．６μＬ
ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ １．２μＬ
Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、５Ｕ／μＬ ０．３μＬ
ＧＳＰ２プライマー（１０ｕＭ）／プライマープール（^＊） １．０μＬ
ＴＭＡＣ（０．５Ｍ） １．５μＬ
Ｐ５＿２、１０μＭ ０．５μＬ
合計 １３．５μＬ
＋Ｐ７＿＃（１０ｕＭ）^＊ １．５μＬ
＋（ステップ８からの）ビーズ付きのＤＮＡ試料 １５．０μＬ
合計 ３０．０μＬ
プライマー濃度は、ＰＣＲ１に記載の詳細に従うべきである
^＊Ｐ７＿＃では、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンサー上での良好な画像記録のために、１
つのシークエンシング泳動において少なくとも４種は使用されるべきである（例えば、Ｐ
７０１～Ｐ７０４またはＰ７０５～Ｐ７０８）
発見サーモサイクラープログラム（タッチダウン）：
ＰＣＲ１用と同じ
検証サーモサイクラープログラム：
ＰＣＲ１用と同じ
１０． ０．７× ＳＰＲＩ ｃｌｅａｎ（２１．０ｕＬ）、３０ｕＬの１×ＴＥバッフ
ァー中に溶出

ｑＰＣＲによるライブラリー定量化およびシークエンシング
ｑＰＣＲ定量化
１１． 製造業者の説明書に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー定量化キット用のＫ
ａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓキットを使用してライブラリーを定量化する。

標準化およびシークエンシング
１２． 各試料についてｑＰＣＲ操作によって得られる１ｕＬあたりの分子の数の平均量
推定値を使用して、全セットのライブラリーを１．２×１０＾１０分子に標準化すること
を行ない、シークエンシング用に一緒にプールされるライブラリーの数によって分割する
。これは、各試料についての分子によるインプット、およびさらに、各試料についての容
量によるインプットを与えることになる。
プーリング後、Ｖａｃｕｆｕｇｅでライブラリーをシークエンシング用に１０ｕＬの最
終容量までＳｐｅｅｄｖａｃ（乾燥減量）する。
ライブラリーを変性させ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ試薬キットＶ２－３００サイ
クル（２×１５０ｂｐ対末端）でのシークエンシングのために、以下を除き、Ｉｌｌｕｍ
ｉｎａ標準プロトコールに従ってＭｉｓｅｑ上にロードする：
１）３ｕｌの１００μＭのカスタムシークエンシングプライマーＩｎｄｅｘ １をＭｉ
ｓｅｑ試薬カートリッジ部位１３に添加する（Ｉｎｄｅｘプライマーミックス）。３ｕｌ
の１００μＭのカスタムシークエンシングプライマーＲｅａｄ ２をＭｉｓｅｑ試薬カー
トリッジ部位１４に添加する（Ｒｅａｄ ２プライマーミックス）。
２）対末端Ｎｅｘｔｅｒａシークエンシングプロトコールで以下の数のサイクル「１５
１｜８｜１６｜１５１」でシークエンスする。
下流のバイオインフォマティクス解析のために関連する管路に対してｂｃｌまたはｆａｓ
ｔｑフォーマットのいずれかでシークエンシングデータを出す。

結果
例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の概要
一部の実施形態では、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、２つのステージからなる（図５Ｂ）：ス
テージＩでは、ヒト生細胞のゲノム内のＤＳＢが、これらの切断における平滑末端二本鎖
オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）の組み込みによってタグ付けされる。ステー
ジＩＩでは、バイアスのない増幅および次世代シークエンシングを使用して、ゲノムＤＮ
Ａ内のｄｓＯＤＮ組み込み部位がヌクレオチドレベルで正確にマップされる。

ステージＩのために、本発明者らは、ヒト細胞においてＲＧＮで誘発されたＤＳＢの中
に平滑末端の、５’リン酸化されたｄｓＯＤＮを組み込む条件を最適化した。最初の実験
では、本発明者らは、こうしたｄｓＯＤＮがＲＧＮで誘発されたＤＳＢ中に組み込まれる
のを観察するのに失敗した。細胞内でオリゴを安定させるために設計された両方のＤＮＡ
鎖の５’末端に２つのホスホチオレート結合を有するｄｓＯＤＮ^２０を使用して、本発明
者らは、適度な検出可能な組み込み頻度だけを観察した（図５Ｂ）。しかし、両鎖の３’
末端でのホスホチオレート結合の付加は、強力な組み込み効率をもたらした（図５Ｂ）。
これらの組み込み率は、これらの部位においてＲＧＮのみによって（すなわち、ｄｓＯＤ
Ｎの非存在下で）誘発されるインデルの頻度よりも２分の１から３分の１低いだけであっ
た。

ステージＩＩのために、本発明者らは、組み込まれたｄｓＯＤＮを有する断片のみを、
バイアスのない様式で、選択的に増幅およびシークエンスすることを可能にする新規戦略
を開発した（図５Ａ）。本発明者らは、ｄｓＯＤＮ、およびＲＧＮ成分をコードしている
プラスミドがトランスフェクトされた細胞からの無作為に切断されたゲノムＤＮＡに最初
に「単一テール」次世代シークエンシングアダプターをライゲーションすることによって
、これを達成した。本発明者らは、次いで、ｄｓＯＤＮに特異的にアニールする１つのプ
ライマーおよびシークエンシングアダプターにアニールするもう１つのプライマーによっ
て開始される一連のＰＣＲ反応を行った（図５Ａおよび図１２）。シークエンシングアダ
プターが単一テールのみ付加されているので、これは、他の方法、例えば直線的増幅を介
する（ＬＡＭ）－ＰＣＲ^{２１、２２}などに特有のバイアスなしで、ｄｓＯＤＮに隣接した
配列の特異的な一方向の増幅を可能にする。本発明者らは、我々の戦略を単一テールアダ
プター／タグ（single-tail adapter/tag：ＳＴＡＴ）－ＰＣＲ法と称する。ｄｓＯＤＮ
鎖のそれぞれにアニールするプライマーを使用してＳＴＡＴ－ＰＣＲ反応を行うことによ
り、本発明者らは、それぞれの組み込まれたタグの両側上の隣接ゲノム配列の読みを得る
ことができた（図５Ｃ）。増幅プロセス中の無作為な８ｂｐの分子バーコードの組み込み
（図１２）により、ＰＣＲバイアスの修正が可能となり、それによって、ハイスループッ
トシークエンシングから得られた固有のシークエンシングの読みの正確な定量化が可能と
なる。

ヒト細胞におけるＣＲＩＳＰＲ ＲＧＮのゲノムワイドなオフターゲット切断プロファイ
ル
本発明者らは、Ｕ２ＯＳまたはＨＥＫ２９３ヒト細胞系のいずれかにおいて、Ｃａｓ９
、および多様な内在性ヒト遺伝子を標的とする異なる１０種のｇＲＮＡでＧＵＩＤＥ－Ｓ
ｅｑを行った（表１）。ｄｓＯＤＮ組み込み部位を解析すること（方法）によって、本発
明者らは、ヌクレオチドレベルまでマップされた、１０種のＲＧＮのそれぞれによって誘
発されたＤＳＢの正確なゲノム部位を同定することができた（図５Ｄ）。これらのゲノム
ウィンドウのうちの＞８０％については、本発明者らは、オンターゲット部位であるまた
はそれに関連するいずれかの重複標的配列を同定することができた（方法）。興味深いこ
とに、各ＲＧＮについて本発明者らが同定したオフターゲット部位の総数は広範に変化し
、ゼロから＞１５０までの範囲に及び（図５Ｅ）、いずれの特定のＲＧＮについても望ま
しくない切断のゲノムワイドな程度が極端に多くまたは少なくなりうることが示された。
本発明者らは、（１から６つのミスマッチを有するゲノム部位の総数によって測定される
ような）ヒトゲノムに対するｇＲＮＡプロトスペーサー配列の直交性と、ＧＵＩＤＥ－Ｓ
ｅｑによって本発明者らが観察したオフターゲット部位の総数との間にいかなる明らかな
相関も観察しなかった（図５Ｆ）。オフターゲット配列は、ゲノムの全体にわたって分散
して見出され（図５Ｇｇおよび図１３Ａ～Ｊ）、エクソン、イントロン、および非コード
遺伝子間領域において減少する（図５Ｈ）。本発明者らが同定したオフターゲット配列の
中に含まれていたのは、すべてＲＧＮのうちの４種についての既知の真正のオフターゲッ
ト部位^４、５であった（図６Ａ～Ｊ）。さらに重要なことには、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、
ヒトゲノムの全体にわたって位置する、多数の新しい、これまでに知られていないオフタ
ーゲット部位を同定した（図５Ｅ、５Ｇ、６Ａ～Ｊおよび１３Ａ～Ｊ）。

本発明者らは、次に、（図６Ａ～Ｊに示される）ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定され
た各オフターゲット部位についてのシークエンシングの読みの数が、ＲＧＮのみによって
（すなわち、ｄｓＯＤＮの非存在下で）誘発されるはずであったインデルの相対頻度の代
わりになっているかどうかを試験した。ヌクレアーゼ成分が発現されたヒトＵ２ＯＳ細胞
における５種のＲＧＮについての、アンカードマルチプレックスＰＣＲ（ＡＭＰ）に基づ
いた次世代シークエンシング（方法）によるこれらの部位の試験より、＞８０％（１３２
からの１０６）がＲＧＮ切断に特徴的な可変長のインデルを有していたことが示され、Ｇ
ＵＩＤＥ－Ｓｅｑが真正のＲＧＮオフターゲット部位を同定するという本発明者らの結論
がさらに支持される（図７Ａ）。検出されたインデル頻度の範囲は、０．０３％から６０
．１％までの範囲に及んだ。重要なことに、本発明者らは、５つすべてのＲＧＮオフター
ゲット部位についてＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読み数とインデル変異頻度との間に陽性の直線
的相関を認めた（図７Ａ～Ｆ）。したがって、本発明者らは、所与の部位についてのＧＵ
ＩＤＥ－Ｓｅｑの読み数が、ＲＧＮによるその配列の切断効率の定量的尺度を表すと結論
する。

ＲＧＮで誘発されるオフターゲット配列特性の解析
１０種すべてのＲＧＮについてのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって本発明者らが同定したオ
フターゲット部位の視覚的検査により、ＲＧＮがそこで切断可能なバリアント配列の多様
性が強調される。これらの部位は、プロトスペーサー配列内の６つものミスマッチ（最大
７つのミスマッチを有する部位のｉｎ ｖｉｔｒｏの切断を示している以前の報告^６と一
致する）、非標準ＰＡＭ（以前に記載されているＮＡＧおよびＮＧＡ配列^５、２３だけで
なく、新規なＮＡＡ、ＮＧＴ、ＮＧＣ、およびＮＣＧ配列も）、およびｇＲＮＡ／プロト
スペーサー境界面での１ｂｐの「バルジ」型ミスマッチ^２４を有しうる（図６Ａ～Ｊ）。
プロトスペーサーミスマッチは、標的部位の５’末端に生じる傾向にあるが、特定の３’
末端部位でも見出されることがあり、部位に基づいてミスマッチ作用を予測するための簡
単な法則はないという考えが支持される^４。興味深いことに、一部のオフターゲット部位
は、実際に、それらの適合したオンターゲット部位よりも高いシークエンシング読み数を
有し（図６Ａ～Ｄ、６Ｊ）、オフターゲット変異頻度は、特定の場合において、目的のオ
ンターゲット部位でのものよりも高くなりうるという本発明者らの以前の知見^４と一致し
ている。特に、ＲＧＮのうちの４種についての既知のオフターゲット部位の多くは、高い
読み数を有し（図６Ａ～Ｄ）、以前の解析は、最も効率良く切断される部位を主に同定し
ていたことが示唆される。

１０種すべてのＲＧＮにおける本発明者らのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑデータの定量的解析は
、本発明者らが異なる可変のもの、例えば、オフターゲット部位切断におけるミスマッチ
数、位置、および型などの寄与および影響を定量化するのを可能にした。本発明者らは、
ＲＧＮによって切断される特定の数のプロトスペーサーミスマッチを有する全ゲノム部位
の割合は、ミスマッチの数の増大と共に低下することを見出した（図８Ａ）。さらに、シ
ークエンシングの読み数は、ミスマッチの数の増大と共に全体的な下降傾向を示す（図８
Ｂ）。一般に、標的部位の５’末端のより近くに位置するプロトスペーサーミスマッチは
、３’末端のより近くのものよりもＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読み数におけるより小さい減少
と関連する傾向にあるが、ＰＡＭから１から４ｂｐ離れて位置するミスマッチは、驚くべ
きことに、５から８ｂｐ離れて位置するものよりもいくらか良好な耐容性を示す（図８Ｃ
）。興味深いことに、ミスマッチの性質も、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読み数に対する影響に
関連する。ゆらぎミスマッチは、オフターゲット部位において頻繁に生じ、本発明者らの
解析は、それらが、他の非ゆらぎミスマッチよりもより小さい、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読
み数に対する影響に関連することを示唆している（図８Ｄ）。これらの結果と一致して、
本発明者らは、一変量回帰分析においてオフターゲット切断における最も程度の大きいバ
リエーションを説明する単一因子が、ミスマッチ数、部位、および型であることを見出し
ている。対照的に、近位ＰＡＭ配列の密度、遺伝子発現レベル、またはゲノム位置（遺伝
子間／イントロン／エクソン）などの他の因子は、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ切断読み数におい
てきわめてより小さな割合の相違を説明する（図８Ｅ）。ミスマッチ部位、ミスマッチ型
、遺伝子発現レベル、および近位ＰＡＭ配列の密度を含む複数の因子を考慮した組み合わ
された線形回帰モデルは、一変量分析と一致した結果を得た（図１４）。この分析により
、本発明者らは、それぞれのさらなるゆらぎミスマッチがオフターゲット切断率を、平均
において、かつそれらの部位に依存して、約２分の１～３分の１だけ低下させるのに対し
て、さらなる非ゆらぎミスマッチは切断率を約３分の１だけ低下させることを独立的に推
定することも可能となった（図１４）。

既存のオフターゲット予測法でのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの比較
ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの効力が確立されたので、本発明者らは、次に、オフターゲット変
異部位を予測するための以下の２つの普及している既存のコンピュータの方法との本発明
者らの新しい方法の直接的な比較を行った：ＭＩＴ ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏ
ｏｌ^２５（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）およびＥ－ＣＲＩＳＰプログラム^２６（ｗｗ
ｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／）。これらの両方のプログラムは、ミス
マッチ数および部位についての特定の「法則」に基づいて潜在的なオフターゲット部位を
同定することを試みるものであり、これまでの刊行物においてオフターゲット部位を同定
するために使用されてきた。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって本発明者らが特徴付けした１０
種のＲＧＮを使用した本発明者らの比較において、本発明者らは、両方のプログラムが、
実験的に検証されたオフターゲット部位のきわめて大多数を同定できなかったことを見出
した（図９Ａ～Ｂ）。これらの部位の多くは、Ｅ－ＣＲＩＳＰおよびＭＩＴプログラムが
、単に、それぞれ３つおよび４つを超えるミスマッチを有するオフターゲットを考慮しな
いので見落とされた（図９Ｃ～Ｄ）。考慮された配列の中でも、これらのプログラムは、
依然として真正のオフターゲット部位の大多数を同定することができず（図９Ｃ～Ｄ）、
切断が生じることになるまたは生じないことになるか否かを決定する因子を説明するため
のこれらの現在限られた能力を強調している。ＭＩＴプログラムによって割り当てられた
ランク付けスコアは、それが正確に同定する部位の中でいくらかの予測的能力を有するが
、特に、見落とされた部位が、わずか１つのミスマッチを有するものを含むことは留意す
べきことである（図９Ｃ～Ｄ）。最後に、両方のプログラムが、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによ
って同定されない多くの「偽陽性」部位を出すことに留意することは重要である（図９Ａ
～Ｂ）。本発明者らは、ＭＩＴおよびＥ－ＣＲＩＳＰの両方が、真正のＲＧＮオフターゲ
ット部位の同定において本発明者らのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法よりも実質的に低い有効性で
機能すると結論する。

ｄＣａｓ９結合部位の決定についてのＣｈＩＰ－Ｓｅｑ法とのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの比較
本発明者らは、ＲＧＮオフターゲット部位の同定について、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを、以
前に記載されているＣｈＩＰ－Ｓｅｑ法と直接に比較することも探求した。本発明者らが
ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって評価したＲＧＮのうちの４つは、オフターゲット結合部位の
大規模なセットの同定につながった、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）でのＣｈ
ＩＰ－Ｓｅｑ実験において以前に特徴付けされていたｇＲＮＡ^１８を使用した。直接的な
比較により、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたＣａｓ９オフターゲット切断部位と
、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑによって同定されたｄＣａｓ９オフターゲット結合部位との間できわ
めて少ない重複しか示されない；４種のｇＲＮＡについて本発明者らが同定した、ＲＧＮ
で誘発された１４９個のオフターゲット切断部位の中で３つだけが、以前に公表された同
じｇＲＮＡを使用したｄＣａｓ９ ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ実験によって以前に同定されている
ものであった（図９Ｅ）。この重複の欠如は、ｄＣａｓ９オフターゲット結合部位がＣａ
ｓ９オフターゲット切断部位とは基本的に異なるからである可能性が高く、本発明者らの
データによって支持される仮説は、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって同定されたこれらの４種
のｇＲＮＡについてのＣａｓ９オフターゲット切断部位が、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ（図９Ｆ）
および、きわめて少ないｄＣａｓ９結合部位が活性Ｃａｓ９の存在下でインデルの証拠を
示すことを示している、以前の研究の結果^{１６～１９}によって同定されたそれらの結合部
位よりも平均ではるかに少ないミスマッチを有することを示している。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅ
ｑは、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑによって以前に同定された４つのオフターゲット部位を同定する
ことができず、かつ次いで、Ｃａｓ９による変異生成の標的であることが示されたが、本
発明者らは、これは、それらの部位がその以前の研究^１８において真正のオフターゲット
切断部位として誤って同定されたからであると考えている。その研究からのシークエンシ
ングデータの注意深い解析により、それらの部位において見出されたインデル変異のきわ
めて大多数は、ＲＧＮ切断活性によってではなく、ＰＣＲまたはシークエンシングの誤り
によって代わりに生じた可能性が高いことが示唆される（図１５Ａ～Ｄ）。まとめると、
これらの発見により、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑが、真正のオフターゲット切断部位の同定につ
いてＣｈＩＰ－Ｓｅｑよりも実質的に優れていることが実証され、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑによ
って発見された（たとえあるとしても）きわめて少ないｄＣａｓ９オフターゲット結合部
位が実際のＣａｓ９オフターゲット切断部位を表すという考えについての実験的支持が得
られる。

ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによるヒト細胞におけるＲＧＮ非依存性ＤＳＢホットスポットの同定
本発明者らのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ実験は、本発明者らの研究のために使用されたＵ２Ｏ
ＳおよびＨＥＫ２９３細胞における合計３０個の固有のＲＧＮ非依存性ＤＳＢホットスポ
ットの存在も予想外に明らかにした（表２）。本発明者らは、ＲＧＮをコードしているプ
ラスミドなしでｄｓＯＤＮのみをトランスフェクトしたＵ２ＯＳおよびＨＥＫ２９３細胞
での対照実験からのゲノムＤＮＡを解析するときには、これらの部位を明らかにした（方
法）。特異的な塩基対部位に正確に位置するＲＧＮで誘発されたＤＳＢとは対照的に、Ｒ
ＧＮ非依存性ＤＳＢは、それらが生じるそれぞれの座位においてより広く分散したｄｓＯ
ＤＮ組み込みパターンを有する（方法）。これらの３０個の切断点ホットスポットは、多
くの染色体にわたって分布していて、セントロメアもしくはテロメア領域にまたはその近
くに存在するように見えた（図１０Ｆ）。興味深いことに、少数のこれらのＤＳＢ（２つ
）のみが両方の細胞系に共通であって、大多数は細胞系特異的であるようであった（Ｕ２
ＯＳにおける２５つおよびＨＥＫ２９３細胞における７つ；図１０Ｆおよび表２）。知る
限りでは、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、ヒト生細胞において、直接的でかつバイアスのない、
切断点ホットスポットの同定を、それらの存在を明らかにするために潜在的に有毒な薬剤
（例えば、アフィジコリンなどのＤＮＡ複製阻害剤）を必要とすることなく、可能にする
最初の方法である。

大規模なゲノム再編成におけるＲＧＮで誘発されたＤＳＢおよびＲＧＮ非依存性ＤＳＢの
両方の関与
ＲＧＮで誘発されたＤＳＢおよびＲＧＮ非依存性ＤＳＢにおけるインデルを同定するた
めに設計された本発明者らの次世代シークエンシング実験の結果を解析する過程において
、本発明者らは、これらの切断の一部が、転座、逆位および大きな欠失に関与しうること
も発見した。使用されたＡＭＰ法により、本発明者らがこれらの大規模なゲノムの変化を
観察することが可能となった。これは、調査される各ＤＳＢ部位について、この方法では
、１対の隣接座位特異的なプライマーではなく、ただ１つの固定された末端にアンカーさ
れる、座位特異的なネステッドプライマーのみが使用されるからである（図１０Ａ）。し
たがって、ＡＭＰに基づいたシークエンシングは、ＤＳＢにおいてインデル変異が生じて
いるかどうかを同定するだけでなく、ＤＳＢが別の配列に結合されているかどうかも検出
することができる。

本発明者らが調査した５種のＲＧＮについて、ＡＭＰシークエンシングにより、ＲＧＮ
で誘発されるオンターゲットおよびオフターゲットのＤＳＢが多様な転座に関与しうるこ
とが明らかにされた（図１０Ｂ）。少なくとも１つの場合において、本発明者らは、１対
のＤＳＢから結果として生じる４種すべての起こりうる転座事象を観察することができた
（図１０Ｃ）。２つのＤＳＢが同じ染色体上に存在した場合に、本発明者らは、大きな欠
失および逆位も観察した（図１０Ｂ）。少なくとも１つの場合では、本発明者らは、ＲＧ
Ｎで誘発された２つの切断間の大きな欠失ならびに同じ介在性配列の逆位の両方を観察し
た（図１０Ｄ）。重要なことに、本発明者らの結果は、ＲＧＮで誘発されたＤＳＢとＲＧ
Ｎ非依存性ＤＳＢとの間の転座（および欠失または逆位）も明らかにし（図１０Ｂ）、細
胞ゲノムに対するＲＧＮのオフターゲット作用を評価するときに、これらの２つの型の切
断の間の相互作用が考慮される必要があることが示唆された。本発明者らのデータは、こ
れらの大規模なゲノム再編成の頻度がきわめて低くなる可能性が高いことを示唆している
が、正確な定量化は、本発明者らの既存のデータセットのシークエンシングの深さではで
きなかった。シークエンシングの読みの数を増やすことにより、検出の感度が高められ、
これらの重要なゲノムの変化のより良好な定量化が可能となるはずである。

トランケートされたｇＲＮＡによって指向されるＲＧＮのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑプロファイ
ル
本発明者らのグループによる以前の研究は、全長ｇＲＮＡｓ２７によって指向されるＲ
ＧＮの既知のオフターゲット部位におけるトランケートされた１７または１８ｎｔの相補
性領域を有するｇＲＮＡの使用により、変異頻度が低下されうることを示している^２７。
しかし、この解析は少数の既知のオフターゲット部位に限定されていたので、これらのト
ランケートされたｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）のゲノムワイドな特異性は、本発明者ら
の以前の実験では不明確なままであった。本発明者らは、３種のｔｒｕ－ｇＲＮＡによっ
て指向されるＲＧＮのゲノムワイドなＤＳＢプロファイルを得るためにＧＵＩＤＥ－Ｓｅ
ｑを使用したが、そのそれぞれは、本発明者らが上記でアッセイした１０種の全長ｇＲＮ
Ａのうちの１つのより短いバージョンである。

本発明者らの結果は、３つのすべての場合において、ＧＵＩＤＥＳｅｑによって同定さ
れるオフターゲット部位の総数は、ｔｒｕ－ｇＲＮＡの使用で実質的に減少されたことを
示している（図１１Ａ～Ｄ）。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読みのマッピングにより、本発明者
らが、オンターゲット（図１１Ｅ）およびオフターゲット（図示せず）部位の切断位置を
正確に同定することが可能となった。予想されたように、かつ本発明者らが全長ｇＲＮＡ
で観察したように、オフターゲット部位のリストに含まれていたのは、３種のｔｒｕ－ｇ
ＲＮＡによって指向されるＲＧＮについての１２個の既知のオフターゲット部位のうちの
１０個であった（図１１Ｆ～Ｈ）。本発明者らが同定したオフターゲット部位の配列は、
プロトスペーサー内に１つまたは２つのミスマッチを主に有していたが、一部の部位は、
４つも有していた（図１１Ｆ～Ｈ）。さらに、一部の部位は、ＮＡＧ、ＮＧＡ、およびＮ
ＴＧの形態の代替のＰＡＭ配列を有していた（図１１Ｆ～Ｈ）。これらのデータは、ｇＲ
ＮＡのトランケーションがＲＧＮのオフターゲット作用を実質的に低減できることのゲノ
ムワイドな規模での確認を可能にし、ＲＧＮプラットフォームについての特異性の向上を
評価するためにＧＵＩＤＥＳｅｑが使用されうる方法を示す。

考察
ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、ＲＧＮで誘発されたＤＳＢを検出するための、バイアスのない
、高感度、かつゲノムワイドな方法を可能にする。該方法は、オフターゲット部位の性質
についての仮説をたてること（例えば、オフターゲット部位が配列においてオンターゲッ
ト部位に密接に関連すると推定すること）なくＤＳＢを検出するのでバイアスがない。Ｇ
ＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、エクソン、イントロン、および遺伝子間領域内を含む、オフターゲ
ット部位をゲノムワイドに同定し、最大６つのプロトスペーサーミスマッチおよび／また
は、以前の研究^５、２３に記載されている代替のＮＡＧおよびＮＧＡ配列以外の、新しい
ミスマッチのＰＡＭ部位を有していた。この実施例において本発明者らが調査したＲＧＮ
では、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑにより、すべての既知のオフターゲット部位の同定が成功した
だけでなく、何百もの新しい部位も同様に明らかにされた。

ヒト細胞においてすべてのＲＧＮオフターゲット部位を包括的に同定するための実際的
な黄金標準方法が現在ないことにより、本発明者らはＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの確実性を有す
る感度を知ることができなくなっているが、本発明者らは、以下の理由で、それが低い偽
陰性率を有する可能性がきわめて高いと考えている：第一に、ＲＧＮで誘発された平滑末
端化されたすべてのＤＳＢは、平滑末端化されたｄｓＯＤＮをＮＨＥＪによって取り込む
はずであり、仮説は、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの読み数（これはｄｓＯＤＮの取り込みを測定
する）とＲＧＮの存在下におけるインデル頻度（これはＤＳＢ形成およびそれらのうちの
変異誘発性修復の率を測定する）との間で本発明者らが観察する強い相関によって支持さ
れた（図７Ｂ～Ｆ）。本発明者らは、これらの相関が、広範囲のインデル変異生成頻度を
示す１３０を超える部位を含むことを注記する。第二に、以前に同定されたオフターゲッ
ト部位をベンチマークとして使用して（これは、現在、成功を判断する唯一の方法である
）、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、０．１２％の低さまで広がっている一範囲の変異生成頻度を
示す４０個のこれらの部位のうちの３８個を検出することができた。この方法は、４種の
全長ｇＲＮＡについての２８個すべての既知のオフターゲット部位および３種のｔｒｕ－
ｇＲＮＡについての１２個の既知のオフターゲット部位のうちの１０個を検出した。検出
されなかった２つのオフターゲット部位のうちの１つは、本発明者らの生のデータにおい
て捕捉の証拠を示したが、シークエンシングの読みが一方向だけであってかつただ１つの
プライマーに由来していたので本発明者らの読みの判定アルゴリズムによって除かれた（
方法）。（この部位についての二方向のマッピングの読みがないのは、読みを正確にマッ
プすることを難しくさせている片側のオフターゲット部位上の反復領域が原因である可能
性があった。）他の検出されないオフターゲット部位は以前に記載されている。

重要なことに、本発明者らが評価したＲＧＮのうちの１つは、（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法
の現在の検出限界で）いかなる検出可能なオフターゲット作用も生じず、一部のｇＲＮＡ
がきわめて少ない望ましくない変異を誘導する、またはおそらく全く誘導しない、という
興味深い可能性を高めた。

本発明者らの検証実験は、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑが、０．１％という低い頻度でＲＧＮに
よって変異誘発されるオフターゲット部位を感度良く検出できることを示しているが、そ
の検出能力は、いくらかの簡単な変更でさらに改良されうる。インデルを検出するために
次世代シークエンシングを使用する戦略は、プラットフォームの誤り率（典型的には約０
．１％）によって制限される。対照的に、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、インデルではなくｄｓ
ＯＤＮ挿入部位を同定するためにシークエンシングを使用し、したがって、誤り率によっ
て制限されるのではなく、シークエンシングの深さによって制限される。例えば、本発明
者らは、本発明者らのシークエンシング検証実験において本発明者らがインデルを見出さ
なかった本発明者らのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ実験において検出される少数の部位が、０．１
％未満のインデル変異頻度を有する可能性の高い部位を実際に表すと考えている。これと
一致して、本発明者らは、これらの２６部位のうち３つ以外のすべては、１００未満のＧ
ＵＩＤＥ－Ｓｅｑ読み数を有したことを注記する。まとめると、これらの知見により、本
発明者らが、単にシークエンシングの読みの数を増加させることによって（および増幅の
ために鋳型として使用されるゲノムの数を増大させることによって）ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ
の感度を増大させることができうることが示唆される。例えば、１０００倍多くの読みが
得られるシークエンシングプラットフォームの使用により、検出が可能となるはずである
。

本発明者らのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ実験によって可能となった直接的な比較により、ＲＧ
Ｎオフターゲット部位を予測するための２つの既存のコンピュータプログラムの限界が示
される。これらのプログラムは、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって見出される真正のオフター
ゲット部位を同定するのに失敗していただけでなく、切断を示さない多くの部位を過判定
もしていた。これは、これらのプログラムによって使用されるパラメーターが、本発明者
らのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ実験によって同定されたより多数のプロトスペーサーミスマッチ
および代替のＰＡＭ配列を説明しないというオフターゲット部位の性質についてのより限
定的な仮定に基づいていたのであれば全く驚くべきことではない。より良好な予測的プロ
グラムが将来開発されうる可能性があるが、そうするためには、より多数のＲＧＮについ
ての実験的に決定されたゲノムワイドなオフターゲット部位が必要とされることになる。
こうしたプログラムが開発されうるまで、オフターゲット部位の同定は、ＧＵＩＤＥ－Ｓ
ｅｑなどの実験法によって最も効果的に対処されることになる。

本発明者らの実験結果は、ｄＣａｓ９のオフターゲット結合部位とＣａｓ９のオフター
ゲット切断部位との間の明らかな相違を詳しく説明する。４種の異なるｇＲＮＡについて
のｄＣａｓ９のＣｈＩＰ－ＳｅｑおよびＣａｓ９のＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑのデータの比較に
より、２セットの部位間でごくわずかな直接的な重複があることおよび２クラスの部位に
おけるミスマッチの平均数が実際に実質的に異なることが示される。さらに、本発明者ら
は、Ｃａｓ９によって変異誘発されると以前に報告されている少数のｄＣａｓ９結合部位
でさえも、ＲＧＮで誘発される真正の切断部位ではない可能性がきわめて高いことを示し
ている。まとめると、本発明者らの結果は、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑで捕捉されているＤＮＡ部
位に対するｄＣａｓ９の結合が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるＤＮＡ部位の切断というよ
りも異なる生物学的プロセスを表していることを示し、プロトスペーサーとのｇＲＮＡの
５’末端の結合が効率的な切断に必要とされることを示している近年の研究の結果^１９と
一致している。ＣｈＩＰ－Ｓｅｑアッセイは、ｄＣａｓ９融合タンパク質のゲノムワイド
な結合の特徴付けにおける役割を疑いなく有するであろうが、その方法は、触媒的に活性
なＲＧＮのゲノムワイドなオフターゲット切断部位を決定するのには明らかに有効でない
。

ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、細胞内のＤＳＢ部位を同定するための以前に記載されている他
のゲノムワイドな方法を超えるいくつかの重要な利点を有する。最近記載されたＢＬＥＳ
Ｓ（breaks labeling, enrichment on streptavidin and next-generation sequencing：
切断標識、ストレプトアビジン上での濃縮および次世代シークエンシング）オリゴヌクレ
オチドタギング法は、固定され、浸透性にされた細胞上でｉｎ ｓｉｔｕで行われる^２７
。細胞固定に伴う人為的結果を生じやすいことに加えて、ＢＬＥＳＳは、一瞬存在する切
断物だけを捕捉することになる。対照的に、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、生細胞上で行われ、
より長期間の時間（日）にわたって生じるＤＳＢを捕捉し、それによって感度がより高く
かつ包括的なアッセイとなっている。ＤＳＢの近くの領域内への組み込み欠損レンチウイ
ルス（ＩＤＬＶ）ＤＮＡの捕捉およびＬＡＭ－ＰＣＲによるそれらの座位の同定は、ヒト
細胞において改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）^２２および転写活性化因子様
エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）^２８についての少数のオフターゲット部位を同
定するために使用されてきた。しかし、ＩＤＬＶ組み込み事象は、一般に数が少なく、か
つ実際のオフターゲットＤＳＢから５００ｂｐも遠くの距離にわたって広範に分散してお
り^{２２、２８}、切断事象の位置を正確にマップすることおよび実際のオフターゲット部位
の配列を推定することの両方を難しくさせている。さらに、ＬＡＭ－ＰＣＲは、配列のバ
イアスおよび／またはシークエンシングの読みの低い効率を欠点としている。まとめると
、これらの制約により、ＩＤＬＶ捕捉によるより低頻度のＺＦＮオフターゲット切断部位
を検出するのは明らかに不可能であることも説明されうる^２９。対照的に、ｄｓＯＤＮは
、ＧＵＩＤＥ－ＳｅｑでＤＳＢ内にきわめて効率良くかつ正確に組み込まれ、単一ヌクレ
オチド分解能での切断のマッピングおよびヌクレアーゼオフターゲット切断部位の簡単で
直接的な同定を可能にする。さらに、ＬＡＭ－ＰＣＲとは対照的に、本発明者らのＳＴＡ
Ｔ－ＰＣＲ法は、効率的な、バイアスのない増幅、およびｄｓＯＤＮが組み込まれている
ゲノムＤＮＡ断片のシークエンシングを可能にする。本発明者らは、ＳＴＡＴ－ＰＣＲが
、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑにおけるその使用を超えたより一般的な有用性を有しうることを注
記する；例えば、ゲノムワイドな規模でウイルスの組み込み部位をマップしようとするこ
とは研究に有用でありうる。

ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは高感度であるが、その検出能力は、いくらかの簡単な変更でさら
に改良しうる。インデルを検出するために次世代シークエンシングを使用する戦略は、プ
ラットフォームの誤り率（典型的には約０．１％）によって制限される。対照的に、ＧＵ
ＩＤＥ－Ｓｅｑは、インデルではなくｄｓＯＤＮ挿入部位を同定するためにシークエンシ
ングを使用し、したがって、誤り率によって制限されるのではなく、シークエンシングの
深さによって制限される。例えば、本発明者らは、本発明者らのシークエンシング検証実
験において本発明者らがインデルを見出さなかった本発明者らのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ実験
において検出される少数の部位が、０．１％未満の変異頻度を有する可能性の高い部位を
実際に表すと考えている。これと一致して、本発明者らは、これらの２６部位のうち３つ
以外のすべては、１００未満のＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ読み数を有したことを注記する。まと
めると、これらの知見により、本発明者らが、単にシークエンシングの読みの数を増加さ
せることによって（および増幅のために鋳型として使用されるゲノムの数を増大させるこ
とによって）ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの感度を増大させることができうることが示唆される。
例えば、１０００倍多くの読みが得られるシークエンシングプラットフォームの使用によ
り、位の３桁低い（すなわち、０．０００１％の）変異生成頻度を有する部位の検出が可
能となるはずであり、本発明者らは、技術における継続した改良でさらなる増大が生じる
のを期待する。

本発明者らの実験の予想外の結果は、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑが、ＲＧＮの非存在下でも細
胞内で生じる切断点ホットスポットも同定することができたという認識であった。本発明
者らのＡＭＰに基づいたシークエンシング実験は、ｄｓＯＤＮの捕捉だけでなくこれらの
部位におけるインデルの形成も検証したので、本発明者らは、これらのＤＳＢはＧＵＩＤ
Ｅ－Ｓｅｑのただの人為的結果ではないと考えている。重要なことに、多くのホットスポ
ットは本発明者らの研究において調査された２種の細胞系のそれぞれに固有であるが、い
くつかは両方に共通しているようである。将来の研究において、１つの細胞型においてい
くつかの部位が切断点ホットスポットであるが別の細胞型ではそうではない理由を律する
パラメーターを定義することは興味深いであろう。さらに、本発明者らの結果は、これら
の切断点ホットスポットが転座に関与しうることを示しているので、細胞型特異的な切断
点ホットスポットの存在は、特定のゲノム再編成が特定の細胞型のみに生じて他では生じ
ない理由を説明するための一助となる可能性がある。知る限りでは、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ
は、ヒト生細胞において、ＤＮＡ複製を阻害する薬剤の添加を必要とすることなく、切断
点ホットスポットを同定できることが記載される最初の方法である^２７。したがって、本
発明者らは、それが、これらの切断を同定および試験するための有用なツールを提供する
ことになると予想する。

本発明者らの研究は、ＲＧＮによって誘発される転座を同定するためのこれまでに記載
された最も包括的な定性的アプローチを確立する。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって発見され
たＲＧＮ誘発性およびＲＧＮ非依存性のＤＳＢ部位のＡＭＰに基づいた標的化されたシー
クエンシングは、両クラスの部位に関与する転座、欠失、および逆位を含む大規模なゲノ
ム再編成を見出すことができ、大規模なゲノム再編成を同定するときに両クラスの切断を
考慮することの重要性を強調している。さらに、おそらく必ずしもすべてのＲＧＮ誘発性
またはＲＧＮ非依存性のＤＳＢが大規模な変化に関与するわけではないであろうし、いく
つかの部位がそれらの再編成に寄与して他の部位はしない理由を理解することは、さらな
る研究のために重要な領域となるであろう。

ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、ゲノムワイドな規模におけるＲＧＮプラットフォームに対する
特異性の改良を評価する重要な手段も提供することになる。この報告において、本発明者
らは、トランケートされたｇＲＮＡの導入によってどのようにゲノム規模でオフターゲッ
ト作用を低減させることができるかを示すためにＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを使用し、このアプ
ローチが、適合された全長ｇＲＮＡの既知のオフターゲット部位における変異を低減させ
うるという本発明者らのグループによる以前の結果^３０を拡張した。これは、他の細菌も
しくは古細菌からの代替のＣａｓ９ヌクレアーゼの、または５’オーバーハングを生成す
る二量体ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ
^{３１、３２}または５’もしくは３’オーバーハングを生成する対になったＣａｓ９ニッカ
ーゼ^{３３、３４}などのヌクレアーゼの、ゲノムワイドな特異性を評価するように適合され
てもよい；しかし、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを拡張してこれらの他の型のＤＳＢを検出するた
めには、こうした切断の中へのその効率的な捕捉を確実にするためのｄｓＯＤＮのさらな
る修飾および最適化が疑いなく必要となるであろう。この方法は、他の細菌または古細菌
からの代替のＣａｓ９ヌクレアーゼ^３５の特異性を評価するためにも使用されうる。本発
明者らは、本発明者らが評価した１０種のｇＲＮＡについてのオフターゲット部位の数に
おけるきわめて広い変動性を見出したので、１つの重要な注意は、任意の新しいＣａｓ９
プラットフォームの特異性についての結論を広く出す前に多数のｇＲＮＡを調査する必要
性である。

ＧＵＩＤＥ－ＳｅｑおよびＡＭＰに基づいたシークエンシングを使用する本発明者らの
例示的なアプローチは、ＲＧＮによって誘発されるオフターゲット変異およびゲノム再編
成の評価のための新しい黄金標準を確立する。本発明者らは、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑが、Ｎ
ＨＥＪが活性でありかつ必要とされる成分が効率良く導入されうるあらゆる細胞における
使用のために拡張されうることを期待する；例えば、本発明者らは、ヒトＫ５６２および
マウス胚性幹細胞において効率的なｄｓＯＤＮ組み込みをすでに達成している（データは
示されていない）。最も重要なことに、ここに概説されている戦略は、厳しい前臨床経路
の一部として、治療的使用のために提唱されるあらゆるＲＧＮの潜在的なオフターゲット
作用を客観的に評価して、それによって診療所におけるこれらの試薬の使用のための見込
みを実質的に改善するために使用しうる。

本方法の一部の実施形態において使用されうるｄｓＯＤＮについての必要条件を探索す
るために、さらなる実験を行った。

以下のｄｓＯＤＮｓを、実施例３の実験において使用した：

最初に、ＥＧＦＰに対して標的化されたＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、およびＲＦＮを使用して
、３つの型のｄｓＯＤＮの組み込み頻度を評価した。２Ｅ５ Ｕ２ＯＳ－ＥＧＦＰ細胞は
、５００ｎｇの各ＴＡＬＥＮモノマー（合計１ｕｇ）、５００ｎｇの各ＺＦＮモノマー（
合計１ｕｇ）、または３２５ｎｇのマルチプレックスｇＲＮＡプラスミドおよび９７５ｎ
ｇのＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９発現プラスミドならびに１００ｐｍｏｌのｄｓＯＤＮでヌクレ
オフェクトした。使用された３種のｄｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート結合を有する
４ｂｐの５’オーバーハング、３’ホスホロチオエート結合を有する４ｂｐの３’オーバ
ーハングのいずれかを有していた、または５’および３’ホスホロチオエート結合を有す
る平滑末端であった。すべてのｄｓＯＤＮは、５’リン酸化されていた。組み込み頻度は
、ＮｄｅＩ制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイで推定し、キャピラリー電気泳動を使用
して定量化した；簡単に説明すると、標的部位は、単離されたゲノムＤＮＡからＰＣＲに
よって増幅した。ＰＣＲは、ＮｄｅＩ制限酵素（２０Ｕ）で３７℃で３時間消化し、１．
８× Ａｍｐｕｒｅ ＸＰで精製した。精製された切断産物は、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラ
リー電気泳動機器（Ｑｉａｇｅｎ）によって泳動および定量化した。図１６Ａは、５’リ
ン酸化され、かつ３’ホスホロチオエート化された、平滑末端化したｄｓＯＤＮが最も高
い組み込み率を有していたことを示している。

上記で使用された同じオリゴ（配列番号１および２）を、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆ
ｅｃｔｏｒ ４－Ｄ上で製造業者の説明書に従って２０μｌの溶液ＳＥ（Ｌｏｎｚａ）中
でＵ２ＯＳ細胞内にトランスフェクトした（プログラムＤＮ－１００）。５００ｎｇの各
ＴＡＬＥＮモノマー（ＣＣＲ５についてはＴＡＬ１２５２／ＴＡＬ１３０１かつＡＰＣに
ついてはＴＡＬ２２９４／２２９５）および１００ｐｍｏｌのｄｓＯＤＮをトランスフェ
クトした。図１６Ｂ～Ｃは、（上記の）ＮｄｅＩ制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析または
Ｔ７Ｅ１アッセイによって決定されるような、Ｕ２ＯＳ細胞における２つの内在性標的部
位、ＣＣＲ５およびＡＰＣでＴＡＬＥＮによって誘発される二本鎖切断（ＤＳＢ）の中へ
の、平滑末端の、５’リン酸化された、３４ｂｐの二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（
ｄｓＯＤＮ）（ｏＳＱＴ６８５／６８６）の効率的な組み込みの証拠を示している（簡単
に説明すると、標的部位は、単離されたゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＰＣ
Ｒは、１．８× Ａｍｐｕｒｅ ＸＰで精製した。精製されたＰＣＲ産物（２００ｎｇ）
は、以下のプロトコールに従ってハイブリダイズした：９５℃５分間、－２℃／秒で９５
～８５℃、－１℃／１０秒で８５～２５℃；１０℃で維持する。Ｔ７エンドヌクレアーゼ
Ｉ（１０Ｕ）を反応物に添加し、これを３７℃で１５分間インキュベートした。反応物は
、ＥＤＴＡ（２５ｍＭ）の添加によって停止し、１．８× Ａｍｐｕｒｅ ＸＰで精製し
た。精製された切断産物は、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動機器（Ｑｉａｇｅｎ）
によって泳動および定量化した）。

さらなる実験を行い、２Ｅ５ Ｕ２ＯＳ－ＥＧＦＰ細胞を、３２５ｎｇのマルチプレッ
クスｇＲＮＡプラスミドおよび９７５ｎｇのＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９発現プラスミドならび
に１００ｐｍｏｌのｄｓＯＤＮでヌクレオフェクトした。さらに、３Ｅ５マウスＥＳ細胞
を、２００ｎｇの単一ｇＲＮＡプラスミドおよび６００ｎｇのＣａｓ９発現プラスミド、
ならびに１００ｐｍｏｌのｄｓＯＤＮでヌクレオフェクトした。２種のｄｓＯＤＮについ
て以下を比較した：１）平滑末端、リン酸化、５’および３’ホスホロチオエート修飾お
よび２）平滑末端、リン酸化、３’ホスホロチオエート修飾のみ。組み込み頻度は、Ｎｄ
ｅＩ制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイで推定し、キャピラリー電気泳動を使用して定
量化した。

実験は、ヒトＵ２ＯＳ細胞においてダイマーＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼで（図
１７Ａ）、またはマウスＥＳ細胞において標準Ｃａｓ９で（図１７Ｂ）行い、３’ホスホ
ロチオエート修飾のみを有するｄｓＯＤＮが最も高い割合の組み込みを有していたことが
示された。

マウスＥＳ細胞において異なる濃度の３’ホスホロチオエート修飾されたオリゴを試験
するために、さらなる実験を行った。３Ｅ５マウスＥＳ細胞は、２００ｎｇの単一ｇＲＮ
Ａプラスミドおよび６００ｎｇのＣａｓ９発現プラスミド、ならびに下記のような異なる
量のｄｓＯＤＮでヌクレオフェクトした。平滑末端の、リン酸化された、３’のみホスホ
ロチオエート修飾されたｄｓＯＤＮをこの実験において使用した。精製ｄｓＯＤＮと未精
製ｄｓＯＤＮとの間の比較では、アニールされたオリゴは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５
カラムを使用して精製した。ｄｓＯＤＮは、１、２、５、１０、２５、５０、および１０
０ｐｍｏｌの濃度で試験した。組み込み頻度は、ＮｄｅＩ制限断片長多型（ＲＦＬＰ）ア
ッセイで推定し、キャピラリー電気泳動を使用して定量化した。結果は、図１８Ａおよび
１８Ｂに示されており、５０ｐｍｏｌまたは１００ｐｍｏｌが最高の活性をもたらしたこ
とを示した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラムを通してのオリゴの精製は、割合を有意
に高めなかった（図１８Ａおよび１８Ｂを参照されたい）。変異生成頻度はＴ７Ｅ１アッ
セイによって推定し、これにより、３’修飾されたｄｓＯＤＮの存在下であっても、破壊
の一般的な割合が高かったことが示された。

ｄｓＯＤＮの長さも評価した。図２０Ａ～Ｂは、より長い（例えば、６０ｂｐ）ｄｓＯ
ＤＮタグが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で誘発されたＤＳＢの部位で効率良く組み込まれた
ことを示している。これらのより長いｄｓＯＤＮは、ＰＣＲ増幅の人為的結果のバイオイ
ンフォマティクス的選別を可能にすることによってＧＵＩＤＥ－ｓｅｑの精度を向上させ
るために使用されうる。これらの配列は、より長いタグ内に存在する配列が含まれていな
かったすべてのものとして認識されうる。

これらの実験により、ｄｓＯＤＮタグ取り込みの効率は、５’および３’末端の両方よ
りもむしろ３’上のみで修飾されている、より長い、オリゴを使用することによって高め
られうること、および形質転換したがん細胞系由来ではない細胞（例えば、マウスＥＳ細
胞）を含む多様な細胞系においてｄｓＯＤＮタグの効率的な捕捉が生じることが示される
。

この実施例では、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｄｓＯＤＮタグのビオチン化バージョンを、ゲ
ノムのＤＳＢの部位の中への組み込みのための基質として使用した。実施例４に示されて
いるように、こうしたオリゴを効率良く組み込むことが可能であった。実験は、ＩＤＴ
ＤＮＡから得られた、ビオチン化ｄｓＯＤＮを使用して、上記のように行った。

図１９Ａ～Ｂは、Ｕ２ＯＳ細胞における３つの内在性標的部位、ＶＥＧＦＡ３、ＥＭＸ
１、およびＦＡＮＣＦ１でＣａｓ９によって誘発される二本鎖切断（ＤＳＢ）の中へのビ
オチン化されたｄｓＯＤＮタグの効率的な組み込みについての証拠を提供する。この向上
により、ビオチンとストレプトアビジンの強固な結合親和性を利用することによるタグ付
き断片の直接的な物理的捕捉を可能にしうる。（Ａ）ＲＦＬＰ解析により、Ｕ２ＯＳ細胞
における３つの内在性標的部位、ＶＥＧＦＡ３、ＥＭＸ１、およびＦＡＮＣＦ１でＣａｓ
９によって誘発されるＤＳＢの中への標準ｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ６８５／６８６）と比較
した、ビオチン化されたｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ１２６１／１２６２）の組み込み率（％）
が示される。（ｂ）Ｔ７ＥＩにより、Ｕ２ＯＳ細胞における３つの内在性標的部位、ＶＥ
ＧＦＡ３、ＥＭＸ１、およびＦＡＮＣＦ１での標準ｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ６８５／６８６
）と比較した、ビオチン化されたｄｓＯＤＮ（ｏＳＱＴ１２６１／１２６２）での推定変
異生成頻度（％）が示される。

ビオチン化が細胞内で維持されるとすると、これを使用して、ビオチン化されたｓｓＯ
ＤＮを含むＤＮＡ断片を物理的にプルダウンすること、ならびに捕捉された断片をシーク
エンスおよびマップすることができる。

本実施例では、例示的なＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法を、バリアントＣａｓ９タンパク質と共
に使用する。

バリアントの化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）お
よび黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質は
、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第６１／１２７，６３４号
明細書および第６２／１６５，５１７号明細書、ならびにKleinstiver et al., "Enginee
red CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities." Nature (2015) doi:10.
1038/nature14592に記載のように作製した。オフターゲット作用は、上記のように評価し
た。

図２１は、ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＲＵＮＸ１、ＶＥＧＦＡ、またはＺＮＦ６２９を標
的とするｓｇＲＮＡ（配列については表４を参照されたい）を使用した、Ｄ１１３５Ｖ／
Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／
Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）における変異を含む改変ＳｐＣａｓ
９バリアントについてのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって同定されたオフターゲット切断部位
の数を示している。これは、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑが、Ｃａｓ９の改変バージョンのゲノム
ワイドな特異性をプロファイルするのにも使用されうることを実証している。ＧＵＩＤＥ
－ｓｅｑは、ヒト細胞においてＮＧＡまたはＮＧＣＧ ＰＡＭを含む内在性部位を標的と
することによってＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントの特異性プロファイル
を決定するためにも使用した。

図２２は、本明細書に記載の例示的なＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ法を使用して検出されたオフ
ターゲット部位での野生型とＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９バリアントとの間の特異性にお
ける変化を示している。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、３つの内在性のヒト細胞の部位での野生
型ＳｐＣａｓ９とＤ１１３５Ｅとの間の読み数の相違を決定するためにも使用した。

ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｄｓＯＤＮタグ組み込みも、野生型および改変Ｃａｓ９ Ｄ１１
３５Ｅバリアントで３つの遺伝子において行った。結果は、図２３Ａ～Ｂに示されている
が、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑが改変Ｃａｓ９バリアントのプロファイルに使用されうるという
さらなる証拠を示している。

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他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されているが、上記の記載は、例示することが
意図されるものであり、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される、本発明の範囲
を制限するものではないことは理解されるべきである。他の態様、利点および改変は、添
付の特許請求の範囲の範囲内である。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．細胞のゲノムＤＮＡ内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を検出するための方法であって、
前記細胞を二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）と接触させるステップであ
って、前記ｄｓＯＤＮが好ましくは１５および５０ｎｔの間の長さであり、前記ｄｓＯＤ
Ｎの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソロガスであり、好ましくは、前記ｄｓＯＤＮの５'
末端がリン酸化されており、さらにまた好ましくは、ホスホロチオエート結合が両方の３
'末端に存在する、または２つのホスホロチオエート結合が両方の３'末端および両方の５
'末端に存在する、ステップ、
前記細胞内で外来性の改変ヌクレアーゼを、前記ヌクレアーゼが前記細胞の前記ゲノムＤ
ＮＡ内にＤＳＢを誘発するのに十分な時間、かつ前記細胞が前記ＤＳＢを修復して、１つ
または複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むのに十分な時間、発現または活性化さ
せるステップ、
組み込まれたｄｓＯＤＮを含むゲノムＤＮＡの一部を増幅するステップ、および
前記ゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステップ
を含み、それによって前記細胞の前記ゲノムＤＮＡ内のＤＳＢを検出する、方法。
２．細胞のゲノムＤＮＡ内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を検出するための方法であって、
前記細胞を二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）と接触させるステップであ
って、前記ｄｓＯＤＮが好ましくは５０および７５ｎｔの間の長さであり、前記ｄｓＯＤ
Ｎの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソロガスであり、好ましくは、前記ｄｓＯＤＮの５'
末端がリン酸化されており、さらにまた好ましくは、ホスホロチオエート結合が両方の３
'末端に存在する、または２つのホスホロチオエート結合が両方の３'末端および両方の５
'末端に存在する、ステップ、
前記細胞内で外来性の改変ヌクレアーゼを、前記ヌクレアーゼが前記細胞の前記ゲノムＤ
ＮＡ内にＤＳＢを誘発するのに十分な時間、かつ前記細胞が前記ＤＳＢを修復して、１つ
または複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むのに十分な時間、発現または活性化さ
せるステップ、
組み込まれたｄｓＯＤＮを含むゲノムＤＮＡの一部を増幅するステップ、および
前記ゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステップ
を含み、それによって前記細胞の前記ゲノムＤＮＡ内のＤＳＢを検出する、方法。
３．ゲノムＤＮＡの一部を増幅するステップが、
前記ＤＮＡを断片化すること、
前記細胞からの断片化されたゲノムＤＮＡの末端をユニバーサルアダプターでライゲーシ
ョンすること、
前記組み込まれたｄｓＯＤＮと相補的なプライマー（プライマーＡ）および前記ユニバー
サルアダプターと相補的なプライマー（プライマーＢ）を用いて、ライゲーションされた
ＤＮＡに対して１回目のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、
次いで、プライマーＡと相補的な３'ネステッドプライマー（プライマーＣ）、プライマ
ーＢと相補的な３'ネステッドプライマー（プライマーＤ）、およびプライマーＤと相補
的なプライマー（プライマーＥ）を使用して２回目のＰＣＲを行うこと
を含む、上記１または２に記載の方法。
４．プライマーＥが、
精製もしくは結合配列、および／または同定配列
のうちの１つまたは複数を含む、上記３に記載の方法。
５．前記改変ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写
活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化された規則
的な間隔の短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（Ｃ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＧＮ）からなる群から選択される、上記１または２に記載の方法
。
６．前記ＤＳＢがオフターゲットＤＳＢである、上記１～５に記載の方法。
７．前記ＤＳＢが、外来性の改変ヌクレアーゼによって誘発された、上記１～５に記載の
方法。
８．複数のガイドＲＮＡのうちのいずれが最も特異的であるか、すなわち、最も少ないオ
フターゲットＤＳＢを誘発するかを決定する方法であって、
第１の細胞の集団を第１のガイドＲＮＡおよび二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓ
ＯＤＮ）と接触させるステップであって、前記ｄｓＯＤＮが好ましくは１５および５０ｎ
ｔの間の長さであり、前記ｄｓＯＤＮの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソロガスであり、
好ましくは、前記ｄｓＯＤＮの５'末端がリン酸化されており、さらにまた好ましくは、
ホスホロチオエート結合が両方の３'末端に存在する、または２つのホスホロチオエート
結合が両方の３'末端および両方の５'末端に存在する、ステップ、
前記第１の細胞の集団内で外来性のＣａｓ９改変ヌクレアーゼを、前記ヌクレアーゼが前
記細胞のゲノムＤＮＡ内にＤＳＢを誘発するのに十分な時間、かつ前記細胞が前記ＤＳＢ
を修復して、１つまたは複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むのに十分な時間、発
現または活性化させるステップ、
組み込まれたｄｓＯＤＮを含む、前記第１の細胞の集団からのゲノムＤＮＡの一部を増幅
するステップ、および
前記第１の細胞の集団からの前記ゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステ
ップ、
前記ｄｓＯＤＮが前記第１の細胞の集団の前記ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数を
決定するステップ、
第２の細胞の集団を第２のガイドＲＮＡおよび二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓ
ＯＤＮ）と接触させるステップであって、前記ｄｓＯＤＮが好ましくは１５および５０ｎ
ｔの間の長さであり、前記ｄｓＯＤＮの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソロガスであり、
好ましくは、前記ｄｓＯＤＮの５'末端がリン酸化されており、さらにまた好ましくは、
ホスホロチオエート結合が両方の３'末端に存在する、または２つのホスホロチオエート
結合が両方の３'末端および両方の５'末端に存在する、ステップ、
前記第２の細胞の集団内で外来性のＣａｓ９改変ヌクレアーゼを、前記ヌクレアーゼが前
記第２の細胞の集団のゲノムＤＮＡ内にＤＳＢを誘発するのに十分な時間、かつ前記細胞
が前記ＤＳＢを修復して、１つまたは複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むのに十
分な時間、発現または活性化させるステップ、
組み込まれたｄｓＯＤＮを含む、前記第２の細胞の集団からのゲノムＤＮＡの一部を増幅
するステップ、および
前記第２の細胞の集団からの前記ゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステ
ップ、
前記ｄｓＯＤＮが前記第２の細胞の集団の前記ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数を
決定するステップ、
前記ｄｓＯＤＮが前記第１の細胞の集団の前記ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数を
、前記ｄｓＯＤＮが前記第２の細胞の集団の前記ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数
と比較するステップ
を含み、より少ない（オフターゲット）部位で組み込まれた前記ｄｓＯＤＮがより特異的
である、方法。
９．複数のガイドＲＮＡのうちのいずれが最も特異的であるか、すなわち、最も少ないオ
フターゲットＤＳＢを誘発するかを決定する方法であって、
第１の細胞の集団を第１のガイドＲＮＡおよび二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓ
ＯＤＮ）と接触させるステップであって、前記ｄｓＯＤＮが好ましくは５０および７５ｎ
ｔの間の長さであり、前記ｄｓＯＤＮの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソロガスであり、
好ましくは、前記ｄｓＯＤＮの５'末端がリン酸化されており、さらにまた好ましくは、
ホスホロチオエート結合が両方の３'末端に存在する、または２つのホスホロチオエート
結合が両方の３'末端および両方の５'末端に存在する、ステップ、
前記第１の細胞の集団内で外来性のＣａｓ９改変ヌクレアーゼを、前記ヌクレアーゼが前
記細胞のゲノムＤＮＡ内にＤＳＢを誘発するのに十分な時間、かつ前記細胞が前記ＤＳＢ
を修復して、１つまたは複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むのに十分な時間、発
現または活性化させるステップ、
組み込まれたｄｓＯＤＮを含む、前記第１の細胞の集団からのゲノムＤＮＡの一部を増幅
するステップ、および
前記第１の細胞の集団からの前記ゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステ
ップ、
前記ｄｓＯＤＮが前記第１の細胞の集団の前記ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数を
決定するステップ、
第２の細胞の集団を第２のガイドＲＮＡおよび二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓ
ＯＤＮ）と接触させるステップであって、前記ｄｓＯＤＮが好ましくは５０および７５ｎ
ｔの間の長さであり、前記ｄｓＯＤＮの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソロガスであり、
好ましくは、前記ｄｓＯＤＮの５'末端がリン酸化されており、さらにまた好ましくは、
ホスホロチオエート結合が両方の３'末端に存在する、または２つのホスホロチオエート
結合が両方の３'末端および両方の５'末端に存在する、ステップ、
前記第２の細胞の集団内で外来性のＣａｓ９改変ヌクレアーゼを、前記ヌクレアーゼが前
記第２の細胞の集団のゲノムＤＮＡ内にＤＳＢを誘発するのに十分な時間、かつ前記細胞
が前記ＤＳＢを修復して、１つまたは複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むのに十
分な時間、発現または活性化させるステップ、
組み込まれたｄｓＯＤＮを含む、前記第２の細胞の集団からのゲノムＤＮＡの一部を増幅
するステップ、および
前記第２の細胞の集団からの前記ゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステ
ップ、
前記ｄｓＯＤＮが前記第２の細胞の集団の前記ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数を
決定するステップ、
前記ｄｓＯＤＮが前記第１の細胞の集団の前記ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数を
、前記ｄｓＯＤＮが前記第２の細胞の集団の前記ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた部位の数
と比較するステップ
を含み、より少ない（オフターゲット）部位で組み込まれた前記ｄｓＯＤＮがより特異的
である、前記方法。
１０．前記細胞が哺乳動物細胞である、上記１～９のいずれかに記載の方法。
１１．前記改変ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼであり、前記方法が、前記Ｃａｓ９
ヌクレアーゼを前記ゲノム内の標的配列に導くガイドＲＮＡを前記細胞内で発現させるス
テップも含む、上記１～１０のいずれかに記載の方法。
１２．前記ｄｓＯＤＮが３０～３５ｎｔの長さまたは６０～６５ｎｔの長さである、上記
のいずれかに記載の方法。
１３．前記ｄｓＯＤＮがビオチン化される、上記のいずれかに記載の方法。
１４．前記ゲノムｇＤＮＡを断片に切断するステップ、および
ｄｓＯＤＮを含む断片を前記ビオチンへの結合によって単離するステップ
を含む、上記１３に記載の方法。
１５．前記ｄｓＯＤＮが平滑末端である、上記のいずれかに記載の方法。
１６．前記ｄｓＯＤＮが前記５'末端に１、２、３、または４ｎｔのオーバーハンギング
を有する、上記のいずれかに記載の方法。
１７．前記ｄｓｏＤＮが、５'末端でリン酸化されており、３'末端でホスホロチオエート
化されている、上記のいずれかに記載の方法。
１８．前記ｄｓＯＤＮが、無作為化されたＤＮＡバーコードを含む、上記のいずれかに記
載の方法。
１９．上記のいずれかに記載の方法であって、
前記ゲノムｇＤＮＡを断片に切断するステップ、および
前記断片を、末端修復／ａテーリング／単一テールのシークエンシングアダプターのライ
ゲーションによってシークエンシング用に調製するステップ
を含む方法。

Claims (25)

1. 細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を検出するための方法であって、
   前記細胞を平滑末端の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）と接触させるステップであって、前記ｄｓＯＤＮの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソゴナルであり、前記ｄｓＯＤＮの５'末端がリン酸化されており、さらに（ａ）ホスホロチオエート結合が両方の３'末端に存在するか、または（ｂ）ホスホロチオエート結合が両方の３'末端および両方の５'末端に存在する、ステップ、
   前記細胞がＤＳＢを修復するのに十分な条件で前記細胞を維持するステップ、１つまたは複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むステップ、
   組み込まれたｄｓＯＤＮを含むｇＤＮＡの一部を増幅するステップ、並びに
   前記ｇＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステップ
   を含み、それによって前記細胞の前記ｇＤＮＡ内のＤＳＢを検出する、方法。
2. ｇＤＮＡの一部を増幅するステップが、
   前記ＤＮＡを断片化すること、
   前記細胞からの断片化されたゲノムＤＮＡの末端をユニバーサルアダプターでライゲーションすること、および
   ライゲーションされたＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ｄｓＯＤＮが３０～３５ｎｔの長さである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ｄｓＯＤＮが、５'末端でリン酸化されており、３'末端でホスホロチオエート化されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ｄｓＯＤＮが、無作為化されたＤＮＡバーコードを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の方法であって、
   前記ｇＤＮＡを断片に切断するステップ、および
   前記断片を、末端修復、ａテーリング、および単一テールのシークエンシングアダプターのライゲーションによってシークエンシング用に調製するステップ
   を含む方法。
8. 前記ｄｓＯＤＮが１５～５０ｎｔの間の長さである、請求項１～３および５～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 細胞のｇＤＮＡ内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を検出するための方法であって、
   前記細胞を平滑末端の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）と接触させるステップであって、前記ｄｓＯＤＮの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソゴナルであり、前記ｄｓＯＤＮの５'末端がリン酸化されており、さらに（ａ）ホスホロチオエート結合が両方の３'末端に存在するか、または（ｂ）ホスホロチオエート結合が両方の３'末端および両方の５'末端に存在する、ステップ、
   ＤＳＢがゲノムＤＮＡ内で生じるのに十分な条件、かつ前記細胞がＤＳＢを修復するのに十分な条件で前記細胞を維持するステップ、１つまたは複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むステップ、
   組み込まれたｄｓＯＤＮを含むｇＤＮＡの一部を増幅するステップ、並びに
   前記ｇＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステップ
   を含み、それによって前記細胞の前記ｇＤＮＡ内のＤＳＢを検出する、方法。
10. ｇＤＮＡの一部を増幅するステップが、
    前記ＤＮＡを断片化すること、
    前記細胞からの断片化されたゲノムＤＮＡの末端をユニバーサルアダプターでライゲーションすること、および
    ライゲーションされたＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、
    を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記ｄｓＯＤＮが３０～３５ｎｔの長さである、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ｄｓＯＤＮが１５～５０ｎｔの間の長さである、請求項９～１１のいずれか一項１項に
    記載の方法。
14. 前記ｄｓＯＤＮが、５'末端でリン酸化されており、３'末端でホスホロチオエート化されている、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ｄｓＯＤＮが、無作為化されたＤＮＡバーコードを含む、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ｇＤＮＡを断片に切断するステップ、および
    前記断片を、末端修復、ａテーリング、および単一テールのシークエンシングアダプターのライゲーションによってシークエンシング用に調製するステップ
    を含む方法。
17. 細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）内の二本鎖切断（ＤＳＢ）に目的の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を効率良く組み込むための方法であって、
    前記細胞を平滑末端のｄｓＯＤＮと接触させるステップであって、前記ｄｓＯＤＮの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソゴナルであり、前記ｄｓＯＤＮの５'末端がリン酸化されており、さらに（ａ）ホスホロチオエート結合が両方の３'末端に存在するか、または（ｂ）２つのホスホロチオエート結合が両方の３'末端および両方の５'末端に存在する、ステップ、
    前記細胞がＤＳＢを修復するのに十分な条件で前記細胞を維持するステップ、および１つまたは複数のＤＳＢにおいてｄｓＯＤＮを組み込むステップ、
    を含む、方法。
18. 組み込まれたｄｓＯＤＮを含むｇＤＮＡの一部を増幅するステップ、および
    前記ｇＤＮＡの増幅された部分をシークエンスするステップ
    を含み、それによって前記細胞の前記ｇＤＮＡ内のＤＳＢを検出する、請求項１７に記載の方法
19. ｇＤＮＡの一部を増幅するステップが、
    前記ＤＮＡを断片化すること、
    前記細胞からの断片化されたゲノムＤＮＡの末端をユニバーサルアダプターでライゲーションすること、および
    ライゲーションされたＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、
    を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記ｄｓＯＤＮが３０～３５ｎｔの長さである、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記ｄｓＯＤＮが１５～５０ｎｔの間の長さである、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記ｄｓＯＤＮが、５'末端でリン酸化されており、３'末端でホスホロチオエート化されている、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ｄｓＯＤＮが、無作為化されたＤＮＡバーコードを含む、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 請求項１７～２４のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ｇＤＮＡを断片に切断するステップ、および
    前記断片を、末端修復、ａテーリング、および単一テールのシークエンシングアダプターのライゲーションによってシークエンシング用に調製するステップ
    を含む方法。
    
    

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