KR102425438B1 - 서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인 (GUIDE-Seq) - Google Patents

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Abstract

조작된 뉴클레아제에 의해 유도된 돌연변이, 예를 들어, 표적-이탈 돌연변이를 검출하기 위한, 비편향된, 게놈 전체에 걸친 매우 민감한 방법이 개시된다.
[대표도]
도 5a

Description

서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인 (GUIDE-Seq){GENOMEWIDE UNBIASED IDENTIFICATION OF DSBS EVALUATED BY SEQUENCING (GUIDE-SEQ)}
우선권 주장
본원은 2014년 6월 23일 출원된 미국 특허 가출원 62/015,911, 2014년 11월 10일 출원된 미국 특허 가출원 62/077,844, 2014년 11월 12일 출원된 미국 특허 가출원 62/078,923; 및 2014년 12월 5일 출원된 미국 특허 가출원 62/088,223을 기초로 한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
미연방 정부 지원 연구 또는 개발
본 발명은 미국 국립 보건원이 부여한 DP1GM105378 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
살아있는 세포에서 조작된 뉴클레아제 절단 부위의 위치를 확인하기 위한 매우 민감하고 비편향된 게놈 전체에 걸친 방법이 제공된다.
인간 의학의 오랜 목표는 유전되는 유전 질환을 치료하는 것이다. 게놈 편집은 질환을 치료하거나 예방하기 위해 내인성 유전자의 돌연변이를 직접 바로잡는 강력한 개념을 포함한다. 이 방법의 떠오르는 예는 HIV의 공동 수용체인 CCR5를 파괴하도록 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 치료제의 임상 시험이다 (1). 상기 생체외 자가 세포 요법은 CCR5의 동형접합성 돌연변이를 갖는 개체로부터 골수 세포를 이식한 "베를린 환자 (Berlin Patient)"인 티모 브라운 (Timothy Brown)에서 HIV의 성공적인 치료법을 되풀이하려고 시도하고 있다. 최근의 또 다른 예는 6개월된 대상체로부터 유래된 조혈 줄기 세포에서 ZFN을 이용한 유전자 표적화에 의한 X-염색체 연관된 중증 복합 면역결핍 장애의 교정이다 (2).
조작된 뉴클레아제의 다음과 같은 4개의 주요 클래스가 존재한다: 1) 메가뉴클레아제, 2) 아연-핑거 뉴클레아제, 3) 전사 활성화인자 이펙터-유사 뉴클레아제 (TALEN), 및 4) 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) Cas RNA-가이드 뉴클레아제 (RGN).
그러나, 이러한 새로운 치료 및 연구 도구의 채택은 그의 특이성의 입증에 따라 결정될 수 있다. 이러한 뉴클레아제가 연구 및 치료 적용 분야에 널리 사용되기 위해서는, 인간 및 다른 진핵 세포에서의 표적-이탈 효과를 이해하고 확인하는 것이 매우 중요할 것이다.
GUIDE-Seq는 조작된 뉴클레아제에 의해 유도된 돌연변이, 예를 들어, 표적-이탈(off-target) 돌연변이를 검출하기 위한, 비편향된, 게놈 전체에 걸친 매우 민감한 방법을 제공한다. 따라서, 이 방법은 살아있는 포유동물 세포의 게놈 전체에 걸친 돌연변이를 평가하는 가장 포괄적인 비편향된 방법을 제공한다. 상기 방법은 dsODN이 뉴클레아제-유도된 DSB로 효율적으로 포획될 수 있는 임의의 세포 유형에서 이용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 예를 들어 세포의 게놈 DNA에서 외인성 조작된 뉴클레아제에 의해 유도된 이중 가닥 절단 (DSB), 예를 들어 표적-이탈 DSB를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (dsODN)와 접촉시키고, 바람직하게는 여기서 dsODN은 15 내지 75 nt, 예를 들어 15 내지 50 nt, 50 내지 75 nt, 30 내지 35 nt, 60 내지 65 nt, 또는 50-65 nt 길이이고, dsODN의 두 가닥은 세포의 게놈과 이종상동성이고; 바람직하게는, dsODN의 5' 말단은 인산화되고; 바람직하게는 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단에 존재하거나, 또는 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재하는 것인 단계;
세포에서 외인성 조작된 뉴클레아제를 뉴클레아제가 세포의 게놈 DNA에서 DSB를 유도하고 세포가 DSB를 복구하기에 충분한 시간 동안 발현시키거나 또는 활성화시켜 하나 이상의 DSB에서 dsODN을 통합시키는 단계;
통합된 dsODN을 포함하는 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계; 및
게놈 DNA의 증폭된 부분의 서열을 결정하고,
이에 의해 세포의 게놈 DNA에서 DSB를 검출하는 단계
를 포함한다.
일부 실시양태에서, 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계는
예를 들어 전단에 의해 DNA를 단편화하고;
세포로부터 단편화된 게놈 DNA의 말단을 범용 어댑터로 라이게이션하고;
통합된 dsODN에 상보성인 프라이머 (프라이머 A) 및 범용 어댑터에 상보성인 프라이머 (프라이머 B)를 사용하여 라이게이션된 DNA에 대해 제1 라운드의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행한 후;
프라이머 A에 상보성인 3' 네스티드 프라이머 (프라이머 C), 프라이머 B에 상보성인 3' 네스티드 프라이머 (프라이머 D) 및 프라이머 D에 상보성인 프라이머 (프라이머 E)를 사용하여 제2 라운드의 PCR을 수행하는 것
을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 E는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 정제 또는 결합 서열, 예를 들어, 유동 세포 결합 서열; 및 확인 서열, 예를 들어, 바코드 또는 랜덤 분자 인덱스.
일부 실시양태에서, 조작된 뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제, 전사 활성화인자 이펙터-유사 뉴클레아제 (TALEN) 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)/Cas RNA-가이드 뉴클레아제 (CRISPR/Cas RGN)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 복수개의 가이드 RNA 중 어느 것이 가장 특이적인지, 즉 가장 적은 표적-이탈 DSB를 유도하는지 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제1 세포 집단을 제1 가이드 RNA 및 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (dsODN)와 접촉시키고, 바람직하게는 여기서 dsODN은 15 내지 75 nt, 예를 들어 15 내지 50 nt, 50 내지 75 nt, 60 내지 65 nt, 30 내지 35 nt 또는 50 내지 65 nt의 길이이고, dsODN의 두 가닥은 세포의 게놈과 이종상동성이고; 바람직하게는, dsODN의 5' 말단은 인산화되고; 또한 바람직하게는, 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단에 존재하거나, 또는 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재하는 것인 단계;
제1 세포 집단에서 외인성 Cas9 조작된 뉴클레아제를 뉴클레아제가 세포의 게놈 DNA에서 DSB를 유도하고 세포가 DSB를 복구하기에 충분한 시간 동안 발현시키거나 또는 활성화시켜 하나 이상의 DSB에서 dsODN을 통합시키는 단계;
통합된 dsODN을 포함하는 제1 세포 집단으로부터 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계; 및
제1 세포 집단으로부터 게놈 DNA의 증폭된 부분의 서열을 결정하는 단계;
dsODN이 제1 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합되는 부위의 수를 결정하는 단계;
제2 세포 집단을 제2 가이드 RNA 및 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (dsODN)와 접촉시키고, 바람직하게는 여기서 dsODN은 15 내지 75 nt, 예를 들어 15 내지 50 nt, 50 내지 75 nt, 30 내지 35 nt, 60 내지 65 nt 또는 50 내지 65 nt의 길이이고, dsODN의 두 가닥은 세포의 게놈과 이종상동성이고; 바람직하게는, dsODN의 5' 말단은 인산화되고; 또한 바람직하게는, 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재하는 것인 단계;
제2 세포 집단에서 외인성 Cas9 조작된 뉴클레아제를 뉴클레아제가 제2 세포 집단의 게놈 DNA에서 DSB를 유도하고 세포가 DSB를 복구하기에 충분한 시간 동안 발현시키거나 또는 활성화시켜 하나 이상의 DSB에서 dsODN을 통합시키는 단계;
제2 세포 집단으로부터 통합된 dsODN을 포함하는 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계; 및
제2 세포 집단으로부터 게놈 DNA의 증폭된 부분의 서열을 결정하는 단계;
dsODN이 제2 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합되는 부위의 수를 결정하는 단계;
dsODN이 제1 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합된 부위의 수를 dsODN이 제2 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합된 부위의 수와 비교하는 단계
를 포함하고, 여기서 보다 적은 (표적-이탈) 부위에 통합된 dsODN이 보다 특이적이다. 이 방법은 제3, 제4, 제5, 제6 또는 그 초과의 세포 집단에 대해 반복될 수 있다. "보다 적은" 표적-이탈 부위는 더 적은 수의 DSB 부위 및/또는 (하나 이상의) 개별 부위에서 DSB 발생 빈도의 감소를 둘 모두 포함할 수 있다.
또한, 본원에서 설명되는 바와 같이 말단 보호된 dsODN의 사용에 의해 관심 있는 짧은 dsDNA를 DSB의 부위 내로 효율적으로 통합시키는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다.
조작된 뉴클레아제가 Cas9 뉴클레아제인 일부 실시양태에서, 방법은 게놈 내의 표적 서열에 Cas9 뉴클레아제를 유도하는 가이드 RNA, 예를 들어, 단일 가이드 또는 tracrRNA/crRNA 쌍을 세포 내에서 발현시키는 것을 또한 포함한다.
일부 실시양태에서, dsODN은 비오티닐화되고, 예를 들어, dsODN에 공유 부착된 비오틴을 포함하고/하거나, 무작위화 DNA 바코드 또는 Cre 또는 Lox 부위를 포함한다. 상기 방법에서, dsODN은 비오티닐화된 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 게놈 gDNA를 단편으로 전단하고; 비오틴에 결합함으로써 dsODN을 포함하는 단편을 단리하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, dsODN은 평활 말단이거나 또는 5' 말단에 1, 2, 3 또는 4 nt 오버행을 갖고; 5' 말단에서 인산화되고/되거나 3' 말단에서 포스포로티오에이트화된다.
일부 실시양태에서, dsODN은 평활 말단이고, 5' 말단에서 인산화되고, 3' 말단에서 포스포로티오에이트화된다.
일부 실시양태에서, dsODN은 무작위화 DNA 바코드, Lox 인식 부위, 제한 효소 인식 부위 및/또는 태그 서열을 함유한다.
일부 실시양태에서, 방법은 게놈 gDNA를 단편으로 전단하고; 서열결정 어댑터, 예를 들어 단일 꼬리 서열결정 어댑터의 말단 복구/a-꼬리 형성/라이게이션에 의해 서열 결정, 예를 들어 고처리량 서열결정을 위한 단편을 제조하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, DSB는 배경 게놈 DSB (예를 들면, 약한 부위에서의) 또는 주요 세포 단백질의 소분자 억제제에 의해 야기되는 DSB이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 물질은 본 발명에서 사용하기 위해 본원에서 설명되고; 관련 기술 분야에 공지된 다른 적절한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서, 제한하고자 의도되지 않는다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이타베이스 항목 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 서로 일치하지 않는 경우에는, 정의를 포함하여 본원 명세서가 우선될 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 도면 및 청구 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a-b. CRISPR-Cas 뉴클레아제-매개 dsODN 포획의 최적화. (a) 사용된 짧은 올리고뉴클레오티드 태그의 서열이 제시된다. 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 5' 인산화된다. 태그 올리고뉴클레오티드는 또한 RFLP에 의한 통합 빈도의 추정을 가능하게 하는 진단 NdeI 제한 부위를 포함한다. (b) 하단 그래프는 RFLP에 의한 짧은 dsODN의 통합 (%)을 보여준다. 5' 및 3' 포스포로티오에이트 연결 둘 모두 (각각의 세트에서 좌측 막대)를 갖는 dsODN에 대한 통합 비율은 5' 포스포로티오에이트 연결만을 갖는 dsODN (각각의 세트의 중간 막대) 및 dsODN가 없는 대조군 (각각의 세트의 우측 막대)와 비교된다.
도 2a-b. VEGF 부위 1에 대한 통합의 특성 결정. (a) 퀴악셀 (Qiaxcel) 모세관 전기영동 기기로 분석한, RFLP 검정이 VEGF 부위 1에 대해 제시되고, 이는 NdeI 제한 부위를 보유하는 dsODN의 성공적인 통합을 보여준다. (b) 생어 (Sanger) 서열결정 데이타는 의도된 VEGF 부위 1 표적 부위에서의 dsODN 통합에 대해 제시된다. dsODN 서열결정은 회색으로 강조 표시된다. VEGFA 부위 1을 표적으로 하는 가이드 RNA/Cas9 복합체에 의해 인식되는 부위는 굵은 글씨로 강조 표시되고, 인접한 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열은 밑줄로 표시된다. 이 부위에서 Cas9에 의해 유도된 예상된 이중 가닥 절단 부위의 위치는 작은 검정 화살표로 표시된다.
도 3. 예시적인 GUIDE-seq 방법의 개요.
도 4a-e. GUIDE-Seq 방법에 의해 발견된 CRISPR-Cas 표적-이탈 절단 부위. 4개의 부위, 즉 VEGF 부위 1-3, EMX1에 대한 데이타가 제시된다. 표적 부위 서열에 대한 미스매치가 강조 표시된다. 작은 진한 검정 화살표는 의도되는 표적-적중 (on-target) 부위를 나타내기 위해 사용되고, 작은 파선 화살표는 이전 연구 (Fu et al., 2013)에서 검출된 알려진 표적-이탈 부위를 표시하기 위해 사용된다.
도 5a-g. 예시적인 GUIDE-Seq 방법의 설계, 최적화 및 적용.
(a) 예시적인 GUIDE-Seq 방법의 도식적인 개요.
(b) 인간 세포에서 RGN-유도된 DSB 내로의 dsODN 통합의 최적화. RFLP 검정에 의해 측정된 상이한 변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 통합 비율이 제시된다. 대조군 반응물은 RGN-코딩 플라스미드만으로 (즉, dsODN 없이) 형질감염시켰다.
(c) 게놈 서열 판독의 맵핑이 DSB 위치의 확인을 가능하게 하는 방법을 제시하는 개략도. 양방향 맵핑 판독 또는 동일한 방향으로 맵핑되지만 상이한 프라이머에 의해 증폭된 판독은 GUIDE-seq 검정에서 DSB의 시그너쳐이다. 도 1a 참조.
(d) RGN-유도 DSB의 GUIDE-Seq 기반 확인. 게놈에 맵핑된 GUIDE-Seq 판독 시작 부위는 몇 개의 염기쌍 내로 DSB의 맵핑이 가능하게 할 수 있다. GUIDE-Seq에 의해 본 발명자들이 평가한 10개의 RGN의 표적-적중 부위에 대해 맵핑된 판독이 제시된다. 모든 경우에, 표적 부위 서열은 x-축 상에서 좌측으로 20 bp의 프로토스페이서 서열, 우측으로 PAM 서열과 함께 제시된다. 모든 경우에 있어서, 가장 높은 피크가 NGG PAM 서열의 5'-끝부분 (edge)의 3 내지 4 bp, 즉 RGN 절단 사건의 예상되는 위치 내에 어떻게 존재하는지에 대해 주목한다.
(e) 본 연구에서 분석된 10개의 RGN에 대해 GUIDE-Seq에 의해 확인된 이전에 알려진 및 신규한 표적-이탈 절단 부위의 수. 4개의 RGN에 대해 이전에 알려진 모든 표적-이탈 절단은 GUIDE-seq에 의해 확인되었다.
(f) 본 보고서의 10개의 RGN에 대해 GUIDE-Seq에 의해 검출된 표적-이탈 부위의 총 수 대 인간 게놈 (y-축)에 대한 표적 부위 직교성 (orthogonality)의 산점도. 직교성은 표적 부위에 비해 1 내지 6개의 미스매치를 보유하는 인간 게놈 내의 총 부위 수로 계산되었다.
(g) 본 보고서의 10개의 RGN에 대해 표적 부위 GC 함량 (y-축) 대 GUIDE-Seq에 의해 검출된 표적-이탈 부위의 총 수에 대한 산점도.
(h) EMX1을 표적으로 하는 RGN에 대한 CRISPR/Cas9 표적-적중 및 표적-이탈 부위의 염색체 핵형도 (ideogram). 나머지 RGN에 대한 추가의 핵형도는 도 13에서 볼 수 있다.
(i) 본 연구에서 조사된 10개의 RGN에 대해 GUIDE-Seq에 의해 확인된 표적-이탈 절단 부위의 게놈 위치.
도 6a-j. 10개의 RGN에 대해 GUIDE-Seq에 의해 확인된 표적-이탈 부위의 서열. 각각의 RGN에 대해, 의도된 표적 서열은 상단 라인에 제시되고, 절단된 부위는 아래에 제시되고, 표적 부위와의 미스매치는 색상으로 강조 표시된다. GUIDE-Seq 서열결정 판독 수가 각각의 부위의 오른쪽에 표시된다. 표적 부위는 정사각형으로 표시되고, 이전에 알려진 표적-이탈 부위는 다이아몬드로 표시된다. 데이터는 하기 부위를 표적화하는 RGN에 대해 제시된다: (a) VEGFA 부위 1, (b) VEGFA 부위 2, (c) VEGFA 부위 3, (d) EMX1, (e) FANCF, (f) HEK293 부위 1, (g) HEK293 부위 2, (h) HEK293 부위 3, (i) HEK293 부위 4, (j) RNF2. RNF2 부위를 표적화하는 RGN에 대한 표적-이탈 부위는 발견되지 않았다.
도 7a-f. GUIDE-Seq 절단 부위는 진정한 (bona fide) RGN 표적-이탈 돌연변이 부위이다.
(a) GUIDE-Seq 절단 부위에서 indel 돌연변이를 확인하기 위해 사용되는 AMP 기반 서열결정 방법의 도식적인 개요는 도면의 상단 절반에 제시된다. 맵핑된 indel 돌연변이의 히스토그램 도면이 3개의 RGN 표적-적중 부위에 대해 제시된다. 결실은 X축 위에 표시되고, 삽입은 아래에 표시된다. 전체 표적 부위 (즉, 프로토스페이서 및 PAM 서열)의 경계는 파선으로 표시되고, 프로토스페이서와 PAM 서열 사이의 경계는 다른 두 지점 사이의 파선으로 표시된다. RGN 절단은 프로토스페이서의 5' 끝부분으로부터의 3 내지 4 bp에서 발생하는 것으로 예상된다.
(b)-(f) VEGFA 부위 1, VEGFA 부위 2, VEGFA 부위 3, EMX1 및 FANCF에 대해 표적화되는 RGN에 대한 GUIDE-Seq에 의해 확인된 절단 부위에 대한 indel 빈도 (x축) 및 GUIDE-Seq 서열결정 판독 수 (y축)의 산점도.
도 8a-e. RGN-유도된 표적-이탈 서열 특징의 분석.
(a) (GUIDE-Seq에 의해 검출된 바와 같이) 절단되는 특정 수의 미스매치를 보유하는 잠재적인 RGN 표적-이탈 부위의 비율.
(b) 특정 수의 미스매치를 보유하는 RGN 표적-이탈 절단 부위에 대한 GUIDE-Seq 판독 수 (로그-스케일)의 도면.
(c) RGN 표적-이탈 부위에 대한 GUIDE-Seq 판독 수에 대한 프로토스페이서 내의 미스매치 위치의 영향. 염기는 1에서 20까지 번호가 매겨지며, 20은 PAM에 인접한 염기이다.
(d) 선형 회귀 분석에 의해 추정된 워블 염기전이 (wobble transition), 비-워블 염기전이 및 염기전환 (transversion) 미스매치의 효과.
(e) 미스매치 수, 미스매치 유형, 미스매치 위치, PAM 밀도, 발현 수준 및 게놈 위치 (유전자간/엑손/인트론)의 영향에 대해 개별 단변량 분석에 의해 설명된 GUIDE-Seq 판독 수 분산의 분율.
도 9a-f. RGN 표적-이탈 부위를 확인하기 위한 GUIDE-Seq와 계산 예측 또는 ChIP-Seq 방법의 비교.
(a) 9개의 RGN에 대해 MIT CRISPR 설계 도구와 GUIDE-Seq에 의해 예측된 표적-이탈 부위 사이의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램.
(b) 9개의 RGN에 대해 E-CRISP 계산 예측 프로그램과 GUIDE-Seq에 의해 예측된 표적-이탈 부위 사이의 중첩을 나타내는 벤 다이어그램.
(c) MIT CRISPR 설계 도구에 의해 예측된, 예측되지 않은 및 고려되지 않은, GUIDE-Seq에 의해 확인된 진정한 RGN 표적-이탈 부위의 수를 보여주는 히스토그램. MIT CRISPR 디자인 도구에 의해 예측된 부위는 프로그램에 의해 제공되는 점수를 기초로 하여 5분위수로 나누어진다. 각각의 막대는 표적-적중 부위와 관련된 미스매치의 수를 기초로 하여 하위 분류된 부위를 갖는다. 돌출(bulge) 부위는 gRNA-프로토스페이서 DNA 계면에서 건너뛴 염기 위치를 갖는 것이다.
(d) E-CRISP 계산 예측 도구에 의해 예측된, 예측되지 않은 및 고려되지 않은, GUIDE-Seq에 의해 확인된 진정한 RGN 표적-이탈 부위의 수를 보여주는 히스토그램. 부위는 (c)에서 설명한 바와 같이 세분된다.
(e) ChIP-Seq에 의해 확인된 dCas9 결합 부위와 GUIDE-Seq에 의해 확인된 RGN 표적-이탈 절단 부위 사이의 중첩을 예시하는 벤 다이어그램.
(f) 의도된 표적-적중 부위에 대한 서열의 미스매치 수에 의해 분류된, GUIDE-Seq에 의해 확인된 RGN 표적-이탈 부위 및 ChIP-Seq에 의해 확인된 dCas9 결합 부위의 히스토그램 도면. GUIDE-Seq 및 ChIP-Seq 미스매치의 커널 (Kernel) 밀도 추정이 제시된다. 파선은 각각의 부위 클래스에 대한 평균 미스매치 수를 나타낸다.
도 10a-f. RGN에 의해 유도된 대규모 구조 변경.
(a) 전위 검출을 위한 AMP 전략의 도식적인 개요. 방법의 추가의 세부 사항.
(b) RGN에 의해 유도된 구조적 변이의 치르코스 (Circos) 플롯. 5개의 RGN에 대한 데이타 및 세포의 제어가 제시된다. 염색체는 두 개의 염색체 위치 사이에 호 (arc)로 표시된 전위가 있는 원으로 배열된다. 길이가 1kb 초과인 결실 또는 역위는 직선으로 표시된다. 표적-적중, 표적-이탈 또는 절단점 핫스팟 (hotspot)이 아닌 부위는 "기타"로 분류된다.
(c) 6번 염색체 상의 VEGFA 부위 1 표적-적중 부위와 17번 염색체 상의 표적-이탈 부위 사이에서 검출된 전위의 예. 4개의 가능한 모든 상호 전위가 AMP를 사용하여 검출되었다.
(d) AMP에 의해 검출된 VEGFA 부위 2에서 2개의 표적-이탈 부위 사이의 큰 결실 및 역위의 예.
(e) 5개의 RGN에서 관찰된 상이한 RGN-유도된 및 RGN-비의존성 구조 변형의 요약 표. Cas9 단독, dsODN 올리고 단독, 세포 단독의 대조군도 제시된다.
(f) U2OS 및 HEK293 세포에서 절단점 핫스팟의 위치를 보여주는 염색체 핵형도. 2개의 핫스팟은 염색체 1 및 10의 동원체 영역과 중첩된다.
도 11a-h. tru-gRNA에 의해 지시되는 RGN의 GUIDE-Seq 프로파일.
(a) 매치된 전장 gRNA 및 말단 절단된 gRNA에 의해 VEGFA 부위 1, VEGFA 부위 3 및 EMX1 표적 부위로 유도되는 RGN에 대해 확인된, 이전에 알려진 및 신규한 표적-이탈 절단 부위의 수. 전장 gRNA에 의해 지시되는 RGN에 대한 데이타는 도 1e에 제시된 것과 동일하고, 용이한 비교를 위해 여기에 다시 제시됨을 유의한다.
(b)-(d) 매치된 전장 gRNA 및 말단 절단된 gRNA에 의해 VEGFA 부위 1, VEGFA 부위 3 및 EMX1 표적 부위로 유도되는 RGN의 표적-적중 및 표적-이탈 부위를 보여주는 염색체 핵형도. 전장 gRNA에 의해 지시되는 RGN에 대한 핵형도는 도 1h 및 도 13a-b에 제시된 것과 동일하고, 용이한 비교를 위해 여기에 다시 제시됨을 유의한다.
(e) tru-gRNA에 의해 지시되는 RGN에 의해 유도되는 DSB의 GUIDE-Seq-기반 확인. 본 발명자들이 GUIDESeq에 의해 평가한 tru-gRNA에 의해 지시된 3개의 RGN의 표적-적중 부위에 대해 맵핑된 판독이 제시된다. 모든 경우에, 표적 부위 서열은 x-축 상에서 좌측으로 20 bp의 프로토스페이서 서열을 나타내고, 우측으로 PAM 서열을 나타낸다. 전장 gRNA에 의해 지시되는 RGN과 마찬가지로, 최고 피크가 RGN 절단 사건의 예상 위치인 NGG PAM 서열의 5'-끝부분의 3 내지 4 bp 내에 어떻게 위치하는지 유의한다.
(f)-(h) tru-gRNA에 의해 지시된 RGN에 대해 GUIDE-Seq에 의해 확인된 표적-이탈 부위의 서열. 각각의 RGN에 대해, 의도된 표적 서열은 상단 라인에 제시되고, 절단된 부위는 아래에 표시되고, 표적-적중 부위와의 미스매치는 색상으로 강조 표시된다. GUIDESeq 서열결정 판독 수는 각각의 부위의 오른쪽에 제시된다. 의도된 표적-적중 부위는 정사각형으로 표시되고, 전장 gRNA 및 tru-gRNA 둘 모두에 의해 지시된 RGN의 이전에 알려진 표적-이탈 부위는 진한 회색의 다이아몬드로 표시되고, tru-gRNA에 의해 지시된 RGN에서만 발견된 이전에 알려진 표적-이탈 부위는 밝은 회색 다이아몬드로 표시된다. 이전에 알려진 표적-이탈 부위는 이전의 보고 [FU et al., Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)]에서 돌연변이 유발 빈도가 0.1% 이상인 것으로 밝혀진 것이었다. 데이타는 (f) VEGFA 부위 1, (g) VEGFA 부위 3 및 (h) EMX1 표적 부위에 대해 tru-gRNA에 의해 지시되는 RGN에 대해 제시된다.
도 12. dsODN 삽입 및 indel 돌연변이의 확인을 위한 GUIDE-Seq 및 AMP 기반 서열결정에 대한 자세한 도식적인 개요. 두 프로토콜에 대한 상세한 내용은 하기 방법 섹션에서 볼 수 있다.
도 13a-j. GUIDE-Seq에 의해 평가된 10개의 모든 RGN에 대한 CRISPR/Cas9 표적-적중 부위 및 표적-이탈 부위의 염색체 핵형도.
도 14. GUIDE-Seq 판독 수에 대한 인자의 독립적인 효과를 보여주는 다중 인자 선형 회귀 모델.
도 15a-d. 이전에 표적-이탈 절단 부위로 특성화된 7개의 ChIP-Seq 결합 부위에 대한 맵핑된 indel 돌연변이의 히스토그램 도면. 실험 및 대조군 샘플이 각각의 부위에 대해 나란히 표시된다.
도 16a는 EGFP를 표적으로 하는 TALEN, ZFN, 및 RFN을 사용하여 3가지 유형의 dsODN의 통합 빈도를 보여주는 그래프이다. 모든 dsODN은 5' 인산화되었다. dsODN은 나타낸 바와 같이 무작위로 선정된 5'- 또는 3'-4-bp 오버행을 갖거나, 평활한 것으로 나타났다.
도 16b-c는 U2OS 세포에서 2개의 내인성 표적 부위, 즉 CCR5 및 APC에서 TALEN에 의해 유도된 이중 가닥 절단 (DSB) 내로의 평활한 5'-인산화된 34-bp 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (dsODN) (oSQT685/686)의 효율적인 통합을 보여주는 그래프이다. (16b) RFLP 분석은 2개의 내인성 부위, 즉 CCR5 및 APC에서 TALEN에 의해 유도된 DSB 내로의 dsODN 태그 oSQT685/686의 통합 %를 보여준다. (16c) 누적 돌연변이 유발 빈도는 2개의 내인성 표적 부위에서 T7E1 검정에 의해 측정된다.
도 17a 및 17b는 상이한 dsODN 말단 보호의 비교를 보여주는 막대 그래프이고, 이 실험에서 사용된 dsODN은 인산화되고 평활한 것이고, 5' 및 3' 포스포로티오에이트 변형 둘 모두 또는 3' 포스포로티오에이트 변형만을 가졌다. 도 17a: 인간 U2OS 세포의 RFN; 17b: 마우스 ES 세포의 Cas9.
도 18a-b는 마우스 ES 세포에서 상이한 농도의 3' 포스포로티오에이트 변형된 올리고의 실험을 보여주는 그래프이다. 18a: Nanog sgRNA/Cas9; 18b: Phc1 sgRNA/Cas9. dsODN은 인산화되고 평활한 것이었고, 5' 및 3' 포스포로티오에이트 변형 둘 모두 또는 3' 포스포로티오에이트 변형만을 가졌다. 실험은 인간 U2OS 세포에서 이량체 RNA-가이드 FokI 뉴클레아제를 사용하여 (도 18a) 또는 마우스 ES 세포에서 표준 Cas9를 사용하여 (도 18b) 수행하였다.
도 18c는 마우스 ES 세포에서 3' 포스포로티오에이트 변형된 올리고의 존재 하의 붕괴 비율에 대한 T7E1 분석을 보여주는 그래프이다.
도 19a-b는 U2OS 세포에서 3개의 내인성 표적 부위인 VEGFA3, EMX1 및 FANCF1에서 Cas9에 의해 유도된 이중 가닥 절단 (DSB) 내로의 비오티닐화된 dsODN 태그의 효율적인 통합을 보여준다. (19a) RFLP 분석은 표준 dsODN (oSQT685/686)에 비해, U2OS 세포에서 3개의 내인성 부위인 VEGFA3, EMX1 및 FANCF1에서 Cas9에 의해 유도된 DSB 내로의 비오티닐화 dsODN (oSQT1261/1262)의 % 통합 비율을 보여준다. (19b) T7EI는 표준 dsODN (oSQT685/686)에 비해, U2OS 세포에서 3개의 내인성 부위인 VEGFA3, EMX1 및 FANCF1에서 비오티닐화 dsODN (oSQT1261/1262)을 사용하여 추정된 돌연변이 유발 빈도 %를 보여준다.
도 20a-b는 더 긴 dsODN 태그가 CRISPR-Cas9 유도된 DSB의 부위에서 효율적으로 통합되도록 최적화될 수 있음을 보여준다. (20a) RFLP 분석은 75, 50 또는 25 pmol로 형질감염시켰을 때 60-bp dsODN (oSQT1255/1256, oSQT1257/1258 및 oSQT1259/1260)의 % 통합 비율을 보여준다. U2OS 세포에서 2개의 내인성 부위인 EMX1 및 FANCF1에서 시험되었다. (20b) T7EI는 75, 50, 또는 25 pmol로 형질감염시켰을 때 60-bp dsODN (oSQT1255/1256, oSQT1257/1258, oSQT1259/1260)의 추정된 NHEJ 비율 %을 보여준다. U2OS 세포에서 2개의 내인성 부위인 EMX1과 FANCF1에서 시험되었다.
도 21은 상이한 sgRNA를 사용하여 조작된 VQR 및 VRER SpCas9 변이체에 대해 GUIDE-seq에 의해 확인된 표적-이탈 절단 부위의 수를 보여주는 그래프이다.
도 22는 표적-이탈 부위에서 야생형과 D1135E SpCas9 변이체 간의 특이성의 GUIDE-seq에 의해 검출된 변화를 요약한 그래프이다. D1135E의 판독 수가 없는 부위에서의 특이성의 추정 획득 배율은 제시되지 않았다.
도 23a-b는 제한 단편 길이 다형성 분석에 의해 추정된, 표적-적중 부위에서의 GUIDE-seq 올리고 태그 통합의 평균 빈도 (23a)를 보여주는 그래프이다. 오류 막대는 s.e.m. (n = 4)를 나타내고; (23b) GUIDE-seq 실험을 위해 T7E1에 의해 검출된 표적-적중 부위에서의 돌연변이 유발 빈도를 의미한다. 오류 막대는 s.e.m. (n = 4)를 나타낸다.
본원에서 설명되는 서열결정 (GUIDE-Seq) 방법에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인은 살아있는 세포, 예를 들어 비-상동성 말단-연결 (NHEJ) 복구 경로가 활성화된 세포에서 조작된 뉴클레아제 절단 부위의 위치를 확인하기 위한 매우 민감하고 비편향된, 게놈 전체에 걸친 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 짧은 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (dsODN)를 뉴클레아제-유도된 절단 (NHEJ 경로에 의해 매개되는 것으로 추정되는 과정) 내로 포획한 다음, 예를 들어 삽입된 dsODN 서열이 고처리량 서열결정을 위한 게놈 삽입 부위를 선택적으로 증폭하기 위해 사용되는 PCR 기반의 심층 (deep) 서열결정 방법을 사용하거나, 또는 예를 들어 용액 하이브리드 포획을 사용하여 부착된 태그, 예컨대 비오틴을 사용하여 삽입된 dsODN을 포함하는 게놈 단편을 선택적으로 끌어냄으로써 게놈 삽입 부위를 확인하기 위해 삽입된 dsODN 서열을 사용하는 것에 의존한다. 배양된 인간 세포에서 GUIDE-Seq 방법의 개발 및 검증이 본원에서 설명되고; 본원에서 설명되는 일반적인 방법은 모든 포유동물 세포 및 NHEJ 경로가 활성이거나 활성인 것으로 추정되는 임의의 세포 종류 또는 유기체에서 작용해야 한다.
상기 초기 서열결정 과정에 의해 확인된 잠재적인 표적-이탈 부위는 뉴클레아제 성분 만이 발현되는 세포에서 NHEJ 복구의 특징인 indel 돌연변이를 분석할 수 있다. 증폭 및 후속 심층 서열결정을 사용하여 수행될 수 있는 상기 실험은 각각의 뉴클레아제에 의해 유도된 표적-이탈 돌연변이의 빈도에 대한 추가적인 확인 및 정량화를 제공할 것이다.
이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (dsODN)
본원에서 설명되는 방법에서, 비-천연 생성 dsODN이 세포에서 발현된다. 본 발명의 방법에서, dsODN의 두 가닥은 세포의 게놈에 대해 이종상동성이다 (즉, 존재하는 서열에 존재하지 않거나 상기 서열에 상보적이 아니고, 즉 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이하의 동일성을 갖는다). dsODN은 바람직하게는 15 내지 75 nt, 예를 들어 15 내지 50 nt, 50 내지 75 nt, 30 내지 35 nt, 60 내지 65 nt, 또는 50 내지 65 nt 길이, 또는 15 내지 50 nt 길이, 예를 들어 20-40 또는 30-35, 예를 들어 32-34 nt 길이일 수 있다. dsODN의 각각의 가닥은 독특한 PCR 프라이밍 서열을 포함해야 한다 (즉, dsODN은 각 가닥에 하나씩, 총 2개의 PCR 프라이머 결합 부위를 포함한다). 일부 실시양태에서, dsODN은 제한 효소 인식 부위, 바람직하게는 세포의 게놈에서 비교적 드문 부위를 포함한다.
dsODN은 변형되는 것이 바람직하고; 바람직하게는, dsODN의 5' 말단이 인산화되고; 바람직하게는 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, dsODN은 평활한 말단이다. 일부 실시양태에서, dsODN은 5' 또는 3' 말단에 무작위로 다양한 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다.
dsODN은 또한 예를 들어 관련 기술 분야에 공지되거나 PCT/US2011/060493에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, dsODN은 비오티닐화된다. 비오티닐화 버전의 GUIDE-seq dsODN 태그는 게놈 DSB의 부위에 통합하기 위한 기재로 사용된다. 비오틴은 dsODN 내부 (예를 들어, 변형된 티미딘 잔기 (비오틴-dT) 또는 비오틴 아지드 사용)의 임의의 부위에 존재할 수 있지만, 5' 또는 3' 말단에는 존재하지 않는다. 실시예 4에서 제시되는 바와 같이, 이러한 올리고를 효율적으로 통합하는 것이 가능하다. 이것은 GUIDE-seq dsODN 태그를 함유하는 단편을 회수하는 대체 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이들 서열은 네스티드트 PCR에 의해 회수되고 확인되지만, 이 방법에서는 이들 서열은 비오틴을 사용하여, 예를 들어 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드에 결합시킴으로써 또는 용액 하이브리드 포획을 사용하여 물리적으로 끌어낸다 (Gnirke et al., Nature Biotechnology 27, 182 - 189 (2009) 참조). 주요 이점은 두 개의 인접 서열 검색이고, 이것은 표적-이탈 절단 부위를 확인하기 위해 서열을 참조 게놈에 맵핑하는 것에 대한 의존성을 감소시킨다.
조작된 뉴클레아제
조작된 뉴클레아제의 다음과 같은 4개의 주요 클래스가 존재한다: 1) 메가뉴클레아제, 2) 아연-핑거 뉴클레아제, 3) 전사 활성화인자 이펙터-유사 뉴클레아제 (TALEN), 및 4) 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) Cas RNA-가이드 뉴클레아제 (RGN). 예를 들어, 문헌 [Gaj et al., Trends Biotechnol. 2013 Jul;31(7):397-405]을 참조한다. 뉴클레아제는 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 세포 내에서 일시적으로 또는 안정하게 발현될 수 있고; 전형적으로, 발현을 위해, 단백질을 코딩하는 서열이 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝된다. 적합한 진핵 발현 시스템은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th ed. 2013)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (2006)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)]을 참조한다. 진핵 세포 및 원핵 세포의 형질 전환은 표준 기술에 따라 수행된다 (예를 들어, 상기 문헌 및 [Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351], [Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al. eds, 1983)] 참조).
귀소 메가뉴클레아제
메가뉴클레아제는 박테리아, 효모, 조류 및 식물 세포 소기관과 같은 다양한 유기체에서 기원하는 서열-특이적 엔도뉴클레아제이다. 내인성 메가뉴클레아제는 12 내지 30개 염기쌍의 인식 부위를 갖고; 18 bp 및 24 bp 길이의 메가뉴클레아제 인식 부위를 갖는 맞춤화된 DNA 결합 부위가 설명된 바 있고, 어느 것이든 본 발명의 방법 및 구축물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Silva, G., et al., Current Gene Therapy, 11:11-27, (2011)]; [Arnould et al., Journal of Molecular Biology, 355:443-58 (2006)]; [Arnould et al., Protein Engineering Design & Selection, 24:27-31 (2011)]; [Stoddard, Q. Rev. Biophys. 38, 49 (2005)]; 및 [Grizot et al., Nucleic Acids Research, 38:2006-18 (2010)]을 참조한다.
CRISPR-Cas 뉴클레아제
최근 연구에 따르면, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)/CRISPR-관련 (Cas) 시스템 ([Wiedenheft et al., Nature 482, 331-338 (2012)], [Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010)]; [Terns et al., Curr Opin Microbiol 14, 321-327 (2011)])은 박테리아, 효모 및 인간 세포뿐만 아니라 과실 파리, 제브라피쉬 및 마우스와 같은 전체 유기체의 생체 내에서 게놈 편집을 수행하기 위한 간단하고 효율적인 방법의 기초로서 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다 ([Wang et al., Cell 153, 910-918 (2013)]; [Shen et al., Cell Res (2013)]; [Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013)]; [Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)]; [Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013)]; [Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013)]; [Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)]; [Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c)]; [Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013)]; [Gratz et al., Genetics 194(4):1029-35 (2013)]). 에스. 피오게네스(S. pyogenes)의 Cas9 뉴클레아제 (이하 간단히 Cas9)는 조작된 가이드 RNA (gRNA), 예를 들어 단일 가이드 RNA 또는 crRNA/tracrRNA 쌍의 17-20개 뉴클레오티드 사이의 간단한 염기쌍 상보성, 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM), 예를 들어 서열 NGG 또는 NAG와 일치하는 PAM의 옆에 위치하는 관심 표적 게놈 DNA 서열의 상보성 가닥을 통해 안내될 수 있다 ([Shen et al., Cell Res (2013)], [Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013)]; [Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)]; [Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013)]; [Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013)]; [Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)]; [Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c)]; [Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013)]; [Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)]).
일부 실시양태에 있어서, 본 시스템은 박테리아에서 코딩되거나 또는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 에스. 피오게네스 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 야생형 또는 변이체 Cas9 단백질을 이용한다. 가이드 RNA는 Cas9와 함께 세포 내에서 발현된다. 가이드 RNA 또는 뉴클레아제 중 하나 또는 둘 모두가 세포 내에서 일시적으로 또는 안정하게 발현될 수 있다.
TAL 이펙터 반복 어레이
크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아의 TAL 이펙터는 숙주 DNA에 결합하고 이펙터-특이적 숙주 유전자를 활성화함으로써 질병에서 중요한 역할을 수행하거나 방어를 촉발한다. 특이성은 이펙터-불완전한, 전형적으로 ~33-35 아미노산 반복부의 수에 의존한다. 다형성은 주로 반복 위치 12 및 13에 존재하고, 이들은 본원에서 반복 가변-2잔기 (RVD)로 언급된다. TAL 이펙터의 RVD는, 일부 축퇴성을 보이고 분명한 컨텍스트 (context) 의존성이 없는 상태에서 직접적인 선형 방식으로 그의 표적 부위 내의 뉴클레오티드에 대응하고, 여기서 한 RVD는 하나의 뉴클레오티드에 존재한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 특이성을 부여하는 다형성 영역은 3잔기 또는 3중체로 표현될 수 있다.
각각의 DNA 결합 반복부는 표적 DNA 서열에서 염기쌍의 인식을 결정하는 RVD를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 DNA 결합 반복부는 표적 DNA 서열에서 하나의 염기쌍 인식을 책임진다. 일부 실시예에서, RVD는 C를 인식하기 위한 HA; C를 인식하기 위한 ND; C를 인식하기 위한 HI; G를 인식하기 위한 HN; G를 인식하기 위한 NA; G 또는 A를 인식하기 위한 SN; T를 인식하기 위한 YG; G를 인식하기 위한 NK 중 하나 이상, 및 C를 인식하기 위한 HD; T를 인식하는 NG; A를 인식하기 위한 NI; G 또는 A를 인식하기 위한 NN; A 또는 C 또는 G 또는 T를 인식하기 위한 NS; C 또는 T를 인식하기 위한 N* (*는 RVD의 제2 위치에서의 갭을 나타냄); T를 인식하기 위한 HG; T를 인식하기 위한 H* (*는 RVD의 제2 위치에서의 갭을 나타냄); 및 T를 인식하기 위한 IG 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
TALE 단백질은 게놈 조작에서 상동성 재조합을 촉진할 수 있는 표적화된 키메라 뉴클레아제로서 (예를 들어, 식물에서 바이오 연료 또는 생체재생가능 물질에 유용한 형질을 추가하거나 향상시키기 위해) 연구 및 생명공학 분야에서 유용할 수 있다. 이들 단백질은 또한 예를 들어 전사 인자로서, 특히 비-제한적인 예로서 병원체 (예를 들어, 바이러스)에 대한 치료제와 같은 매우 높은 수준의 특이성을 필요로 하는 치료 용도에 유용할 수 있다.
조작된 TALE 어레이를 생성하는 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어, USSN 61/610,212 및 문헌 [Reyon et al., Nature Biotechnology 30,460-465 (2012)]에 기재된 고속 라이게이션 기반 자동화가능 고상 고처리량 (FLASH) 시스템; 및 문헌 [Bogdanove & Voytas, Science 333, 1843-1846 (2011)]; [Bogdanove et al., Curr Opin Plant Biol 13, 394-401 (2010)]; [Scholze & Boch, J. Curr Opin Microbiol (2011)]; [Boch et al., Science 326, 1509-1512 (2009)]; [Moscou & Bogdanove, Science 326, 1501 (2009)]; [Miller et al., Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011)]; [Morbitzer et al., T. Proc Natl Acad Sci USA 107, 21617-21622 (2010)]; [Morbitzer et al., Nucleic Acids Res 39, 5790-5799 (2011)]; [Zhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)]; [Geissler et al., PLoS ONE 6, e19509 (2011)]; [Weber et al., PLoS ONE 6, e19722 (2011)]; [Christian et al., Genetics 186, 757-761 (2010)]; [Li et al., Nucleic Acids Res 39, 359-372 (2011)]; [Mahfouz et al., Proc Natl Acad Sci USA 108, 2623-2628 (2011)]; [Mussolino et al., Nucleic Acids Res (2011)]; [Li et al., Nucleic Acids Res 39, 6315-6325 (2011)]; [Cermak et al., Nucleic Acids Res 39, e82 (2011)]; [Wood et al., Science 333, 307 (2011)]; [Hockemeye et al. Nat Biotechnol 29, 731-734 (2011)]; [Tesson et al., Nat Biotechnol 29, 695-696 (2011)]; [Sander et al., Nat Biotechnol 29, 697-698 (2011)]; [Huang et al., Nat Biotechnol 29, 699-700 (2011)]; 및 [Zhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)]에 기재된 방법을 참조하고; 상기 문헌은 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
아연 핑거
아연 핑거 단백질은 하나 이상의 아연 핑거, 독립적으로 폴딩된 아연 함유 미니 도메인을 포함하는 DNA 결합 단백질이고, 그 구조는 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Miller et al., 1985, EMBO J., 4:1609]; [Berg, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:99]; [Lee et al., 1989, Science. 245:635]; 및 [Klug, 1993, Gene, 135:83]에 규정되어 있다. DNA에 결합된 아연 핑거 단백질 Zif268 및 그의 변이체의 결정 구조는 반-보존된 상호작용 패턴을 보여 주고, 여기서 아연 핑거의 알파 나선으로부터 일반적으로 3개의 아미노산이 3개의 인접한 염기쌍 또는 DNA 내의 하위부위와 접촉한다 ([Pavletich et al., 1991, Science, 252:809], [Elrod-Erickson et al., 1998, Structure, 6:451]). 따라서, Zif268의 결정 구조는 아연 핑거 DNA 결합 도메인이 아연 핑거와 DNA 서열 내의 3 염기쌍의 "하위부위" 사이의 일대일 상호작용을 통해 모듈 방식으로 기능할 수 있음을 시사하였다. 천연 생성 아연 핑거 전사 인자에서, 다중 아연 핑거는 전형적으로 인접 DNA 서열의 서열 특이적 인식을 달성하기 위해 직렬 배열로 함께 연결된다 (Klug, 1993, Gene 135:83).
여러 연구는 DNA 결합에 관여하는 알파-나선 위치에서 아미노산을 무작위 선발하고 파지 디스플레이와 같은 선택 방법을 사용하여 관심 DNA 표적 부위에 결합할 수 있는 원하는 변이체를 확인함으로써 개별 아연 핑거의 DNA 결합 특성을 인위적으로 조작할 수 있음을 제시하였다 ([Rebar et al., 1994, Science, 263:671], [Choo et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163], [Jamieson et al., 1994, Biochemistry 33:5689]; [Wu et al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 344]). 상기 재조합 아연 핑거 단백질은 유전자 발현을 조절하고, DNA 메틸화를 변경하고, 모델 유기체, 식물 및 인간 세포의 게놈 내로 표적화된 변형을 도입하기 위해 전사 활성화인자, 전사 억제인자, 메틸화 도메인 및 뉴클레아제와 같은 기능성 도메인에 융합될 수 있다 ([Carroll, 2008, Gene Ther., 15:1463-68], [Cathomen, 2008, Mol. Ther., 16:1200-07], [Wu et al., 2007, Cell. Mol. Life Sci., 64:2933-44]).
"모듈형 어셈블리 (modular assembly)"로 알려진 아연 핑거 어레이를 조작하기 위한 기존의 방법 중 하나는 사전 선택된 아연 핑거 모듈을 함께 어레이로 간단하게 연결하는 것을 지지한다 ([Segal et al., 2003, Biochemistry, 42:2137-48]; [Beerli et al. 2002, Nat. Biotechnol, 20:135-141]; [Mandell et al., 2006, Nucleic Acids Res., 34:W516-523], [Carroll et al., 2006, Nat. Protoc. 1:1329-41]; [Liu et al., 2002, J. Biol. Chem., 277:3850-56], [Bae et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:275-280], [Wright et al., 2006, Nat. Protoc., 1:1637-52]). 임의의 연구자에 의해 실행될 수 있을 만큼 간단하지만, 최근 보고서는 특히 아연 핑거 뉴클레아제의 측면에서 상기 방법의 높은 실패율 ([Ramirez et al., 2008, Nat. Methods, 5:374-375], [Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88]), 제시된 표적 유전자에 대해 매우 많은 아연 핑거 단백질의 구축 및 세포 기반 시험을 전형적으로 필요로 하는 한계 (Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88)를 제시하였다.
무작위 선정 라이브러리로부터 아연 핑거 어레이를 확인하는 조합 선택 기반 방법은 모듈형 어셈블리보다 성공률이 더 높은 것으로 밝혀졌다 ([Maeder et al., 2008, Mol. Cell, 31:294-301], [Joung et al., 2010, Nat. Methods, 7:91-92], [Isalan et al., 2001, Nat. Biotechnol., 19:656-660]). 바람직한 실시양태에서, 아연 핑거 어레이는 WO 2011/017293 및 WO 2004/099366에 기재되어 있거나, 이들에 기재된 바와 같이 생성된다. 추가의 적합한 아연 핑거 DBD는 미국 특허 6,511,808, 6,013,453, 6,007,988 및 6,503,717, 및 미국 특허 출원 공개 2002/0160940에 기재되어 있다.
세포
본원에 기재된 방법은 게놈 DNA에서 DSB를 복구할 수 있는 임의의 세포에서 사용될 수 있다. 진핵 세포에서 2개의 주요 DSB 복구 경로는 상동성 재조합 (HR) 및 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)이다. 바람직하게는, 상기 방법은 NHEJ가 가능한 세포에서 수행된다. NHEJ 활성을 검출하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있고; NHEJ 정규 및 대체 경로의 검토를 위해, 문헌 [Liu et al., Nucleic Acids Res. Jun 1, 2014; 42(10):6106-6127]을 참조한다.
서열결정
본원에서 사용되는 바와 같이, "서열결정"은 핵산의 서열을 결정하는 임의의 방법을 포함한다. 쇄 종결자 (생어) 서열결정 및 염료 종결자 서열결정을 포함하는 임의의 서열결정 방법이 본 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수천 개 또는 수백만 개의 서열결정 반응을 동시에 수행하는 고처리량 서열결정 기술인 차세대 서열결정 (NGS)이 사용된다. 다른 NGS 플랫폼은 다양한 검정 화학을 사용하지만, 이들은 모두 매우 많은 주형에서 동시에 실행되는 매우 많은 서열결정 반응으로부터 서열 데이타를 생성한다. 전형적으로, 서열 데이타는 스캐너를 사용하여 수집되고, 생물 정보학 방식으로 모으고 분석된다. 따라서, 서열결정 반응은 동시에 수행되고, 판독되고, 모으고, 분석된다. 예를 들어, US 20140162897 및 문헌 [Voelkerding et al., Clinical Chem., 55:641-658, 2009]; 및 [MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7:287-296 (2009)]을 참조한다. 일부 NGS 방법은 주형 증폭이 필요하고, 일부는 그렇지 않다. 증폭을 필요로 하는 방법은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) (예를 들어, 로슈 (Roche)에 의해 상업화된 미국 특허 6,210,89 및 6,258,568 참조); 솔렉사(Solexa)/일루미나(Illumina) 플랫폼 (예를 들어, 미국 특허 6,833,246, 7,115,400 및 6,969,488 참조); 및 지원된 올리고뉴클레오티드 라이게이션 및 검출 (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLiD)) 플랫폼 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems); 예를 들어, 미국 특허 5,912,148 및 6,130,073 참조)을 포함한다. 증폭을 필요로 하지 않는 방법, 예를 들어 단일 분자 서열결정 방법은 나노포어 서열결정, 헬리스코프(HeliScope) (미국 특허 7,169,560, 7,282,337, 7,482,120, 7,501,245, 6,818,395, 6,911,345 및 7,501,245); 합성에 의한 실시간 서열결정 (예를 들어, 미국 특허 7,329,492 참조); 제로-모드 도파로 (ZMW)를 이용한 단일 분자 실시간 (SMRT) DNA 서열결정 방법; 및 미국 특허 7,170,050; 7,302,146; 7,313,308; 및 7,476,503에 기재된 것을 포함하는 다른 방법들을 포함한다. 예를 들어, US 20130274147; US20140038831; [Metzker, Nat Rev Genet 11(1): 31-46 (2010)]을 참조한다.
대안적으로, 혼성화-기반 서열결정 방법 또는 다른 고처리량 방법, 예를 들어 마이크로어레이 분석, 나노스트링 (NANOSTRING), 일루미나 (ILLUMINA), 또는 다른 서열결정 플랫폼이 사용될 수도 있다.
실시예
본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 다음의 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예 1.
초기 실험에서, dsODN 카세트를 뉴클레아제-유도된 이중 가닥 절단 (DSB)에 통합시키는 과정이 최적화되었다. 이전에 발표된 실험은 5' 말단에서 2개의 포스포로티오에이트 연결 변형을 보유하는 dsODN이 포유동물 세포에서 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)로 유도된 DSB 내에 포획될 수 있음을 입증하였다 (Orlando et al., Nucleic Acids Res. 2010 Aug;38(15):e152). 그러나, 매우 낮은 빈도의 DSB를 확인하기 위해 상기 ssODN의 포획을 사용하기 위해, dsODN의 특성을 최적화하여 상기 절단 내로의 그의 포획 비율을 향상시켰다. 초기 노력은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) RNA-가이드 뉴클레아제 Cas9에 의해 유도된 DSB 내로의 dsODN 포획에 집중되었다. Cas9는 평활 말단을 갖는 DSB를 유도하는 것으로 보고되었고, 따라서 dsODN 변이체는 평활 말단으로 설계되었다. 최적화 실험은 두 5' 말단의 인산화 및 두 3' 말단 (5' 말단 상의 것 이외에)에서의 2개의 포스포로티오에이트 연결의 도입이 dsODN의 Cas9-유도된 DSB 내로의 포획 비율을 실질적으로 증가시킨다는 것을 보여 주었다 (도 1a-b). 생어 서열결정을 통해, dsODN이 이 특정한 DSB 내로 성공적으로 포획되었음을 확인하였다 (도 2a-b).
dsODN이 Cas9-유도된 DSB 내에 효율적으로 통합될 수 있음을 확인한 후, 다음 실험은 차세대 심층 서열결정 방법이 포유동물 세포의 게놈에서 dsODN 통합 부위를 포획, 증폭 및 확인하기 위해 사용될 수 있는지의 여부를 결정하고자 하였다. 이를 위해, 2개의 PCR 프라이머 결합 부위 (각각의 가닥에 하나씩)를 포함하는 34 bp dsODN을 이용하였고, 이들 서열은 이들이 인간 게놈과 각각 이종상동성이기 때문에 선택되었다.
사용된 dsODN의 서열은 표 1에 제시된다.
<표 1>
Figure 112017005617270-pct00001
/5Phos/는 5' 인산화를 나타낸다.
*는 인접 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
이 dsODN은 Cas9를 코딩하는 플라스미드, 및 각각 상이한 내인성 인간 유전자 서열 (EMX1 및 VEGFA 부위 1, 2 및 3)을 표적으로 하는 4개의 상이한 표적-특이적 gRNA 중 하나와 함께 인간 U2OS 세포 내로 형질감염시켰다. 상기 4개의 특정 gRNA는 진정한 표적-이탈 부위가 이전에 그 각각에 대해 확인되었기 때문에 선택되었다 (Fu et al., Nat Biotechnol. 2013; 표 1). 형질감염은 다음과 같이 수행하였다: dsODN을 각각 100 μM의 농도로 STE (100 mM Tris HCl, 500 mM NaCl, 10 mM EDTA)에서 어닐링하였다. U2OS 세포의 경우, 500 ng의 Cas9 발현 플라스미드, 250 ng의 gRNA 발현 플라스미드 및 100 pmol의 dsODN을 사용하여 2E5 세포를 용액 SE 및 프로그램 DN-100으로 뉴클레오펙션시켰다.
게놈 DNA를 형질감염 3일 후에 수거하고 (아젠코트 암퓨어 (Agencourt Ampure) XP), PCR 기반 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 검정을 사용하여, dsODN이 dsODN에서 코딩되는 제한 부위의 존재를 기초로 하여 상기 세포의 표적-적중 부위 내로 효율적으로 통합되었음을 확인하였다.
형질감염된 세포의 게놈에서 dsODN 통합 위치를 종합적으로 확인하기 위해, 이러한 삽입 부위를 선택적으로 증폭하고 차세대 서열결정 기술을 사용하여 이들의 서열을 분석할 수 있도록 하는 PCR 기반 방법을 사용하였다. 전략의 일반적인 개요는 도 3에 제시된다. 게놈 DNA는 코바리스 (Covaris) 어댑티브 포커스트 어쿠스틱 (Adaptive Focused Acoustic) (AFA) 초점형 초음파기를 사용하여 500 bp의 평균 길이로 전단되었다. 전단된 gDNA는 말단 복구되고 (엔자이매틱스 (Enzymatics)), A 꼬리가 형성되고 (엔자이매틱스), 반-기능적 서열결정 어댑터 (US 20130303461)를 전단된 DNA의 말단에 라이게이션시켰다 (엔자이매틱스). 고상 가역적 고정 (Solid Phase Reversible Immobilization; SPRI) 자기 비드 세정을 사용하여 상기 각각의 효소 단계 (아젠코트 XP)를 세정하였다.
이어서, dsODN 서열을 보유하는 DNA 단편을 서열결정 어댑터에 어닐링하는 프라이머와 함께 dsODN에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭하였다. dsODN 내에 2개의 잠재적인 프라이밍 부위가 있기 때문에 (위에서 언급한 바와 같이 각각의 가닥에 하나씩), 2개의 독립적인 PCR 반응을 수행하여 다음과 같이 원하는 서열을 선택적으로 증폭하였다.
표적화 서열결정 라이브러리를 생성하기 위해 네스티드 PCR을 2회 수행하였다. 통합 dsODN에 상보성인 프라이머 (프라이머 A) 및 범용 어댑터에 상보성인 프라이머 (프라이머 B)를 사용하여 제1 라운드의 PCR을 수행하였다. 서열결정을 위해 준비된 '완전한' 분자를 만들기 위해 유동 세포 결합 서열 및 무작위 분자 인덱스를 추가하는, 프라이머 A에 상보성인 3' 네스티드 프라이머 (프라이머 C), 프라이머 B에 상보성인 3' 네스티드 프라이머 (프라이머 D) 및 프라이머 D에 상보성인 프라이머 (프라이머 E)를 사용하여 제2 라운드의 PCR을 수행하였다. SPRI 자기 비드는 PCR의 각 라운드를 세정하기 위해 사용되었다 (아젠코트 암퓨어 XP).
이 방법에 의한 dsODN-함유 게놈 서열의 증폭은 서열결정 어댑터가 게놈 DNA의 무작위 공유에 의해 유도된 절단부에 라이게이션되기 때문에 삽입 지점의 바로 측면에 인접한 서열에 의존하지 않고 편향되지도 않는다. 차세대 서열결정 어댑터 서열 및 dsODN에 가장 가까운 말단 상의 인덱싱 바코드를 추가하여, 차세대 서열결정을 위해 준비된 단편의 라이브러리를 만들기 위해 추가 라운드의 PCR을 수행하였다. 상기 일반적인 방법은 서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인을 위한 GUIDE-Seq로서 본원에서 언급된다.
GUIDE-Seq을 사용하여 구축된 라이브러리의 심층 서열결정은 dsODN이 4개의 동시발현된 gRNA/Cas9 뉴클레아제 각각의 존재 하에 삽입된 넓은 범위의 게놈 유전자좌를 밝혀냈다. 심층 서열결정 원데이타를 분석할 때, 진정한 삽입 부위가 두 방향 모두에서 적어도 하나의 판독에 의해 커버된 게놈 유전자좌로서 확인될 수 있다고 추론되었다. dsODN이 어느 방향으로나 삽입될 수 있고 dsODN 서열 내의 하나의 가닥 또는 다른 가닥에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭이 수행되기 때문에, 양방향으로의 판독이 가능하였다. 조사된 4개의 gRNA에 대해 상기 기준을 충족시킨 총 465개의 게놈 유전자좌가 확인되었다. 이 465개의 유전자좌의 36%에 대해, 사용된 gRNA의 표적-적중 부위와 유사하고 표적-적중 부위에 비해 6개의 미스매치를 보유하는, 삽입 지점의 25 bp 이내의 서열도 확인되었다 (도 4a-e). 이 방법은 또한 여기서 조사된 4종의 gRNA 모두에 대해 이전에 공지된 모든 진정한 표적-이탈 부위뿐만 아니라 이전에 알려지지 않은 많은 표적-이탈 부위를 성공적으로 발견하였다 (도 4에 도시된 이전에 알려진 모든 표적-이탈 부위는 문헌 [Fu et al., Nat Biotechnol. 2013]의 표 1에 제시됨).
실시예 2.
맞춤형 CRISPR-Cas RNA-가이드 뉴클레아제 (RGN)는 넓은 범위의 연구 및 잠재적인 임상 적용시에 강력한 맞춤형 게놈 편집 시약이지만1 , 2; 인간에서 RGN의 치료 목적의 사용은 해로운 결과의 위험을 최소화하기 위해 그의 표적-이탈 효과에 대한 충분한 지식을 요구할 것이다. 에스. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제에 의한 DNA 절단은 프로그램 가능한 ~100 nt 가이드 RNA (gRNA)에 의해 지시된다3. 표적화는 형태 5'-NGG의 프로토스페이서 인접 모티브 (PAM) 옆에 존재하는 "프로토스페이서" DNA 부위에 상보성인, gRNA 5'-말단의 17-20 nt에 의해 매개된다. 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의한 프로토스페이서 내의 Cas9 유도 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)의 복구는 가변 길이 삽입/결실 돌연변이 (indel)를 유도할 수 있다. 본 발명자들의 그룹 및 다른 연구자들은 의도하지 않은 RGN 유도 indel이 프로토스페이서 내의 5개의 위치만큼 많이 상이하거나 또는 대체 PAM 서열이 있는 표적-이탈 절단 부위에서 발생할 수 있음을 이전에 보여주었다4 - 7. 염색체 전위는 표적-적중 및 표적-이탈 RGN-유도된 절단 사건의 연결에 의해 발생할 수 있다8 - 11. 임상 적용을 위해, RGN을 이용한 생체 외 및 생체 내 치료 전략은 매우 큰 세포 집단의 변형을 필요로 할 것으로 예상되기 때문에, 훨씬 낮은 빈도의 변경의 확인이 매우 중요할 것이다. 세포 클론의 심지어 희소한 하위 집합에서의 발암성 변형 (예를 들어, 종양 억제 유전자의 돌연변이의 불활성화 또는 종양 형성 염색체 전위의 형성)의 유도는 상기 변화가 불리한 임상 결과로 이어질 수 있기 때문에 특히 중요하다.
게놈의 어느 곳에서나 일어날 수 있는 indel 또는 고차원의 게놈 재배열의 포괄적인 확인은 쉽게 해결할 수 없는 도전이고, 불행하게도 살아있는 세포에서 RGN에 의해 유도된 표적-이탈 돌연변이의 비편향된, 게놈 전체에 걸친 확인을 위한 민감한 방법은 아직 설명된 바 없다12 , 13. 전체 게놈 재-서열결정은 편집된 단일 세포 클론에서 RGN 표적-이탈 변경을 확인하기 위한 시도에서 사용되었지만14 , 15, 매우 많은 수의 게놈을 서열결정하는 데 드는 많은 비용 때문에, 이 방법은 세포 집단에서 저빈도 사건를 찾는 데 비실용적이다12. 본 발명자들 및 다른 연구자들은 표적-이탈 부위에 대한 서열 유사성에 의해4 , 5 또는 부분적으로 축퇴된 결합 부위 라이브러리로부터의 시험관내 선택에 의해6 확인된 잠재적인 표적-이탈 부위에서 indel 돌연변이를 확인하기 위해 초점을 맞춘 심층 서열결정을 사용하였다. 그러나, 이러한 방법은 표적-이탈 서열의 특성에 대해 가정하고, 따라서 게놈 내의 다른 위치에서의 다른 돌연변이 부위를 놓칠 수 있다. ChIP-Seq은 또한 촉매적으로 사멸된 Cas9 (dCas9)와 복합체를 형성한 gRNA에 대한 표적-이탈 결합 부위를 확인하기 위해 사용되어 왔지만, 대부분의 발표된 연구는 존재할 경우에도 이들 부위 중 매우 적은 부위가 활성 Cas9 뉴클레아제에 의한 표적-이탈 절단 부위를 나타냄을 시사한다16 -19.
여기서, 본 발명자들은 살아있는 인간 세포에서 10개의 상이한 RGN에 대한 최초의 전체적인 특이성 배치를 생성할 수 있도록 하는 서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸쳐 비편향된 확인 (Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Evaluated by Sequencing; GUIDE-Seq)을 위한 새로운 방법의 개발을 설명한다. 이 프로파일은 표적-이탈 DSB의 총수가 개별 RGN에 대해 광범위하게 다양함을 보여주고, 에스. 피오게네스 또는 다른 종으로부터의 RGN의 특이성에 대한 광범위한 결론은 소수의 gRNA가 아닌 대규모 조사를 기초로 해야 한다고 제안하였다. 본 발명자들의 발견은 또한 표적-이탈 효과가 발생할 수 있는 서열의 범위 및 특성을 확장하였다. 직접 비교에 의해, GUIDE-Seq은 널리 사용되는 2개의 컴퓨터 이용 방식 및 RGN 표적-이탈 부위를 확인하기 위한 ChIP-Seq 방법보다 상당히 더 우수함이 입증되었다. 예기치 않게, GUIDE-Seq은 또한 전위와 같은 고차원 게놈 변형에서 RGN-유도 DSB와 함께 참여할 수 있는 RGN-비의존성 DNA 절단점 핫스팟을 확인하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 직접 비교에서 gRNA의 상보성 영역의 말단 절단이 게놈 전체에 걸친 표적-이탈 DSB 프로파일을 크게 개선함을 제시하고, 이것은 RGN 특이성을 개선하기 위해 설계된 발전을 평가하기 위한 GUIDE-Seq의 유용성을 입증한다. 여기에 개요가 설명된 실험은 RGN의 특이성뿐만 아니라, 치료 용도로 고려될 수 있는 플랫폼에 대한 임의의 개선 사항을 평가하기 위해 지금까지 설명된 가장 엄격한 전략을 제공한다.
방법
본 실시예에서는 하기 물질 및 방법을 사용하였다.
인간 세포 배양 및 형질감염
U2OS 및 HEK293 세포를 10% FBS, 2 mM 글루타맥스 (GlutaMax) (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies)), 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 어드밴스트 (Advanced) DMEM (라이프 테크놀로지스)에서 37℃에서 5% CO2 하에 배양하였다. U2OS 세포 (프로그램 DN-100) 및 HEK293 세포 (프로그램 CM-137)를 제조사의 지시에 따라 론자 뉴클레오펙터 (Lonza Nucleofector) 4-D에서 20 ㎕ 용액 SE 내에서 형질감염시켰다. dsODN 통합 비율은 NdeI을 사용하여 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 검정에 의해 평가하였다. 절단 생성물을 이전에 설명된 바와 같이 퀴악셀 모세관 전기영동 기기 (퀴아젠 (Qiagen))로 이동시키고 정량하였다 (Tsai et al., Nat. Biotechnol 32, 569-576 (2014)).
GUIDE-Seq을 위한 게놈 DNA 단리 및 준비
게놈 DNA는 고상 가역 고정화 자성 비드 (아젠코트 DNAdvance)를 사용하여 단리하고, 코바리스 S200 초음파 분해기로 500 bp의 평균 길이로 전단하고, 말단을 복구하고, A-꼬리를 형성시키고, 8-nt 무작위 분자 인덱스를 포함하는 반-기능적 어댑터에 라이게이션시켰다. 올리고 태그에 상보성인 프라이머를 사용하여 2 라운드의 네스티드 고정 PCR을 표적 풍부화를 위해 사용하였다. 예시적인 GUIDE-Seq 프로토콜의 완전히 상세한 내용은 본 명세서에서 볼 수 있다.
서열결정 판독의 처리 및 통합
서열의 동일한 6개의 처음 염기 서열 및 동일한 8-nt 분자 인덱스를 공유하는 판독은 이들이 동일한 본래의 프리-PCR 주형 단편에서 유래한 것으로 가정되기 때문에 함께 비닝(binning)되었다. 상기 판독은 각각의 위치에서 다수의 염기를 선택하여 단일 컨센서스 판독으로 통합되었다. 10% 초과의 불일치 판독이 있는 상황에서는 비판정 (no call) (N) 염기가 지정되었다. 염기 품질 점수는 사전 통합 판독 중 가장 높은 것으로 간주되었다. 통합된 판독은 BWA-MEM (Li and Durbin, Bioinformatics 26, 589-595 (2010))을 사용하여 인간 게놈 참조물 (GrCh37)에 맵핑되었다.
표적-이탈 절단 부위의 확인
맵핑 품질이 50 이상인 판독에 대한 출발 맵핑 위치를 표로 나타내었고, 근처에 출발 맵핑 위치가 있는 영역을 10 bp 슬라이딩 윈도우를 사용하여 분류하였다. 통합된 dsODN를 보유하는 게놈 윈도우는 다음 기준 중 하나에 의해 확인되었다: 1) 참조 서열에서 반대 가닥에 맵핑되는 2개 이상의 특유한 분자 인덱스 판독 또는 2) 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 증폭된 2개 이상의 특유한 분자 인덱스 판독. 추정된 절단점의 양 측면에 인접하는 25 bp의 참조 서열을 의도된 표적 부위에 정렬시키고, 의도된 표적 서열로부터 8개 이하의 미스매치를 갖는 RGN 표적-이탈 부위를 호출하였다. SNP 및 indel은 분자 인덱스 및 SAM툴을 기초로 한 맞춤 빈-컨센서스 변이체-호출 알고리즘에 의해 이들 위치에서 호출되었고, 참조 서열과 다른 표적-이탈 서열은 대응하는 세포-특이적 서열로 교체되었다.
AMP-기반 서열결정
GUIDE-Seq 검출된 DSB의 AMP 검증을 위해, 프라이머는 8-nt 분자 지수를 추가하여, 이전에 설명된 바와 같이 추정된 이중 가닥 절단점에 인접한 영역으로 설계되었다 (Zheng, Z. et al., Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nat Med 2014 Nov. 10. doi: 10.1038/nm.3729 (2014)). 가능한 경우, 본 발명자들은 각각의 DSB에 인접하도록 2개의 프라이머를 설계하였다.
AMP 검증 데이타의 분석
평균 품질 평가 점수가 30 초과인 판독은 파이톤(Python)을 사용하여 GUIDE-Seq 추정 DSB 위치와 겹치는 삽입, 결실 및 통합에 대해 분석되었다. 1-bp indel은 PCR 또는 서열결정 오류로 인한 노이즈의 도입을 최소화하기 위해 예측된 DSB 부위의 1-bp 내에 존재하는 경우에만 포함되었다. 통합 및 indel 빈도는 통합된 분자 인덱스화된 판독을 기초로 하여 계산되었다.
구조 변형
전위, 대량 결실 및 역위는 분할된 BWA-MEM 정렬을 기초로 한 맞춤 알고리즘을 사용하여 확인되었다. 동일한 염색체 상의 50개 염기 내의 후보 융합 절단점을 Cas9 절단 부위 주위의 잠재적인 절제를 수용하기 위해 분류하였다. 융합 사건는 세게멜 (segemehl) 도구 (Hoffmann, Genome biology, 2014)에 의해서도 사용되는 파라미터인 적어도 3개의 특유하게 맵핑된 분할 판독으로 호출되었다. 2개의 관련 DSB 사이의 상호 융합을 확인하고 결실 또는 역위를 결정하기 위해 맵핑 가닥성 (mapping strandedness)을 유지하였다. 1 kb 염색체 위치 내의 융합 관련 DSB는 단일 Cas9 절단으로 인한 큰 indel의 고려를 위해 폐기되었다. 나머지 융합 DSB는 다음과 같은 4가지의 범주로 분류되었다: GUIDE-seq를 기초로 한 '표적-적중', '표적-이탈' 또는 '배경', 또는 '기타'.
GUIDE- Seq 및 ChIP - Seq 및 인 실리코 (in silico ) 예측에 의해 검출된 부위의 비교
본 발명자들은 MIT CRISPR 설계 도구를 사용하여 10개의 모든 RGN에 대해 잠재적인 표적-이탈 부위를 확인하였다. 이 도구는 각각의 잠재적인 표적-이탈 부위에 대응하는 백분위수를 지정한다. 이어서, 본 발명자들은 상기 백분위수를 시각화를 위해 5분위수로 분류하였다. E-CRISP 도구는 표적-이탈을 평가하지 않기 때문에, 본 발명자들은 E-CRISP에 의해 정확하게 예측된 GUIDE-seq 표적-이탈을 간단하게 발견하였다. 상기 GUIDE-Seq 대 인 실리코 예측 둘 모두에 대해, 본 발명자들은 인 실리코 방법으로 예측되지 않은 GUIDE-Seq 결과를 MIT 도구 (최대 4) 및 E-CRISPR의 범위 내의 미스매치 수 (최대 3개)를 갖는 표적-이탈 및 상기 예측 도구의 임계값보다 큰 미스매치 수를 갖는 것으로 분리하였다. GUIDE-Seq 표적-이탈과 ChIP-Seq 예측을 비교할 때, ChIP-Seq에 의해 정확하게 예측된 GUIDE-Seq 표적-이탈을 찾기 위해 동일한 기술이 사용되었다. 이러한 각각의 비교를 위해, 정확하고 부정확하게 예측된 RGN 표적-이탈의 특성을 더 잘 규명하기 위해 만들어진 모든 분류군을 표적-이탈 미스매치 수로 세분하였다.
미스매치 , DNA 접근성 및 국소 PAM 밀도가 표적-이탈 절단 비율에 미치는 영향의 분석
본 발명자들은 4개 이하의 미스매치가 있는 잠재적인 표적-이탈 부위에서 추정된 절단 비율에 적합한 선형 회귀 모델을 사용하여 미스매치 위치, 미스매치 종류 및 DNA 접근가능성이 특이성에 미치는 영향을 평가하였다. 미스매치 위치 공변량은 PAM 상류의 각각의 5개의 중첩되지 않는 4-bp 윈도우 내의 미스매치된 염기의 수로 정의되었다. 미스매치 종류 공변량은 i) 워블 쌍형성 (표적 T는 C로 교체되고, 표적 G는 A로 교체 됨), ii) 비-워블 퓨린-피리미딘 염기-쌍형성 (표적 C는 T로 교체되고, 표적 A는 G로 교체됨), 및 iii) 퓨린-퓨린 또는 피리미딘-피리미딘 쌍형성을 생성하는 미스매치의 수로서 정의되었다.
3개의 요소는 각각 log2(1 + GUIDE-Seq 판독 수)에 의해 추정되는 상대 절단 비율의 예측자로서 별개의 모델에 사용되었다. 효과 크기 추정치는 표적 부위간 변동성에 맞게 조정되었다. 각각의 인자에 의해 설명된 부위내 절단 비율 변동성의 비율은 회귀 제곱합 (SS)을 기초로 하여 부분 에타-제곱 통계에 의해 평가되었다: η2 P = SS인자/(SS인자 + SS오류). 단일-인자 모델에 추가로, 본 발명자들은 표적-이탈 절단 확률에 대한 그의 독립적인 기여도를 평가하기 위해 1 kb 윈도우에 3개의 인자, 발현 수준 및 PAM 밀도를 모두 포함하는 조합된 선형 회귀 모델을 적합하게 만들었다.
실온에서 Guide-seq 라이브러리 제제 보관을 위한 예시적인 시약 및 장비
품목 납품업자
코바리스 S220 마이크로튜브 코바리스
에탄올, 200-프루프 (100%) 시그마 알드리치
마이크로앰프(MicroAmp) 광학 96웰 플레이트 어플라이드 바이오시스템즈
뉴클레아제-미함유 H2O 프로메가
큐빗(Qubit) 검정 튜브, 500개 튜브/팩 인비트로젠
큐빗 dsDNA BR 키트 - 500회 검정 인비트로젠
TMAC 완충제, 5M 시그마 알드리치
- 테트라메틸암모늄 클로라이드
1X TE 완충제/10 mM Tris-HCl, pH 8.0 인비트로젠
울트라퓨어(UltraPure) 0.5 M EDTA, 라이프 테크놀로지스
pH 8.0 (깁코(Gibco)) (4x100 mL)
4℃에서 보관
품목 납품업자
아젠코트 AMPure XP 비드 - 60 mL 베크만 코울터
-20℃에서 보관
품목 카탈로그 #
25 mM dNTP 용액 혼합물 엔자이매틱스, 인크.
느린 라이게이션 완충제 엔자이매틱스, 인크.
최종 복구 혼합물 (저농도) 엔자이매틱스, 인크.
T4 DNA 리가제 엔자이매틱스, 인크.
- 10X T4 DNA 리가제 완충제 (느린 라이게이션 완충제)
플래티넘(Platinum)® Taq DNA 폴리머라제 라이프 테크놀로지스
-10X PCR 완충제 (MgCl2 미함유)
- 50 mM MgCl2
qPCR 일루미나 라이브러리 정량 키트 카파 바이오시스템즈, 인크.
장비
96-웰 플레이트 마그네틱 스탠드 인비트로젠
큐빗 형광 측정기 2.0 라이프 테크놀로지스
코바리스 S-2 초점형 울트라-소니케이터(Ultra-sonicator)™ 기기 코바리스
탁상용 원심분리기 써모 싸이언티픽
탁상용 볼텍서 써모 싸이언티픽
열 순환기 에펜도르프
Miseq 일루미나
GUIDE-seq 라이브러리 제조를 위한 예시적인 프로토콜
Y 어댑터 제조
Y-어댑터는 Miseq 공통 올리고를 각 샘플 바코드 어댑터 (A01 내지 A16, 표 3 참조)와 어닐링하여 제조된다. 어댑터에는 또한 8-mer NNWNNWNN (N = A, C, T 또는 G, W = A 또는 T) 분자 인덱스를 함유한다.
1X TE 완충제 80.0 ㎕
A## (100 μM) 10.0 ㎕
MiSeq 공통 어댑터_MI (100 μM) 10 . 0 ㎕
총 100.0 ㎕
어닐링 프로그램: 95℃, 1s; 60℃ 1s; 서서히 4℃로 감온 (약 -2℃/분); 4℃에서 유지. -20℃에서 보관.
투입량 정량 및 전단
1. dsDNA를 큐빗으로 정량하고, 400 ng를 1X TE 완충제를 사용하여 120 ㎕의 최종 부피로 만든다.
2. 각각의 샘플은 코바리스 S2의 표준 작동 프로토콜에 따라 500 bp의 평균 길이로 전단한다.
3. 120 ㎕의 AMPure XP SPRI 비드 (1X 비)를 사용한 세정을 제조사 프로토콜에 따라 수행하고, 15 ㎕의 1X TE 완충제에서 용리시킨다.
최종 복구, A-꼬리 형성 및 라이게이션
최종 복구
4. 200 ㎕의 PCR 튜브 또는 96-웰 플레이트 내의 웰에 다음을 첨가한다 (반응당):
뉴클레아제-미함유 H2O 0.5 ㎕
dNTP 혼합물, 5 mM 1.0 ㎕
느린 라이게이션 완충제, 10X 2.5 ㎕
최종 복구 혼합물 (낮은 농도) 2.0 ㎕
Taq 폴리머라제에 대한 완충제, 10X (Mg2+ 미함유) 2.0 ㎕
Taq 폴리머라제 (비-고온 출발) 0.5 ㎕
총 8.5 ㎕
+ DNA 샘플 (이전 단계로부터의) 14.0 ㎕
총 22.5 ㎕
최종 복구 열 순환기 프로그램: 12℃에서 15분, 37℃에서 15분; 72℃에서 15분; 4℃에서 유지.
어댑터 라이게이션
5. 샘플 반응 튜브 또는 웰에 다음 시약을 순서대로 첨가한다 (피펫팅에 의해 혼합한다).
어닐링된 Y 어댑터_MI (10 μM) 1.0 ㎕
T4 DNA 리가제 2.0 ㎕
+ DNA 샘플 (이전 단계로부터의) 22 . 5 ㎕
총 25.5 ㎕
어댑터 라이게이션 열 순환기 프로그램: 16℃에서 30분, 22℃에서 30분; 4℃에서 유지.
6. 0.9X SPRI 세정 (22.95 ㎕ 암퓨어 XP 비드) 후, 12 ㎕의 1X TE 완충제에서 용리시킨다.
PCR
PCR 1 (올리고 태그 프라이머 [발견] 또는 큰 프라이머 풀 [심층-서열결정 검증])
7. 다음 마스터 혼합물을 제조한다.
뉴클레아제-미함유 H2O 11.9 ㎕
Taq 폴리머라제에 대한 완충제, 10X (MgCl2) 3.0 ㎕
dNTP 혼합물, 10 mM 0.6 ㎕
MgCl2, 50 mM 1.2 ㎕
플래티넘 Taq 폴리머라제, 5 U/㎕ 0.3 ㎕
GSP1 프라이머 (10 μM)/프라이머 풀(*) 1.0 ㎕*
TMAC (0.5 M) 1.5 ㎕
P5_1, 10 μM 0.5 ㎕
총 20.0 ㎕
+ DNA 샘플 (단계 6으로부터의) 10.0 ㎕
총 30.0 ㎕
*발견을 위해서, +/(센스) 및 -/(안티센스) 반응을 위한 별도의 마스터 혼합물을 만들고, 별도의 PCR 반응을 진행한다.
*심층 서열결정 확인을 위해, 하나의 마스터 혼합물을 만들 수 있다. 프라이머 풀은 30 ㎕ 반응에서 30 pmol의 총량으로 정규화되어야 한다.
발견 열 순환기 프로그램 (터치 다운):
95℃에서 5분,
[95℃ 30초, 70℃ (-1℃/사이클) 2분, 72℃ 30초]의 15 사이클,
[95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 30초]의 10 사이클,
72℃에서 5분,
4℃에서 유지.
확인 열 순환기 프로그램:
95℃에서 5분,
[95℃ 30초, 65℃까지 20% 감온, 65℃ 5분]의 14 사이클,
72℃에서 5분,
4℃에서 유지.
8. 1.2X SPRI 세정 (36.0 ㎕) 후, 15 ㎕의 1X TE 완충제에서 용리시킨다.
PCR 2 (올리고 태그 프라이머 [발견] 또는 큰 프라이머 풀 [심층-서열결정 확인])
9. 다음 마스터 혼합물을 제조한다.
뉴클레아제-미함유 H2O 5.4 ㎕
Taq 폴리머라제에 대한 완충제, 10X (Mg2 + 미함유) 3.0 ㎕
dNTP 혼합물, 10 mM 0.6 ㎕
MgCl2, 50 mM 1.2 ㎕
플래티넘 Taq 폴리머라제, 5 U/㎕ 0.3 ㎕
GSP2 프라이머 (10 μM)/프라이머 풀(*) 1.0 ㎕
TMAC (0.5 M) 1.5 ㎕
P5_2, 10 μM 0.5 ㎕
총 13.5 ㎕
+ P7_# (10 μM)* 1.5 ㎕
+ 비드가 존재하는 DNA 샘플 (단계 8으로부터의) 15.0 ㎕
총 30.0 ㎕
프라이머 농도는 PCR1에 설명된 내역을 따라야한다.
*P7_#의 경우, 일루미나 서열결정기에서 좋은 이미지 등록을 위해 하나의 서열결정 과정에 적어도 4개 (예를 들어, P701 - P704 또는 P705 - P708)가 사용되어야 한다.
디스커버리 열 순환기 프로그램 (터치 다운):
PCR1과 동일
확인 열 순환기 프로그램:
PCR1과 동일
10. 0.7X SPRI 세정 (21.0 ㎕) 후, 30 ㎕의 1X TE 완충제에서 용리시킨다.
qPCR 및 서열결정에 의한 라이브러리 정량
qPCR 정량
11. 제조사의 지시에 따라 일루미나 라이브러리 정량 키트 (Illumina Library Quantification Kit)에 대해 카파 바이오시스템즈 (Kapa Biosystems) 키트를 사용하여 라이브러리를 정량한다.
정규화 및 서열결정
12. 각각의 샘플에 대한 qPCR에 실행에 의해 얻은 ㎕당 분자의 수의 평균 수량 추정치를 사용하여, 전체 세트의 라이브러리를 1.2 X 1010 분자로 정규화하고 서열결정을 위해 함께 모은 라이브러리의 수로 나눈다. 이것은 각각의 샘플에 대한 분자 투입량, 및 또한 각각의 샘플에 대한 부피 투입량을 제공할 것이다.
한데 모은 후, 라이브러리를 서열결정하기 위해 10 ㎕의 최종 부피로 배큐퓨지(Vacufuge)로 진공 농축 (스피드백(Speedvac)) (건조)한다.
일루미나 Miseq 시약 키트 V2 - 300 사이클 (2 x 150 bp의 쌍형성된 말단)로 서열결정하기 위해 일루미나의 표준 프로토콜에 따라 라이브러리를 변성시키고 Miseq 상에 로딩하되,
1) Miseq 시약 카트리지 위치 13 (인덱스 프라이머 혼합물)에 3 ㎕의 100 μM 맞춤 서열결정 프라이머 인덱스 1을 첨가한다. 3 ㎕의 100 μM 맞춤 서열결정 프라이머 판독 2를 Miseq 시약 카트리지 포지션 14 (판독 2 프라이머 혼합물)에 첨가한다.
2) 쌍형성된 말단 넥스테라(Nextera) 서열결정 프로토콜을 사용하여 "151 | 8 | 16 | 151"의 사이클 수로 서열결정한다.
서열결정 데이타를 하류 생물정보학 분석을 위해 bcl 또는 fastq 형식으로 관련 계통(pipeline)에 제출한다.
<표 3>
GUIDE-Seq에 필요한 공통 프라이머
Figure 112017005617270-pct00002
Figure 112017005617270-pct00003
*는 포스포로티오에이트 결합 변형을 나타낸다.
결과
예시적인 GUIDE-Seq 방법의 개요
일부 실시태양에서, GUIDE-Seq는 2개의 단계로 구성되고 (도 5b): 단계 I에서, 살아있는 인간 세포의 게놈 내의 DSB는 상기 절단부에서 평활한 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (dsODN)의 통합에 의해 태그가 부착된다. II 단계에서, 게놈 DNA의 dsODN 통합 부위는 편향 증폭 및 차세대 서열결정을 사용하여 뉴클레오티드 수준에서 정확히 맵핑된다.
I 단계에서, 본 발명자들은 평활한 5' 인산화 dsODN을 인간 세포에서 RGN에 의해 유도된 DSB에 통합하는 조건을 최적화하였다. 초기 실험에서, 본 발명자들은 RGN에 의해 유도된 DSB 내로 상기 dsODN의 통합을 관찰하지 못하였다. 세포에서 올리고를 안정화하도록 설계된 두 DNA 가닥의 5' 말단에 2개의 포스포로티오에이트 연결을 보유하는 dsODN를 사용하여20, 본 발명자들은 단지 작은 검출가능한 통합 빈도만을 관찰하였다 (도 5b). 그러나, 두 가닥 모두의 3' 말단에서 포스포로티오에이트 연결을 추가하면, 강력한 통합 효율을 얻을 수 있다 (도 5b). 이러한 통합 비율은 이들 부위에서 RGN만으로 (즉, dsODN 부재 하에) 유도된 indel의 빈도보다 단지 2 내지 3배 더 낮았다.
II 단계에서, 본 발명자들은 본 발명자들이 편향되지 않은 방식으로, 통합된 dsODN을 보유하는 단편만을 선택적으로 증폭하고 서열결정할 수 있도록 하는 새로운 전략을 개발하였다 (도 5a). 본 발명자들은 dsODN 및 RGN 성분을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 무작위로 전단된 게놈 DNA에 "단일 꼬리 (single-tail)" 차세대 서열결정 어댑터를 먼저 라이게이션함으로써 이를 달성하였다. 이어서, 본 발명자들은 dsODN에 특이적으로 어닐링하는 하나의 프라이머 및 서열결정 어댑터에 어닐링하는 다른 프라이머에 의해 개시되는 일련의 PCR 반응을 수행하였다 (도 5a와 도 12). 서열결정 어댑터는 단일 꼬리 형태이기 때문에, 이것은 선형 증폭-매개 (linear amplification-mediated, LAM)-PCR21 ,22과 같은 다른 방법에 내재된 편향 없이 dsODN에 인접한 서열의 특이적인 단방향 증폭을 가능하게 할 수 있다. 본 발명자들은 본 발명자들의 전략을 단일-꼬리 어댑터/태그 (single-tail adapter/tag, STAT)-PCR 방법이라고 부른다. 각각의 dsODN 가닥에 어닐링하는 프라이머를 사용하여 STAT-PCR 반응을 수행함으로써, 본 발명자들은 각각의 통합된 태그의 양 측면에서 인접한 게놈 서열의 판독을 얻을 수 있었다 (도 5c). 증폭 과정 동안 무작위 8 bp 분자 바코드의 통합 (도 12)은 PCR 편향의 보정을 가능하게 하여, 고처리량 서열결정에서 얻은 특유한 서열결정 판독을 정확하게 정량할 수 있게 한다.
인간 세포에서 CRISPR RGN의 게놈 전체에 걸친 표적-이탈 절단 프로파일
본 발명자들은 U2OS 또는 HEK293 인간 세포주에서 Cas9 및 다양한 내인성 인간 유전자를 표적으로 하는 10개의 상이한 gRNA를 사용하여 GUIDE-Seq를 수행하였다 (표 1). dsODN 통합 부위 (방법)를 분석함으로써, 본 발명자들은 10개의 RGN 각각에 의해 유도된 DSB의 정확한 게놈 위치를 확인하여 뉴클레오티드 수준에 맵핑할 수 있었다 (도 5d). 상기 게놈 윈도우의 80% 초과에 대해, 본 발명자들은 정확한 부위 (방법)이거나 이와 관련된 중첩 표적 서열을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도, 본 발명자들이 각각의 RGN에 대해 확인한 표적-이탈 부위의 총수는 0에서 150 초과까지 광범위하게 다양했고 (도 5e), 이것은 임의의 특정 RGN에 대한 원치 않는 절단의 게놈 전체에 걸친 정도가 상당하나 극히 작을 수 있음을 보여준다. 본 발명자들은 인간 게놈에 대해 gRNA 프로토스페이서 서열의 직교성 (1 내지 6개의 미스매치를 보유하는 게놈 부위의 총수에 의해 측정됨)과 본 발명자들이 GUIDE-Seq에 의해 관찰된 표적-이탈 부위의 총수 사이에 임의의 명백한 상관관계를 관찰하지 못하였다 (도 5f). 표적-이탈 서열은 게놈 전체에 걸쳐 분산되어 발견되고 (도 5g 및 도 13a-j), 엑손, 인트론 및 비-코딩 유전자 간 영역에 존재한다 (도 5h). 본 발명자들이 확인한 표적-이탈 서열에는, 이전에 4개의 RGN에 대해 알려진 모든 진정한 표적-이탈 부위가 포함되었다4 , 5 (도 6a-j). 보다 중요한 것은, GUIDE-Seq은 인간 게놈 전체에 걸쳐 맵핑되는 이전에 알려지지 않은 매우 많은 새로운 표적-이탈 부위를 확인하였다는 것이다 (도 5e, 5g, 6a-j 및 13a-j).
Figure 112017005617270-pct00004
이어서, 본 발명자들은 GUIDE-Seq에 의해 확인된 각각의 표적-이탈 부위에 대한 서열결정 판독의 수 (도 6a-j에 도시됨)가 RGN 단독 (즉, dsODN 부재 하)에 의해 유도될 indel의 상대적 빈도에 대한 대용물을 나타내는지 시험하였다. 뉴클레아제 성분이 발현된 인간 U2OS 세포에서 5개의 RGN에 대한 고정된 멀티플렉스 PCR (anchored multiplex PCR, AMP) 기반 차세대 서열결정에 의한 상기 부위의 검사 (방법)는 80% 초과 (132개 중 106개)가 RGN 절단에 특징적인 가변 길이 indel을 보유함을 보여주었고, 이것은 GUIDE-Seq가 진정한 RGN 표적-이탈 부위를 확인한다는 본 발명자들의 결론을 추가로 뒷받침한다 (도 7a). 검출된 indel 빈도의 범위는 0.03% 내지 60.1%였다. 중요하게는, 본 발명자들은 5개의 RGN 표적-이탈 부위 모두에 대해 GUIDE-Seq 판독 수와 indel 돌연변이 빈도 사이의 양의 선형 상관 관계를 관찰하였다 (도 7a-f). 따라서, 본 발명자들은 제시된 부위에 대한 GUIDE-Seq 판독 수가 RGN에 의한 해당 서열의 절단 효율의 정량적 척도를 나타낸다고 결론지었다.
RGN에 의해 유도된 표적-이탈 서열 특성의 분석
본 발명자들이 모든 10개의 RGN에 대해 GUIDE-Seq에 의해 확인한 표적-이탈 부위의 육안 검사는 RGN이 절단할 수 있는 변이체 서열의 다양성을 강조한다. 이들 부위는 프로토스페이서 서열 내에 6개만큼 많은 미스매치 (최대 7개의 미스매치를 보유하는 부위의 시험관 내 절단을 보여주는 이전의 보고서와 일치함6), 비-정규 PAM (이전에 설명된 NAG 및 NGA 서열5 , 23, 및 또한 새로운 NAA, NGT, NGC 및 NCG 서열) 및 gRNA/프로토스페이서 계면의 1 bp "돌출" 유형 미스매치를 포함할 수 있다24 (도 6a-j). 프로토스페이서 미스매치는 표적 부위의 5' 말단에서 발생하는 경향이 있지만, 특정 3' 말단 위치에서도 발견될 수 있고, 이것은 위치에 기초한 미스매치 효과를 예측하기 위한 간단한 규칙이 없다는 개념을 지지한다4. 흥미롭게도, 일부 표적-이탈 부위는 실제로 그들의 매치된 표적-적중 부위보다 더 높은 서열결정 판독 수를 갖고 (도 6a-d, 6j), 이것은 표적-이탈 돌연변이 빈도가 특정 경우에 의도한 표적-적중 부위에서의 것보다 더 높을 수 있다는 본 발명자들의 이전의 관찰과 일치하였다4. 특히, 4개의 RGN에 대해 이전에 알려진 표적-이탈 부위 중 많은 수가 높은 판독 수를 가졌고 (도 6a-d), 이것은 이전의 분석이가장 효율적으로 절단되는 부위를 주로 확인했음을 시사한다.
10개의 모든 RGN에 대한 GUIDE-Seq 데이타의 정량 분석을 통해 본 발명자들은 표적-이탈 부위 절단에 대한 미스매치 수, 위치 및 종류와 같은 상이한 변수의 기여 및 영향을 정량화할 수 있었다. 본 발명자들은 RGN에 의해 절단되는 특정 수의 프로토스페이서 미스매치를 보유하는 전체 게놈 부위의 비율이 미스매치 수의 증가에 따라 감소한다는 것을 발견하였다 (도 8a). 또한, 서열 판독 수는 미스매치 수가 증가함에 따라 일반적인 하향 경향을 보인다 (도 8b). 일반적으로, 표적 부위의 5' 말단에 보다 근접하여 위치하는 프로토스페이서 미스매치는 3' 말단에 보다 근접한 것보다 GUIDE-Seq 판독 수가 더 적게 감소하는 것과 연관되는 경향이 있지만, PAM으로부터 1에서 4 bp 떨어져 위치하는 미스매치가 놀랍게도 5 내지 8 bp 떨어진 것보다 약간 더 양호한 내성을 보였다 (도 8c). 흥미롭게도, 미스매치의 특성은 또한 GUIDE-Seq 판독 수에 대한 영향과 연관된다. 워블 미스매치는 표적-이탈 부위에서 빈번히 발생하고, 본 발명자들의 분석은 이들이 다른 비-워블 미스매치보다 GUIDE-Seq 판독 수에 대한 더 작은 영향과 연관됨을 제시한다 (도 8d). 이러한 결과와 일치하게, 본 발명자들은 단변량 회귀 분석에서 표적-이탈 절단의 가장 큰 변화 정도를 설명하는 단일 요인이 미스매치 수, 위치 및 종류임을 발견하였다. 이와 대조적으로, 근위 PAM 서열의 밀도, 유전자 발현 수준 또는 게놈 위치 (유전자간/인트론/엑손)와 같은 다른 인자는 GUIDE-Seq 절단 판독 수의 훨씬 더 작은 변이 비율을 설명한다 (도 8e). 미스매치 위치, 미스매치 종류, 유전자 발현 수준 및 근위 PAM 서열의 밀도를 포함하는 다수의 요인을 고려한 조합 선형 회귀 모델은 단변량 분석과 일치하는 결과를 생성하였다 (도 14). 이 분석을 통해, 본 발명자들은 또한 평균적으로 및 그의 위치에 따라 각각의 추가적인 워블 미스매치가 표적-이탈 절단 비율을 ~2배 내지 3배 감소시키는 반면, 추가의 비-워블 미스매치는 절단 비율을 ~3배 감소시킨다고 독립적으로 추정할 수 있었다 (도 14).
GUIDE-Seq와 기존의 표적-이탈 예측 방법의 비교
GUIDE-Seq의 효능을 확립한 후, 본 발명자들은 새로운 방법을 표적-이탈 돌연변이 부위를 예측하기 위한 2개의 유명한 다음과 같은 기존의 컴퓨터 이용 방법과 직접 비교하였다: MIT CRISPR 설계 도구25 (crispr.mit.edu) 및 E-CRISP 프로그램26 (www.e-crisp.org/E-CRISP/). 이들 두 프로그램은 모두 미스매치 수 및 위치에 대한 특정 "규칙"을 기초로 하여 잠재적인 표적-이탈 부위를 확인하기 위해 시도하고, 이전의 간행물에서 표적-이탈 부위를 확인하기 위해 사용되었다. 본 발명자들이 GUIDE-Seq에 의해 특성화한 10개의 RGN을 사용한 본 발명자들의 비교에서, 본 발명자들은 두 프로그램 모두가 실험적으로 확인된 표적-이탈 부위의 대다수를 확인하지 못함을 발견하였다 (도 9a-b). E-CRISP 및 MIT 프로그램은 각각 3개 및 4개 초과의 미스매치를 보유하는 표적-이탈을 단순히 고려하지 않았기 때문에 이들 부위 중 많은 부분이 누락되었다 (도 9c-d). 심지어 고려되는 서열들 사이에서도, 이들 프로그램은 여전히 진정한 표적-이탈 부위의 대다수를 확인하지 못하고 (도 9c-d), 이것은 절단 발생 여부를 결정하는 인자를 설명하는 이들의 현재의 제한된 능력을 강조한다. 특히, 누락된 부위는 하나의 매우 적은 미스매치를 갖는 것을 포함하지만 (도 9c-d), MIT 프로그램에 의해 할당된 순위 지정 점수는 올바르게 확인한 부위들 사이에 일부의 예측력을 가지고 있다는 것은 주목할 가치가 있다. 마지막으로, 두 프로그램 모두 GUIDE-Seq에 의해 확인되지 않는 많은 "위 양성" 부위를 반송한다는 점에 유의하는 것은 중요하다 (도 9a-b). 본 발명자들은 MIT 및 E-CRISP 프로그램 둘 모두가 진정한 RGN 표적-이탈 부위를 확인할 때 본 발명자들의 GUIDE-Seq 방법보다 실질적으로 효과가 더 낮은 것으로 결론지었다.
dCas9 결합 부위를 결정하기 위한 GUIDE-Seq와 ChIP-Seq 방법의 비교
본 발명자들은 또한 GUIDE-Seq와 이전에 설명된 ChIP-Seq 방법을 직접 비교하여 RGN 표적-이탈 부위를 확인하고자 하였다. 본 발명자들이 GUIDE-Seq에 의해 평가한 4개의 RGN은 이전에 큰 세트의 표적-이탈 결합 부위의 확인을 보인, 촉매 비활성의 Cas9 (dCas9)를 이용한 ChIP-Seq 실험에서 특성화된 gRNA를 사용하였다18. 직접 비교는 GUIDE-Seq에 의해 확인된 Cas9 표적-이탈 절단 부위와 ChIP-Seq에 의해 확인된 dCas9 표적-이탈 결합 부위 사이에 중첩을 거의 보이지 않고; 4개의 gRNA에 대해 본 발명자들이 확인한 149개의 RGN 유도된 표적-이탈 절단 부위 중에서, 3개만이 동일한 gRNA를 사용하는, 이전에 발표된 dCas9 ChIP-Seq 실험에 의해 이전에 확인된 것이었다 (도 9e). 이러한 중복성의 결여는 dCas9 표적-이탈 결합 부위가 Cas9 표적-이탈 절단 부위와 근본적으로 상이하기 때문인 것으로 보이고, 이것은 GUIDE-Seq에 의해 확인된 상기 4개의 gRNA에 대한 Cas9 표적-이탈 절단 부위가 ChIP-Seq에 의해 확인된 그의 결합 부위보다 훨씬 더 적은 미스매치를 평균적으로 보유함 (도 9f)을 보여주는 본 발명자들의 데이타에 의해 및 극히 적은 dCas9 결합 부위만이 활성 Cas9의 존재 하에 indel의 증거를 보임을 제시하는 이전의 연구 결과에 의해 지지되는 가설이다16 -19. GUIDE-Seq가 ChIP-Seq에 의해 이전에 확인된 4개의 표적-이탈 부위를 확인하지 못했고, 이후에 Cas9에 의한 돌연변이 유발의 표적이 되는 것으로 밝혀졌지만, 본 발명자들은 이것이, 이들 부위가 이전 연구18에서 진정한 표적-이탈 절단 부위로 잘못 확인되었기 때문인 것으로 생각한다. 이 연구로부터의 서열결정 데이타를 주의 깊게 분석하면, 이들 부위에서 발견되는 거의 대부분의 indel 돌연변이가 RGN 절단 활성이 아니라 PCR 또는 서열결정 오류에 의해 유발되었을 가능성이 높다는 것을 알 수 있다 (도 15a-d). 종합하면, 이러한 결과는 GUIDE-Seq가 진정한 표적-이탈 절단 부위의 확인을 위해 ChIP-Seq보다 실질적으로 우위에 있음을 입증하고, ChIP-Seq에 의해 발견된 (존재할 경우) 극소수의 dCas9 표적-이탈 결합 부위는 실제 Cas9 표적-이탈 절단 부위를 나타낸다는 아이디어에 대한 실험적 지지를 제공한다.
GUIDE-Seq에 의한, 인간 세포에서 RGN 비의존성 DSB 핫스팟의 확인
본 발명자들의 GUIDE-Seq 실험은 또한 예기치 않게 본 발명자들의 연구에 사용된 U2OS 및 HEK293 세포에서 총 30개의 특유한 RGN 비의존성 DSB 핫스팟의 존재를 나타내었다 (표 2). 본 발명자들은 본 발명자들이 RGN-코딩 플라스미드 없이 dsODN만으로 형질감염시킨 U2OS 및 HEK293 세포를 사용한 대조 실험으로부터 게놈 DNA를 분석할 때 이들 부위를 규명하였다 (방법). 특이적 염기쌍 위치에 정확하게 맵핑되는 RGN 유도 DSB와 달리, RGN 비의존성 DSB는 dsODN 통합 패턴을 갖고, 이 패턴은 이들이 발생하는 각각의 유전자좌에서 보다 광범하게 분산된다 (방법). 이들 30개의 절단점 핫스팟은 많은 염색체에 걸쳐 분포되었고, 동원체 또는 텔로머 영역 근처에 존재하는 것으로 나타났다 (도 10f). 흥미롭게도, 소수의 상기 DSB (2개)만이 두 세포주 모두에 공통적으로 나타났고, 그 대다수는 세포주 특이적이었다 (U2OS는 25개, HEK293 세포는 7개, 도 10f 및 표 2). 본 발명자들의 지식으로는, GUIDE-Seq는 잠재적인 독성 약물 (예를 들어, 아피디콜린과 같은 DNA 복제 억제제) 없이도 살아있는 인간 세포에서 절단점 핫스팟을 직접적으로 비편향되게 확인할 수 있도록 하는 최초의 방법이다.
<표 2>
인간 U2OS 및 HEK293 세포에서의 RGN-비의존성 절단점 핫스팟의 요약
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대규모 게놈 재배열에서 RGN -유도 및 RGN - 비의존성 DSB 둘 모두의 참여
RGN 유도 및 RGN 비의존성 DSB에서 indel을 확인하기 위해 설계된 본 발명자들의 차세대 서열결정 실험의 결과를 분석하는 과정에서, 본 발명자들은 또한 이들 절단 중 일부가 전위, 역위 및 대규모 결실에 참여할 수 있음을 발견하였다. 사용된 AMP 방법을 통해, 본 발명자들은 조사된 각각의 DSB 부위에 대해 상기 방법이 인접한 유전자좌 특이적 프라이머의 쌍보다 단지 하나의 고정된 말단에만 고정된 네스티드 유전자좌 특이적 프라이머만을 사용하기 때문에 상기 대규모 게놈 변형을 관찰할 수 있었다 (도 10a). 따라서, AMP 기반 서열결정은 DSB에서 indel 돌연변이가 발생했는지 여부를 확인 할뿐만 아니라 DSB가 다른 서열에 연결합되었는지의 여부도 검출할 수 있다.
본 발명자들이 조사한 5개의 RGN에 대해, AMP 서열결정은 RGN-유도된 표적-적중 및 표적-이탈 DSB가 다양한 전위에 참여할 수 있음을 보여주었다 (도 10b). 적어도 하나의 경우에, 본 발명자들은 한 쌍의 DSB로 인한 4개의 가능한 모든 전위 사건을 관찰할 수 있었다 (도 10c). 두 개의 DSB가 동일한 염색체에 존재할 때, 본 발명자들은 또한 큰 결실 및 역위를 관찰하였다 (도 10b). 적어도 하나의 경우에, 본 발명자들은 동일한 개입 서열의 역위뿐만 아니라 2개의 RGN-유도된 절단 사이의 큰 결실을 둘 모두 관찰하였다 (도 10d). 중요하게도, 본 발명자들의 결과는 또한 RGN-유도 및 RGN-비의존성 DSB 사이의 전위 (및 결실 또는 역위)를 보여주었고 (도 10b), 이것은 세포 게놈에 대한 RGN의 표적-이탈 효과를 평가할 때 두 유형의 절단 사이의 상호작용을 고려할 필요가 있음을 시사한다. 본 발명자들의 데이타는 상기 대규모 게놈 재배열의 빈도가 매우 낮을 가능성이 있음을 시사하지만, 본 발명자들의 기존 데이타세트의 서열결정 수준으로는 정확한 정량화가 불가능하였다. 서열결정 판독의 수를 늘리면, 검출 민감도가 증가하고 상기 중요한 게놈 변경의 정량화가 보다 잘 이루어질 수 있다.
말단 절단된 gRNA에 의해 지시되는 RGN의 GUIDE-Seq 프로파일
본 발명자들의 이전 연구는 17 또는 18 nt의 말단 절단된 상보성 영역을 보유하는 gRNA를 사용하면 전장 gRNA가 지시하는 RGN의 알려진 표적-이탈 부위에서 돌연변이 빈도를 줄일 수 있음을 보여주었다27. 그러나, 이 분석은 소수의 알려진 표적-이탈 부위로 제한되기 때문에, 이러한 말단 절단된 gRNA (tru-gRNA)의 게놈 전체에 걸친 특이성은 본 발명자들의 이전 실험에서 정의되지 않았다. 본 발명자들은 GUIDE-Seq을 사용하여 3개의 tru-gRNA에 의해 지시되는 RGN의 게놈 전체에 걸친 DSB 프로파일을 얻었고, 그 각각은 본 발명자들이 위에서 분석한 10개의 전장 gRNA 중 하나의 보다 짧은 버전이다.
본 발명자들의 결과는 세 가지 경우 모두에서 GUIDE-Seq에 의해 확인된 표적-이탈 부위의 총수가 tru-gRNA의 사용에 의해 상당히 감소함을 보여준다 (도 11a-d). GUIDE-Seq 판독의 맵핑은 본 발명자들이 표적-적중 부위 (도 11e) 및 표적-이탈 부위 (표시되지 않음)의 절단 위치를 정확하게 확인할 수 있게 한다. 예상한 바와 같이 및 본 발명자들이 전장 gRNA를 사용하여 관찰된 바와 같이, 표적-이탈 부위의 목록에는 포함된 것은 3개의 tru-gRNA에 의해 지시된 RGN에 대한 이전에 공지된 12개의 표적-이탈 부위 중 10개였다 (도 11f-h). 본 발명자들이 확인한 표적-이탈 부위의 서열은 주로 프로토스페이서 내에 1 또는 2개의 미스매치를 가지고 있었지만, 일부 부위는 4개로 많았다 (도 11f-h). 또한, 일부 부위는 NAG, NGA 및 NTG 형태의 대체 PAM 서열을 가졌다 (도 11f-h). 이러한 데이타는 gRNA의 말단 절단이 RGN의 표적-이탈 효과를 상당히 감소시킬 수 있는 게놈 전체에 걸친 규모의 확인을 제공하고, RGN 플랫폼의 특이성 개선을 평가하기 위해 GUIDE-Seq를 사용하는 방법을 보여준다.
논의
GUIDE-Seq은 RGN-유도된 DSB를 검출하기 위한, 게놈 전반에 걸친 비편향되고 민감한 방법을 제공한다. 이 방법은 표적-이탈 부위의 특성에 대해 가정하지 않고 (예를 들어, 표적-이탈 부위가 표적-적중 부위와 서열이 밀접하게 관련되어 있다고 추정하지 않고) DSB를 검출하기 때문에 비편향적이다. GUIDE-Seq는 엑손, 인트론 및 유전자간 영역 내를 비롯하여 게놈 전체에 걸친, 이전 연구5 , 23에서 설명된 다른 NAG 및 NGA 서열 뒤의 6개 이하의 프로토스페이서 미스매치 및/또는 새로운 미스매치된 PAM 부위를 보유하는 표적-이탈 부위를 확인한다. 본 발명자들이 본 실시예에서 조사한 RGN의 경우, GUIDE-Seq는 이전에 알려진 모든 표적-이탈 부위를 성공적으로 확인할 뿐만 아니라, 수백 개의 새로운 부위도 밝혀내었다.
인간 세포에서 모든 RGN 표적-이탈 부위를 포괄적으로 확인하기 위한 실용적인 핵심 기준 (gold standard) 방법이 현재 결여되어 본 발명자들이 GUIDE-Seq의 민감성을 확실하게 알지 못하지만, 본 발명자들은 다음과 같은 이유로 위음성 비율이 낮을 가능성이 높다고 생각한다. 먼저, 모든 RGN-유도 평활 말단 DSB는 NHEJ에 의한 평활 말단 dsODN을 흡수해야 하고, 이것은 GUIDE-Seq 판독 수 (dsODN 흡수를 측정하는)와 RGN의 존재 하의 indel 빈도 (DSB 형성 및 돌연변이 복구의 속도를 측정하는) 사이의, 본 발명자들이 관찰한 강한 상관관계에 의해 뒷받침되는 가설이다 (도 7b-f). 본 발명자들은 이러한 상관관계가 넓은 범위의 indel 돌연변이 유발 빈도를 보여주는 130개 초과의 부위를 포함하고 있음에 주목한다. 두 번째로, 이전에 확인된 표적-이탈 부위를 벤치마크 (현재 성공을 측정할 수 있는 유일한 방법임)로 사용하여, GUIDE-Seq는 0.12%로 낮게 연장된 다양한 돌연변이 유발 빈도를 보인 40개의 상기 부위 중 38개의 부위를 검출할 수 있었다. 이 방법은 4개의 전장 gRNA에 대해 이전에 알려진 28개의 모든 표적-이탈 부위 및 3개의 tru-gRNA에 대해 이전에 알려진 12개의 표적-이탈 부위 중 10개를 모두 검출하였다. 검출되지 않은 2개의 표적-이탈 부위 중 하나는 본 발명자들의 원데이타에서 포획의 증거를 보여주었지만, 서열결정 판독이 단방향이고 단 하나의 프라이머로부터 기인했기 때문에 본 발명자들의 판독 호출 알고리즘에 의해 여과되었다 (방법) (이 부위에 대한 양방향 맵핑 판독의 결여는 표적-이탈 부위의 한쪽에 있는 반복 영역으로 인해 판독을 정확하게 맵핑하는 것이 어려웠기 때문일 수 있다). 다른 하나의 검출되지 않은 표적-이탈 부위는 이전에 여과되었다.
본 발명자들이 평가한 RGN 중 하나는 (GUIDE-Seq 방법의 현재 검출 한계에서) 임의의 검출가능한 표적-이탈 효과를 나타내지 않아, 일부 gRNA가 원하지 않는 돌연변이를 거의 또는 아마도 전혀 유발할 수 없을 가능성을 제기하였다.
본 발명자들의 검증 실험은 GUIDE-Seq가 0.1%의 낮은 빈도로 RGN에 의해 돌연변이 유발된 표적-이탈 부위를 민감하게 검출할 수 있음을 보여주었지만, 그의 검출 능력은 몇 가지 간단한 변경으로 더 개선될 수 있다. indel를 검출하기 위해 차세대 서열결정을 사용하는 전략은 플랫폼의 오류율 (일반적으로 ~0.1%)에 의해 제한된다. 이와 대조적으로, GUIDE-Seq는 indel보다는 dsODN 삽입 부위를 확인하기 위해 서열결정을 사용하고, 따라서 오류율이 아니라 서열결정 심층도에 의해 제한된다. 예를 들어, 본 발명자들은 본 발명자들이 본 발명자들의 서열결정 검증 실험에서 indel을 찾지 못한 본 발명자들의 GUIDE-Seq 실험에서 검출된 적은 수의 부위가 실제로 0.1% 미만의 indel 돌연변이 빈도를 가질 가능성이 있는 부위를 나타낸다고 생각한다. 이와 일치하게, 본 발명자들은 상기 26개의 부위 중 3개를 제외한 모두 부위에서 GUIDE-Seq 판독 수가 100 미만이었음에 주목한다. 함께 살펴보면, 이러한 관찰은 본 발명자들이 단순히 서열결정 판독의 수를 증가시킴으로써 (및 증폭을 위한 주형으로 사용되는 게놈의 수를 증가시킴으로써) GUIDE-Seq의 민감도를 증가시킬 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 1000배 더 많은 판독을 생성하는 서열결정 플랫폼을 사용하면 검색이 가능할 것이다.
본 발명자들의 GUIDE-Seq 실험에 의해 가능해진 직접적인 비교는 RGN 표적-이탈 부위를 예측하기 위한 2개의 기존 컴퓨터 프로그램의 한계를 보여준다. 이러한 프로그램은 GUIDE-Seq에 의해 발견된 진정한 표적-이탈 부위를 확인하지 못할 뿐만 아니라, 절단을 나타내지 않는 많은 부위를 과대평가하였다. 이것은 상기 프로그램이 사용하는 파라미터가 GUIDE-Seq 실험에 의해 확인된 더 많은 프로토스페이서 미스매치 및 다른 PAM 서열을 설명하지 않는 표적-이탈 부위의 성격에 대한 보다 제한적인 가정을 기반으로 한다는 점을 고려할 때 전혀 놀랍지 않다. 미래에 더 나은 예측 프로그램이 개발될 수도 있지만, 그것은 보다 많은 많은 수의 RGN에 대해 실험적으로 결정된 게놈 전체에 걸친 표적-이탈 부위를 필요할 것이다. 그러한 프로그램이 개발될 수 있을 때까지, 표적-이탈 부위의 확인은 GUIDE-Seq와 같은 실험적 방법에 의해 가장 효과적으로 처리될 것이다.
본 발명자들의 실험 결과는 dCas9의 표적-이탈 결합 부위와 Cas9의 표적-이탈 절단 부위 사이의 명확한 구별을 정교하게 만든다. 4개의 상이한 gRNA에 대한 dCas9 ChIP-Seq 및 Cas9 GUIDE-Seq 데이타의 비교는 두 부위의 세트 사이에 무시할 수 있는 직접적인 중복이 존재하고 두 부위의 클래스의 평균 미스매치 수가 실제로 상이하다는 것을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 Cas9에 의해 돌연변이 유발된 것으로 이전에 보고된 적은 수의 dCas9 결합 부위조차도 진정한 RGN-유도 절단 부위가 아닐 가능성이 매우 높음을 보여준다. 종합하면, 본 발명자들의 결과는 ChIP-Seq로 포획되는 DNA 부위에 dCas9의 결합이 Cas9 뉴클레아제에 의한 DNA 부위의 절단과 상이한 생물학적 과정을 나타냄을 보여고, 이것은 gRNA의 5' 말단과 프로토스페이의 결합이 효율적인 절단에 필요함을 보여주는 최근 연구 결과와 일치한다19. ChIP-Seq 검정은 의심할 여지없이 dCas9 융합 단백질의 게놈 전체에 걸친 결합의 특성화시에 일정 역할을 수행하지만, 이 방법은 촉매 활성 RGNs의 게놈 전체에 걸친 표적-이탈 절단 부위를 결정하는 데 분명히 효과적이지 않다.
GUIDE-Seq은 세포에서 DSB 부위를 확인하기 위해 이전에 설명된 다른 게놈 전체에 걸친 방법에 비해 몇 가지 중요한 이점을 갖는다. 최근에 설명된 BLESS (breaks labeling, enrichment on streptavidin and next-generation sequencing) 올리고뉴클레오티드 태그 부착 방법은 고정된, 투과성을 갖는 세포에서 제자리에서 수행된다27. 세포 고정과 관련된 인공물에 노출되기 쉬운 것 외에, BLESS는 단지 한 순간에 존재하는 절단을 포획할 것이다. 이와 대조적으로, GUIDE-Seq은 살아있는 세포에서 수행되고 더 긴 시간 (일)에 걸쳐 발생하는 DSB를 포획하기 때문에, 더 민감하고 포괄적인 검정을 가능하게 한다. 통합 결핍 렌티바이러스 (integration-deficient lentivirus, IDLV) DNA의 DSB 근처의 영역 내로의 포획 및 LAM-PCR에 의한 이들 유전자좌의 확인은 인간 세포에서 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)22 및 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)28에 대한 적은 수의 표적-이탈 부위를 확인하는데 사용되어 왔다. 그러나, IDLV 통합 사건는 일반적으로 숫자가 적고, 실제 표적-이탈 DSB로부터 500 bp의 먼 거리에 걸쳐 널리 퍼져있기 때문에22 , 28, 절단 사건의 위치를 정확하게 맵핑하고 실제 표적-이탈 부위의 서열을 추론하는 것이 어렵다. 또한, LAM-PCR은 서열 바이어스 및/또는 서열결정 판독의 낮은 효율로 인해 어려움을 겪는다. 종합적으로, 이러한 제한은 IDLV 포획에 의해 보다 낮은 빈도의 ZFN 표적-이탈 절단 부위를 검출할 수 없는 명백한 무능력을 설명할 수 있다29. 이와 대조적으로, dsODN은 GUIDE-Seq에 의해 DSB 내로 매우 효율적이고 정확하게 통합되어, 단일 뉴클레오티드 분해능의 절단의 맵핑 및 뉴클레아제 표적-이탈 절단 부위의 간단하고 직접적인 확인을 가능하게 한다. 또한, LAM-PCR과 달리, 본 발명자들의 STAT-PCR 방법은 dsODN이 통합된 게놈 DNA 단편의 효율적인 비편향 증폭 및 서열결정을 허용한다. 본 발명자들은 STAT-PCR이 GUIDE-Seq에서 그의 사용을 넘어선 보다 일반적인 유용성을 가질 수 있음에 주목하고, 예를 들어 STAT-PCR은 바이러스의 통합 부위를 게놈 전체에 걸친 규모로 맵핑하려는 연구에 유용할 수 있다.
GUIDE-Seq는 매우 민감하지만, 그의 검출 능력은 몇 가지의 간단한 변경으로 보다 개선될 수 있다. indel을 검출하기 위해 차세대 서열결정을 사용하는 전략은 플랫폼의 오류율 (일반적으로, ~0.1%)에 의해 제한된다. 이와 대조적으로, GUIDE-Seq는 서열결정을 사용하여 indel보다는 dsODN 삽입 부위를 확인하기 때문에, 오류율이 아니라 서열결정 심층도에 의해 제한된다. 예를 들어, 본 발명자들은 본 발명자들의 서열결정 검증 실험에서 indel을 찾지 못한 본 발명자들의 GUIDE-Seq 실험에서 검출된 적은 수의 부위가 실제로 0.1% 미만의 돌연변이 빈도를 가질 가능성이 있는 부위를 나타낸다고 생각한다. 이것과 일치하게, 본 발명자들은 26개 부위 중 3개를 제외한 모든 부위가 100 미만의 GUIDE-Seq 판독 수를 갖는다는 것에 주목한다. 종합하면, 상기 관찰은 본 발명자들이 단순히 서열결정 판독의 수를 증가시킴으로써 (및 증폭을 위한 주형으로 사용되는 게놈의 수를 증가시킴으로써) GUIDE-Seq의 감도를 증가시킬 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 1000배 더 많은 판독을 산출하는 서열결정 플랫폼을 사용하면, 돌연변이 유발 빈도가 103배 더 낮은 (즉, 0.0001%) 부위를 검출할 수 있고, 본 발명자들은 기술의 지속적인 개선으로 인해 더 많은 증가가 발생할 것으로 예상된다.
본 발명자들의 실험의 예상치 못한 결과는 GUIDE-Seq가 RGN이 없는 경우에도 세포에서 발생하는 절단점 핫스팟을 또한 확인할 수 있다는 것이었다. 본 발명자들은 본 발명자들의 AMP 기반 서열결정 실험이 dsODN 포획뿐만 아니라 이들 부위에서 indel의 형성을 확인했기 때문에, 상기 DSB가 GUIDE-Seq의 인공물이 아니라고 생각한다. 흥미롭게도, 많은 핫스팟은 본 발명자들의 연구에서 조사된 2개의 세포주 각각에 특유하지만, 일부 핫스팟은 또한 둘 모두에게 공통적인 것처럼 보인다. 앞으로의 연구에서, 몇몇 부위가 한 세포 종류에서는 절단점 핫스팟이지만 또 다른 부위에서는 그렇지 않은 이유를 제어하는 파라미터를 규정하는 것은 흥미로울 것이다. 또한, 본 발명자들의 결과는 이러한 절단점 핫스팟이 전위에 참여할 수 있음을 보여주기 때문에, 세포 종류에 특이적인 절단점 핫스팟의 존재는 특정 게놈 재배열이 특정 세포 종류에서만 발생하고 다른 종류에서는 발생하지 않는 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있다. 본 발명자들이 아는 바로는, GUIDE-Seq는 DNA 복제를 억제하는 약물을 첨가할 필요없이 살아있는 인간 세포에서 절단점 핫스팟을 확인할 수 있는 최초의 방법이다27. 따라서, 본 발명자들은 상기 방법이 상기 절단을 확인하고 연구하기 위한 유용한 도구를 제공할 것으로 기대한다.
본 발명자들의 연구는 RGN에 의해 유도된 전위를 확인하기 위해 현재까지 설명된 가장 포괄적인 정성적인 방법을 확립한다. GUIDE-Seq에 의해 발견된 RGN-유도 및 RGN-비의존성 DSB 부위의 AMP-기반 표적화 서열결정은 두 클래스의 부위를 포함하는 전위, 결실 및 역위를 포함하는 대규모의 게놈 재배열을 발견할 수 있고, 이것은 대규모 게놈 재배치를 확인할 때 두 클래스의 절단을 고려하는 것의 중요성을 강조한다. 또한, 추정하기로는, 모든 RGN-유도 또는 RGN-비의존성 DSB가 대규모 변경에 참여하는 것은 아니고, 일부 부위는 상기 재배열에 기여하고 다른 부위는 재배치에 기여하지 않는 이유의 이해는 추가 연구를 위한 중요한 영역이 될 것이다.
GUIDE-Seq은 또한 게놈 전체에 걸친 규모에서 RGN 플랫폼의 특이성 향상을 평가하는 중요한 수단을 제공할 것이다. 이 보고서에서, 본 발명자들은 GUIDE-Seq을 사용하여 말단절단된 gRNA의 구현이 게놈 규모에 대한 표적-이탈 효과를 어떻게 줄일 수 있는지를 보여주었고, 매치된 전장 gRNA의 알려진 표적-이탈 부위에서 돌연변이를 감소시킬 수 있다는 본 발명자들의 선행 연구 결과를 확장한다30. 또한, 다른 박테리아 또는 고세균으로부터의 다른 Cas9 뉴클레아제, 또는 이량체 ZFN, TALEN, 및 5' 오버행을 생성하는 CRISPR RNA-가이드 FokI 뉴클레아제31 , 32와 같은 뉴클레아제 또는 5' 또는 3' 오버행을 생성하는 쌍을 이룬 Cas9 니카제 (nickase)33, 34의 게놈 전체에 걸친 특이성을 평가하도록 조정될 수 있지만; 상기 다른 유형의 DSB를 검출하기 위해 GUIDE-Seq을 확장하는 것은 의심할 여지없이 상기 절단 내로의 효율적인 포획을 보장하기 위해 dsODN의 추가의 변형 및 최적화를 필요로 할 것이다. 이 방법은 또한 다른 박테리아 또는 고세균으로부터의 다른 Cas9 뉴클레아제의 특이성을 평가하기 위해 사용될 수 있다35. 하나의 중요한 경고는 본 발명자들이 평가한 10개의 gRNA에 대한 표적-이탈 부위의 수의 매우 광범한 다양성을 발견했기 때문에, 임의의 새로운 Cas9 플랫폼의 특이성에 대한 결론을 넓게 내리기 전에 많은 수의 gRNA를 조사할 필요가 있다는 것이다.
GUIDE-Seq 및 AMP 기반 서열결정을 사용한 본 발명자들의 예시적인 방법은 RGN에 의해 유도된 표적-이탈 돌연변이 및 게놈 재배열의 평가를 위한 새로운 핵심 기준을 확립한다. 본 발명자들은 NHEJ가 활성을 갖고 필요한 성분이 효율적으로 도입될 수 있는 임의의 세포에서 사용할 수 있도록 GUIDE-Seq를 확장할 수 있고, 예를 들어, 본 발명자들은 인간 K562 및 마우스 배아 줄기 세포에서 효율적인 dsODN 통합을 이미 달성하였다 (데이타 미제시). 가장 중요한 것은, 여기에 개관된 전략을 치료 목적으로 제안된 임의의 RGN의 잠재적인 표적-이탈 효과를 객관적으로 평가하기 위한 엄격한 전임상 경로의 일부로서 사용할 수 있고, 따라서 병원에서 상기 시약의 사용 전망을 상당히 개선할 수 있다.
실시예 3.
본 방법의 방법의 일부 실시양태에서 사용될 수 있는 dsODN에 대한 요건을 조사하기 위해 추가의 실험을 수행하였다.
다음 dsODN은 실시예 3의 실험에서 사용되었다.
Figure 112017005617270-pct00006
/5Phos/는 5' 인산화를 나타낸다.
*은 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
모든 올리고는 STE에서 어닐링되었다.
먼저, TALEN, ZFN, 및 EGFP를 표적으로 한 RFN을 사용하여 3개 종류의 dsODN의 통합 빈도를 평가하였다. 2E5 U2OS-EGFP 세포를 500 ng의 각각의 TALEN 단량체 (총 1 ㎍), 500 ng의 각각의 ZFN 단량체 (총 1 ㎍), 또는 325 ng의 다중 gRNA 플라스미드 및 975 ng의 FokI-dCas9 발현 플라스미드 및 100 pmol의 dsODN으로 뉴클레오펙션시켰다. 사용된 3개의 dsODN은 5' 포스포로티오에이트 연결을 갖는 4-bp 5' 오버행, 3' 포스포로티오에이트 연결을 갖는 4-bp 3' 오버행을 갖거나, 또는 5' 및 3' 포스포로티오에이트 연결으로 평활한 상태였다. 모든 dsODN은 5' 인산화되었다. 통합 빈도는 NdeI 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 검정으로 추정하고, 모세관 전기 분해를 사용하여 정량하였고, 간단히 설명하면, 표적 부위는 단리된 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다. PCR을 NdeI 제한 효소 (20 U)로 37℃에서 3시간 동안 소화시키고, 1.8X 암퓨어 XP로 정제하였다. 정제된 절단 산물을 퀴악셀 모세관 전기영동 기기 (퀴아젠)에서 이동시키고 정량한다. 도 16a는 5' 인산화되고 3' 포스포로티오에이트화된 평활-말단 dsODN이 가장 높은 통합 비율을 가짐을 보여준다.
상기에서 사용된 것과 동일한 올리고 (서열식별번호 (SEQ ID NO): 1 및 2)를 제조자의 지시에 따라 론자 뉴클레오펙터 4-D에서 20 ㎕ 용액 SE (론자) 내의 U2OS 세포 (프로그램 DN-100)를 형질감염시켰다. 500 ng의 각각의 TALEN 단량체 (CCR5에 대해 TAL1252/TAL1301, APC에 대해서는 TAL2294/2295) 및 100 pmol의 dsODN으로 형질감염시켰다. 도 16b-c는 NdeI 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석 (상기 설명됨) 또는 T7E1 검정 (간단히 설명하면, 표적 부위는 단리된 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다. PCR은 1.8X 암퓨어 XP로 정제하였다. 정제된 PCR 산물 (200 ng)을 다음 프로토콜에 따라 혼성화하였다: 95℃에서 5분, -2℃/s에서 95-85℃, -1℃/10s에서 85-25℃, 10℃에서 유지. T7 엔도뉴클레아제 I (10 U)을 반응물에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 반응은 EDTA (25 mM)를 첨가하여 중지시키고, 1.8X 암퓨어 XP로 정제하였다. 정제된 절단 산물을 퀴악셀 모세관 전기영동 기기 (퀴아젠)에서 이동시키고 정량하였다)에 의해 결정된 바와 같이, U2OS 세포에서 2개의 내인성 표적 부위, 즉 CCR5 및 APC에서 TALEN에 의해 유도된 이중 가닥 절단 (DSB) 내로의 평활한 5'-인산화된 34-bp 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (dsODN) (oSQT685/686)의 효율적인 통합의 증거를 보여준다.
2E5 U2OS-EGFP 세포를 325 ng의 다중 gRNA 플라스미드 및 975 ng의 FokI-dCas9 발현 플라스미드 및 100 pmol dsODN으로 뉴클레오펙션시켜 추가 실험을 수행하였다. 추가로, 3E5 마우스 ES 세포를 200 ng의 단일 gRNA 플라스미드 및 600 ng의 Cas9 발현 플라스미드 및 100 pmol dsODN으로 뉴클레오펙션시켰다. 다음과 같은 2개의 dsODN을 비교하였다: 1) 평활한, 인산화된, 5' 및 3' 포스포로티오에이트-변형된 것 및 2) 평활한, 인산화된, 3'만 포스포로티오에이트-변형된 것. 통합 빈도는 NdeI 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 검정으로 추정하고, 모세관 전기영동을 사용하여 정량하였다.
인간 U2OS 세포에서 이량체 RNA-가이드 FokI 뉴클레아제 (도 17a) 또는 마우스 ES 세포에서 표준 Cas9 (도 17b)로 수행된 실험은 단지 3' 포스포로티오에이트 변형만을 갖는 dsODN가 가장 높은 통합 비율을 갖는다는 것을 보여주었다.
추가의 실험은 마우스 ES 세포에서 상이한 농도의 3' 포스포로티오에이트 변형 올리고를 시험하기 위해 수행되었다. 3E5 마우스 ES 세포는 200 ng의 단일 gRNA 플라스미드 및 600 ng의 Cas9 발현 플라스미드 및 아래에서 설명되는 바와 같은 다양한 양의 dsODN으로 뉴클레오펙션시켰다. 평활한, 인산화된, 단지 3'만 포스포로티오에이트-변형된 dsODN가 이 실험에 사용되었다. 어닐링된 올리고를 정제 및 정제되지 않은 dsODN을 비교하기 위해 세파덱스 (Sephadex) G-25 컬럼을 사용하여 정제하였다. dsODN은 1, 2, 5, 10, 25, 50 및 100 pmol의 농도로 시험하였다. 통합 빈도는 NdeI 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 검정으로 추정하고, 모세관 전기영동을 사용하여 정량하였다. 도 18a 및 18b에 도시된 결과는 50 pmol 또는 100 pmol이 최상의 활성을 제공함을 나타내었다. 세파덱스 G-25 컬럼을 통한 올리고의 정제는 비율을 유의하게 개선하지 못하였다 (도 18a 및 18b 참조). 돌연변이 유발 빈도는 T7E1 검정에 의해 평가하였고, 이것은 3'-변형된 dsODN의 존재 하에서도 전체적인 붕괴 속도가 높다는 것을 보여주었다.
dsODN의 길이 또한 평가되었다. 도 20a-b는 보다 긴 (예를 들어, 60 bp) dsODN 태그가 CRISPR-Cas9 유도된 DSB의 부위에 효율적으로 통합되었음을 보여준다. 이러한 보다 긴 dsODN은 PCR 증폭 생성물의 생물정보학적 여과를 가능하게 함으로써 GUIDE-seq의 정확성을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 이들 서열은 보다 긴 태그에 존재하는 서열을 포함하지 않는 것으로서 인식될 수 있다.
Figure 112017005617270-pct00007
*은 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
상기 실험은 dsODN 태그 흡수 효율이 보다 긴 5' 및 3' 말단 둘 모두보다 3' 말단에서만 변형된 올리고를 사용함으로써 증가될 수 있고 dsODN 태그의 효율적인 포획이 형질전환된 암 세포주 (예를 들어, 마우스 ES 세포)가 아닌 세포를 포함한 다양한 세포주에서 발생함을 보여준다
실시예 4.
본 실시예에서, GUIDE-seq dsODN 태그의 비오티닐화된 버전을 게놈 DSB의 부위 내로의 통합을 위한 기질로 사용하였다. 실시예 4에서 제시되는 바와 같이, 상기 올리고를 효율적으로 통합하는 것이 가능하였다. 실험은 IDT DNA로부터 얻은 비오티닐화된 dsODN을 사용하여 상기한 바와 같이 수행하였다.
Figure 112017005617270-pct00008
iBiodT - 비오틴 dT 태그
*은 포스포로 티오에이트 연결을 나타낸다.
도 19a-b는 U2OS 세포에서 3개의 내인성 표적 부위인 VEGFA3, EMX1 및 FANCF1에서 Cas9에 의해 유도된 이중 가닥 절단 (DSB) 내로의 비오티닐화 dsODN 태그의 효율적인 통합에 대한 증거를 제공한다. 이러한 진보는 비오틴 및 스트렙타비딘의 강력한 결합 친화도를 이용하여 태그 부착된 단편을 직접 물리적으로 포획할 수 있게 한다. (a) RFLP 분석은 U2OS 세포에서 3개의 내인성 표적 부위인 VEGFA3, EMX1 및 FANCF1에서 Cas9에 의해 유도된 DSB 내로의 표준 dsODN (oSQT685/686)에 비해, 비오티닐화 dsODN (oSQT1261/1262)의 % 통합 비율을 보여준다. (b) T7EI는 U2OS 세포에서 3개의 내인성 표적 부위인 VEGFA3, EMX1 및 FANCF1에서 표준 dsODN (oSQT685/686)에 비해, 비오티닐화 dsODN (oSQT1261/1262)에 의한 추정된 돌연변이 유발 빈도 %를 보여준다.
비오티닐화가 세포에서 보존된다고 가정할 때, 이것은 비오티닐화 ssODN을 포함하는 DNA 단편을 물리적으로 끌어내리고, 포획된 단편을 서열결정하고 맵핑하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 5.
본 실시예에서, 예시적인 GUIDE-Seq 방법이 변이체 Cas9 단백질과 함께 사용된다.
변형된 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 (SaCas9) 단백질은 본원에 참조로 포함된 USSN 61/127,634 및 62/165,517 및 문헌 [Kleinstiver et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities." Nature (2015) doi:10.1038/nature14592]. 표적-이탈 효과는 상기 설명한 바와 같이 평가되었다.
도 21은 EMX1, FANCF, RUNX1, VEGFA 또는 ZNF629 (서열은 표 4 참조)를 표적으로하는 sgRNA를 사용하여 D1135V/R1335Q/T1337R (VQR 변이체) 또는 D1135V/G1218R/R1335E/T1337R (VRER 변이체)에서 돌연변이를 포함하는 조작된 SpCas9 변이체에 대해 GUIDE-seq에 의해 확인된 표적-이탈 절단 부위의 수를 보여준다. 이것은 GUIDE-seq가 또한 Cas9의 조작된 버전의 게놈 전체에 걸친 특이성을 프로파일링하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. GUIDE-seq는 또한 NGA 또는 NGCG PAM을 함유하는 내인성 부위를 표적화함으로써 인간 세포에서 VQR 및 VRER SpCas9 변이체의 특이성 프로파일을 결정하기 위해 사용되었다.
Figure 112017005617270-pct00009
도 22는 본원에서 설명되는 바와 같은 예시적인 GUIDE-seq 방법을 사용하여 검출된 표적-이탈 부위에서 야생형과 D1135E SpCas9 변이체 사이의 특이성의 변화를 보여준다. GUIDE-seq는 3개의 내인성 인간 세포 부위에서 야생형 SpCas9와 D1135E 사이의 판독 수 차이를 결정하기 위해 사용되었다.
GUIDE-seq dsODN 태그 통합은 또한 야생형 및 조작된 Cas9 D1135E 변이체를 갖는 3개의 유전자에서 수행되었다. 도 23a-b에 도시된 결과는 GUIDE-seq가 조작된 Cas9 변이체를 프로파일링하기 위해 사용될 수 있다는 추가의 증거를 제공한다.
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다른 실시양태
본 발명은 그의 상세한 설명과 관련하여 설명되었지만, 상기 설명은 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 첨부되는 청구범위에 의해 규정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 다음의 청구범위의 범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION <120> GENOMEWIDE UNBIASED IDENTIFICATION OF DSBS EVALUATED BY SEQUENCING (GUIDE-SEQ) <130> 00786-0786WO1 <140> PCT/US2015/037269 <141> 2015-06-23 <150> 62/088,223 <151> 2014-12-05 <150> 62/078,923 <151> 2014-11-12 <150> 62/077,844 <151> 2014-11-10 <150> 62/015,911 <151> 2014-06-23 <160> 769 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5Phos-g <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (32)..(34) <223> Phosphorothioate linkage <400> 1 gtttaattga gttgtcatat gttaataacg gtat 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5Phos-a <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (32)..(34) <223> Phosphorothioate linkage <400> 2 ataccgttat taacatatga caactcaatt aaac 34 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtgactgg agtcctctct atgggcagtc 60 ggtga 65 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 caagcagaag acggcatacg agatctagta cggtgactgg agtcctctct atgggcagtc 60 ggtga 65 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 caagcagaag acggcatacg agatttctgc ctgtgactgg agtcctctct atgggcagtc 60 ggtga 65 <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 caagcagaag acggcatacg agatgctcag gagtgactgg agtcctctct atgggcagtc 60 ggtga 65 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 caagcagaag acggcatacg agataggagt ccgtgactgg agtcctctct atgggcagtc 60 ggtga 65 <210> 8 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 caagcagaag acggcatacg agatcatgcc tagtgactgg agtcctctct atgggcagtc 60 ggtga 65 <210> 9 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 caagcagaag acggcatacg agatgtagag aggtgactgg agtcctctct atgggcagtc 60 ggtga 65 <210> 10 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 caagcagaag acggcatacg agatcctctc tggtgactgg agtcctctct atgggcagtc 60 ggtga 65 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 aatgatacgg cgaccaccga gatcta 26 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 atcaccgact gcccatagag aggactccag tcac 34 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 gtgactggag tcctctctat gggcagtcgg tgat 34 <210> 15 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> Phos-g <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> Phosphorothioate linkage <400> 15 gatcggaaga gcca 14 <210> 16 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 16 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgcnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatc 77 <210> 17 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 17 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctatnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 18 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 18 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atcctctnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 19 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 19 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gagtagannw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 20 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 20 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg taaggagnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 21 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 21 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctgcatannw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 22 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other 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modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 24 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg acattgtnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 25 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 25 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctgatggnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 26 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 26 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg tacctagnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 27 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 27 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc agagctannw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 28 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 28 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc atagtgannw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 29 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 29 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact acctagtnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 30 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 30 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc gcgatatnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 31 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (38)..(39) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (41)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (44)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Phosphorothioate linkage <400> 31 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ggattgtnnw nnwnnacact ctttccctac 60 acgacgctct tccgatct 78 <210> 32 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 32 ggatctcgac gctctcccta taccgttatt aacatatgac a 41 <210> 33 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 ggatctcgac gctctccctg tttaattgag ttgtcatatg ttaataac 48 <210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 cctctctatg ggcagtcggt gatacatatg acaactcaat taaac 45 <210> 35 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 cctctctatg ggcagtcggt gatttgagtt gtcatatgtt aataacggta 50 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 36 gagtccgagc agaagaagaa ngg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 37 gggtgggggg agtttgctcc ngg 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 38 gaccccctcc accccgcctc ngg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 39 ggtgagtgag tgtgtgcgtg ngg 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 40 gtcatcttag tcattacctg ngg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 41 ggaatccctt ctgcagcacc ngg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 42 gggaaagacc cagcatccgt ngg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 43 gaacacaaag catagactgc ngg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 44 ggcccagact gagcacgtga ngg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 45 ggcactgcgg ctggaggtgg ngg 23 <210> 46 <400> 46 000 <210> 47 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5Phos modified a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(4) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (36)..(38) <223> Phosphorothioate linkage <400> 47 nnnngtttaa ttgagttgtc atatgttaat aacggtat 38 <210> 48 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5Phos modified a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(4) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (36)..(38) <223> Phosphorothioate linkage <400> 48 nnnnataccg ttattaacat atgacaactc aattaaac 38 <210> 49 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5Phos-g <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (35)..(38) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> misc_feature <222> (36)..(38) <223> Phosphorothioate linkage <400> 49 gtttaattga gttgtcatat gttaataacg gtatnnnn 38 <210> 50 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5Phos-a <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 gcggcggctg cacaaccagt ggag 24 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 ggttgtgcag ccgccgctcc 20 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 ggttgtgcag ccgccgctcc agag 24 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 ggtgcatttt caggaggaag 20 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 ggtgcatttt caggaggaag cgat 24 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 gagatgtagg gctagagggg 20 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 gagatgtagg gctagagggg tgag 24 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 gcgagcagcg tcttcgagag 20 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 gcgagcagcg tcttcgagag tgag 24 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 gtgcggcaag agcttcagcc 20 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 gtgcggcaag agcttcagcc agag 24 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 gcagaaggga ttccatgagg 20 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 gcagaaggga ttccatgagg tgcg 24 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 gaagggattc catgaggtg 19 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 gaagggattc catgaggtgc gcg 23 <210> 81 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 gggtgcattt tcaggagga 19 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 gggtgcattt tcaggaggaa gcg 23 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 gcagacggca gtcactaggg 20 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 gcagacggca gtcactaggg ggcg 24 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 gctgggtgaa tggagcgagc 20 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 gctgggtgaa tggagcgagc agcg 24 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 87 gtggggggag tttgctccng g 21 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 88 gagtgagtgt gtgcgtgngg 20 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 atgcgtgggg ggtgtttgct cccgggcaat gaggtaagag 40 <210> 109 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 tttgagggtg gggagtttac tcctggaagt agagaagaaa 40 <210> 110 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 aaaggtgggg gtagagtttg ctccaggtgt cagaaaagac 40 <210> 111 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 aagggggtgg ggggagtttg ctcctggacc ccctatttct 40 <210> 112 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 atagggaggg tggagtttgc tcctggggat ggaagggccg 40 <210> 113 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 tcacggggga gggagtttgc tcctggggaa cctgtgatcc 40 <210> 114 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 tgtgggatgg agggagtttg ctcctggggt gtcagaatgt 40 <210> 115 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 gttgggtaag taagggaagt ttgctcctgg tccctgctgg 40 <210> 116 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 agtttagtgg agggagcttg ctcctggctg gctggagggc 40 <210> 117 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 attgctggtg ggggagcttg ctccagggaa ggaatggaag 40 <210> 118 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 gtgggtgggg ggagtttgcc ccaggccaca ccaggagtct 40 <210> 119 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 ccgcctcccc cacaccccgc atccggtgtg tctccgcctg 40 <210> 120 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 gaaacccccg ccatccccgc ctcaggagag tggtcctcac 40 <210> 121 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 ttcccccctc cacccccgcc cccggcttta gggattttta 40 <210> 122 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 cctgaccctg tccaccccac ctcaggacgt tctccagggg 40 <210> 123 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 tgccgccccc ccaccccaac tccggagctc cccaggttgg 40 <210> 124 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 cggggggccc tcccacctcg cccctggcct gtggtccctc 40 <210> 125 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 tgtctccctc cccaccccac ctctgggtaa tctcttcaca 40 <210> 126 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 caggacacac cccaccccac ctcaggtgtc ctgctgcccc 40 <210> 127 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 atgacccccc ccccaccccg cccccggcca cgcggctgac 40 <210> 128 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 cacaacaccc ccccacccca ccccaggcaa ggaatagcta 40 <210> 129 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 caattccccc ccaccccgcc tcaggaaaga ataaacctca 40 <210> 130 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 ggaacccccc ccccccccgc ccccggagac aagaccacac 40 <210> 131 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 aatcaacccc cccaccccgc ttcaggtgat tctaatgtgc 40 <210> 132 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 aggacttccc ccacaccccg ccccaggatc atctcttggg 40 <210> 133 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 cgcccccacc cccaccccgc ccccggtctg ctcctcctcc 40 <210> 134 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 tgggtccccc tcctccctgt ctcagggtgg 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 aggctccccc ccctccccgc ctcgggccag ccgcggcggc 40 <210> 141 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 ggccgccccc ccaccccgcc gccggccgcc tcccgcccgc 40 <210> 142 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 tctctacccc tccaccccgc ctccgggcaa gtgaggaacc 40 <210> 143 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 accatgcccc ctccacccca cctctgacca gaaatagcag 40 <210> 144 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 cagagacccc ccccacccca ccccaggaat cctgaaacca 40 <210> 145 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 ggcggcctcc ccccacccag cctcgggccc cagtcactca 40 <210> 146 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 ccgacacacc cccccccgcc tccggggttc cccgctcctc 40 <210> 147 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 ccccgacccc ctccaccccg cctccgggcg cgggctccgg 40 <210> 148 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 tgcaacctcc acctccccgc ctcaggtgat cctcccactt 40 <210> 149 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 ccctccaccc cccaccccgc cccgggtttc aagtgatttt 40 <210> 150 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 tgaaccaccc ccaccccacc ccagggaggg aaggagcctt 40 <210> 151 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 taaggacccc tcacaccccg cccctgggtt tagagttcca 40 <210> 152 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 tgtgtacccc accaccccgc cccaggtgtc aggataagga 40 <210> 153 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 aaacccccct ccccgccccg cccccggcgg gggaacccaa 40 <210> 154 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 ggaccccccc accaccccgc cccgggaccc tgaaagcata 40 <210> 155 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 cccacaccca ccaccccgcc tcagatcacc tttcactttc 40 <210> 156 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 gacatccccc caccacccca cccccggcca ccccaagaac 40 <210> 157 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 ttgcacaccc ccccaccccg cctcaggacg tccaacaggg 40 <210> 158 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 ttttagccaa ccccaccccg cctctggtgt cccactgagt 40 <210> 159 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 cctcgccctc cccattccgc cccgggctcc tccgcttatt 40 <210> 160 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 agcagccgcc cccaccccgc ccccggccgc tgccatcaca 40 <210> 161 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 aagtaccccc cccaccccgc cacaggcaca cctcatagga 40 <210> 173 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 ctaggggccc ctccaccccg cctctggcca agttttgagg 40 <210> 174 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 ctgaggcccc cccgccccgc ctcaggttaa gatttccaac 40 <210> 175 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 aagagaaggc agatccctct ccaccccacc ccaggcagga 40 <210> 176 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 cctccatccc ccccacccca ccccgggatg ctgtcggggg 40 <210> 177 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 ctgccacccc 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Synthetic oligonucleotide <400> 188 gtgtcccctc ccaccccgcc tccagaggaa gaatatgttc 40 <210> 189 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 aaaagacccc ccccaccccg cccccggctg ctgttgcaga 40 <210> 190 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 cctttcccca ccccgccccg cctctggtcc aaccctgtct 40 <210> 191 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 191 acaatgcccc ccccacccca cctctggcct gtggaaaaac 40 <210> 192 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 192 cttttatcct ccccaccccg ccccgggtca cagggtgctg 40 <210> 193 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 193 cccccccccc ccccccccgc cccgggcatc 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 ggccccgccc ctccaccccg ccactggctc agagcaaagc 40 <210> 200 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 cccgcccacc ccaccccacc tcaggagcca ggctgagccc 40 <210> 201 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 ctgactcccc tccaccccgg ctcgggtcta tctgttgcag 40 <210> 202 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 attaacaccc tccaccccac cacaggagtt tccttctaaa 40 <210> 203 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 ccctttcccc cccaccccaa ctcaggtgga gggggagcag 40 <210> 204 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 ccgcaccccc ccccccccgc ccccggccca gttcacaaga 40 <210> 205 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 cactgccccc acccaccccg cctctggccc atgtattctg 40 <210> 206 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 aatgcccccc accaccccac ctcgggagaa atttccactt 40 <210> 207 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 cagagagctc ccccaccccg ccccggggct ccggttcgac 40 <210> 208 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 agccctgccc cccaccccgc cccaggggac actgggtgat 40 <210> 209 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 cccaccccca cccccacccc atctctggcg ctctttgctt 40 <210> 210 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 cactcccacc cccaccccgc cacggggtag gtacccatga 40 <210> 211 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 agaaagaccc cccaccccgc cccaggagag atgtattttc 40 <210> 212 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 catcaacacc ccccacccca ccccgggcac cactggcccc 40 <210> 213 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 tttaccaccc ccccaccccg cccctggcag gccccagtgt 40 <210> 214 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 tcgcagaccc ccccacccca ccccaggaac catcccagag 40 <210> 215 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 catgcgtccc cccccccccg cctcaggcgc cccccgccca 40 <210> 216 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 cctgtccctc cccaccccgc cttggggcac tctgctttgc 40 <210> 217 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 tccagccccc acctccccgc ctcgggctcc tcccgcttcg 40 <210> 218 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 tggtcaccca ctactccccg cctcaggcca cctcgggctc 40 <210> 219 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 taatgccccc caccacccca cccccggctc cacatgttga 40 <210> 220 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 gtcccccccc cccccccgcc tccggcctcc atcccttcag 40 <210> 221 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 tgtggggggt gagtgtgtgt gtgggggggc acttgtggag 40 <210> 222 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 tctgtgtggg tgagtgtgtg tgtgtggtgg gagtgagggg 40 <210> 223 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 cttggtgagt gtgtgtgtgc atgtgggcac acacatgagt 40 <210> 224 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 actaggtgag caagtgtgtg tgtgtggggc ggggggaggg 40 <210> 225 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 ggggtgagtc agtgtgtgag tgaggtgtgt gtgtgtgtgt 40 <210> 226 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 agtgagtgaa tgagtgtgtg tgtgtggggt cacacgtgtg 40 <210> 227 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 tgtgcgcgag tgagtgtgtg cgcggggtgc gcgcgcgggc 40 <210> 228 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 gtgagtgagt gagtgagtga gtgaggaagt agattccccc 40 <210> 229 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 atgtgtgggt gagtgtgtgc gtgaggacat ttaagatcta 40 <210> 230 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 ggtgtgtgag tgagtgtgtg tatgggggca gtgttcgggg 40 <210> 231 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 ggagagagag tgagtgtgtg catgaggaac tgtcaaacac 40 <210> 232 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 cttggatgag tgagtgagtg agtggggagt gtctgtgaag 40 <210> 233 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 gtgggtgagt gagtgtgtgc gtgtggggtt gagggcgttg 40 <210> 234 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 gtgagtgagt aagtgagtga gtgagggagt gagttgggat 40 <210> 235 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 gtgtgagtga gtgtgtgtgt gtgagagaga gagagagaga 40 <210> 236 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 agggtagagt gagtgtgtgt gtgtggtgag aagtatgtgc 40 <210> 237 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 agtgagcgag tgagtgtgtg tgtgggggga gtggtggtgt 40 <210> 238 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 ggggtgtggg tgagtgtgtg cgtgagagcg ctcatgtggt 40 <210> 239 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 atttgttgag tgaatgtgtg cgtgaggtca ggccaagaag 40 <210> 240 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 gggagtgggt gagtgagtgc gtgcgggtgg cgatgcaagc 40 <210> 241 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 ggtggatgac tgtgtgtgtg ggggtgtgtg ttttcacacg 40 <210> 242 <211> 40 <212> DNA <213> 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Synthetic oligonucleotide <400> 247 gcgtgtgagt aagtgtgtgt gtgtggaggg ggtgggaggg 40 <210> 248 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 agtgagtgag tgagtgtgtg tgtggggggg actcggcttg 40 <210> 249 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 gcgagcgagt gggtgtgtgc gtggggggtc agccaaactt 40 <210> 250 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 atgtgtgagt gagtgtgtgc gtgtgatcct gggtgctgcc 40 <210> 251 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 251 atggggtgaa tgagtgtgtg ctctggggat ggaagaaagc 40 <210> 252 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 gtgtgtgagt gagtgtgtgt gtgtgagtgt 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 taacgctgag tgagtgtatg cgtgtggctt tagcgggaag 40 <210> 259 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 cgaggtgaga gagtgtgtgc acggggccac ttctccagac 40 <210> 260 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 260 ctggtgtgtg agtgtgtgtg tgtggtccag ggggtggtgg 40 <210> 261 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 261 gtagaagtcc gaggagagga agaaagggtt ctggagctct 40 <210> 262 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 262 gaggaggccg agcagaagaa agacggcgac agatgttggg 40 <210> 263 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 263 cctgagtccg agcagaagaa gaagggctcc catcacatca 40 <210> 264 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 264 ggggaatcca agcaggagaa gaaggaggga aaaaccactc 40 <210> 265 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 265 atgatcatcc aagcagaaga agaagagaag gattttggca 40 <210> 266 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 gtcagagtta gagcagaaga agaaaggcat ggagtaaagg 40 <210> 267 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 acaaagtctg agcacaagaa gaatggtgag aaggaataca 40 <210> 268 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 caaaacgtct gagcagaaga agaatggaca gaactctgag 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 274 gaccccctcc accccgcctc cgg 23 <210> 275 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 gtcatcttag tcattacctg agg 23 <210> 276 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 gggaaagacc cagcatccgt ggg 23 <210> 277 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 277 ggtgagtgag tgtgtgcgtg tgg 23 <210> 278 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 278 gagtccgagc agaagaagaa ggg 23 <210> 279 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 279 gaacacaaag catagactgc ggg 23 <210> 280 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 ggcccagact gagcacgtga tgg 23 <210> 281 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 281 ggaatccctt ctgcagcacc tgg 23 <210> 282 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 282 ggcactgcgg ctggaggtgg ggg 23 <210> 283 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 283 ggatggaggg agtttgctcc tgg 23 <210> 284 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 gggtgggggg agtttgctcc tgg 23 <210> 285 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 tagtggaggg agcttgctcc tgg 23 <210> 286 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 298 aggtggtggg agcttgttcc tgg 23 <210> 299 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 299 gggcaagggg aggttgctcc tgg 23 <210> 300 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 300 ggtgggggag agctagctcc ggg 23 <210> 301 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 301 aggaaggagg agttagctcc tgg 23 <210> 302 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 302 ggttgagggg agtctgctcc agg 23 <210> 303 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 303 aagtaaggga agtttgctcc tgg 23 <210> 304 <211> 23 <212> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 369 ctcccccccc accccgcctc agg 23 <210> 370 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 gcttccctcc accccgcatc cgg 23 <210> 371 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 371 taccccccac accccgcctc tgg 23 <210> 372 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 tgcccctccc accccgcctc tgg 23 <210> 373 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 373 gacccctccc accccgactc cgg 23 <210> 374 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 gtaccccacc accccgcccc agg 23 <210> 375 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 452 aacctccccc accccacccc agg 23 <210> 453 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 gtcccctccc accccgcctc cag 23 <210> 454 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 454 tggcccctcc gccccacctc tgg 23 <210> 455 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 455 caccccctcc cctccgcctc agg 23 <210> 456 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 456 cccccctccc accccgcctc tag 23 <210> 457 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 457 agaccccccc accccacccc agg 23 <210> 458 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 458 ctacccctcc accccgactc gga 23 <210> 459 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 459 cacacccacc accccgcctc aga 23 <210> 460 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 460 ggcccactcc actccgtctc cgg 23 <210> 461 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 461 acgccccccc accccacgtc tgg 23 <210> 462 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 462 cgcccacccc accccacctc agg 23 <210> 463 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 463 caccccccgc accccgcccc agg 23 <210> 464 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Synthetic oligonucleotide <400> 529 aagtcccggc agaggaagaa ggg 23 <210> 530 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 530 tcatccaagc agaagaagaa gag 23 <210> 531 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 531 gagtctaagc aggagaataa agg 23 <210> 532 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 532 gagcacgagc aagagaagaa ggg 23 <210> 533 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 533 ggaatccctt ctgcagcacc tgg 23 <210> 534 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 534 ggaaccccgt ctgcagcacc agg 23 <210> 535 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 541 ggagtccctc ctgcagcacc tga 23 <210> 542 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 542 gggaaagacc cagcatccgt ggg 23 <210> 543 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 543 gggaaagtcc cagcatcctt tgg 23 <210> 544 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 544 gggaaaagcc cagcatccct tgg 23 <210> 545 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 545 gggaaggacc cagcatcctg ggg 23 <210> 546 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 546 gggaaatacc cagcatccaa tgg 23 <210> 547 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 547 caagaagacc cagcttccgt agg 23 <210> 548 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 548 gagaaaagcc cagcatcctt agg 23 <210> 549 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 549 ggaaaagacc aagcatcagt ggg 23 <210> 550 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 550 atgaaagacc cagcatccat tga 23 <210> 551 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 551 gggaaggacc cagcattcct ggg 23 <210> 552 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 552 gaacacaaag catagactgc ggg 23 <210> 553 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 636 ggcactgcag acggaggtgt ggg 23 <210> 637 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 637 tacactgcgg ccgggagtgg tgg 23 <210> 638 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 638 ggcactgggg ctgggggtgc agg 23 <210> 639 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 639 gccaccgcgg caggaggcgg agg 23 <210> 640 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 640 ggcactgtgg caagaggtgg gag 23 <210> 641 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 641 ggcactgcgg gaggaggtgg gcg 23 <210> 642 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 744 gtggggggtg tttgctcccg g 21 <210> 745 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 745 ggggagggag tttgctcctg g 21 <210> 746 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 746 gggggggcag tttgctcctg g 21 <210> 747 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 747 gtgtggggaa tttgctccag g 21 <210> 748 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 748 gtgggtggag tttgctacag g 21 <210> 749 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 749 ggtgggggag cttgctccag g 21 <210> 750 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 750 gagtgagtgt gtgcgtgtgg 20 <210> 751 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 751 gagtgagtgt gtgtgtgggg 20 <210> 752 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 752 gagtgagtgt atgcgtgtgg 20 <210> 753 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 753 gtgtgagtgt gtgcgtgagg 20 <210> 754 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 754 gagtgagtgt gtgcatgagg 20 <210> 755 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 755 gagtgagtgt gtgtgtgtgg 20 <210> 756 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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oligonucleotide <400> 768 atccaagcag aagaagaaga g 21 <210> 769 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 769 ctccaagcag aagaagaaga g 21

Claims (29)

  1. 세포를 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드와 접촉시키고, 여기서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드는 15 내지 50 nt 길이이고, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 두 가닥은 세포의 게놈과 이종상동성이고; 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 5' 말단은 인산화되고; 또한 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단에 존재하거나, 또는 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재하는 것인 단계;
    세포에서 외인성 조작된 뉴클레아제를 뉴클레아제가 세포의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도하고 세포가 이중 가닥 절단을 복구하기에 충분한 시간 동안 발현시키거나 또는 활성화시켜 하나 이상의 이중 가닥 절단에서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 통합시키는 단계;
    통합된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계; 및
    게놈 DNA의 증폭된 부분의 서열을 결정하고,
    이에 의해 세포의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 검출하는 단계
    를 포함하는, 세포의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 검출하는 시험관내 또는 생체외 방법.
  2. 세포를 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드와 접촉시키고, 여기서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드는 50 내지 75 nt 길이이고, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 두 가닥은 세포의 게놈과 이종상동성이고; 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 5' 말단은 인산화되고; 또한 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단에 존재하거나, 또는 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재하는 것인 단계;
    세포에서 외인성 조작된 뉴클레아제를 뉴클레아제가 세포의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도하고 세포가 이중 가닥 절단을 복구하기에 충분한 시간 동안 발현시키거나 또는 활성화시켜 하나 이상의 이중 가닥 절단에서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 통합시키는 단계;
    통합된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계; 및
    게놈 DNA의 증폭된 부분의 서열을 결정하고,
    이에 의해 세포의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 검출하는 단계
    를 포함하는, 세포의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 검출하는 시험관내 또는 생체외 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계가
    DNA를 단편화하고;
    세포로부터 단편화된 게놈 DNA의 말단을 범용 어댑터로 라이게이션하고;
    통합된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드에 상보성인 프라이머 (프라이머 A) 및 범용 어댑터에 상보성인 프라이머 (프라이머 B)를 사용하여 라이게이션된 DNA에 대해 제1 라운드의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행한 후;
    프라이머 A에 상보성인 3' 네스티드 프라이머 (프라이머 C), 프라이머 B에 상보성인 3' 네스티드 프라이머 (프라이머 D) 및 프라이머 D에 상보성인 프라이머 (프라이머 E)를 사용하여 제2 라운드의 PCR을 수행하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조작된 뉴클레아제가 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제, 전사 활성화인자 이펙터-유사 뉴클레아제 (TALEN) 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)/Cas RNA-가이드 뉴클레아제 (CRISPR/Cas RGN)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 가닥 절단이 표적-이탈 이중 가닥 절단인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 가닥 절단이 외인성 조작된 뉴클레아제에 의해 유도된 것인 방법.
  7. 제1 세포 집단을 제1 가이드 RNA 및 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드와 접촉시키고, 여기서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드는 15 내지 50 nt의 길이이고, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 두 가닥은 세포의 게놈과 이종상동성이고; 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 5' 말단은 인산화되고; 또한 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단에 존재하거나, 또는 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재하는 것인 단계;
    제1 세포 집단에서 외인성 Cas9 조작된 뉴클레아제를 뉴클레아제가 세포의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도하고 세포가 이중 가닥 절단을 복구하기에 충분한 시간 동안 발현시키거나 또는 활성화시켜 하나 이상의 이중 가닥 절단에서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 통합시키는 단계;
    통합된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 제1 세포 집단으로부터 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계; 및
    제1 세포 집단으로부터 게놈 DNA의 증폭된 부분의 서열을 결정하는 단계;
    이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 제1 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합되는 부위의 수를 결정하는 단계;
    제2 세포 집단을 제2 가이드 RNA 및 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드와 접촉시키고, 여기서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드는 15 내지 50 nt의 길이이고, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 두 가닥은 세포의 게놈과 이종상동성이고; 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 5' 말단은 인산화되고; 또한 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단에 존재하거나, 또는 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재하는 것인 단계;
    제2 세포 집단에서 외인성 Cas9 조작된 뉴클레아제를 뉴클레아제가 제2 세포 집단의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도하고 세포가 이중 가닥 절단을 복구하기에 충분한 시간 동안 발현시키거나 또는 활성화시켜 하나 이상의 이중 가닥 절단에서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 통합시키는 단계;
    제2 세포 집단으로부터 통합된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계;
    제2 세포 집단으로부터 게놈 DNA의 증폭된 부분의 서열을 결정하는 단계;
    이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 제2 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합되는 부위의 수를 결정하는 단계;
    이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 제1 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합된 부위의 수를 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 제2 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합된 부위의 수와 비교하는 단계
    를 포함하고, 여기서 보다 적은 표적-이탈 부위에 통합된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 보다 특이적인 것인, 복수개의 가이드 RNA 중 어느 것이 가장 특이적인지, 즉 가장 적은 표적-이탈 이중 가닥 절단을 유도하는지 결정하는 시험관내 또는 생체외 방법.
  8. 제1 세포 집단을 제1 가이드 RNA 및 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드와 접촉시키고, 여기서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드는 50 내지 75 nt의 길이이고, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 두 가닥은 세포의 게놈과 이종상동성이고; 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 5' 말단은 인산화되고; 또한 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단에 존재하거나, 또는 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재하는 것인 단계;
    제1 세포 집단에서 외인성 Cas9 조작된 뉴클레아제를 뉴클레아제가 세포의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도하고 세포가 이중 가닥 절단을 복구하기에 충분한 시간 동안 발현시키거나 또는 활성화시켜 하나 이상의 이중 가닥 절단에서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 통합시키는 단계;
    통합된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 제1 세포 집단으로부터 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계; 및
    제1 세포 집단으로부터 게놈 DNA의 증폭된 부분의 서열을 결정하는 단계;
    이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 제1 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합되는 부위의 수를 결정하는 단계;
    제2 세포 집단을 제2 가이드 RNA 및 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드와 접촉시키고, 여기서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드는 50 내지 75 nt의 길이이고, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 두 가닥은 세포의 게놈과 이종상동성이고; 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드의 5' 말단은 인산화되고; 또한 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단에 존재하거나, 또는 2개의 포스포로티오에이트 연결이 두 3' 말단 및 두 5' 말단에 존재하는 것인 단계;
    제2 세포 집단에서 외인성 Cas9 조작된 뉴클레아제를 뉴클레아제가 제2 세포 집단의 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도하고 세포가 이중 가닥 절단을 복구하기에 충분한 시간 동안 발현시키거나 또는 활성화시켜 하나 이상의 이중 가닥 절단에서 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 통합시키는 단계;
    제2 세포 집단으로부터 통합된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA의 일부를 증폭시키는 단계;
    제2 세포 집단으로부터 게놈 DNA의 증폭된 부분의 서열을 결정하는 단계;
    이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 제2 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합되는 부위의 수를 결정하는 단계;
    이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 제1 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합된 부위의 수를 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 제2 세포 집단의 게놈 DNA 내로 통합된 부위의 수와 비교하는 단계
    를 포함하고, 여기서 보다 적은 표적-이탈 부위에 통합된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 보다 특이적인 것인, 복수개의 가이드 RNA 중 어느 것이 가장 특이적인지, 즉 가장 적은 표적-이탈 이중 가닥 절단을 유도하는지 결정하는 시험관내 또는 생체외 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조작된 뉴클레아제가 Cas9 뉴클레아제이고, 방법이 Cas9 뉴클레아제를 게놈 내의 표적 서열로 유도하는 가이드 RNA를 세포에서 발현시키는 것을 또한 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 30-35 nt 길이인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 비오티닐화된 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 증폭시키는 단계가
    게놈 DNA를 단편으로 전단하고;
    이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 단편을 비오틴에 결합시킴으로써 단리하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 평활 말단을 갖는 것인 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 5' 말단에 1, 2, 3, 또는 4 nt 오버행을 갖는 것인 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 5' 말단에서 인산화되고, 3' 말단에서 포스포로티오에이트화되는 것인 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 무작위화 DNA 바코드를 함유하는 것인 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 증폭시키는 단계가
    게놈 DNA를 단편으로 전단하고;
    단일 꼬리 서열결정 어댑터의 말단 복구, a-꼬리 형성, 및 라이게이션에 의해 서열 결정을 위한 단편을 제조하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  19. 제7항 또는 제8항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
  20. 제2항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 60-65 nt 길이인 방법.
  21. 제7항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 30-35 nt 길이인 방법.
  22. 제8항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 60-65 nt 길이인 방법.
  23. 제7항 또는 제8항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 비오티닐화된 것인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 증폭시키는 단계가
    게놈 DNA를 단편으로 전단하고;
    이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 단편을 비오틴에 결합시킴으로써 단리하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  25. 제7항 또는 제8항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 평활 말단을 갖는 것인 방법.
  26. 제7항 또는 제8항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 5' 말단에 1, 2, 3, 또는 4 nt 오버행을 갖는 것인 방법.
  27. 제7항 또는 제8항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 5' 말단에서 인산화되고, 3' 말단에서 포스포로티오에이트화되는 것인 방법.
  28. 제7항 또는 제8항에 있어서, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드가 무작위화 DNA 바코드를 함유하는 것인 방법.
  29. 제7항 또는 제8항에 있어서, 증폭시키는 단계가
    게놈 DNA를 단편으로 전단하고;
    단일 꼬리 서열결정 어댑터의 말단 복구, a-꼬리 형성, 및 라이게이션에 의해 서열 결정을 위한 단편을 제조하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
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