JP2009516749A - 核酸の配列決定のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2005年11月22日に出願された米国仮特許出願第11/286,626号、および2005年12月5日に出願された米国仮特許出願第11/295,406号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第11/286,626号および米国仮特許出願第11/295,406号の全開示は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、ヌクレオチド・アナログおよびこれを利用した核酸配列法に関する。
合成による核酸配列解読によって、生物組織および生物機能に対する理解に変革をもたらすことが可能である。従来の配列法では、サンプル・ベース核酸の増幅および/または電気泳動ゲルの利用によって配列情報を得てきたが、最近では、増幅バイアスに影響されない高密度配列情報を得る方法として、単一分子配列法が提供されている。非特許文献1を参照のこと。
本発明が提供する方法および組成物は、テンプレート依存型の配列反応に単一の塩基を一回ずつ導入することが可能である。本発明により、標的核酸のホモポリマー領域を含む全領域についてテンプレート依存型の合成配列が可能になる。このため、さらに本発明により、ホモポリマー領域に存在するヌクレオチドの数が測定される。
本発明は、テンプレート/プライマー・デュープレクスのプライマー部分に対する第二ヌクレオチド(N+1;Nは第一塩基付加)付加を阻害する、合成による配列解読である。実施形態によっては、阻害体の局所濃度を濃くすることによって(N+1)組み込み阻害が実行され、この阻害体全体の濃度は、組み込み阻害全般を実行するには不十分とすればよい。一面で本発明は、核酸アナログを提供し、テンプレート依存型の合成配列においてこのアナログを利用する方法を提供している。本発明のアナログにはブロック基が含まれており、これによりテンプレート依存反応において、テンプレート−プライマー・デュープレクスのプライマー部分に単一ヌクレオチドを付加することが可能になる。本発明のアナログには開裂可能リンカーが含まれており、これによってブロック基の除去が可能になりプライマーへ後続の(N+1)塩基を付加することが可能になる。本発明のヌクレオチド・アナログを利用することによってホモポリマー領域の高精度配列が可能になり、この領域に存在するヌクレオチドの数の測定が可能になる。
本発明のヌクレオチド・アナログは、式Iまたは式IIの汎用構造を有している。
既述のように本発明による方法は、ホモポリマー領域を含む核酸配列法を改良したものである。この方法は、核酸テンプレート−プライマー・デュープレクスを、(i)プライマ−へのヌクレオチド付加を触媒するポリメラーゼと、(ii)リンカーによってブロッカーと共有結合した第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログを含む標識ヌクレオチド・アナログとに曝露することを含む。このときの条件は、ポリメラーゼがテンプレートの第一塩基に相補的である位置で、標識ヌクレオチド・アナログをプライマーに加えることが可能であり、次の下流塩基に相補的である位置では、別のヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログをプライマーに加えられないという条件である。この曝露ステップの後に、プライマーに組み込まれるヌクレオチド・アナログが検知される。ブロッカーが除去されると、他のヌクレオチドがプライマーに組み込まれることが可能になる。標識、例えば、本明細書に記載の光学検知可能な標識の一つも、ブロッカーと同時に除去することができる。
核酸テンプレートは、デオキシリボ核酸(DNA)および/またはリボ核酸(RNA)を含む。核酸テンプレートは合成することもできるし、天然源から誘導することもできる。実施形態によっては、核酸テンプレート分子が、タンパク質、脂質、および、非テンプレート核酸のような種々の他の成分を含む生物サンプルから単離される。核酸テンプレート分子は、動物、植物、バクテリア、菌類、または、その他の細胞生物から得られる細胞物質から得ることも可能である。本発明において利用される生物サンプルには、ウイルス粒子もしくは調製物が含まれる。核酸テンプレート分子は、有機体から直接得ることもできるし、例えば血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞、および、組織などの有機体から得られる生物サンプルから直接得ることもできる。いずれの組織もしくは体液標本も、本発明における核酸用のソースとして利用することができる。核酸テンプレート分子もまた、一次細胞培養もしくは細胞系のような培養細胞から単離可能である。テンプレート核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたはその他の細胞内病原体によって感染させることもできる。サンプルは、生物標本、DNAライブラリ、ウイルスDNA、または、ゲノムDNAから抽出される全RNAとすることもできる。
本発明に有用な核酸ポリメラーゼには、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、および、以上の突然変異体もしくは変更型が含まれている。DNAポリメラーゼおよびその特性については、Kornberg、Baker共著、DNA Replication、第二版、1991年、W.H.Freeman社、ニューヨーク州、ニューヨーク市、において詳述されている。本発明に有用な既知のおよび従来のDNAポリメラーゼには、限定的ではないが以下の例がある。Pyrococcus furiosus(Pfu)DNAポリメラーゼ(Lundberg、他著Gene、108:1,1991年、Stratagene社)、Pyrococcus woesei(Pwo)DNAポリメラーゼ(Hinnisdaels、他著Biotechniques、20:186−8,1996年、Boehringer Mannheim社)、Thermus thermophilus(Tth)DNAポリメラーゼ(Myers、Gelfand共著、Biochemistry、30:7661,1991年)、Bacillus stearothermophilusDNAポリメラーゼ(Stenesh、McGowan共著、Biochim Biophys Acta、475:32,1977年)、Thermococcus litoralis(Tli)DNAポリメラーゼ(Vent(商標)DNAポリメラーゼ、Cariello、他著Polynucleotides Res、19:4193,1991年、New England Biolabs)、90Nm(商標)DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、Stoffel断片、ThermoSquenase(登録商標)(Amersham Pharmacia Biotech社、イギリス)、Therminator(商標)(New England Biolabs)、Thermotoga maritima(Tma)DNAポリメラ−ゼ(Diaz、Sabino共著、Braz J. Med.Res、31:1239,1998年)、Thermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼ(Chien他著J.Bacteoriol、127:1550,1976年)、DNAポリメラーゼ、Pyrococcus kodakaraensis KOD DNAポリメラーゼ(タカギ他著、Appl.Environ.Microbiol、63:4504,1997年)、JDF−3DNAポリメラーゼ(Thermococcus sp.JDF−3、国際公開第0132887)、PyrococcusGB−D(PGB−D)DNAポリメラーゼ(Deep Vent(商標)DNAポリメラーゼ、Juncosa−Ginesta他著、Biotechniques、16:820,1994年、New England Biolabs)、UITmaDNAポリメラーゼ(好熱性Thermotoga maritimaより得られる、Diaz、Sabino共著、Braz J.Med.Res、31:1239,1998年、PE Applied Biosystems)、TgoDNAポリメラーゼ(thermococcus gorgonariusより得られる、Roche Molecular Biochemicals)、E.coli DNAポリメラーゼI(Lecomte、Doubleday共著、PolynucleotidesRes、11:7505,1983年)、T7DNAポリメラーゼ(Nordstrom他著、J Biol.Chem、256:3112,1981年)、古細菌DP1I/DP2DNAポリメラーゼII(Cann)、他著、Proc.Natl.Acad.Sci、95:14250,1998年、アメリカ)。
好ましい実施形態では、核酸テンプレート分子が、基板(本明細書では表面ともよばれる)に付着され、ここで説明される単一分子配列によって分析される。核酸テンプレート分子が表面に付着されると、テンプレート−プライマー・デュープレクスが光学的に個々に分解可能となる。本発明に利用される基板は、二次元もしくは三次元とすることができ、平面(例、ガラス・スライド)を含むことができ、あるいはこのように形成することができる。基板には、ガラス(例、制御細孔ガラス(CPG))、石英、プラスチック(例、ポリスチレン(低架橋および高架橋ポリスチレン)、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリ(メチメタクリレート))、アクリル共重合体、ポリアミド、シリコン、金属(例、アルカンチオレート誘導体化金)、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲル・マトリクス(例、シリカ・ゲル)、ポリアクロレイン、または、複合体が含まれる。
利用される標識のタイプに対して適正な任意の検知法を利用することができる。よって、代表的な検知法としては、放射性検知、吸光検知、例えばUV可視吸光検知、発光検知、例えば蛍光または化学発光、が含まれる。例えば、利用される走査法に基づいて、各基板のすべてもしくは一部を同時にあるいは連続して走査することによって、基板上の伸長プライマーを検知することができる。蛍光標識については、フォーダー(Fodor)、他(米国特許番号5,445,934)およびマシーズ(Mathies)、他(米国特許番号5,091,652)によって説明されている蛍光顕微鏡装置を利用して、選択された領域が、一つ一つあるいは一行ごとに連続して走査される。単一分子から蛍光物質を感知することが可能なデバイスには、走査トンネル顕微鏡(siM)および原子間力顕微鏡(AFM)がある。ハイブリダイゼーションのパターンの走査には、Yershov他著、Proc.Natl.Acad.Sci、93:4913、1996年に説明されているような、適正光学系(Ploem著、T.G.Mason編、Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity、pp.1〜11、Academic Press、ロンドン、1993年)が装備されたCCDカメラ(例、モデルTE/CCD512SF、Princeton Instruments、ニューヨーク州、トレントン市)が使われてもよいし、TVモニタリングによって画像化されてもよい。放射性信号についてはホスホイメージャ・デバイスを利用することができる。Johnston他著、Electrophoresis、13:566,1990年、Drmanac他著、Electrophoresis、13:566,1992年、1993年)。画像化装置の他の民間納入業者には、General Scanning Inc.、マサチューセッツ州、ウォータタウン市、www.genscan.com、Genix Technologies、カナダ、オンタリオ州、ウォータールー市、www.confocal.com、Applied Precision Inc.がある。このような検知法は特に、複数の付着テンプレート核酸を同時走査するために利用される。
上述に大まかに記載されているように、生成される画像スタックから得られた配列結果を、整列および/または編集するには、可能な配列変更(例、エラー、変異、その他による)を考慮した参照表が利用される。本来、本明細書に記載されているようにして得られた配列結果は、一つもしくは二つの塩基エラーを加えたあらゆる可能な基準配列を含む参照表と比較される。
この実施例は、ヌクレオチド・アナログ5と記される以下のヌクレオチド・アナログの合成について説明している。
この実施例は、ヌクレオチド・アナログ7であるヌクレオチド・アナログの合成を示している。
この実施例ではヌクレオチド・アナログ9であるヌクレオチド・アナログの合成が示されており、nは3である。
本実施例は、本明細書に記載のヌクレオチド・アナログを利用したテンプレート核酸の配列法を示している。
本実施例では、本発明の三種のヌクレオチド・アナログについて、ホモポリマー領域での配列時のテンプレート依存型の配列反応における組み込み機能、および、次の塩基(もしくはN+1)の組み込みを阻害する機能をテストした。これらのヌクレオチド・アナログについて、テンプレート依存型の法によるプライマーへの組み込み機能、および、「非ブロック」アナログと同程度の速度でプライマーの3’末端に組み込まれる機能を分析した。さらに、これらのヌクレオチド・アナログについて、組み込まれた後のプライマーへのさらなる塩基付加に対する阻害機能を分析した。その後、ブロック基の除去によって阻害が可逆であるかどうかが判定するためにヌクレオチド・アナログを分析した。
ここに引用されているあらゆる刊行物、特許、特許出願は、それら全体がそれぞれの個々に表示されている目的に応じて、特に参照資料によって引用されている。
本発明の特定の実施形態について説明してきたが、上記は、代表的な例であり限定的な例ではない。本明細書を検討することによって本発明の多くの変更が、当業者に明らかになるであろう。本明細書に記載のヌクレオチド・アナログの考えられる均等物には、下記以外の転では該アナログに対応し該アナログと同様の一般的特性を有し、置換基または成分について一つ以上の単純な変形があり、これによって、対象のヌクレオチド・アナログの特性に悪影響を及ぼさない化合物が含まれる。通常、本明細書に記載のヌクレオチド・アナログの成分は、容易に入手可能な開始材料、試薬、従来の合成法を利用し、さらに、本明細書に記載の一般反応スキームにおいて例示された方法またはそれを変更した方法を利用して調製すればよい。本発明の範囲は、請求項および均等物の全範囲ならびに本明細書およびその変更を参照することにより決まる。
Claims (47)
- 式Iまたは式IIのヌクレオチド・アナログであって:
各発生におけるR1、R2は、OH、NH2、F、N3、およびHからなる群から選択され、
Yは、NR’,O,S,CH2および結合からなる群から選択され、R’は、H、アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から選択され、
Aは、−S−S−、エステル、およびアミド基からなる群から選択され、
R3は、
R4は、アルキル、アルケニル、アルキニル、エーテルおよび結合からなる群から選択され、
R5は、
Arは、アリールであり、
R6は、
R7は、アルキルまたは結合であり、
R8は、S、アルキル、アルケニル、アルキニル、NR’からなる群から選択され、
R9は、NR’,O,S,および−(CH2)m−からなる群から選択され、
Lは、標識であり、
Xは、Hまたはハロゲンであり、
Zは、それぞれ独立しているOもしくはSであり、
mは、それぞれ独立している0〜50の整数であり、
nは、それぞれ独立している0〜50の整数であり、
pは、それぞれ独立している0〜50の整数である、
ヌクレオチド・アナログ - R4はグリコール・エーテルである請求項1に記載のヌクレオチド・アナログ。
- Arはフェニルまたは芳香酸である請求項1に記載のヌクレオチド・アナログ。
- nは1または4である請求項1に記載のヌクレオチド・アナログ。
- R9は−(CH2)m−である請求項1に記載のヌクレオチド・アナログ。
- nは4であり、mは3である請求項7に記載のヌクレオチド・アナログ。
- mは0、2または3である請求項7に記載のヌクレオチド・アナログ。
- R1はOHであり、R2はHである請求項1に記載のヌクレオチド・アナログ。
- B1およびB2はそれぞれ独立して、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、およびそれらのアナログからなる群から選択される請求項1に記載のヌクレオチド・アナログ。
- Lは光学検知可能な標識である請求項1に記載のヌクレオチド・アナログ。
- 前記光学検知可能な標識は蛍光標識である請求項12のヌクレオチド・アナログ。
- 前記光学検知可能な標識は、シアニン、ローダミン、フルオロセイン、クマリン、BODIPY、Alexaおよび共役マルチ染料からなる群から選択される請求項13のヌクレオチド・アナログ。
- 前記蛍光標識はCy3またはCy5である請求項13のヌクレオチド・アナログ。
- R3はアルキルまたは結合であり、LはR1、R2、R5、R6またはB2と共有結合している請求項1に記載のヌクレオチド・アナログ。
- Lはアミド結合によってR1またはR2と共有結合している請求項16のヌクレオチド・アナログ。
- 前記アミド結合は−CH2−S−S−CH2−CH2−NHCO−である請求項17のヌクレオチド・アナログ。
- Lはアミド結合によってR5またはR6と共有結合している請求項1に記載のヌクレオチド・アナログ。
- B1およびB2はそれぞれ独立して、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、およびこれらのアナログからなる群から選択される請求項21に記載のヌクレオチド・アナログ。
- Lは光学検知可能な標識である請求項21に記載のヌクレオチド・アナログ。
- 前記光学検知可能な標識は蛍光標識である請求項23に記載のヌクレオチド・アナログ。
- 前記光学検知可能な標識は、シアニン、ローダミン、フルオロセイン、クマリン、BODIPY、alexaおよび共役マルチ染料からなる群から選択される請求項24に記載のヌクレオチド・アナログ。
- 前記蛍光標識はCy3またはCy5である請求項24に記載のヌクレオチド・アナログ。
- R3がアルキルまたは結合であるとき、LはR11と共有結合している請求項21に記載のヌクレオチド・アナログ。
- Lは蛍光標識である請求項28に記載のヌクレオチド・アナログ。
- 前記蛍光標識は、Cy5、Cy3、ローダミン、フルオロセイン、クマリン、BODIPY、alexaおよび共役マルチ染料からなる群から選択される請求項29に記載のヌクレオチド・アナログ。
- R12は、B1と結合したアルキニル部分を含む請求項31に記載のヌクレオチド・アナログ。
- R12は、B2と結合したアルキニル部分を含む請求項31に記載のヌクレオチド・アナログ。
- 核酸テンプレートの配列を決定するステップであって、
(a)ポリメラーゼによってヌクレオチド・アナログをプライマーに付加することが可能であるという条件のもとに、3’−OH末端を有する前記プライマーにハイブリダイズされた核酸テンプレートを、(i)前記プライマーに対するヌクレオチド付加を触媒する前記ポリメラーゼ、および(ii)請求項1〜34のいずれか1項に記載のヌクレオチド・アナログに曝露するステップ、
(b)ステップ(a)において前記プライマーに付加された前記ヌクレオチド・アナログを検知するステップ、
(c)前記ヌクレオチド・アナログから標識を除去するステップ、
(d)ステップ(a)、(b)、(c)を反復して前記テンプレートの配列を決定するステップ
を含む方法。 - 核酸テンプレートの配列を決定する方法であって、
(a)ポリメラーゼによって標識ヌクレオチド・アナログが第一の塩基に対して相補的な位置にあるプライマーに付加される一方、別のヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログが第二の塩基に対して相補的な位置にあるプライマーに付加されることを防ぐという条件のもとに、3’末端を有するプライマーにハイブリダイズされる第一および第二の連続する塩基を含む前記核酸テンプレートを、(i)前記プライマーに対するヌクレオチド付加を触媒するポリメラーゼ、および(ii)リンカーによってブロック基に共有結合されている第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログを含む前記標識ヌクレオチド・アナログに曝露するステップ、
(b)ステップ(a)において前記プライマーに付加された前記ヌクレオチド・アナログを検知するステップ
(c)前記ブロック・ヌクレオチドまたは前記ブロック・ヌクレオチド・アナログを除去するステップ、
(d)ステップ(a)、(b)、(c)を反復して前記テンプレートの配列を決定するステップ、
を含む方法。 - 前記ブロック基は第二のヌクレオチドもしくは第二ヌクレオチド・アナログである請求項36に記載の方法。
- 前記リンカーは、前記第一のヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログの塩基に、および前記第二のヌクレオチドまたは第二ヌクレオチド・アナログの塩基に共有結合される請求項37に記載の方法。
- 前記リンカーは約4〜約50原子を含む請求項38に記載の方法。
- 前記リンカーは約15〜約50原子を含む請求項38に記載の方法。
- 前記リンカーはtrans型の二重結合を含むアルキニル基またはアルケニル基によって、前記第一のヌクレオチドまたは前記第一ヌクレオチド・アナログに共有結合される請求項36に記載の方法。
- ステップ(a)において、前記標識ヌクレオチド・アナログは請求項1、20、21、28または31に記載のヌクレオチド・アナログを含む請求項36に記載の方法。
- ステップ(b)において、前記標識は前記ブロック基と同時に除去される請求項36に記載の方法。
- 前記標識は光学検知可能な標識である請求項36に記載の方法。
- 前記条件は単一の分子を個々に検知して配列するのに充分である請求項36に記載の方法。
- テンプレートの少なくとも一部分に対して相補的なプライマーと、ポリメラーゼとを用いてホモポリマー部位を含む核酸テンプレートの配列を決定することの改良方法であって、
前記改良は、前記ポリメラーゼによって単一標識ヌクレオチド・アナログのみが、前記ホモポリマー部位の一つの塩基に対して相補的な位置にある前記プライマーから伸長している鎖に付加される条件において、リンカーによってブロック基に共有結合される第一のヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログを含む標識ヌクレオチド・アナログの存在下で、配列反応の各サイクルを実施するステップ
を含む方法。 - 前記ブロック基はヌクレオチドもしくはヌクレオチド・アナログである請求項46に記載の方法。
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