JP2004508054A - 方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、サンプル核酸配列における標的位置の塩基を同定する方法であって、標的位置のすぐ隣で前記サンプル核酸とハイブリダイズするプライマーを、ヌクレオチド存在下においてポリメラーゼプライマー伸長反応させる工程（ここでヌクレオチドは、標的位置における塩基と相補的である場合のみ取込まれる）、及び、ＰＰｉの放出を検出することにより前記ヌクレオチドが取込まれるか否かを決定する工程（標的塩基の同一性は、取込まれる任意のヌクレオチドの同一性から決定される）、さらに、ここで、前記ヌクレオチドがアデニン塩基を含む場合に、前記ヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログが用いられ、前記アナログのＲｐ異性体及び／又は前記アナログの分解生成物がポリメラーゼ反応工程から除去されること、を含む方法を提供するものである。
Description
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出による塩基取込みの検出に基づくＤＮＡ配列決定法における改良に関する。
【０００２】
発明の背景
ＤＮＡ配列決定は、分子遺伝解析において不可欠な道具である。ヒト及びその他の生命体の大きなゲノムの配列を決定するための試みが行われるにつれて、ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する能力がますます重要になってきている。
【０００３】
単一のＤＮＡ塩基の変化又はいくつかの塩基の変化を迅速に検出できる技術もまた、例えば遺伝病又は特定の癌の解析における臨床状況等では、遺伝解析についての重要な道具である。実際、より多くの病気が遺伝子レベルの変化（とりわけ、一塩基多型（ＳＮＰｓ））に関係があることが明らかになるにつれて、ＳＮＰｓ又はその他の変異又は遺伝子の変化を（代表的なゲノムサンプルを配列決定することによって）スクリーニングする方法、及びＳＮＰｓ（又はその他の変異／変化）をスコアリング（ｓｃｏｒｉｎｇ）する方法に対する需要が増大している。従って、より長いＤＮＡ配列を決定するための新規な配列決定技術の開発と同様に、当該技術分野において、単一の（又はいくつかの）塩基の変化を検出するための技術の開発が急速に行われてきている。１のみ又はいくつかの塩基についての、より限られた配列情報を得るためのそのようなプロトコールは、微小配列決定（ｍｉｎｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と呼ばれている。
【０００４】
ＤＮＡ配列決定についての又は標的ＤＮＡ塩基の同定についての基礎として、最も広く用いられている方法は、Ｓａｎｇｅｒによる酵素鎖−終結（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法である。従来、そのような方法は、より大きなＤＮＡ断片から得られたＤＮＡ断片をそれらの大きさによって分離するため、ゲル電気泳動法に依存する。しかしながら、近年、重量分析及びアレイ技術等の各種異なる検出戦略を用いた種々の配列決定技術が発展してきている。
【０００５】
当該技術分野において重要だと見なされている配列決定法の１の種類は、検出戦略としてＰＰｉ放出の検出を用いるものである。そのような方法は、大規模なゲノム研究、又は、臨床的な配列決定又はスクリーニングに見事に適しており、ここでは高性能で相対的にコスト効率の良い設備が必要とされることが明らかになっている。
【０００６】
ポリメラーゼ反応の間に放出される無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を検出するコンセプトに基づく配列決定方法は、文献に記載されている（例えば、ＷＯ９３／２３５６４、ＷＯ８９／０９２８３、ＷＯ９８／１３５２３、及びＷＯ９８／２８４４０）。各ヌクレオチドが、ポリメラーゼ反応の間に成長する核酸鎖に添加されると、ピロリン酸分子が放出される。これらの条件下において放出されるピロリン酸は、例えば酵素を用いて（ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ）、例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の発生により、容易に検出できることが明らかになっている。そのような方法によれば、電気泳動法及び標識の使用を必要とすることなく、標的位置において塩基を同定することができ、そして、ＤＮＡを簡易かつ迅速に配列決定することができる。
【０００７】
最も基本的には、ＰＰｉに基づく配列決定反応は、プライマーに対するポリメラーゼ伸長反応を単に行うこと、及び、ＰＰｉが放出されたか否かを検出することにより、ヌクレオチドが取込まれたか否かを検出すること、を含む。好ましくは、このＰＰｉの検出は、酵素を用いて達成され、最も好ましくは、いわゆるＥＬＩＤＡと呼ばれるルシフェラーゼに基づく光検出反応を用いて達成され得る（以下をさらに参照）。
【０００８】
取込みのためのヌクレオチドとして添加されるｄＡＴＰは、ＰＰｉ検出に用いられるルシフェラーゼ反応を阻害することが明らかになっている。従って、基本的なＰＰｉに基づく配列決定法に対する主な改善点は、ｄＡＴＰの代わりに、ｄＡＴＰアナログ（特に、ｄＡＴＰαｓ）を用いることである。これは、ルシフェラーゼに対する基質として働くことはできないが、それにもかかわらず、ポリメラーゼ酵素によりヌクレオチド鎖に取込まれることができる（ＷＯ９８／１３５２３）。
【０００９】
基本的なＰＰｉに基づく配列決定技術に対するさらなる改善点には、取込まれないヌクレオチドが分解されるように、ポリメラーゼ工程の間にアピラーゼ等のヌクレオチド分解酵素を使用すること（ＷＯ９８／２８４４０に記載）、及び、鋳型へのプライマーのアニールの後に、１本鎖核酸結合タンパク質を反応混合物に使用すること（これは、誤ったシグナルの数を減少させるという有益な効果を有することが分かっている、ＷＯ００／４３５４０に記載）が含まれる。
【００１０】
しかしながら、上述の修正され、改善されたＰＰｉに基づく配列決定方法であっても、例えば、手順の効率及び／又は精度を高めること、或いは、以下で詳細に述べるように、読み取り可能な配列の長さを増大すること等においては、まだ改善の余地がある。本発明はこれらの要求に対応するものである。
【００１１】
特に、本発明は、デオキシＡＴＰ（ｄＡＴＰ）（又は、ジデオキシＡＴＰ（ｄｄＡＴＰ））のα−チオアナログ、すなわち、デオキシ或いはジデオキシＡＴＰの（１−チオ）三リン酸（又は、α−チオリン酸）アナログ、好ましくは、デオキシアデノシンα−チオ三リン酸（ｄＡＴＰαｓ）としても知られるデオキシアデノシン［１−チオ］三リン酸、を用いるＰＰｉに基づく配列決定方法に関する。ｄＡＴＰαｓは（全てのα−チオヌクレオチドアナログと同様に）、Ｒｐ異性体とＳｐ異性体の混合物として生じる。
【００１２】
ｄＡＴＰαｓ（及び／又はその他のα−チオヌクレオチド）が用いられる場合、配列決定方法の効率は、サイクル数の増加に伴って減少すること、具体的には、読み取り可能な長さが（例えば、４０乃至５０塩基に）制限されることが明らかとなっている。これは、反応系における阻害物質の蓄積によるものと考えられている。本発明は、特に、そのような阻害物質の減少又は除去に関する。
【００１３】
より詳細には、驚くべきことに、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は当該アナログの分解生成物を重合混合物から除去又は排除することにより、ＰＰｉに基づく配列決定方法、とりわけ、ルシフェラーゼに基づくＥＬＩＤＡ反応によるＰＰｉの検出に基づくそのような方法の効率が改善されることが分かっている。
【００１４】
理論による説明を要せずとも、多くの原因又は効果が、配列決定反応におけるα−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物の除去による当該有益な効果に寄与していると考えられる。これらの特定の効果についてはさらに後述するが、特に、出願人は、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物が、ポリメラーゼの活性を阻害する能力があると考えている。従って、そのような有力な効果の１つは、ポリメラーゼの活性の阻害における（これは現在のところ十分理解されていないが）、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物の効果によるものと考えられる。それゆえ、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物を排除又は除去することによって、この阻害効果を回避することができ、これにより、より効果的かつ迅速な重合反応が可能となり、ＰＰｉ検出反応においてより均等な（ｅｖｅｎ）シグナルが生じることになる。さらに、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物を除去又は排除することによって、ＤＮＡ合成の忠実度が増大、すなわち、誤った取込みが発生する数が減少する。
【００１５】
従って、一面において、本発明は、サンプル核酸配列における標的位置の塩基を同定する方法であって、
標的位置のすぐ隣で前記サンプル核酸とハイブリダイズするプライマーを、ヌクレオチド存在下においてポリメラーゼプライマー伸長反応させる工程（ここでヌクレオチドは、標的位置における塩基と相補的である場合のみ取込まれる）、及び、ＰＰｉの放出を検出することにより前記ヌクレオチドが取込まれるか否かを決定する工程（標的塩基の同一性は、取込まれる任意のヌクレオチドの同一性から決定される）、
ここで、前記ヌクレオチドがアデニン塩基を含む場合に、前記ヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログが用いられ、前記アナログのＲｐ異性体及び／又は前記アナログの分解生成物がポリメラーゼ反応工程から除去されること、
を含む、当該方法を提供するものである。
【００１６】
アデニン塩基を含むヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログの使用、及び、それらのＲｐ異性体を除去すること及び／又は前記アナログの分解生成物を除去することは本発明の本質的特徴であり、これは、取込みのためにグアニン、チミン、シトシン塩基を含むヌクレオチドのみが添加される微小配列決定反応等とは関連しない。
【００１７】
ヌクレオチドがアデニン塩基（Ａ）を含む場合という条件に従って、前記ヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログが用いられ、当該ヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素によって核酸鎖又は核酸分子に取込まれることができる任意のヌクレオチドであることができる。従って、例えば、ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、デオキシヌクレオシド三リン酸）又はジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ、ジデオキシヌクレオシド三リン酸）であることができる。
【００１８】
好ましくは、配列決定の目的のために、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、又はアデニン（Ａ）デオキシ−或いはジデオキシ−ヌクレオチドが用いられ得る。従って、ヌクレオチドは、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）、又は、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）の代わりにそのα−チオ三リン酸アナログであるｄＡＴＰαｓ（デオキシアデノシンα−チオ三リン酸アナログ、又はデオキシアデノシン［１−チオ］−三リン酸としても知られる）であることができる。同様に、ヌクレオチドは、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、又はｄｄＴＴＰ、或いは、ｄｄＡＴＰの代わりのｄｄＡＴＰαｓであることができる。
【００１９】
従って、本発明は、アデニンヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログの使用を要するが、その他の塩基（Ｇ、Ｔ、及びＣ）についてはアナログを必要とせず、天然のヌクレオチドを用いることができる（又は、実際は、ポリメラーゼ酵素により取込まれることができるならば、ヌクレオチド誘導体等の、任意のその他のヌクレオチドの使用が所望される）。従って、本発明では、アデニンヌクレオチドの少なくとも１のα−チオアナログが用いられる。
【００２０】
しかしながら、特定の場合には、１以上のその他のヌクレオチドの（すなわち、グアニン、シトシン、又はチミンヌクレオチドの）α−チオアナログを用いることもまた、望ましい。ヌクレオチドのα−チオアナログが用いられるような任意の場合において、本発明では、前記アナログのＲｐ異性体が、ポリメラーゼ反応工程から除去される。すなわち、本発明の方法において、ヌクレオチドがα−チオヌクレオチド（例えば、デオキシ−或いはジデオキシ−ヌクレオシドα−チオ三リン酸（ｄＮＴＰαＳ又はｄｄＮＴＰαＳ））である場合、当該α−チオヌクレオチドのＲｐ異性体はポリメラーゼ反応工程から除去され、及び／又はＮＴＰαＳの分解生成物が除去される。
【００２１】
従って、便宜上、本明細書において“デオキシヌクレオチドα−チオ三リン酸”（ｄＮＴＰαＳ）という語には、デオキシアデノシンα−チオ三リン酸（ｄＡＴＰαＳ）、デオキシシチジンα−チオ三リン酸（ｄＣＴＰαＳ）、デオキシグアノシンα−チオ三リン酸（ｄＧＴＰαＳ）、及びデオキシチミジンα−チオ三リン酸（ｄＴＴＰαＳ）が含まれる。同様に、“ジデオキシヌクレオチドα−チオ三リン酸”という語には、ジデオキシの相当物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）が含まれる。本明細書において、“ジデオキシヌクレオチド”という語には、３’−ヒドロキシル基が存在しない或いは修飾されている全ての２’−デオキシヌクレオチドが含まれる。従って、それは、ポリメラーゼの存在下においてプライマーに添加されることができるが、連続的な重合反応に参入することはできない。すなわち、ジデオキシヌクレオチドは“連鎖停止剤”であり、当該技術分野において周知なように、特定の配列決定方法はそのような連鎖停止ヌクレオチドを用いることができる。
【００２２】
本明細書において、“ＮＴＰαＳ”（ヌクレオシドα−チオ三リン酸）という語は、本発明に用いられ得る全てのα−チオ三リン酸ヌクレオチドアナログ（すなわち、α−チオヌクレオチド）について適用され、それには、リボ−及びデオキシリボ（又はジデオキシ）ヌクレオチドのいずれもが含まれる。これらには、特に、ｄＮＴＰαＳ及びｄｄＮＴＰαＳが含まれる。
【００２３】
合成される場合、α−チオ三リン酸ヌクレオチドアナログ（例えば、ｄｄ−、又はｄＮＴＰαＳ）は、通常、２つの異性体、Ｓｐ及びＲｐ異性体の形態で生成される。α−チオ三リン酸ヌクレオチドアナログは、キラル中心を有しており、従って、これら２つの種はエナンチオマーである。Ｓｐ異性体は、左回り（ｌｅｆｔ−ｈａｎｄｅｄ）の異性体であり、Ｌ異性体とも呼ばれる。右回りの異性体は、Ｒｐ異性体であり、Ｄ異性体としても知られている（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４巻、３６７−４０２頁、１９８５年、を参照）。
【００２４】
ＮＴＰαＳのＲｐ異性体は、プライマー伸長反応において用いられるポリメラーゼ酵素に対する基質としては機能しない。しかしながら、驚くべきことに、上述のように、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体の使用が、ＰＰｉに基づく配列決定反応に関与する酵素の阻害をもたらすことが明らかとなった。これら種々の阻害効果の厳密な性質は完全に明らかではないが、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体自体が（さらに、おそらくＮＤＰαＳのＲｐ異性体及びＮＭＰαＳのＲｐ異性体も）、上述のポリメラーゼの阻害をも含む、観測される阻害効果の原因であると考えられる。ＮＴＰαＳの分解生成物も、また、観測される阻害効果の原因である。分解生成物には、ＮＤＰαＳ、ＮＭＰαＳ、及びそれらの分解生成物が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。ヌクレオチド分解酵素及びＰＰｉ検出酵素におけるｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体の阻害効果について、調査を行った（実施例２、及び、図８Ｉ、８Ｊ、８Ｋ、及び８Ｌを参照）。その結果、ｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は分解生成物は、ヌクレオチドの分解及びＰＰｉ放出の検出に関与する酵素を阻害することが分かった。
【００２５】
プライマーの３’に近接する標的塩基がそれらの３’の塩基と同一であり、（ジデオキシヌクレオチドよりもむしろ）デオキシヌクレオチドに重合がもたらされる場合、伸長反応は、同時に２つの塩基を加え、実際、サンプルにおける連続した同一性塩基の任意の配列により、対応する塩基がプライマーへ同時に取込まれることは明らかであろう。しかしながら、解放されるピロリン酸の量は、明らかに、取込まれる塩基の数に比例するであろうから、そのような反復を検出することは困難ではない。
【００２６】
プライマーは、上述の手順によって一塩基単位で（又は、同一性塩基の配列単位で）伸長されるので、伸長されるプライマーは、配列における次の隣の塩基を決定するために繰り返される手順において全く同様に働くことができ、従って、サンプル全体を配列決定することができる。
【００２７】
従って、本発明の方法は、単一の塩基の同一性（すなわち、配列）を評価するために用いることができる。しかしながら、好ましくは、さらなる（連続する）ヌクレオチドの存在下においてプライマー伸長工程を繰り返すことによって、サンプル核酸の配列におけるさらなる塩基の配列（又は同一性）を明らかにすることができる。従って、本発明の方法は、サンプル核酸における１以上の塩基の同一性を評価するために（すなわち、サンプル核酸における１以上の配列を決定するために）用いることができる。
【００２８】
従って、本発明の方法は、（例えば、点変異、又は多型、又は対立遺伝子変異などの検出における）一塩基の変化の検出等の微小配列決定法を含む、多くの異なる配列決定方法及び形式（ｆｏｒｍａｔ）において、有益である。従って、本発明の方法は、一塩基検出手順におけるのと同様に、“完全（ｆｕｌｌ）”配列決定手順、すなわちヌクレオチドの伸長における塩基の配列順の同定、において用いられ得る。
【００２９】
例えば、標的ヌクレオチド配列（すなわち、標的又はサンプル核酸）における配列情報を評価するために、異なるヌクレオチドを、サンプル−プライマー混合物の個々のアリコット（例えば、４のアリコットであり、そのうち１つはそれぞれ、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣヌクレオチドである）に添加することもできるし、又は、同一のサンプル−プライマー混合物に連続的に添加することもでき、そして、どのヌクレオチドが取込まれたかを示すポリメラーゼ反応を受けさせることができる。
【００３０】
サンプル核酸を配列決定するため、手順は、当該技術分野において公知なように、１回以上、すなわち循環的に繰り返される。この方法で、サンプル核酸におけるいくつかの又は多くの塩基の同定を、原則的に同一の反応において行うことができる。
【００３１】
別個のアリコットが用いられる場合、いったんどの塩基が取込まれたか（すなわち、どのアリコットで取込みが起こったか）が同定されたら、次の塩基配列決定のための手順を繰り返す（サイクル）前に、“取込まれた”塩基を“未反応”のアリコットに添加し、全てのアリコットにおいてプライマーを伸長することができる。“連続的な”実施態様では、手順が繰り返されるとすぐに、ＰＰｉの放出により取込みが示唆されるまで異なるヌクレオチドが連続的に添加される。
【００３２】
それゆえ、配列決定プロトコールには、上述したプライマーのアニーリング、ヌクレオチドの添加、ポリメラーゼに触媒されるプライマー伸長反応の実施、任意のＰＰｉ放出の検出により前記ヌクレオチドの取込みが存在するか否かの検出、及び、ヌクレオチド添加及びプライマー伸長工程等を１回以上繰り返すこと、が含まれ得る。上述したように、単一の（すなわち、個々の）ヌクレオチドが、所望の配列情報及び選択により、同一のプライマー−鋳型混合物に、又はプライマー−鋳型混合物の個々のアリコットに、連続的に添加され得る。
【００３３】
複数塩基の配列決定手順における、繰り返しの又は連続的な（反復の）ヌクレオチド添加を行うためには、それまでに添加されたヌクレオチドは除去されなければならない。これは、洗浄によって、より好ましくは、ヌクレオチド分解酵素（例えば、ＷＯ９８／２８４４０に詳細に記載されている）を用いることによって、達成され得る。
【００３４】
従って、本発明の原則的な実施態様では、任意の取込まれない又は過剰のヌクレオチドを分解するためにヌクレオチド分解酵素が用いられる。従って、ヌクレオチドが添加されたが取込まれない場合（これは、ターゲット塩基と相補的でないことにより起こる）、又は、取込みが起こった後もなお、添加された任意のヌクレオチド（すなわち、過剰のヌクレオチド）が残っている場合には、その後、そのような取込まれなかったヌクレオチドは、ヌクレオチド分解酵素を用いて容易に除去され得る。このことは、ＷＯ９８／２８４４０において詳細に記載されている。
【００３５】
以下でより詳細に述べるが、ヌクレオチド分解酵素を用いる場合、α−チオヌクレオチドの使用による阻害効果が特に生じ（又は観測され）、そして、本発明では、本明細書に記載の方法によって、そのような効果が有益に排除され得ることが、観測された。
【００３６】
本明細書において、“ヌクレオチド分解酵素”という語には、特異的に又は非特異的にヌクレオチド（少なくともヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰｓ）、所望ならば、二リン酸及び一リン酸を含む）を分解できる任意の酵素が含まれ、さらに、ヌクレオシドトリホスファターゼ活性又はその他のＮＴＰ分解活性が存在することを条件に、そのような酵素の任意の組合せ又は混合物が含まれる。好ましくは、ホスファターゼ活性を有するヌクレオチド分解酵素が本発明において用いられる。しかしながら、任意のヌクレオチド又はヌクレオシド分解活性を有する任意の酵素、例えば、リン酸基以外の位置（例えば、塩基又は糖の残基）においてヌクレオチドを開裂させる酵素、もまた用いられることができる。従って、ヌクレオシド三リン酸分解酵素が、本発明において必須である。ヌクレオシド二リン酸及び／又は一リン酸分解酵素は随意的なものであり、ヌクレオシド三リン酸分解酵素と併用して用いられ得る。本発明の当該態様においてヌクレオチド分解酵素として用いられるホスファターゼは、いくつかの基準を満たさなければならない。とりわけ、ホスファターゼ反応のリン酸（Ｐｉ）生成物に対する阻害定数（Ｋｉ）は、蓄積したリン酸により酵素が阻害されない程度に高い値であるべきである。第２に、酵素は、比較的速く働くことが必要であり、あまり遅くないべきである（あるホスファターゼ酵素は、あまりにゆっくり働くため用いることができない）。第３に、４つのヌクレオチド基質（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ基質）は全て、おおよそ等しい効率で分解されるべきである。以下で詳細に述べるように、ＥＬＩＤＡ反応により生じるＡＴＰはＰＰｉ検出に対して好ましく、さらに、本発明において有用なヌクレオチド分解酵素は、また、ＡＴＰを効率良く分解すべきである。これにより、シグナルの効率的な“消滅（ｔｕｒｎｉｎｇ−ｏｆｆ）”がもたらされる。全てのホスファターゼ酵素がこれらの基準を満たすわけではなく（例えば、生成物であるリン酸により強く阻害されるアルカリホスファターゼ）、さらに、全てが本発明におけるヌクレオチド分解酵素としての使用に適切なわけではない、ということは明らかであろう。しかしながら、そのような適性は、通常の実験により容易に評価できる。
好ましいヌクレオチド分解酵素はアピラーゼであり、これはヌクレオシドジホスファターゼ及びヌクレオシドトリホスファターゼのいずれでもあり、
ＮＴＰ → ＮＤＰ＋Ｐｉ、及び
ＮＤＰ → ＮＭＰ＋Ｐｉ
の反応を触媒する（ここで、ＮＴＰはヌクレオシド三リン酸、ＮＤＰはヌクレオシド二リン酸、ＮＭＰはヌクレオシド一リン酸、及び、Ｐｉは無機リン酸である）。アピラーゼは、シグマ・ケミカル・カンパニーから入手することができる。その他の可能なヌクレオチド分解酵素には、ブタ膵臓ヌクレオシド三リン酸ジホスフォリドロラーゼ（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｄｒｏｌａｓｅ）が含まれる（ＬｅＢｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻、１２２７−１２３３頁、１９８０年）。さらなる酵素は、文献中に記載されている。
【００３７】
ヌクレオチド分解酵素は、好ましくは、ポリメラーゼ（すなわち、プライマー伸長）反応工程に含まれ得る。従って、例えば、ポリメラーゼ反応は、ヌクレオチド分解酵素の存在下において実施される。あまり好ましいことではないが、そのような酵素は、ヌクレオチドの取込み（又は、非取込み）が起こった後に、すなわちポリメラーゼ反応工程の後に添加されることもできる。
【００３８】
従って、ヌクレオチド分解酵素（例えば、アピラーゼ）は、任意の適切な方法により、ポリメラーゼ反応混合物（すなわち、サンプル核酸、プライマー、及びポリメラーゼ）に添加され得る。例えば、反応の開始の前あるいはそれと同時に、又はポリメラーゼ反応が行われた後に、例えば、反応を開始するために試料／プライマー／ポリメラーゼにヌクレオチドを添加する前に、又はポリメラーゼとヌクレオチドが試料／プライマー混合物に添加された後に、添加され得る。
【００３９】
好ましくは、ヌクレオチド分解酵素は、単に、ヌクレオチドの添加により開始され得るポリメラーゼ反応の反応混合物に含まれ得る。
【００４０】
本発明のさらなる驚くべき特徴は、α−チオヌクレオチドのＲｐ異性体及び／又は前記α−チオヌクレオチドの分解生成物の使用により、本発明のヌクレオチド分解酵素（特に、アピラーゼ）の阻害がもたらされることが観測されたことである。Ｒｐ異性体は、アピラーゼに対する基質として機能することができず、従ってアピラーゼのヌクレオチド分解活性によっては分解されない、と考えられる。或いは、ＮＴＰαＳの分解による生成物が阻害性を有するのかもしれない。従って、この状況は、配列決定手順の間における阻害性及び不活性なＲｐ異性体（又は、阻害性の分解生成物）の連続的な蓄積から生じ可能性がある。従って、本発明における前記α−チオヌクレオチドのＲｐ異性体及び／又は分解生成物を除去することにより生じ得るさらなる利益は、アピラーゼの阻害を減少又は回避できるということである。このことは、配列決定法の実施及び効率において、顕著な、かつ、これまで予期し得なかった利益であり、さらに本発明の有意義な驚くべき利点を表すものである。
【００４１】
取込まれないヌクレオチドのアピラーゼによる分解は、均一でかつ鮮明な（例えば、狭い／明確な、または鋭い）ＰＰｉ検出シグナルを生じさせるという利益を有する（後記参照）。そのような分解が、アピラーゼ酵素の阻害により効果を生じない場合には、この利益は徐々に失われる。従って、アピラーゼの阻害は、より遅いヌクレオチド分解速度として、及び、その結果として、配列決定のその後のサイクルにおける“広く”又は鮮明でないＰＰｉ検出シグナルとして、直接又は間接的に観測される。特に、さらに後述するＰＰｉ放出のＥＬＩＤＡ検出の記述においては、観測されるシグナル（光）の減衰は、（ＥＬＩＤＡ反応で生ずる）ＡＴＰの分解として“観測（ｓｅｅｎ）”される。従って、より遅いＡＴＰ分解速度が“観測”される。このことから、取込まれないヌクレオチドの分解速度も、また、より遅いことが推測され得る。さらに、同時進行しない（ｎｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｓｅｄ）伸長が結果として生じ得る。取込まれないヌクレオチドの存在は、複数の伸長反応の位相不一致をもたらすと考えられるため、これが生じることにより、重なった（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）シグナル（シグナルオーバーレイ、又は位相不一致シグナル）がもたらされる。従って、そのような同時進行しない伸長により、所定の配列決定の実行において配列決定されるヌクレオチドの数（すなわち、読み取り可能な長さ）が制限される。
【００４２】
より長い核酸を配列決定する能力は、配列決定の分野における所望のゴールである。本発明のＰＰｉに基づく配列決定方法において、α−チオヌクレオチドの使用によって生じる酵素の阻害効果は、忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）の減少及び同時進行しない伸長をもたらし、それにより、読み取り可能な長さ（すなわち、配列決定が成功し得る核酸の長さ）が制限される。本発明において、読み取り長さ（ｒｅａｄ−ｌｅｎｇｔｈ）は、α−チオヌクレオチドのＲｐ異性体及び／又はα−チオヌクレオチドの分解生成物を除去することにより、改善され得る。
【００４３】
読み取り可能な長さは、ある程度、用いられる採用基準に依存するパラメーターである。シグナルの綺麗さが失われた場合であっても、熟練し経験豊かな実施者にとっては、なおも、配列が読み取り可能であることもある。それゆえ、正確な読み取り長さの限界は、常に有意義とは限らず、一様に適用はできるわけではない。しかしながら、特定のケースでは、５０以上、さらには、１００以上（例えば、２００以上）の塩基を、本発明によって容易に読み取ることができるということが分かった。従って、本発明の方法は、１００塩基以上の配列決定に対して適応する。特に、本発明は、好ましくは、５０以上、６０以上、７０以上、又は８０以上の塩基の配列決定において用いることができる。
【００４４】
本発明において、ＰＰｉの放出は、任意の所望の又は簡便な方法により検出され得る。ＰＰｉは、多くの異なる方法により測定されることができ、酵素を用いる多くの方法が文献に記載されている（Ｒｅｅｖｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８巻、２８２−２８７頁、１９６９年；Ｇｕｉｌｌｏｒｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３９巻、１７０−１８０頁、１９７１年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５巻、２７３頁、１９６８年；Ｃｏｏｋら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９１巻、５５７−５６５頁、１９７８年；及び、Ｄｒａｋｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９４巻、１１７−１２０頁、１９７９年）。
【００４５】
ピロリン酸の放出を検出するためにルシフェラーゼに基づく（例えば、ルシフェリンとルシフェラーゼに基づく）光発生反応を用いるのが好ましい。なぜなら、発生する光量は、実質的に放出されるピロリン酸の量に比例し、そして今度は、その量は取込まれる塩基の数に直接的に比例するからである。光量は、ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）等の適切な光検出装置により、容易に算出することができる。
【００４６】
ＰＰｉの放出を検出するためのルシフェラーゼに基づく反応は、当該技術分野において周知である。特に、酵素であるＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼに基づくＰＰｉの放出を検出するための方法が、Ｎｙｒｅｎ及びＬｕｎｄｉｎにより既に開発されており（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５１巻、５０４−５０９頁、１９８５年）、そして、それはＥＬＩＤＡ（酵素による発光計測無機リン酸検出法）と呼ばれている。ＰＰｉを検出するためのＥＬＩＤＡ法の使用は、本発明において好ましい。しかしながら、当該方法は、例えば、より熱安定性のルシフェラーゼを用いることにより（Ｋａｌｉｙａｍａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８巻、１１７０−１１７１頁、１９９４年）、及び／又はＡＴＰスルフリラーゼを用いることにより（Ｏｎｄａら、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６０：１０、１７４０−４２頁、１９９６年）、改良され得る。この方法は、以下の反応に基づくものである。
【００４７】
【化１】
【００４８】
従って、酵素を用いてＰＰｉの放出を検出することが好ましく、ＰＰｉ検出反応において用いられる好ましい検出酵素は、ＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼである。
【００４９】
酵素であるＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼに基づくＰＰｉ検出反応では、（放出されるＰＰｉに対応する）シグナルは光として認識される。光の発生は、Ｐｙｒｏｇｒａｍとして知られている曲線として観測され得る。光は、ルシフェラーゼの作用により、生成物、ＡＴＰ（これは、ＰＰｉと、ＡＴＰスルフリラーゼにより媒介されるＡＰＳ（以下参照）の間の反応により生成する）上において発生する。アピラーゼ等のヌクレオチド分解酵素が用いられる場合、この光の発生は、その後、ヌクレオチド分解酵素の作用（ルシフェラーゼに対する基質であるＡＴＰの分解）により“消滅”する。上昇曲線の傾きは、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＰｉ放出）の活性度、及びＡＴＰスルフリラーゼ（ＰＰｉからのＡＴＰの発生、それによるルスフェラーゼに対する基質の提供）の活性度についての指標として理解することができる。シグナルの高さは、ルシフェラーゼの活性度に依存し、そして、上昇曲線の傾きは、上述のように、ヌクレオチド分解酵素の活性度の指標である。
【００５０】
好ましくは、ポリメラーゼ反応工程にＰＰｉ検出酵素（すなわち、選択された酵素による検出システムにおいてＰＰｉ検出を達成するために必要な酵素であって、ＥＬＩＤＡの場合においては、ＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼであろう）を含むことによって、本発明の方法は、各ヌクレオチドが取込まれることによるシグナルが発生し、それを検出しながら、配列決定反応をリアルタイムで連続的にモニターするために容易に適応されることができる。そのようなアプローチの利点は、ＷＯ９８／１３５２３において、より詳細に記載されている。
【００５１】
従って、ＰＰｉ検出酵素は（ＰＰｉ検出反応に必要とされる任意の酵素基質又はその他の試薬と共に）、ポリメラーゼ反応混合物に単に含まれることができる。
【００５２】
より詳細には、本発明の方法の当該実施態様を実施するために、検出酵素は、ポリメラーゼ反応工程に、すなわち連鎖伸長反応工程に組込まれる。従って、検出酵素は、ポリメラーゼ反応の前に、ポリメラーゼ反応と同時に、又はポリメラーゼ反応の間に、ポリメラーゼ工程の反応混合物に添加される。それゆえ、ＥＬＩＤＡ検出反応の場合において、ポリメラーゼ反応についての反応混合物には、少なくとも１のヌクレオチド、ポリメラーゼ、ルシフェリン、ＡＰＳ、ＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼが含まれ得る。ポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼの添加によって、又は、より好ましくはヌクレオチドの添加によって開始され得る。そして、好ましくは、検出酵素は、反応が開始する時点で既に存在し、又は、反応を開始する試薬と共に添加され得る。アピラーゼ等のヌクレオチド分解酵素用いられる場合には、ヌクレオチドが存在するなら、ポリメラーゼ添加はアピラーゼの後であるべきではないことは、当然明らかであろう。
【００５３】
従って、本発明により、リアルタイムのシグナルを与えるポリメラーゼ反応の間に、ＰＰｉ放出が検出され得る。配列決定反応は、連続的にリアルタイムでモニターされ得る。
【００５４】
ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は分解生成物は、本発明では、多くの方法により除去されることができ、“除去される（ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ）”という語は、単に、Ｒｐ異性体及び／又は分解生成物がポリメラーゼ反応工程から取り除かれ又は排除されることを要するものである。これは、任意の適切な方法により達成され得る。例えば、Ｒｐ異性体は、ポリメラーゼ反応混合物に添加され又は含まれるＮＴＰαＳ調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）中に存在させないことによって、排除され得る。又は、ＮＴＰαＳ調製物が当初はＲｐ異性体を含む場合でも、例えば酵素による分解によって、ポリメラーゼ反応混合物への添加又は取りこみの前、その間、或いはその後にＲｐ異性体を排除することができる。Ｒｐ異性体を除去するための方法の組合せ（例えば、除去及び排除）も、また用いることができる。従って、Ｒｐ異性体は、ポリメラーゼ反応工程から、重合が起こった後の工程（すなわち、ヌクレオチド分解工程）から、又はヌクレオチド取りこみの検出工程から、除去或いは排除され得る。
【００５５】
ＮＴＰαＳの分解生成物は、ポリメラーゼ反応工程、ヌクレオチド分解工程、又はヌクレオチド取りこみの検出工程の間に、除去され得る。例えば、分解生成物は、酵素による分解により排除される。
【００５６】
それゆえ、本発明の１の実施態様において、Ｒｐ異性体は、Ｓｐ異性体のみを含むＮＴＰαＳの調製を用いることにより、すなわちＮＴＰαＳのＳｐ異性体のみ（純粋なＳｐ異性体）を用いることにより、排除され得る。ＮＴＰαＳにおける個々のＲｐ及びＳｐ異性体は、商業的に入手可能である（例えば、Ｂｉｏｌｏｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｅｍｅｎ、ＤＥ、から）。或いは、そのような異性体は、立体特異的に容易に合成することができ、又は、文献に記載されており当該技術分野において周知の技術を用いて、ラセミ混合物から精製（分離）することもできる（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、ｓｕｐｒａ、参照）。ｄＡＴＰαＳ、それと共にｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのα−チオアナログは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｕｐｐｓａｌａ、ＳＥ）から購入することができる。
【００５７】
Ｒｐ異性体は、反応工程において、ｄＡＴＰαＳの総量の１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは３％未満まで減少され得る。
【００５８】
別の実施態様において、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物は、それを分解する酵素（特にアルカリホスファターゼ）を用いて除去され得る。特に、予備実験の結果から、出願人は、アルカリホスファターゼが、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び分解生成物を含むＮＴＰαＳの両方の異性体を分解することができると考えている。従って、反応混合物中に又はＮＴＰαＳ調製物中に存在するＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び分解生成物は、アルカリホスファターゼ酵素の添加によって容易に除去（分解）することができる。
【００５９】
より詳細な実施態様では、アルカリホスファターゼ酵素とＳｐ異性体の組合せを用いることができる。
【００６０】
好ましくは、アルカリホスファターゼは、ポリメラーゼ反応工程の間にのみ取りこまれる。これは、ポリメラーゼ反応の開始の前或いはそれと同時に、又はポリメラーゼ反応が起こった後に（例えば、反応を開始するためにヌクレオチドをサンプル／プライマー／ポリメラーゼに添加する前に、又は、ポリメラーゼとヌクレオチドをサンプル／プライマー混合物に添加した後に）、ポリメラーゼ反応混合物へ酵素を添加することにより達成できる。
【００６１】
さらに、アルカリホスファターゼは、個体支持体、例えば、微粒子個体支持体（例えば、磁性ビーズ）又はフィルター、又はディップスティックなどに固定化でき、適切な時期にポリメラーゼ反応混合物に添加され得る。Ｒｐ異性体が分解されると、固定化された酵素は、次のヌクレオチドが添加される前に、反応混合物から除去され得る（例えば、磁性ビーズの場合には、磁気的に回収又は捕捉され得る）。その後、この手順が繰り返され、さらなる塩基を配列決定できる。
【００６２】
アルカリホスファターゼは、ヌクレオチド三リン酸、二リン酸、及び一リン酸（リボ−ＮＴＰ及びｄＮＴＰ、及び上述のＮＴＰαＳについての両方の異性体を含む）からの５’−リン酸残基の除去を触媒する。従って、ヌクレオチド（ヌクレオシド三リン酸）だけでなく、ＮＤＰ及びＮＭＰも分解される。エビ由来、細菌由来、子ウシ腸由来のアルカリホスファターゼが好ましい酵素であるが、任意の適切な供給源からの任意の適切なアルカリホスファターゼ酵素も本発明の方法において用いられ得る。好ましい酵素は、エビ由来のアルカリホスファターゼである。アルカリホスファターゼについては多くの商業的供給源が存在し、又は、所望ならば、生成生物体から単離することもできる。
【００６３】
用いられるアルカリホスファターゼ酵素の量は、用いられる正確な反応系、反応条件等に依存するであろうが、それは、通常の実験により容易に決定できる。例えば、５０ｍＵ乃至１０Ｕの濃度が用いられ得ることが分かった。
【００６４】
上述したように、アルカリホスファターゼは、ＮＴＰにおけるのと同様に、ＮＤＰ及びＮＭＰの分解において活性を有する。従って、ＮＴＰαＳだけでなくＮＤＰαＳ及びＮＭＰαＳを含むα−チオ修飾基質においても、有益に働く。この活性は本発明にさらなる利益を与える。前述のように、ＮＴＰαＳがヌクレオチド取り込みに用いられる場合、アピラーゼ酵素、及び、本発明において好ましいＰＰｉ検出法において用いられるルシフェラーゼ酵素は、阻害される。観測された阻害効果の厳密な性質は明らかではないが、ＮＴＰαＳ生成物又は基質の阻害によるものかもしれない。従って、ＮＴＰαＳ自体が阻害物質かもしれないし、又は、むしろ（例えば、アピラーゼの働きによりもたらされる）ＮＴＰαＳの分解生成物のほうが阻害物質かもしれない。例えば、取り込みのためにポリメラーゼ反応混合物に添加されるＮＴＰαＳにおけるアピラーゼの働きにより生成される分解生成物ＮＤＰαＳ及びＮＭＰαＳ（特に、ｄＡＤＰαＳ及びｄＡＭＰαＳ）が、阻害物質かもしれない。より詳細には、ＮＤＰαＳ及び／又はＮＭＰαＳのＳｐ及びＲｐ異性体の両方が、ルシフェラーゼを阻害し、さらにアピラーゼ酵素も阻害すると考えられる（以下の実施例をさらに参照）。そのような阻害性基質は、アルカリホスファターゼの働きにより除去（又は減少）され得る。
【００６５】
上述のように、アピラーゼの阻害は、より遅いヌクレオチド分解速度、及びそれによるシグナル幅の増加により示唆される。同時進行しない（ｎｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｓｅｄ）伸長も起こり、これは読み取り可能な長さを制限する。ルシフェラーゼの阻害は、シグナル強度の減少により示唆される。従って、以下の実施例でさらに示すように、ルシフェラーゼの阻害は、ヌクレオチドがその後の配列決定サイクルにおいて取り込まれるにつれて起こる、シグナルのピーク高さにおける規則的な減少として観測できる。
【００６６】
シグナル強度の減少（ルシフェラーゼの阻害）の効果は、シグナル鮮明度の損失（例えば、シグナル幅の増加又はシグナルの位相不一致）（アピラーゼの阻害）の効果と結び付き、配列決定方法の効率を減少させ、それゆえ読み取り長さの延長を提供する能力を減少させる。アピラーゼ及びｄＡＴＰαＳ（所望ならば、その他のｄＮＴＰαＳ）と共にアルカリホスファターゼを用いることは、これらの重要なさらなる阻害（すなわち、アピラーゼと共にＮＴＰαＳを用いることから生ずる阻害、例えば、アピラーゼの働きにより生成するＮＤＰαＳ及び／又はＮＭＰαＳに起因する阻害）の源を排除するという予期せぬさらなる利益を有する。
【００６７】
アルカリホスファターゼを用いることのさらなる利益も、また利用可能である。従って、特定の条件又は状況、例えば長い配列決定（例えば、５０サイクル以上）では、取り込みのために添加されるその他のチオ修飾されていないＮＴＰも、（α−チオ修飾アナログよりもその程度は低いが）阻害の源になり得る。例えば、予備的な結果により、ｄＡＴＰがルシフェラーゼ酵素の阻害源になり得ることが示唆される（以下の実施例参照）。取り込まれないＮＴＰにおけるアピラーゼの働きにより、分解生成物、すなわちＮＤＰ及びＮＭＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＡＭＰ、ｄＣＤＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＤＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＤＰ、ｄＴＭＰ）の蓄積が生じる。その後の配列決定サイクルにおいて、そのような生成物は、配列決定及び／又はＰＰｉ検出反応において用いられる酵素、例えばアピラーゼ及び／又はルシフェラーゼを阻害し得る。その他のヌクレオチドにおいて得られ得る任意のそのような阻害効果は、ＮＴＰαＳの使用により生ずる効果よりは少ないものではあるが、それにもかかわらず、それらはなお、当該系の効率の減少に寄与し得る。この場合も同様に、そのような阻害性物質により生じる任意の潜在的問題は、アルカリホスファターゼの働きにより除去又は減少されることができる。
【００６８】
ＡＴＰは、ＰＰｉ検出のための好ましい方法として用いられる（酵素であるＡＴＰスルフリラーゼにより触媒される）ＥＬＩＤＡ反応の最初の工程において生じる。そのようなＡＴＰ生成物（特に、連続的なルシフェラーゼ反応において用いられない任意のそのようなＡＴＰ）も、また、アピラーゼ（又は、その他のヌクレオチド分解酵素）に対する基質として働くことができ、それゆえ、ルシフェラーゼを阻害し、及びより少ない程度ではあるがアピラーゼも阻害する阻害性生成物（例えば、ＡＤＰ及びＡＭＰ）の発生ももたらし得る。この場合も同様に、任意のそのような阻害性生成物は、アルカリホスファターゼの働きにより除去又は減少され得る。
【００６９】
最後に、アルカリホスファターゼの使用は、キナーゼの混入により引き起こされる任意の問題を減少させるという利益をさらに有する。キナーゼは、本明細書で述べる配列決定及びＰＰｉ検出反応において用いられる酵素調製物の混入物となり得る。アピラーゼ分解生成物（すなわち、ＮＤＰ又はＮＭＰ）、及びＥＬＩＤＡ法におけるＡＴＰスルフリラーゼにより生ずるＡＴＰにおけるキナーゼの働きは、初期の配列決定反応を歪め得る（すなわち、ポリメラーゼにより取り込まれ得る）ＮＴＰを生じさせ、さらに同時進行しない（ｎｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｓｅｄ）伸長をもたらす。アルカリホスファターゼは、潜在的なキナーゼ基質を分解させるという有益な効果を有する。
【００７０】
サンプル核酸（すなわち、配列決定される標的核酸）は、配列情報を得ることが望まれる任意のポリヌクレオチド配列であることができる。従って、それは任意のポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド配列であることができる。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができ、天然物であっても合成物であってもよい。従って、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、又はｃＤＮＡ、又はＰＣＲ生成物或いはその他のアンプリコンなどであることができる。標的（サンプル）核酸は、当該技術分野において公知の技術（例えば、単離、クローン化、増幅など）により任意の適切な形態で用いることができ、所望ならば、公知技術により配列決定反応のために調製され得る。サンプル核酸は、ポリメラーゼに基づくプライマー伸長を可能にするための鋳型として機能することができ、それゆえ、簡易的に“鋳型”又は“核酸鋳型”と呼ばれ得る。また、従来は、配列決定反応又は任意のプライマー伸長反応において１本鎖ＤＮＡ鋳型が用いられてきたのに対し、ここでは、ＤＮＡは１本鎖又は２本鎖であり、２本鎖鋳型を用いることもできる。２つのＤＮＡ鎖の鎖置換又は局在化解放（ｌｏｃａｌｉｓｅｄ ｏｐｅｎｉｎｇ−ｕｐ）が起こることにより、プライマーのハイブリダイズ及びポリメラーゼ反応が起こる。
【００７１】
ポリメラーゼ反応では、以下でより詳細に述べるように、選択により任意の適切なポリメラーゼ酵素を用いることができる。ＲＮＡ鋳型を用いる場合には、そのようなポリメラーゼ酵素は、逆転写酵素であることができる。
【００７２】
当該方法を臨床的に繰り返すことによりサンプルＤＮＡを配列決定するために、さらに、相補的な鎖からの１本鎖サンプルＤＮＡの分離を補助するために、サンプルＤＮＡは、所望ならば、個体支持体へ固定化され、又は個体支持体への結合のための手段を提供され得る。
【００７３】
さらに、分析されるサンプル中に存在するＤＮＡの量は少なくても良く、それゆえ、配列決定の前にＤＮＡを増幅するのが望ましい。従って、上述したように、サンプルＤＮＡはアンプリコンであることができる。
【００７４】
任意の所望されるｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ増幅方法を用いることができ、例えば、ＰＣＲ（又は、それらの改良又は修正）、又は自律（Ｓｅｌｆ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（３ＳＲ）、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などである。いずれの増幅方法を用いる場合であっても、増幅ＤＮＡを固定化すること、又は個体支持体への結合のための手段を提供することが好ましいであろう。例えば、ＰＣＲプライマーは、固定化され、又は個体支持体への結合のための手段を提供され得る。
【００７５】
増幅されたＤＮＡの固定化は、１以上のプライマーが支持体に接続されることにより、ＰＣＲ増幅自体の一部として起こることができ、又は、１以上のＰＣＲプライマーは、その後の固定化を可能にする官能基（例えば、ビオチン又はチオール基）を有し得る。プライマーの５’末端による固定化によって、当該プライマーから生ずるＤＮＡ鎖が個体支持体へ固定され、その３’末端が支持体から遠ざけられ、その後の伸長プライマーとのハイブリダイゼーション、及びポリメラーゼによる連鎖伸長が可能となる。好ましくは、個体支持体は、マイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｗｅｌｌ）の形態をとることができる。しかしながら、好ましくは、当該技術分野で（例えば、分離／固定化反応又は固相分析において）説明されている膨大な数のものを含む、任意の固体支持体も用いることができる。従って、支持体には、また、粒子（例えば、ビーズ）、ファイバー又はキャピラリー（これらは、例えば、アガロース、セルロース、アルギナート、テフロン（登録商標）、又はポリスチレンから作られる）を含み得る。Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）により製造されている超常磁性ビーズ等の磁性ビーズも、また、支持体として用いられ得る。
【００７６】
固体支持体は、核酸分子（例えば、プライマー）との接続のために、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、又はアミノ基等の官能基、又はアビジン或いはストレプタビジンのようなその他の部位を有し得る。これらは一般に、そのような官能基の１つを有するポリマーの表面コーティングで支持体を処理することにより、例えば、ヒドロキシル基はポリウレタンとポリグリコール又はセルロース誘導体によって、カルボキシル基はアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー又はコポリマーによって、さらに、アミノ基はアミノアルキル化ポリマーによって提供される。米国特許第４，６５４，２６７号には、多くのそのような表面コーティングの導入について記載されている。
【００７７】
所望ならば、サンプルは、ある回数の反応サイクル（例えば、１５−２５）の後に、当該技術分野において周知の手法により、洗浄され得る。洗浄は、固体表面上におけるサンプルの固定化によって促進され得る。しかしながら、Ｒｐ異性体の除去（特に、アルカリホスファターゼの使用）と共にヌクレオチド分解酵素を用いることは、洗浄が絶対必須ではないということを意味する。
【００７８】
当該分析技術は非常に簡便かつ迅速であり、それゆえ、大量のサンプルを迅速に分析できる無人装置を用いることにより容易に自動化することができる。好ましい検出及び定量は発光反応（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）に基づくものであるため、これはその後に分光光度法を容易に行うことができる。ルミノメーターの使用は、当該技術分野において周知であり、文献に記載されている。
【００７９】
本発明の方法は、サンプルが表面上に分布し、順序付けられたサンプルの集まりが２次元形式で固定化され得る、アレー形式（ａｒｒａｙ ｆｏｒｍａｔ）、例えば微細加工ビーズにおける使用に特に適している。それにより、多くのサンプルを同時に分析することができる。本発明の方法を用いて、酵素と１のヌクレオチドを含む溶液を表面に流し、その後に各サンプルから生じるシグナルを検出することによって、多くの固定化された鋳型をこの方法で分析することができる。その後、この手順を繰り返すことができる。又は、鋳型のハイブリダイゼーションの後に、鋳型と相補的ないくつかの異なるオリゴヌクレオチドを表面上に分布させることができる。ヌクレオチドの取り込みは、種々のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて生じるシグナルによって、各オリゴヌクレオチドについてモニターすることができる。表面の異なる領域からのシグナルを組合せることによって、配列に基づく（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ）分析を種々のヌクレオチドを用いる４サイクルのポリメラーゼ反応により行うことができる。
【００８０】
伸長プライマーの長さは、重大なものではなく、選択によることができる。伸長プライマーのサイズ及びハイブリダイゼーションの安定性が、Ｃ−Ｇに対するＡ−Ｔの比にある程度依存する、ということは当業者には明らかであろう。これは、Ｃ−Ｇ塩基対形成においては、より多くの水素結合形成が可能であることによる。また、当業者は、伸長プライマーと鋳型配列のその他の部分との間における配列同一性の程度を検討し、それにより緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の程度を選択するであろう。そのような通常の実験についての手引きは、文献中に記載されている（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．ＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、１９８９年）。平滑末端ＤＮＡポリメラーゼの活性を排除するために、鋳型の３’末端から少なくとも１塩基内側において配列決定プライマーをハイブリダイズさせることが有益であろう。個別のアリコット（すなわち、各塩基について１ずつの４つのアリコット）を用いる場合、好ましくは、伸長プライマーは、（各アリコットへ別々に添加され得るが）サンプルが４つのアリコットに分割される前に添加される。
【００８１】
又は、ループを含み、それ自身と１本鎖鋳型の３’−末端とを再度アニールする、リン酸化した５’−末端を有するプライマーを用いることができる。鋳型の３’−末端が、Ｔ（鋳型）で表される配列領域を有する場合、プライマーは５’−末端から始まるＰ−Ｌ−Ｐ’−Ｔ’の配列を有する。ここで、Ｐは特異的プライマー（５乃至３０ヌクレオチド）であり、Ｌはループ（好ましくは、４乃至１０ヌクレオチド）であり、Ｐ’はＰに相補的配列（好ましくは、５乃至３０ヌクレオチド）であり、及び、Ｔ’は３’−末端（Ｔ）において鋳型配列と相補的な配列（少なくとも４ヌクレオチド）である。その後、このプライマーは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ又は類似の酵素を用いて、１本鎖鋳型に連結（ｌｉｇａｔｅ）され得る。これは鋳型とプライマーの間に共有結合を提供し、それにより、ハイブリダイズしたプライマーが当該プロトコールの間に洗い流される可能性を回避することができる。
【００８２】
ポリメラーゼ反応では、選択により任意の適切なポリメラーゼ酵素を用いることができ、例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、クレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）、なたはシークエナーゼ Ｖｅｒ．２．０（ＵＳＢ Ｕ．Ｓ．Ａ．）である。好ましくは、任意の適切なポリメラーゼを用いることができ、それらの多くは、当該技術分野において公知であり、文献において報告されている。しかしながら、多くのポリメラーゼは校正能力或いはエラーチェック能力を有しており、連鎖伸長で利用可能な３’末端は時々、１以上のヌクレオチドによって消化（ｄｉｇｅｓｔ）されることが知られている。本発明の方法においてそのような消化が生じると、バックグラウンドノイズのレベルが増加する。この問題を回避するために、非校正ポリメラーゼ、例えばエキソヌクレアーゼ欠乏（ｅｘｏ−）クレノウポリメラーゼを用いることができ、これは
本発明についても好ましい。代替として、フッ化物イオン或いはヌクレオチド一リン酸のような、ポリメラーゼによる３’末端の消化を抑制する物質を用いることができる。厳密な反応条件、試薬濃度などは、選択により、それぞれの系に対して容易に決定できるであろう。しかしながら、全てのフリーな３’末端が伸長されるように、プライマー／鋳型に対して過剰量のポリメラーゼを用いることが有益であろう。
【００８３】
本発明の方法においては、完全に伸長されない鋳型が累積する場合に起こり得るバックグラウンドシグナルの急速な増加を考慮すると、高効率のＤＮＡポリメラーゼをそれぞれの伸長工程において用いることが好ましい。また、各工程における高い忠実度も所望され、これは、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることにより達成され得る。しかしながら、これは伸長鎖の分解が起こり得るという上述した不利益も有する。クレノウポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は低いのではあるが、ヌクレオチド非存在下における長時間の培養によって、プライマーの３’末端が分解され得る。重合工程における誘導適合の結合メカニズムは、１０５−１０６の忠実度へ純粋に寄与する正確なｄＮＴＰの結合を、非常に効率的に選択する。（ｅｘｏ−）クレノウ又はシークエナーゼ Ｖｅｒ．２．０のようなエキソヌクレアーゼ−欠乏ポリメラーゼは、相補的なｄＮＴＰが存在する場合のみ観測されたヌクレオチド取り込みを触媒し、校正エキソヌクレアーゼ活性がないときでもこれらの酵素の忠実度が確認された。シークエナーゼ２．０よりも（ｅｘｏ−）クレノウＤＮＡポリメラーゼを使用することの主な利点は、ヌクレオチドに対するより低いＫｍであり、これは低いヌクレオチド濃度においても高い割合のヌクレオチド取り込みを可能とする。上述のように、全てのｄＮＴＰを、ｄＮＴＰαＳのようなヌクレオチドアナログ又は非天然ヌクレオチドと置換することも可能であり、そのようなアナログは、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと共に用いるのが望ましい。
【００８４】
特定の状況（例えば、より長いサンプル鋳型）において、正しくない（ミスマッチの）ヌクレオチドに対するよりも、正しい（マッチの）ヌクレオチドの取り込みに対してより低いＫＭを有するポリメラーゼを用いることが有益である。これにより、当該方法の精度及び効率が改善される。適切なそのようなポリメラーゼ酵素には、ショウジョウバエのα−ポリメラーゼが含まれる。
【００８５】
多くの診断用途、例えば遺伝性疾患の保因者に対する遺伝子検査において、サンプルはヘテロ接合物質を含むであろう。すなわち、ＤＮＡの半分は標的位置における１のヌクレオチドを有し、もう半分は別のヌクレオチドを有するであろう。従って、本発明の実施態様において４つのアリコット（すなわち、同一サンプルの４つの並行反応）が用いられる場合、２つはネガティブシグナルを示し、もう２つは半分ポジティブシグナルを示すであろう。それゆえ、各サンプルで検出されたシグナルの量を定量的に決定することが所望されることが分かるであろう。また、２以上の同一塩基がプライマーの３’−末端に隣接する場合には、より大きなシグナルが生じることも明らかであろう。ホモ接合サンプルの場合については、サンプルが４つの並行反応に分けられたとき、３つのネガティブシグナルと１つのポジティブシグナルが生じることが明らかであろう。
【００８６】
本発明の方法を実施するにあたり、起こり得るＰＰｉによる試薬（例えば、ＮＴＰ溶液）の汚染は望ましくなく、それは、試薬溶液中にピロホスファターゼを（好ましくは、少量）含むことによって容易に回避され得る。実際、いずれの種類の混入をも回避することが望ましく、例えばキナーゼによる汚染を回避するために、高純度の試薬又は入念に精製された試薬の使用が好ましい。
【００８７】
反応効率は、試薬（ＮＴＰ及び／又はポリメラーゼ）溶液中にＭｇ２＋イオンを含むことにより改善できる。
【００８８】
配列決定されるＤＮＡが複数の、特に、３以上の隣接する同一塩基を有する場合に、ＰＰｉに基づく配列決定方法においてこれまで見られてきた潜在的な問題が発生する。さらに、ミスプライミング（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ）、すなわち、標的ＤＮＡ配列中における標的とされる補体ではないその他の領域へのプライマーのハイブリダイゼーション、によって誤ったシグナルが生じることがあり、これは標的配列の同一性を反映しない“取り込みシグナル”の発生をもたらすであろう。ＷＯ００／４３５４０に記載されているように、このことは、鋳型へプライマーをアニールした後の反応混合物において、１本鎖核酸結合タンパク質を用いることにより回避できる。
【００８９】
従って、本発明のさらなる好ましい特徴は、１本鎖核酸結合タンパク質の使用であり、それはプライマーをアニールした後のポリメラーゼ反応工程の間に含まれる。
【００９０】
上述のように、本発明の利点は、反応混合物から阻害性物質を除去（例えば、撤去及び／又は排除）することに起因する。
【００９１】
従って、異なる観点から見れば、本発明は、少なくとも１のＮＴＰαＳを用いるＰＰｉに基づく配列決定手法においてポリメラーゼの阻害を減少させる方法であって、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は前記ＮＴＰαＳの分解生成物を配列決定反応混合物（すなわち、鋳型、プライマー、ポリメラーゼ、及び／又はヌクレオチドの混合物）から除去することを含む、当該方法を提供する。
【００９２】
さらに、同様の阻害効果は、取り込まれないヌクレオチドを分解するために用いられ得るアピラーゼ酵素についても観測されているので、本発明は、また、少なくとも１のＮＴＰαＳを用いるＰＰｉに基づく配列決定手法において用いられる場合にアピラーゼの阻害を減少させる方法であって、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は前記ＮＴＰαＳの分解生成物を配列決定反応から除去することを含む、当該方法も提供する。
【００９３】
さらに上述したように、好ましくはＰＰｉ検出において用いられるルシフェラーゼ酵素は、種々の阻害性物質（例えば、Ｒｐ異性体及び／又は分解生成物）により阻害され得、好ましくは、これらはアルカリホスファターゼの働きによって除去され得る。従って、さらなる観点では、本発明は、ＰＰｉに基づく配列決定手法において検出酵素として用いられる場合にルシフェラーゼの阻害を減少させる方法であって、配列決定及び／又はＰＰｉ検出の反応混合物中にアルカリホスファターゼを含む、当該方法を提供する。
【００９４】
典型的には、本発明の特定の実施態様において、ＮＴＰαＳはＡＴＰαＳである（例えば、ｄＡＴＰαＳ又はｄｄＡＴＰαＳ）。
【００９５】
本発明には、また、少なくとも以下の構成要素；
（ａ）ポリメラーゼ、
（ｂ）ピロリン酸の放出を検出する手段（好ましくは酵素を用いる手段、最も好ましくはルシフェラーゼ及びＡＴＰスルフリラーゼ、例えばＥＬＩＤＡ分析の反応成分（上記参照））、
（ｃ）任意に、ヌクレオチド分解酵素（好ましくはアピラーゼ）、
（ｄ）アルカリホスファターゼ、
（ｅ）１以上のヌクレオチド、好ましくはデオキシヌクレオチド（これには、アデニンヌクレオチド（例えばｄＡＴＰ）の代わりに前記ヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログ（例えばｄＡＴＰαＳ）が含まれる）、
（ｆ）任意に、標的位置がプライマーの３’末端に近接するようにサンプル核酸へハイブリダイズする特異的テストプライマー、
を標準的に含む、本発明の方法における使用のためのキットが含まれる。
【００９６】
本発明にキットについてのさらなる実施態様は、少なくとも以下の構成要素；
（ａ）ポリメラーゼ、
（ｂ）ピロリン酸の放出を検出する手段（好ましくは酵素を用いる手段、最も好ましくはルシフェラーゼ及びＡＴＰスルフリラーゼ、例えばＥＬＩＤＡ分析の反応成分（上記参照））、
（ｃ）任意に、ヌクレオチド分解酵素（好ましくはアピラーゼ）、
（ｄ）アデニンヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログのＳｐ異性体（好ましくはｄＡＴＰαＳ）、及び、所望ならばチミン、シトシン、又はグアニンヌクレオチドの１以上のＳｐ異性体（好ましくは、ｄＧＴＰαＳ、ｄＣＴＰαＳ、又はｄＧＴＰα）、及び、
（ｆ）任意に、標的位置がプライマーの３’末端に近接するようにサンプル核酸ＤＮＡへハイブリダイズする特異的テストプライマー、
（ｇ）任意に、１以上の非修飾チミン、シトシン、又はグアニンヌクレオチド（好ましくは、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、
（ｈ）任意に、アルカリホスファターゼ、
を標準的に含む。
【００９７】
ＰＰｉの基づく配列決定での阻害性物質の効果を減少させることにおける本発明の利点は、当該方法の効率及び信頼性を改善し、及び、当該方法を用いることができる用途を拡大する。従って、ゲノム再配列決定（ｇｅｎｏｍｅ ｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、比較ＥＳＴ配列決定、微生物型別、及び確証配列決定（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などの、より長い配列の読み取りが要求される技術は、全て、本発明におけるＰＰｉに基づく配列決定によって実行することができる。
【００９８】
キット中に存在するならば、プライマーは、標的ヌクレオチドに近接する位置においてその３’末端で鋳型核酸と結合するように設計される。近接とは、標的ヌクレオチドから１乃至３０ヌクレオチド、好ましくは１乃至２０ヌクレオチド、より好ましくは１乃至１０、最も好ましくは１乃至５ヌクレオチドの範囲を意味する。
【００９９】
これ以降は、図を参照しつつ、非限定的な実施例により本発明を説明する。
【０１００】
実施例１
ＥＬＩＤＡ検出反応を用いるＰＰｉに基づく配列決定における、相違するヌクレオチドの阻害効果の検討−アルカリホスファターゼの効果
本実施例では、酵素であるアピラーゼ及びルシフェラーゼにおける５つの各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）の阻害効果を調査するために、一連の５つの実験を行った。ＰＰｉに基づく配列決定反応におけるこれらのヌクレオチドの効果をシミュレートするモデル系を用いた。各ヌクレオチドを、（ルシフェラーゼに対する基質を提供するための）ＡＴＰと共に、ルシフェラーゼ／アピラーゼ／基質の混合物へ添加し、さらに、酵素における各ヌクレオチドの添加の効果を、ルシフェラーゼ反応から生じる光シグナルの観測によってモニターした。さらなる２つ実験は、第１に、ｄＡＴＰαＳの使用による阻害効果が、アルカリホスファターゼの使用によりモデル系において排除され得ること、第２に、アルカリホスファターゼは、反応系におけるキナーゼ酵素の妨害効果を相殺するという付加的な利益をさらに有するということ（配列決定反応において証明されたように）、を実証する。
【０１０１】
反応は、自動化された試作型パイロシーケンサー機器（パイロシーケンシング ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンから提供）において、５０μｌの体積で、室温で行った。反応混合物は、５０ｍＵのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ＵＳＡ）、１００ｎｇの精製ルシフェラーゼ（ＢｉｏＴｈｅｍａ、Ｄａｌａｒｏ、スウェーデン）、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）、を含む。ルシフェラーゼ及びアピラーゼの活性を理解するために図１乃至５に示すように、２μＭの濃度のＡＴＰを、異なるヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）へ添加した。エビ由来のアルカリホスファターゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）の効果を検討するために、この酵素の２つのユニットを反応混合物へ添加した（以下をさらに参照）。合計すると、５０分間でヌクレオチド及びＡＴＰ混合物の５０添加を行った。ヌクレオチドの取り込みから生じる光のアウトプットは、ＣＣＤ−カメラで検出した。データは、Ｅｘｃｅｌの形式で得た。
【０１０２】
７つの実験を行った。実験１から実験５では、ｄＡＴＰ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのそれぞれの効果について検討した。実験１は、反応混合物に注入される０．７ｍＭのヌクレオチドｄＡＴＰ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。実験１から得られた図を、図１に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している（又は指標である）。シグナル強度の比較的直線的な減少に注目すると、これはルシフェラーゼの阻害によるものであり、ｄＡＴＰ（例えば、ｄＡＭＰ）の分解生成物の蓄積によるものであると考えられる。ｄＡＭＰがルシフェラーゼを阻害することがこれまでに報告されており（Ｆｏｒｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０２巻、３−２０頁、１９９８年）、従って、このことから、阻害性物質はｄＡＭＰであると推論される。従って、ｄＡＴＰを用いた場合にルシフェラーゼの阻害が見られ、これはｄＡＭＰ（ｄＡＴＰ及び／又はｄＡＤＰ）の分解生成物によるものと考えられる。
【０１０３】
実験２は、反応混合物に注入される０．７ｍＭのヌクレオチドｄＡＴＰαＳ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。結果を図２に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。シグナル強度の比較的直線的な減少に注目すると、これはルシフェラーゼの阻害によるものであり、阻害性生成物（例えば、ｄＡＭＰαＳ）の蓄積により引き起こされると考えられる。５０サイクルの後におけるシグナル強度の減少は、図１におけるｄＡＴＰの分解から得られたデータの５０％未満である。従って、このことから、ｄＡＴＰαＳの１の異性体だけが阻害性であると推論され、それはＳｐ異性体である（もっと正確に言えば、Ｓｐ異性体の生成物がルシフェラーゼに対して阻害性である）と考えられる。得られる幅の広いピークにより分かるように、アピラーゼはその後のサイクルにおいて急激に阻害される。各添加の後の阻害効果は、ｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体の蓄積、及びＳｐ異性体の分解生成物の蓄積によるものと考えられる。アピラーゼは、Ｓｐ異性体のみを分解し、Ｒｐ異性体は分解しないと考えられている。ｄＡＴＰαＳの不活性異性体（Ｒｐ）は、分解されて阻害性生成物を生じないため、ルシフェラーゼには認識されないと推測される。
【０１０４】
実験３は、反応混合物に注入される０．２ｍＭのヌクレオチドｄＣＴＰ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。結果を図３に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。５０サイクルの後でも比較的一定しているシグナル強度は、このヌクレオチドの生成物が、用いられる条件下及び示したサイクル数の範囲内においてはルシフェラーゼもアピラーゼも阻害しないことを示唆することに注目すべきである。
【０１０５】
実験４は、反応混合物に注入される０．１６ｍＭのヌクレオチドｄＧＴＰ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。実験４から得られた結果を図４に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。５０サイクルの後でも比較的一定しているシグナル強度は、このヌクレオチドの生成物が、用いられる条件下及び示したサイクル数の範囲内においてはルシフェラーゼもアピラーゼも阻害しないことを示唆することに注目すべきである。
【０１０６】
実験５は、反応混合物に注入される０．８ｍＭのヌクレオチドｄＴＴＰ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。結果を図５に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。５０サイクルの後でも比較的一定しているシグナル強度は、このヌクレオチドの生成物が、用いられる条件下及び示したサイクル数の範囲内においてはルシフェラーゼもアピラーゼも阻害しないことを示唆することに注目すべきである。
【０１０７】
実験６は、反応混合物へのアルカリホスファターゼの添加によりもたらされる阻害の減少を検討したものである。この実験は、反応混合物に注入される０．７ｍＭのヌクレオチドｄＡＴＰαＳ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて、実験２と同様に行った。結果を図６に示す。得られたピークの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。図２と比較したヌクレオチド分解の効率に注目すべきである。シグナルの幅は５０サイクルの後でも一定に保たれているが、これはアピラーゼの阻害が無いことを示唆し、それゆえ、当該阻害の回避におけるアルカリホスファターゼの高い効果が分かるであろう（これは、ｄＡＴＰαＳの両方の異性体（すなわち、Ｒｐ及びＳｐ異性体）を分解する働きにによるものと考えられる）。シグナル強度の減少は観測されず、それによりルシフェラーゼの阻害がないことが示唆される。このことは、ｄＡＴＰαＳの生成物を分解する（すなわち、阻害性要因を除去する）アルカリホスファターゼの効果に起因すると考えられる。実験６において反応物中に２ＵのＡＰを添加していること以外は、図２と図６の実験条件は同じである。従って、実験６の結果は、アルカリホスファターゼは反応系から阻害性物質を除去することができ、それによりルシフェラーゼとアピラーゼ酵素の性能が改善されることを示している。
【０１０８】
実験７では、配列決定反応におけるヌクレオチド及びキナーゼの阻害効果、及びアルカリホスファターゼを用いることによるこれらの効果の減少について検討した。キナーゼの効果を調査するために、２ｍＵのキナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を配列決定反応混合物に添加した。当該反応混合物は、０．５ｐｍｏｌのプライム化合成鋳型Ｅ３ＰＮ／ＮＵＳＰＴ（Ｒｏｎａｇｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年）、１０Ｕのエキソヌクレアーゼ欠乏クレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）、４０ｍＵのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ＵＳＡ）、１００ｎｇの精製ルシフェラーゼ（ＢｉｏＴｈｅｍａ、Ｄａｌａｒｏ、スウェーデン）、１５ｍＵの組換えにより生成されたＡＴＰスルフリラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、５μＭのアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）、を含む。Ｓｐ−ｄＡＴＰαＳ（Ｂｉｏｌｏｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｅｍｅｎ、ＤＥ）、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の連続的な添加におけるプライマー鎖の段階的な伸長により、及び、それと同時のアピラーゼによるヌクレオチド分解によって、配列決定の手順を実行した。キナーゼの活性におけるアルカリホスファターゼの効果を調査するために、２ｍＵのキナーゼ酵素及び２Ｕのアルカリホスファターゼを、上記の混合物に添加した。ヌクレオチドの取り込みから生じる光のアウトプットは、ＣＣＤ−カメラで検出した。データは、Ｅｘｃｅｌの形式で得た。図７ａは、添加されるキナーゼ及びアルカリホスファターゼの非存在下における配列決定反応の結果を示している。図７ｂは、２ｍＵのヌクレオシド二リン酸キナーゼの存在下における配列決定反応の結果の図を示すものである。矢印は、誤って発生するシグナルを示している。従って、ポリメラーゼ反応混合物へのアルカリホスファターゼの添加は、キナーゼに対する基質を溶液から取り除くことによって、キナーゼの汚染から生じる誤ったシグナルを除去することが理解できるであろう。
【０１０９】
実施例２
ＰＰｉに基づく配列決定におけるｄＡＴＰαＳの阻害効果
本実施例において、通常の（すなわち、ラセミの）ｄＡＴＰαＳ（Ｒｐ及びＳｐ異性体のいずれをも含む）の量、又はｄＡＴＰαＳの純粋なＳｐ異性体の量を変化させて、鋳型非存在下における反応混合物をプレインキュベートすることにより、ＥＬＩＤＡ検出を用いるＰＰｉに基づく配列決定反応（いわゆる、パイロシーケンシング、登録商標）におけるｄＡＴＰαＳの阻害効果を検討した。プレインキュベーションの後に、鋳型を添加し、通常の“パイロシーケンシング（登録商標）反応”を行った。
【０１１０】
原料及び方法
“通常の”ｄＡＴＰαＳは、パイロシーケンシング ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、ＳＥ）により供給されたＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キットから得た。純粋なＲｐ及びＳｐ異性体はＢｉｏｌｏｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）から購入した。反応混合物には、また、パイロシーケンシング ＡＢにより供給されたＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キットからの、Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ−スルフリラーゼ、アピラーゼ、及びルシフェラーゼ）及びＳｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘ（ルシフェリン及びＡＰＳ）が含まれた。鋳型は、配列決定プライマーのアニールの後に読み取ることができた以下の配列、
ＣＴＡＡＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＡＴＣからのオリゴヌクレオチド（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ、Ｕｌｍ、ドイツ）である。
【０１１１】
純粋な異性体のサンプルを、ＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キットにおけるｄＡＴＰαＳと同じ濃度に希釈した。プレインキュベーションのために、０、５、１０、又は２０μｌのＡ−サンプル（通常のｄＡＴＰαＳ、又はＲｐ或いはＳｐ異性体）をそれぞれ、混合物へ添加した。当該混合物は、総量４５μｌ中に、５μｌのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、５μｌのＳｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘを含む。反応は、ＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キット由来の９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）において実行した。反応は、暗室で１０分間、室温において培養した。この後、５μｌのアニール化オリゴヌクレオチド鋳型の１．５ｐｍｏｌを各ウェルに添加し、プレートをＰＳＱ９６装置から移動し、ここで通常の“パイロシーケンシング（登録商標）”反応を行った（Ｅｎｚｙｍｅ及びＳｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘの添加は省略）。
【０１１２】
結果を図８に示す。通常の（すなわち、ラセミの）ｄＡＴＰαＳを用いる場合、５μｌ（図８Ｂ）、１０μｌ（図８Ｃ）、又は２０μｌ（図８Ｄ）におけるプレインキュベーションにより、（０μｌのｄＡＴＰαＳを添加した場合（図８Ａ）と比較して）配列決定反応の深刻な阻害が徐々にもたらされることがわかる。シグナル強度（ピーク高さ）の損失、及び、さらに顕著にはシグナルの鮮明度の損失（例えば、より広い、より不鮮明な、きれいでないシグナル）を見ることができる。従って、アピラーゼの阻害が著しく生じていることがわかるであろう。Ｒｐ異性体が用いられる場合には（図８Ｊ参照）、さらに顕著な阻害が見られる。図８Ｆ（５μｌ）、図８Ｇ（１０μｌ）及び図８Ｈ（２０μｌ）から分かるように（０μｌの図８Ｅと比較して）、この効果は、ラセミのｄＡＴＰαＳ又はｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体の代わりに純粋なＳｐ異性体を用いた場合に劇的に減少した。純粋なＲｐ異性体は、ＥＬＩＤＡ検出に関わる全ての酵素に深刻な影響を有する（図８Ｉ及び８Ｊ）。アピラーゼの阻害は、シグナル幅の増加により示唆される。これは、図８Ｊ乃至８Ｌにおいて明確に見ることができ、図８Ｋにおいて最も明確に示されている。ルシフェラーゼの阻害は、シグナル強度の減少により示唆される。図８Ｋにおいて見ることができるように、シグナル強度は、図８Ｉと比較して減少しており、これはルシフェラーゼが阻害されていることを示唆するものである。
【０１１３】
また、“通常の” ｄＡＴＰαＳをｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、又はｄＴＴＰ（これらは、全てＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キットのプロトタイプから得た）と比較したプレインキュベーションを行って、同様の実験を実行した。対照として、１ｘＴＥ（ｄＮＴＰに対する希釈バッファー）のみを添加した。鋳型は上記と同様であるが、各ウェルに２ｐｍｏｌを添加した。
【０１１４】
得られた結果（図略）は、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、又はｄＴＴＰによるプレインキュベーションからのネガティブ効果は示さなかったが、主にアピラーゼにおけるｄＡＴＰαＳからの深刻なネガティブ効果が確認された。
【０１１５】
実施例３
Ｒｐ−ｄＡＴＰαＳ存在下及び非存在下におけるＰＰｉに基づくＤＮＡ配列決定
この実験では、ｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体を用いる場合及び用いない場合（すなわち、ｄＡＴＰαＳのラセミ混合物を用いる場合、及び純粋なＳｐ−ｄＡＴＰαＳを用いる場合）において、同じ鋳型（標準的なクローニングプラスミドｐＵＣ１９のＰＣＲ生成物）を用いて２つの配列決定実験を行った。
【０１１６】
１本鎖鋳型の調製
標準プラスミドｐＵＣ１９を用いて、ＰＣＲにより鋳型を生じさせた。手短に言えば、ＰＣＲプライマーＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡ（上流プライマー、ビオチン化位置は１３４５）、及びＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧ（下流プライマー、位置は１６４８）をｐＵＣ１９のＰＣＲ反応において用い（ここで、位置は、１６４８−１３４５＝３０３ｂｐ）、長さ３０３ｂｐの断片を生じさせた。５０μｌのビオチン化ＰＣＲ生成物を、３０分間４３℃の培養により、２０μｌのストレプタビジンでコートされた超常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０−ストレプタビジン、Ｄｙｎａｌ ＡＳ、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）上に固定化した。５μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨにおいて固定化ＰＣＲ生成物を４分間培養することにより、１本鎖ＤＮＡを得た。固定化鎖は、８μｌのＨ２Ｏと１μｌのアニーリングバッファー（１００ｍＭのトリス−Ａｃ２（ｐＨ７．７５）、２０ｍＭのＭｇＡｃ２）において分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）した。５０μｌのＰＣＲ生成物に対応する１本鎖ＤＮＡを、５分間の室温における培養の後に、１０ｐｍｏｌの配列決定プライマー（ＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣ）と７０℃において３分間ハイブリダイズさせた。（配列決定プライマーのアニーリングの後に、残った１本鎖鋳型の長さは２１１ｂｐであった。）プライム化ＰＣＲ生成物をパイロシーケンシング（登録商標）反応混合物に添加した。ここで、当該反応混合物は、０．１Ｍのトリス−Ａｃ２（ｐＨ７．７５）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１０Ｕのエキソヌクレアーゼ欠乏（ｅｘｏ−）クレノウＤＮＡポリメラーゼ、４０ｍＵのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）、０．８μｇの精製ルシフェラーゼ（ＢｉｏＴｈｅｍａ、Ｄａｌａｒｏ、スウェーデン）、１５ｍＵの組換えＡＴＰスルフリラーゼ（Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄら、１９９９年）、０．５μｇの１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＭｇＡｃ２、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）、１ｍＭのジチオスレイトール、５μＭのアデノシン５’−ホスホ硫酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．）、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を含み、総容量は５０μｌである。
【０１１７】
パイロシーケンシング（登録商標）
８ミリ秒のオープン時間及び６０秒のサイクル時間、６００ミリバールの分配圧（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の、自動化パイロシケンサー試作モデル（パイロシーケンシング ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン；ｗｗｗ．ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｃｏｍ）において、パイロシーケンシング（登録商標）を室温で行った。配列決定の手順は、異なるデオキシヌクレオシド三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の循環的分注（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉｓｐｅｎｓａｔｉｏｎ）におけるプライマー鎖の段階的伸長により実行した。１の実験（図９に示す）では、ｄＡＴＰαＳのラセミ混合物（“通常の” ｄＡＴＰαＳ）を用い（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰと同様に）、さらに第２の実験では、ｄＡＴＰαＳの純粋なＳｐ異性体を用いる。ヌクレオチドの取り込みにより生じる光のアウトプットは、光電子増倍管により検出した。データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにおいて取得し、それを図９及び１０に示す。
【０１１８】
図９を見ると、ヌクレオチドの添加を繰り返すにつれてシグナルの質が徐々に劣化し、結果的に、読み取り可能なシグナルの損失がもたらされることが分かる。図１０では、純粋なＳｐ異性体を用いることによって、シグナルの質はより長い間保持され、読み取ることができないほどシグナルの質が劣化する以には、より長い読み取り長さが得られることが分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＡＴＰの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．７ｍＭヌクレオチド（ｄＡＴＰ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。ＰＰｉはリアルタイムで検出した。
【図２】
図２に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＡＴＰαＳの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．７ｍＭヌクレオチド（ｄＡＴＰαＳ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。
【図３】
図３に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＣＴＰの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．２ｍＭヌクレオチド（ｄＣＴＰ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。
【図４】
図４に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＧＴＰの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．１６ｍＭヌクレオチド（ｄＧＴＰ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。
【図５】
図５に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＴＴＰの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．８ｍＭヌクレオチド（ｄＴＴＰ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。
【図６】
図１に、アルカリホスファターゼの存在下において、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＡＴＰαＳの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）、及び、１Ｕのアルカリホスファターゼを用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．７ｍＭヌクレオチド（ｄＡＴＰαＳ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。ＰＰｉはリアルタイムで検出した。
【図７】
図７に、２ｐｍｏｌのプライム化オリゴヌクレオチド鋳型を用いるＤＮＡ配列決定反応において得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この反応系は、１０ＵのクレノウＤＮＡポリメラーゼ、２５ｍＵのＡＴＰスルフリラーゼ、及び、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を含む。さらに、Ａ）１００ｎｇのルシフェラーゼ及び５０ｍＵのアピラーゼ、Ｂ）１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、及び２ｍＵのヌクレオシド二リン酸キナーゼ、Ｃ）１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、２ｍＵのヌクレオシド二リン酸キナーゼ、及び２Ｕのアルカリホスファターゼを含む。Ｂにおける矢印は、当該系におけるキナーゼ活性の結果として現れる誤ったシグナルを指し示しており、これは、Ｃに示した実験におけるアルカリホスファターゼの添加によって除去される。
【図８】
図８は、Ｒｐ及びＳｐ異性体のいずれをも含む“通常の”（すなわち、ラセミの）ｄＡＴＰαＳ（（Ａ）０μｌ、（Ｂ）５μｌ、（Ｃ）１０μｌ、（Ｄ）２０μｌ）、又はｄＡＴＰαＳの純粋なＳｐ異性体（（Ｅ）０μｌ、（Ｆ）５μｌ、（Ｇ）１０μｌ、（Ｈ）２０μｌ）、又はｄＡＴＰαＳの純粋なＲｐ異性体（（Ｉ）０μｌ、（Ｊ）５μｌ、（Ｋ）１０μｌ、（Ｌ）２０μｌ）、の量を変化させた場合において、ＰＰｉ−配列決定反応混合物をプレインキュベーションさせた（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）効果を示す図（ヌクレオチド添加に対する光強度）である。プレインキュベーションの後に、鋳型を添加し、実施例２に記載のようにＰＰｉに基づく配列決定反応を行った。
【図９】
図９は、ｐＵＣ１９由来の鋳型におけるＤＮＡ配列決定反応の結果を示す図（ヌクレオチド添加に対する光強度）である。ここで、４つの異なるヌクレオチドは、プライマーとハイブリダイズする鋳型へ段階的に添加される。ｄＡＴＰαＳのＲｐ及びＳｐ異性体の混合物を用いている。鋳型／プライマーを、１０Ｕ（ｅｘｏ−）クレノウ及び４０ｍＵのアピラーゼ、及び実施例３に記載の配列決定／ＰＰｉ検出反応におけるその他の成分、と共に培養した。反応を最初のヌクレオチドの添加により開始させ、ヌクレオチドを段階的に添加した。放出されたＰＰｉは、ルシフェラーゼによりリアルタイムで検出した。
【図１０】
図１０は、ｐＵＣ１９由来の鋳型におけるＤＮＡ配列決定反応の結果を示す図（ヌクレオチド添加に対する光強度）である。ここで、４つのヌクレオチドは、プライマーとハイブリダイズする鋳型へ段階的に添加される。ｄＡＴＰαＳの純粋なＳｐ異性体の混合物のみを用いた。鋳型／プライマーを、１０Ｕ（ｅｘｏ−）クレノウ及び４０ｍＵのアピラーゼ、及び実施例３に記載の配列決定／ＰＰｉ検出反応におけるその他の成分、と共に培養した。反応を最初のヌクレオチドの添加により開始させ、その後ヌクレオチドを段階的に添加した。放出されたＰＰｉは、ルシフェラーゼによりリアルタイムで検出した。
発明の属する技術分野
本発明は、ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出による塩基取込みの検出に基づくＤＮＡ配列決定法における改良に関する。
【０００２】
発明の背景
ＤＮＡ配列決定は、分子遺伝解析において不可欠な道具である。ヒト及びその他の生命体の大きなゲノムの配列を決定するための試みが行われるにつれて、ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する能力がますます重要になってきている。
【０００３】
単一のＤＮＡ塩基の変化又はいくつかの塩基の変化を迅速に検出できる技術もまた、例えば遺伝病又は特定の癌の解析における臨床状況等では、遺伝解析についての重要な道具である。実際、より多くの病気が遺伝子レベルの変化（とりわけ、一塩基多型（ＳＮＰｓ））に関係があることが明らかになるにつれて、ＳＮＰｓ又はその他の変異又は遺伝子の変化を（代表的なゲノムサンプルを配列決定することによって）スクリーニングする方法、及びＳＮＰｓ（又はその他の変異／変化）をスコアリング（ｓｃｏｒｉｎｇ）する方法に対する需要が増大している。従って、より長いＤＮＡ配列を決定するための新規な配列決定技術の開発と同様に、当該技術分野において、単一の（又はいくつかの）塩基の変化を検出するための技術の開発が急速に行われてきている。１のみ又はいくつかの塩基についての、より限られた配列情報を得るためのそのようなプロトコールは、微小配列決定（ｍｉｎｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と呼ばれている。
【０００４】
ＤＮＡ配列決定についての又は標的ＤＮＡ塩基の同定についての基礎として、最も広く用いられている方法は、Ｓａｎｇｅｒによる酵素鎖−終結（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法である。従来、そのような方法は、より大きなＤＮＡ断片から得られたＤＮＡ断片をそれらの大きさによって分離するため、ゲル電気泳動法に依存する。しかしながら、近年、重量分析及びアレイ技術等の各種異なる検出戦略を用いた種々の配列決定技術が発展してきている。
【０００５】
当該技術分野において重要だと見なされている配列決定法の１の種類は、検出戦略としてＰＰｉ放出の検出を用いるものである。そのような方法は、大規模なゲノム研究、又は、臨床的な配列決定又はスクリーニングに見事に適しており、ここでは高性能で相対的にコスト効率の良い設備が必要とされることが明らかになっている。
【０００６】
ポリメラーゼ反応の間に放出される無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を検出するコンセプトに基づく配列決定方法は、文献に記載されている（例えば、ＷＯ９３／２３５６４、ＷＯ８９／０９２８３、ＷＯ９８／１３５２３、及びＷＯ９８／２８４４０）。各ヌクレオチドが、ポリメラーゼ反応の間に成長する核酸鎖に添加されると、ピロリン酸分子が放出される。これらの条件下において放出されるピロリン酸は、例えば酵素を用いて（ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ）、例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の発生により、容易に検出できることが明らかになっている。そのような方法によれば、電気泳動法及び標識の使用を必要とすることなく、標的位置において塩基を同定することができ、そして、ＤＮＡを簡易かつ迅速に配列決定することができる。
【０００７】
最も基本的には、ＰＰｉに基づく配列決定反応は、プライマーに対するポリメラーゼ伸長反応を単に行うこと、及び、ＰＰｉが放出されたか否かを検出することにより、ヌクレオチドが取込まれたか否かを検出すること、を含む。好ましくは、このＰＰｉの検出は、酵素を用いて達成され、最も好ましくは、いわゆるＥＬＩＤＡと呼ばれるルシフェラーゼに基づく光検出反応を用いて達成され得る（以下をさらに参照）。
【０００８】
取込みのためのヌクレオチドとして添加されるｄＡＴＰは、ＰＰｉ検出に用いられるルシフェラーゼ反応を阻害することが明らかになっている。従って、基本的なＰＰｉに基づく配列決定法に対する主な改善点は、ｄＡＴＰの代わりに、ｄＡＴＰアナログ（特に、ｄＡＴＰαｓ）を用いることである。これは、ルシフェラーゼに対する基質として働くことはできないが、それにもかかわらず、ポリメラーゼ酵素によりヌクレオチド鎖に取込まれることができる（ＷＯ９８／１３５２３）。
【０００９】
基本的なＰＰｉに基づく配列決定技術に対するさらなる改善点には、取込まれないヌクレオチドが分解されるように、ポリメラーゼ工程の間にアピラーゼ等のヌクレオチド分解酵素を使用すること（ＷＯ９８／２８４４０に記載）、及び、鋳型へのプライマーのアニールの後に、１本鎖核酸結合タンパク質を反応混合物に使用すること（これは、誤ったシグナルの数を減少させるという有益な効果を有することが分かっている、ＷＯ００／４３５４０に記載）が含まれる。
【００１０】
しかしながら、上述の修正され、改善されたＰＰｉに基づく配列決定方法であっても、例えば、手順の効率及び／又は精度を高めること、或いは、以下で詳細に述べるように、読み取り可能な配列の長さを増大すること等においては、まだ改善の余地がある。本発明はこれらの要求に対応するものである。
【００１１】
特に、本発明は、デオキシＡＴＰ（ｄＡＴＰ）（又は、ジデオキシＡＴＰ（ｄｄＡＴＰ））のα−チオアナログ、すなわち、デオキシ或いはジデオキシＡＴＰの（１−チオ）三リン酸（又は、α−チオリン酸）アナログ、好ましくは、デオキシアデノシンα−チオ三リン酸（ｄＡＴＰαｓ）としても知られるデオキシアデノシン［１−チオ］三リン酸、を用いるＰＰｉに基づく配列決定方法に関する。ｄＡＴＰαｓは（全てのα−チオヌクレオチドアナログと同様に）、Ｒｐ異性体とＳｐ異性体の混合物として生じる。
【００１２】
ｄＡＴＰαｓ（及び／又はその他のα−チオヌクレオチド）が用いられる場合、配列決定方法の効率は、サイクル数の増加に伴って減少すること、具体的には、読み取り可能な長さが（例えば、４０乃至５０塩基に）制限されることが明らかとなっている。これは、反応系における阻害物質の蓄積によるものと考えられている。本発明は、特に、そのような阻害物質の減少又は除去に関する。
【００１３】
より詳細には、驚くべきことに、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は当該アナログの分解生成物を重合混合物から除去又は排除することにより、ＰＰｉに基づく配列決定方法、とりわけ、ルシフェラーゼに基づくＥＬＩＤＡ反応によるＰＰｉの検出に基づくそのような方法の効率が改善されることが分かっている。
【００１４】
理論による説明を要せずとも、多くの原因又は効果が、配列決定反応におけるα−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物の除去による当該有益な効果に寄与していると考えられる。これらの特定の効果についてはさらに後述するが、特に、出願人は、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物が、ポリメラーゼの活性を阻害する能力があると考えている。従って、そのような有力な効果の１つは、ポリメラーゼの活性の阻害における（これは現在のところ十分理解されていないが）、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物の効果によるものと考えられる。それゆえ、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物を排除又は除去することによって、この阻害効果を回避することができ、これにより、より効果的かつ迅速な重合反応が可能となり、ＰＰｉ検出反応においてより均等な（ｅｖｅｎ）シグナルが生じることになる。さらに、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物を除去又は排除することによって、ＤＮＡ合成の忠実度が増大、すなわち、誤った取込みが発生する数が減少する。
【００１５】
従って、一面において、本発明は、サンプル核酸配列における標的位置の塩基を同定する方法であって、
標的位置のすぐ隣で前記サンプル核酸とハイブリダイズするプライマーを、ヌクレオチド存在下においてポリメラーゼプライマー伸長反応させる工程（ここでヌクレオチドは、標的位置における塩基と相補的である場合のみ取込まれる）、及び、ＰＰｉの放出を検出することにより前記ヌクレオチドが取込まれるか否かを決定する工程（標的塩基の同一性は、取込まれる任意のヌクレオチドの同一性から決定される）、
ここで、前記ヌクレオチドがアデニン塩基を含む場合に、前記ヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログが用いられ、前記アナログのＲｐ異性体及び／又は前記アナログの分解生成物がポリメラーゼ反応工程から除去されること、
を含む、当該方法を提供するものである。
【００１６】
アデニン塩基を含むヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログの使用、及び、それらのＲｐ異性体を除去すること及び／又は前記アナログの分解生成物を除去することは本発明の本質的特徴であり、これは、取込みのためにグアニン、チミン、シトシン塩基を含むヌクレオチドのみが添加される微小配列決定反応等とは関連しない。
【００１７】
ヌクレオチドがアデニン塩基（Ａ）を含む場合という条件に従って、前記ヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログが用いられ、当該ヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素によって核酸鎖又は核酸分子に取込まれることができる任意のヌクレオチドであることができる。従って、例えば、ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、デオキシヌクレオシド三リン酸）又はジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ、ジデオキシヌクレオシド三リン酸）であることができる。
【００１８】
好ましくは、配列決定の目的のために、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、又はアデニン（Ａ）デオキシ−或いはジデオキシ−ヌクレオチドが用いられ得る。従って、ヌクレオチドは、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）、又は、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）の代わりにそのα−チオ三リン酸アナログであるｄＡＴＰαｓ（デオキシアデノシンα−チオ三リン酸アナログ、又はデオキシアデノシン［１−チオ］−三リン酸としても知られる）であることができる。同様に、ヌクレオチドは、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、又はｄｄＴＴＰ、或いは、ｄｄＡＴＰの代わりのｄｄＡＴＰαｓであることができる。
【００１９】
従って、本発明は、アデニンヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログの使用を要するが、その他の塩基（Ｇ、Ｔ、及びＣ）についてはアナログを必要とせず、天然のヌクレオチドを用いることができる（又は、実際は、ポリメラーゼ酵素により取込まれることができるならば、ヌクレオチド誘導体等の、任意のその他のヌクレオチドの使用が所望される）。従って、本発明では、アデニンヌクレオチドの少なくとも１のα−チオアナログが用いられる。
【００２０】
しかしながら、特定の場合には、１以上のその他のヌクレオチドの（すなわち、グアニン、シトシン、又はチミンヌクレオチドの）α−チオアナログを用いることもまた、望ましい。ヌクレオチドのα−チオアナログが用いられるような任意の場合において、本発明では、前記アナログのＲｐ異性体が、ポリメラーゼ反応工程から除去される。すなわち、本発明の方法において、ヌクレオチドがα−チオヌクレオチド（例えば、デオキシ−或いはジデオキシ−ヌクレオシドα−チオ三リン酸（ｄＮＴＰαＳ又はｄｄＮＴＰαＳ））である場合、当該α−チオヌクレオチドのＲｐ異性体はポリメラーゼ反応工程から除去され、及び／又はＮＴＰαＳの分解生成物が除去される。
【００２１】
従って、便宜上、本明細書において“デオキシヌクレオチドα−チオ三リン酸”（ｄＮＴＰαＳ）という語には、デオキシアデノシンα−チオ三リン酸（ｄＡＴＰαＳ）、デオキシシチジンα−チオ三リン酸（ｄＣＴＰαＳ）、デオキシグアノシンα−チオ三リン酸（ｄＧＴＰαＳ）、及びデオキシチミジンα−チオ三リン酸（ｄＴＴＰαＳ）が含まれる。同様に、“ジデオキシヌクレオチドα−チオ三リン酸”という語には、ジデオキシの相当物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）が含まれる。本明細書において、“ジデオキシヌクレオチド”という語には、３’−ヒドロキシル基が存在しない或いは修飾されている全ての２’−デオキシヌクレオチドが含まれる。従って、それは、ポリメラーゼの存在下においてプライマーに添加されることができるが、連続的な重合反応に参入することはできない。すなわち、ジデオキシヌクレオチドは“連鎖停止剤”であり、当該技術分野において周知なように、特定の配列決定方法はそのような連鎖停止ヌクレオチドを用いることができる。
【００２２】
本明細書において、“ＮＴＰαＳ”（ヌクレオシドα−チオ三リン酸）という語は、本発明に用いられ得る全てのα−チオ三リン酸ヌクレオチドアナログ（すなわち、α−チオヌクレオチド）について適用され、それには、リボ−及びデオキシリボ（又はジデオキシ）ヌクレオチドのいずれもが含まれる。これらには、特に、ｄＮＴＰαＳ及びｄｄＮＴＰαＳが含まれる。
【００２３】
合成される場合、α−チオ三リン酸ヌクレオチドアナログ（例えば、ｄｄ−、又はｄＮＴＰαＳ）は、通常、２つの異性体、Ｓｐ及びＲｐ異性体の形態で生成される。α−チオ三リン酸ヌクレオチドアナログは、キラル中心を有しており、従って、これら２つの種はエナンチオマーである。Ｓｐ異性体は、左回り（ｌｅｆｔ−ｈａｎｄｅｄ）の異性体であり、Ｌ異性体とも呼ばれる。右回りの異性体は、Ｒｐ異性体であり、Ｄ異性体としても知られている（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４巻、３６７−４０２頁、１９８５年、を参照）。
【００２４】
ＮＴＰαＳのＲｐ異性体は、プライマー伸長反応において用いられるポリメラーゼ酵素に対する基質としては機能しない。しかしながら、驚くべきことに、上述のように、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体の使用が、ＰＰｉに基づく配列決定反応に関与する酵素の阻害をもたらすことが明らかとなった。これら種々の阻害効果の厳密な性質は完全に明らかではないが、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体自体が（さらに、おそらくＮＤＰαＳのＲｐ異性体及びＮＭＰαＳのＲｐ異性体も）、上述のポリメラーゼの阻害をも含む、観測される阻害効果の原因であると考えられる。ＮＴＰαＳの分解生成物も、また、観測される阻害効果の原因である。分解生成物には、ＮＤＰαＳ、ＮＭＰαＳ、及びそれらの分解生成物が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。ヌクレオチド分解酵素及びＰＰｉ検出酵素におけるｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体の阻害効果について、調査を行った（実施例２、及び、図８Ｉ、８Ｊ、８Ｋ、及び８Ｌを参照）。その結果、ｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は分解生成物は、ヌクレオチドの分解及びＰＰｉ放出の検出に関与する酵素を阻害することが分かった。
【００２５】
プライマーの３’に近接する標的塩基がそれらの３’の塩基と同一であり、（ジデオキシヌクレオチドよりもむしろ）デオキシヌクレオチドに重合がもたらされる場合、伸長反応は、同時に２つの塩基を加え、実際、サンプルにおける連続した同一性塩基の任意の配列により、対応する塩基がプライマーへ同時に取込まれることは明らかであろう。しかしながら、解放されるピロリン酸の量は、明らかに、取込まれる塩基の数に比例するであろうから、そのような反復を検出することは困難ではない。
【００２６】
プライマーは、上述の手順によって一塩基単位で（又は、同一性塩基の配列単位で）伸長されるので、伸長されるプライマーは、配列における次の隣の塩基を決定するために繰り返される手順において全く同様に働くことができ、従って、サンプル全体を配列決定することができる。
【００２７】
従って、本発明の方法は、単一の塩基の同一性（すなわち、配列）を評価するために用いることができる。しかしながら、好ましくは、さらなる（連続する）ヌクレオチドの存在下においてプライマー伸長工程を繰り返すことによって、サンプル核酸の配列におけるさらなる塩基の配列（又は同一性）を明らかにすることができる。従って、本発明の方法は、サンプル核酸における１以上の塩基の同一性を評価するために（すなわち、サンプル核酸における１以上の配列を決定するために）用いることができる。
【００２８】
従って、本発明の方法は、（例えば、点変異、又は多型、又は対立遺伝子変異などの検出における）一塩基の変化の検出等の微小配列決定法を含む、多くの異なる配列決定方法及び形式（ｆｏｒｍａｔ）において、有益である。従って、本発明の方法は、一塩基検出手順におけるのと同様に、“完全（ｆｕｌｌ）”配列決定手順、すなわちヌクレオチドの伸長における塩基の配列順の同定、において用いられ得る。
【００２９】
例えば、標的ヌクレオチド配列（すなわち、標的又はサンプル核酸）における配列情報を評価するために、異なるヌクレオチドを、サンプル−プライマー混合物の個々のアリコット（例えば、４のアリコットであり、そのうち１つはそれぞれ、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣヌクレオチドである）に添加することもできるし、又は、同一のサンプル−プライマー混合物に連続的に添加することもでき、そして、どのヌクレオチドが取込まれたかを示すポリメラーゼ反応を受けさせることができる。
【００３０】
サンプル核酸を配列決定するため、手順は、当該技術分野において公知なように、１回以上、すなわち循環的に繰り返される。この方法で、サンプル核酸におけるいくつかの又は多くの塩基の同定を、原則的に同一の反応において行うことができる。
【００３１】
別個のアリコットが用いられる場合、いったんどの塩基が取込まれたか（すなわち、どのアリコットで取込みが起こったか）が同定されたら、次の塩基配列決定のための手順を繰り返す（サイクル）前に、“取込まれた”塩基を“未反応”のアリコットに添加し、全てのアリコットにおいてプライマーを伸長することができる。“連続的な”実施態様では、手順が繰り返されるとすぐに、ＰＰｉの放出により取込みが示唆されるまで異なるヌクレオチドが連続的に添加される。
【００３２】
それゆえ、配列決定プロトコールには、上述したプライマーのアニーリング、ヌクレオチドの添加、ポリメラーゼに触媒されるプライマー伸長反応の実施、任意のＰＰｉ放出の検出により前記ヌクレオチドの取込みが存在するか否かの検出、及び、ヌクレオチド添加及びプライマー伸長工程等を１回以上繰り返すこと、が含まれ得る。上述したように、単一の（すなわち、個々の）ヌクレオチドが、所望の配列情報及び選択により、同一のプライマー−鋳型混合物に、又はプライマー−鋳型混合物の個々のアリコットに、連続的に添加され得る。
【００３３】
複数塩基の配列決定手順における、繰り返しの又は連続的な（反復の）ヌクレオチド添加を行うためには、それまでに添加されたヌクレオチドは除去されなければならない。これは、洗浄によって、より好ましくは、ヌクレオチド分解酵素（例えば、ＷＯ９８／２８４４０に詳細に記載されている）を用いることによって、達成され得る。
【００３４】
従って、本発明の原則的な実施態様では、任意の取込まれない又は過剰のヌクレオチドを分解するためにヌクレオチド分解酵素が用いられる。従って、ヌクレオチドが添加されたが取込まれない場合（これは、ターゲット塩基と相補的でないことにより起こる）、又は、取込みが起こった後もなお、添加された任意のヌクレオチド（すなわち、過剰のヌクレオチド）が残っている場合には、その後、そのような取込まれなかったヌクレオチドは、ヌクレオチド分解酵素を用いて容易に除去され得る。このことは、ＷＯ９８／２８４４０において詳細に記載されている。
【００３５】
以下でより詳細に述べるが、ヌクレオチド分解酵素を用いる場合、α−チオヌクレオチドの使用による阻害効果が特に生じ（又は観測され）、そして、本発明では、本明細書に記載の方法によって、そのような効果が有益に排除され得ることが、観測された。
【００３６】
本明細書において、“ヌクレオチド分解酵素”という語には、特異的に又は非特異的にヌクレオチド（少なくともヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰｓ）、所望ならば、二リン酸及び一リン酸を含む）を分解できる任意の酵素が含まれ、さらに、ヌクレオシドトリホスファターゼ活性又はその他のＮＴＰ分解活性が存在することを条件に、そのような酵素の任意の組合せ又は混合物が含まれる。好ましくは、ホスファターゼ活性を有するヌクレオチド分解酵素が本発明において用いられる。しかしながら、任意のヌクレオチド又はヌクレオシド分解活性を有する任意の酵素、例えば、リン酸基以外の位置（例えば、塩基又は糖の残基）においてヌクレオチドを開裂させる酵素、もまた用いられることができる。従って、ヌクレオシド三リン酸分解酵素が、本発明において必須である。ヌクレオシド二リン酸及び／又は一リン酸分解酵素は随意的なものであり、ヌクレオシド三リン酸分解酵素と併用して用いられ得る。本発明の当該態様においてヌクレオチド分解酵素として用いられるホスファターゼは、いくつかの基準を満たさなければならない。とりわけ、ホスファターゼ反応のリン酸（Ｐｉ）生成物に対する阻害定数（Ｋｉ）は、蓄積したリン酸により酵素が阻害されない程度に高い値であるべきである。第２に、酵素は、比較的速く働くことが必要であり、あまり遅くないべきである（あるホスファターゼ酵素は、あまりにゆっくり働くため用いることができない）。第３に、４つのヌクレオチド基質（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ基質）は全て、おおよそ等しい効率で分解されるべきである。以下で詳細に述べるように、ＥＬＩＤＡ反応により生じるＡＴＰはＰＰｉ検出に対して好ましく、さらに、本発明において有用なヌクレオチド分解酵素は、また、ＡＴＰを効率良く分解すべきである。これにより、シグナルの効率的な“消滅（ｔｕｒｎｉｎｇ−ｏｆｆ）”がもたらされる。全てのホスファターゼ酵素がこれらの基準を満たすわけではなく（例えば、生成物であるリン酸により強く阻害されるアルカリホスファターゼ）、さらに、全てが本発明におけるヌクレオチド分解酵素としての使用に適切なわけではない、ということは明らかであろう。しかしながら、そのような適性は、通常の実験により容易に評価できる。
好ましいヌクレオチド分解酵素はアピラーゼであり、これはヌクレオシドジホスファターゼ及びヌクレオシドトリホスファターゼのいずれでもあり、
ＮＴＰ → ＮＤＰ＋Ｐｉ、及び
ＮＤＰ → ＮＭＰ＋Ｐｉ
の反応を触媒する（ここで、ＮＴＰはヌクレオシド三リン酸、ＮＤＰはヌクレオシド二リン酸、ＮＭＰはヌクレオシド一リン酸、及び、Ｐｉは無機リン酸である）。アピラーゼは、シグマ・ケミカル・カンパニーから入手することができる。その他の可能なヌクレオチド分解酵素には、ブタ膵臓ヌクレオシド三リン酸ジホスフォリドロラーゼ（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｄｒｏｌａｓｅ）が含まれる（ＬｅＢｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻、１２２７−１２３３頁、１９８０年）。さらなる酵素は、文献中に記載されている。
【００３７】
ヌクレオチド分解酵素は、好ましくは、ポリメラーゼ（すなわち、プライマー伸長）反応工程に含まれ得る。従って、例えば、ポリメラーゼ反応は、ヌクレオチド分解酵素の存在下において実施される。あまり好ましいことではないが、そのような酵素は、ヌクレオチドの取込み（又は、非取込み）が起こった後に、すなわちポリメラーゼ反応工程の後に添加されることもできる。
【００３８】
従って、ヌクレオチド分解酵素（例えば、アピラーゼ）は、任意の適切な方法により、ポリメラーゼ反応混合物（すなわち、サンプル核酸、プライマー、及びポリメラーゼ）に添加され得る。例えば、反応の開始の前あるいはそれと同時に、又はポリメラーゼ反応が行われた後に、例えば、反応を開始するために試料／プライマー／ポリメラーゼにヌクレオチドを添加する前に、又はポリメラーゼとヌクレオチドが試料／プライマー混合物に添加された後に、添加され得る。
【００３９】
好ましくは、ヌクレオチド分解酵素は、単に、ヌクレオチドの添加により開始され得るポリメラーゼ反応の反応混合物に含まれ得る。
【００４０】
本発明のさらなる驚くべき特徴は、α−チオヌクレオチドのＲｐ異性体及び／又は前記α−チオヌクレオチドの分解生成物の使用により、本発明のヌクレオチド分解酵素（特に、アピラーゼ）の阻害がもたらされることが観測されたことである。Ｒｐ異性体は、アピラーゼに対する基質として機能することができず、従ってアピラーゼのヌクレオチド分解活性によっては分解されない、と考えられる。或いは、ＮＴＰαＳの分解による生成物が阻害性を有するのかもしれない。従って、この状況は、配列決定手順の間における阻害性及び不活性なＲｐ異性体（又は、阻害性の分解生成物）の連続的な蓄積から生じ可能性がある。従って、本発明における前記α−チオヌクレオチドのＲｐ異性体及び／又は分解生成物を除去することにより生じ得るさらなる利益は、アピラーゼの阻害を減少又は回避できるということである。このことは、配列決定法の実施及び効率において、顕著な、かつ、これまで予期し得なかった利益であり、さらに本発明の有意義な驚くべき利点を表すものである。
【００４１】
取込まれないヌクレオチドのアピラーゼによる分解は、均一でかつ鮮明な（例えば、狭い／明確な、または鋭い）ＰＰｉ検出シグナルを生じさせるという利益を有する（後記参照）。そのような分解が、アピラーゼ酵素の阻害により効果を生じない場合には、この利益は徐々に失われる。従って、アピラーゼの阻害は、より遅いヌクレオチド分解速度として、及び、その結果として、配列決定のその後のサイクルにおける“広く”又は鮮明でないＰＰｉ検出シグナルとして、直接又は間接的に観測される。特に、さらに後述するＰＰｉ放出のＥＬＩＤＡ検出の記述においては、観測されるシグナル（光）の減衰は、（ＥＬＩＤＡ反応で生ずる）ＡＴＰの分解として“観測（ｓｅｅｎ）”される。従って、より遅いＡＴＰ分解速度が“観測”される。このことから、取込まれないヌクレオチドの分解速度も、また、より遅いことが推測され得る。さらに、同時進行しない（ｎｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｓｅｄ）伸長が結果として生じ得る。取込まれないヌクレオチドの存在は、複数の伸長反応の位相不一致をもたらすと考えられるため、これが生じることにより、重なった（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）シグナル（シグナルオーバーレイ、又は位相不一致シグナル）がもたらされる。従って、そのような同時進行しない伸長により、所定の配列決定の実行において配列決定されるヌクレオチドの数（すなわち、読み取り可能な長さ）が制限される。
【００４２】
より長い核酸を配列決定する能力は、配列決定の分野における所望のゴールである。本発明のＰＰｉに基づく配列決定方法において、α−チオヌクレオチドの使用によって生じる酵素の阻害効果は、忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）の減少及び同時進行しない伸長をもたらし、それにより、読み取り可能な長さ（すなわち、配列決定が成功し得る核酸の長さ）が制限される。本発明において、読み取り長さ（ｒｅａｄ−ｌｅｎｇｔｈ）は、α−チオヌクレオチドのＲｐ異性体及び／又はα−チオヌクレオチドの分解生成物を除去することにより、改善され得る。
【００４３】
読み取り可能な長さは、ある程度、用いられる採用基準に依存するパラメーターである。シグナルの綺麗さが失われた場合であっても、熟練し経験豊かな実施者にとっては、なおも、配列が読み取り可能であることもある。それゆえ、正確な読み取り長さの限界は、常に有意義とは限らず、一様に適用はできるわけではない。しかしながら、特定のケースでは、５０以上、さらには、１００以上（例えば、２００以上）の塩基を、本発明によって容易に読み取ることができるということが分かった。従って、本発明の方法は、１００塩基以上の配列決定に対して適応する。特に、本発明は、好ましくは、５０以上、６０以上、７０以上、又は８０以上の塩基の配列決定において用いることができる。
【００４４】
本発明において、ＰＰｉの放出は、任意の所望の又は簡便な方法により検出され得る。ＰＰｉは、多くの異なる方法により測定されることができ、酵素を用いる多くの方法が文献に記載されている（Ｒｅｅｖｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８巻、２８２−２８７頁、１９６９年；Ｇｕｉｌｌｏｒｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３９巻、１７０−１８０頁、１９７１年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５巻、２７３頁、１９６８年；Ｃｏｏｋら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９１巻、５５７−５６５頁、１９７８年；及び、Ｄｒａｋｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９４巻、１１７−１２０頁、１９７９年）。
【００４５】
ピロリン酸の放出を検出するためにルシフェラーゼに基づく（例えば、ルシフェリンとルシフェラーゼに基づく）光発生反応を用いるのが好ましい。なぜなら、発生する光量は、実質的に放出されるピロリン酸の量に比例し、そして今度は、その量は取込まれる塩基の数に直接的に比例するからである。光量は、ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）等の適切な光検出装置により、容易に算出することができる。
【００４６】
ＰＰｉの放出を検出するためのルシフェラーゼに基づく反応は、当該技術分野において周知である。特に、酵素であるＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼに基づくＰＰｉの放出を検出するための方法が、Ｎｙｒｅｎ及びＬｕｎｄｉｎにより既に開発されており（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５１巻、５０４−５０９頁、１９８５年）、そして、それはＥＬＩＤＡ（酵素による発光計測無機リン酸検出法）と呼ばれている。ＰＰｉを検出するためのＥＬＩＤＡ法の使用は、本発明において好ましい。しかしながら、当該方法は、例えば、より熱安定性のルシフェラーゼを用いることにより（Ｋａｌｉｙａｍａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８巻、１１７０−１１７１頁、１９９４年）、及び／又はＡＴＰスルフリラーゼを用いることにより（Ｏｎｄａら、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６０：１０、１７４０−４２頁、１９９６年）、改良され得る。この方法は、以下の反応に基づくものである。
【００４７】
【化１】
従って、酵素を用いてＰＰｉの放出を検出することが好ましく、ＰＰｉ検出反応において用いられる好ましい検出酵素は、ＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼである。
【００４９】
酵素であるＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼに基づくＰＰｉ検出反応では、（放出されるＰＰｉに対応する）シグナルは光として認識される。光の発生は、Ｐｙｒｏｇｒａｍとして知られている曲線として観測され得る。光は、ルシフェラーゼの作用により、生成物、ＡＴＰ（これは、ＰＰｉと、ＡＴＰスルフリラーゼにより媒介されるＡＰＳ（以下参照）の間の反応により生成する）上において発生する。アピラーゼ等のヌクレオチド分解酵素が用いられる場合、この光の発生は、その後、ヌクレオチド分解酵素の作用（ルシフェラーゼに対する基質であるＡＴＰの分解）により“消滅”する。上昇曲線の傾きは、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＰｉ放出）の活性度、及びＡＴＰスルフリラーゼ（ＰＰｉからのＡＴＰの発生、それによるルスフェラーゼに対する基質の提供）の活性度についての指標として理解することができる。シグナルの高さは、ルシフェラーゼの活性度に依存し、そして、上昇曲線の傾きは、上述のように、ヌクレオチド分解酵素の活性度の指標である。
【００５０】
好ましくは、ポリメラーゼ反応工程にＰＰｉ検出酵素（すなわち、選択された酵素による検出システムにおいてＰＰｉ検出を達成するために必要な酵素であって、ＥＬＩＤＡの場合においては、ＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼであろう）を含むことによって、本発明の方法は、各ヌクレオチドが取込まれることによるシグナルが発生し、それを検出しながら、配列決定反応をリアルタイムで連続的にモニターするために容易に適応されることができる。そのようなアプローチの利点は、ＷＯ９８／１３５２３において、より詳細に記載されている。
【００５１】
従って、ＰＰｉ検出酵素は（ＰＰｉ検出反応に必要とされる任意の酵素基質又はその他の試薬と共に）、ポリメラーゼ反応混合物に単に含まれることができる。
【００５２】
より詳細には、本発明の方法の当該実施態様を実施するために、検出酵素は、ポリメラーゼ反応工程に、すなわち連鎖伸長反応工程に組込まれる。従って、検出酵素は、ポリメラーゼ反応の前に、ポリメラーゼ反応と同時に、又はポリメラーゼ反応の間に、ポリメラーゼ工程の反応混合物に添加される。それゆえ、ＥＬＩＤＡ検出反応の場合において、ポリメラーゼ反応についての反応混合物には、少なくとも１のヌクレオチド、ポリメラーゼ、ルシフェリン、ＡＰＳ、ＡＴＰスルフリラーゼ及びルシフェラーゼが含まれ得る。ポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼの添加によって、又は、より好ましくはヌクレオチドの添加によって開始され得る。そして、好ましくは、検出酵素は、反応が開始する時点で既に存在し、又は、反応を開始する試薬と共に添加され得る。アピラーゼ等のヌクレオチド分解酵素用いられる場合には、ヌクレオチドが存在するなら、ポリメラーゼ添加はアピラーゼの後であるべきではないことは、当然明らかであろう。
【００５３】
従って、本発明により、リアルタイムのシグナルを与えるポリメラーゼ反応の間に、ＰＰｉ放出が検出され得る。配列決定反応は、連続的にリアルタイムでモニターされ得る。
【００５４】
ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は分解生成物は、本発明では、多くの方法により除去されることができ、“除去される（ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ）”という語は、単に、Ｒｐ異性体及び／又は分解生成物がポリメラーゼ反応工程から取り除かれ又は排除されることを要するものである。これは、任意の適切な方法により達成され得る。例えば、Ｒｐ異性体は、ポリメラーゼ反応混合物に添加され又は含まれるＮＴＰαＳ調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）中に存在させないことによって、排除され得る。又は、ＮＴＰαＳ調製物が当初はＲｐ異性体を含む場合でも、例えば酵素による分解によって、ポリメラーゼ反応混合物への添加又は取りこみの前、その間、或いはその後にＲｐ異性体を排除することができる。Ｒｐ異性体を除去するための方法の組合せ（例えば、除去及び排除）も、また用いることができる。従って、Ｒｐ異性体は、ポリメラーゼ反応工程から、重合が起こった後の工程（すなわち、ヌクレオチド分解工程）から、又はヌクレオチド取りこみの検出工程から、除去或いは排除され得る。
【００５５】
ＮＴＰαＳの分解生成物は、ポリメラーゼ反応工程、ヌクレオチド分解工程、又はヌクレオチド取りこみの検出工程の間に、除去され得る。例えば、分解生成物は、酵素による分解により排除される。
【００５６】
それゆえ、本発明の１の実施態様において、Ｒｐ異性体は、Ｓｐ異性体のみを含むＮＴＰαＳの調製を用いることにより、すなわちＮＴＰαＳのＳｐ異性体のみ（純粋なＳｐ異性体）を用いることにより、排除され得る。ＮＴＰαＳにおける個々のＲｐ及びＳｐ異性体は、商業的に入手可能である（例えば、Ｂｉｏｌｏｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｅｍｅｎ、ＤＥ、から）。或いは、そのような異性体は、立体特異的に容易に合成することができ、又は、文献に記載されており当該技術分野において周知の技術を用いて、ラセミ混合物から精製（分離）することもできる（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、ｓｕｐｒａ、参照）。ｄＡＴＰαＳ、それと共にｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのα−チオアナログは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｕｐｐｓａｌａ、ＳＥ）から購入することができる。
【００５７】
Ｒｐ異性体は、反応工程において、ｄＡＴＰαＳの総量の１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは３％未満まで減少され得る。
【００５８】
別の実施態様において、α−チオヌクレオチドアナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物は、それを分解する酵素（特にアルカリホスファターゼ）を用いて除去され得る。特に、予備実験の結果から、出願人は、アルカリホスファターゼが、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び分解生成物を含むＮＴＰαＳの両方の異性体を分解することができると考えている。従って、反応混合物中に又はＮＴＰαＳ調製物中に存在するＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び分解生成物は、アルカリホスファターゼ酵素の添加によって容易に除去（分解）することができる。
【００５９】
より詳細な実施態様では、アルカリホスファターゼ酵素とＳｐ異性体の組合せを用いることができる。
【００６０】
好ましくは、アルカリホスファターゼは、ポリメラーゼ反応工程の間にのみ取りこまれる。これは、ポリメラーゼ反応の開始の前或いはそれと同時に、又はポリメラーゼ反応が起こった後に（例えば、反応を開始するためにヌクレオチドをサンプル／プライマー／ポリメラーゼに添加する前に、又は、ポリメラーゼとヌクレオチドをサンプル／プライマー混合物に添加した後に）、ポリメラーゼ反応混合物へ酵素を添加することにより達成できる。
【００６１】
さらに、アルカリホスファターゼは、個体支持体、例えば、微粒子個体支持体（例えば、磁性ビーズ）又はフィルター、又はディップスティックなどに固定化でき、適切な時期にポリメラーゼ反応混合物に添加され得る。Ｒｐ異性体が分解されると、固定化された酵素は、次のヌクレオチドが添加される前に、反応混合物から除去され得る（例えば、磁性ビーズの場合には、磁気的に回収又は捕捉され得る）。その後、この手順が繰り返され、さらなる塩基を配列決定できる。
【００６２】
アルカリホスファターゼは、ヌクレオチド三リン酸、二リン酸、及び一リン酸（リボ−ＮＴＰ及びｄＮＴＰ、及び上述のＮＴＰαＳについての両方の異性体を含む）からの５’−リン酸残基の除去を触媒する。従って、ヌクレオチド（ヌクレオシド三リン酸）だけでなく、ＮＤＰ及びＮＭＰも分解される。エビ由来、細菌由来、子ウシ腸由来のアルカリホスファターゼが好ましい酵素であるが、任意の適切な供給源からの任意の適切なアルカリホスファターゼ酵素も本発明の方法において用いられ得る。好ましい酵素は、エビ由来のアルカリホスファターゼである。アルカリホスファターゼについては多くの商業的供給源が存在し、又は、所望ならば、生成生物体から単離することもできる。
【００６３】
用いられるアルカリホスファターゼ酵素の量は、用いられる正確な反応系、反応条件等に依存するであろうが、それは、通常の実験により容易に決定できる。例えば、５０ｍＵ乃至１０Ｕの濃度が用いられ得ることが分かった。
【００６４】
上述したように、アルカリホスファターゼは、ＮＴＰにおけるのと同様に、ＮＤＰ及びＮＭＰの分解において活性を有する。従って、ＮＴＰαＳだけでなくＮＤＰαＳ及びＮＭＰαＳを含むα−チオ修飾基質においても、有益に働く。この活性は本発明にさらなる利益を与える。前述のように、ＮＴＰαＳがヌクレオチド取り込みに用いられる場合、アピラーゼ酵素、及び、本発明において好ましいＰＰｉ検出法において用いられるルシフェラーゼ酵素は、阻害される。観測された阻害効果の厳密な性質は明らかではないが、ＮＴＰαＳ生成物又は基質の阻害によるものかもしれない。従って、ＮＴＰαＳ自体が阻害物質かもしれないし、又は、むしろ（例えば、アピラーゼの働きによりもたらされる）ＮＴＰαＳの分解生成物のほうが阻害物質かもしれない。例えば、取り込みのためにポリメラーゼ反応混合物に添加されるＮＴＰαＳにおけるアピラーゼの働きにより生成される分解生成物ＮＤＰαＳ及びＮＭＰαＳ（特に、ｄＡＤＰαＳ及びｄＡＭＰαＳ）が、阻害物質かもしれない。より詳細には、ＮＤＰαＳ及び／又はＮＭＰαＳのＳｐ及びＲｐ異性体の両方が、ルシフェラーゼを阻害し、さらにアピラーゼ酵素も阻害すると考えられる（以下の実施例をさらに参照）。そのような阻害性基質は、アルカリホスファターゼの働きにより除去（又は減少）され得る。
【００６５】
上述のように、アピラーゼの阻害は、より遅いヌクレオチド分解速度、及びそれによるシグナル幅の増加により示唆される。同時進行しない（ｎｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｓｅｄ）伸長も起こり、これは読み取り可能な長さを制限する。ルシフェラーゼの阻害は、シグナル強度の減少により示唆される。従って、以下の実施例でさらに示すように、ルシフェラーゼの阻害は、ヌクレオチドがその後の配列決定サイクルにおいて取り込まれるにつれて起こる、シグナルのピーク高さにおける規則的な減少として観測できる。
【００６６】
シグナル強度の減少（ルシフェラーゼの阻害）の効果は、シグナル鮮明度の損失（例えば、シグナル幅の増加又はシグナルの位相不一致）（アピラーゼの阻害）の効果と結び付き、配列決定方法の効率を減少させ、それゆえ読み取り長さの延長を提供する能力を減少させる。アピラーゼ及びｄＡＴＰαＳ（所望ならば、その他のｄＮＴＰαＳ）と共にアルカリホスファターゼを用いることは、これらの重要なさらなる阻害（すなわち、アピラーゼと共にＮＴＰαＳを用いることから生ずる阻害、例えば、アピラーゼの働きにより生成するＮＤＰαＳ及び／又はＮＭＰαＳに起因する阻害）の源を排除するという予期せぬさらなる利益を有する。
【００６７】
アルカリホスファターゼを用いることのさらなる利益も、また利用可能である。従って、特定の条件又は状況、例えば長い配列決定（例えば、５０サイクル以上）では、取り込みのために添加されるその他のチオ修飾されていないＮＴＰも、（α−チオ修飾アナログよりもその程度は低いが）阻害の源になり得る。例えば、予備的な結果により、ｄＡＴＰがルシフェラーゼ酵素の阻害源になり得ることが示唆される（以下の実施例参照）。取り込まれないＮＴＰにおけるアピラーゼの働きにより、分解生成物、すなわちＮＤＰ及びＮＭＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＡＭＰ、ｄＣＤＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＤＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＤＰ、ｄＴＭＰ）の蓄積が生じる。その後の配列決定サイクルにおいて、そのような生成物は、配列決定及び／又はＰＰｉ検出反応において用いられる酵素、例えばアピラーゼ及び／又はルシフェラーゼを阻害し得る。その他のヌクレオチドにおいて得られ得る任意のそのような阻害効果は、ＮＴＰαＳの使用により生ずる効果よりは少ないものではあるが、それにもかかわらず、それらはなお、当該系の効率の減少に寄与し得る。この場合も同様に、そのような阻害性物質により生じる任意の潜在的問題は、アルカリホスファターゼの働きにより除去又は減少されることができる。
【００６８】
ＡＴＰは、ＰＰｉ検出のための好ましい方法として用いられる（酵素であるＡＴＰスルフリラーゼにより触媒される）ＥＬＩＤＡ反応の最初の工程において生じる。そのようなＡＴＰ生成物（特に、連続的なルシフェラーゼ反応において用いられない任意のそのようなＡＴＰ）も、また、アピラーゼ（又は、その他のヌクレオチド分解酵素）に対する基質として働くことができ、それゆえ、ルシフェラーゼを阻害し、及びより少ない程度ではあるがアピラーゼも阻害する阻害性生成物（例えば、ＡＤＰ及びＡＭＰ）の発生ももたらし得る。この場合も同様に、任意のそのような阻害性生成物は、アルカリホスファターゼの働きにより除去又は減少され得る。
【００６９】
最後に、アルカリホスファターゼの使用は、キナーゼの混入により引き起こされる任意の問題を減少させるという利益をさらに有する。キナーゼは、本明細書で述べる配列決定及びＰＰｉ検出反応において用いられる酵素調製物の混入物となり得る。アピラーゼ分解生成物（すなわち、ＮＤＰ又はＮＭＰ）、及びＥＬＩＤＡ法におけるＡＴＰスルフリラーゼにより生ずるＡＴＰにおけるキナーゼの働きは、初期の配列決定反応を歪め得る（すなわち、ポリメラーゼにより取り込まれ得る）ＮＴＰを生じさせ、さらに同時進行しない（ｎｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｓｅｄ）伸長をもたらす。アルカリホスファターゼは、潜在的なキナーゼ基質を分解させるという有益な効果を有する。
【００７０】
サンプル核酸（すなわち、配列決定される標的核酸）は、配列情報を得ることが望まれる任意のポリヌクレオチド配列であることができる。従って、それは任意のポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド配列であることができる。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができ、天然物であっても合成物であってもよい。従って、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、又はｃＤＮＡ、又はＰＣＲ生成物或いはその他のアンプリコンなどであることができる。標的（サンプル）核酸は、当該技術分野において公知の技術（例えば、単離、クローン化、増幅など）により任意の適切な形態で用いることができ、所望ならば、公知技術により配列決定反応のために調製され得る。サンプル核酸は、ポリメラーゼに基づくプライマー伸長を可能にするための鋳型として機能することができ、それゆえ、簡易的に“鋳型”又は“核酸鋳型”と呼ばれ得る。また、従来は、配列決定反応又は任意のプライマー伸長反応において１本鎖ＤＮＡ鋳型が用いられてきたのに対し、ここでは、ＤＮＡは１本鎖又は２本鎖であり、２本鎖鋳型を用いることもできる。２つのＤＮＡ鎖の鎖置換又は局在化解放（ｌｏｃａｌｉｓｅｄ ｏｐｅｎｉｎｇ−ｕｐ）が起こることにより、プライマーのハイブリダイズ及びポリメラーゼ反応が起こる。
【００７１】
ポリメラーゼ反応では、以下でより詳細に述べるように、選択により任意の適切なポリメラーゼ酵素を用いることができる。ＲＮＡ鋳型を用いる場合には、そのようなポリメラーゼ酵素は、逆転写酵素であることができる。
【００７２】
当該方法を臨床的に繰り返すことによりサンプルＤＮＡを配列決定するために、さらに、相補的な鎖からの１本鎖サンプルＤＮＡの分離を補助するために、サンプルＤＮＡは、所望ならば、個体支持体へ固定化され、又は個体支持体への結合のための手段を提供され得る。
【００７３】
さらに、分析されるサンプル中に存在するＤＮＡの量は少なくても良く、それゆえ、配列決定の前にＤＮＡを増幅するのが望ましい。従って、上述したように、サンプルＤＮＡはアンプリコンであることができる。
【００７４】
任意の所望されるｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ増幅方法を用いることができ、例えば、ＰＣＲ（又は、それらの改良又は修正）、又は自律（Ｓｅｌｆ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（３ＳＲ）、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などである。いずれの増幅方法を用いる場合であっても、増幅ＤＮＡを固定化すること、又は個体支持体への結合のための手段を提供することが好ましいであろう。例えば、ＰＣＲプライマーは、固定化され、又は個体支持体への結合のための手段を提供され得る。
【００７５】
増幅されたＤＮＡの固定化は、１以上のプライマーが支持体に接続されることにより、ＰＣＲ増幅自体の一部として起こることができ、又は、１以上のＰＣＲプライマーは、その後の固定化を可能にする官能基（例えば、ビオチン又はチオール基）を有し得る。プライマーの５’末端による固定化によって、当該プライマーから生ずるＤＮＡ鎖が個体支持体へ固定され、その３’末端が支持体から遠ざけられ、その後の伸長プライマーとのハイブリダイゼーション、及びポリメラーゼによる連鎖伸長が可能となる。好ましくは、個体支持体は、マイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｗｅｌｌ）の形態をとることができる。しかしながら、好ましくは、当該技術分野で（例えば、分離／固定化反応又は固相分析において）説明されている膨大な数のものを含む、任意の固体支持体も用いることができる。従って、支持体には、また、粒子（例えば、ビーズ）、ファイバー又はキャピラリー（これらは、例えば、アガロース、セルロース、アルギナート、テフロン（登録商標）、又はポリスチレンから作られる）を含み得る。Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）により製造されている超常磁性ビーズ等の磁性ビーズも、また、支持体として用いられ得る。
【００７６】
固体支持体は、核酸分子（例えば、プライマー）との接続のために、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、又はアミノ基等の官能基、又はアビジン或いはストレプタビジンのようなその他の部位を有し得る。これらは一般に、そのような官能基の１つを有するポリマーの表面コーティングで支持体を処理することにより、例えば、ヒドロキシル基はポリウレタンとポリグリコール又はセルロース誘導体によって、カルボキシル基はアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー又はコポリマーによって、さらに、アミノ基はアミノアルキル化ポリマーによって提供される。米国特許第４，６５４，２６７号には、多くのそのような表面コーティングの導入について記載されている。
【００７７】
所望ならば、サンプルは、ある回数の反応サイクル（例えば、１５−２５）の後に、当該技術分野において周知の手法により、洗浄され得る。洗浄は、固体表面上におけるサンプルの固定化によって促進され得る。しかしながら、Ｒｐ異性体の除去（特に、アルカリホスファターゼの使用）と共にヌクレオチド分解酵素を用いることは、洗浄が絶対必須ではないということを意味する。
【００７８】
当該分析技術は非常に簡便かつ迅速であり、それゆえ、大量のサンプルを迅速に分析できる無人装置を用いることにより容易に自動化することができる。好ましい検出及び定量は発光反応（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）に基づくものであるため、これはその後に分光光度法を容易に行うことができる。ルミノメーターの使用は、当該技術分野において周知であり、文献に記載されている。
【００７９】
本発明の方法は、サンプルが表面上に分布し、順序付けられたサンプルの集まりが２次元形式で固定化され得る、アレー形式（ａｒｒａｙ ｆｏｒｍａｔ）、例えば微細加工ビーズにおける使用に特に適している。それにより、多くのサンプルを同時に分析することができる。本発明の方法を用いて、酵素と１のヌクレオチドを含む溶液を表面に流し、その後に各サンプルから生じるシグナルを検出することによって、多くの固定化された鋳型をこの方法で分析することができる。その後、この手順を繰り返すことができる。又は、鋳型のハイブリダイゼーションの後に、鋳型と相補的ないくつかの異なるオリゴヌクレオチドを表面上に分布させることができる。ヌクレオチドの取り込みは、種々のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて生じるシグナルによって、各オリゴヌクレオチドについてモニターすることができる。表面の異なる領域からのシグナルを組合せることによって、配列に基づく（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ）分析を種々のヌクレオチドを用いる４サイクルのポリメラーゼ反応により行うことができる。
【００８０】
伸長プライマーの長さは、重大なものではなく、選択によることができる。伸長プライマーのサイズ及びハイブリダイゼーションの安定性が、Ｃ−Ｇに対するＡ−Ｔの比にある程度依存する、ということは当業者には明らかであろう。これは、Ｃ−Ｇ塩基対形成においては、より多くの水素結合形成が可能であることによる。また、当業者は、伸長プライマーと鋳型配列のその他の部分との間における配列同一性の程度を検討し、それにより緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の程度を選択するであろう。そのような通常の実験についての手引きは、文献中に記載されている（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．ＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、１９８９年）。平滑末端ＤＮＡポリメラーゼの活性を排除するために、鋳型の３’末端から少なくとも１塩基内側において配列決定プライマーをハイブリダイズさせることが有益であろう。個別のアリコット（すなわち、各塩基について１ずつの４つのアリコット）を用いる場合、好ましくは、伸長プライマーは、（各アリコットへ別々に添加され得るが）サンプルが４つのアリコットに分割される前に添加される。
【００８１】
又は、ループを含み、それ自身と１本鎖鋳型の３’−末端とを再度アニールする、リン酸化した５’−末端を有するプライマーを用いることができる。鋳型の３’−末端が、Ｔ（鋳型）で表される配列領域を有する場合、プライマーは５’−末端から始まるＰ−Ｌ−Ｐ’−Ｔ’の配列を有する。ここで、Ｐは特異的プライマー（５乃至３０ヌクレオチド）であり、Ｌはループ（好ましくは、４乃至１０ヌクレオチド）であり、Ｐ’はＰに相補的配列（好ましくは、５乃至３０ヌクレオチド）であり、及び、Ｔ’は３’−末端（Ｔ）において鋳型配列と相補的な配列（少なくとも４ヌクレオチド）である。その後、このプライマーは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ又は類似の酵素を用いて、１本鎖鋳型に連結（ｌｉｇａｔｅ）され得る。これは鋳型とプライマーの間に共有結合を提供し、それにより、ハイブリダイズしたプライマーが当該プロトコールの間に洗い流される可能性を回避することができる。
【００８２】
ポリメラーゼ反応では、選択により任意の適切なポリメラーゼ酵素を用いることができ、例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、クレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）、なたはシークエナーゼ Ｖｅｒ．２．０（ＵＳＢ Ｕ．Ｓ．Ａ．）である。好ましくは、任意の適切なポリメラーゼを用いることができ、それらの多くは、当該技術分野において公知であり、文献において報告されている。しかしながら、多くのポリメラーゼは校正能力或いはエラーチェック能力を有しており、連鎖伸長で利用可能な３’末端は時々、１以上のヌクレオチドによって消化（ｄｉｇｅｓｔ）されることが知られている。本発明の方法においてそのような消化が生じると、バックグラウンドノイズのレベルが増加する。この問題を回避するために、非校正ポリメラーゼ、例えばエキソヌクレアーゼ欠乏（ｅｘｏ−）クレノウポリメラーゼを用いることができ、これは
本発明についても好ましい。代替として、フッ化物イオン或いはヌクレオチド一リン酸のような、ポリメラーゼによる３’末端の消化を抑制する物質を用いることができる。厳密な反応条件、試薬濃度などは、選択により、それぞれの系に対して容易に決定できるであろう。しかしながら、全てのフリーな３’末端が伸長されるように、プライマー／鋳型に対して過剰量のポリメラーゼを用いることが有益であろう。
【００８３】
本発明の方法においては、完全に伸長されない鋳型が累積する場合に起こり得るバックグラウンドシグナルの急速な増加を考慮すると、高効率のＤＮＡポリメラーゼをそれぞれの伸長工程において用いることが好ましい。また、各工程における高い忠実度も所望され、これは、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることにより達成され得る。しかしながら、これは伸長鎖の分解が起こり得るという上述した不利益も有する。クレノウポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は低いのではあるが、ヌクレオチド非存在下における長時間の培養によって、プライマーの３’末端が分解され得る。重合工程における誘導適合の結合メカニズムは、１０５−１０６の忠実度へ純粋に寄与する正確なｄＮＴＰの結合を、非常に効率的に選択する。（ｅｘｏ−）クレノウ又はシークエナーゼ Ｖｅｒ．２．０のようなエキソヌクレアーゼ−欠乏ポリメラーゼは、相補的なｄＮＴＰが存在する場合のみ観測されたヌクレオチド取り込みを触媒し、校正エキソヌクレアーゼ活性がないときでもこれらの酵素の忠実度が確認された。シークエナーゼ２．０よりも（ｅｘｏ−）クレノウＤＮＡポリメラーゼを使用することの主な利点は、ヌクレオチドに対するより低いＫｍであり、これは低いヌクレオチド濃度においても高い割合のヌクレオチド取り込みを可能とする。上述のように、全てのｄＮＴＰを、ｄＮＴＰαＳのようなヌクレオチドアナログ又は非天然ヌクレオチドと置換することも可能であり、そのようなアナログは、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと共に用いるのが望ましい。
【００８４】
特定の状況（例えば、より長いサンプル鋳型）において、正しくない（ミスマッチの）ヌクレオチドに対するよりも、正しい（マッチの）ヌクレオチドの取り込みに対してより低いＫＭを有するポリメラーゼを用いることが有益である。これにより、当該方法の精度及び効率が改善される。適切なそのようなポリメラーゼ酵素には、ショウジョウバエのα−ポリメラーゼが含まれる。
【００８５】
多くの診断用途、例えば遺伝性疾患の保因者に対する遺伝子検査において、サンプルはヘテロ接合物質を含むであろう。すなわち、ＤＮＡの半分は標的位置における１のヌクレオチドを有し、もう半分は別のヌクレオチドを有するであろう。従って、本発明の実施態様において４つのアリコット（すなわち、同一サンプルの４つの並行反応）が用いられる場合、２つはネガティブシグナルを示し、もう２つは半分ポジティブシグナルを示すであろう。それゆえ、各サンプルで検出されたシグナルの量を定量的に決定することが所望されることが分かるであろう。また、２以上の同一塩基がプライマーの３’−末端に隣接する場合には、より大きなシグナルが生じることも明らかであろう。ホモ接合サンプルの場合については、サンプルが４つの並行反応に分けられたとき、３つのネガティブシグナルと１つのポジティブシグナルが生じることが明らかであろう。
【００８６】
本発明の方法を実施するにあたり、起こり得るＰＰｉによる試薬（例えば、ＮＴＰ溶液）の汚染は望ましくなく、それは、試薬溶液中にピロホスファターゼを（好ましくは、少量）含むことによって容易に回避され得る。実際、いずれの種類の混入をも回避することが望ましく、例えばキナーゼによる汚染を回避するために、高純度の試薬又は入念に精製された試薬の使用が好ましい。
【００８７】
反応効率は、試薬（ＮＴＰ及び／又はポリメラーゼ）溶液中にＭｇ２＋イオンを含むことにより改善できる。
【００８８】
配列決定されるＤＮＡが複数の、特に、３以上の隣接する同一塩基を有する場合に、ＰＰｉに基づく配列決定方法においてこれまで見られてきた潜在的な問題が発生する。さらに、ミスプライミング（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ）、すなわち、標的ＤＮＡ配列中における標的とされる補体ではないその他の領域へのプライマーのハイブリダイゼーション、によって誤ったシグナルが生じることがあり、これは標的配列の同一性を反映しない“取り込みシグナル”の発生をもたらすであろう。ＷＯ００／４３５４０に記載されているように、このことは、鋳型へプライマーをアニールした後の反応混合物において、１本鎖核酸結合タンパク質を用いることにより回避できる。
【００８９】
従って、本発明のさらなる好ましい特徴は、１本鎖核酸結合タンパク質の使用であり、それはプライマーをアニールした後のポリメラーゼ反応工程の間に含まれる。
【００９０】
上述のように、本発明の利点は、反応混合物から阻害性物質を除去（例えば、撤去及び／又は排除）することに起因する。
【００９１】
従って、異なる観点から見れば、本発明は、少なくとも１のＮＴＰαＳを用いるＰＰｉに基づく配列決定手法においてポリメラーゼの阻害を減少させる方法であって、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は前記ＮＴＰαＳの分解生成物を配列決定反応混合物（すなわち、鋳型、プライマー、ポリメラーゼ、及び／又はヌクレオチドの混合物）から除去することを含む、当該方法を提供する。
【００９２】
さらに、同様の阻害効果は、取り込まれないヌクレオチドを分解するために用いられ得るアピラーゼ酵素についても観測されているので、本発明は、また、少なくとも１のＮＴＰαＳを用いるＰＰｉに基づく配列決定手法において用いられる場合にアピラーゼの阻害を減少させる方法であって、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は前記ＮＴＰαＳの分解生成物を配列決定反応から除去することを含む、当該方法も提供する。
【００９３】
さらに上述したように、好ましくはＰＰｉ検出において用いられるルシフェラーゼ酵素は、種々の阻害性物質（例えば、Ｒｐ異性体及び／又は分解生成物）により阻害され得、好ましくは、これらはアルカリホスファターゼの働きによって除去され得る。従って、さらなる観点では、本発明は、ＰＰｉに基づく配列決定手法において検出酵素として用いられる場合にルシフェラーゼの阻害を減少させる方法であって、配列決定及び／又はＰＰｉ検出の反応混合物中にアルカリホスファターゼを含む、当該方法を提供する。
【００９４】
典型的には、本発明の特定の実施態様において、ＮＴＰαＳはＡＴＰαＳである（例えば、ｄＡＴＰαＳ又はｄｄＡＴＰαＳ）。
【００９５】
本発明には、また、少なくとも以下の構成要素；
（ａ）ポリメラーゼ、
（ｂ）ピロリン酸の放出を検出する手段（好ましくは酵素を用いる手段、最も好ましくはルシフェラーゼ及びＡＴＰスルフリラーゼ、例えばＥＬＩＤＡ分析の反応成分（上記参照））、
（ｃ）任意に、ヌクレオチド分解酵素（好ましくはアピラーゼ）、
（ｄ）アルカリホスファターゼ、
（ｅ）１以上のヌクレオチド、好ましくはデオキシヌクレオチド（これには、アデニンヌクレオチド（例えばｄＡＴＰ）の代わりに前記ヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログ（例えばｄＡＴＰαＳ）が含まれる）、
（ｆ）任意に、標的位置がプライマーの３’末端に近接するようにサンプル核酸へハイブリダイズする特異的テストプライマー、
を標準的に含む、本発明の方法における使用のためのキットが含まれる。
【００９６】
本発明にキットについてのさらなる実施態様は、少なくとも以下の構成要素；
（ａ）ポリメラーゼ、
（ｂ）ピロリン酸の放出を検出する手段（好ましくは酵素を用いる手段、最も好ましくはルシフェラーゼ及びＡＴＰスルフリラーゼ、例えばＥＬＩＤＡ分析の反応成分（上記参照））、
（ｃ）任意に、ヌクレオチド分解酵素（好ましくはアピラーゼ）、
（ｄ）アデニンヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログのＳｐ異性体（好ましくはｄＡＴＰαＳ）、及び、所望ならばチミン、シトシン、又はグアニンヌクレオチドの１以上のＳｐ異性体（好ましくは、ｄＧＴＰαＳ、ｄＣＴＰαＳ、又はｄＧＴＰα）、及び、
（ｆ）任意に、標的位置がプライマーの３’末端に近接するようにサンプル核酸ＤＮＡへハイブリダイズする特異的テストプライマー、
（ｇ）任意に、１以上の非修飾チミン、シトシン、又はグアニンヌクレオチド（好ましくは、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、
（ｈ）任意に、アルカリホスファターゼ、
を標準的に含む。
【００９７】
ＰＰｉの基づく配列決定での阻害性物質の効果を減少させることにおける本発明の利点は、当該方法の効率及び信頼性を改善し、及び、当該方法を用いることができる用途を拡大する。従って、ゲノム再配列決定（ｇｅｎｏｍｅ ｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、比較ＥＳＴ配列決定、微生物型別、及び確証配列決定（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などの、より長い配列の読み取りが要求される技術は、全て、本発明におけるＰＰｉに基づく配列決定によって実行することができる。
【００９８】
キット中に存在するならば、プライマーは、標的ヌクレオチドに近接する位置においてその３’末端で鋳型核酸と結合するように設計される。近接とは、標的ヌクレオチドから１乃至３０ヌクレオチド、好ましくは１乃至２０ヌクレオチド、より好ましくは１乃至１０、最も好ましくは１乃至５ヌクレオチドの範囲を意味する。
【００９９】
これ以降は、図を参照しつつ、非限定的な実施例により本発明を説明する。
【０１００】
実施例１
ＥＬＩＤＡ検出反応を用いるＰＰｉに基づく配列決定における、相違するヌクレオチドの阻害効果の検討−アルカリホスファターゼの効果
本実施例では、酵素であるアピラーゼ及びルシフェラーゼにおける５つの各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）の阻害効果を調査するために、一連の５つの実験を行った。ＰＰｉに基づく配列決定反応におけるこれらのヌクレオチドの効果をシミュレートするモデル系を用いた。各ヌクレオチドを、（ルシフェラーゼに対する基質を提供するための）ＡＴＰと共に、ルシフェラーゼ／アピラーゼ／基質の混合物へ添加し、さらに、酵素における各ヌクレオチドの添加の効果を、ルシフェラーゼ反応から生じる光シグナルの観測によってモニターした。さらなる２つ実験は、第１に、ｄＡＴＰαＳの使用による阻害効果が、アルカリホスファターゼの使用によりモデル系において排除され得ること、第２に、アルカリホスファターゼは、反応系におけるキナーゼ酵素の妨害効果を相殺するという付加的な利益をさらに有するということ（配列決定反応において証明されたように）、を実証する。
【０１０１】
反応は、自動化された試作型パイロシーケンサー機器（パイロシーケンシング ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンから提供）において、５０μｌの体積で、室温で行った。反応混合物は、５０ｍＵのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ＵＳＡ）、１００ｎｇの精製ルシフェラーゼ（ＢｉｏＴｈｅｍａ、Ｄａｌａｒｏ、スウェーデン）、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）、を含む。ルシフェラーゼ及びアピラーゼの活性を理解するために図１乃至５に示すように、２μＭの濃度のＡＴＰを、異なるヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）へ添加した。エビ由来のアルカリホスファターゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）の効果を検討するために、この酵素の２つのユニットを反応混合物へ添加した（以下をさらに参照）。合計すると、５０分間でヌクレオチド及びＡＴＰ混合物の５０添加を行った。ヌクレオチドの取り込みから生じる光のアウトプットは、ＣＣＤ−カメラで検出した。データは、Ｅｘｃｅｌの形式で得た。
【０１０２】
７つの実験を行った。実験１から実験５では、ｄＡＴＰ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのそれぞれの効果について検討した。実験１は、反応混合物に注入される０．７ｍＭのヌクレオチドｄＡＴＰ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。実験１から得られた図を、図１に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している（又は指標である）。シグナル強度の比較的直線的な減少に注目すると、これはルシフェラーゼの阻害によるものであり、ｄＡＴＰ（例えば、ｄＡＭＰ）の分解生成物の蓄積によるものであると考えられる。ｄＡＭＰがルシフェラーゼを阻害することがこれまでに報告されており（Ｆｏｒｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０２巻、３−２０頁、１９９８年）、従って、このことから、阻害性物質はｄＡＭＰであると推論される。従って、ｄＡＴＰを用いた場合にルシフェラーゼの阻害が見られ、これはｄＡＭＰ（ｄＡＴＰ及び／又はｄＡＤＰ）の分解生成物によるものと考えられる。
【０１０３】
実験２は、反応混合物に注入される０．７ｍＭのヌクレオチドｄＡＴＰαＳ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。結果を図２に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。シグナル強度の比較的直線的な減少に注目すると、これはルシフェラーゼの阻害によるものであり、阻害性生成物（例えば、ｄＡＭＰαＳ）の蓄積により引き起こされると考えられる。５０サイクルの後におけるシグナル強度の減少は、図１におけるｄＡＴＰの分解から得られたデータの５０％未満である。従って、このことから、ｄＡＴＰαＳの１の異性体だけが阻害性であると推論され、それはＳｐ異性体である（もっと正確に言えば、Ｓｐ異性体の生成物がルシフェラーゼに対して阻害性である）と考えられる。得られる幅の広いピークにより分かるように、アピラーゼはその後のサイクルにおいて急激に阻害される。各添加の後の阻害効果は、ｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体の蓄積、及びＳｐ異性体の分解生成物の蓄積によるものと考えられる。アピラーゼは、Ｓｐ異性体のみを分解し、Ｒｐ異性体は分解しないと考えられている。ｄＡＴＰαＳの不活性異性体（Ｒｐ）は、分解されて阻害性生成物を生じないため、ルシフェラーゼには認識されないと推測される。
【０１０４】
実験３は、反応混合物に注入される０．２ｍＭのヌクレオチドｄＣＴＰ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。結果を図３に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。５０サイクルの後でも比較的一定しているシグナル強度は、このヌクレオチドの生成物が、用いられる条件下及び示したサイクル数の範囲内においてはルシフェラーゼもアピラーゼも阻害しないことを示唆することに注目すべきである。
【０１０５】
実験４は、反応混合物に注入される０．１６ｍＭのヌクレオチドｄＧＴＰ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。実験４から得られた結果を図４に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。５０サイクルの後でも比較的一定しているシグナル強度は、このヌクレオチドの生成物が、用いられる条件下及び示したサイクル数の範囲内においてはルシフェラーゼもアピラーゼも阻害しないことを示唆することに注目すべきである。
【０１０６】
実験５は、反応混合物に注入される０．８ｍＭのヌクレオチドｄＴＴＰ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて行った。結果を図５に示す。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。５０サイクルの後でも比較的一定しているシグナル強度は、このヌクレオチドの生成物が、用いられる条件下及び示したサイクル数の範囲内においてはルシフェラーゼもアピラーゼも阻害しないことを示唆することに注目すべきである。
【０１０７】
実験６は、反応混合物へのアルカリホスファターゼの添加によりもたらされる阻害の減少を検討したものである。この実験は、反応混合物に注入される０．７ｍＭのヌクレオチドｄＡＴＰαＳ及び２μＭのＡＴＰの混合物を用いて、実験２と同様に行った。結果を図６に示す。得られたピークの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。図２と比較したヌクレオチド分解の効率に注目すべきである。シグナルの幅は５０サイクルの後でも一定に保たれているが、これはアピラーゼの阻害が無いことを示唆し、それゆえ、当該阻害の回避におけるアルカリホスファターゼの高い効果が分かるであろう（これは、ｄＡＴＰαＳの両方の異性体（すなわち、Ｒｐ及びＳｐ異性体）を分解する働きにによるものと考えられる）。シグナル強度の減少は観測されず、それによりルシフェラーゼの阻害がないことが示唆される。このことは、ｄＡＴＰαＳの生成物を分解する（すなわち、阻害性要因を除去する）アルカリホスファターゼの効果に起因すると考えられる。実験６において反応物中に２ＵのＡＰを添加していること以外は、図２と図６の実験条件は同じである。従って、実験６の結果は、アルカリホスファターゼは反応系から阻害性物質を除去することができ、それによりルシフェラーゼとアピラーゼ酵素の性能が改善されることを示している。
【０１０８】
実験７では、配列決定反応におけるヌクレオチド及びキナーゼの阻害効果、及びアルカリホスファターゼを用いることによるこれらの効果の減少について検討した。キナーゼの効果を調査するために、２ｍＵのキナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を配列決定反応混合物に添加した。当該反応混合物は、０．５ｐｍｏｌのプライム化合成鋳型Ｅ３ＰＮ／ＮＵＳＰＴ（Ｒｏｎａｇｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年）、１０Ｕのエキソヌクレアーゼ欠乏クレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）、４０ｍＵのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ＵＳＡ）、１００ｎｇの精製ルシフェラーゼ（ＢｉｏＴｈｅｍａ、Ｄａｌａｒｏ、スウェーデン）、１５ｍＵの組換えにより生成されたＡＴＰスルフリラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、５μＭのアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）、を含む。Ｓｐ−ｄＡＴＰαＳ（Ｂｉｏｌｏｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｅｍｅｎ、ＤＥ）、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の連続的な添加におけるプライマー鎖の段階的な伸長により、及び、それと同時のアピラーゼによるヌクレオチド分解によって、配列決定の手順を実行した。キナーゼの活性におけるアルカリホスファターゼの効果を調査するために、２ｍＵのキナーゼ酵素及び２Ｕのアルカリホスファターゼを、上記の混合物に添加した。ヌクレオチドの取り込みから生じる光のアウトプットは、ＣＣＤ−カメラで検出した。データは、Ｅｘｃｅｌの形式で得た。図７ａは、添加されるキナーゼ及びアルカリホスファターゼの非存在下における配列決定反応の結果を示している。図７ｂは、２ｍＵのヌクレオシド二リン酸キナーゼの存在下における配列決定反応の結果の図を示すものである。矢印は、誤って発生するシグナルを示している。従って、ポリメラーゼ反応混合物へのアルカリホスファターゼの添加は、キナーゼに対する基質を溶液から取り除くことによって、キナーゼの汚染から生じる誤ったシグナルを除去することが理解できるであろう。
【０１０９】
実施例２
ＰＰｉに基づく配列決定におけるｄＡＴＰαＳの阻害効果
本実施例において、通常の（すなわち、ラセミの）ｄＡＴＰαＳ（Ｒｐ及びＳｐ異性体のいずれをも含む）の量、又はｄＡＴＰαＳの純粋なＳｐ異性体の量を変化させて、鋳型非存在下における反応混合物をプレインキュベートすることにより、ＥＬＩＤＡ検出を用いるＰＰｉに基づく配列決定反応（いわゆる、パイロシーケンシング、登録商標）におけるｄＡＴＰαＳの阻害効果を検討した。プレインキュベーションの後に、鋳型を添加し、通常の“パイロシーケンシング（登録商標）反応”を行った。
【０１１０】
原料及び方法
“通常の”ｄＡＴＰαＳは、パイロシーケンシング ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、ＳＥ）により供給されたＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キットから得た。純粋なＲｐ及びＳｐ異性体はＢｉｏｌｏｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）から購入した。反応混合物には、また、パイロシーケンシング ＡＢにより供給されたＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キットからの、Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ−スルフリラーゼ、アピラーゼ、及びルシフェラーゼ）及びＳｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘ（ルシフェリン及びＡＰＳ）が含まれた。鋳型は、配列決定プライマーのアニールの後に読み取ることができた以下の配列、
ＣＴＡＡＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＡＴＣからのオリゴヌクレオチド（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ、Ｕｌｍ、ドイツ）である。
【０１１１】
純粋な異性体のサンプルを、ＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キットにおけるｄＡＴＰαＳと同じ濃度に希釈した。プレインキュベーションのために、０、５、１０、又は２０μｌのＡ−サンプル（通常のｄＡＴＰαＳ、又はＲｐ或いはＳｐ異性体）をそれぞれ、混合物へ添加した。当該混合物は、総量４５μｌ中に、５μｌのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、５μｌのＳｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘを含む。反応は、ＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キット由来の９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）において実行した。反応は、暗室で１０分間、室温において培養した。この後、５μｌのアニール化オリゴヌクレオチド鋳型の１．５ｐｍｏｌを各ウェルに添加し、プレートをＰＳＱ９６装置から移動し、ここで通常の“パイロシーケンシング（登録商標）”反応を行った（Ｅｎｚｙｍｅ及びＳｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘの添加は省略）。
【０１１２】
結果を図８に示す。通常の（すなわち、ラセミの）ｄＡＴＰαＳを用いる場合、５μｌ（図８Ｂ）、１０μｌ（図８Ｃ）、又は２０μｌ（図８Ｄ）におけるプレインキュベーションにより、（０μｌのｄＡＴＰαＳを添加した場合（図８Ａ）と比較して）配列決定反応の深刻な阻害が徐々にもたらされることがわかる。シグナル強度（ピーク高さ）の損失、及び、さらに顕著にはシグナルの鮮明度の損失（例えば、より広い、より不鮮明な、きれいでないシグナル）を見ることができる。従って、アピラーゼの阻害が著しく生じていることがわかるであろう。Ｒｐ異性体が用いられる場合には（図８Ｊ参照）、さらに顕著な阻害が見られる。図８Ｆ（５μｌ）、図８Ｇ（１０μｌ）及び図８Ｈ（２０μｌ）から分かるように（０μｌの図８Ｅと比較して）、この効果は、ラセミのｄＡＴＰαＳ又はｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体の代わりに純粋なＳｐ異性体を用いた場合に劇的に減少した。純粋なＲｐ異性体は、ＥＬＩＤＡ検出に関わる全ての酵素に深刻な影響を有する（図８Ｉ及び８Ｊ）。アピラーゼの阻害は、シグナル幅の増加により示唆される。これは、図８Ｊ乃至８Ｌにおいて明確に見ることができ、図８Ｋにおいて最も明確に示されている。ルシフェラーゼの阻害は、シグナル強度の減少により示唆される。図８Ｋにおいて見ることができるように、シグナル強度は、図８Ｉと比較して減少しており、これはルシフェラーゼが阻害されていることを示唆するものである。
【０１１３】
また、“通常の” ｄＡＴＰαＳをｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、又はｄＴＴＰ（これらは、全てＰＳＱ９６ＳＮＰ試薬キットのプロトタイプから得た）と比較したプレインキュベーションを行って、同様の実験を実行した。対照として、１ｘＴＥ（ｄＮＴＰに対する希釈バッファー）のみを添加した。鋳型は上記と同様であるが、各ウェルに２ｐｍｏｌを添加した。
【０１１４】
得られた結果（図略）は、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、又はｄＴＴＰによるプレインキュベーションからのネガティブ効果は示さなかったが、主にアピラーゼにおけるｄＡＴＰαＳからの深刻なネガティブ効果が確認された。
【０１１５】
実施例３
Ｒｐ−ｄＡＴＰαＳ存在下及び非存在下におけるＰＰｉに基づくＤＮＡ配列決定
この実験では、ｄＡＴＰαＳのＲｐ異性体を用いる場合及び用いない場合（すなわち、ｄＡＴＰαＳのラセミ混合物を用いる場合、及び純粋なＳｐ−ｄＡＴＰαＳを用いる場合）において、同じ鋳型（標準的なクローニングプラスミドｐＵＣ１９のＰＣＲ生成物）を用いて２つの配列決定実験を行った。
【０１１６】
１本鎖鋳型の調製
標準プラスミドｐＵＣ１９を用いて、ＰＣＲにより鋳型を生じさせた。手短に言えば、ＰＣＲプライマーＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡ（上流プライマー、ビオチン化位置は１３４５）、及びＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧ（下流プライマー、位置は１６４８）をｐＵＣ１９のＰＣＲ反応において用い（ここで、位置は、１６４８−１３４５＝３０３ｂｐ）、長さ３０３ｂｐの断片を生じさせた。５０μｌのビオチン化ＰＣＲ生成物を、３０分間４３℃の培養により、２０μｌのストレプタビジンでコートされた超常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０−ストレプタビジン、Ｄｙｎａｌ ＡＳ、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）上に固定化した。５μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨにおいて固定化ＰＣＲ生成物を４分間培養することにより、１本鎖ＤＮＡを得た。固定化鎖は、８μｌのＨ２Ｏと１μｌのアニーリングバッファー（１００ｍＭのトリス−Ａｃ２（ｐＨ７．７５）、２０ｍＭのＭｇＡｃ２）において分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）した。５０μｌのＰＣＲ生成物に対応する１本鎖ＤＮＡを、５分間の室温における培養の後に、１０ｐｍｏｌの配列決定プライマー（ＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣ）と７０℃において３分間ハイブリダイズさせた。（配列決定プライマーのアニーリングの後に、残った１本鎖鋳型の長さは２１１ｂｐであった。）プライム化ＰＣＲ生成物をパイロシーケンシング（登録商標）反応混合物に添加した。ここで、当該反応混合物は、０．１Ｍのトリス−Ａｃ２（ｐＨ７．７５）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１０Ｕのエキソヌクレアーゼ欠乏（ｅｘｏ−）クレノウＤＮＡポリメラーゼ、４０ｍＵのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）、０．８μｇの精製ルシフェラーゼ（ＢｉｏＴｈｅｍａ、Ｄａｌａｒｏ、スウェーデン）、１５ｍＵの組換えＡＴＰスルフリラーゼ（Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄら、１９９９年）、０．５μｇの１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＭｇＡｃ２、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）、１ｍＭのジチオスレイトール、５μＭのアデノシン５’−ホスホ硫酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．）、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を含み、総容量は５０μｌである。
【０１１７】
パイロシーケンシング（登録商標）
８ミリ秒のオープン時間及び６０秒のサイクル時間、６００ミリバールの分配圧（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の、自動化パイロシケンサー試作モデル（パイロシーケンシング ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン；ｗｗｗ．ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｃｏｍ）において、パイロシーケンシング（登録商標）を室温で行った。配列決定の手順は、異なるデオキシヌクレオシド三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の循環的分注（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉｓｐｅｎｓａｔｉｏｎ）におけるプライマー鎖の段階的伸長により実行した。１の実験（図９に示す）では、ｄＡＴＰαＳのラセミ混合物（“通常の” ｄＡＴＰαＳ）を用い（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰと同様に）、さらに第２の実験では、ｄＡＴＰαＳの純粋なＳｐ異性体を用いる。ヌクレオチドの取り込みにより生じる光のアウトプットは、光電子増倍管により検出した。データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにおいて取得し、それを図９及び１０に示す。
【０１１８】
図９を見ると、ヌクレオチドの添加を繰り返すにつれてシグナルの質が徐々に劣化し、結果的に、読み取り可能なシグナルの損失がもたらされることが分かる。図１０では、純粋なＳｐ異性体を用いることによって、シグナルの質はより長い間保持され、読み取ることができないほどシグナルの質が劣化する以には、より長い読み取り長さが得られることが分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＡＴＰの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．７ｍＭヌクレオチド（ｄＡＴＰ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。ＰＰｉはリアルタイムで検出した。
【図２】
図２に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＡＴＰαＳの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．７ｍＭヌクレオチド（ｄＡＴＰαＳ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。
【図３】
図３に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＣＴＰの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．２ｍＭヌクレオチド（ｄＣＴＰ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。
【図４】
図４に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＧＴＰの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．１６ｍＭヌクレオチド（ｄＧＴＰ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。
【図５】
図５に、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＴＴＰの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．８ｍＭヌクレオチド（ｄＴＴＰ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。
【図６】
図１に、アルカリホスファターゼの存在下において、ヌクレオチド溶液中の２μＭのＡＴＰを用いて、ルシフェラーゼとアピラーゼにおけるｄＡＴＰαＳの効果のシミュレーションから得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この実験では、１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）、及び、１Ｕのアルカリホスファターゼを用いた。２μＭのＡＴＰを含む０．７ｍＭヌクレオチド（ｄＡＴＰαＳ）の２００μｌを、実施例１に記載のように反応混合物中へ分注した。上昇カーブの高さはルシフェラーゼの活性度を表し、下降カーブの傾きはアピラーゼの活性度を表している。ＰＰｉはリアルタイムで検出した。
【図７】
図７に、２ｐｍｏｌのプライム化オリゴヌクレオチド鋳型を用いるＤＮＡ配列決定反応において得られた図（ヌクレオチド添加に対する光強度）を示す。この反応系は、１０ＵのクレノウＤＮＡポリメラーゼ、２５ｍＵのＡＴＰスルフリラーゼ、及び、０．１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ７．７５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、及び、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＴｈｅｍａ）を含む。さらに、Ａ）１００ｎｇのルシフェラーゼ及び５０ｍＵのアピラーゼ、Ｂ）１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、及び２ｍＵのヌクレオシド二リン酸キナーゼ、Ｃ）１００ｎｇのルシフェラーゼ、５０ｍＵのアピラーゼ、２ｍＵのヌクレオシド二リン酸キナーゼ、及び２Ｕのアルカリホスファターゼを含む。Ｂにおける矢印は、当該系におけるキナーゼ活性の結果として現れる誤ったシグナルを指し示しており、これは、Ｃに示した実験におけるアルカリホスファターゼの添加によって除去される。
【図８】
図８は、Ｒｐ及びＳｐ異性体のいずれをも含む“通常の”（すなわち、ラセミの）ｄＡＴＰαＳ（（Ａ）０μｌ、（Ｂ）５μｌ、（Ｃ）１０μｌ、（Ｄ）２０μｌ）、又はｄＡＴＰαＳの純粋なＳｐ異性体（（Ｅ）０μｌ、（Ｆ）５μｌ、（Ｇ）１０μｌ、（Ｈ）２０μｌ）、又はｄＡＴＰαＳの純粋なＲｐ異性体（（Ｉ）０μｌ、（Ｊ）５μｌ、（Ｋ）１０μｌ、（Ｌ）２０μｌ）、の量を変化させた場合において、ＰＰｉ−配列決定反応混合物をプレインキュベーションさせた（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）効果を示す図（ヌクレオチド添加に対する光強度）である。プレインキュベーションの後に、鋳型を添加し、実施例２に記載のようにＰＰｉに基づく配列決定反応を行った。
【図９】
図９は、ｐＵＣ１９由来の鋳型におけるＤＮＡ配列決定反応の結果を示す図（ヌクレオチド添加に対する光強度）である。ここで、４つの異なるヌクレオチドは、プライマーとハイブリダイズする鋳型へ段階的に添加される。ｄＡＴＰαＳのＲｐ及びＳｐ異性体の混合物を用いている。鋳型／プライマーを、１０Ｕ（ｅｘｏ−）クレノウ及び４０ｍＵのアピラーゼ、及び実施例３に記載の配列決定／ＰＰｉ検出反応におけるその他の成分、と共に培養した。反応を最初のヌクレオチドの添加により開始させ、ヌクレオチドを段階的に添加した。放出されたＰＰｉは、ルシフェラーゼによりリアルタイムで検出した。
【図１０】
図１０は、ｐＵＣ１９由来の鋳型におけるＤＮＡ配列決定反応の結果を示す図（ヌクレオチド添加に対する光強度）である。ここで、４つのヌクレオチドは、プライマーとハイブリダイズする鋳型へ段階的に添加される。ｄＡＴＰαＳの純粋なＳｐ異性体の混合物のみを用いた。鋳型／プライマーを、１０Ｕ（ｅｘｏ−）クレノウ及び４０ｍＵのアピラーゼ、及び実施例３に記載の配列決定／ＰＰｉ検出反応におけるその他の成分、と共に培養した。反応を最初のヌクレオチドの添加により開始させ、その後ヌクレオチドを段階的に添加した。放出されたＰＰｉは、ルシフェラーゼによりリアルタイムで検出した。
Claims (13)
- サンプル核酸配列における標的位置の塩基を同定する方法であって、
標的位置のすぐ隣で前記サンプル核酸とハイブリダイズするプライマーを、ヌクレオチド存在下においてポリメラーゼプライマー伸長反応させる工程（ここでヌクレオチドは、標的位置における塩基と相補的である場合のみ取込まれる）、及び、ＰＰｉの放出を検出することにより前記ヌクレオチドが取込まれるか否かを決定する工程（標的塩基の同一性は、取込まれる任意のヌクレオチドの同一性から決定される）、
ここで、前記ヌクレオチドがアデニン塩基を含む場合に、前記ヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログが用いられ、前記アナログのＲｐ異性体及び／又は前記アナログの分解生成物がポリメラーゼ反応工程から除去されること、
を含む、当該方法。 - Ｓｐ異性体のみを含むアデニンヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログの調製を用いることによりＲｐ異性体が除去される、請求項１に記載の方法。
- Ｓｐ異性体のみを含むｄＡＴαＳ又はｄｄＡＴＰαＳの調製を用いることによりＲｐ異性体が除去される、請求項２に記載の方法。
- 前記アナログのＲｐ異性体及び／又は分解生成物が酵素分解により除去される、請求項１に記載の方法。
- アルカリホスファターゼがポリメラーゼ反応混合物に含まれるか又は添加される、請求項４に記載の方法。
- ヌクレオチド分解酵素がポリメラーゼ反応工程の間に又はその後に存在する、請求項１乃至５のいずれか１に記載の方法。
- ヌクレオチド分解酵素がアピラーゼである、請求項６に記載の方法。
- アルカリホスファターゼがポリメラーゼ反応混合物に含まれるか又は添加される、請求項２に記載の方法。
- プライマー伸長反応がさらなるヌクレオチドの存在下において繰り返される、請求項１乃至８のいずれか１に記載の方法。
- 少なくとも１のＮＴＰαＳを用いるＰＰｉに基づく配列決定手法において用いられる場合にアピラーゼの阻害を減少させる方法であって、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は前記アナログの分解生成物を配列決定反応から除去することを含む、当該方法。
- 少なくとも１のＮＴＰαＳを用いるＰＰｉに基づく配列決定手法において用いられる場合にルシフェラーゼの阻害を減少させる方法であって、ＮＴＰαＳのＲｐ異性体及び／又は前記アナログの分解生成物を配列決定反応から除去することを含む、当該方法。
- 核酸における標的位置の塩基を同定する方法に使用するためのキットであって、
（ａ）ポリメラーゼ、
（ｂ）ピロリン酸の放出を検出する手段、
（ｃ）任意に、ヌクレオチド分解酵素、
（ｄ）アルカリホスファターゼ、
（ｅ）１以上のヌクレオチド、好ましくはデオキシヌクレオチド（これには、アデニンヌクレオチドの代わりに前記ヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログが含まれる）、
（ｆ）任意に、標的位置がプライマーの３’末端に近接するようにサンプル核酸へハイブリダイズする特異的テストプライマー、
を含む、当該キット。 - 核酸における標的位置の塩基を同定する方法に使用するためのキットであって、
（ａ）ポリメラーゼ、
（ｂ）ピロリン酸の放出を検出する手段、
（ｃ）任意に、ヌクレオチド分解酵素、
（ｄ）アデニンヌクレオチドのα−チオ三リン酸アナログのＳｐ異性体、及び、所望ならばチミン、シトシン、又はグアニンヌクレオチドの１以上のＳｐ異性体、及び、
（ｆ）任意に、標的位置がプライマーの３’末端に近接するようにサンプル核酸ＤＮＡへハイブリダイズする特異的テストプライマー、
（ｇ）任意に、１以上の非修飾チミン、シトシン、又はグアニンヌクレオチド、
（ｈ）任意に、アルカリホスファターゼ、
を含む、当該キット。
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