JP3510272B2 - Ｄｎａの配列決定法 - Google Patents

Ｄｎａの配列決定法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ピロホスフェート（PPi）の放出による塩
基の取り込みの検出に基づくDNAの配列決定法に関す
る。特に、本発明は、「リアルタイム」配列決定法に関
する。
DNA配列決定（シークエンシング）は、分子遺伝学的
分析において必須の道具である。DNAヌクレオチド配列
を決定する能力は、ヒトおよび他の高等生物の大きなゲ
ノムの配列の決定するための努力が開始されたので、ま
すます重要になってきている。DNA配列決定の２つの最
も一般的に用いられる方法は、サンガー（Sanger）の酵
素的鎖停止法、およびマキサムおよびギルバート（Maxa
m and Gilbert）の化学的切断技術である。両方法と
も、より大きなDNAフラグメントから生成されたDNAフラ
グメントを、そのサイズにしたがって解像するために、
ゲル電気泳動に依存している。電気泳動の工程は、その
後の分離されたDNAフラグメントの検出とともに、手間
のかかる手順であるので、これらの工程を自動化するた
めに多大な努力がなされてきた。しかし、自動化された
電気泳動ユニットが商業的に利用可能であるという事実
にもかかわらず、電気泳動は、高性能のスループットを
有する比較的費用に対する効果のよいユニットが必要と
される大規模ゲノムプロジェクトまたは臨床的配列決定
には充分に適していない。したがって、電気泳動によら
ない配列決定法に対する必要性は大きく、電気泳動の欠
点を克服するためのいくつかの代替的な戦略、例えばス
キャニング・トンネル電子顕微鏡術（Driscoll et al.,
1990,Nature,346,294−296）、ハイブリダイゼーション
による配列決定法（Bains et al.,1988,J.Theo.Biol.13
5,308−307）および単一分子検出法（Jeff et al.,198
9,Biomol.Struct.Dynamics,7,301−306）が記載されて
きた。
単一のDNA塩基の変化の迅速な検出を可能にする技術
もまた、遺伝的解析のための重要な道具である。多くの
場合、単一塩基または少数塩基の検出は、遺伝的解析に
おいて非常な助けとなる。これは、いくつかの遺伝的疾
患およびある種のガンは微少な突然変異に関連している
ためである。固相原理に基づくミニ配列決定プロトコー
ルが記載されていた（Hultman et al.,1988,Nucl,Acids
Res.,17,4937−4946;Syvanen et al.,1990,Genomics,
8,684−692）。放射性標識ヌクレオチドの取り込みを測
定し、ヒトアポリポタンパクＥ遺伝子の３対立遺伝子多
型の解析に用いた。しかし、放射活性法は、ルーチンの
臨床的適用には充分に適さず、それゆえ、迅速なDNA配
列決定解析のための簡便な非放射活性法も興味が持たれ
てきた。
ポリメラーゼ反応中に放出される無機ピロホスフェー
ト（PPi）を検出するコンセプトに基づく配列決定の方
法は、記載されていた（WO93/23564およびWO89/0928
3）。ポリメラーゼ反応中に伸長する核酸鎖に各ヌクレ
オチドが付加されるにしたがって、ピロホスフェート分
子が放出される。これらの条件下で放出されるピロホス
フェートは、酵素的に、例えばルシフェラーゼ−ルシフ
ェリン反応において光を生成することにより、検出する
ことができることが見出された。このような方法は、電
気泳動の必要性および有害な放射性標識の使用を回避し
ながら、塩基が標的位置で同定され、DNAが簡便に迅速
に配列決定されることを可能にする。
しかし、上述のPPiベースの配列決定方法は、欠点が
ないものではない。まず最初に、配列決定反応（鎖伸
長）において用いられるdATPは、ルシフェラーゼ酵素の
基質として作用することにより、その後のルシフェラー
ゼベースの検出反応に干渉することが見出されている。
多くの場合に、この干渉は、この方法の利用性を著しく
制限する。
第二に、上述のPPiベースの方法は、操作の容易さお
よび速さにおいて改良を示す一方で、配列情報の迅速な
検出および提供を可能にする改良された配列決定法の需
要がなお存在する。特に、配列決定・鎖伸長反応と同時
に、またはその直後に配列情報が解明されることを可能
にする「リアルタイム」の配列決定法の需要が存在す
る。
本発明者らは、これらの問題が検討され、配列決定反
応が連続的にモニターされることを可能にした、各ヌク
レオチドが取り込まれるにしたがってシグナルが生成さ
れ、検出される、新規な改変されたPPiベースの配列決
定法を提案する。これは、dATPの代わりに、ルシフェラ
ーゼ反応に干渉しないdATPアナログを用いることによ
り、そして、鎖伸長反応混合物中に「検出酵素」を包含
させることによって鎖伸長と検出（またはシグナル生
成）反応とを実質的に同時に行うことにより達成され
る。これは、まず鎖伸長反応を第一の反応工程として分
離して行い、続いて別個の「検出」工程を行い、ここで
鎖伸長反応の生成物を続いてルシフェリン−ルシフェラ
ーゼベースのシグナル生成（「検出」）反応に供する、
という上記で提案されたPPiベースの配列決定法に報告
されたアプローチからの逸脱を表す。
したがって、１つの側面においては、本発明は、一本
鎖試料DNA配列中の標的位置の塩基を同定する方法であ
って、 標的位置にすぐ隣接して試料DNAにハイブリダイズする
伸長プライマーを用意し、試料DNAおよび伸長プライマ
ーを、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオ
チドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、 それによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌク
レオチドを、それが標的位置の塩基と相補的である場合
には取り込まれて、ピロホスフェート（PPi）を放出す
るようにし、PPiの放出を酵素的に検出し、異なるデオ
キシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、試
料−プライマー混合物の別個のアリコートに、または同
じ試料−プライマー混合物に連続的に添加して、ポリメ
ラーゼ反応に供し、どのデオキシヌクレオチドまたはジ
デオキシヌクレオチドが取り込まれたかを示す方法であ
って、 PPi検出酵素がポリメラーゼ反応工程に包含されるこ
と、およびデオキシまたはジデオキシアデノシントリホ
スフェート（ATP）の代わりに、ポリメラーゼの基質と
して作用することができるが、前記PPi検出酵素の基質
としては作用することができないdATPまたはddATPアナ
ログを用いること、を特徴とする方法、を提供する。
本明細書で用いる場合、「ジデオキシヌクレオチド」
という用語は、３′−ヒドロキシル基が欠如し、または
改変されており、したがってポリメラーゼの存在下でプ
ライマーに付加されることはできるが、その後の重合反
応に入ることはできないすべての２′−ジデオキシヌク
レオチドを包含する。
PPiは、多くの異なる方法によって決定することがで
き、多数の酵素的方法が文献に記載されている（Reeves
et al.,（1969）,Anal.Biochem.,28,282−287;Guillor
y et al.,（1971）,Anal.Biochem.,39,170−180;Johnso
n et al.,（1968）,Anal.Biochem,15,273;Cook et al.,
（1978）,Anal.Biochem.91,557−565;およびDrake et a
l.,（1979）,Anal.Biochem.94,117−120）。
ピロホスフェートの放出を同定するために、ルシフェ
ラーゼおよびルシフェリンを組み合わせで用いることが
好ましい。これは、生成される光の量は、放出されたピ
ロホスフェートの量に実質的に比例し、放出されたピロ
ホスフェートの量は、取り込まれた塩基の量に正比例す
るためである。光の量は、ルミノメーターのような好適
な光感受性装置により容易に概算することができる。
PPiの放出を検出するためのルシフェリン−ルシフェ
ラーゼ反応は、当業界で周知である。特に、酵素ATPス
ルフリラーゼおよびルシフェラーゼに基づいてPPi放出
を連続的にモニタリングする方法は、NyrenおよびLundi
n（Anal.Biochem.,151,504−509,1985）により開発され
ており、ELIDA（Enzymatic Luminometric Inorganic Py
rophosphate Detection Assay;酵素的ルミノメトリック
無機ピロホスフェート検出アッセイ）と呼ばれる。PPi
を検出するためのELIDA法の使用は、本発明によれば、
好ましい。しかし、この方法は、例えばより温度安定性
の高いルシフェラーゼ（Kaliyama et al.,1994,Biosci.
Biotech.Biochem.58,1170−1171）の使用により、改変
してもよい。この方法は、以下の反応に基づいている： したがって、PPi検出反応に関与する好ましい検出酵
素は、ATPスルフリラーゼおよびルシフェラーゼであ
る。
本発明の方法を実行するためには、検出酵素をポリメ
ラーゼ反応工程、すなわち鎖伸長反応工程に包含させ
る。したがって、検出酵素は、ポリメラーゼ反応の前
に、それと同時に、またはその最中に、ポリメラーゼ工
程のための反応混合物に添加する。ELIDA検出反応の場
合には、ポリメラーゼ反応のための反応混合物は、少な
くとも１つのヌクレオチド（デオキシまたはジデオキ
シ）、ポリメラーゼ、ルシフェリン、APS、ATPスルフリ
ラーゼおよびルシフェラーゼを含有していてもよい。ポ
リメラーゼ反応は、ポリメラーゼの添加、またはより好
ましくはヌクレオチドの添加により開始させてもよく、
好ましくは、検出酵素は、反応が開始する時には既に存
在するか、それらを反応を開始させる試薬とともに添加
してもよい。
したがって、本発明は、ポリメラーゼ反応中にPPi放
出が検出されることを可能にし、リアルタイムのシグナ
ルを与える。配列決定反応は、リアルタイムで連続的に
モニタリングしてもよい。したがって、PPi放出の迅速
な検出のための手順が本発明により可能になる。ELIDA
反応は、２秒未満で起こると概算されている（Nyren an
d Lundin、前出）。律速工程は、ATPスルフリラーゼに
よるPPiのATPへの変換であり、一方、ルシフェラーゼ反
応は素早く、0.2秒未満で起こると概算されている。ポ
リメラーゼについての取り込み率もまた、種々の方法で
概算されており、例えばKlenow（クレノウ）ポリメラー
ゼの場合には、１つの塩基の完全な取り込みが0.5秒未
満で起こりうることが見出されている。したがって、EL
IDAによる１つの塩基の取り込みおよび検出のための概
算の総時間は、およそ３秒である。したがって、非常に
早い反応時間が可能であり、リアルタイムの検出が可能
になることがわかるであろう。反応時間は、より温度安
定性の高いルシフェラーゼを用いることにより、さらに
短縮しうる。
本発明のさらなる特徴は、酵素的PPi検出反応に干渉
しないが、それにもかかわらずポリメラーゼにより伸長
するDNA鎖に正常に取り込まれうる、dATPまたはddATPア
ナログの使用である。「正常に取り込まれる」とは、ヌ
クレオチドは正常な正しい塩基対を形成して取り込まれ
ることを意味する。ルシフェラーゼがPPi検出酵素であ
る本発明の好ましい態様においては、本発明にしたがっ
て用いるための好ましいアナログは、デオキシまたはジ
デオキシATPの〔１−チオ〕トリホスフェート（または
α−チオトリホスフェート）アナログ、好ましくはデオ
キシアデノシン〔１−チオ〕トリホスフェート、または
これも公知のデオキシアデノシンα−チオトリホスフェ
ート（dATPαＳ）である。dATPαＳは、dCTP、dGTPおよ
びdTTPのα−チオアナログとともに、New England Nucl
ear Labsから購入することができる。以下の実施例にお
いて記載するように、実験は、dATPをdATPαＳで置換す
ることは、dATPαＳとルシフェラーゼとの間での相互作
用の欠如のため、低いバックグラウンドシグナルでのポ
リメラーゼによる効率的な取り込みを可能にすることを
示した。シグナル対ノイズ比は、dATPの代わりにヌクレ
オチドアナログを用いることにより、それがルシフェラ
ーゼの基質として機能することができるdATPの能力によ
り引き起こされるバックグラウンドを排除するため、本
発明にしたがえば増大する。特に、本発明者らは、dATP
による干渉に起因するルシフェリン−ルシフェラーゼ系
による光の生成によるバックグラウンドシグナルが実質
的に減少する一方で、ポリメラーゼを用いての効率的な
取り込みが達成されることを見出した。
鎖伸長の間またはその後に、例えば不純物としてまた
は取り込ませるべき塩基の供給源として添加したdATPの
夾雑物として、反応混合物中にATPが存在する場合に
は、これもピロホスフェートルシフェリン系に干渉し、
不正な発光の読み取りを与える。したがって、反応混合
物に加える前に試薬溶液からATPを除去することが有利
である可能性がある。これは、もはやルシフェラーゼの
基質ではない生成物にATPを変換させる固定化酵素と溶
液とを接触させることにより、達成することができる。
このような酵素としては、特に、ATPをAMPおよび２個の
ホスフェート分子に変換するアピラーゼ（apyrase）が
挙げられる。次に、この固定化酵素を、鎖伸長／検出の
前に除去してもよい。固体支持体としてDynabeads（登
録商標）（ノルウェイ、オスロのDynal ASにより販売）
のような磁性ビーズを用いることが特に好都合である。
これは、このようなビーズは、磁石を用いて溶液との接
触から容易に除去できるためである。しかし、一般に、
このようなATP除去工程は、本発明にしたがえば必要で
あるとは見出されていない。
本発明の方法をサイクルとして繰り返し、それによっ
て試料DNAを配列決定するために、また、一本鎖試料DNA
をその相補鎖から分離するのを助けるために、試料DNA
を、固定化するか、または固体支持体への付着のための
手段とともに提供することが望ましい。さらに、利用可
能な試料DNAの量は少量である可能性があり、したがっ
て、本発明の方法を実行する前に試料DNAを増幅するこ
とが望ましいことがある。
試料DNAは、例えばインビトロでPCRまたはSelf Susta
ined Sequence Replication（3SR）により、あるいはイ
ンビボでベクターを用いて、増幅することができ、そし
て望ましい場合にはインビトロおよびインビボ増幅を組
み合わせて用いてもよい。いずれの増幅方法を用いる場
合であっても、増幅されたDNAは、固定化するか、また
は固体支持体への付着手段とともに提供することが望ま
しい。例えば、PCRプライマーを固定化してもよく、ま
たは固体支持体への付着手段とともに提供してもよい。
また、ベクターは、増幅された試料DNAおよび付着手段
が一緒に切り出されうるように、試料DNAの挿入部位の
隣に固体支持体への付着手段を含んでいてもよい。
増幅されたDNAの固定化は、１または２以上のプライ
マーを支持体に付着させる場として、PCR増幅反応それ
自身の一部として起こってもよく、あるいは１または２
以上のPCRプライマーがその後の固定化を可能にする官
能基、例えばビオチンまたはチオール基を有していても
よい。プライマーの５′末端による固定化は、DNAの鎖
が固体支持体に付着すべきプライマーから発し、その
３′末端が支持体から離れてその後の伸長プライマーと
のハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼによる鎖
伸長に利用可能であることを可能にする。
固体支持体は、好都合にはマイクロタイターウェルの
形態をとってもよく、これは、有利には８×12の従来の
フォーマット、またはプライマーDNAを結合するように
活性化されるポリスチレン製であってもよい計量棒（デ
ィップスティック）の形態であってもよい（K.Almer,博
士論文,Royal Institute of Technology,Stockholm,Swe
den,1988）。しかし、当業界で記載されている非常に多
数のいずれのものをも含め、任意の固体支持体を好都合
に用いることができ、例えば分離／固定化反応または固
相アッセイ用のものがある。したがって、支持体は、例
えば、アガロース、セルロース、アルギネート、テフロ
ン（商標）またはポリスチレン製の、粒子、繊維または
キャピラリ（毛細管）をも含んでいてよい。磁性粒子、
例えばDynal AS（Oslo,Norway）によって生産される超
常磁性ビーズは、反応混合物から容易に単離することが
でき、しかも多くの他の形態の支持体よりも優れた反応
動態を有するので、好ましい支持体である。
固体支持体は、プライマーの付着のために、ヒドロキ
シル、カルボキシル、アルデヒドまたはアミノ基のよう
な官能基、あるいは他の部分（アビジンまたはストレプ
トアビジン等）を担持していてもよい。これらは、一般
に、このような官能基の１つを担持するポリマーの表面
コーティングを提供するために支持体を処理することに
より提供してもよい。例えば、ポリグリコールとともに
ポリウレタンを用いてヒドロキシル基を提供し、または
セルロース誘導体によりヒドロキシル官能基、アクリル
酸またはメタクリル酸のポリマーまたはコポリマーによ
りカルボキシル基、またはアミノアルキル化ポリマーに
よりアミノ基を提供してもよい。米国特許第4654267号
には、多くのこのような表面コーティングの導入が記載
されている。
アッセイ技術は、非常に簡便で迅速であり、したがっ
て多量の試料を迅速に解析する可能性がある場合にはロ
ボット装置を用いることによって自動化することが容易
となる。好ましい検出および定量は発光計測反応に基づ
いているので、これは、分光光度分析的に容易に行うこ
とができる。ルミノメーターの使用は、当業界で周知で
あり、文献に記載されている。
したがって、本発明のリアルタイムのピロホスフェー
ト検出法は、大規模な、電気泳動によらない、固相配列
決定手順のための自動化アプローチの可能性を拓くもの
であり、これは、時間とともに重合反応の進行を連続的
に計測することを可能にする。また、本発明の方法は、
複数の試料を並行して取り扱うことができるという利点
も有する。
標的DNAは、試料中のRNAから合成されたcDNAであって
もよく、したがって、本発明の方法は、特徴的なRNAに
基づく診断に適用可能である。このような予備的合成
は、逆転写酵素を用いる予備的処理により、好都合には
用いる場合その後のPCR工程の緩衝液および塩基類と同
じ系において、実行することができる。PCR手順は、鎖
の分離を行うために加熱を必要とするので、逆転写酵素
は最初のPCRサイクルで不活性化されることになる。mRN
Aが試料核酸である場合、すべてのmRNAをその末端のポ
リＡ配列を介して取り出すために、最初の試料、例えば
血清試料を、固定化ポリdTオリゴヌクレオチドでの処理
に供することが有利である可能性がある。あるいは、特
異的オリゴヌクレオチド配列を用いて、そのRNAを、特
異的RNA配列を介して取り出してもよい。オリゴヌクレ
オチドは、次に、WO89/0982に記載されているようにcDN
A合成のプライマーとして役立てることができる。
有利には、伸長プライマーは、標的位置のすぐ５′側
の配列との適切なハイブリダイゼーションを提供するの
に充分に長いものであり、なおかつ不要な化学合成を避
けるために妥当に短いものである。Ｃ−Ｇペアリング
（対合）においてより多い水素結合が利用できるので、
伸長プライマーのサイズおよびハイブリダイゼーション
の安定性がある程度Ａ−Ｔ対Ｃ−Ｇの塩基ペアリングの
比に依存することは、当業者には明らかであろう。ま
た、当業者は、伸長プライマーと増幅された配列の他の
部分との間の相同性の度合いも考慮して、それにしたが
ってストリンジェンシー（厳密性）を選択するであろ
う。このようなルーチンの実験のための指針は、例えば
Sambrook,J.,Fritsch E.F.およびManiatis,T（1989）の
「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」のような
文献に見出すことができる。４つのアリコートを用いる
場合、伸長プライマーは、各アリコートに別個に添加し
てもよいが、好ましくは、試料を４つのアリコートに分
ける前に添加する。伸長プライマーは、PCRプライマー
と同一であってもよいが、系にさらなる特異性の要素を
導入するために、好ましくは異なるものであることは注
意すべきである。
あるいは、リン酸化された５′末端を有し、ループを
含み、それ自身にアニーリングするプライマー、および
一本鎖テンプレート（鋳型）の３′末端を用いることが
できる。テンプレートの３′末端がＴ（テンプレート）
で示される配列領域を有する場合、プライマーは、５′
末端から始まる以下の配列を有する:P−Ｌ−Ｐ′−
Ｔ′、ここで、Ｐはプライマー特異的であり（５〜30ヌ
クレオチド）、Ｌはループであり（好ましくは４〜10ヌ
クレオチド）、Ｐ′はＰに相補的であり（好ましくは５
〜30ヌクレオチド）、Ｔ′は３′末端のＴ中のテンプレ
ート配列（少なくとも４ヌクレオチド）に相補的であ
る。このプライマーは、T4DNAリガーゼまたは同様の酵
素を用いて一本鎖テンプレートに連結させることができ
る。これは、テンプレートとプライマーとの間に共有結
合リンクを提供し、したがってハイブリダイズしたプラ
イマーがプロトコールの最中に洗い落とされる可能性を
回避する。
伸長プライマーおよびデオキシヌクレオチドの存在下
での各アリコートにおけるポリメラーゼ反応は、ジデオ
キシヌクレオチドを取り込むであろうポリメラーゼ、例
えばT7ポリメラーゼ、クレノウまたはシークエナーゼ
（Sequenase）Ver.2.0（USB U.S.A.）を用いて実行す
る。しかし、多くのポリメラーゼはプルーフリーディン
グまたはエラーチェック能を有すること、および鎖伸長
に利用可能である３′末端はしばしば１または２以上の
ヌクレオチドにより消化されることが公知である。本発
明の方法においてこのような消化が起こる場合、バック
グラウンドのノイズのレベルが上昇する。この問題を避
けるために、プルーフリーディングのないポリメラー
ゼ、例えばエキソヌクレアーゼ欠損（exo-）クレノウポ
リメラーゼを用いてもよい。そうでない場合、ポリメラ
ーゼによる３′消化を抑制するフッ化物イオンまたはヌ
クレオチドモノホスフェートを各アリコートに添加する
ことが望ましい。
本発明の方法において、充分に伸長されていないテン
プレートが蓄積する場合に起こりうるバックグラウンド
シグナルの急速な増大のため、各伸長工程において高い
効率を有するDNAポリメラーゼを用いることが好まし
い。各工程における高い正確性も望ましく、これは、エ
キソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて達
成することができる。しかし、これは、プライマーの分
解が起こりうるという上述の不利益を有する。クレノウ
ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は低いが、本発
明者らは、プライマーの３′末端がヌクレオチドの不存
在下でのより長いインキュベーションで分解されること
を見出した。重合工程におけるインデュースト・フィッ
ト結合メカニズムは、非常に効率的に105〜106の正確性
に向かっての正味の貢献を有する正しいdNTPの結合に対
して選択する。エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ、
例えば（exo-）クレノウまたはシークエナーゼ2.0は、
相補的なdNTPが存在するときのみ観察されるヌクレオチ
ドの取り込みを触媒し、プルーフリーディングエキソヌ
クレアーゼ活性が存在しなくても、これらの酵素の高い
正確性が確認された。シークエナーゼ2.0と比較して（e
xo-）クレノウDNAポリメラーゼを用いる主な利点は、そ
のヌクレオチドに対するより低いKmであり、これが低い
ヌクレオチド濃度でさえ、高率のヌクレオチド取り込み
を可能にする。すべてのdNTPをヌクレオチドアナログま
たは非天然ヌクレオチド（例えばdNTPαＳ）で置換する
ことも可能であり、このようなアナログは、エキソヌク
レアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼと用いるために
は好ましいことがある。
多くの診断用の適用、例えば遺伝性疾患のキャリアに
ついての遺伝的試験において、試料は、ヘテロ接合体の
物質を含むことになる。これは、そのDNAの半分が、標
的位置に１つのヌクレオチドを有し、他の半分が別のヌ
クレオチドを有することになるということである。した
がって、本発明の好ましい方法において４つのアリコー
トを用いる場合、２つは陰性シグナルを示すであろう
し、２つは陽性シグナルの半分を示すであろう。したが
って、各試料中の検出されたシグナルの量を定量的に決
定することが望ましいことがわかるであろう。また、２
またはそれ以上の同じ塩基がプライマーの３′末端に隣
接する場合、より大きなシグナルが生成されることも理
解されるであろう。ホモ接合体の試料の場合には、同じ
ものを４つのアリコートにするとき、３つの陰性および
１つの陽性シグナルがあることは明らかであろう。
プライマーのすぐ３′側の標的塩基がその３′側と同
じ塩基を有する場合、および重合がデオキシヌクレオチ
ド（ジデオキシヌクレオチドでなく）を用いて行われる
場合、伸長反応は、同時に２つの塩基を付加し、実際、
試料中の連続する同一の塩基のあらゆる配列は、プライ
マー中への対応する塩基の同時取り込みをもたらすこと
は理解されるであろう。しかし、そのような反復を検出
するのに何の困難もないように、解放されたピロホスフ
ェートの量は、取り込まれた塩基の数に明らかに比例す
るであろう。
プライマーは、上述の手順で単一の塩基（または同一
の塩基の配列）ごとに伸長されるので、伸長されたプラ
イマーは、正確に同じようにして、繰り返した手順にお
いて配列中の次の塩基の決定に役立つことができ、した
がって試料全体の配列決定が可能になる。試料およびハ
イブリダイズしたプライマーの固定化は、次の工程に進
む前に不要なデオキシヌクレオチドを分離するための洗
浄を可能にする。
本発明は、固定化DNAの配列決定の、２つの基本的な
方法を提供する。
A. 本発明は、試料DNAの配列決定の第一の方法を提供
する。この方法においては、試料DNAを増幅に供し；増
幅されたDNAを固定化して、次に鎖分離に供し、固定化
されていない鎖を除去し、配列決定すべきDNAのその部
分にすぐに隣接する固定化DNAにハイブリダイズする伸
長プライマーを用意し；次に、固定化一本鎖DNAの４つ
のアリコートの各々を、デオキシヌクレオチドの存在下
でポリメラーゼ反応に供し、ここで、各アリコートには
異なるデオキシヌクレオチドを用いることによって、標
的位置の塩基に相補的なデオキシヌクレオチドのみが取
り込まれるようにし；塩基取り込みにより放出されたピ
ロホスフェートを同定し；次に固定化試料およびプライ
マーを、反応溶液から分離し、重合条件下で試料／プラ
イマーの反応していないアリコートに取り込まれた塩基
を添加して、上記の取り込まれた塩基によりすべてのア
リコート中でプライマーを伸長させ、次に固定化した試
料／プライマーを、反応溶液から分離し、試料DNAを配
列決定するためにこのプロセスを繰り返す。
B. 本発明は、試料DNAを配列決定する第二の方法も提
供する。この方法においては、試料DNAを増幅に供し；
増幅されたDNAを固定化し、次に鎖分離に供し、固定化
されていない鎖を除去し、配列決定すべきDNAのその部
分にすぐに隣接する固定化DNAにハイブリダイズする伸
長プライマーを用意し；次に、固定化一本鎖DNAを第一
のデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に
供し、ピロホスフェートの放出の度合いを決定し、必要
な場合、固定化試料およびプライマーを反応混合物から
分離し、反応を、第二、第三、第四のデオキシヌクレオ
チドの連続的な添加によって、ピロホスフェートの陽性
の放出が特定のデオキシヌクレオチドのプライマー中へ
の取り込みを示すまで繰り返し、そこで、手順を、１度
に１塩基プライマーを伸長するよう、また、各段階で伸
長されたプライマーのすぐ３′側の塩基を決定するよ
う、繰り返す。
解析のための代替的なフォーマットの１つは、試料が
例えば微細に制作されたチップの表面に分布されたアレ
イ（array）フォーマットを用いることであり、それに
より試料の秩序だったセットを２次元フォーマットに固
定化してもよい。多くの試料をこれにより並行して解析
することができる。本発明の方法を用いれば、酵素およ
び１つのヌクレオチドを含有する溶液を表面から流出さ
せて、次に各試料について生成されたシグナルを検出す
ることにより、このようにして多くの固定化テンプレー
トを解析することができる。こうして、この手順を繰り
返すことができる。あるいは、テンプレートに相補的な
いくつかの異なるオリゴヌクレオチドを表面に分布さ
せ、続いてテンプレートのハイブリダイゼーションを行
ってもよい。デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌ
クレオチドの取り込みは、プライマーとして種々のオリ
ゴヌクレオチドを用いて生成されたシグナルにより各ヌ
クレオチドについてモニタリングしてもよい。表面の異
なる区域からのシグナルを一緒にすることにより、配列
ベースの解析を、種々のジデオキシヌクレオチドを用い
てポリメラーゼ反応の４つのサイクルにより行ってもよ
い。
本発明者らによる係属中の出願WO90/11369に記載され
ているような（ネステッド・プライマーを用いる）２段
階PCRを用いて、シグナル対ノイズ比を強化し、それに
より本発明の方法の感度を増大させてもよい。このよう
な予備的な増幅により、標的DNAの濃度は、試料中に存
在しうる他のDNAに関して大きく増大し、標的DNAの異な
る配列に対して特異的な少なくとも１つのプライマーを
用いる第二段階の増幅は、「バックグラウンドノイズ」
に対して標的DNAによるシグナルを有意に増強する。
一段階または二段階PCRのどちらを行うかに拘らず、P
CRの効率は重要ではない。これは、本発明は、アリコー
トからの異なる区別される差異に依存するためである。
しかし、上述したように、増幅されたDNAの存在または
不存在のチェックとして最初の定性的DIANAを行うこと
が好ましい。
任意の好適なポリメラーゼを用いてよいが、PCRの各
サイクルにおいて、さらにポリメラーゼ（例えばクレノ
ウフラグメント）を添加する必要なしに反復的な温度サ
イクルを可能にするために、Taqポリメラーゼのような
好熱性酵素を用いることが好ましい。
最初に標的DNAを増幅する好ましい方法として上記でP
CRを記載したが、当業者は、PCRの代わりに、またはそ
れと組み合わせて、他の方法を用いてもよいことを理解
するであろう。最近開発された温度サイクルまたは熱安
定性ポリメラーゼの使用を必要としない増幅技術の１つ
は、Self Sustained Sequence Replication（3SR）であ
る。3SRは、レトロウイルスの複製をモデルとしてお
り、増幅に用いることができる（例えば、Gingeras,T.
R.et al.,PNAS（USA）87:1874−1878およびGingeras,T.
R.et al.,PCR Methods and Applications Vol.1,pp.25
−33を参照されたい）。
上で示したように、この方法は、ジデオキシヌクレオ
チド残基がDNA鎖の末端に取り込まれる場合、ピロホス
フェートの放出を同定することに適用することができ
る。WO93/23562は、DNA配列の単一の標的位置での塩基
の同定方法（ミニ・シークエンシング）に関する。この
方法においては、試料DNAを増幅に供し；増幅されたDNA
を固定化し、次に鎖分離に供し、固定化されていない鎖
を除去し、標的位置にすぐ隣接する固定化DNAにハイブ
リダイズする伸長プライマーを用意し；固定化一本鎖DN
Aの４つのアリコートの各々を、次に、ジデオキシヌク
レオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、各アリコ
ートには異なるジデオキシヌクレオチドを用いて、それ
により標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチ
ドのみが取り込まれるようにし；次に、４つのアリコー
トを４つすべてのデオキシヌクレオチドの存在下で伸長
反応に供し、それにより各アリコートにおいてジデオキ
シヌクレオチドと反応していないDNAを伸長させて二本
鎖DNAを形成させ、一方、ジデオキシでブロックされたD
NAフラグメントを一本鎖のまま残し；続いて二本鎖およ
び／または一本鎖DNAを同定して、どのジデオキシヌク
レオチドが取り込まれたか、それゆえどの塩基が標的位
置に存在したかを示す。明らかに、鎖停止ジデオキシヌ
クレオチド反応におけるピロホスフェートの放出は、ど
の塩基が取り込まれたかを示すが、その後のデオキシヌ
クレオチドプライマー伸長反応（いわゆるチェース反
応）において放出された比較的大量のピロホスフェート
は、はるかに強いシグナルを与えるので、より高感度で
ある。
通常、ジデオキシヌクレオチドなしの対照（コントロ
ール）および４つすべてのジデオキシヌクレオチドの混
合物を含有する「ゼロ対照」を設けることが望ましい。
WO93/23562は、「ジデオキシヌクレオチド」という用
語を、さらなる鎖伸長を防止することにより同じように
作用する３′保護２′デオキシヌクレオチドを含むもの
として定義している。しかし、３′保護基が、（例えば
加水分解によって）除去可能であれば、鎖伸長（単一塩
基による）の後に３′位のブロック除去を続け、伸長さ
れた鎖をさらなる伸長反応の準備ができた状態にしても
よい。このようにして、鎖伸長は、上で論じたような同
一塩基の配列についての複雑さなしに、一度に１つの位
置を進むことができる。したがって、上述の方法Ａおよ
びＢは、改変することができ、それにより各段階で付加
された塩基が３′保護２′デオキシヌクレオチドであ
り、この塩基が付加された（および発光が検出された）
後に、３′保護基を除去して、さらに３′保護２′デオ
キシヌクレオチドが付加されるのを可能にする。好適な
保護基としては、アルカノール基のようなアシル基、例
えばアセチル、または実際当業界で公知の任意のヒドロ
キシル保護基、例えば「Protective Groups in Organic
Chemistry」JFW McOnie,Plenum Press,1973に記載され
ているものが挙げられる。
本発明は、上記の態様において、単一塩基変化の検出
のための簡便で迅速な方法を提供する。好ましいフォー
マットにおいては、これは２つの技術、すなわち固相技
術（磁気ビーズに結合させたDNA）および酵素的発光計
測検出アッセイ（ELIDA）を成功裏に一緒にする。この
方法は、選択的に増幅されたDNAフラグメントを同定お
よび定量するために用いることができる。それはまた、
単一塩基置換の検出および増幅された多型遺伝子フラグ
メントについてのヘテロ接合性インデックスの推定のた
めにも用いることができる。これは、この方法が、後天
的および遺伝性疾患の両方に関与する希な点突然変異に
ついてスクリーニングするため、DNA多型を同定するた
め、また、ウイルスまたは細菌の薬剤耐性および薬剤感
受性株を遠心分離、ろ過、抽出または電気泳動する必要
なしに区別するためにさえ用いることができることを意
味する。この方法は、その簡便性のため、多くの医療的
（広い範囲の遺伝性疾患におけるルーチンの解析）およ
び商業的適用に好適である。
以下に表す陽性の実験結果は、この方法が段階的単一
デオキシヌクレオチドの取り込みを伴う、オンライン自
動化非電気泳動的固相DNA配列決定法に適用可能である
ことを明らかに示す。増幅し、磁性ビーズに固定化し、
一本鎖DNAを得るために融解し、そしてプライマーとア
ニーリングさせた後、テンプレート／プライマーフラグ
メントを、dNTPインキュベーションおよび洗浄の反復的
サイクルにおいて用いる。試料は、ELIDAにおいて連続
的にモニタリングする。DNAの合成には、取り込まれた
ヌクレオチドの量と等しい量の無機ピロホスフェート
（PPi）の放出が付随するので、ELIDAにおけるシグナル
は、相補的な塩基が取り込まれたときにのみ観測され
る。PPiを定量的に決定するこの方法の能力のため、２
個または数個の同時の取り込みから単一塩基の取り込み
を区別することが可能である。DNAテンプレートは、好
ましくはPCRによって得られるため、そのようなアッセ
イについて必要とされるDNAの量を増加させることは、
比較的容易である。
上述のように、本発明者らの結果は、電気泳動によら
ない大規模な固相DNA配列決定の新規なアプローチの可
能性を拓くものであり、この配列決定法は、時間ととも
に重合反応の進行を連続的に決定することを可能にす
る。このようなアプローチの成功のためには、「フェー
ズが合っていない（not“in phase"）」テンプレートが
蓄積する場合に急速に増大するバックグラウンドシグナ
ルのため、DNAポリメラーゼの高い効率の必要性があ
る。この新規なアプローチは、標準的配列決定法と比較
して、いくつかの利点を有する。第一に、この方法は、
複数の試料を並行して取り扱うのに適している。第二
に、比較的費用に対する効果のよい装置を企図すること
ができる。さらに、この方法は、電気泳動の使用を避
け、それにより試料の装填およびゲルの作製を回避す
る。
有利には、本発明の方法は、WO93/23563において教示
されている方法と組み合わせてもよい。その方法は、PC
Rを用いて、目的のDNA鎖の３′末端に永久的に付着した
３′プライマーを提供するループ構造を導入する。例え
ば、このような改変された方法においては、伸長プライ
マーを、標的位置を含む二本鎖DNAの１つの鎖の標的配
列上に３′末端ループ構造の一部として導入し、前記標
的配列は、その３′末端に領域Ａを有し、場合によって
は領域Ａから３′側に伸びるDNA領域Ｂを有し、それに
より、標的配列に相補的な配列の３′末端のハイブリダ
イズする第一のプライマー（この第一のプライマーは固
定化されているか、または固体支持体への付着手段を備
えている）と、標的配列のＡおよび／またはＢの少なく
とも一部分にハイブリダイズする３′末端配列を有する
一方で実質的にＡと同一の配列をその５′末端に有する
第二のプライマーとを用いて、前記二本鎖DNAをポリメ
ラーゼ連鎖反応（PCR）増幅に供し、前記増幅により標
的配列の３′末端に二本鎖標的DNAを、以下の順序：領
域Ａ、ループを形成することができる領域、および配列
Ａに相補的な配列Ａ′で生成させ、その後、増幅された
二本鎖DNAを固定化形態で鎖分離に供し、それにより固
定化されていない標的鎖を放出させて領域Ａ′が領域Ａ
にハイブリダイズできるようにするかハイブリダイズを
起こさせ、それにより前記ループを形成する。領域Ａ′
の３′末端は、標的位置のすぐ隣にハイブリダイズす
る。ジデオキシおよび／または伸長反応は、ハイブリダ
イズした部分をプライマーとして用いる。この原理を用
いた実験は、本明細書の実施例において記載したよう
に、成功裏に行われた。
本発明はまた、本発明の方法において使用するための
キットをも含む。キットは、通常、少なくとも以下のも
のを含む： （ａ）標的位置がプライマーの３′末端に直接隣接する
ように試料DNAにハイブリダイズする試験特異的プライ
マー； （ｂ）ポリメラーゼ； （ｃ）ピロホスフェート放出を同定するための検出酵素
手段 （ｄ）dATPの代わりに、ポリメラーゼの基質として作用
することができるが前記PPi検出酵素の基質として作用
することはできないdATPアナログを含むデオキシヌクレ
オチド；および （ｅ）場合により、ジデオキシヌクレオチド、場合によ
り、ddATPは、ポリメラーゼの基質として作用すること
ができるが前記PPi検出酵素の基質として作用すること
はできないddATPアナログで置換されているもの。
キットが、最初のPCR増幅について使用するためのも
のである場合、通常は、少なくとも以下の成分をも含
む： （ｉ） 少なくとも１つのプライマーがプライマーの固
定化を可能にする手段を有する１対のPCRプライマー； （ii） 好ましくは熱安定性である、ポリメラーゼ（例
えばTaq Iポリメラーゼ）； （iii）PCR反応のための緩衝液；および （iv）デオキシヌクレオチド。
酵素標識を用いてPCRを評価する場合、キットは、有
利には酵素の基質および検出系の他の成分を含む。
本発明を、非制限的な例および図面の参照により説明
する。
図面において、 図１は、リアルタイムDNA配列決定法の模式図であ
る。４つの異なるヌクレオチドを、プライマーにハイブ
リダイズした固定化テンプレートに段階的に添加する。
DNAポリメラーゼ触媒反応において放出されたPPiは、AT
Pスルフリラーゼおよびルシフェラーゼにより触媒され
る反応によって検出される。シグナルの高さは、取り込
まれた塩基の数に比例する。各塩基の添加の後、洗浄工
程を行う。これらの工程を、サイクルで繰り返し、テン
プレートの配列を推定する。
図２は、ルシフェラーゼ反応に対するdATPおよびdATP
αＳの影響を示す。0.1nmolのdATPおよび8nmolのdATPα
Ｓを示したとおりに添加し、発光のアウトプットを検出
した。
図３は、テンプレート濃度の関数としてのPPi合成の
程度を示す。3pmolの（exo-）クレノウを、１または2pm
olのE3PN/NUSPTとともに、示したとおりにインキュベー
トした。反応は、40pmolのdCTPを添加することにより開
始した。放出されたPPiは、ELIDAによって検出した。
図４は、３つの異なるテンプレートへの１塩基の取り
込みのリアルタイム検出を示す。1.5pmolの示したテン
プレートを3pmolの（exo-）クレノウとともにインキュ
ベートした。反応は、40pmolの示したデオキシヌクレオ
チドを添加することにより開始し、放出されたPPiは、E
LIDAによって検出した。
図５は、ストレプトアビジンでコーティングした常磁
性ビーズ上に固定化した、PCRで生成した291塩基の長さ
の一本鎖テンプレートについて行ったリアルタイムDNA
配列決定を示す。約1pmolのテンプレート／プライマー
（NUSPT）を、3pmolの（exo-）クレノウとともにインキ
ュベートした。反応は、40pmolの示したデオキシヌクレ
オチドを添加することにより開始し、放出されたPPi
は、ELIDAによって検出した。各ヌクレオチドの添加の
間に、ビーズを洗浄した。与えられたELIDAシグナル
は、洗浄手順の間のビーズの損失について補償した。半
自動化固相DNA配列決定法により確認されたとおりの、
プライマーの後のDNA配列を、図に挿入してある。
図６は、一方のプライマーがビオチニル化されている
ループ構造を生成するためのPCRの使用の模式図を示
す。PCR生成物を固定化し、非ビオチニル化鎖をアルカ
リで溶出させた。ビオチニル化鎖は、ハイブリダイズさ
せて、ループ構造を作らせた。このループ構造を、図１
に説明し、実施例１に記載したように、リアルタイムDN
A配列決定法のためのテンプレートとして用いた。
図７は、ストレプトアビジンでコーティングした常磁
性ビーズ上に固定化した、PCRで生成されたループ構造
について行ったリアルタイムDNA配列決定法を示す。約2
pmolのテンプレートを、3pmolの（exo-）クレノウDNAポ
リメラーゼとともにインキュベートした。反応は、40pm
olの示したデオキシヌクレオチドを添加することにより
開始し、放出されたPPiは、ELIDAによって検出した。ル
ープ構造は、PCR反応中に３′末端への余分のＡの付加
を可能にするように設計した。これは、いくつかの熱安
定性DNAポリメラーゼ（例えばTaq DNAポリメラーゼ）
は、ターミナルトランスフェラーゼ活性を示し、３′末
端に非テンプレート依存性の余分のＡを付加するためで
ある。
図８は、ストレプトアビジンでコーティングしたキャ
ピラリ上に固定化したDNAフラグメントにハイブリダイ
ズしたプライマーを用いた構成（セットアップ）の模式
図を示す。
実施例１ 材料および方法 オリゴヌクレオチドの合成および精製 RIT28、RIT29、およびUSP（Hultman,T.,Murby,M.,Stah
l,S.,Hornes,E.,and Uhlen,M.（1990）Nucleic Acids R
es.18,5107−5112）を、自動化DNA合成装置（Gene Asse
mbler Plus,Phairmacia Biotech,Uppsala,Sweden）を用
いてホスホルアミダイト化学により合成した。精製は、
迅速タンパク液体クロマトグラフィpepRPC5/5カラム（P
harmacia Biotech,Uppsala,Sweden）によって行った。
インビトロ増幅およびテンプレート調製 PCR反応は、プラスミドpRIT28のマルチリンカー上
で、Hultmanら（前出）にしたがって7.5pmolの一般プラ
イマーRIT28およびRIT29を用いて行った。PCR生成物を
ストレプトアビジンでコーティングした超常磁性ビーズ
Dynabeads（登録商標）M280−ストレプトアビジンまた
はM450−ストレプトアビジン（Dynal A.S.,Oslo,Norwa
y）上に固定化した。一本鎖DNAの生成および配列決定プ
ライマーとのハイブリダイゼーションは、以前に記載さ
れたように行った（Nyren,P.,Pettersson,B.,and Uhle
n,M.（1993）Anal.Biochem.208,171−175）。
リアルタイムDNA配列決定 オリゴヌクレオチドE3PNおよび上述のPCR生成物を、
リアルタイムDNA配列決定のためのテンプレートとして
用いた。オリゴヌクレオチドE3PNを、上述のようにスト
レプトアビジンでコーティングした超常磁性ビーズ〔Dy
nabeads（登録商標）M280−ストレプトアビジンまたはM
450−ストレプトアビジン〕上に固定化し、この固定化
されたテンプレートにプライマーをハイブリダイズさせ
た。固体化されたDNAフラグメントを、改変T7DNAポリメ
ラーゼ（Sequenase 2.0;U.S.Biochemical,Cleveland,O
H,USA）、クレノウDNAポリメラーゼ（Pharmacia Biotec
h,Uppsala,Sweden）またはエキソヌクレアーゼ欠損（ex
o-）クレノウDNAポリメラーゼ（Amersham,UK）のいずれ
かとともにインキュベートした。配列決定手順は、異な
るデオキシヌクレオシドトリホスフェート（Pharmacia
Biotech,Uppsala,Sweden）の連続的な付加の際のプライ
マー鎖の段階的伸長により行った。各ヌクレオチド付加
の間の固定化DNAフラグメントの洗浄は、２工程で行っ
た：最初に、10mMトリス−HCl（pH7.5）、0.25M NaCl、
0.1％Tween 20を含有する緩衝液を用い、次に10mMトリ
ス−アセテート（pH7.5）を用いた。ヌクレオチド取り
込みのために放出されたPPiは、ELIDAによって検出した
〔Nyren,P.（1987）Anal.Biochem.167,235−238〕。発
光は、電位差計測レコーダーに接続したLKB1250ルミノ
メーターを用いて測定した。ルミノメーターは、内部光
標準について10mVの応答を与えるように較正した。発光
アウトプットは、既知の量のATPまたはPPiの添加により
較正した。標準的アッセイ容量は、0.2mlであり、以下
の成分を含有していた:0.1Mトリス−アセテート（pH7.7
5）、2mM EDTA、10mMマグネシウムアセテート、0.1％ウ
シ血清アルブミン、1mMジチオスレイトール、５μＭア
デノシン５′−ホスホスルフェート（APS）、0.4mg/ml
ポリビニルピロリドン（360,000）、100μg/ml D−ルシ
フェリン（BioOrbit,Finland）、４μg/ml L−ルシフェ
リン（BioOrbit,Finland）、0.3U/ml ATPスルフリラー
ゼ（ATP:スルフェートアデニリルトランスフェラーゼ;E
C2.7.7.4）（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA）、
精製ルシフェラーゼ（Sigma Chemial Co.,St.Louis,MO,
USA）、0.1μM ATPについて200mVの応答を与える量。1p
molの固定化DNAフラグメントおよび3pmolのDNAポリメラ
ーゼを上記の溶液に添加した。配列決定反応は、40pmol
のヌクレオチドの１つ（Pharmacia Biotech,Uppsala,Sw
eden）を添加することによって開始させた。反応は、室
温で行った。ルシフェラーゼ反応に対するdATPおよびdA
TPαＳの影響を調べる場合は、APSおよびATPスルフリラ
ーゼの両方をアッセイから除外した。
半自動化固相DNA配列決定 リアルタイムDNA配列決定により得られた配列データ
を、半自動化固相配列決定法〔Hultman,T.,Bergh,S.,Mo
ks,T.,and Uhlen,M.（1991）Biotechniques 10,84−9
3〕により確認した。
結果 配列決定法の原理 配列決定法の原理を図１において説明する。目的の特
異的DNAフラグメントを固体支持体上に（例えばビオチ
ン／ストレプトアビジンカップリングによって）固定化
し、続いて一本鎖形態に変換する。この一本鎖DNAに配
列決定プライマーをハイブリダイズさせ、デオキシヌク
レオチドとのインキュベートおよび洗浄のサイクルの繰
り返しを行う。DNAの合成は、取り込まれたヌクレオチ
ドのそれに等しいモル濃度のPPiの放出を伴う。それに
より、相補的な塩基が取り込まれた場合にのみ、ELIDA
によって、リアルタイムのシグナルを得る。ELIDAにお
いては、生成されたPPiは、ATPスルフリラーゼによりAT
Pに変換され、次に、ATPの量をルシフェラーゼアッセイ
によって決定する（図１）。ELIDAの結果から、プライ
マーの後の配列を推定する。
ルシフェラーゼ系に対するdATPおよびdATPαＳの影響 本発明者らは、dATPがNyrenらにより記載された（前
出）ルシフェラーゼ発光アッセイの検出系に干渉するこ
とを観察した。この干渉は、この方法を単一塩基取り込
み事象を検出するために用いる場合、大きな問題であ
る。このバックグラウンド活性を低減させるためにいく
つかのアプローチを試験したが（データは示していな
い）、それらの中で最大の成果は、天然dATPをdATPαＳ
で置き換えることによって達成された。図２は、ルシフ
ェラーゼアッセイの間にdATPおよびdATPαＳを用いた結
果を示す。0.1nmolのdATPの添加により、発光が即時的
に増大され、続いて定常状態レベルに達するまでゆっく
り減少した。dATPの添加後の発光の定常状態レベルの増
加は、同等のATPの添加からの１〜２％の発光に相当す
る。dATPのこの影響は、dATPを添加することによって配
列決定反応を開始させることを不可能にする。反応は、
その代わりに、DNAポリメラーゼの添加によって開始さ
れなければならない。シグナル対ノイズ比もまた、他の
ヌクレオチドに比較してdATPについてより高くなる。そ
の一方で、8nmolのdATPαＳ（dATPより80倍高い量）の
添加は、ルシフェラーゼに対してほんのわずかの影響し
か与えない（図２）。図２から、dATPαＳが、ルシフェ
ラーゼの基質としてdATPNO0.05％未満しか有効ではない
ことが推定される。これらの結果にしたがって、dATPの
代わりにdATPαＳを、このヌクレオチドを許容するDNA
ポリメラーゼとともに用いることについて、大きな利点
がある。
固相技術 いくつかの異なるパラメーターを、２つの異なる合成
DNAテンプレートを用いてモデル系において最適化し
た。いくかの塩基の配列決定を単純化するために、DNA
を固相上に固定化した。ここで、本発明者らは、Dynal
からの２つのタイプのストレプトアビジンコーティング
を有する超常磁性ビーズ、M280およびM450を用いた。こ
れらのビーズの両タイプは、高い結合容量を有してい
る。本発明者らは、大きい方のビーズ（M450）がその速
い沈降速度のため迅速な洗浄手順を可能にすることを見
出した（データは示していない）。平滑末端DNAポリメ
ラーゼ活性を排除するために（Clak,J.M.（1991）Gene,
104,75−80）、テンプレートの3'末端から少なくとも１
塩基内側にアニーリングする配列決定プライマーを選択
した。図３においては、単一塩基取り込み事象を、２つ
の異なるプライマー／テンプレート濃度について示す。
反応は、次の正しい塩基（dCTP）の添加により開始させ
た。軌跡は、この塩基の取り込み中のPPiの放出を示
す。相補的でない塩基を添加した場合には、PPiの取り
込みは観察されなかった（データは示していない）。後
の実験においては、1pmolのプライマー／テンプレート
を用い、関連シグナル差を記録した（図３）。最初の速
度およびELIDA中に形成されたPPiの度合いは、広い間隔
内でDNAの濃度に比例する（Hultmanら、前出）。アッセ
イの上限は、形成されたPPiで200pmol（１μＭ）〔Nyre
n,P.and Lundin,A.（1985）Anal.Biochem.151,504−50
9〕。下限は、主に、用いた容量、および異なる溶液中
のPPiおよびATPの夾雑によって決定される。
DNAポリメラーゼ濃度の影響 次の一連の実験において、配列決定手順に対するポリ
メラーゼ濃度の影響を調べた。本発明者らは、すべての
遊離３′末端が伸長されることを確実にするためにはプ
ライマー／テンプレートに対して過剰のポリメラーゼを
用いることが重要であることを見出した。より低いポリ
メラーゼ濃度では、２相型の動態（速い相のあとに遅い
相）が観察された（データは示していない）。速い相の
規模は、存在する酵素の量について化学量論的であり、
遅い相は、定常状態の取り込み速度と同じである。遅い
相についての律速工程は、伸長されたプライマー／テン
プレートからのポリメラーゼの解離およびその後の伸長
されていないプライマー／テンプレートへの結合であ
る。ヌクレオチド濃度の間数としての取り込み速度も調
べた。本発明者らは、１塩基取り込みについてのKmが、
クレノウおよびSequenase2.0についてそれぞれ0.2およ
び0.4μＭであることを観察した（データは示していな
い）。後者の結果は、文献のデータと一致している〔Va
n Draanen,N.A.,Tucker,S.C.,Boyd,F.L.,Trotter,B.W.,
and Reardon,J.E.（1992）J.Biol.Chem.267,25019−250
24〕。
リアルタイムDNA配列決定 新規なアプローチの可能性を調べるために、異なる合
成テンプレートならびにPCR生成物を、配列決定した。
３つの異なるプライマー／テンプレート上での１塩基の
伸長を、図４に示す。ヌクレオチド取込みの速度および
程度（傾きおよびシグナルの高さ）の両方が、試験した
３つのタイプのテンプレートについて同様であった。図
５においては、291塩基の長さの一本鎖PCR生成物の15塩
基のリアルタイム配列決定を示す。配列決定手順は、dA
TPαＳの添加により開始した。ELIDAにおいて、塩基取
り込みによるPPi放出は検出されなかった。観察された
小さいシグナルは、ヌクレオチド溶液中のPPiの夾雑に
よるものである。洗浄工程の後に、dGTPを添加した。１
つの残基の取り込みに相当するシグナルが観察された。
次に添加した塩基はdCTPであった。２つの同一塩基の取
り込みに相当するシグナルは検出されなかった。続くdT
TPの添加は何のシグナルも与えなかった。その後、dATP
αＳを再び添加した。このとき、２つの同一塩基の取り
込みが認められた。後者の検出された取り込みは、dATP
αＳはクレノウポリメラーゼによりプライマー／テンプ
レート中に効率的に取り込まれるという以前の観察〔Vo
sberg,H.P.,and Eckstein,F.（1977）Biochemistry 16,
3633−3640〕を確認した。１つの残基の取り込みに相当
するシグナルは、次の添加（dGTP）の後に得られた。こ
のサイクル手順を継続することにより、配列についての
さらなる情報が得られた。同一の残基のストレッチが存
在する場合により長い伸長を可能にするために充分なヌ
クレオチドを添加しなければならないことに注目するこ
とは重要である。配列決定手順を、同じテンプレート上
で数回繰り返し、同じ結果を得た。図５においては、洗
浄手順中のビーズの凝集および損失によるシグナルの低
減（光学密度の低減により測定した）を補償した。損失
は、M280ビーズについてよりもM450ビーズについての方
が少なかった。得られた配列は、半自動化固相サンガー
配列決定法により確認した（データは示していない）。
実施例２ 材料および方法 ヘアピンベクターpRIT28HPの構築およびテンプレートの
調製 オリゴヌクレオチドRIT203およびRIT204（実施例１に記
載したように調製したもの）をハイブリダイズさせ、Hi
nd III（Pharmacia,Biotech,Uppsala,Sweden）で予め制
限したプラスミドpRIT28（Hultmanら、1990、前出）に
連結した。7.5pmolのプライマー対RIT29/ROMO205S、200
μＭ dNTP、20mMトリス−HCl（pH8.7）、2mM MgCl2、
0.1％Tween 20および１単位のAmpliTaq DNAポリメラ
ーゼ（Perkin Elmer,Cetus,Emeryville,USA）を用い、
最終容量を50μｌとして、pRIT28HPプラスミドのマルチ
リンカー上でPCR反応を行った。温度プロフィールは、9
5℃で15秒の変性工程および72℃で90秒のアニーリング
／伸長工程を含んでいた。これらの工程を、GeneAmp P
CRシステム9600（Perkin Elmer,Cetus,Emeryville,US
A）を用いて35回繰り返した。ビオチニル化されたPCR生
成物を、ストレプトアビジンでコーティングされた超常
磁性ビーズ〔Dynabeads（登録商標）M280−ストレプト
アビジン、DynalA.S.,Oslo,Norway〕上に固定化した。
ビーズは、製造者（Dynal A.S.,Oslo,Norway）により記
載されているように使用した。固定化されたPCR生成物
を0.1M NaOH中で５分間インキュベートした後、上清を
除去することにより、一本鎖DNAを得た。固定化された
一本鎖DNAを、まず１×TE（10mMトリス−HCl、1mM EDT
A、pH7.5）で洗浄し、20mMトリス−HCl（pH7.5）、8mM
MgCl2中で、65℃で５分間ハイブリダイズさせ、リアル
タイムDNA配列決定のためのループ構造を作成した。
ループ構造上でのリアルタイムDNA配列決定 調製した、超常磁性ビーズ上に固定化されたループ構
造を、（exo-）クレノウDNAポリメラーゼとともにイン
キュベートした。実施例１に記載したように配列決定手
順を行った。
結果 リアルタイム配列決定における使用のためのテンプレ
ートとしてループ構造を生成する原理を、図６に示す。
この方法は、１つのみのビオチニル化されたプライマー
の使用を包含し、このプライマーが、ハイブリダイズし
た増幅生成物を固定化するために用いられる。非ビオチ
ニル化鎖は除去され、ハイブリダイゼーションによるル
ープ構造の形成を可能にする。固定化されたループ構造
の使用の結果を、後の12回の配列決定サイクルについて
図７に示す。この方法によって、ループプライマーに隣
接する最初の10塩基の配列を決定することができた。
配列決定は、固体支持体としてキャピラリ（毛細管）
を用いて行ってもよい。ハイブリダイズしたプライマー
を有する固定化DNAフラグメントを用いての構成（セッ
トアップ）についての模式図（例１のような）を、図８
に示す。同様のセットアップを、ループプライマーを有
する固定化DNAフラグメントについて用いてもよい。
フロントページの続き (72)発明者 ロナギ、モスタファ スウェーデン国、エス―115・50・スト ックホルム、ロイトナンツガータン 11・６ティーアール (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一本鎖試料DNA中の標的位置の塩基を同定
    する方法であって、標的位置にすぐ隣接して試料DNAに
    ハイブリダイズする伸長プライマーを用意し、試料DNA
    および伸長プライマーを、デオキシヌクレオチドまたは
    ジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に
    供し、それによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキ
    シヌクレオチドを、それが標的位置の塩基と相補的であ
    る場合にのみ取り込まれてピロホスフェート（PPi）を
    放出するようにし、PPiの放出を酵素的に検出し、異な
    るデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチド
    を、試料−プライマー混合物の別個のアリコートに、ま
    たは同じ試料−プライマー混合物のアリコートに連続的
    に、添加して、ポリメラーゼ反応に供し、どのデオキシ
    ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが取り込ま
    れたかを示す方法であって、PPi検出酵素をポリメラー
    ゼ反応の前に、それと同時に、またはその最中に、ポリ
    メラーゼ工程のための反応混合物に添加し、およびデオ
    キシまたはジデオキシアデノシントリホスフェート（AT
    P）の代わりに、ポリメラーゼの基質としては作用する
    ことができるが、前記PPi検出酵素の基質としては作用
    することができないdATPアナログまたはddATPアナログ
    を用いることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】PPiの放出を、ルシフェラーゼ−ルシフェ
    リンベースの反応を手段として検出する、請求項１記載
    の方法。
  3. 【請求項３】PPiの放出を、酵素的発光計測無機ピロホ
    スフェート検出アッセイ（ELIDA）を用いて検出する、
    請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】dATPまたはddATPアナログが、デオキシア
    デノシンα−チオトリホスフェート（dATPαＳ）であ
    る、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】dCTP、dGTPおよびdTTPのα−チオアナログ
    の使用をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載
    の方法。
  6. 【請求項６】試料DNAを、固定化する、または固体支持
    体への付着のための手段とともに提供する、請求項１〜
    ５のいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】試料DNAを最初に増幅する、請求項１〜６
    のいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】伸長プライマーが、ループを含み、それ自
    身および試料DNAの３′末端にアニーリングする、請求
    項１〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】試料DNAを増幅に供し；増幅されたDNAを固
    定化し、次に鎖分離に供し、固定化されていない鎖を除
    去し、標的位置にすぐ隣接して固定化DNAにハイブリダ
    イズする伸長プライマーを用意し；固定化一本鎖DNAの
    ４つのアリコートの各々を、次にジデオキシヌクレオチ
    ドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、各アリコートに
    は異なるジデオキシヌクレオチドを用いて、それにより
    標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドのみ
    が取り込まれるようにし；次に、４つのアリコートを４
    つすべてのデオキシヌクレオチドの存在下で伸長に供
    し、それにより各アリコートにおいてジデオキシヌクレ
    オチドと反応していないDNAを伸長させて二本鎖DNAを形
    成させる一方で、ジデオキシでブロックされたDNAを一
    本鎖DNAのまま残し；続いて、二本鎖DNAおよび／または
    一本鎖DNAを同定して、どのジデオキシヌクレオチドが
    取り込まれたか、したがってどの塩基が標的位置に存在
    したかを示す、請求項１〜８のいずれか１項記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】ポリメラーゼ反応工程中のポリメラーゼ
    が、エキソヌクレアーゼ欠損性（exo-）である、請求項
    １〜９のいずれか１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】複数の試料DNA配列についての使用のた
    めの、前記DNA配列を固体表面にアレイフォーマットで
    配置する、請求項１〜10のいずれか１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】請求項１〜11のいずれか１項記載の方法
    において用いるためのキットであって、 （ａ）ポリメラーゼ； （ｂ）ピロホスフェート放出を同定するための検出酵
    素；および （ｃ）dATPの代わりに、ポリメラーゼの基質として作用
    することができるが前記PPi検出酵素の基質として作用
    することはできないdATPアナログを包含する、デオキシ
    ヌクレオチド を含むキット。
  13. 【請求項１３】請求項１〜11のいずれか１項記載の方法
    において用いるためのキットであって、 （ａ） ポリメラーゼ； （ｂ） ピロホスフェート放出を同定するための検出酵
    素；および （ｃ） ddATPの代わりに、ポリメラーゼの基質として
    作用することができるが前記PPi検出酵素の基質として
    作用することはできないddATPアナログを包含する、ジ
    デオキシヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】さらに、 （ｄ） 標的位置がプライマーの3'末端に直接隣接する
    ように試料DNAにハイブリダイズする試験特異的プライ
    マー；および （ｅ） ddATPが、ポリメラーゼの基質として作用する
    ことができるが前記PPi検出酵素の基質として作用する
    ことができないddATPアナログで置換されている、ジデ
    オキシヌクレオチド の一方または両方を含む、請求項12記載のキット。
  15. 【請求項１５】さらに、 （ｄ） 標的位置がプライマーの3'末端に直接隣接する
    ように試料DNAにハイブリダイズする試験特異的プライ
    マー；および （ｅ） dATPが、ポリメラーゼの基質として作用するこ
    とができるが前記PPi検出酵素の基質として作用するこ
    とができないdATPアナログで置換されている、デオキシ
    ヌクレオチド の一方または両方を含む、請求項13記載のキット。
  16. 【請求項１６】最初のPCR増幅について用いるために、
    さらに （ｉ） 少なくとも１つのプライマーがプライマーの固
    定化を可能にする手段を有する１対のPCRプライマー； （ii） PCR用ポリメラーゼ；および （iii） デオキシヌクレオチド を含む、請求項12〜15のいずれか１項に記載のキット。
  17. 【請求項１７】ポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ欠
    損性（exo）である、請求項12〜16のいずれか１項記載
    のキット。
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