JP2009513135A - エンコードされたライブラリーを用いて興味のある化合物を同定する方法 - Google Patents
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- C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Abstract
Description
本出願は、2005年10月28日に提出された米国仮出願番号60/731,464の優先権を主張する。本出願は、2005年6月9日に提出された米国特許出願番号60/689,466(係属中)、および2004年12月17日に提出された米国特許出願番号11/015458に関連する。本出願はさらに、2003年12月17日に提出された米国仮特許出願番号60/530,854;2004年1月30日に提出された米国仮特許出願番号60/540,681;2004年3月15日に提出された米国仮特許出願番号60/553,715;および2004年7月16日に提出された米国仮特許出願番号60/588,672にも関連する。前記出願のそれぞれの全内容は本発明の一部として参照される。
有用な生物活性を有する化合物を同定するためのより有効な方法の探索は、コンビナトリアルライブラリーと呼ばれる集団において存在する、膨大な数の異なる化合物のスクリーニング法の開発に至っている。このようなライブラリーは105以上の異なる化合物を含み得る。コンビナトリアルライブラリーを産生するための様々な方法が存在し、ペプチド、ペプチド模倣物および有機小分子の組み合わせ合成が報告されている。
イミン/イミニウム/エナミン形成反応:
芳香族求核置換反応:
アルドール反応:
を有し得、式中、Aは、ビルディングブロックと共有結合を形成できる官能基であり、Bはオリゴヌクレオチドの5’末端と結合を形成できる官能基であり、Cはオリゴヌクレオチドの3’末端と結合を形成できる官能基である。D、FおよびEは官能基A、CおよびBを、コア原子または骨格であるSと連結する化学基である。好ましくは、D、EおよびF はそれぞれ独立して、原子の鎖、例えば、アルキレン鎖またはオリゴ(エチレングリコール)鎖であり、およびD、EおよびFは同一または異なり、好ましくは、2つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび官能部分の合成を可能にするために有効である。1つの実施形態において、三価リンカーは構造
5’−CAGCGTTCGA N’N’N’N’N’CAGACAAGCTTCACCTGC−3’
3’−AA GTCGCAAGCT N N N N N GTCTGTTCGAAGTGGACG−5’
3’−AA GTCGCAAGCTACG ABBBABBBABBBA GACTACCGCGCTCCCTCCG
式中、Xは分子骨格であり、各Yは独立して、末梢部分であり、nは1から6の整数である。各Aは独立してビルディングブロックであり、nは0から約5の整数である。Lは結合部分であり、Zは一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであって、構造−At−X(Y)nを特定するものである。構造X(Y)nは、例えば、表8(下記参照)に記載される骨格構造の一つである。1つの実施形態において、本発明は式IIIの化合物、およびかかる化合物を含むライブラリーを提供する
式中、tは0から約5、好ましくは、0から3の整数であり、各Aは独立してビルディングブロックである。Lは結合部分であり、Zは一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであって、各AおよびR1、R2、R3およびR4を特定するものである。R1、R2、R3およびR4はそれぞれ独立して、置換基水素、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、および置換アミノから選択される置換基である。1つの実施形態において、各Aはアミノ酸残基である。
(A)化合物のライブラリーを合成し(ここで、化合物は:
(i)mのイニシエーター化合物を含む溶液を提供し(ここで、mは1以上の整数であり、イニシエーター化合物は、nのビルディングブロックを含む官能部分(ここで、nは1以上の整数である)であって、nのビルディングブロックを同定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合するものからなり;
(ii)段階(i)の溶液をrの反応容器中に分割し(ここで、rは2以上の整数である)、これにより、溶液のrのアリコートを作製し;
(iii)各反応容器中のイニシエーター化合物をrのビルディングブロックの1つと反応させ、これにより、初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合したn+1のビルディングブロックを含む官能部分からなる化合物を含むrのアリコートを作製し;
(iv)各アリコート中の初期オリゴヌクレオチドを、rの独立した入力オリゴヌクレオチドの組の一つと、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドを触媒する酵素の存在下、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの酵素結紮に適した条件下で反応させ;これにより、n+1のビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合したn+1のビルディングブロックを含む官能部分からなる分子のrのアリコートを作製する
ことにより、官能部分の構造を特定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合する2以上のビルディングブロックを含む官能部分を含む);
(B)生物学的標的を化合物のライブラリー、またはその一部と、化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバーが標的と結合するために適した条件下で接触させ;
(C)標的と結合しないライブラリーメンバーを除去し;
(D)標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを配列決定し;
(E)生物学的標的と結合する化合物のライブラリーのメンバー,の官能部分の構造を決定するために、段階(D)において決定された配列を使用し、これにより生物学的標的と結合する1以上の化合物を同定することを含む方法により同定することができる。
実施例
105のオーダーで異なるメンバーを含むライブラリーの合成を、次の試薬を用いて行った:
デオキシリボヌクレオチドについての1文字コード:
A=アデノシン
C=シチジン
G=グアノシン
T=チミジン
配列 タグ番号
5’−PO3−GCAACGAAG(配列番号1) 1.1
ACCGTTGCT−PO3−5’(配列番号2)
5’−PO3−GCGTACAAG(配列番号3) 1.2
ACCGCATGT−PO3−5’(配列番号4)
5’−PO3−GCTCTGTAG(配列番号5) 1.3
ACCGAGACA−PO3−5’(配列番号6)
5’−PO3−GTGCCATAG(配列番号7) 1.4
ACCACGGTA−PO3−5’(配列番号8)
5’−PO3−GTTGACCAG(配列番号9) 1.5
ACCAACTGG−PO3−5’(配列番号10)
5’−PO3−CGACTTGAC(配列番号11) 1.6
CAAGTCGCA−PO3−5’(配列番号12)
5’−PO3−CGTAGTCAG(配列番号13) 1.7
ACGCATCAG−PO3−5’(配列番号14)
5’−PO3−CCAGCATAG(配列番号15) 1.8
ACGGTCGTA−PO3−5’(配列番号16)
5’−PO3−CCTACAGAG(配列番号17) 1.9
ACGGATGTC−PO3−5’(配列番号18)
5’−PO3−CTGAACGAG(配列番号19) 1.10
CGTTCAGCA−PO3−5’(配列番号20)
5’−PO3−CTCCAGTAG(配列番号21) 1.11
ACGAGGTCA−PO3−5’(配列番号22)
5’−PO3−TAGGTCCAG(配列番号23) 1.12
ACATCCAGG−PO3−5’(配列番号24)
5’−PO3−GCGTGTTGT(配列番号25) 2.1
TCCGCACAA−PO3−5’(配列番号26)
5’−PO3−GCTTGGAGT(配列番号27) 2.2
TCCGAACCT−PO3−5’(配列番号28)
5’−PO3−GTCAAGCGT(配列番号29) 2.3
TCCAGTTCG−PO3−5’(配列番号30)
5’−PO3−CAAGAGCGT(配列番号31) 2.4
TCGTTCTCG−PO3−5’(配列番号32)
5’−PO3−CAGTTCGGT(配列番号33) 2.5
TCGTCAAGC−PO3−5’(配列番号34)
5’−PO3−CGAAGGAGT(配列番号35) 2.6
TCGCTTCCT−PO3−5’(配列番号36)
5’−PO3−CGGTGTTGT(配列番号37) 2.7
TCGCCACAA−PO3−5’(配列番号38)
5’−PO3−CGTTGCTGT(配列番号39) 2.8
TCGCAACGA−PO3−5’(配列番号40)
5’−PO3−CCGATCTGT(配列番号41) 2.9
TCGGCTAGA−PO3−5’(配列番号42)
5’−PO3−CCTTCTCGT(配列番号43) 2.10
TCGGAAGAG−PO3−5’(配列番号44)
5’−PO3−TGAGTCCGT(配列番号45) 2.11
TCACTCAGG−PO3−5’(配列番号46)
5’−PO3−TGCTACGGT(配列番号47) 2.12
TCAGATTGC−PO3−5’(配列番号48)
5’−PO3−GTGCGTTGA(配列番号49) 3.1
CACACGCAA−PO3−5’(配列番号50)
5’−PO3−GTTGGCAGA(配列番号51) 3.2
CACAACCGT−PO3−5’(配列番号52)
5’−PO3−CCTGTAGGA(配列番号53) 3.3
CAGGACATC−PO3−5’(配列番号54)
5’−PO3−CTGCGTAGA(配列番号55) 3.4
CAGACGCAT−PO3−5’(配列番号56)
5’−PO3−CTTACGCGA(配列番号57) 3.5
CAGAATGCG−PO3−5’(配列番号58)
5’−PO3−TGGTCACGA(配列番号59) 3.6
CAACCAGTG−PO3−5’(配列番号60)
5’−PO3−TCAGAGCGA(配列番号61) 3.7
CAAGTCTCG−PO3−5’(配列番号62)
5’−PO3−TTGCTCGGA(配列番号63) 3.8
CAAACGAGC−PO3−5’(配列番号64)
5’−PO3−GCAGTTGGA(配列番号65) 3.9
CACGTCAAC−PO3−5’(配列番号66)
5’−PO3−GCCTGAAGA(配列番号67) 3.10
CACGGACTT−PO3−5’(配列番号68)
5’−PO3−GTAGCCAGA(配列番号69) 3.11
CACATCGGT−PO3−5’(配列番号70)
5’−PO3−GTCGCTTGA(配列番号71) 3.12
CACAGCGAA−PO3−5’(配列番号72)
5’−PO3−GCCTAAGTT(配列番号73) 4.1
CTCGGATTC−PO3−5’(配列番号74)
5’−PO3−GTAGTGCTT(配列番号75) 4.2
CTCATCACG−PO3−5’(配列番号76)
5’−PO3−GTCGAAGTT(配列番号77) 4.3
CTCAGCTTC−PO3−5’(配列番号78)
5’−PO3−GTTTCGGTT(配列番号79) 4.4
CTCAAAGCC−PO3−5’(配列番号80)
5’−PO3−CAGCGTTTT(配列番号81) 4.5
CTGTCGCAA−PO3−5’(配列番号82)
5’−PO3−CATACGCTT(配列番号83) 4.6
CTGTATGCG−PO3−5’(配列番号84)
5’−PO3−CGATCTGTT(配列番号85) 4.7
CTGCTAGAC−PO3−5’(配列番号86)
5’−PO3−CGCTTTGTT(配列番号87) 4.8
CTGCGAAAC−PO3−5’(配列番号88)
5’−PO3−CCACAGTTT(配列番号89) 4.9
CTGGTGTCA−PO3−5’(配列番号90)
5’−PO3−CCTGAAGTT(配列番号91) 4.10
CTGGACTTC−PO3−5’(配列番号92)
5’−PO3−CTGACGATT(配列番号93) 4.11
CTGACTGCT−PO3−5’(配列番号94)
5’−PO3−CTCCACTTT(配列番号95) 4.12
CTGAGGTGA−PO3−5’(配列番号96)
5’−PO3−ACCAGAGCC(配列番号97) 5.1
AATGGTCTC−PO3−5’(配列番号98)
5’−PO3−ATCCGCACC(配列番号99) 5.2
AATAGGCGT−PO3−5’(配列番号100)
5’−PO3−GACGACACC(配列番号101) 5.3
AACTGCTGT−PO3−5’(配列番号102)
5’−PO3−GGATGGACC(配列番号103) 5.4
AACCTACCT−PO3−5’(配列番号104)
5’−PO3−GCAGAAGCC(配列番号105) 5.5
AACGTCTTC−PO3−5’(配列番号106)
5’−PO3−GCCATGTCC(配列番号107) 5.6
AACGGTACA−PO3−5’(配列番号108)
5’−PO3−GTCTGCTCC(配列番号109) 5.7
AACAGACGA−PO3−5’(配列番号110)
5’−PO3−CGACAGACC(配列番号111) 5.8
AAGCTGTCT−PO3−5’(配列番号112)
5’−PO3−CGCTACTCC(配列番号113) 5.9
AAGCGATGA−PO3−5’(配列番号114)
5’−PO3−CCACAGACC(配列番号115) 5.10
AAGGTGTCT−PO3−5’(配列番号116)
5’−PO3−CCTCTCTCC(配列番号117) 5.11
AAGGAGAGA−PO3−5’(配列番号118)
5’−PO3−CTCGTAGCC(配列番号119) 5.12
AAGAGCATC−PO3−5’(配列番号120)
1Xリガーゼ緩衝液:50mM トリス、pH 7.5;10mM ジチオトレイトール;10mM MgCl2;2.5mM ATP;50mM NaCl。
10Xリガーゼ緩衝液:500mM トリス、pH 7.5;100mM ジチオトレイトール;100mMmgCl2;25mM ATP;500mM NaCl
12のPCR試験管のそれぞれに、化合物1の水中1mM溶液50μL;タグ1.1−1.12のうちの1つの0.8mM溶液75μL;10Xリガーゼ緩衝液15μLおよび脱イオン水10μLを添加した。試験管を95℃に1分間加熱し、次いで16℃に10分間かけて冷却した。各試験管に、50μl 1Xリガーゼ緩衝液中5,000単位のT4 DNAリガーゼ(2,000,000単位/mL溶液2.5μL(New England Biolabs、Cat. No.M0202))を添加し、得られた溶液を16℃で16時間インキュベートした。
これらのサイクルのそれぞれについて、前のサイクルから得られる合した溶液をそれぞれ50ulの12の等しいアリコートに分割し、PCR管中に入れた。それぞれの試験管に、異なるタグを含む溶液を添加し、結紮、精製およびアシル化をサイクル1について記載されたようにして行った。ただし、サイクル3−5について、サイクル1について記載されたHPLC精製段階は省略した。サイクル2−5についてのタグおよびビルディングブロック前駆体間の対応を表2に示す。
5’−PO3−GGCACATTGATTTGGGAGTCA
GTGTAACTAAACCCTCAGT−PO3−5’
前記の合成手順は、125(約249,000)の異なる構造を含むライブラリーを産生できる。ライブラリーの合成は、各サイクルの生成物のゲル電気泳動法によりモニターした。5サイクルのそれぞれの結果およびクロージングプライマーの結紮後の最終ライブラリーを図7に示す。化合物標識「ヘッドピース」は化合物1である。図は、各サイクルの結果、予想されるように分子量が増加し、各サイクルの生成物は分子量に関して実質的に均一であることを示す。
108のオーダーの異なるメンバーを含むライブラリーの合成は、次の試薬を用いて行った:
化合物2:
A=アデノシン
C=シチジン
G=グアノシン
T=チミジン
10Xリガーゼ緩衝液:500mM トリス、pH 7.5;100mMジチオトレイトール;100mMmgCl2;20mM ATP;500mM NaCl
化合物2(60mL、1mM)のホウ酸ナトリウム緩衝液(150mM、pH9.4)中溶液(4℃に冷却)に、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(16mL、0.15M)中40当量のN−Fmoc−15−アミノ−4,7,10,13−テトラオキサオクタデカン酸(S−Ado)を添加し、続いて、水(9.6mL、0.25M)中40当量の4−(4,6−ジメトキシ[1.3.5]トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド水和物(DMTMM)を添加した。混合物を2時間4℃で穏やかに振盪した後、追加の40当量のS−AdoおよびDMTMMを添加し、4℃でさらに16時間振盪した。
96ウェルプレート中の各ウェルに、12.5μLの化合物3の水中4mM溶液;100μLの表3(化合物3のタグに対するモル比は1:2であった)に示すオリゴヌクレオチドタグ1.1から1.96のうちの1つの1mM溶液を添加した。プレートを96℃に1分間加熱し、次に10分にわたって16℃に冷却した。各ウェルに、10μLの10Xリガーゼ緩衝液、30単位のT4 DNAリガーゼ(1μLの30単位/μL溶液(FermentasLife Science、Cat. No. EL0013))、76.5μlの水を添加し、得られた溶液を16℃で16時間インキュベートした。
これらのサイクルのそれぞれについて、先のサイクルから得られた乾燥ペレットを水中に溶解させ、ライブラリーの濃度をライブラリーのDNA成分の消散係数に基づいた吸光分光分析により決定し、ここで、化合物2の当初の消散係数は131,500 L/(モル.cm)であった。ライブラリーの濃度を水で調節して、その後の結紮反応における最終濃度っが0.25mMになるようにした。ライブラリーを次に96ウェルプレート中96の等しいアリコートに分割した。各ウェルに、異なるタグ(ライブラリーのタグに対するモル比は1:2であった)を含む溶液を添加し、サイクル1について記載されたようにして結紮を行った。サイクル2、3および4において使用したオリゴヌクレオチドタグをそれぞれ表4、5および6に記載する。サイクル1から4のそれぞれについてのタグとビルディングブロック前駆体間の対応を表7に示す。サイクル1について前述のようにライブラリーをエタノールの添加により沈殿させ、ホウ酸ナトリウム緩衝液(150mM、pH 9.4)中に1mMの濃度まで溶解させた。続いてアシル化および精製をサイクル1について記載されたようにして行った。ただし、HPLC精製をサイクル3において省略した。
5’−PO3−CAG AAG ACA GAC AAG CTT CAC CTG C (配列番号889)
5’−PO3−GCA GGT GAA GCT TGT CTG TCT TCT GAA (配列番号890)
前記の合成手順は、964(約108)の異なる構造を含むライブラリーを産生できる。 ライブラリーの合成は、各サイクルの生成物のゲル電気泳動法およびLC/MSによりモニターした。完了時に、いくつかの技術を用いてライブラリーを分析した。図13aはサイクル4後であるが、クロージングプライマーの結紮前のライブラリーのクロマトグラムであり;図13bは、同じ合成段階でのライブラリーの質量スペクトルである。平均分子量は負イオンLC/MS分析により決定した。ProMassソフトウェアを用いて、イオンシグナルを脱回旋させた。この結果はライブラリーの予想される質量と一致する。
サイクル4の完了時に、通常のアシル化条件下でアジド酢酸を用いて、ライブラリーの一部をN末端でキャップした。生成物を、EtOH沈殿による精製後、リン酸ナトリウム緩衝液(150mM、pH8)中に1mMの濃度まで溶解させ、それぞれ4当量の、水中CuSO4 (200mM)、水中アスコルビン酸(200mM)、および以下に示す化合物のDMF中溶液DMF(200mM)を添加した。反応混合物を次に穏やかに2時間室温で振盪した。
アジドアセチル−Gly−Pro−Phe−Pra−NH2の調製:
0.3ミリモルのRink−アミド樹脂を用いて、Fmoc−保護アミノ酸およびHATUを活性化剤として用いた標準的固相合成技術を用いて、表示された配列を合成した(Pra=C−プロパルギルグリシン)。アジド酢酸を用いて、テトラペプチドにキャップをして。20% TFA/DCMを4時間用いて樹脂からペプチドを開裂させた。RP HPLCにより精製して、白色固体として生成物を得た(75mg、51%)。1H NMR(DMSO−d6、400MHz):8.4−7.8(m、3H)、7.4−7.1(m、7 H)、4.6−4.4(m、1H)、4.4−4.2(m、2H)、4.0−3.9(m、2H)、3.74(dd、1H、J=6 Hz、17 Hz)、3.5−3.3(m、2H)、3.07(dt、1H、J=5 Hz、14 Hz)、2.92(dd、1H、J=5 Hz、16 Hz)、2.86(t、1H、J=2 Hz)、2.85−2.75(m、1H)、2.6−2.4(m、2H)、2.2−1.6(m、4H)。IR(mull) 2900、2100、1450、1300 cm−1. ESIMS 497.4([M+H]、100%)、993.4([2M+H]、50%)。イオン源フラグメンテーションを伴うESIMS:519.3([M+Na]、100%)、491.3(100%)、480.1([M−NH2]、90%)、452.2([M−NH2−CO]、20%)、424.2(20%)、385.1([M−Pra]、50%)、357.1([M−Pra−CO]、40%)、238.0([M−Pra−Phe]、100%)。
アジドアセチルペプチド(31mg、0.62ミリモル)をMeCN(30mL)中に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン(DIEA、1mL)およびCu(MeCN)4PF6(1mg)を添加した。1.5時間撹拌後、溶液を蒸発させ、結果として得られた残留物を20%MeCN/H2O中に溶解させた。遠心分離して不溶性塩を除去した後、溶液を分取逆相HPLCに付した。所望の環状ペプチドが白色固体として単離された(10mg、32%)。1H NMR(DMSO−d6、400MHz):8.28(t、1H、J=5 Hz)、7.77(s、1H)、7.2−6.9(m、9H)、4.98(m、2H)、4.48(m、1H)、4.28(m、1H)、4.1−3.9(m、2H)、3.63(dd、1H、J=5 Hz、16 Hz)、3.33(m、2H)、3.0(m、3H)、2.48(dd、1H、J=11 Hz、14 Hz)、1.75(m、1H0、1.55(m、1H)、1.32(m、1H)、1.05(m、1H)。IR(mull) 2900、1475、1400 cm−1. ESIMS 497.2([M+H]、100%)、993.2([2M+H]、30%)、1015.2([2M+Na]、15%)。イオン源フラグメンテーションを伴うESIMS:535.2(70%)、519.3([M+Na]、100%)、497.2([M+H]、80%)、480.1([M−NH2]、30%)、452.2([M−NH2−CO]、40%)、208.1(60%)。
0.3ミリモルのグリシン−Wang樹脂を使用して、表示された配列を、Fmoc−保護アミノ酸およびHATUを活性化剤として使用して合成した。アジド酢酸を最後のカップリング段階において使用して、ペンタペプチドをキャップした。ペプチドの開裂は、50%TFA/DCMを用いて2時間行った。RP HPLCによる精製により、ペプチドを白色固体として得た(83mg;50%)。1H NMR(DMSO−d6、400MHz):8.4−7.9(m、4H)、7.2(m、5H)、4.7−4.2(m、3H)、4.0−3.7(m、4H)、3.5−3.3(m、2H)、3.1(m、1H)、2.91(dd、1H、J=4 Hz、16 Hz)、2.84(t、1H、J=2.5 Hz)、2.78(m、1H)、2.6−2.4(m、2H)、2.2−1.6(m、4H)。IR(mull) 2900、2100、1450、1350 cm−1. ESIMS 555.3([M+H]、100%)。イオン源フラグメンテーションを伴うESIMS:577.1([M+Na]、90%)、555.3([M+H]、80%)、480.1([M−Gly]、100%)、385.1([M−Gly−Pra]、70%)、357.1([M−Gly−Pra−CO]、40%)、238.0([M−Gly−Pra−Phe]、80%)。
ペプチド(32mg、0.058ミリモル)をMeCN(60mL)中に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン(1mL)およびCu(MeCN)4PF6(1mg)を添加し、溶液を2時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をRP HPLCに付して、ダイマーおよびトリマーを除去した。環状モノマーが無色ガラス状物質(6mg、20%)として単離された。ESIMS 555.6([M+H]、100%)、1109.3([2M+H]、20%)、1131.2([2M+Na]、15%)。
イオン源フラグメンテーションを伴うESIMS:555.3([M+H]、100%)、480.4([M−Gly]、30%)、452.2([M−Gly−CO]、25%)、424.5([M−Gly−2CO]、10%、only possible in a 環状構造)。
化合物2(45nmol)を45μL ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 9.4;150mM)中に溶解させた。4℃で、直鎖ペプチド(100mMのDMF中ストックを18μL;180nmol;40当量)を添加し、続いて、DMT−MM(500mMの水中ストックを3.6μL;180 nmol;40当量)を添加した。2時間撹拌後、LCMS は完全な反応を示し、生成物は、エタノール沈殿により単離された。ESIMS 1823.0([M−3H]/3、20%)、1367.2([M−4H]/4、20%)、1093.7([M−5H]/5、40%)、911.4([M−6H]/6、100%)。
化合物2(20nmol)を20μLホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.4、150mM)中に溶解させた。4℃で、直鎖ペプチド(100mMのDMF中ストックを8μL;80nmol;40当量)を添加し、続いて、DMT−MM(500mMの水中ストック1.6μL;80nmol;40当量)を添加した。2時間撹拌後、LCMSは完全な反応を示し、生成物は、エタノール沈殿により単離された。ESIMS 1823.0([M−3H]/3、20%)、1367.2([M−4H]/4、20%)、1093.7([M−5H]/5、40%)、911.4([M−6H]/6、100%)。
塩化シアヌルを用いた化合物3のアリール化の基本手順:
化合物2をpH9.4ホウ酸ナトリウム緩衝液中に1mMの濃度で溶解させる。溶液を4℃に冷却し、20当量の塩化シアヌルを次いでMeCN中500mM溶液として添加する。2時間後、完全な反応をLCMSにより確認し、結果として得られたジクロロトリアジン−DNA接合体をエタノール沈殿により単離する。
ジクロロトリアジン−DNA接合体をpH9.5ホウ酸塩緩衝液中に1mMの濃度で溶解させる。室温で、40当量の脂肪族アミンをDMF溶液として添加する。反応に続いてLCMSを行い、通常2時間後に完了する。結果として得られるアルキルアミノ−モノクロロトリアジン−DNA接合体をエタノール沈殿により単離する。
アルキルアミノ−モノクロロトリアジン−DNA接合体をpH9.5ホウ酸塩緩衝液中に1mMの濃度で溶解させる。42℃で、40当量の第二脂肪族アミンをDMF溶液として添加する。反応に続いてLCMSを行い、通常2時間後に完了する。結果として得られるジアミノトリアジン−DNA接合体をエタノール沈殿により単離する。
アルデヒドビルディングブロックを有する第二アミンを癌有するDNA−リンカーの還元的アミノ化の基本手順:
化合物2N末端プロリン残基にカップリングさせた。結果として得られた化合物をリン酸ナトリウム緩衝液(50μL、150mM、pH5.5)中に1mMの濃度で溶解させた。この溶液に、それぞれ40当量の、DMF(8μL、0.25M)中アルデヒドビルディングブロックおよびDMF(8μL、0.25M)中ナトリウムシアノボロヒドリドを添加し、溶液を80℃で2時間加熱した。アルキル化後、溶液をエタノール沈殿により精製した。
アルデヒド基を含むビルディングブロックとカップリングした化合物2を、リン酸ナトリウム緩衝液(50μL、250mM、pH 5.5)中に1mMの濃度で溶解させた。この溶液に、それぞれ40当量のDMF(8μL、0.25M)中アミンビルディングブロックおよびDMF(8μL、0.25M)中ナトリウムシアノボロヒドリドを添加し、溶液を80℃で2時間加熱した。アルキル化後、溶液をエタノール沈殿により精製した。
DNAリンカー上でのペプトイド合成の基本手順:
化合物2をホウ酸ナトリウム緩衝液(50μL、150mM、pH9.4)中に1mMの濃度で溶解させ、4℃に冷却した。この溶液に、DMF(13μL、0.15M)中40当量のN−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテートを添加し、溶液を4℃で2時間優しく振盪した。アシル化後、DNAリンカーをエタノール沈殿により精製し、ホウ酸ナトリウム緩衝液(50μL、150mM、pH 9.4)中に1mMの濃度で再溶解させ、4℃に冷却した。この溶液に、DMF(13μL、0.15M)中40当量のアミンビルディングブロックを添加し、溶液を4℃で16時間優しく振盪した。DNAリンカーをエタノール沈殿により精製し、ホウ酸ナトリウム緩衝液(50μL、150mM、pH 9.4)中に1mMの濃度で再溶解させ、4℃に冷却した。ペプトイド合成に続いてN−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテートを滴下し、続いてアミンビルディングブロックを添加する。
基本手順
アルキン含有DNA接合体をpH8.0リン酸塩緩衝液中に約1mMの濃度で溶解させる。この混合物に、10当量の有機アジドおよびそれぞれ5当量の硫酸銅(II)、アスコルビン酸、およびリガンド(トリス−((1−ベンジルトリアゾール−4−イル)メチル)アミンを全て室温で添加する。反応に続いてLCMSを行い、通常、1〜2時間後に完了する。結果として得られるトリアゾール−DNA接合体をエタノール沈殿により単離できる。
DNAでエンコードされたライブラリーにおける興味のある分子を望ましくないライブラリーメンバーよりも濃縮する能力は、興味のある治療標的に対して所定の特性を有する1つの化合物を同定するために重要である。この濃縮能力を示すために、rhAblキナーゼ(GenBank U07563)に対して公知の結合分子(Shah et al.、Science 305、399−401(2004)(本発明の一部として参照される)により記載)を合成した。標準的方法を用いてこの化合物を前記実施例において記載されるリンカーにより二本鎖DNAオリゴヌクレオチドに付着させ、実施例1および2において記載される方法により産生されるものと類似した分子(オリゴヌクレオチドに結合した官能部分)を産生した。実施例2において記載されたように一般的に生成されたライブラリーおよびDNA結合Ablキナーゼバインダーは、両種のqPCR分析を可能にする独自のDNA配列を有するように設計された。DNA結合Ablキナーゼバインダーをライブラリーと1:1000の比で混合した。この混合物をrhAbleキナーゼと平衡化し、酵素を固相上に捕捉し、洗浄して、非結合ライブラリーメンバーを除去し、結合分子を溶出させた。溶離液中のライブラリー分子のDNA結合Ablキナーゼ阻害物質に対する比は1:1であり、このことは、ライブラリー分子の1000倍過剰でDNA結合Abl−キナーゼの500倍以上の濃縮を示す。
当業者らは、単に慣用の実験を用いて、本明細書において記載された本発明の特定の実施形態の多くの等価物を承認または確認することができる。このような等価物は、以下の請求の範囲に含まれることを意図される。
Bは標的分子であり、XはBと操作可能に結合した部分であって、選択培地からのBの除去を可能にするものである。
Claims (47)
- 生物学的標的と結合する1以上の化合物を同定する方法であって:
(A)化合物のライブラリーを合成し(ここで、化合物は:
(i)mのイニシエーター化合物を含む溶液を提供し(ここで、mは1以上の整数であり、イニシエーター化合物は、nのビルディングブロックを含む官能部分(ここで、nは1以上の整数である)であって、nのビルディングブロックを同定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合するものからなる);
(ii)段階(i)の溶液をrの反応容器中に分割し(ここで、rは2以上の整数である)、これにより、溶液のrのアリコートを作製し;
(iii)各反応容器中のイニシエーター化合物をrのビルディングブロックの1つと反応させ、これにより、初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合したn+1のビルディングブロックを含む官能部分からなる化合物を含むrのアリコートを作製し;
(iv)各アリコート中の初期オリゴヌクレオチドを、rの独立した入力オリゴヌクレオチドの組の一つと、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドを触媒する酵素の存在下、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの酵素結紮に適した条件下で反応させ;これにより、n+1のビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合したn+1のビルディングブロックを含む官能部分からなる分子のrのアリコートを作製する
ことにより官能部分の構造を特定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合する2以上のビルディングブロックを含む官能部分を含む);
(B)生物学的標的を化合物のライブラリー、またはその一部と、化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバーが標的と結合するために適した条件下で接触させ;
(C)標的と結合しないライブラリーメンバーを除去し;
(D)標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを配列決定し;
(E)生物学的標的と結合する化合物のライブラリーのメンバー,の官能部分の構造を決定するために、段階(D)において決定された配列を使用し、これにより生物学的標的と結合する1以上の化合物を同定することを含む方法。 - 標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを増幅することをさらに含む請求項1記載の方法。
- 前記増幅段階が:
(i)油中水エマルジョンを形成して、複数の水性ミクロリアクターを作製し(ここで、ミクロリアクターの少なくとも1つは、標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバー、標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドと結合できる1つのビーズ、および核酸増幅を行うために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含む);
(ii)前記エンコーディングオリゴヌクレオチドの増幅されたコピーを形成するために、ミクロリアクター中でエンコーディングオリゴヌクレオチドを増幅し;
(iii)ミクロリアクター中のビーズにエンコーディングオリゴヌクレオチドの増幅されたコピーを結合させることを含む、請求項2記載の方法。 - 前記配列決定段階(D)が:
(i)有効量のシークエンシングプライマーをエンコーディングオリゴヌクレオチドの増幅されたコピーとアニールし、シークエンシングプライマーをポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸で伸長して、配列決定生成物、および所定のヌクレオチド三リン酸が前記シークエンシングプライマーの3’末端上に組み入れられるならば、シークエンシング反応副生成物を得;
(ii)シークエンシング反応副生成物を同定し、これにより、エンコーディングオリゴヌクレオチドの配列を決定することを含む、請求項1記載の方法。 - 生物学的標的と結合する1以上の化合物を同定する方法であって:
(A)化合物のライブラリーを合成し(ここで、化合物は:
(i)mのイニシエーター化合物を含む溶液を提供し(ここで、mは1以上の整数であり、イニシエーター化合物は、nのビルディングブロックを含む官能部分からなり、nは1以上の整数であり、前記化合物は、nのビルディングブロックを特定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合する);
(ii)段階(i)の溶液をrの反応容器中に分割し(ここで、rは2以上の整数である)、これにより溶液のrのアリコートを得;
(iii)各反応容器中のイニシエーター化合物をrのビルディングブロックのうちの1つと反応させて、これにより、初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合したn+1のビルディングブロックを含む官能部分からなる化合物を含むrのアリコートを作製し;
(iv)各アリコート中の初期オリゴヌクレオチドを、1組のrの異なる入力オリゴヌクレオチドの1つと、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの結紮を触媒する酵素の存在下、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの酵素結紮に適した条件下で反応させ;これにより、n+1ビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合するn+1のビルディングブロックを含む官能部分からなる分子のrアリコートを作製する
ことにより官能部分の構造を特定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合する2以上のビルディングブロックを含む官能部分を含む);
(B)生物学的標的を化合物のライブラリー、またはその一部と、化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバーを標的と結合させるために適した条件下で接触させ;
(C)標的と結合しないライブラリーメンバーを除去し;
(D)標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを配列決定し(ここで、前記配列決定は:
(i)有効量のシークエンシングプライマーを増幅されたエンコーディングオリゴヌクレオチドとアニールし、シークエンシングプライマーをポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸で伸長して、シークエンシング産物および、もし所定のヌクレオチド三リン酸が前記シークエンシングプライマーの3’末端上に組み入れられるならば、シークエンシング反応副生成物を得;
(ii)シークエンシング反応副生成物を同定し、これによりエンコーディングオリゴヌクレオチドの配列を決定することを含む);
(E)段階(D)において決定されたエンコーディングオリゴヌクレオチドの配列を用いて、生物学的標的と結合する化合物のライブラリーのメンバーの官能部分の構造を決定し、これにより生物学的標的と結合する1以上の化合物を同定することを含む方法。 - 標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも1つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを増幅することをさらに含む請求項5記載の方法。
- エンコーディングオリゴヌクレオチドの前記増幅が:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR);転写ベースの増幅、cDNA末端の迅速増幅、連続流増幅、およびローリングサークル増幅からなる群から選択される方法により行われる請求項6記載の方法。
- エンコーディングオリゴヌクレオチドの前記配列決定が、ピロホスフェートベースのシークエンシング反応または合成法による単分子配列決定により行われる、請求項1、4、または5のいずれか1項記載の方法。
- シークエンシング反応副生成物がPPiであり、カップリングしたスルフリラーゼ/ルシフェラーゼ反応が、検出のための光を発生させるために使用される、請求項8記載の方法。
- エンコーディングオリゴヌクレオチドが結合しないビーズから離れた、増幅したエンコーディングオリゴヌクレオチドと結合するビーズに関して濃縮する段階をさらに含む請求項1または5のいずれか1項記載の方法。
- 前記濃縮段階が、親和性精製、および電気泳動法からなる群から選択される請求項10記載の方法。
- 1以上の増幅されたエンコーディングオリゴヌクレオチドを回収するために、エマルジョンを破壊することをさらに含む請求項3記載の方法。
- (A)(v)rのアリコートの2以上を組み合わせ、これにより、n+1のビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合するn+1のビルディングブロックを含む官能部分からなる溶液を生成させる段階をさらに含む、請求項1または5記載の方法。
- rのアリコートが組み合わせられる請求項13記載の方法。
- (A)(i)から(A)(v)の段階が、1回以上行われ、サイクル1〜iが得られ、ここで、iは2以上の整数であり、サイクルs+1において、sはi−1以下の整数であり、段階(a)のmのイニシエーター化合物を含む溶液が、サイクルsの段階(e)の溶液である、請求項13記載の方法。
- 少なくとも1つのビルディングブロックがアミノ酸である請求項1または5記載の方法。
- 初期オリゴヌクレオチドが共有結合した二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項1または5記載の方法。
- 入力オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項17記載の方法。
- イニシエーター化合物が、ビルディングブロックと結合するために適合させられる第一官能基、オリゴヌクレオチドの5’末端と結合するために適合される第二官能基、およびオリゴヌクレオチドの3’末端と結合するために適合される第三官能基を含むリンカー部分を含む請求項1または5記載の方法。
- Aがアミノ基であり;
Bがホスフェートであり;
Cがホスフェートである請求項20記載の方法。 - D、EおよびFがそれぞれ独立して、アルキレン基またはオリゴ(エチレングリコール)基である請求項20記載の方法。
- Sが炭素原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子、ホスフェート、環状基または多環式基である請求項23記載の方法。
- n、mおよびpのそれぞれが独立して2から8の整数である請求項24記載の方法。
- n、mおよびpのそれぞれが独立して3から6の整数である請求項25記載の方法。
- 前記イニシエーター化合物のそれぞれが反応性基を含み、前記のrのビルディングブロックが前記反応性基に対して相補性である相補反応性基を含む請求項1または5記載の方法。
- 反応性基および相補反応性基が、アミノ基;カルボキシル基;スルホニル基;ホスホニル基;エポキシド基;アジリジン基;およびイソシアネート基からなる群から選択される請求項28記載の方法。
- 反応性基および相補反応性基が、ヒドロキシル基;カルボキシル基;スルホニル基;ホスホニル基;エポキシド基;アジリジン基;およびイソシアネート基からなる群から選択される請求項28記載の方法。
- 反応性基および相補反応性基が、アミノ基およびアルデヒドまたはケトン基からなる群から選択される請求項28記載の方法。
- 反応性基および相補反応性基間の反応が還元条件下で行われる請求項28記載の方法。
- 反応性基および相補反応性基が、リンイリド基およびアルデヒドまたはケトン基からなる群から選択される請求項28記載の方法。
- 反応性基および相補反応性基が付加環化により反応して、環状構造を形成する請求項28記載の方法。
- 反応性基および相補反応性基が、アルキンおよびアジドからなる群から選択される請求項34記載の方法。
- 反応性基および相補性官能基が、ハロゲン化複素環式芳香族基および求核試薬からなる群から選択される請求項28記載の方法。
- ハロゲン化複素環式芳香族基が、塩素化ピリミジン、塩素化トリアジンおよび塩素化プリンからなる群から選択される請求項36記載の方法。
- 求核試薬がアミノ基である請求項36記載の方法。
- サイクルi後に:
(A)(vi)1以上の官能部分を環化する段階をさらに含む請求項13記載の方法。 - 段階(A)(vi)の官能部分がアジド基およびアルキニル基を含む請求項39記載の方法。
- 官能部分が、アジド基およびアルキニル基の付加環化に適した条件下で維持されて、トリアゾール基を形成し、これにより環状官能部分を形成する、請求項40記載の方法。
- 付加環化反応が、銅触媒の存在下で行われる請求項41記載の方法。
- 段階(f)の1以上の官能部分の少なくとも1つが、少なくとも2つのスルフヒドリル基を含み、前記官能部分が2つのスルフヒドリル基の反応に適した条件下に維持されて、ジスルフィド基を形成し、これにより前記官能部分が環化される請求項42記載の方法。
- 初期オリゴヌクレオチドがPCRプライマー配列を含む請求項1または5記載の方法。
- サイクルiの入力オリゴヌクレオチドがPCRクロージングプライマーを含む請求項13記載の方法。
- サイクルi後に、
(d)クロージングPCRプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドをエンコーディングオリゴヌクレオチドに結紮する段階をさらに含む請求項13記載の方法。 - クロージングPCRプライマー配列がエンコーディングオリゴヌクレオチドに、前記結紮を触媒する酵素の存在下で結紮されることを含む請求項46記載の方法。
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