FI97153C - Menetelmä ja reagenssiyhdistelmä nukleotidisekvenssien määrittämiseksi - Google Patents
Menetelmä ja reagenssiyhdistelmä nukleotidisekvenssien määrittämiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI97153C FI97153C FI895682A FI895682A FI97153C FI 97153 C FI97153 C FI 97153C FI 895682 A FI895682 A FI 895682A FI 895682 A FI895682 A FI 895682A FI 97153 C FI97153 C FI 97153C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- acid
- attachment
- sequencing
- primer
- poly
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 93
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title abstract description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 82
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 61
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 61
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 35
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims abstract description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 11
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 11
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 10
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 claims description 3
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 claims description 3
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 claims description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 9
- IGMNYECMUMZDDF-UHFFFAOYSA-N homogentisic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC(O)=CC=C1O IGMNYECMUMZDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims 4
- 239000012925 reference material Substances 0.000 claims 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims 1
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 94
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 64
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 12
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002585 base Substances 0.000 description 11
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 11
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 6
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 6
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 3
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 3
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 3
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 3
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 2
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 2
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 2
- ALSQUSUPDQPCQY-UHFFFAOYSA-N (methoxyamino)phosphonous acid Chemical compound CONP(O)O ALSQUSUPDQPCQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical class [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008604 lipoprotein metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
97153
MENETELMÄ JA REAGENSSIYHDISTELMÄ NUKLEOTIDISEKVENSSIEN MÄÄRITTÄMISEKSI
Keksinnön kohteena on menetelmä ja reagenssiyhdistelmä nukleotidisekvenssin määrittämiseksi tietyltä polynukleotidi-alueelta, ja tämän menetelmän käyttö geneettisten variaatioiden identifioinnissa.
Elävien organismien geneettinen informaatio sisältyy genomin nukleotidisekvenssiin. Geenien ekspressioksi kutsutussa prosessissa nukleotidisekvenssi transloituu aminohapposekvenssiksi, s.o. proteiineiksi. Pienetkin muutokset nukleoti-disekvenssissä, jopa yhden ainoan emäksen substituutio, voi johtaa muuttuneeseen proteiinituotteeseen. Muutokset tiettyjen proteiinien laadussa tai määrässä muuttaa organismin tai solun fenotyyppiä (s.o. havaittavia ominaisuuksia), mikä voidaan todeta esimerkiksi sairauden kehittymisenä. Tämän vuoksi on tärkeää, että nukleotidisekvenssin muutokset : genomissa voidaan määrittää tarkasti ja niin tehokkaasti, että voidaan analysoida suuria määriä näytteitä. Tämä tarjoaisi mahdollisuuksia perinnöllisen sairauden tai sille alttiuden diagnoosissa, somaattisten mutaatioiden havaitsemisessa syövän yhteydessä, sekä solujen, kantojen ja lajikkeiden valinnassa kasvin- ja eläinjalostuksessa.
Nukleotidisekvenssissä tapahtuneet muutokset voidaan havaita eri tavoin. Hyvin vakuuttavia tuloksia antaa mentelmä, jossa määritetään genomin varsinainen nukleotidisekvenssi alueelta, joka sisältää mielenkiinnon kohteena olevan geenin. Nukleiinihappohybridisaatioon perustuviin menetelmiin verrattuna nukleotidisekvenssin määritys tarjoaa sen edun, ettei varsinaista mutaatiota tarvitse tuntea.
Riittää, että tiedetään mielenkiinnon kohteena olevan alueen sijainti ja verrataan näytteestä tätä aluetta normaalin standardin vastaavaan alueeseen.
97153 2
Nukleotidisekvenssin määrityksessä käytetään kahta lähestymistapaa. Nämä ovat Maxam-Gilbertin kemiallinen menetelmä sekä Sangerin ketjunpäättämismenetelmä (chain termination method). Molempia on hyvin kuvattu tavanomaisissa biokemian oppikirjoissa. Näille menetelmille on yhteistä se, että niissä tarvitaan alle mikrogramman luokkaa oleva määrä suhteellisen puhdasta sekvenoitavaa kohdepolynukleotidiä. Useimmiten tämä kohdepolynukleotidi kloonataan geenitekniikan menetelmillä sopiviin vektoreihin ja amplifioidaan biologisesti, jotta saataisiin riittävästi nukleiinihappo-polymeeriä analyysiä varten. Toistettuun replikaatioreaktioon perustuva menetelmä (Kleppe et ai., J. Mol. Biol. (1971) 56, 341-361) on tarjonnut toisen tavan amplifioida haluttuja polynukleotidialueita iji vitro. Menetelmää on myöhemmin sovellettu Eurooppalaisessa patentissa No. 200362. Vaikka tällä menetelmällä on huomattavia etuja nopeudessa ja tehokkuudessa verrattuna kloonausmenetelmään tuotettaessa riittäviä määriä DNA:ta, se ei tuota kuitenkaan sekvenointi-prosessiin suoraan kelpaavaa DNA-tuotetta. Sen sijaan • amplifioitu alue täytyy huolellisesti puhdistaa esim.
elektroforeesin tai ultrasuodatuksen avulla amplifikaatio-reaktioseoksesta, jonka läsnäolo sekvenointiprosessissa on vahingollista. Nämä puhdistusproseduurit ovat yleensä aikaavieviä, mikä estää niiden käytön rutiinianalyyseissä.
Nukleotidisekvenssin muutosten määrittämiseen on nyt kehitetty parannettu menetelmä, joka soveltuu hyvin rutiiniluonteiseksi diagnostiseksi välineeksi. Tällä menetelmällä on useita etuja aikaisempiin menetelmiin verrattuna. Kohdepoly-nukleotidia ei tarvitse enää kloonata spesifisiin vektoreihin. Entsymaattisesti amplifioidun kohdepolynukleotidin eristys on yksinkertaista eikä aikaavieviä puhdistusvaiheita, kuten ultrasuodatusta tai geelielektroforeesia, enää tarvita. Lisäksi sekvenointireaktiot suoritetaan immobilisoiduilla templaateilla, mikä on edullista prosessikontrollin kannalta ja antaa mahdollisuuksia automaatioon sekä kohdepolynukleotidin molempien säikeiden samanaikaiseen sekvenointiin.
tt 3 97153
Keksinnönmukainen menetelmä nukleotidisekvenssin muutosten havaitsemiseksi perustuu kiinnostuksen kohteena olevan alueen nukleotidisekvenssin määrittämiseen. Keksinnön mukaisesti tämän prosessin esimmäisessä vaiheessa modifioidulla toistetulla replikaatioreaktiolla tuotetaan amplifioitu DNA-näyte, jossa vähintään toinen spesifisen kohdepoly-nukleotidin säikeistä on varustettu ainakin yhdellä kiinni-tinkomponentilla. Tämä voidaan suorittaa saattamalla yhteen kohdenukleiinihappopolymeeriä sisältävä näyte, nukleotidi-monomeerien (dATP, dCTP, dGTP ja dTTP) seos, DNA-polymeraasi, sekä ensimmäinen ja toinen amplifikaatioaluke. Kukin amplifikaatioalukkeista sisältää oligonukleotidialueen, joka on komplementaarinen kohdepolynukleotidin toiselle vastin-säikeelle siten, että eri amplifikaatioalukkeet hybridi-soituvat eri vastinsäikeiden (templaattien) kanssa. Ampli-fikaatioalukkeet toimivat DNA-polymerisaatioreaktion alukkeina DNA-polymeraasille. Ainakin yksi amplifikaatioalukkeista sisältää lisäksi kiinnitinkomponentin oligonuk-leotidiin liittyneenä. Näin saatua amplifikaatioreaktioseosta : toistuvasti kierrätetään kahden tilan välillä, joista ensim mäisessä tapahtuu DNA-polymerisaatio ja toisessa kaksisäikei-sen DNA:n denaturaatio yksisäikeiseksi, niin monta kertaa, että kohdepolynukleotidiä saadaan kopioitua riittävä määrä DNA-sekvenointiproseduuria varten. Näin saatu amplifioitu näyte sisältää kohdenukleotidisekvenssin kopioita, joihin on liittynyt kiinnitinkomponenetti. Kolmas inkubaatiotila, jossa yksisäikeinen DNA liittyy kaksisäikeiseksi, erityisesti yksisäikeisten amplifikaatioalukkeiden liittyminen yksisäikeiseen templaatti-DNA:han, voidaan edullisesti sisällyttää prosessiin ennen kutakin polymerisaatiotilaa.
Amplifikaation jälkeen kiinnitinkomponenttia kantavat kohdepolynukleotidin säikeet erotetaan kiinteän matriisin avulla, joka on päällystetty erityisellä kiinnitinkohdalla, johon kiinnitinkomponentti tai sen johdannainen voi sitoutua. Tällä tavalla kohdepolynukleotidin säikeet kiinnittyvät kiinteään matriisiin, jolloin ne voidaan helposti erottaa 97153 4 kiinteän matriisin mukana matriisiin sitoutumattomista reagensseista.
Kohdepolynukleotidin puhdistetut kopiot denaturoidaan joko ennen immobilisointia tai matriisiin sitoutumattomista reagensseista erottamisen jälkeen, ja amplifioidun kohdepolynukleotidin sekvenssi määritetään. Esimerkiksi ketjunpäättämissekvenoinnin reaktiot voidaan käynnistää kohdepolynukleotidin denaturoiduille kopioille, jotka toimivat nyt templaatteina. Syntetisoituneet sekvenointi-reaktiotuotteet vapautetaan lopuksi templaateista, erotetaan ja määritetään koon mukaan.
Keksintö koskee myös reagenssiyhdistelmää tai kittiä keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi. Vaikka täsmällinen pakkaamistapa riippuu valittavasta kiinnitin-komponenttien ja kiinnitinkohtien yhdistelmästä, tällainen kitti sisältää yleensä ainakin amplifikaatioalukkeen, johon on sitoutunut kiinnitinkomponentti, sekä kantajan, johon amplifikaatioaluke voidaan immobilisoida.
Keksinnön mukainen menetelmä on käyttökelpoinen määritettäessä ainakin yhtä potentiaalista nukleotidivariaatiota kohdenukleiinihapossa. Tämä variaatio voi olla nukleotidin substituutio, deleetio tai insertio. Täten keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa perinnöllisen sairauden tai sille alttiuden analyysissä. Joissakin näistä analyyseistä nukleotidivariaatio voi olla somaattinen mutaatio. Yllä olevan perusteella on selvää, että keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa myös solujen, kantojen tai lajikkeiden valinnassa kasvin- tai eläinjalostuksessa, tai haluttua genotyyppiä ilmentävien mikro-organismien valinnassa.
Seuraavassa keksintöä selitetään oheisiin piirustuksiin viittaamalla.
Kuvio 1 esittää kaaviomaisesti eri vaiheiden järjestystä li.
5 97153 eräässä keksinnön sovellutuksessa.
Kuvio 2 esittää mahdollisia komplementaarisuusalueita kohdenukleiinihapon ja sekvenointialukkeen välillä.
Keksintö sisältää menetelmän määrittää nukleotidisekvenssi ennalta määrätyltä alueelta kompleksisista nukleiinihappo-seoksista. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa käytetään hyväksi kahta tunnettua perusmenetelmää: Sangerin sekve-nointia ketjunpäättämismenetelmällä (chain-termination sequencing) sekä toistettua replikaatioreaktiota. Keksinnössä käytetään myös hyväksi affiniteettiin perustuvaa hybridin-kiinnitysmenetelmää, jota hakija on kuvannut patenttijulkaisussa GB 2,169,403. Näiden menetelmien uusi yhdistelmä tarjoaa nukleiinihappojen sekvenointia varten helpon ja tehokkaan prosessin, joka sopii hyvin geneettisten virheiden havaitsemiseen.
Keksinnön mukaisesti pieni näyte kohdenukleiinihappoa ampli-fioidaan aluksi käyttäen toistettua replikaatioreaktiota, jossa yksi tai molemmat amplifikaatioalukkeet on modifioitu kiinnitinkoraponentilla, esimerkiksi affiniteettiparin komponentilla. Kohdesekvenssiä amplifioidaan sopiva määrä kertoja tällä modifioidulla toistetulla replikaatioreaktiol-la. Sen jälkeen näytettä voidaan käsitellä siten, että saatetaan kaksisäikeiset nukleiinihapot yksisäikeisiksi, minkä jälkeen kaikki tietyllä kiinnitinkomponentilla modifioidut molekyylit kiinnitetään kiinteään matriisiin, joka on päällystetty komplementaarisella kiinnitinkohdalla, esimerkiksi affiniteettiparin toisella komponentilla. Matriisi pestään tämän jälkeen kaiken sitoutumattoman materiaalin poistami-: seksi. On myös mahdollista kiinnittää amplifioitu DNA
matriisiin ennen denaturaatiota. Siinä tapauksessa sitoutuneen kaksi säikeisen nukleiinihappomolekyylin denaturointi yksisäikeiseksi tehdään immobilisoinnin (kiinnittämisen) jälkeen. Tämä tapa tekee mahdolliseksi myös eluida oleellisesti puhdasta komplementaarista säiettä, vaikka sitä ei olisikaan syntetisoitu kiinnitinkomponentin kanssa.
97153 6
Riippumatta siitä, missä vaiheessa denaturointi on suoritettu, tuloksena on kiinteä kantaja, johon yksisäikeinen nukleiinihappo on sitoutunut toisesta päästään. Tämä kiinteä kantaja, edullisesti mikrohelmet, siirretään ketjunpäättämis-sekvenointiprosessin reaktioseoksiin, yksi reaktioseos kutakin nukleotidia (A,C,G ja T) kohti. Polymerisaation annetaan tapahtua helmien pinnalla. Sen jälkeen helmet voidaan pestä haluttaessa, minkä jälkeen polymerisaatio-tuotteet eluoidaan helmistä ja analysoidaan geelielektro-foreesilla kuten on kuvattu useille manuaalisille, puoli-manuaalisille ja automatisoiduille sekvenointiprotokollil-le. Tämän prosessin modifikaatiossa matriisiin sitoutuneesta modifioidusta säikeestä eluoitua oleellisesti puhdasta komplementaarista säiettä käytetään sekvenointitemplaattina. Jos kukin amplifikaatioaluke modifioidaan erilaisella kiinni tinkomponentilla ja saatu amplifioitu DNA kiinnitetään erilaisiin fysikaalisesti erotettavissa oleviin matriiseihin, voidaan kumpikin säie siirtää samaan sekvenointireaktioseok-seen, eikä matriiseja, joihin säikeet ovat kiinnittyneinä, tarvitse erottaa toisistaan ennen kuin vasta juuri ennen lopullista denaturointia ja geelielektroforeesia. Tämä mahdollisuus sekvenoida molemmat säikeet samanaikaisesti erottamatta säikeitä ennen kuin vasta juuri ennen elektroforeesia vähentää sekvenointityön määrän lähes puoleen.
, Seuraavaksi esitellään yksityiskohtaisesti keksinnön erilaisia suoritusvaihtoehtoja.
a) Kohdenukleiinihappofragmenttien modifiointi kiinnitin-komponenteilla
Keksinnönmukaisella menetelmällä analysoitavan kohdenuk-leiinihapon (DNA tai RNA) lähteenä voi olla mikä tahansa humaanisolu, eläinsolu, kasvisolu tai mikrobi. Kohdenuk-leiinihappo voidaan eristää biologisista näytteistä tavanomaisilla nukleiinihappojen puhdistusmenetelmillä, mutta keksinnön mukaisesti on myös mahdollista käyttää puhdista-mattomia biologisia näytteitä suoraan.
I! 7 97153
Keksinnönmukaisessa menetelmässä kiinnitinkomponentit voidaan liittää kohdepolynukleotidiin modifioidulla toistetulla replikaatioreaktiolla käyttäen hyväksi kahta oligonukleotidi-aluketta amplifioitavaa aluetta kohti. Ainakin yksi näistä amplifikaatioalukkeista on modifioitu kiinnitinkomponentilla. Tässä affiniteettikomponentilla tarkoitetaan komponenttia, jolla on affiniteettiä toiseen komponenttiin, joka muodostaa affiniteettiparin sitoutumalla ensisijaisesti ja selektiivisesti tuohon toiseen komponenttiin. Sellaisia affiniteetti-pareja ovat esimerkiksi biotiini/avidiini tai streptaviini, komplementaariset polynukleotidit sisältäen homopolynukleoti-dit kuten poly dA/poly dT ja poly dG/poly dc, haptiini/vasta-aine ja metalli/kelaatti. Mikä tahansa komponenttipari, joilla on voimakas affiniteetti toinen toisiinsa, voivat toimia affiniteettiparina. Kiinnitinkomponentilla tarkoitetaan tässä affiniteettikomponenttia tai komponenttia, johon tällainen affiniteettikomponentti voidaan kiinnittää.
Oligonukleotidialukkeet voidaan syntetisoida kemiallisilla • standardimenetelmillä. Myös rekombinantti-DNA tekniikoita voidaan käyttää alukkeiden valmistamiseen. Alukkeiden koko on edullisesti 14 - 40 emästä, mutta alukkeita, joissa on vähintään 8 emästä tai huomattavasti enemmän kuin 40 emästä, voidaan myös käyttää. Alukkeet modifioidaan kiinnitinkompo-nenteilla käyttäen kemiallisia tai entsymaattisia tai mitä tahansa muita menetelmiä. Kiinnitinkomponentti liitetään edullisesti alukkeen 5'-päähän. Myös muut kiinnityskohdat ovat mahdollisia edellyttäen, että alukkeen aluketoiminta ja emäspariutumiskyky säilyvät.
Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä suoritustavassa · käytetään kahta modifioitua aluketta. Alukkeet täytyy tässä tapauksessa modifioida erilaisilla kiinnitinkomponenteilla.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä amplifikaatioalukkeet, joista yksi tai molemmat ovat modifioituja, kohdenukleiini-happo, mononukleosiditrifosfaatit ja nukleiinihappoa synteti- 97153 8 soiva entsyymi, kuten DNA-polymeraasi, yhdistetään. Toistetaan syklisesti kohteen denaturointia, alukkeiden liittymistä kohdesäikeisiin ja alukkeiden entsymaattista pidentymistä minkä tahansa toistetulle replikaatioreaktiolle esitetyn protokollan mukaan niin monta kertaa kuin on tarpeellista, jotta saadaan riittävä määrä nukleiinihappoa käytettäväksi halutussa DNA-sekvenointireaktiossa. Ketjunpäättämis-sekvenointireaktioita varten tuotetaan edullisesti vähintään 1010 DNA-molekyyliä.
Prosessin tuloksena saadaan kopioita alkuperäisestä kohde-polynukleotidistä, nyt modifioituna kiinnitinkomponenteilla, modifioitujen alukkeiden sisältyessä syntetisoituviin poly-nukleotidimolekyyleihin. Jos ainoastaan yksi alukkeista on modifioitu, syntetisoituu polynukleotidimolekyylejä, joiden toinen säie on modifioitu kiinnitinkomponentilla. Jos käytetään kahta eri tavoin modifioitua aluketta, jotka hybridisoi-tuvat kohdenukleiinihapon eri säikeisiin, saadaan polynukleotidimolekyyle jä , joiden toinen säie on modifioitu yhdellä kiinnitinkomponentilla ja toinen säie toisella (erilaisella) kiinnitinkomponentilla. Erikoistapaus saadaan yhden alukkeen ollessa modifioitu polynukleotidikiinnitinkomponentilla. Tällöin toinen säie modifioituu amplifikaatioprosessin aikana komplementaarisella sekvenssillä, joka puolestaan voi toimia kiinnitinkomponenttina tälle toiselle säikeelle. Tuotetun modifioidun kohde-DNA:n koko ja määrä rajoittuu ainoastaan toistetun replikaatioreaktion kapasiteetin perusteella.
(b) Yksisäikeisen kohdepolynukleotidin erotus
Synteesin jälkeen modifioitu kohdepolynukleotidi kiinnitetään kiinteään kantajaan, johon on liitetty kiinnitinkohta.
Kiinnitinkohdalla tarkoitetaan tässä affiniteettiparin komponenttia, joka on valittu siten, että se ensisijaisesti ja selektiivisesti sitoutuu amplifikaatioalukkeeseen liitettynä kiinnitinkomponenttina käytettyyn affiniteetti- 11 9 97153 komponenttiin tai kiinnitinkomponenttiin myöhemmin liitettyyn affiniteettikomponenttiin. Jos ainoastaan kohdepolynukleoti-din yksi säie on modifioitu affiniteettikomponentilla, käytetään yhtä kiinteää matriisia, ja jos molemmat säikeet on modifioitu, käytetään kahta erilaista kiinteää matriisia. Edullisesti nämä kaksi matriisia on valittu siten, että ne voidaan fysikaalisesti erottaa toinen toisistaan. Vaihtoehtoisesti kaksi eri tavalla modifioitua säiettä voidaan eristää peräkkäin kahteen erilaiseen kiinteään matriisiin.
Kiinteä matriisi voi olla mitä tahansa muotoa, esimerkiksi helmiä, mikropartikkeleja, mikrotiitterilevyn tai koeputken pinta, dipsticksysteemi tai filtteri. Matriisin materiaali voi olla esimerkiksi polystyreeniä, selluloosaa, lateksia, nitroselluloosaa, nailonia, polyakryyliamidia, dekstraania tai agaroosia. Matriisin materiaalille on ainoana edellytyksenä, että siihen voidaan liittää kiinnitinkohta. Matriisin sitomiskapasiteetin pitäisi sallia kiinnittyminen riittävälle määrälle modifioitua kohdepolynukleotidiä sekä myös ylimäärälle läsnäolevaa modifioitua aluketta, joka myöskin kiinnityy matriisiin. Kuitenkin on edullista käyttää sellaista matriisia, joka voidaan jakaa helposti osiin, esimerkiksi suuri määrä pienemmän sitomiskapasiteetin omaavia matriisipartikkeleja mieluummin kuin hyvin vähän suuren kapasiteetin omaavia matriisipartikkeleja.
Modifioitu kohdenukleiinihappo voidaan saattaa kontaktiin affiniteettimatriisin kanssa suoraan siinä reaktioseoksessa, jossa amplifikaatio suoritettiin. Seosta voidaan myös laimentaa tai sen koostumusta muuttaa olosuhteiden saamiseksi mahdollisimman suotuisiksi affiniteettiparin komponenttien väliselle reaktiolle.
Kun käytetään kahta affiniteettiparia, on edullista denaturoida kohdepolynukleotidi ennen affiniteettikiinnitysreak-tiota, jotta varmistetaan kahden säikeen erillinen erotus erilaisiin affiniteettimatriiseihin. Jos nämä kaksi erilaista 10 97153 affiniteettimatriisia voidaan fysikaalisesti erottaa toinen toisistaan, esimerkiksi sekvenointireaktiovaiheen jälkeen, näitä kahta matriisia voidaan käsitellä yhtenä kiinnitysvai-heessa ja sekvenointireaktiovaiheessa. Kun kohteen ainoastaan yksi säie on modifioitu, on valinnanvaraista, halutaanko kohde denaturoida ennen kiinnitysreaktiota.
Kohdepolynukleotidin kiinnitinkomponenttien annetaan reagoida immobilisoidun komplementaarisen kiinnitinkohdan kanssa riittävän kauan, jotta saadaan kerätyksi olennainen osa amplifioitua kohdenukleiinihappoa. Riittävä aika voi vaihdella riippuen sitoutumisreaktion kinetiikasta. Jos kiinnitin-komponentti ei suoraan sitoudu kiinnitinkohtaan, tulee käyttöön myös välittäjäkomponentti, eli molekyyli jolla on erityinen sitoutumiskohta sekä kiinnitinkomponenttiin että kiinnitinkohtaan ja voi muodostaa linkin näiden kahden välille. Kiinnitysreaktion jälkeen erotetaan sitoutunut kohdepoly-nukleotidi sitoutumattomasta materiaalista, mm. mononukleosi-ditrifosfaattien ylimäärästä, modifioitamattomista alukkeis-ta, entsyymistä, suoloista, pesemällä matriisia sopivissa olosuhteissa. Erotusproseduuri riippuu matriisin fysikaalisesta muodosta, ja siihen voi kuulua esimerkiksi sentrifu-gointi, magneettinen erotus, kolonniproseduuri tai matriisin pinnan huuhtelu tai näiden yhdistelmä.
Pesuvaiheiden jälkeen matriisia käsitellään olosuhteissa, jotka saattavat sitoutuneen kohdepolynukleotidin yksi-säikeiseen muotoon. Mitä tahansa olosuhteita, jotka denaturoivat kaksisäikeisen polynukleotidin mutta eivät vaikuta affiniteettiparin komponenttien väliseen sitoutumiseen, voidaan käyttää, esimerkiksi kuumennusta, alkalia tai entsyymejä. Tämä vaihe on pakollinen, jos kohdepolynukleotidiä ei denaturoitu ennen kiinnitysreaktiota. Jos denaturointi suoritettiin ennen kiinnitysreaktiota, on tämä vaihe hyödyllinen, mutta valinnainen, kiinnitysvaiheen aikana mahdollisesti emäspariutuneiden kohdemolekyylien denaturoitumisen varmistamiseksi. Poikkeuksena on tietysti tapaus, jossa kiinnitin- II: 97153 11 komponentti ja kiinnitinkohta ovat komplementaarisia nukleii-nihapposäikeitä. Tässä tapauksessa denaturointi täytyy edeltää kiinnitystä, sillä muutoin linkki kantajaan häviää.
Lisäksi eräässä keksinnön toteutustavassa tässä vaiheessa suoritettu denaturointi tarjoaa uuden mukavan menetelmän toistetulla replikaatioreaktiolla syntetisoidun kohteen yhden säikeen eristämiseksi. Eristetty säie on vapaa mononukleo-siditrifosfaattien ylimäärästä, alukkeista ja muista amplifi-kaatioreaktion komponenteista ja voidaan sekvenoida tavanomaisella sekvenoinnilla liuoksessa tai käyttää muihin tarkoituksiin.
(c) Sekvenointireaktio
Eristettyjen amplifioitujen polynukleotidifragmenttien sek-venssinmääritys voidaan keksinnön mukaisesti suorittaa ket-junpäättämismenetelmällä. Menetelmä perustuu deoksinukleoti-dianalogien käyttöön siten, että polynukleotidiä syntetisoiva entsyymi liittää ne kasvavaan polynukleotidisäikeeseen satunnaisesti aiheuttaen säikeen spesifisen päättymisen. Ketjun päättyminen voidaan saada aikaan myös pitämällä yhden deoksinukleosiditrifosfaatin konsentraatiota hyvin pienenä.
Ketjunpäättämismenetelmällä suoritettujen sekvenointireaktioiden tarpeelliset komponentit ovat sekvenointialuke, polynukleotidiä syntetisoiva entsyymi, ketjun päättymisen aiheuttavat dideoksinukleotidit, deoksinukleotidit sekä havaittava leima. Immobilisoidun kohdepolynukleotidin sekvenointi voidaan keksinnön mukaisesti suorittaa laboratorioissa standardinomaisesti käytettyjen sekvenointiprotokollien mukaan. Järjestys, jossa sekvenointireaktion komponentit lisätään, voi vaihdella käytetyn affiniteettimatriisin ja valitun protokollan mukaan.
Kuten kuvassa 2 on esitetty, sekvenointialuke voi olla sama tai eri kuin amplifikaatioreaktiossa käytetty aluke. Jos se 97153 12 on eri kuin amplifikaatioaluke, se voi kokonaan sijaita kohdepolynukleotidissa mielenkiinnon kohteena olevan alueen ja amplifikaatioalukkeen 3'-pään välillä (A), tai se voi osittain peittää amplifikaatioalukkeen niin että sen 3'-pää emäspariutuu vähintään yhden, mielellään yli kolmen, nukleotidin kanssa lähempänä kohdepolynukleotidin 5'-päätä (B). Sekvenointialuke voi myös sijaita täysin amlifikaatioalukkeen alueen sisällä (C) tai olla sama kuin amplifikaatioaluke (D).
Sekvenointialukkeen valinta riippuu analyysin tarkoituksesta. Aluke, joka eroaa amplifikaatioalukkeesta, lisää sekvenointi-reaktion spesifisyyttä, koska amplifikaatioreaktion mahdollisesti tuottamien väärien fragmenttien sekvenointi estyy.
Siten on edullista käyttää sekvenontialuketta, joka on eri kuin amplifikaatioaluke. Toisaalta tällaisen alukkeen valmistamiseksi tarvitaan enemmän tietoa amplifioitavan fragmentin sekvenssistä jo ennalta.
Sekvenointireaktiossa tuotettujen fragmenttien havaitsemiseen käytetty leima voidaan saada mukaan käyttämällä leimattuja sekvenointialukkeita. Leima voi sijaita 5'-päässä tai ketjun sisällä. Se voi olla isotooppi, kuten 32P, tai fluoresoiva ryhmä, tai mikä tahansa muu havaittava leima, tai leiman myöhemmän kiinnittämisen salliva ryhmä. Leimana voidaan . käyttää myös deoksinukleotididerivaatteja, jotka on leimattu isotoopilla, kuten 35S tai 32P, tai fluoresoivalla tai muuten havaittavalla leimalla. Leimaavaa ryhmää käytetään siinä määrin, että se liittyy olennaisesti jokaiseen syntetisoituvaan nukleiinihappoon, myös hyvin lyhyisiin fragraentteihin.
Polynukleotidifragmenttia kantava matriisi suspentoidaan sopivaan sekvenointialukkeen sisältävään liuokseen. Aluketta lisätään edullisesti ekvivalentti tai suurempi molaarinen pitoisuus kohdepolynukleotidiin verrattuna. Alukkeen annetaan emäspariutua kohdepolynukleotidin kanssa sopivassa lämpötilassa ja riittävän ajan, joka riippuu käytetyn alukkeen koosta ja määrästä. On huomattava, että kahta eri sekvenoin- il 13 97153 tialuketta käytetään silloin, kun kohdepolynukleotidin molemmat säikeet on modifioitu ja kiinnitetty eri affiniteettimat-riiseihin, jotka voidaan erottaa toisistaan fysikaalisesti ja käsitellään nyt yhtenä.
Jos käytetään jaettavissa olevaa affiniteettimatriisiä, kuten helmiä, on edullista jakaa näyte neljään osaan alukkeen emäspariutumisen jälkeen yksittäisiä sekvenointireaktioita varten. Jos käytetään jakamatonta affiniteettimatriisia, kuten mikrotiitterilevyä, valmistetaan neljä rinnakkaista reaktiota affiniteettikiinnitysvaiheessa. On myös mahdollista suorittaa neljä reaktiota peräkkäin samalla kantajalla eluoi-malla kunkin reaktion tuotteet ennen seuraavan suorittamista. Tietyissä tapauksissa saadaan tarpeeksi informaatiota pelkästään yhden, kahden tai kolmen reaktion avulla. Esimerkiksi jos geneettisen virheen tiedetään johtuvan pistemutaatiosta yhdessä spesifisessä kohdassa, joka on normaalisti C, voi pelkästään C-reaktion suorittaminen riittää, koska tässä kohdassa ilmenevän ei-C nukleiinihappotähteen varsinainen identifioiminen ei ole tarpeen. Oleellinen tieto on se, ettei tähde ole C.
Emäspariutumisen jälkeen lisätään polynukleotidiä syntetisoiva entsyymi, kuten E. coli DNA-polymeraasi I tai T7 DNA-poly-meraasi, ketjun päättävien dideoksinukleotidien, deoksinuk-leotidien ja, jos käytetään leimaamattomia alukkeita, leimattujen deoksinukleotidien muodostamat seokset sopivissa suhteissa, jotka riippuvat käytetystä entsyymistä ja kohteen koosta. Polymerisointireaktion annetaan jatkua riittävän kauan, jotta saadaan täydellinen fragmenttikoon jakauma, lämpötilassa joka riippuu käytetystä entsyymistä ja olosuhteista. Lopuksi suoritetaan deoksinukleotideilla ns. ajoreak-tio (chase reaction) niiden polynukleotidisäikeiden synteesin täydentämiseksi, jotka eivät ole päättyneet. Tämän jälkeen reaktio pysäytetään.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä affiniteettimatriisi voi- 97153 14 daan tässä vaiheessa pestä sekvenointireaktion komponenttien poistamiseksi. Seoksen koostumusta voidaan täten myös muuttaa, jotta saadaan edullisimmat olosuhteet syntetisoituneiden fragmenttien analysoimiseksi. Jos molemmat säikeet oli modifioitu ja kiinnitetty kahteen eri affiniteettimatriisiin, erotetaan matriisit fysikaalisesti tässä vaiheessa, esimerkiksi magneettikentän avulla. Kohde-DNA saatetaan yksisäikei-seksi, ja syntetisoituneet fragmentit neljästä sekvenointi-reaktiosta erotetaan elektroforeesin tai muun sopivan menetelmän avulla. Keksinnön mukaisessa menetelmässä affiniteet-timatriisi voidaan poistaa ennen elektroforeesia tai, kun affiniteettimatriisi on mikropartikkeli, se voidaan lisätä näytteen mukana geelin kuoppiin elektroforeesivaihetta varten. Tämä tarjoaa etuja näytteen käsittelyssä. Fragmenttien kokojakauma analysoidaan elektroforeesivaiheessa. Detektioproseduuri voi vaihdella käytetyn leiman mukaan. Käytettäessä isotooppeja geeli valmistellaan kiinnittämällä ja kuivaamalla ja asetetaan röntgensädefilmille standardi- . proseduurien mukaisesti. Fluoresoivia leimoja käytettäessä fragmentit detektoidaan käyttämällä tähän tarkoitukseen kehitettyjä automaattisia laitteita. Sekvenointireaktion tuottamasta polynukleotidifragmenttien kokojakaumasta saadaan sekvenointikuvio ("sequencing ladder"), joka antaa kohde-nukleotidin nukleotidisekvenssin.
«
Keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi tarvittavat reagenssit voidaan pakata kittimuotoon. Esimerkiksi kitti voidaan valmistaa siten, että se sisältää pakatun yhdistelmän yhtä tai kahta amplifikaatioaluketta sisältäen kiinnitin-komponentit ja vastaavat kiinteät kantajat. Kitti voi myös lisäksi sisältää sekvenointialukkeen, tai referenssivälineen määritetyn nukleiinihapposekvenssin vertaamiseksi standardi-sekvenssin kanssa. Esimerkkejä referenssivälineistä ovat pakkauksen liitteet, jotka kuvaavat standardin sekvenoinnista saatavaa sekvenointikuviota, taikka näyte itse standardista. Jos standardi on mukana, se sisältää edullisesti kiinnitin-komponentin siten, että sitä voidaan käsitellä samoin kuin
II
15 97153 sekvenoitavaa kohdetta. Reagenssien järjestäminen kitin säiliöihin riippuu mukaan otetuista spesifisistä reagens-seista. Kukin reagenssi voidaan luonnollisesti pakata omiin säiliöihinsä, mutta erilaiset yhdistelmät voivat myös olla mahdollisia. Esimerkiksi jos käytetty kiinnitinkomponentti ja kiinnitinkohta eivät sitoudu toisiinsa amplifikaatioreaktion olosuhteissa, molemmat voidaan sisällyttää yhteen säiliöön. Tällainen tapaus voi olla kysymyksessä esimerkiksi jos käytetään välittäjäkomponenttia.
Keksintöä valaistaan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien avulla, jotka eivät kuitenkaan rajoita keksintöä niihin.
Esimerkki 1
Nukleotidisekvenssin määritys sytomegaloviruksen DNA-fragmentista, joka biotinyloidaan ja immobilisoidaan avidiini-mikropartikkeleihin
Alukkeiden synteesi
Alukkeet syntetisoitiin Applied Biosystems 381A DNA syn-tetisoijalla metoksifosforamidiitti-menetelmällä. Alukkeet (merkitään 25A ja 25B) olivat 25-meerejä, joiden sekvenssit olivat: 25A: 5'-TCG CAA GCT CTT TCC CGG CCT GGC T 25b: 5'-GCT CTG CGC GAA CAT GTA GTC GGC C 5'-pään aminoryhmä lisättiin 25A-alukkeeseen synteesin viimeisenä vaiheena käyttäen Aminolink II reagenssia (Applied Biosystems, P/N 400808). Aminoryhmä biotinyloitiin sulfo-NHS-biotiinilla (Pierce Chemical Co.). Biotinyloitu oligo-nukleotidi puhdistettiin HPLC:llä C-18 käänteisfaasikolon-nilla.
97153 16
Kohde-DNA
Kohde-DNA oli fragmentti sytomegaloviruksen (CMV) genomin pitkältä uniikilta alueelta kartan kohdasta 0.30-0.35, s.o.
12.2 kb Hind illL-fragmentti pAT153 vektoriin kloonatusta AD 169 CMV DNA(ATC VR-538):sta. Kohdeplasmidi linearisoitiin restriktioentsyymillä Eco Rl. Alukkeet sivuavat 115 bp aluetta CMV Hind IIIL-fragmentissa.
Amplifikaatio
Biotiini liitettiin CMV-DNA:n 165 bp fragmenttiin 25 syklin amplifikaatiolla käyttäen 5'-biotinyloitua aluketta 25A ja ei-modifioitua aluketta 25B. Amplifikaatio suoritettiin käyttämällä 3 x 105 molekyyliä linearisoitua CMV Hind IIIL fragmenttia, 100 pmol kutakin aluketta, 200 /uM kutakin neljää mononukleosiditrifosfaattia (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100 /;l:ssa 10 mM Tris-HCL-liuosta, pH 8,35, joka sisälsi 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2 ja 0,1 mg/ml gelatiinia 0,5 ml:n Eppendorf-putkissa viskoosin parafiinikerroksen alla. Kohde-DNA:ta keitettiin 5 min reaktioseoksessa sen saattamiseksi yksisäikeiseksi, minkä jälkeen lisättiin 2U Thermus aquaticus DNA-polymeraasia (New England Biolabs). Putkia prosessoitiin 25 syklin verran seuraavasti:
Alukkeen emäspariutuminen 55°C:ssa 1 min, alukkeiden pidentyminen 72°C:ssa 3 min, templaatin denaturointi 95°C:ssa 1 min 15 sek.
Biotinyloidun ja amplifioidun DNA:n kiinnitys avidiinilla päällystettyihin polystyreenipartikkeleihin 25 yul näytettä sisälsi n. 1010 molekyyliä, s.o. 0,02 pmol, amplifioitua DNA-fragmenttia, joka oli kaksisäikeistä ja sisälsi 5'-biotiinin toisessa säikeessä. Amplifioitu DNA-fragmentti eristettiin reaktioseoksesta inkuboimalla 5 //l:ssa liuosta, joka sisälsi 5% avidiinilla päällystettyjä polystyreenipartikkeleja (0,8 /um, Pandex Laboratories), 1 II· 97153 17 tunti huoneenlämpötilassa. Helmet eristettiin sentri-fugoimalla Eppendorf-sentrifuugissa 3 min ja pestiin kolme kertaa pyörrettämällä 1 ml:lla fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS), pH 7,5, sisältäen 0,1 % triton-X-100, minkä jälkeen sentrifugoitiin kuten edellä. Sitoutunut DNA denaturoitiin käsittelemällä 200 //1:11a 0,15 M NaOH liuosta 15 min 37°C:ssa, partikkelit eristettiin ja pestiin kahdesti 1 ml:lla 0,1% triton-X-100 ja lopuksi kerran 1 ml:lla 0,01% triton-X-100.
Immobilisoidun DNA-fragmentin sekvenointi DNA-fragmenttia kantavat mikropartikkelit suspentoitiin 10 //Iraan 40mM Tris-HCl, pH 7,5, joka sisälsi 20 mM MgCl2, 50mM NaCl, 100 //g/ml hoviini seerumin albumiinia, ja 0,06 - 0,08 pmol 25B aluketta. Alukkeen annettiin emäspariutua 10 min 55°C:ssa ja sen jälkeen 30 min 37°C:ssa. Seuraavaksi lisättiin 2 μΐ 35S-leimattua dCTPrtä (600 Ci/mmol; Amersham) ja 1 //1 (5 yksikköä) E. coli DNA-polymeraasia (Klenow-f ragmentti; Boehringer Mannheim). Suspensio jaettiin neljään koeputkeen, 2,5 μΐ kuhunkin, yksittäisiä sekvenointireaktioita varten. 2 μΐ deoksi- ja dideoksinukleotidiseoksia lisättiin, jolloin saatiin seuraavat lopulliset pitoisuudet:
A-reaktio: 125 //M dGTP, dTTP, 16 //M dATP, 250 //M ddATP
C-reaktio: 125 //M dGTP, dTTP, dATP, 20 //M ddCTP
G-reaktio: 125 //M dTTP, dATP, 16 //M dGTP, 200 //M ddGTP
T-reaktio: 125 μη dGTP, dATP, 16 μη dTTP, 500 μη ddTTP.
Reaktion annettiin jatkua 20 min huoneenlämpötilassa.
Sen jälkeen lisättiin 2 μΐ 2 mM liuosta kutakin neljää dNTP:tä, ja ajoreaktion (chase reaction) annettiin jatkua 20 min huoneenlämpötilassa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 4 μΐ 95% formamidia, 20 mM EDTA, 0,05% bromofenolisinistä, 0,05% ksyleenisyanolia. Näytteitä kuumennettiin 3 min 98°C:ssa.
Putket sentrifugoitiin ja 3 μΐ supernatanttia asetettiin 8% polyakryyliamidi sekvenointigeelille. Näytteille suoritettiin elektroforeesi, geeli poistettiin, kiinnitettiin ja asetettiin röntgensädefilmille standardiproseduurien mukaisesti.
97153 18
Kehityksen jälkeen havaittiin selvä sekvenointikuvio.
Esimerkki 2
Koko proseduuri suoritettiin samoin kuin esimerkissä 1 paitsi, että sekvenointireaktiosta saadut näytteet asetettiin suoraan geelille ilman mikropartikkelien poistamista näytteestä. Saatiin samanlainen sekvenointikuvio kuin esimerkissä 1.
Esimerkki 3 Tässä esimerkissä sekvenointireaktioissa käytettiin 32P-leimattuja alukkeita. Proseduuri suoritettiin kuten esimerkissä 1 lukuun ottamatta seuraavia poikkeuksia: Sekvenointialuke (25B) leimattiin käyttäen gamma-32P-ATP:tä ja polynukleotidikinaasia standardimenetelmän mukaisesti.
·' Leimausreaktiota kohti käytettiin 2 pmol oligonukleotidi- aluketta ja 14 pmol gamma-32P-ATP:tä (> 5000 Ci/mmol; Amersham). Saaduilla alukkeilla oli spesifinen aktiivisuus 107 cpm/pmol. Sekvenointireaktiota varten mikropartikkelit, jotka sisälsivät n. 0,02 pmol amplifioitua DNA-fragmenttia, suspentoiti in sekvenointipuskuriin (katso Esimerkki 1), joka sisälsi 0,1 pmol leimattua 25B-aluketta. Alukkeen emäs-par iutumisreaktio suoritettiin kuten esimerkissä 1. Seuraa-vaksi lisättiin 1//1(5 yksikköä) DNA-polymeraasia, ja suspensio jaettiin neljään osaan, kussakin 2,5 //1. Lisättiin lopuksi 2 μΐ deoksi- ja dideoksinukleotidiseokset siten, että , saatiin seuraavat lopulliset pitoisuudet:
A-reaktio: 125 μη dCTP, dGTP, dTTP, 16 μΚ dATP ja 250 μη ddATP
C-reaktio: 125 μη dATP, dGTP, dTTP, 16 μΆ dCTP ja 80 μΥί ddCTP G-reaktio: 125 //M dATP, dCTP, dTTP, 16 μη dGTP ja 200 μη ddGTP
T-reaktio: 125 μη dATP, dCTP, dGTP, 16 μη dTTP ja 500 μη 97153 19 ddTTP.
Ketjunpäättäminen ja ajoreaktiot samoin kuin saatujen fragmenttien analyysi suoritettiin kuten esimerkissä 1.
Myös tässä esimerkissä saatiin selvät sekvenointikuviot.
Esimerkki 4 Tässä esimerkissä käytetyt amplifikaatio-aluke ja sek-venointialuke olivat ei-identtisiä. Sekvenointialuke sijaitsi 78 emäksen etäisyydellä amplifikaatioalukkeesta kohti amplifioidun fragmentin biotinyloitua 5'-päätä. Amplifikaatio suoritettiin käyttäen biotinyloitua aluketta 25A sekä 25-meeri aluketta, jota merkitään 25C ja jolla oli seuraava sekvenssi: 5'—CAG GGT CAC TGA CAA CAG CCG CCC T.
Alukkeet 25A ja 25C sivuavat 209 bp sekvenssiä CMV-genomissa. Amplifikaatio- ja kiinnitysproseduurit olivat samat kuin esimerkissä 1. Aluke 25b leimattiin 32P:llä ja sitä - käytettiin sekvenointialukkeena esimerkin 3 olosuhteissa.
Saatu sekvenssi oli identtinen esimerkissä 3 saadun kanssa.
Esimerkki 5
Kaikki prosessit suoritettiin kuten esimerkissä 1 paitsi affiniteettikiinnitysvaihetta. Tässä esimerkissä affini-teettimatriisina käytettiin magneettihelmiä. Helmien halkaisija oli 2 /um, niillä oli paramagneettinen ydin ja pyöreä streptavidiinilla päällystetty polystyreenikuori.
Helmet (Dynabead 280-Streptavidin) hankittiin Dynal'lta Norjasta. Ennen käyttöä helmet pestiin kerran fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Kuten esimerkissä 1, 25 μΐ näytettä, joka sisälsi amplifioitua DNA-fragmenttia, analysoitiin. Lisättiin 5 μΐ 4% magneettihelmisuspensiota PBS:ssä, ja kiinnitysreaktion annettiin jatkua 30 min 37°C:ssa Eppendorf-putkissa pyörivässä sekoittajassa. Helmien 97153 20 annettiin erottua liuoksesta 1 min ajan käyttäen tavallista laboratoriomagneettia, ja liuos heitettiin pois. Helmet pestiin kolme kertaa 1 ml:11a PBS-liuosta pyörrettämällä ja erotettiin magneetilla kuten edellä. Sitoutunut DNA denaturoitiin käsittelemällä 200 /yl:lla 0,15 M NaOH 15 min ajan 37°C:ssa. Helmet eristettiin ja pestiin kahdesti PBS-liuoksella ja kerran 40 mM Tris-HCl-liuoksella, pH 7,5, sisältäen 20 mM MgCl2 ja 50 mM NaCl. Immobilisoidun DNA-fragmentin sekvenointi tapahtui kuten esimerkissä 1.
Esimerkki 6
Amplifikaatio ja kiinnitysproseduuri suoritettiin kuten esimerkissä 1. Tässä esimerkissä sekvenoitiin amplifioidun DNA-fragmentin toinen säie, joka saatiin denaturointi-vaiheesta. 200 μΐ 0,15 M NaOH supernatanttia, joka sisälsi affiniteettimatriisista eluoidun DNA-säikeen, neutralisoitiin lisäämällä 20 μΐ 1,5 M etikkahappoa ja 12 μΐ 3 M natrium-asetaattia (pH 7). DNA saostettiin etanolilla ja liuotettiin 10 niiaan sekvenointipuskuria (katso Esimerkki 1), joka sisälsi sekvenointialukkeen. Sekvenointiproseduuri suoritettiin esimerkissä 1 mainituissa olosuhteissa. Jälleen saatiin selvät sekvenointikuviot.
Esimerkki 7
Apolipoproteiini E:n geneettisen polymorfismin identifiointi sekvenoimalla biotinyloituja immobilisoituja apolipoproteiini E:n DNA-fragmentteja Tämä esimerkki havainnollistaa keksinnön mukaisen menetelmän käyttökelpoisuutta geneettisten sairauksien diagnostiikassa. Menetelmää sovellettiin analysoitaessa apolipoproteiini E:n (apo E) geneettistä variaatiota. Tällä proteiinilla on tärkeä merkitys lipoproteiinimetaboliassa. Populaatiossa esiintyy
II
97153 21 kolme yleistä apo E:n isomorfista muotoa (E2, E3 ja E4), joita koodaa kolme erilaista alleelia (ε2, ε3 ja ε4). Näiden alleelien geneettinen variaatio johtuu yhden emäksen substituutiosta aminohappokohdissa 112 ja 158. Tämä apo E:n geneettinen polymorfismi selittää jopa 10 % yksilöiden välillä esiintyvästä seerumin kolesterolitason vaihtelusta, joten sillä on huomattava kliininen merkitys.
Alukkeiden synteesi
Neljä aluketta (P1-P4) syntetisoitiin Applied Biosystems 381A DNA synthesizer -laitteella. Alukkeiden nukleotidisekvenssi ja niiden sijainti (nukleotidinumeroilla ilmaistuna) apolipo-proteiini E:n geenissä (Apo E) oli seuraava:
Pl: 5'-AAG GAG TTG AAG GCC TAC AAA T (3616 - 3637) P2: 5'-TCG CGG GCC CCG GCC TGG TAC A (3893 - 3914) P3: 5'-GAA CAA CTG AGC CCG GTG GCG G (3649 - 3670) P4: 5'—GGA TGG CGC TGA GGC CGC GCT C (3922 - 3943) 5'-aminoryhmä liitettiin alukkeeseen P2 käyttäen reagenssia aminolink II (Applied Biosystems). Aminoryhmä biotinyloitiin sulfo-NHS-biotiinilla (Pierce Chemicals Co.). Biotinyloitu oligonukleotidi puhdistettiin HPLC käänteisfaasikolonnilla. Sekvenointialuke P3 leimattiin [gamma-32P]dATP:n ja T4 polynukleotidikinaasin avulla (spesifinen aktiivisuus 4 x 106 cpm/pm).
DNA-näytteet
Laskimoverinäytteet saatiin tiedetyn Apo E fenotyypin omaavilta potilailta HYKS:in lipidipoliklinikalta. Leukosyytti-DNA eristettiin standardimenetelmien mukaisesti.
Ampli fikaatio
DNA (100 ng per näyte) amplifioitiin alukkeilla Pl ja P4 (lopullinen konsentraatio 1 μΜ) 100 //l:ssa liuosta, joka sisälsi 0,2 mM kutakin dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 mM
97153 22
Tris-HCl, pH 8,8, 15 mM (NH)4S04, 1,5 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20, 0,1 mg/ml gelatiinia ja 2,5 yksikköä Thermus aquaticus DNA-polymeraasia (Promega), DNA thermal cycler -laitteella (Perkin-Elmer /Cetus) 25 syklillä (1 min 96eC:ssa ja 2 min 65°C:ssa). Pieni osa (3 μ\ laimennusta 1:100) tätä ensimmäistä amplifikaatioseosta siirrettiin toiseen amplifikaa-tioseokseen. Tämä toinen amplifikaatio suoritettiin edellä kuvatuissa olosuhteissa ja käyttämällä alukkeita, joista toinen oli biotinyloitu (P3 ja biotinyloitu P2).
Biotinyloidun ja amplifioidun Apo E DNA:n kiinnitys avidiinilla päällystettyihin polystyreenipartikkeleihin 25 μΐ toista amplif ikaatioseosta laimennettiin 50 //l:aan liuoksella, joka sisälsi 0,15 M NaCl ja 20 mM Na-fosfaat-tipuskuria, pH 7,5 (PBS), minkä jälkeen lisättiin 5 μΐ avidiinilla päällystettyjen polystyreenipartikkelien 5% (p/til) suspensiota (0,8 μΐηοΐ, Baxter Healthcare Corp.). Näytteitä pidettiin 20°C:ssa 1 tunnin ajan. Partikkelit • kerättiin sentrifugoimalla 2 min Eppendorf sentrifuugissa ja
pestiin kahdesti pyörrettämällä 1 ml:ssa liuosta, joka sisälsi 15 mM NaCl ja 1,5 mM Na-sitraattia, ja kahdesti 1 ml:ssa 0,1 % Tween 20:n PBS-liuosta. Partikkeleita käsiteltiin kahdesti 0,15 M NaOH:lla 15 min 37°C:ssa, minkä jälkeen seurasi kaksi pesukertaa liuoksella, joka sisälsi 0,1 % Tween 20 50 mM NaCl-liuoksessa ja 40 mM Tris-HCl, pH
7.5. Lopullinen pesu suoritettiin liuoksella, joka sisälsi 0,01 % Tween 20 50 mM NaCl-liuoksessa ja 40 mM Tris-HCl, pH
7.5.
Immobilisoidun DNA-fragmentin sekvenointi DNA-templaatteja kantavat partikkelit suspentoitiin 10 /ul:aan liuosta, joka sisälsi 50 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, ja 0,5 - 1,0 pmol sekvenointialuketta P2 tai P3. Koeputkia kuumennettiin 65°C:ssa 2 min ja annettiin jäähtyä hitaasti huoneenlämpötilaan. Seuraavaksi lisättiin 1 )i 97153 23 μΐ 0,1 M dithiothreitolia, 2,5 μΐ H2 O ja 2 μΐ (3,25 yksikköä) T7 DNA-polymeraasia (Sequenase™, United States Biochemical Corp.) ja koeputkia pidettiin 3 min 22°C:ssa. 3,5 μΐ tätä reaktioseosta siirrettiin neljään koeputkeen, jotka sisälsivät 2,5 μΐ sekvenointiseosta (80 μΜ d NTP, 8 μΜ ddNTP A ja T reaktioille; 320 μΜ dNTP, 8 μΜ ddNTP C ja G reaktioille). Putkia inkuboitiin 6 min 42°C:ssa, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 4 μΐ liuosta, joka sisälsi 95 % formamidia, 20 mM EDTA, 0,05 % bromofenolisinistä ja 0,05 % ksyleenisyanolia. Näytteitä kuumennettiin 2 min 80°C:ssa ja sentrifugoiti in 2 min. Sekvenointireaktion tuotteet ajettiin 6 % sekvenointi-geelissä. Elektroforeesi suoritettiin ja geeli käsiteltiin standardimenetelmien mukaan. Oikeat alleelit identifioitiin ' saatujen sekvenointi- kuvioiden perusteella. Heterotsygoot tisissa näytteissä molemmat alleelit identifioitiin päällek-käinasetetuista sekvenointikuvioista nukleotidivariaation kohdalta.
Claims (35)
- 97153 24
- 1. Menetelmä kohdenukleiinihapon sekvenssin määrittämiseksi tunnettu siitä, että suoritetaan ainakin seuraavat vaiheet: (a) valmistetaan amplifikaatioreaktioseos yhdistämällä kohdenukleiinihapon sisältävä näyte nukleosiditrifosfaattien, nukleiinihappopolymeraasin sekä ensimmäisen ja toisen ampli£ikaatioalukkeen kanssa kunkin amplifikaatioalukkeen sisältäessä oligonukleotidialueen, joka on komplementaarinen kohdenukleiinihapon toiselle vastinsäikeelle siten, että eri amplifikaatioalukkeet hybridisoituvat eri vastinsäikeiden kanssa, ja kunkin amplifikaatioalukkeen toimiessa alukkeena nukleiinihappopolymeraasin suorittamalle nukleiinihappo-polymerisaatiolle, ja sanotun ensimmäisen amplifikaatioalukkeen sisältäessä lisäksi ensimmäisen kiinnitinkomponentin oligonukleotidiin liittyneenä; (b) kierrätetään amplifikaatioreaktioseosta toistuvasti kahden tilan välillä, joista ensimmäisessä tapahtuu DNA-polymerisaatio ja toisessa kaksisäikeisen DNA:n denaturaatio yksisäikeiseksi, niin monta kertaa, että kohdenukleiinihappoa saadaan kopioitua riittävä määrä DNA-sekvenointiproseduuria varten näin saadun amplifioidun näytteen sisältäessä kohdenukleiinihapposekvenssin kopioita, joihin on liittynyt kiinnitinkomponentti; (c) lisätään amplifioituun näytteeseen ensimmäinen kantaja, joka sisältää kiinteän matriisin ja ensimmäisen kiinnitin-kohdan, joka kiinnitinkohta pystyy immobilisoimaan kohdenukleiinihapon säikeen ensimmäisen kiinnitinkomponentin kautta; (d) annetaan ensimmäisen kiinnitinkohdan reagoida ensimmäisen kiinnitinkomponentin kanssa siten, että amplifioidun näytteen sisältämä kohdenukleiinihappo immobilisoituu ensimmäiseen II 97153 25 kantajaan; (e) erotetaan immobilisoitu nukleiinihappo amplifikaatio-seoksesta; (f) denaturoidaan amplifioitu nukleiinihapponäyte yksisäi-keiseksi; ja (g) määritetään yksisäikeisen nukleiinihapon sekvenssi.
- 2. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että amplifioidun näytteen denaturointivaihe suoritetaan ennen kohdenukleiinihapon kopioiden immobilisointia kantajaan.
- 3. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että yksisäikeisen immobilisoidun nukleiinihapon sekvenssi määritetään ketjunpäättämismenetelmällä.
- 4. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että sanottu ensimmäinen kiinnitinkomponentti ja sanottu ensimmäinen kiinnitinkohta ovat affiniteettiparin komponentteja.
- 5. Vaatimuksen 4 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että affiniteettipari on biotiini/avidiini, biotiini/strept-avidiini, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, haptiini/vasta-aine tai metalli/kelaatti.
- 6. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että sanottu toinen amplifikaatioaluke sisältää toisen kiinnitinkomponentin, joka on eri kuin sanottu ensimmäinen ki inni tinkomponentti.
- 7. Vaatimuksen 6 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että lisävaiheena lisätään amplifioituun näytteeseen toinen kantaja, joka sisältää kiinteän matriisin ja toisen kiinni- „ 97153 26 tinkohdan, joka kiinnitinkohta pystyy immobilisoimaan koh-denukleiinihapon säikeen toisen kiinnitinkomponentin kautta.
- 8. Vaatimuksen 6 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että sanottu toinen kiinnitinkomponentti ja sanottu toinen kiinnitinkohta ovat affiniteettiparin komponentteja.
- 9. Vaatimuksen 8 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että affiniteettipari on biotiini/avidiini, biotiini/strept-avidiini, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, haptiini/vasta-aine tai metalli/kelaatti.
- 10. Vaatimuksen 7 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että sanotut ensimmäinen ja toinen kantaja ovat samanaikaisesti läsnä amplifioidussa näytteessä ja ne voidaan erottaa fysikaalisesti toisistaan.
- 11. Vaatimuksen 10 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että yksi sanotuista ensimmäisestä ja toisesta kantajasta on magneettinen.
- 12. Vaatimuksen 10 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että yksi tai molemmat sanotuista ensimmäisestä ja toisesta kantajista on dipsticksysteemi.
- 13. Vaatimuksen 3 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että sekvenssinmääritysprosessi sisältää seuraavat vaiheet: (a) yhdistetään yksisäikeinen immobilisoitu nukleiinihappo, sekvenointialuke ja sekvenointiseos, joka sekvenointiseos sisältää nukleosiditrifosfaatit, ketjun päättävän nukleotidin, polynukleotidiä syntetisoivan entsyymin ja leimakompo-nentin, joka liittyy mukaan nukleiinihapposynteesin aikana; (b) annetaan polymerisointireaktion jatkua niin kauan, että saadaan tarpeeksi ketjunpäättymisiä sekvenssin määritystä varten; (c) annetaan polymerisointireaktion jatkua ajoreagensseissa niin kauan, että DNA-synteesi on olennaisesti täydellinen; ti 97153 27 (d) erotetaan täydellisesti polymerisoitu näyte ajoreagens-seista; (e) vapautetaan polymerisoidut nukleiinihapot kantajasta; (f) denaturoidaan polymerisoidut nukleiinihapot yksisäi-keisiksi; (g) määritetään kohdenukleiinihapon sekvenssi analysoimalla yksisäikeisten nukleiinihappojen koko.
- 14. Vaatimuksen 13 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että sekvenointialuke on komplementaarinen ainakin amplifikaatioalukkeen osan kanssa tai komplementaarinen kohdenukleiinihapon osan kanssa, joka sijaitsee kohdenuk-leiinihapossa mielenkiinnon kohteena olevan alueen ja amplifikaatioalukkeen 3'-pään välillä.
- 15. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että se sisältää lisävaiheena amplifikaatioseoksen inkuboin-nin nukleiinihappojen emäspariutumista edistävässä lämpötilassa ennen kutakin polymerisaatiovaihetta.
- 16. Reagenssiyhdistelmä käytettäväksi kohdenukleiinihapon sekvenssin määrittämisessä vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnettu siitä, että se sisältää pakattuna yhdistelmänä ainakin: (a) ensimmäisen amplifikaatioalukkeen, joka sisältää oligo-nukleotidin, joka hybridisoituu ja on komplementaarinen kohdenukleiinihapon osan kanssa ja toimii alukkeena entsy-maattiselle nukleiinihappopolymerisaatiolle, sekä ensimmäisen kiinnitinkomponentin; ja (b) ensimmäisen kantajan, joka sisältää kiinteän matriisin ja ainakin yhden kiinnitinkohdan, joka pystyy immobilisoimaan amplifikaatioalukkeen sanotun ensimmäisen kiinnitinkomponentin kautta.
- 17. Vaatimuksen 16 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että kiinnitinkomponentti ja kiinnitinkohta ovat affiniteettiparin komponentteja. 9715ä
- 16. Vaatimuksen 17 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että affiniteettipari on biotiini/avidiini, biotiini/streptavidiini, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, haptiini/vasta-aine tai metalli/kelaatti.
- 19. Vaatimuksen 16 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että kiinnitinkomponentti ei sitoudu suoraan kiinnitinkohdan kanssa, ja reagenssiyhdistelmä sisältää lisäksi välittäjäkomponentin, joka voi muodostaa linkin kiinnityskomponentin ja kiinnityskohdan välille.
- 20. Vaatimuksen 16 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että se sisältää lisäksi sekvenointialukkeen, joka on komplementaarinen ainakin amplifikaatioalukkeen osan kanssa tai komplementaarinen kohdenukleiinihapon osan kanssa, joka sijaitsee kohdenukleiinihapossa mielenkiinnon kohteena olevan alueen ja amplifikaatioalukkeen 3'-pään välillä.
- 21. Vaatimuksen 20 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että sekvenointialuke sisältää lisäksi detektoi-tavissa olevan leiman.
- 22. Vaatimuksen 16 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että se sisältää lisäksi referenssivälineen määritetyn nukleiinihapposekvenssin vertaamiseksi standardi-sekvenssin kanssa.
- 23. Vaatimuksen 22 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että referenssiväline on pakkauksen liite, joka kuvaa standardin sekvenoinnista saatavaa sekvenointikuviota.
- 24. Vaatimuksen 22 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että referenssiväline on näyte standardista.
- 25. Vaatimuksen 16 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että amplifikaatioalukkeen oligonukleotidi hybridisoituu ja on komplementaarinen kohdenukleiinihapon 97153 29 osan kanssa, joka on johdettu kohdeorganismista.
- 26. Vaatimuksen 16 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että se sisältää lisäksi toisen amplifikaatio-alukkeen, joka hybridisoituu ja on komplementaarinen kohdenukleiinihapon osan toisen vastinsäikeen kanssa ja toimii alukkeena entsymaattiselle nukleiinihappopolymeri-saatiolle ja sisältää toisen kiinnitinkomponentin, joka on eri kuin ensimmäinen kiinnitinkomponentti; ja toisen kantajan, joka sisältää kiinteän matriisin ja ainakin yhden kiinnityskohdan, joka pystyy immobilisoimaan amplifikaatio-alukkeen sanotun toisen kiinnitinkomponentin kautta.
- 27. Vaatimuksen 26 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet- t u siitä, että kiinnitinkomponentti ja kiinnitinkohta ovat affiniteettiparin komponentteja.
- 28. Vaatimuksen 27 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että affiniteettipari on biotiini/avidiini, biotiini/streptavidiini, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, haptiini/vasta-aine tai metalli/kelaatti.
- 29. Vaatimuksen 26 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että se sisältää lisäksi referenssivälineen määritetyn nukleiinihapposekvenssin vertaamiseksi standardi-sekvenssin kanssa.
- 30. Jonkin vaatimuksista 1-15 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että kohdenukleiinihaposta määritetään ainakin yksi potentiaalinen nukleotidivariaatio.
- 31. Vaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleotidivariaatio liittyy perinnölliseen sairauteen tai sille alttiuteen.
- 32. Jonkin vaatimuksista 30-31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleotidivariaatio on 97153 30 somaattinen mutaatio.
- 33. Jonkin vaatimuksista 30-31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleotidivariaatio liittyy solujen, kantojen tai lajikkeiden valintaan eläin- tai kasvinjalostuksessa, tai haluttua genotyyppiä ilmentävän mikro-organismin valintaan.
- 34. Jonkin vaatimuksista 16-29 mukainen reagenssiyhdistelmä jonkin vaatimuksista 30-33 mukaisen menetelmän käyttöön. 97153 31
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27764388A | 1988-11-29 | 1988-11-29 | |
| US27764388 | 1988-11-29 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI895682A0 FI895682A0 (fi) | 1989-11-28 |
| FI97153B FI97153B (fi) | 1996-07-15 |
| FI97153C true FI97153C (fi) | 1996-10-25 |
Family
ID=23061771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI895682A FI97153C (fi) | 1988-11-29 | 1989-11-28 | Menetelmä ja reagenssiyhdistelmä nukleotidisekvenssien määrittämiseksi |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0371437B1 (fi) |
| JP (1) | JP2766003B2 (fi) |
| AT (1) | ATE134388T1 (fi) |
| AU (1) | AU623200B2 (fi) |
| CA (1) | CA2004056C (fi) |
| DE (1) | DE68925717T2 (fi) |
| DK (1) | DK175170B1 (fi) |
| ES (1) | ES2082766T3 (fi) |
| FI (1) | FI97153C (fi) |
| GR (1) | GR3019105T3 (fi) |
| IL (1) | IL92474A (fi) |
| NO (1) | NO176362C (fi) |
| NZ (1) | NZ231576A (fi) |
| PT (1) | PT92420B (fi) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8801070D0 (sv) * | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
| DE3816934A1 (de) * | 1988-05-18 | 1989-11-23 | Ramalho Ortigao Jose Flavio | Neue sequenzierungsmethode fuer einzel- oder doppelstraengige nucleinsaeuren an fester phase |
| US5858652A (en) * | 1988-08-30 | 1999-01-12 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| US6013431A (en) | 1990-02-16 | 2000-01-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators |
| IL97222A (en) * | 1990-02-16 | 1995-08-31 | Orion Yhtymae Oy | Method and reagent for determining specific nucleotide variations |
| GB9017788D0 (en) * | 1990-08-14 | 1990-09-26 | Medical Res Council | Method for preparing,isolating and sequencing polynucleotides |
| US6004744A (en) | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
| WO1992020820A1 (en) * | 1991-05-15 | 1992-11-26 | Vanderbilt University | Method to determine metastatic potential of tumor cells |
| US5569582A (en) * | 1991-07-15 | 1996-10-29 | Institute Of Molecular Biology & Technology | Rapid amplification and detection of nucleic acids |
| AU660484B2 (en) * | 1991-07-24 | 1995-06-29 | University Partnerships Pty Ltd | Single step amplification and sequencing of nucleic acids |
| CA2114124A1 (en) * | 1991-07-24 | 1993-02-04 | Keith Gregg | Single step amplification and sequencing of nucleic acids |
| DE4214112A1 (de) * | 1991-08-02 | 1993-02-04 | Europ Lab Molekularbiolog | Neues verfahren zur sequenzierung von nukleinsaeuren |
| GB9122060D0 (en) * | 1991-10-17 | 1991-11-27 | Dynal As | Method of sequencing double stranded dna |
| GB9207598D0 (en) * | 1992-04-03 | 1992-05-20 | Dynal As | Method of sequencing double stranded dna |
| GB9210176D0 (en) † | 1992-05-12 | 1992-06-24 | Cemu Bioteknik Ab | Chemical method |
| US5843640A (en) * | 1992-06-19 | 1998-12-01 | Northwestern University | Method of simultaneously detecting amplified nucleic acid sequences and cellular antigens in cells |
| US5795714A (en) | 1992-11-06 | 1998-08-18 | Trustees Of Boston University | Method for replicating an array of nucleic acid probes |
| US6436635B1 (en) | 1992-11-06 | 2002-08-20 | Boston University | Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids |
| CA2158642A1 (en) * | 1993-03-19 | 1994-09-29 | Hubert Koster | Dna sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
| ES2078185B1 (es) * | 1994-05-06 | 1996-08-16 | Inia | Procedimiento para la tipificacion molecular de patogenos virales con genoma rna y de patogenos subvirales mediante sintesis aleatoria de cdna. |
| AU707391B2 (en) * | 1994-05-28 | 1999-07-08 | Tepnel Medical Limited | Producing copies of nucleic acids |
| US7803529B1 (en) | 1995-04-11 | 2010-09-28 | Sequenom, Inc. | Solid phase sequencing of biopolymers |
| US6077664A (en) * | 1995-06-07 | 2000-06-20 | Promega Corporation | Thermophilic DNA polymerases from Thermotoga neapolitana |
| US6001645A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-14 | Promega Corporation | Thermophilic DNA polymerases from thermotoga neapolitana |
| SE9504099D0 (sv) * | 1995-11-16 | 1995-11-16 | Pharmacia Biotech Ab | A method of sequencing |
| AU2320597A (en) | 1996-03-19 | 1997-10-10 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide |
| US6096273A (en) | 1996-11-05 | 2000-08-01 | Clinical Micro Sensors | Electrodes linked via conductive oligomers to nucleic acids |
| US7381525B1 (en) | 1997-03-07 | 2008-06-03 | Clinical Micro Sensors, Inc. | AC/DC voltage apparatus for detection of nucleic acids |
| US6140053A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-31 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
| CA2370976C (en) | 1999-04-20 | 2009-10-20 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| US20060275782A1 (en) | 1999-04-20 | 2006-12-07 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| ATE417127T1 (de) | 1999-07-26 | 2008-12-15 | Clinical Micro Sensors Inc | Nukelinsäuresequenzbestimmung mittels elektronischem nachweis |
| US7244559B2 (en) | 1999-09-16 | 2007-07-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
| US7211390B2 (en) | 1999-09-16 | 2007-05-01 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
| US6518024B2 (en) | 1999-12-13 | 2003-02-11 | Motorola, Inc. | Electrochemical detection of single base extension |
| ATE412774T1 (de) | 2000-02-16 | 2008-11-15 | Illumina Inc | Parallele genotypisierung mehrerer patientenproben |
| JP2004532026A (ja) | 2001-03-30 | 2004-10-21 | アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ | Ｐ４５０単一ヌクレオチド多型バイオチップ分析 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8507706D0 (en) * | 1985-03-25 | 1985-05-01 | Genetics Int Inc | Magnetic nucleic acid sequences |
| AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
| SE8801070D0 (sv) * | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
| NO165894C (no) * | 1988-05-24 | 1991-04-24 | Gunnar Paulsen | Analysemetode for gener. |
| US5817797A (en) * | 1988-06-01 | 1998-10-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction |
-
1989
- 1989-11-27 IL IL9247489A patent/IL92474A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-11-27 DK DK198905953A patent/DK175170B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-11-28 DE DE68925717T patent/DE68925717T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-28 NO NO894746A patent/NO176362C/no unknown
- 1989-11-28 PT PT92420A patent/PT92420B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-11-28 AT AT89121895T patent/ATE134388T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-11-28 FI FI895682A patent/FI97153C/fi active IP Right Grant
- 1989-11-28 ES ES89121895T patent/ES2082766T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-28 CA CA002004056A patent/CA2004056C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-28 JP JP1308817A patent/JP2766003B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-28 EP EP89121895A patent/EP0371437B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-29 AU AU45749/89A patent/AU623200B2/en not_active Ceased
- 1989-11-29 NZ NZ231576A patent/NZ231576A/en unknown
-
1996
- 1996-02-23 GR GR960400527T patent/GR3019105T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK595389A (da) | 1990-05-30 |
| DE68925717T2 (de) | 1996-07-04 |
| EP0371437A3 (en) | 1991-03-27 |
| NO176362B (no) | 1994-12-12 |
| JPH02219600A (ja) | 1990-09-03 |
| ATE134388T1 (de) | 1996-03-15 |
| PT92420A (pt) | 1990-05-31 |
| CA2004056C (en) | 2004-05-11 |
| IL92474A (en) | 1994-04-12 |
| AU4574989A (en) | 1990-06-07 |
| ES2082766T3 (es) | 1996-04-01 |
| EP0371437A2 (en) | 1990-06-06 |
| FI895682A0 (fi) | 1989-11-28 |
| EP0371437B1 (en) | 1996-02-21 |
| NO176362C (no) | 1995-03-22 |
| DE68925717D1 (de) | 1996-03-28 |
| JP2766003B2 (ja) | 1998-06-18 |
| NO894746D0 (no) | 1989-11-28 |
| DK175170B1 (da) | 2004-06-21 |
| NO894746L (no) | 1990-05-30 |
| DK595389D0 (da) | 1989-11-27 |
| NZ231576A (en) | 1991-12-23 |
| CA2004056A1 (en) | 1990-05-29 |
| AU623200B2 (en) | 1992-05-07 |
| FI97153B (fi) | 1996-07-15 |
| IL92474A0 (en) | 1990-08-31 |
| GR3019105T3 (en) | 1996-05-31 |
| PT92420B (pt) | 1995-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI97153B (fi) | Menetelmä ja reagenssiyhdistelmä nukleotidisekvenssien määrittämiseksi | |
| FI111554B (fi) | Reagenssikoostumus ja -kitti nukleiinihapon tietyssä asemassa olevan nukleotidiemäksen tunnistamiseksi | |
| US7132235B2 (en) | Reagent kit for determining specific nucleotide variations | |
| EP0359789B1 (en) | Amplification and detection of nucleic acid sequences | |
| JP3510272B2 (ja) | Ｄｎａの配列決定法 | |
| US5849483A (en) | High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids | |
| US5834181A (en) | High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids | |
| IE910525A1 (en) | Method and reagent for determining specific nucleotide¹variations | |
| KR20020008195A (ko) | 폴리뉴클레오티드 서열 변형의 미세배열-기초 분석 | |
| JP2000500024A (ja) | 塩基配列決定法 | |
| JP2000513202A (ja) | 核酸の塩基配列決定または遺伝的置換の大量スクリーニング法 | |
| JPH07505291A (ja) | 配列決定法 | |
| CA2205234A1 (en) | High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: SANGTEC MEDICAL AB |
|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: SANGTEC MEDICAL AB |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB |