NO176362B - Fremgangsmåte og reagenskombinasjon for bestemmelse av nukleotidsekvenser, samt anvendelse for bestemmelse av nukleotidvariasjon - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte og en reagenskombinas jon -til bestemmelse av nukleotidsekvens en over et avgrenset polynukleotidområde og anvendelse av denne fremgangsmåte til identifisering av genetiske variasjoner.

Den genetiske informasjon hos levende organismer bæres i nukleotidsekvensen i deres genom. I genekspresjonsprosessen blir nukleotidsekvensen translatert til aminosyresekvenser, d.v.s. proteiner. Mindre forandringer i nukleotidsekvensen, selv en enkeltbasesubstitusjon, kan føre til et endret protein-produkt. Den endrede kvalitet eller kvantitet av gitte proteiner endrer fenotypen (d.v.s de observerbare kjennetegn) av organismen eller cellen, hvilke f.eks. kan observeres som en utvikling av en sykdom. Det vil derfor være av betydning dersom endringer i nukleotidsekvenser i genomet hos levende organismer kan bestemmes nøyaktig og med en slik effektivitet at store antall prøver kan screenes. Dette vil gi en mulighet for diagnostisering av arvelige tilbøyligheter eller sykdom, påvisning av somatiske mutasjoner i kreft og seleksjon av celler og stammer for planteforedling og dyreoppdrett.

Deteksjonen av forandringer i nukleotidsekvensen kan utføres på forskjellige måter. En metode som gir meget overbevisende resultater er den faktiske bestemmelse av nukleotidsekvensen over det området av genomet som inneholder det gen som er av interesse. Sammenlignet med nukleinsyre-hybridiseringsmetoder er det ved fremgangsmåten til bestemmelse av nukleotidsekvensen unødvendig å kjenne den egentlige mutasjon. Det er bare nødvendig å kjenne plasseringen av det område som er av interesse og sammenligne dette område i en prøve med det samme område i en "normal" standard.

To grunnleggende metoder er i bruk for bestemmelse av nukleotidsekvens. Disse er den kjemiske metode i henhold til Maxam-Gilbert og kjedeavslutningsmetoden i henhold til Sanger. Begge metoder er godt beskrevet i moderne lærebøker i biokj emi. Felles for disse to metoder er behovet for submikrogram-mengder av relativt rent målpolynukleotid som skal sekvenseres. I de fleste tilfeller blir dette målpolynukleotid klonet ved genteknikkmetoder inn i egnede vektorer for biologisk amplifikasjon for å oppnå tilstrekkelige mengder nukleinsyrepolymer for analyse. Den gjentatte replikasjonsreaksjon i henhold til Kleppe et al. (J. Mol. Biol. (1971) 56, 341-361) har skaffet nok en metode til amplifisering av gitte polynukleotidområder in vitro. Skjønt denne fremgangsmåte gir betydelige fordeler med hensyn til hurtighet og effektvitet i forhold til klonings-metoden for fremstilling av tilstrekkelige mengder DNA, skaffer den ikke et produkt som er direkte egnet til sekvensering. I steden må de amplifiserte områder omhyggelig renses, f.eks. ved elektroforese eller ultrafiltrering, fra amplifikasjonsreak-sjonsblandingen som dersom den foreligger i løpet av sekvenser ingsprosessen ville være skadelig for sekvenseringen. Disse rensemetoder er tilbøyelig til å være tidkrevende og dette taler mot deres bruk i rutinemessige analyser.

Det er derfor hensiktene med foreliggende oppfinnelse å utvikle fremgangsmåte og utstyrspakker til bruk i fremgangsmåten som ikke har ovennevnte ulemper.

Disse hensikter er oppnådd ved foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av patentkravene.

Det er nå utviklet en forbedret fremgangmåte for deteksjon av forandringer i en nukleotidsekvens som er vel tilpasset anvendelse som et rutinemessig diagnostiseringsverktøy. Denne metode skaffer flere fordeler i forhold til tidligere kjente metoder. Der er ikke noe behov for kloning av målpolynukleotidet inn i spesielle vektorer. Isolasjon av enzymatisk amplifisert målpolynukleotid er enkel, og der er ingen arbeids-krevende rensetrinn f.eks. utrafiltrering eller gelelektroforese. Videre blir sekvenseringsreaksj onene utført på immobiliserte templater hvilket skaffer fordeler med hensyn til prosesskontroll og muligheter for automatisering og samtidig sekvensering av begge tråder av målpolynukleotid. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for deteksjon av forandringer i en nukleotidsekvens er basert på bestemmelsen av nukleotidsekvensen over det område som er av interesse. I henhold til oppfinnelsen omfatter det første trinn i fremgangsmåten oppnåelse av en amplifisert DNA-prøve hvor minst én festedel (attachment moiety) er blitt innført i minst én tråd av spesifikt målpolynukleotid ved en modifisert gjentatt replikasjonsreaksjon. Dette kan oppnås ved å kombinere en prøve som inneholder målnukleinsyrepolymeren med en blanding av nukléotidmonomerer (dATP, dCTP, dGTP og dTTP) en DNA-polymerase og første og andre amplifikasjonsprimere. Hver av amplifika-sjonsprimerene omfatter et oligonukleotid som har et område som er komplementært med og hybridiserer med en forskjellig tråd

(d.v.s. den ene eller den andre av de to komplementære tråder)

av målnukleinsyrepolymeren og som er virksom som en primer for DNA-polymerisasjon ved DNA-polymerasen. Minst én av amplif ikasjonsprimerene omfatter dessuten en første festedel som er bundet til oligonukleotidet. Den resulterende amplifikasjonsblanding blir gjentatte ganger bragt til å gjennomgå sykluser mellom en første betingelse under hvilken DNA-polymerisasjonen finner sted og en annen betingelse under hvilken denaturering av dobbelttrådet DNA til enkelttrådet DNA, finner sted for et antall sykluser som er tilstrekkelig til å produsere kopier av målnukleinsyrepolymeren i en mengde som er egnet til bruk i en DNA-sekvenseringsmetode for dannelse av en amplifisert prøve omfattende kopier av målnukleinsyren bundet til festedelen. En tredje inkubasjonsbetingelse under hvilken sammenføyning av enkelttrådet til dobbelttrådet DNA finner sted, særlig sammenføyning av de enkeltettrådede amplif ika-sjonsprimere til det enkelttrådede template-DNA, kan med fordel innlemmes før hvert polymerisasjonstrinn.

Etter amplifikasjon blir trådene av målnukleinsyrepolymer som bærer festedelen fanget opp ved bruk av en fast matriks belagt med et festesete til hvilket festedelen eller en modifikasjon derav kan binde. På denne måte blir trådene av målnukleinsyre bundet til den faste matriks og kan lett separeres sammen med den faste matriks fra ubundne reaktanter.

De rensede kopier av målpolynukleotid denatureres enten før immobilisering eller etter separering av den faste matriks fra de ubundne reaktanter, og sekvensen av den amplifiserte målpolymer bestemmes. F.eks., kjedeavslutnings-sekvenserings-reaksjoner kan initieres på de denaturerte kopier av målpolynukleotidet som nå virker som templater. De nylig syntetiserte sekvenseringsreaksjonsprodukter blir deretter frigjort fra templaten og separert og detektert etter stør-relse.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter også en reagenskombina-sjon eller -pakke (kit) for utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Skjønt den nøyaktige pakking vil avhenge av kombinasjoner av festedeler og festeseter som velges, vil en slik pakke generelt innbefatte en amplifikasjonsprimer som har en festedel inkludert og en bærer som er tilpasset til å immobilisere amplifikasjonsprimeren.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er nyttig for å bestemme i en målenukleinsyre minst én potensiell nukleotidvariasjon, hvilken variasjon kan være en nukleotidutskifting, - slettelse eller - innsetning.

Således kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes i rettsmedisinsk analyse eller analyse av arvelige tilbøyligheter eller sykdommer.

I noen av disse analyser er nukleotidvariasjonen en somatisk mutasjon.

Fra det som er angitt ovenfor er det åpenbart at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også kan anvendes til å selektere celler, stammer eller arter for planteforedling eller dyreoppdrett eller for seleksjon av mikroorganismer som oppviser en ønsket genotype. Fig. 1 er en skjematisk tegning av rekkefølgen av trinnene som anvendes i en utførelsesform av oppfinnelsen; og Fig. 2 er en skjematisk tegning av mulige områder med komple-mentaritet mellom en målnukleinsyre og en sekvenseringsprimer. Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til bestemmelse av nukleotidsekvensen av tidligere definerte områder i komplekse nukleinsyreblandinger. I en foretrukket utf ørelsesform blir to grunnleggende metoder benyttet: kjedeavslutnings-sekvenseringsmetoden i henhold til Sanger og den gjentatte replikasjonsreaksjon. Oppfinnelsen anvender også den aff initetsbaserte hybride oppsamlingsmetode beskrevet i stamsøknaden, amerikansk patentsøknad nr. 024 604. Den nye kombinasjon av disse metoder i den foreliggende oppfinnelse gir en enkel og effektiv prosess for sekvensering av nukleinsyrer som er vel egnet til påvisning av genetiske defekter.

I henhold til oppfinnelsen blir en liten prøve av målnukleinsyre først amplifisert ved bruk av gjentatt replikasjonsreaksjon i hvilken en eller begge amplif ikasjonsprimerene er modifisert for å innbefatte en festedel, f.eks. ett medlem av et af f initetspar. Målsekvensen av interesse amplifiseres med et egnet antall sykluser av denne modifiserte amplifika-sjonsreaksjon. Deretter kan prøven behandles for å gjøre dobbelttrådede nukleinsyrer enkelttrådede, hvoretter alle molekyler som er modifisert med en gitt festedel, bindes til en fast matriks belagt med et komplementært festesete, f .eks. den annen komponent i et af f initetspar. Matriksen blir deretter vasket for å fjerne alt ubundet materiale. Det er også mulig å feste amplifisert DNA til matriksen før denaturering. I dette tilfelle blir denaturer ingen av dobbeltrådede adsorberte nukleinsyremolekyler til enkelttrådet form utført etter immobilisering (festing) . Denne metode gjør det også mulig å eluere den stort sett rene komplementære tråd selv om den ikke er blitt syntetisert med en festedel.

Uavhengig av det stadium på hvilket denatureringstrinnet utføres er resultatet en fast bærer på hvilken enkelttrådet nukleinsyre bindes fra én ende. Denne faste bærer, fortrinnsvis mikroperler (microbeads), blir deretter innført i reaksj onsblandingene i kjedeavslutnings-sekvenseringsprosessen, én reaksjonsblanding for hvert nukleotid, A,C,G eller T. Polymer isas jonstrinnet tillates å skride frem på perlene. Deretter kan perlene vaskes, om ønskelig, hvoretter polymerisa-sjonsproduktet elueres fra perlene og analyseres ved gelelektroforese som beskrevet for en rekke manuelle, halvmanuelle eller automatiserte sekvenseringsprotokoller. I en modifikasjon av denne fremgangsmåte blir den stort sett rene komplementære tråd, eluert fra matriksbundet modifisert tråd, anvendt som sekvenseringstemplaten. Dersom begge amplifikasjonsprimere er modifisert med en forskjellig festedel og det resulterende amplifiserte DNA er "festet" til forskjellige fysisk separerer-bare matrikser, kan begge tråder innføres i den samme sekvenser ingsreaks jonsblanding og matriksen, til hvilke de er festet kan separareres fra hinannen så sent som like før den endelige denaturering og gelelektroforese. Denne mulighet til å sekvensere begge tråder samtidig hvor separasjonen av de to ikke finner sted før straks innen elektroforesen, reduserer mengden av sekvenseringsarbeid med en faktor på nesten to. De forskjellige moder for utføreelse av den foreliggende oppfinnelse skal nå angis i detalj. (a) Modifikasjon av målnukleinsyrefragmenter med festedeler.

Kilden til målnukleinsyre (DNA eller RNA) som skal analyseres ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan være en hvilken som helst menneskecelle, dyrecelle, plantecelle eller mikrobe. Målnukleinsyren kan isoleres fra biologiske prøver ved vanlige nukleinsyre-rensemetoder, men i henhold til den foreliggende oppfinnelse er det også mulig å anvende urensede biologiske prøver direkte.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir festedeler innført i målpolynukleotidet ved den modifiserte gjentatte replikasjonsreaksjon ved hjelp av to oligonukleotidprimere pr. område som skal amplifiseres. Minst én av disse "amplifikasjon"-primere er blitt modifisert med en festedel. For formålene ifølge søknaden og de tilhørende krav er en af f initetsdel en komponent som har affinitet for en annen komponent som danner et af f initetspar ved pref erensiell og selektiv binding med den annen komponent. F.eks. biotin/avidin eller strepavidin, komplementære polynukleotider, innbefattet homopolynukleotider såsom poly dA/poly dT og poly dG/poly dC, hapten/antistoff, og metall/chelat er slike af f initetspar. Hvilke som helst komponentpar med sterk affinitet for hverandre kan fungere som et af f initetspar. En festedel er en af f initetsdel eller en del som skaffer et sete for festing av en af f initetsdel.

Oligonukleotidprimerene kan syntetiseres ved standard kjemiske metoder. Rekombinant DNA-teknikker kan også anvendes for fremstillingen av primere. Størrelsen av primerene er fortrinnsvis mellom 14 og 40 baser, men primere på minst 8 baser eller betydelig lengre enn 40 baser kan også anvendes. Primerene modifiseres med festedelene ved anvendelse av kjemiske eller enzymatiske eller hvilke som helst andre metoder. Fortrinnsvis er festedelen festet til 5'-enden av primeren. Andre seter for festing er også mulige, forutsatt at baseparingsegenskapen av primeren og dens primerfunksjon bibeholdes.

I en utførelelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir to modifiserte primere anvendt. Primerene må i dette tilfelle modifiseres med forskjellige festedeler.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir amplifikasjons-primerene, en eller begge modifisert, målnukleinsyren, mononukleosidtrifosfater og et nukleinsyre-syntetiserende enzym såsom DNA-polymerase blir kombinert. Gjentatte sykluser av denaturer ing av målet, sammenføyning av primerene til mål-trådene og enzymatisk forlengelse av primerne utføres i henhold til en hvilken som helst gjentatt replikasjonsreaksjon-protokoll for så mange sykluser som nødvendig for oppnåelse av en mengde nukleinsyre som er tilstrekkelig for bruk i den DNA-sekvenseringsreaksjon som skal anvendes. For bruk i kjedeavslutnings-sekvenseringsreaksjoner blir minst IO<10> molekyler av DNA fortrinnsvis oppnådd.

Som et resultat av fremgangsmåten blir kopier av det opp-rinnelige målpolynukleotid, nå modifisert med festedeler, produsert ved innlemmelse av de modifiserte primere i de nylig syntetiserte polynukleotidmolekyler. Når bare én av primerene er modifisert blir polynukleotidmolekyler med én tråd som er modifisert med en festedel syntetisert. Bruken av to forskjellig modifiserte primere, som hver er innrettet til å hybridi-sere med en forskjellig tråd av målnukleinsyren, produserer polynukleotidmolekyler hvor én tråd er modifisert med én festedel og den annen tråd er modifisert med en forskjellig festedel. Et spesielt tilfelle fås når en av primerene er modifisert med en polynukleotid-festedel. I dette tilfelle blir den annen tråd modifisert med den komplementære sekvens under amplifikasjonsprosessen som så kan tjene som en festedel for en annen tråd. Størrelsen og mengden av det modifiserte mål-DNA som produseres er begrenset bare ved kapasiteten av den gjentatte replikasjonsreaksjon.

(b) Isolering av enkelttrådet målpolynukleotid

Etter syntese blir det modfiserte målpolynukleotid fanget opp på en fast matriks til hvilken et festesete er blitt festet. For formålene ifølge søknaden og de tilhørende krav er et festesete en komponent av et af f initetspar som velges slik at den preferensielt og selektivt binder seg til den affinitetsdel som anvendes eller som senere binder seg til den festedel som innlemmes i amplifikasjonsprimeren. Når én tråd av målpolynukleotidet er modifisert med en affinitetsdel, anvendes en fast matriks og når begge tråder er modifisert, anvendes to forskjellige faste matrikser. Fortrinnsvis blir de to matrikser valgt slik at de kan separeres fysisk fra hverandre. Alternativt kan oppfangingen av de to forskjellige modifiserte tråder utføres i rekkefølge på to forskjellige faste matrikser. Den faste matriks kan være av et hvilket som helst format, såsom perler, mikropartikler, overflaten av en mikrotitra-sjonsbrønn eller et reagensrør, en målepinne (dipstick) eller et filter. Materialet i matriksen kan f.eks. være polystyren, cellulose, lateks, nitrocellulose, nylon, polyakrylamid, dekstran eller agarose. Det eneste krav til materialet i matriksen er at festesetet kan festes til dette. Bindings-kapasiteten av matriksen bør tillate oppfanging av en tilstrekkelig mengde av det modifiserte målpolynukleotid, så vel som overskuddet av den modifiserte primer som foreligger, hvilket også vil bli fanget opp. Imidlertid foretrekkes bruken av en matriks som lett kan deles opp i partier, f .eks. et stort antall matrikspartikler med mindre bindingskapasitet, i motsetning til noen få matrikspartikler med meget høy kapasi-tet.

Den modifiserte målnukleinsyre kan bringes i berøring med af f initetsmatriksen direkte i reaks j onsblandingen hvor amplifikasjonen utføres. Blandingen kan også fortynnes eller dens sammensetning kan forandres for oppnåelse av betingelser som er gunstige for reaksjonen mellom komponentene av affinitetsparet.

Når to affinitetspar anvendes, blir målpolynukleotidet fortrinnsvis denaturert før af f initets-oppf angelsesreaksjonen for å tillate separat oppsamling av de to tråder på forskjellige affinitetsmatrikser. Hvis disse to forskjellige affinitetsmatrikser kan separeres fysisk fra hinannen, f.eks. etter sekvenseringsreaksjonsstadiet, kan de to matrikser håndteres som én i oppfangingsstadiet og i sekvenseringsreaksjonsstadiet. Når målet er modifisert i én tråd kun, er det valgfritt å denaturere målet før oppfangingsreaksjonen.

Festedelene av målpolynukleotidet tillates å reagere med det immobiliserte komplementære festesete i et tilstrekkelig tidsrom til å utvinne en betydelig del av den amplifiserte målnukleinsyre, hvilket kan variere avhengig av kinetikken av bindingsreaksjonen. I det tilfelle at festedelen ikke lar seg binde direkte til festesetet vil dette dessuten medføre innføringen av en koblingsdel, et molekyl med separate bindingsseter for festedelen og festesetet som kan danne et ledd mellom de to. Etter oppfangingsreaksjonen blir det bundne målpolynukleotid separert fra ubundet materiale innbefattet overskytende mononukleosidtrifosfater, umodifisert primer, enzym, salter etc. ved vasking av matriksen under egnede betingelser. Separasjonsmetoden avhenger av den fysiske form av matriksen og kan f.eks. være sentrifugering, magnetisk separasjon, en kolonnemetode eller skylling av overflaten av matriksen eller kombinasjoner derav.

Etter at vaskingen er utført, blir matriksen behandlet under betingelser som gjør det bundne målpolynukleotid enkelttrådet. Hvilke som helst betingelser som denaturerer dobbelttrådet polynukleotid såsom varme, alkali eller enzymer, men ikke påvirker bindingene mellom komponentene i af f initetspar et, kan anvendes. Dette trinn er obligatorisk dersom målpolynukleotidet ikke var denaturert før oppf angingsreaksj onen. Når denatureringen utføres før oppfangingsreaksjonen er dette trinn fordelaktig, men valgfritt, for å sikre at målmolekylene som kan være blitt sammenføyd på nytt under oppfangingstrinnet, denatureres. Unntagelsen er selvfølgelig det tilfelle hvor festedelen og festesetet er komplementære nukleinsyretråder. I dette tilfelle må denatureringen gå foran festingen da koblingene til bæreren ellers ville gå tapt.

Videre, i en annen variant av oppfinnelsen, skaffer denatureringstrinnet når det utføres på dette stadium en ny bekvem metode til isolering av én tråd av målet som er syntetisert ved den gjentatte replikasjonsreaksjon. Den isolerte tråd er fri for overskytende mononukleosidtrifosfater, primere og andre komponenter av amplif ikasjonsreaksjonen og kan sekvenseres ved vanlig sekvensering i oppløsning eller anvendes for et annet formål.

(c) Sekvenseringsreaksjonen

I henhold til den foreliggende oppfinnelse kan sekvenserings-bestemmelsen av de isolerte amplifiserte polynukleotidfrag-menter utføres ved bruk av kjedeavslutningsmetoden. Denne metode er basert på bruken av deoksynukleotidanaloger som innlemmes tilfeldig ved et polynukleotidsyntetiserende enzym i den voksende polynukleotidtråd for å gi spesifikk kjedeavslutning. Kjedeavslutning kan også oppnås ved bruk av meget lave konsentrasjoner av et av deoksynukleosidtrif osf åtene.

De nødvendige komponenter i kjedeavslutnings-sekvenseringsreaksjonen er en sekvenseringsprimer, et polynukleotidsyntetiserende enzym, kjedeavslutnings-dideoksynukleotidene, deoksynukleotider og en detekterbar markør (label). I henhold til den foreliggende oppfinnelse blir de forskjellige standard-laboratorieprotokoller for sekvensering anvendt på sekvensering av det immobiliserte målpolynukleotid. Tilsetningsrekkefølgen av komponentene i sekvenseringsreaksj onen kan variere avhengig av hvilken affinitet smatr iks som anvendes og av den valgte protokoll.

Som vist på fig. 2 kan sekvenseringsprimeren være forskjellig fra eller lik den primer som anvendes i amplif ikasj onsreak-sjonen. Dersom den er forskjellig fra amplif ikasj onsprimeren kan den være fullstendig anordnet mellom det område som er av interesse i målnukleinsyrepolymeren og 3'-enden av amplifikasjonsprimeren (A), eller den kan delvis overlappe amplif ika-sjonsprimeren på en slik måte at dens 3'-ende føyer seg sammen, minst ett nukleotid, men fortrinnsvis mer enn 3 nukleotider fra 5'-enden av målnukleinsyrepolymeren (B) . Sekvenseringsprimeren kan også falle helt og holdent innenfor amplif ikasj onsprimeren (C) eller være den samme som amplif ikasj onsprimeren (D) .

Valget av sekvenseringsprimer avhenger av formålet av analysen.

En primer som er forskjellig fra amplif ikasj onsprimeren vil øke spesifisiteten av sekvenser ingsreaksj onen fordi sekvensering av gale fragmenter som muligens produseres i amplif ikasj onsreak-sjonen unngås. Således foretrekkes en sekvenseringsprimer som er forskjellig fra amplif ikasj onsprimeren. På den annen side er mer forutgående informasjon med hensyn til sekvensen av det amplifiserte fragment nødvendig for å lage en slik primer.

Merkelappen eller markøren (label) for påvisning av fragmentene som produseres i sekvenser ingsreaksj onen kan innføres ved bruk av en merket sekvenseringsprimer. Merkelappen kan anordnes ved 5'-enden eller internt. Den kan være en isotop såsom <32>P, eller en fluorescerende gruppe, eller en hvilken som helst annen påvisbar merkelapp eller en gruppe som skaffer et sete for senere festing av en påvisbar merkelapp. Merkelappen kan også innføres ved bruk av deoksynukleotidderivater merket med en isotop såsom <35>S eller <32>P eller med fluorescerende eller andre påvisbare merkelapper. Merkelappdelen innlemmes i en slik mengde at den er innlemmet i stort sett all den nukleinsyre som er syntetisert, selv meget korte fragmenter.

Matriksen som bærer polynukleotidfragmentet suspenderes i en egnet oppløsning inneholdende sekvenseringsprimeren. Primeren blir fortrinnsvis tilsatt i lik eller overskytende molar-konsentrasjon til målpolynukleotidet. Primeren tillates å føye seg til målpolynukleotidet ved egnet temperatur og i en tilstrekkelig tid avhengig av størrelsen og mengden av primeren som anvendes. Det skal bemerkes at når begge tråder av målpolynukleotid er modifisert og bundet til forskjellige affinitetsmatrikser, som kan være fysisk separert fra hinannen og håndtert nå som én, blir to forskjellige sekvenseringsprimer e anvendt.

Dersom der anvendes en af f initetsma triks som lar seg dele opp, såsom perler, er det bekvemt å dele opp prøven etter sammenføy-ning av primeren i fire deler for de individuelle sekvenser-ingsreaks joner. Dersom en aff initetsma triks som ikke lar seg dele opp anvendes, såsom en mikrotitrasjonsbrønn, blir fire parallelle reaksjoner fremstilt på affinitet-oppfangingstrinnet. Det er også mulig å utføre de fire reaksjoner i rekkefølge på den samme bærer ved eluering av produktet fra hver reaksjon før den neste utføres. I visse tilfeller blir nok informasjon oppnådd ved bruk av bare en, to eller tre reaksjoner. F.eks., dersom en genetisk defekt er kjent for å oppstå fra en punktmutasjon ved et enkelt spesifikt sete som normalt er C, kan det være tilstrekkelig å kjøre bare C-reaksj onene da den faktiske indentitet av et ikke-C nuklein-syreresiduum på dette punkt ikke er nødvendig. Det relevante faktum er at residuet er ikke-C.

Etter sammenføyning blir et polynukleotidsyntetiserende enzym såsom E. coli DNA-polymerase I eller T7 DNA-polymerase og blandinger inneholdende de kjedeavsluttende dideoksy-nukleotider, deoksynukleotider og dersom umerkede primere ble anvendt, merkede deoksynukleotider tilsatt ved egnede forhold som avhenger av det enzym som anvendes og av målets størrelse. Polymerisasjonsreaksjonen tillates å skride frem i en tid som er tilstrekkelig for å oppnå stort sett fullstendig fordeling av fragmentstørrelser ved en temperatur som avhenger av enzymet og betingelsene som anvendes. Til slutt blir en oppfølgings-reaksjon (chase reaction) med deoksynukleotider utført for å fullføre syntesen av de polynukleotidtråder som ikke er blitt avsluttet. Reaksjonen blir deretter stanset.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan af f initetsmatriksen vaskes på dette stadium for å fjerne komponentene av sekvenser ingsreaksj onen. Sammensetning av blandingen kan også således forandres for å oppnå de mest gunstige betingelser for analysen av de syntetiserte fragmenter. Dersom begge tråder var modifisert og bundet til to forskjellige af f initetsmatrikser blir matriksene separert fysisk på dette stadium, f.eks. ved et magnetfelt. Mål-DNA gjøres enkelttrådet og de syntetiserte fragmenter fra de fire sekvenser ingsreaksj oner separeres ved elektroforese eller en annen egnet metode. I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan aff initetsmatriksen fjernes før elektroforese, eller når affinitetsmatriksen er en mikropar-tikkel kan den lastes sammen med prøven inn i åpningene (slots) i gelen for elektroforesetrinnet. Dette gir en fordel i håndtering av prøven. I elektroforesetrinnet blir størrelse-fordelingen av fragmentene analysert. Det eks jonsmet oden kan variere avhengig av den merkelapp som anvendes. Med isotoper blir gelen preparert ved fiksering og tørking og eksponert for en røntgenfilm i henhold til standardmetoder. Med fluorescerende merkelapper blir fragmentene påvist ved bruk av automatisk utstyr utviklet for dette formål. Størrelsefor-delingen av polynukleotidfragmentene produsert ved sekvenseringsreaksjonen gir et mønster som kalles en "sekvenseringsstige", hvilket gir nukleotidsekvensen av målpolynukleotidet.

Reagenser for bruk ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan pakkes i form av en utstyrspakke (kit) .

F.eks. utstyrspakker kan fremstilles som omfatter pakkede kombinasjoner av én eller flere amplifikasjonsprimere som innbefatter festedeler og de tilsvarende faste bærere. Pakker kan også fremstilles som dessuten innbefatter en sekvenseringsprimer eller et referanseorgan for å sammenligne den sekvens som bestemmes av nukleinsyrepolymeren med sekvensen av en standard. Eksempler på referanseorganer omfatter pakkeinnskudd som viser den sekvenseringsstige som fås fra sekvensering av standarden eller en prøve av selve standarden. Dersom standarden leveres, har den fortrinnsvis en festedel festet til seg slik at den kan håndteres på en lignende måte som målet for sekvensering.

Arrangementet med reagensene inne i beholdere i utstyrspakken vil avhenge av de spesifikke reagenser som er involvert. Selvsagt kan hver reagens pakkes i en individuell beholder, men forskjellige kombinasjoner kan også være mulig. F.eks., dersom festedelen og festesetet som anvendes ikke vil binde seg til hinannen under amplifikasjonsreaksjonens betingelser, kan begge skaffes i en enkelt beholder. Dette kan være tilfelle, f.eks. dersom en koblingsdel ble benyttet.

Den foreliggende oppfinnelse skal belyses nærmere med de følgende eksempler som ikke er ment å begrense oppfinnelsens omfang.

Eksempel 1

Bestemmelse av nukleotidsekvensen av et biotinylert cytomegalovirus DNA-fragment immobilisert på avidin-mikropartikler.

Syntese av primerene

Primerene ble syntetisert på et Applied Biosystems 38 IA DNA-synteseapparat ved metoksyfosforamiditt-metoden. Primerene (betegnet 25A og 25B) var 25-merer med den følgende nukleotidsekvens:

En 5'-terminalaminogruppe ble satt til 25A-primeren som det siste trinn i syntesen ved bruk av aminolink-II-reagensen (Applied Biosystems, P/N 400808) . Aminogruppen ble biotinylert med sulfo-NHS-biotin (Pierce Cehmical Co.). Det biotinylerte oligonukleotid ble renset ved HPLC på en reversfase C-18-kolonne.

Mål- DNA

Mål-DNAet var et fragment av den lange unike region av genomet av cytomegalovirus (CMV) ved kartposisjon 0,30-0,35, d.v.s. ved 12,2 kb Hind 11 IL-fragmentet av AD 169 CMV DNA(ATC VR-538) klonet i pATl53-vektoren. Målplasmidet ble linearisert med restriksjonsenzymet EcoRI. Primerene flankerer en 115 bp region i CMV Hind IIIL-fragmentet.

Gjentatt replikasionsreaksion- amplif ikasion

Biotin ble innført i et 165 baseparfragment av CMV DNA ved 25 sykluser med amplifikasjon ved den gjentatte replikasjonsreaksjon ved bruk av den 5'-biotinylerte primer 25A og den umodifiserte primer 25B. Amplif ikasj onen ble utført med 3 x IO<5> molekyler av det lineariserte CMV Hind HIL-fragment, 100 pmol hver av primerene, 200 /zM hver av de fire mono-nukleosidtrif osf ater (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) i 100 /il av en oppløsning av 10 mM Tris-HCl, pH 8,35, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2 og 0,1 mg/ml gelatin i 0,5 ml eppendorfrør under et lag av tyktflytende parafin. Mål-DNAet ble kokt i 5 min. i reaksjonsblandingen for å gjøre det enkelttrådet, hvoretter 2U av Thermus aquaticus DNA-polymerase (New England Biolabs) ble tilsatt. Rørene ble deretter behandlet i 25 sykluser som følger: Primersammenføying ved 55°C i 1 min., forlengelse av primerene ved 72°C i 3 min., denaturering av templaten ved 95°C i 1 min. og 15 sek.

Oppfan<g>ina av det biotinylerte am<p>lifiserte

DNA på avidin- belaate <p>olystyrenpartikler

En 25 fj. 1 prøve som inneholdt ca. 10<10> molekyler, dvs.

0,02 pmol, av det amplifiserte DNA-fragment som var dobbelttrådet og inneholdt et 5'-biotin i en tråd ble samlet opp fra reaksjonsblandingen ved inkubasjon med 5 /il av en 5% oppløsning av avidin-belagte polystyrenpartikler (0,8 /im Pandex Laboratories) i 1 time ved værelsetemperatur. Perlene ble

samlet opp ved sentr ifugering i en eppendorf sentrifuge i 3 min. og vasket tre ganger ved svirring med 1 ml f osf atbuf f ret saline (PBS) , pH 7,5 inneholdende 0,1% triton-X-100 fulgt av sentrifugering som angitt ovenfor. Det bundne DNA ble denaturert ved

behandling med 200 /il 0,15 M NaOH i 15 min. ved 37°C, partiklene ble samlet opp og vasket to ganger med 1 ml 0,1% triton-X-100 og tilslutt en gang med 1 ml 0,01% triton-X-100.

Sekvensering av det immobiliserte DNA- fragment

Mikropartiklene som bar DNA-fragmentet ble suspendert i 10 /il 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 100 /ig/ml bovinserumalbumin inneholdende 0,06 - 0,08 pmol av 5B-primeren. Primeren ble tillatt å sammenføye i 10 min. ved 55°C fulgt av 30 min. ved 37°C. Deretter ble 2 /il av <35>S-merket dCTP (600 Ci pr. mmol; Amersham) og 1 /il (5 enheter) E. coli DNA-polymerase

(Klenowfragmentet; Boehringer Mannheim) tilsatt. Suspensjonen ble delt opp fire reagensrør, 2,5 /ul i hvert, for de individuelle sekvenser ingsreaksj oner. 2 /xl av deoksy- og dideoksy-nukleotidblandinger ble tilsatt for å gi de følgende endelige konsentrasj oner: A-reaksjon: 125 /iM dGTP, dTTP, 16 /xM dATP, 250 /xM ddATP C-reaksjon: 125 /xM dGTP, dTTP, dATP, 20 /xM ddCTP

G-reaksjon: 125 /xM dTTP, dATP 16 /xM dGTP, 200 /xM ddGTP T-reaksjon: 125 /xM dGTP, dATP 16 /xM dTTP, 500 /xM ddTTP.

Reaksjonen ble tillatt å skride frem i 20 min. ved værelsetemperatur. Deretter ble 2 /il av en 2 mM oppløsning av de fire dNTPer tilsatt og oppfølgingsreaksjonen ble tillatt å skride frem i 20 min. ved værelsetemperatur. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 4 /il 95% formamid, 20 mM EDTA, 0,05% bromfenolblått, 0,05% xylencyanol. Prøvene ble varmet opp i 3 min. ved 98°C. Rørene ble sentrifugert og 3 /xl av super-natanten ble lastet på en 8% polyacrylamid-sekvenseringsgel. Prøvene ble underkastet elektroforese, gelen fjernet, fiksert og eksponert for en røntgenfilm i henhold til standard fremgangsmåte. Etter utvikling ble klare sekvenseringsstiger observert.

Eksempel 2

Hele fremgangsmåten ble utført på nøyaktig samme måte som i Eksempel 1, bortsett fra at prøvene fra sekvenseringsreaksjonen ble lastet direkte på gelen uten forutgående fjerning av mikropartiklene. Sekvenseringsstiger identiske med dem i Eksempel 1 ble oppnådd.

Eksempel 3

I dette eksempel ble <32>P-merkede primere anvendt i sekvenser-ingsreaksjonene. Fremgangsmåten ble utført som i Eksempel 1 med de følgende unntagelser: Sekvenseringsprimeren (25B) ble merket ved bruk av gamma-<32>P-ATP og polynukleotidkinase i henhold til en standard fremgangsmåte. 2 pmol av oligonukleotidprimer og 14 pmol av gamma-<32>P-ATP (> 5000 Ci pr. mmol, Amersham) ble brukt for hver marker-ingsreaksjon. Primere med spesifikke aktiviteter på IO<7> cpm pr. pmol ble oppnådd.

For sekvenser ingsreaksj onen ble mikropartiklene som bar ca. 0,02 pmol av det amplifiserte DNA-fragment suspendert i sekvenseringsbufferen (se Eksempel 1) inneholdende 0,1 pmol av den merkede 25B-primer. Primer-sammenføyingsreaksjonen var som 1 Eksempel 1. Deretter ble 1 /il (5 enheter) DNA-polymerase tilsatt og suspensjonen ble delt opp i fire deler, 2,5 /il hver. 2 fil deoksy- og dideoksynukleotid-blandinger ble tilsatt for å gi de følgende endelige konsentrasjoner: A-reaksjon: 125 /iM dCTP, dGTP, dTTP, 16 /iM dATP og 250 /iM ddATP C-reaksjon: 125 /iM dATP, dGTP, dTTP, 16 nK dCTP og 80 /iM ddCTP G-reaksjon: 125 /iM dATP, dCTP, dTTP, 16 /iM dGTP og 200 /iM ddGTP T-reaksjon: 125 /iM dATP, dCTP, dGTP, 16 iiM dTTP, 500 /iM ddTTP.

Kjedeavslutnings- og oppfølgingsreaksjonene samt en analyse av de produserte fragmenter ble utført som i Eksempel 1. Klare sekvenseringsstiger ble oppnåd også i dette eksempel.

Eksempel 4

I dette eksempel var amplif ikasj onsprimeren og sekvenseringsprimeren som ble anvendt ikke identiske. Sekvenseringsprimeren var anordnet ved en avstand på 78 baser fra amplif ikasj onsprimeren i retning av den biotinylerte 5'-ende av det amplifiserte fragment.

Amplifikasjonen ble utført med den biotinylerte primer 25A og en 25-mer primer, angitt som 25C, med den følgende sekvens: 5'-CAG GGT CAC TGA CAA CAG CCG CCC T. Primerene 25A og 25C flankerer en 209 bp-sekvens i CMV-genomet.

Amplifikasjon- og oppfangingsmetodene var som beskrevet i Eksempel l. Primeren 25B ble merket med <32>P og anvendt som sekvenseringsprimer ved de betingelser som er beskrevet i Eksempel 3. Den oppnådde sekvens var identisk med den som ble oppnådd i Eksempel 3.

Eksempel 5

Alle prosesser ble utført som i Eksempel 1 med unntagelse av affinitet-oppfangingstrinnet. I dette eksempel ble magnetiske perler anvendt som aff initetsmatriksen. Perlene var 2 /im i diameter og hadde en paramagnetisk kjerne med et sfærisk polystyrenskall belagt med streptavidin. Perlene (Dynabead 280-Streptavidin) ble skaffet fra Dynal, Norge. Før bruk ble perlene vasket en gang med fosfatbuffret saline (PBS).

Som i Eksempel 1 ble 25 /il av prøven inneholdende det amplifiserte DNA-fragment analysert. 5 fil av en 4% suspensjon av de magnetiske perler i PBS ble tilsatt, og oppf angingsreaksj onen ble tillatt å skride frem i 30 min. ved 37°C i eppendorf rør i en roterende mikser. Perlene ble separert fra oppløsningen i 1 min. ved bruk av en standard laboratoriemagnet og oppløsningen ble kassert. Perlene ble vasket tre ganger med 1 ml PBS ved svirring fulgt av magnetisk separasjon som angitt ovenfor. Det bundne DNA ble denaturert ved behandling med 200 /il 0,15 M NaOH i 15 min. ved 37°C. Perlene ble samlet opp og vasket to ganger med PBS og en gang med 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM MgCl2, 50 mM NaCl. Sekvenseringen av det immobiliserte DNA-fragment var som i Eksempel 1.

Eksempel 6

Amplif ikasjon- og oppf angingsmetodene ble utført som i Eksempel 1. I dette eksempel ble den annen tråd av det amplifiserte DNA-fragment som ble oppnådd ved denatureringstrinnet sekven-sert.

Den 200 /xl 0,15 M NaOH- super nat ant inneholdende DNA-tråden eluert fra aff initetsmatriksen ble nøytralisert ved tilsetning av 20 ul, 1, 5 M eddiksyre og 12 /xl 3 M natriumacetat (pH 7). DNA ble utfelt med etanol og oppløst i 10 /xl sekvenserings-buffer (se Eksempel 1) inneholdende sekvenseringsprimeren. Sekvenseringsmetoden ble utført med de betingelser som er angitt i Eksempel 1. Klare sekvenseringsstiger ble igjen oppnådd.

Eksempel 7

Identifisering av genetisk polymorfisme av apolipoprotein E ved sekvensering av immobilisert biotinylert apolipoprotein E DNA-fragment er .

Dette eksempel er gitt for å vise hvor bekvem fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er for diagnose av genetiske sykdommer. Metoden ble anvendt til analyse av den genetiske variasjon av apolipoprotein E (apo E) . Dette protein spiller en viktig rolle i lipoproteinmetabolismen. Tre vanlige isoformer av apo E (E2, E3 og E4) som kodes for ved tre forskjellige alleler (c2, c3 og c4) eksisterer i befolkningen. Den genetiske variasjon av disse alleler skyldes enkeltbasesubstitusjoner ved aminosyreseter 112 og 158.

Den genetiske polymorfisme av apo E kan forklare så meget som 10% av den individuelle variasjon av serumkolesterolnivåer og er således av stor klinisk betydning.

Syntese av primerene

Fire primere (Pl - P4) ble syntetisert på et Applied Biosystems 3 8 IA DNA-syntetiseringsapparat. Nukleotidsekvensen av primerene og deres anordning (gitt som nukleotidnumre) på apolipoprotein-E-genet (Apo E) var:

En 5' -aminogruppe ble føyet til primeren P2 med aminolink-II-reagensen (Applied Biosystems) . Aminogruppen ble biotinylert ved bruk av sulfo-NHS-biotin (Pierce Chemical Co.) og renset ved reversfase HPLC. Sekvenseringsprimeren (P3) ble merket med [gamma-<32>P]dATP og T4-polynukleotidkinase til en spesifikk aktivitet på 4 x IO<6> cpm pr. pmol.

DNA- prøvene

Prøver av venøst blod ble oppnådd fra pasienter med kjent Apo E-fenotype som var pasienter ved Lipid Polyklinikk ved Helsinkiuniversitets Sentralhospital. Leukocyttisk DNA ble ekstrahert i henhold til standardmetoder.

Amplif ikasion

DNA (100 ng pr. prøve) ble amplifisert med Pl- og P4-primerene (endelig konsentrasjon 1 /xM) i 100 /xl av en oppløsning på 0,2 mM hver av dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 15mM (NH)4S04, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Tween 20, 0,1 mg/ml gelatin og. 2,5 enheter Thermus aquaticus DNA-polymerase (Promega) i et DNA termisk syklusapparat (Perkin-Elmer/Cetus) i 25 sykluser på 1 min. ved 96°C og 2 min. ved 65°C. En liten porsjon (3 /xl av en 1:100 fortynning) av denne første amplifikasjonsblanding ble overført til en annen amplif ikas jon. Denne annen amplif ikas jon ble utført med de betingelser som er beskrevet ovenfor og dirigert ved et par sammenpassede (nested) primere hvorav en var biotinylert (biotynylert P2 og P3) .

Affinitet- oppsamling av det biotinylerte amplifiserte a<p>o E DNA

på avidin- belagte <p>olystyrenpartikler

En 25 /xl porsjon av den annen amplif ikas jonsblanding ble fortynnet til 50 fil med 0,15 M NaCl, 20 mM Na-fosfatbuffer, pH 7,5 (PBS), hvoretter 5 /xl av en 5% (w/v) suspensjon av avidin-belagte polystyrenpartikler (0,8 /im, Baxter Healthcare Corp.) ble tilsatt. Prøvene ble holdt på 20°C i 1 time. Partiklene ble samlet opp ved sentrifuger ing i 2 min. i en eppendorf-sentrifuge og ble vasket to ganger ved svirring med 1 ml 15 mM NaCl, 1,5 mM Na-citrat og to ganger med 1 ml 0,1% Tween 20 i PBS. Partiklene ble behandlet to ganger med 0,15 M NaOH i 15 min. ved 37°C, fulgt av to vaskinger med 0,1% Tween 20 i 50 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 og en endelig vask med 0,01% Tween 20 i 50 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, pH 7,5.

Nukleotidsekvenserina av det immobiliserte DNA- fragment

Partiklene som bar DNA-templaten ble suspendert i 10 fil 50 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 inneholdende 0,5-1 pmol av sekvenseringsprimeren P2 eller P3. Rørene ble varmet opp ved 65°C i 2 min. og tillatt å avkjøle langsomt til værelsetemperatur. Én fil av 0,1 M ditiotreitol, 2,5 fil av H20 og 2 ul (3,25 enheter) av T7 DNA-polymerase (Sequenase™ United States Biochemical Corp.) ble tilsatt og rørene ble holdt på 22°C i 3 min. Én porsjon (3,5 fil) av reaksjonsblandingen ble overført til fire rør inneholdende 2,5 fil kjedeavslutningsblanding (80 /iM dNTP, 8 /iM ddNTP for A- og T-reaksjonene, 320 /iM dNTP, 8 /im ddNTP for C- og G-reaksjonene) . Rørene ble inkubert ved 42°C i 6 min. og reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 4 fil av en oppløsning inneholdende 95% formamid, 20 mM EDTA, 0,05% bromfenolblått og 0,05% xylencyanol. Prøvene ble varmet opp ved 80°C i 2 min. og partiklene ble spunnet ned over en periode på 2 min. Produktene av kjedeavslutningsreaksjonene ble kjørt på 6% sekvenseringsgeler. Elektroforesen ble utført og gelen ble behandlet i henhold til standard fremgangsmåter. De riktige alleler ble identifisert fra sekvenseringsstigene som ble oppnådd. I heterozyge prøver ble begge alleler identifisert og lagt oppå sekvenser ings-stigene ved posisjonen for nukleotidvariasjonen.

Claims (28)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av sekvensen av en målnukleinsyrepolymer, hvor en prøve inneholdende målnukleinsyrepolymeren kombineres med en blanding av nukleosidtrif osf ater, en nukleinsyrepoly-merase, og første og andre amplifikasjonsprimere, hvor hver amplifikasjonsprimer omfatter et oligonukleotid som har et område som er komplementært med og hybrid i ser er med en forskjellig tråd av målnukleinsyrepolymeren og er virksom som en primer for nukleinsyrepolymerisasjon ved nukleinsyrepoly-merasen for dannelse av en amplif ikas jonsblanding, idet den første amplif ikasj onspr imer ytterligere omfatter en første festedel som er bundet til oligonukleotidet, og; amplif ikasj onsblandingen gjentatte ganger bringes til å gjennomgå en syklus mellom en første betingelse under hvilken DNA-polymerisasjon finner sted og en annen betingelse under hvilken denaturering av dobbelttrådet DNA til enkelttrådet DNA finner sted i et antall sykluser som er tilstrekkelig til å produsere kopier av målnukleinsyrepolymeren i en mengde som er egnet til bruk i en DNA-sekvenseringsmetode for dannelse av en amplifisert prøve omfattende kopier av målnukleinsyresekvensen bundet til festedelen, karakterisert ved at (a) man setter til den amplifiserte prøve en rekke første bærere, som hver omfatter en fast matriks og et første festesete som kan immobilisere én tråd av målnukleinsyrepolymeren ved hjelp av den første festedel, (b) de første festeseter tillates å samvirke med de første festedeler slik at kopiene av målnukleinsyren i den amplifiserte prøve immobiliseres på de første bærere, (c) de immobiliserte nukleinsyrer separeres fra amplif ikasj onsblandingen, (d) den amplifiserte nukleinsyreprøve denatureres for dannelse av enkelttrådede nukleinsyrer, og (e) sekvensen av de enkelttrådede nukleinsyrer bestemmes.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at trinnet å denaturere den amplifiserte prøve utføres før immobilisering av kopiene av målnukleinsyren på bæreren.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at sekvensen av de enkelttrådede immobiliserte nukleinsyrer bestemmes ved bruk av en kj edeavs lutningsmetode.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den første festedel og det første festesete er komponenter av et aff initetspar.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at affinitetsparet velges fra gruppen bestående av biotin/avidin, biotin/streptavidin, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, hapten/antistoff og metall/chelat.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den annen amplif ikasj onspr imer omfatter en annen festedel som er forskjellig fra den første festedel.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at den ytterligere omfatter det trinn å sette til den amplifiserte prøve en rekke andre (second) bærere som omfatter en bærermatriks og et andre festesete som kan immobilisere én tråd av målnukleinsyrepolymeren ved hjelp av den annen festedel.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at den annen festedel og det annet festesete er komponenter av et aff initetspar.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at af f initetsparet velges fra gruppen bestående av biotin/avidin, biotin/streptavidin, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, hapten/antistoff og metall/chelat.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at at de nevnte første og andre bærere foreligger samtidig i den amplifiserte prøve og velges slik at de er fysisk separerbare fra hinannen.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at en av de nevnte første og andre bærere er magnetisk.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at én eller begge de nevnte første og andre bærere er en målepinne (dipstick) .

13. Utstyrspakke for å utføre fremgangsmåte ifølge krav 1 til betemmelse av rekkefølgen av en målnukleinsyrepolymer, karakterisert ved at den omfatter, i en pakket kombinasjon (a) en første amplif ikasj onsprimer omfattende et oligonukleotid som er komplementært med og hybridiserer med et parti av målnukleinsyrepolymeren og som er virksom som en primer for enzymatisk nukleinsyrepolymer isas jon og en første festedel, og (b) en rekke første bærere, som hver omfatter en fast matriks og minst ett festesete som kan immobilisere oligonukleotidet av amplif ikas jonsproben ved hjelp av den første festedel; og eventuelt ytterligere omfatter en sekvenseringsprimer hvor sekvenseringsprimeren er et oligonukleotid valgt blant oligonukleotider som er komplementære med i det minste et parti av amplif ikasj onsprimeren og oligonukleotider som er komplementære med et parti av målnukleinsyrepolymeren som er anordnet mellom 3'-enden av amplifikasjonsprimeren og et område av interesse i målnukleinsyrepolymeren.

14. Pakke som angitt i krav 13, karakterisert ved at den første festedelen og det første festesetet er komponenter av et affinitetspar.

15. Pakke som angitt i krav 14, karakterisert ved at aff initetspar et er valgt fra gruppen bestående av biotin/avidin, biotin/streptavidin, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, hapten/antistoff og metall/chelat.

16. Pakke som angitt i krav 13, karakterisert ved at festedelen ikke danner en binding direkte med festesetet, ytterligere omfattende en koblingsdel valgt slik at den danner en binding mellom festedelen og festesetet.

17. Pakke som angitt i krav 13, karakterisert ved at sekvenseringsprimeren ytterligere omfatter en detekterbar markør.

18. Pakke som angitt i krav 13, karakterisert ved at den ytterligere omfatter et referanseorgan for å sammenligne den sekvens som bestemmes på målnukleinsyrepolymeren med sekvensen på en standard.

19. Pakke som angitt i krav 18, karakterisert ved at ref er anseor ganet er et pakke-innskudd som viser den sekvenserings stige som fås fra sekvensering av standarden.

20. Pakke som angitt i krav 18, karakterisert ved at referanseorganet er en prøve av standarden.

21. Pakke som angitt i krav 13, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en annen amplif ikasj onspr imer som omfatter et oligonukleotid som er komplementært med og hybridiserer med et parti av den annen tråd av målnukleinsyrepolymeren og som er virksomt som en primer for enzymatisk nukleinsyrepolymerisasjon og en annen festedel som er forskellig fra den første festedel, og en rekke andre bærere som hver omfatter en fast matriks og minst ett festesete som kan immobilisere oligonukleotidet av amplifika-sjonsproben ved hjelp av den annen festedel.

22. Pakke som angitt i krav 21, karakterisert ved at den andre festedelen og det andre festesetet er komponenter av et aff initetspar.

23. Pakke som angitt i krav 22, karakterisert ved at af f initetsparet er valgt fra gruppen bestående av biotin/avidin, biotin/streptavidin, poly-dA/poly-dT, poly-dG/poly-dC, hapten/antistoff og metall/chelat.

24. Pakke som angitt i krav 21, karakterisert ved at den ytterligere omfatter et referanseorgan for å sammenligne den sekvens som bestemmes på målnukleinsyrepolymeren med sekvensen av en standard.

25. Anvendelse av fremgangsmåten som angitt krav 1, for å bestemme minst én potensiell nukleotidvariasjon i målnukleinsyrepolymeren .

26. Anvendelse av fremgangsmåten som angitt i krav 1, for rettsmedisinsk analyse eller for analyse av arvelige til-bøyeligheter eller sykdommer.

27. Anvendelse av fremgangsmåte i henhold til krav 1 som angitt i krav 25 eller 26, hvori nukleotidvariasjonen er en somatisk mutasjon.

28. Anvendelse av fremgangsmåten som angitt i krav 1 for seleksjon av celler og stammer eller arter for foredling av planter eller oppdrett av dyr eller for seleksjon av mikroorganismer som oppviser en ønskelig genotype.