JP2004532026A - P450単一ヌクレオチド多型バイオチップ分析 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
発明の分野
本発明は、全般に、新規プローブを使用するP450遺伝子の単一ヌクレオチド多型(SNP)の決定のための新規方法および組成物、およびP450SNP検出の特異性および効率を改善する方法を指向する。この発明は、1つのアッセイのP450SNPプローブの独特の集合物を提供し、これは種々のアレイプラットフォーム、7つのP450遺伝子のそれぞれの特異的増幅のためのプライマー配列、およびアンプリコンコントロールプローブ上で実施し、意図されるP450遺伝子標的が首尾良く増幅されたかいなか評価できる。
【0002】
発明の背景
体内の薬物代謝の基本的目的は、薬物をより水溶性とし、それにより尿または胆汁中容易に分泌されるようにすることである。薬物を代謝する1つの共通のやり方は、チトクロムP450酵素による、親分子の官能基の変化(例えば酸化)に関係する。これらの酵素は、肝臓中に卓越して見出される。チトクロムp450酵素は、多くの薬物代謝経路並びにコレステロール、ステロイドおよび他の重要な脂質、例えばプロスタシクリンおよびトロンボキサンA2を作成するために使用される経路に関係する。多くの薬物相互作用は、チトクロムP450酵素の阻害または誘導の結果である。
【0003】
哺乳動物チトクロムP450遺伝子は、内生および外生化合物の酸化的代謝において活性である、ヘムタンパク質のスーパーファミリーをコードする。チトクロムP450(CYPという)は現在、アミノ酸類似性に基づいて;40%より大きい類似性を示すファミリーチトクロム内P450、およびサブファミリー内で55%より大きい類似性に分類される。チトクロムP450酵素を、文字「CYP」、次いで数字、文字および他の数字によって命名される(例えばCYP2D6)。ヒトでは、20より多い異なるCYP酵素が存在する。コンパイルの結果、チトクロムP450 2C酵素サブファミリーは、36の明瞭な遺伝子および偽遺伝子を含み、そして現在までに同定された最大のチトクロムp450サブファミリーである。哺乳動物チトクロムP450遺伝子は、転写のレベルで一次的に調節されることが一般に受け入れられ、そして転写を調節する要因について知られる情報はほとんどない。
【0004】
p450酵素には、広範の多型(例えば突然変異)が存在し、これらの多型の多くは、酵素活性の阻害または誘導という結果となる(またはそれと連関する)。これらの多型は頻繁に、人種的集団に発生する。この点についてもっとも詳細に研究されたチトクロムP450遺伝子は、チトクロムP450 2D6という、デブリイソキンヒドロキシラーゼ遺伝子、およびチトクロムP450 32C19であって、これはS−メフェントシンヒドロキシラーゼをコードする。種々の他のP450酵素は、発現レベルの変異を示す。例えば、チトクロムP450 3A4という、ヒト肝臓に存在する主要なチトクロムP450は、タンパク質およびmRNAレベルの両方で数倍範囲にわたる変化をする。加えて、P450酵素の多くは、バルビツール酸系催眠薬、抗生物質等を含む種々の薬物による誘導の対象となる。
【0005】
本発明で特に興味深いのは、CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2C19、CYP3D6、CYP2E1およびCYP3A4である。CYP2D6は、詳細に研究され、というのは、白人のおおむね7ないし10パーセントはCYP2D6によって代謝される薬物の不全代謝者であるからである。通常のCYP2D6活性を有する患者は、多量代謝者と呼ばれ、アジア人およびアフリカ系アメリカ人は、白人より不全代謝者である傾向が少ない。不全代謝者は、薬物蓄積およびこの酵素によって代謝された薬物由来の毒性のリスクがある。たった2ないし6パーセントの総肝臓チトクロームP450がCYP2D6であるが、臨床的に有用な投薬のほとんど25パーセントは、この酵素によって代謝される。CYP2D6基質の不全代謝者は、CYP2D6によって代謝される投薬由来の増加された毒性のリスクがある。逆に、活性メタボライトの形成が薬物作用に必須であるとき、CYP2D6の不全代謝者は、多量代謝者と比較して薬物治療により応答をしめすことができない。約15パーセントの臨床的に使用される投薬は、CYP1A2によって代謝され、そしてそれはタバコおよび他の多環式芳香族炭化水素によって誘導されるCYPのみである。
【0006】
CYP2E1は、比較的小フラクションの投薬を代謝し(それは、アセトアミノフェノンの代謝において重要な役割を有するが)、それは毒素の活性化および不活性化において重要な役割を演ずる。それはエタノールによって誘導可能であり、そして基本的に小有機性分子を代謝される。
【0007】
CYP3Aファミリーのメンバーは、ヒトで最も豊富かつ最も臨床的に重要なチトクロム酵素であり、CYP3A4は、最も普通の形態であり、そしてほとんどの薬物相互作用に最も広く関係する。CYP3A4ファミリーは、小腸に位置し、そして薬物に加えて、また体の内生ステロイドのほとんどを代謝する原因である。
【0008】
CYP2D6とともにCYP2C19はまた、遺伝的多型を示し、3パーセントの白人および20パーセントの日本人は該酵素を完全に欠く。これらの個体は、より頻繁かつより重度な不利な効果のリスクにあり、CYP2C19によって代謝される薬物の減少された排除のためである。
【0009】
こうして、特定のP450 SNPの検出は、診断投薬および分子生物学調査において、およびまた多くの薬物の作用の機構を理解するため重要であり、そして治療的に関連の表現型的変異の直接的原因および/または疾患素因でありそうである。
【0010】
正確なSNP検出は、SBEアッセイの良好な感度を要する。マイクロアレイ上のSNPの高度に平行的なスクリーニング2つの大きなハードルは:1)PCRによってSNPを横切るDNP領域を増幅し、反復可能なやり方で複合ヒトゲノム中の単一延期変異を検出する十分な感度および特異性を達成する必要性;および2)2倍体ヒトゲノムのホモ接合およびヘテロ接合アリル変異の間をあいまいでなく区別する可能性、である。アリル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブでのディファレンシャルハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ形式で最も普通に使用される(Pastinen et al., Genome Research 2000)。感度の要求(すなわち低検出限界)は、分析前の特異的核酸配列を指数間数的に増幅することを研究者に可能とする、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および他の増幅技法の開発によって大きく省略された(レビューのために、Abramson et al., Current Opinion in Biotechnology, 4;41-47(1993)参照)。SNP遺伝子座の、オリゴヌクレオチドアレイヘのその後のハイブリダイゼーションによる、マルチプレックスPCR増幅は、少なくとも何百のSNPを同時的に遺伝子型決定する正確且つ信頼できる方法であることが示された;Wang et al., Science, 280:1077(1988)参照;またSchafer et al., Nature Biotechnology 16:33-39(1998)参照。
【0011】
対照的に、特異性は、多くの現在利用可能な遺伝子プローブアッセイに問題が残る。プローブと標的の間の分子相補性の程度は、相互作用の特異性を規定する。プローブ、標的およびハイブリダイゼーション媒体の塩の濃度、反応温度、およびプローブの長さの変異は、プローブ/標的相互作用の特異性を変化または影響し得る。
【0012】
ミスマッチで標的から完全な相補性を有する標的を区別することは、ある状況下では可能であり得るが、これは一般に、伝統的な技法を使用して、非常に困難であり、なぜなら反応条件の小さい変異は、ハイブリダイゼーションを変化させるからである。標準的プローブでのミスマッチ検出のための新規実験的技法は、以下に詳細に規定するように、OLA、RCA、Invader(登録商標)、単一塩基伸長(SBE)法、アリルPCR、および競合的プローブ分析を含むがこれらに限定されない。SBEアッセイでは、ポリヌクレオチドプローブを、支持体に付着させ、そして標的DNAにハイブリダイズさせる。
【0013】
一般に、SBEアッセイのために、プローブセットは、プローブの3’末端のヌクレオチドが標的中のクエリー塩基とマッチまたはミスマッチのいずれかであるように設計される。もし塩基がマッチしハイブリダイズするならば、DNAポリメラーゼは、4種の標識されたターミネーターヌクレオチドの存在下、1塩基によって、プローブを伸長させるであろう。代替的に、3’塩基がミスマッチであるならば、DNAポリメラーゼは、プローブを伸長させない。こうして、標的中のSNPまたはクエリー塩基の同一性は、DNAポリメラーゼによって伸長されるプローブセットによって決定される。
【0014】
あるプローブは、内部幹−環構造(internal stem-loop strictires)を形成し、プローブの標的に依存しない自己伸長という結果となり、こうしてSNP塩基の決定を妨害する誤りの陽性のシグナルを生じる。本発明は、そのような問題に打ち勝つことを目的とする。
【0015】
よって、1または2以上の患者からのサンプルを評価するための組成物および方法を提供すること、存在する種々のP450酵素のレベルおよび/または遺伝子型を確認することが本発明の目的である。本発明の更なる目的は、P450 SBEアッセイの感度および特異性を増加させることである。本発明は、増幅方法の組み合わせ、および標的の不存在下での捕捉プローブの自己伸長を防止するための方法を使用し、それによって誤りの陽性結果の発生を減少させる。
【0016】
発明の要約
上記概説目的にしたがって、本発明は、CPY1A1をコードする核酸のセンス鎖の一部に実質的に相同な、少なくとも1の捕捉プローブを含むアレイを含む固体基質を含むバイオチップであって、少なくとも1の捕捉プローブが、CPY1A2をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同であり、少なくとも1の捕捉プローブがCPY1B1をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同であり、少なくとも1の捕捉プローブがCPY2C19をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同であり、少なくとも1の捕捉プローブがCYP2D6をコードするセンス鎖の第1部分に実質的に相同であり、少なくとも1の捕捉プローブがCYP2E1をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同であり、そして少なくとも1の捕捉プローブが、CPY3A4をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同である、バイオチップを提供する。
【0017】
加えて、本発明は、CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、およびCYP3A4からなる群より選択される少なくとも1の標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、該方法はCPY1A1をコードする核酸の第1部分に実質的に相同な少なくとも1の第1捕捉プローブ、ここで該第1捕捉プローブは検出位置に直接隣接し、またはその末端に含み、CPY1A2をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1の第2捕捉プローブ、ここで該第2捕捉プローブは検出位置に直接的に隣接し、またはその末端に含み、CPY1B1をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1の第3捕捉プローブ、ここで該第3捕捉プローブは検出位置に直接隣接し、またはその末端に含み、CPY2C19をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1の第4捕捉プローブ、ここで該第4捕捉プローブは検出部分に直接的に隣接しまたはその末端に含み、CPY2D6をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1の第5捕捉プローブ、ここで該第5捕捉プローブは検出部分に直接的に隣接しまたはその末端に含み、CPY2E1をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1の第6捕捉プローブ、ここで該第6捕捉プローブは検出部分に直接的に隣接しまたはその末端に含み、CPY3A4をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1の第7捕捉プローブ、ここで該第7捕捉プローブは検出部分に直接的に隣接しまたはその末端に含み、を含むアレイを提供することを含む方法を提供する。該方法はさらに、少なくとも1の標的配列を、その対応する捕捉プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成すること、もしdNTPが検出位置に完全に相補的であるならば、該dNTPが捕捉プローブに付加し、伸長されたプローブを形成するような条件下で、ポリメラーゼおよび、標識を含む少なくとも1のdNTPを添加すること、当該伸長されたプローブの質問位置ヌクレオチドを決定することを含む。
加えて、本発明は、標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法を提供する。該方法は、捕捉プローブのアレイを含むハイドロゲル層を含む第1表面を有する固体支持体を含むアレイを提供すること、該標的配列を該捕捉プローブの少なくとも1つにハイブリダイズさせハイブリダイゼーション複合体を形成させること、および該検出位置のヌクレオチドを決定することを含む。
【0018】
加えて本発明は標的配列の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法を提供する。該方法は、非自己伸長プローブを形成し、その結果非自己伸長プローブの自己伸長が標的の不存在下で起こらないよう修飾された、少なくとも1の伸長プローブを含む第1表面を有する固体支持体を提供すること、(そしてここで、該非自己伸長プローブは質問ヌクレオチド含む)、該標的配列を非自己伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、該表面を、伸長酵素および、ハプテンを含む少なくとも1の鎖終結化ヌクレオチドと、該鎖終結化ヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション複合体中の非自己伸長プローブの3’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、該鎖終結化ヌクレオチドが該非自己慎重プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成するような条件下で接触させること、を含む。加えて本発明は、該修飾された伸長部ローブを、ハプテンの結合パートナーと接触させることを含み、ここで該結合パートナーは標識され、標識の存在を検出し、検出位置のヌクレオチドを決定する。
【0019】
加えて本発明は、標的配列の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、ランダムプライマーを使用して該標的DNAを増幅し、DNAアンプリコンを生成すること、該DNAアンプリコンを転写し、RNA標的配列を生成すること(インビトロ転写)、少なくとも1の伸長プローブを含む第1表面を有する固体支持体を提供すること、ここで該伸長プローブは、質問ヌクレオチドを含む、該RNA標的配列を該伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を生成すること、該表面を修飾された逆転写酵素および、ハプテンを含む少なくとも1の鎖終結化ヌクレオチドと、もし該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の再設計された伸長プローブの3’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、該鎖終結化ヌクレオチドが、該再設計された伸長プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成させる条件下で接触させること、該修飾された伸長プローブを、該ハプテンの結合パートナーと接触させることを含み、ここで該結合パートナーは標識され、該標識の存在を検出し、該検出位置のヌクレオチドを決定する。
【0020】
加えて本発明は、標的配列の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、少なくとも1の伸長プローブを含むハイドロゲル層を含む第1表面を有する固体支持体を含む第1表面を有する固体支持体を提供すること、ここで該伸長プローブは、該伸長プローブの3’末端の2塩基以内に質問ヌクレオチドを含む、該標的配列を、該伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成すること、該表面を、伸長酵素および、ハプテンを含む少なくとも1の鎖終結化ヌクレオチドと;もし該鎖停止したヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の伸長プローブの3’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、該鎖終結化ヌクレオチドを該伸長プローブに付加し、修飾された伸長プローブを形成する条件下で接触させること、該修飾された伸長プローブを、該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで該結合パートナーは標識され、そして該標識の存在を検出し、該検出位置のヌクレオチドを決定する、を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】図1は、SBE遺伝子型決定反応の2つの異なる構成を示す。図1Aにおいて、検出位置10を伴う標的5は、捕捉プローブ25にハイブリダイズされ、付着リンカー20を介して固体支持体15に付着される。該捕捉プローブはまた、SBE伸長プローブとして供する。図1B、検出位置10を伴う標的5の第1部分は、捕捉プローブ25にハイブリダイズされ、固体支持体15に、付着リンカー20を介して付着される。標的5の第2部分は、「サンドウィッチ型」アッセイのためのSBE伸長プライマー30にハイブリダイズされる。
【図2】図2Aは、典型的な単一塩基伸長(SBE)アッセイを示す。図2Bは、標的配列の不存在下でいかにプローブの自己伸長が、該捕捉プローブによって形成された幹−環構造のためにSBE反応で起こり、その結果誤りの陽性結果を生じ得るか示す。
【図3A】図3Aは、P450多型(SNP)および我々のアッセイ設計に含まれる遺伝子のそれぞれについての文献参照を記載するワークシートである。
【図3B】図3Bは、P450多型(SNP)および我々のアッセイ設計に含まれる遺伝子のそれぞれについての文献参照を記載するワークシートである。
【図3C】図3Cは、CYPアリルハプロタイプファミリーを記載するワークシートである。
【図3D】図3Dは、CYPアリルハプロタイプファミリーを記載するワークシートである。
【図4】図4は、CYP2D6ファミリーにおける遺伝子によって共有される相対的相同性を示す比較表を示す。対応するイントロンおよびエキソン間の比較並びにこれらの%類似性を示す。
【図5】図5は、現在増幅に使用される好ましいP450 PCRプライマーリストを示す。所望の標的遺伝子に特異的にプライマーを設計するために、該プライマーの3’末端に特に焦点がある、サブファミリー関連遺伝子に対する塩基対ミスマッチで、領域を選択した。この態様では、アニーリングハイブリダイゼーション特異性および該プライマーの3’末端からのヌクレオチドを伸長するPCRポリメラーゼの区別は、特異性を付与することによる。プライマー設計はさらに、19bpよりも大きい長さおよびGC含量の観点のバランスおよび対あたりのTmを制限する。すべてのプライマー候補を、BLASTアルゴリズムを、コンパイルされたP450配列ライブラリー(57遺伝子)に対して使用して分析し(相同性分析アルゴリズム)、任意の潜在性交差反応性プライマー候補を除去する。相同性分析に加えて、プライマー候補をまた、反復性配列のデータベースに対してスクリーニングした。
【図6A】図6Aは、現在のP450アッセイのためのチップ上の最終的P450プローブリストである。
【図6B】図6Bは、現在のP450アッセイのためのチップ上の最終的P450プローブリストである。
【図6C】図6Cは、現在のP450アッセイのためのチップ上の最終的P450プローブリストである。
【図6D】図6Dは、現在のP450アッセイのためのチップ上の最終的P450プローブリストである。
【図7】図7は、Beta Validation Performanceデータの要約およびこれらのプローブの識別可能性を示す。
【図8A】図8AないしEは、特定のSNPを同定するために設計されたプローブを示す。
【図8B】図8AないしEは、特定のSNPを同定するために設計されたプローブを示す。
【図8C】図8AないしEは、特定のSNPを同定するために設計されたプローブを示す。
【図8D】図8AないしEは、特定のSNPを同定するために設計されたプローブを示す。
【図8E】図8AないしEは、特定のSNPを同定するために設計されたプローブを示す。
【図9A】図9AないしBは、CYP遺伝子の関連清を示す。
【図9B】図9AないしBは、CYP遺伝子の関連清を示す。
【図10A】図10AないしCは、産物アンプリコン特性を要約する。
【図10B】図10AないしCは、産物アンプリコン特性を要約する。
【図10C】図10AないしCは、産物アンプリコン特性を要約する。
【図11】図11.ヒトチトクロムP450遺伝子のためのCodelink(登録商標)SNP Bioarray。
【図12】図12.プライマープレートにおけるプライマー対のレイアウト。
【図13】図13.マスターミックスおよびサンプルの、ミクロ遠心管への添加。
【図14】図14.反応混合物を、チャンバー内へ負荷することティップオリエンテーション。
【図15】図15.チャンバーポートへストリップをシールすることのオリエンテーション。
【図16】図16.Hybaid Omnislide熱ブロック上のスライド配置。
【図17】図17.塩基付加のための自己伸長の防止。プローブの長さを、プローブの3’末端の1または2以上の塩基によって増加させることは、幹−環構造の末端のミスマッチを創出する。DNAポリメラーゼは、該3’末端がミスマッチであるとき、プローブを伸長させず、そしてゆえに、自己伸長はない。
【図18】図18は、SBEアッセイにおける強い標的依存性自己伸長を示すプローブ配列の例を示す。予測された幹−環は下線を付す。
【図19】図19は、なし、1、2、または3つの塩基を、2WIAF−913.114.T.Aプローブの末端に付加する。1塩基の付加は、自己伸長シグナルを減少させるが、標的依存性シグナルを減少させなかった。このプローブは「再び対形成」され、そして正確にSNP塩基を応答させる(call)。2または3の追加的塩基の付加は、自己伸長を生じる新しい幹−環構造を創出した。追加的塩基が新しい自己伸長体を創出する頻度は、プローブ配列で変化する。該プローブの配列は、以下のとおりである:
【化1】 推定的幹-環構造は下線で示す。2WIAF−913.114 .1.T.A.のミスマッチ3’塩基に注目。
【図20】図20は、P450遺伝子ファミリーのための35このプローブの試みられた再設計からの結果である。不正確にSNP塩基を応答させた35個のプローブセットについて、1または2以上の塩基が、自己伸長プローブの3’末端に付加されたとき、23個(66%)のSNP塩基は、そのときの100%正確に応答させた。Pは、応答割合および正確性の産物である。P=1は、プローブセットが、そのときの100%正確にSNP塩基を応答させることを示す。
【図21】図21(A)は、標的配列中の相補的塩基に対応する、標識されたヌクレオチドを取りこむことによる標的依存性伸長を示す。XおよびYは、標的依存性シグナル生成への最小の影響を有する修飾された塩基であり、天然塩基との、これらの塩基対形成能力は、影響されない(B)。修飾された塩基対X、Yは効率的に、標的依存性伸長を抑制し、これらはお互いと安定的塩基対を形成できないからである。安定性の欠如のため、非伸長および誤りの陽性シグナルが、SBEアッセイで抑制される。
【図22】図22。修飾された核酸を使用し、本発明の好ましい実施態様で使用される新規プローブを合成する。この塩基対は効率的に、標的依存性伸長を抑制し、これらはお互いと安定的塩基対を形成できず、それは熱力学的に、自己折り畳み産物を脱安定化するからである。
【図23】図23.ある環外アミン修飾された塩基の例示的構造。
【図24】図24.修飾された「ターミネーター型塩基」。(A)において、修飾された「ターミネーター型塩基」Zは、標的核酸を結合でき、そしてSBEアッセイにおいて伸張することができる。しかし(B)において、該修飾された「ターミネーター型塩基」Zは、DNAポリメラーゼを、修飾塩基位置を超えて伸張することから妨げる。こうして、標的依存性プローブ伸長のみがおこり、そして該標的に依存しない伸長が抑制される。
【図25】図25.伸長「ターミネーター」塩基の例示的構造。
【図26】図26.図27−29に使用される修飾された塩基/ヌクレオシドのリスト。
【図27】図27.修飾核酸を有するプローブの使用の有効性を示す実験のグラフ。この実験では、プローブ配列5’−ATACACACATGTGCACACACA−3’を使用した。これは、該修飾された塩基がその意図された効果を有することを示す。
【図28】図28。プローブ配列5’−GCCAGGCAATTTTATTTGCであって、また安定的ヘアピンループを形成するものでの実験。これは、修飾された塩基対がその意図された効果を有することを明かに示す。伸長部位(3’末端)に近い修飾された塩基対は、なおより劇的効果を有することができる。
【図29】図29.天然の塩基での3つの異なるプローブ配列での実験。任意の標的の不存在下で該プローブはSBEアッセイ中に伸長する。しかし、天然塩基が修飾塩基/ヌクレオシドで置換されたときに、これらのそれぞれの1つからの標的依存性シグナルは、5倍増加する。
【図30】図30.捕捉プローブの「幹」領域中の塩基の修飾は、ポリメラーゼ酵素を、幹−環構造への結合から防止することによって、自己伸長を阻害する。
【図31】図31.プローブ−標的二重らせんの熱力学的安定性は、ポリメラーゼ酵素活性を可能とし、そして伸長は妥協されない。
【図32A】図32(A)SBE酵素(ポリメラーゼ)の結合アフィニティを減少させる「幹」領域で使用される修飾されたヌクレオチド塩基。
【図32B】図32(B)は、幹−環形成プローブのポリメラーゼ伸長を防止するプローブの「幹」構造で使用され得るキラルホスホジエステルアナログを示す。(a)結合アフィニティおよび酵素の特異性に貢献する酵素タンパク質との水素結合形成に関係するpro−Rおよびpro−S非架橋酸素の位置を実証する通常のホスホジエステル結合;および酵素結合を減少させる3つのキラルホスホジエステルアナログ;(b)H−ホスホネート;(c)ホスホロチオネート;および(d)メチルホスホネート。
【図33】図33:プローブの自己伸長を防止するための「オリゴヌクレオチド阻害剤」を使用するSBEアッセイおよびそれによる結果。A:一本鎖RNA標的および阻害剤の両方がないRCA 1SNPチップ上で実施される修飾されたSBEアッセイ。APO E321.T.A.の誤りの陽性シグナルを、枠付ボックスで示す。B:一本鎖RNAを、RCA SNPチップに適用した。APO E中の誤りの陽性シグナルの強度は、Aのそれと同じである。C:一本鎖RNA標的、また短いオリゴ阻害剤を、RCAチップ上に適用し、APO E321の誤りの陽性シグナルは阻害され、そしてシグナルは今、チップ上に存在する他の陽性シグナルに対する強度において類似である。
【図34】図34.自己伸長のない、SNP遺伝子型決定およびプライマー伸長のためのユニプレックス化標的調製のための方法。方法および修飾された酵素のこの組み合わせは本発明の好ましい実施態様の1つを規定する。
【図35】図35.コントロールプローブから取得された結果。ここでPCRや他の増幅技法はSNP遺伝子型決定のために使用していない。プライマー伸長予備増幅、次いでインビトロ翻訳、それから修飾された逆転写酵素を使用するプローブ伸長を、この方法で使用した。
【図36】図36.通常の逆転写酵素を超える、修飾された逆転写酵素の有利性を実証する。修飾された酵素は、自己伸長を排除する。
【図37】図37.SurModics(登録商標)表面上のアミノオリゴヌクレオチドの反応。ここに、ポリマー骨格上の、アシル置換反応の例を示す。
【図38】図38.SurModics(登録商標)Gel Matrixの可能な構造、好ましい実施態様での固体基質上で使用されるポリマー。
【0022】
発明の詳細な記載
本発明は、種々のP450酵素の遺伝子型(単一ヌクレオチド多型、またはSNPの存在を含む)を解明するために設計されたプローブの特に有用の組み合わせを含む、バイオチップを含む方法および組成物を指向する。本発明の組成物および方法は、p450遺伝子の幾つかの間の独特かつ有利な特異性を提供し、それぞれの関連遺伝子の特異的増幅を可能とする、PCRプライマー(けれども、当業者によって認識されるであろうように、増幅反応の他の型をまた実施し得る)の使用に基づく。得られるアンプリコンを次いで、P450酵素変異体の識別および検出可能とする、単一塩基伸長(SBE)反応の特異性および効率を改善する新規プローブを使用してSNPについて分析し、疾患状態と、薬物特異性および抵抗性の相関を可能とする。
【0023】
よって、1または2以上の患者由来のサンプルを分析および評価するための組成物および方法を提供すること、存在する種々のP450酵素のレベルおよび/または遺伝子型を確認することが、本発明の目的である。当業者に認識されるように、該サンプル溶液は、体液(事実上任意の生物であるが、哺乳動物サンプルが好ましく、ヒトサンプルが特に好ましい、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗および精液を含むが限定されない)を含むが限定されない任意の数のものを含み得る。当業者に認識されるように、サンプルは、標的およびシグナル増幅であってPCT/US99/01705に全般に記載されるのもの、例えばPCR等、増幅反応および以下に概説の両方を含む増幅反応の産物であり得る。当業者に認識されるように、事実上任意の実験的操作が、サンプルについてなし得る。
【0024】
本発明の組成物および方法は、標的DNA配列上のSNPの検出を指向する。用語「標的配列」または「標的核酸」または文法的均等物は、ここで、遺伝子の一部であり得る核酸配列、ゲノムDNA、cDNA、mRNAおよびrRNAを含むRNA、またはその他を意味する。ここに概説するように、標的配列は、サンプルからの標的配列、または二次的標的、例えばPCR等のような増幅反応の産物であり得る。より長い配列はより特異的である理解とともに、それは任意の長さであり得る。当業者に認識されるように、相補的標的配列は、多くの形態を取り得る。それは例えば、より大きい核酸配列、すなわち遺伝子またはmRNAの全部または一部、とりわけプラスミドまたはゲノムDNAの制限フラグメントを含み得る。より十分に以下に概説するように、プローブは標的配列にハイブリダイズするように作成され、サンプルの標的配列中のSNPの存在または不存在を決定する。一般にいって、この用語は、当業者に理解されるであろう。標的配列はまた、異なる標的ドメインを含み得る。例えば、サンプル標的配列の第1標的ドメインは、第1捕捉プローブにハイブリダイズし、第2標的ドメインは、捕捉プローブの一部にハイブリダイズし得るなどである。該標的ドメインは、示されるように隣接または分離され得る。特記しない限り、用語「第1」および「第2」は、標的配列の5’−3’方向について配列の方向を付与することを意味しない。例えば、相補的な標的配列の5’−3’方向を仮定すると、第1標的ドメインは、第2ドメインの5’側または第2ドメインの3’側に位置し得る。
【0025】
遺伝される単一塩基変化は、一般に、多型またはSNPと言及する。より十分に以下に概説するように、本発明の許容される実施態様は、配列情報が望まれるSNP(単一ヌクレオチド多型)または複数のSNPを含む標的配列を含み、一般にここに「SNP」部位または「SNP位置」または「クエリー塩基」または「質問位置」または「検出位置」と言及する。好ましい実施態様では、SNP位置は、単一ヌクレオチドであり、けれども、ある実施態様では、それは複数のヌクレオチドを含み得、お互いと連続し、または1または2以上のヌクレオチドによって分離される。ここでいう「複数」は、少なくとも2を意味する。ここで使用するように、捕捉プローブは、「質問位置」を、通常はしかしいつもではなく、3’末端で、または3’末端に向けて含む。
【0026】
本発明の目的のために、配列は、「完全にマッチの」または「ミスマッチの」としてここに言及する。この文脈では、「ミスマッチ」は、相対的な用語であり、そして特定のSNP位置の2つの異なるプローブの2つの配列の間の同一性の相違を指摘することを意味することが注意されるべきである。一般に、野生型配列と異なる配列は、ミスマッチと言及する。しかし、および特にSNPの場合には、何が「野生型」を構成するかは決定するのが困難であり得、多重アリルが比較的頻繁に集団中に観察され、こうしてこの文脈での「ミスマッチ」は、標準として1つの配列の人工的適応を要するからである。こうして、この発明の目的のために、配列はここに、野生型配列標準について、「完全なマッチ」または「ミスマッチ」または「突然変異体」として言及する。「ミスマッチ」はときに、また「アリル変異体」と言及する。ここに「アリル変異体」と相互交換的に使用する用語「アリル」は、遺伝子またはその一部の代替的(択一的)形態を言及する。アリルは、相同染色体上の同じ遺伝子座または位置を占める。対象が遺伝子の2つの同一のアリルを有する場合、該対象は該遺伝子またはアリルについて「ホモ接合性」といわれる。対象が遺伝子の2つの異なるアリルを有する場合、該対象は、該遺伝子について「ヘテロ接合性」といわれる。特異的遺伝子のアリルは、単一ヌクレオチド、または幾つかのヌクレオチド中で互いに異なることができ、そしてヌクレチドの置換、欠失、および挿入を含むことができる。遺伝子のアリルはまた、突然変異を含む遺伝子の形態であることができる。用語「遺伝子の多型領域のアリル変異体」は、同じ種の他の個体の遺伝子のその領域に見出される幾つかのヌクレオチド配列の内の1つを有する遺伝子の領域をいう。こうして上記用語は、該用語の全部の意味を誘導する文脈で使用されなければならない。
【0027】
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的均等物によてここに、一緒に共有連結された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含むが、ある場合には、前記で概説した通りに、例えばホスホルアミダイト(Beaucage et al., Tetrahedron 49(19):1925(1993) およびそこの引用;Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800(1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579(1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487(1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805(1984), letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988);およびPauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986))、ホスホロチオエート(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437(1991);および米国特許5644048号)、ホスホルホロジチオエート(Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321(1989)、O−メチルホスホロアミダイト連結(Eckstein, Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)、およびペプチド核酸骨格および連結(Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895(1992);Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31;1008(1992); Nielsen, Nature, 365:566(1993); Calsson et al., Nature 380:207(1996)、すべてのそれらは引用により含める))を含む代替的骨格を有し得る核酸アナログが含まれる。他のアナログ核酸は、ロック性核酸(Koshkin et al. J. Am. Chem. Soc.120:13252-3(1998);陽性骨格(Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097(1995);非イオン性骨格(米国特許5386023、5637684、5602240、5216141および4469863号;Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423(1991); Letsinger et al., J.Am. Chem. Soc.110:4470(1988);Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597(1994); Chpter 2 and 3, ASC Symposium Sries 580, ''Carbohydrate Modification in Antisense Research''. Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395(1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17(1994);Tetrahedron Lett.37:743(1996))および非リボース骨格であって、米国特許5235033および5034506号、および6および7章の、ASC Symposium Sries 580, ''Carbohydrate Modification in Antisense Research'', Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookにを含むものを含む二環式構造のある物を含む。1または2以上の炭素環式糖を含む核酸はまた、核酸の定義に含まれる(Jenkins et al., Chem, Soc. Rev. (1995)pp169-176参照)。いくつかの核酸アナログは、Rawls, C & E News June 2, 1997 page 35に記載される。該定義はまた、「ロック性核酸」を含む。これらの引用の全ては引用によってここに明示的に含ませる。リボースホスフェート骨格のこれらの修飾は、生理学的環境中のそのような分子の安定性および半減期を増加させるためになし得る。
【0028】
当業者に認識されるように、これらの核酸アナログのすべては、本発明での用途を見出し得る。加えて、天然に存在する核酸およびアナログの混合物を作成できる。代替的に、異なる核酸アナログの混合物、および天然に存在する核酸およびアナログの混合物を作成し得る。
【0029】
核酸は、特定されるように「一本鎖」または「二本鎖」であり得、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含み得る。核酸はゲノムおよびcDNAの両方のDNA、RNAまたはハイブリッドであり得、ここに、核酸はデオキシリボ−およびリボヌクレオチドの任意の組み合わせを含み、そしてウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基の任意の組み合わせを含む。好ましい実施態様は、標的配列よりもむしろ、他のプローブに相補的に設計される核酸中のイソシトシンおよびイソグアニンを利用し、これは非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるからであり、全般に米国特許5681702号に記載されるとおりである。ここで使用するように、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチド並びにヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログ、および修飾されたヌクレオシド、例えばアミノ修飾ヌクレオシドを含む。加えて、「ヌクレオシド」は、非天然存在アナログ構造を含む。こうして、例えばそれぞれが塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、ここにヌクレオシドとして言及する。
【0030】
要すれば、標的配列は、既知の技法を使用して調製する。例えばサンプルを、既知の溶解バッファー、電気泳動等を、必要により精製および/または増幅とともに使用して細胞を溶解するために処理し得、当業者に認識されるとおりである。標的核酸を増幅するための好適な増幅技法は、PCTUS99/01705に概説され、ここに引用および以下の概説によって明示的に含める。
【0031】
標的配列増幅のための全般的技法は、以下に議論する。ここで使用するプライマーまたはプローブは、ここに、標的DNAの増幅を可能とし、当業界で理解されるとおりである。
【0032】
標的増幅は、標的配列の増幅(複製)に関係し、その結果標的配列のコピー数が増加する。好適な標的増幅技法は、限定しないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、アリルPCR、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列に基づく増幅(NASBA)、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)、ローリングサークル増幅(RCA)、Invaider(登録商標)技法、切れやすい(scissile)プライマーを使用すること(CPT)等、以下に定義されるものを含む。
【0033】
種々の増幅技法は、以下により十分に記載されるようにプライマーまたはプローブの更なる要件を有し得る。プライマー核酸のサイズは、当業者に認識されるように、用途および増幅技法に依存して、一般に5ないし500ヌクレオチド長で変化し得る。
【0034】
プライマーおよび標的配列の間の複合体がひとたび形成されると、ときに「増幅酵素」とよばれる酵素を使用してプライマーを修飾する。ここに概説される全ての方法について、酵素はアッセイ中の任意の点、プライマーの添加の前、中、後で添加し得る。酵素の同定は、以下に十分に概説されるように使用される増幅技法に依存する。
【0035】
好ましい実施態様では、標的増幅技法は、PCRである。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、広く使用され、記載され、そして標的配列を増幅するための熱サイクル化と組み合わせたプライマー伸長の使用に関係する。引用により全体を含ませる、米国特許4683195および4683202号およびPCR Essential Data, J. W. Wiley & sons, Ed. C.R. Newton, 1995参照。加えて、本発明で使用できる、ある数のPCRの変形があり、「定量的競合的PCR」または「QC−PCR」、「arbitrarily primed PCR」または「AP−PCR」、「イムノPCR」、「Alu−PCR」、「PCR一本鎖conformational多型」または「PCR−SSCP」、「逆転写酵素PCR」または「RT−PCR」、「ビオチン捕捉PCR」、「vectorette OCR」。「パンハンドルPCR」、およびとりわけ「PCRselectcDNA subtraction」を含む。PCRの詳細は周知であり、熱安定性ポリメラーゼ、例えばTaqIポリメラーゼおよび熱サイクリングの使用を含む。よって、PCR反応は、少なくとも1のPCRプライマーおよびポリメラーゼを必要とする。
【0036】
SNP遺伝子座のマルチプレックスPCR増幅と、オリゴヌクレオチドアレイヘの次のハイブリダイゼーションは、正確かつ少なくとも数百のSNPを同時的に遺伝子型決定する信頼できる方法であることが示された;Wang et al., Science, 280:1077(1988)参照;またSchafer et al., Nature Biotechnology 16:33-39(1998)参照。標的DNAの異なる領域のための異なるプライマーセットに関係するマルチプレックスPCR反応を、標的DNAを増幅するために使用できる。好ましい実施態様では、7マルチプレックスPCR反応を実施し、7つの異なる領域であって、それぞれの領域が標的DNAの異なるSNP位置に対応するものを、適当なプライマーセットを使用して増幅する。アンプリコンを貯留し、そして総貯留物を分析のために使用する。こうして、例えば、もし10SNP位置がPCRによって増幅されるならば、7x10=70SNP位置が、それぞれの増幅されるDNAサンプルについて同時に質問できる;例えばp450チップ上で。
【0037】
さらなる増幅方法は、アリルPCRであり、引用により明示的にここに引用する、Newton et al., Nucl. Acid Res, 17:2503(1989)に記載される。アリルPCRは、もし末端3’ヌクレオチドがミスマッチであるならば、使用されるDNAポリメラーゼは、3’−エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を欠くことものと推定して、PCR反応があまりよく進行しないという事実に基づき、単一塩基識別を可能とする。
【0038】
好ましい実施態様では、標的増幅技法は、SDAである。鎖置換増幅(SDA)は全般に、すべて引用により明示的にここに全体を含める、Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press Inc., 1995中および米国特許5455166および5130238号に記載される。全般には、SDAを以下のように記載し得る。通常DNA標的配列である、一本鎖標的核酸を、一般に25−100ヌクレオチドの長さであるSDAプライマーと接触させる。SDSプライマーは標的配列の3’末端の領域に実質的に相補的であり、そして該プライマーはその5’末端に(標的に相補的である領域の外側に)ときにここに「ニッキング酵素」または「ニッキングエンドヌクレアーゼ」として言及する、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位である配列を有する。SDAプライマーを次いで、標的配列にハイブリダイズさせる。該SDA反応混合物はまた、ポリメラーゼ(ある「SDAポリメラーゼ」)および4のデオキシヌクレオシド−トリフォスフェート(またデオキシヌクレオチドまたはdNTP、すなわちdATP、dTTP、dCTPおよびdGTPと呼ばれる)、少なくともその1種は置換または修飾されたdNTPの混合物を含み;こうしてSDAプライマーは修飾され、すなわち伸長され、修飾されたプライマーを形成し、ときにここに、「新しく合成された鎖」として言及する。置換されたdNTPを修飾し、その結果それは置換されたdNTPを含む鎖中の切断を阻害するが、他の鎖の切断を阻害しない。好適な置換dNTPの例は、限定しないが、2’デオキシアデノシン5’−O−(1−チオトリフォスフェート)、5−メチルデオキシシチジン5’−トリフォスフェート、2’−デオキシウリジン5’−トリフォスフェート、および7−デアザ−2’−デオキシグアノシン5’−トリフォスフェートを含む。加えて、dNTPの置換は、新しく合成された鎖への取りこみ後に起こり得る;例えばメチラーゼを使用し、合成された鎖にメチル基を付加し得る。加えて、もしすべてのヌクレオチドが置換されるならば、該ポリメラーゼは、5’−>3’エキソヌクレアーゼ活性を有し得る。しかし、もしすべてより少ないヌクレオチドが置換されるならば、該ポリメラーゼは好ましくは5’−>3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。使用されるべき、好適な酵素を描くチャートおよびこれらの対応する認識部位および修飾されたdNTPは、引用により明示的にここに含める米国特許5455166号に見出される。
【0039】
よって、SDA反応は、特定の順序ではなく、SDAプライマー、SDAポリメラーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼおよびdNTPを要し、その少なくとも1種は修飾される。
【0040】
一般に、SDAは熱サイクリングを必要としない。反応の温度は、一般に、非特異的ハイブリダイゼーションを防止するのに十分高いが、特異的ハイブリダイゼーションを可能とするのに十分低いようにセットする;これは一般に、酵素に依存して約37℃ないし約42℃である。
【0041】
好ましい実施態様では、該標的増幅技法は、核酸配列に基づく増幅(NASBA)である。NASBAは全般に、すべて引用によりここに含める、米国特許5409818号;Sooknanan et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, 1995のNucleic Acid Sequence-Based Amplification, Ch.12(pp.261-285);および''Profiting from Gene-based Diagnostics'', CTB International Publishing Inc.N. J. 1996に記載される。NASBAは、TMAおよびQBRの両方に非常に類似する。転写仲介性増幅(TMA)は全般に、すべて引用によりここに含める、米国特許5399491、5888779、5705365、5710029号に記載される。NASBAとTMAの間の主要な相違は、NASBAがRNアーゼHの添加を利用し、RNA分解をもたらし、TMAは、逆転写酵素の固有のRNアーゼH活性によることである。
【0042】
一般に、これらの技法を、以下に記載し得る。一本鎖標的核酸、とくにRNA標的配列(ときにここに、「第1標的核酸」または「第1テンプレート」として言及する)を、第1プライマー、一般にここに「NASBAプライマー」(「TMAプライマー」もまた好適であるが)と接触させる。DNA標的配列での出発を以下に記載する。これらのプライマーは一般に25−100ヌクレオチドの長さを有し、近似的に50−75ヌクレオチドのNASBAプライマーが好ましい。第1プライマーは好ましくは、その3’末端に、第1テンプレートの3’末端に実質的に相補的である配列を有するDNAプライマーである。該第1プライマーはまた、その5’末端にRNAポリメラーゼプロモーターを有する(またはその相補物(アンチセンス)、システムの構成に依存して)。該第1プライマーを次いで、該第1テンプレートにハイブリダイズさせ、第1ハイブリダイゼーション複合体を形成する。該反応混合物はまた、逆転写酵素(「NASBA逆転写酵素」)および4つのdNTPの混合物を含み、その結果第1NASBAプライマーは修飾され、すなわち伸長され、修飾された第1プライマーであってRNA(第1テンプレート)およびDNA(新しく合成された鎖)のハイブリダイゼーション複合体を含むものを形成する。
【0043】
「逆転写酵素」または「RNA依存性DNAポリメラーゼ」はここでに、DNAプライマーおよびRNAテンプレートからDNAを合成できる酵素を意味する。好適なRNA依存性DNAポリメラーゼは限定しないが、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(「AMV−RT」)およびモロニーマウス白血病ウイルスRTを含む。増幅反応がTMAであるとき、逆転写酵素はさらにRNA分解活性を含む。
【0044】
好ましい実施態様では、「逆転写酵素」は、修飾された逆転酵素(RT)であって、ここにDNA依存性DNAポリメラーゼ活性が排除されたものである。ここに、自己伸長性プローブは、該修飾されたRTによっては伸長せず、なぜならこれらはDNA依存性伸長であり、そしてRNA標的に結合されたプローブのみが、該RNA依存性DNAポリメラーゼによって伸長されるからである。
【0045】
前列挙の構成要素に加えて、NASBA反応はまた、RNA分解酵素、またときにここにリボヌクレアーゼとして言及されるものを含み、これはRNA:DNAハイブリッドのRNAを、一本鎖または二本鎖RNAまたはDNAを加水分解することなく、ハイブリダイズする。好適なリボヌクレアーゼは、限定しないが、E. coliおよびウシ胸腺由来のRNアーゼを含む。
【0046】
リボヌクレアーゼ活性は、ハイブリダイゼーション複合体中の第1RNAテンプレートを分解し、ハイブリダイゼーション複合体の脱会合を生じ、ときに「第2テンプレート」としてここに言及する、第1の一本鎖である新しく合成されたDNA鎖を残す。
【0047】
加えて、NASBA反応はまた、一般にDNAを含む(プライマーを含むここでのすべてのプローブについて、核酸アナログをまた使用し得るが)第2NASBAプライマーを含む。この第2NASBAプライマーはその3’末端に第2テンプレートにの3’末端に、実質的に相補的である配列を有し、そしてまた、機能性プロモーターのためのアンチセンス配列および転写開始部位のアンチセンス配列を含む。こうして、このプライマー配列は、第3DNAテンプレートの合成のためのテンプレートとして使用されるとき、RNAポリメラーゼの特異的かつ効率的結合および望まれる部位の転写の開始を可能とする十分な情報を含む。好ましい実施態様は、アンチセンスプロモーターを利用し、そして転写開始部位は、T’ RNAポリメラーゼのそれであるが、以下の概説のように他のRNAポリメラーゼプロモーターおよび開始部位をまた使用することができる。
【0048】
第2プライマーは、第2テンプレートにハイブリダイズし、そしてDNAポリメラーゼ、また「DNA依存性DNAポリメラーゼ」と呼ばれるものは、また反応物中に存在し、第3テンプレートを合成し(第2の、新しく合成されたDNA鎖)、2つの新しく合成されたDNA鎖を含む第2ハイブリダイゼーション複合体を生じる。
【0049】
最後に、RNAポリメラーゼの取りこみおよび要求される4つのリボヌクレオシドトリフォスフェート(リボヌクレオチドまたはNTP)は、RNA鎖(第3の、新しく合成され、すなわち本質的に第1テンプレートと同じもの)の合成という結果となる。ときにここに「DNA依存性RNAポリメラーゼ」として言及するRNAポリメラーゼは、プロモーターを認識し、そして開始部位でのRNA合成を特異的に開始させる。加えて、RNAポリメラーゼは好ましくは、DNA二重らせんあたりのRNAの幾つかのコピーを合成する。好ましいRNAポリメラーゼは限定しないが、T7 RNAポリメラーゼを含み、そしてファージT3、ファージΦII、サルモネラファージsp6、またはシュードモナスファージgh−1のそれらを含む他のバクテリオファージRNAポリメラーゼを含む。
【0050】
ある実施態様では、TMAおよびNASBAを、出発DNA標的配列とともに使用する。この実施態様では、RNAポリメラーゼプロモーターおよびDNAポリメラーゼ酵素を含む第1プライマーを利用して、プロモーター配列を含む新しく合成される鎖との二本鎖DNAハイブリッドを生成することが必要である。該ハイブリッドを次いで変成し、そして第2プライマーを付加する。
【0051】
よって、NASBA反応は、特定の順序ではなく、第1NASBAプライマー、第2NASBAプライマーであって、RNAポリメラーゼプロモーターのアンチセンス配列を含むもの、該プロモーターを認識するRNAポリメラーゼ、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNA分解酵素、NTPおよびdNTP、さらに以下に概説する検出構成要素を要する。
【0052】
これらの構成要素は、単一のDNAに重らせんを生成する単一の出発RNAテンプレートを生じる;しかし、このDNA二重らせんは、多重RNA鎖であって、これらはついで使用して再び反応を開始させ得るものの創出という結果となるから、増幅は急速に進行する。
【0053】
よって、TMA反応は、特定の順序ではなく、第1TMAプライマー、RNAポリメラーゼプロモーターのアンチセンス配列を含む第2TMAプライマー、該プロモーターを認識するRNAポリメラーゼ、RNA分解活性を有する逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、NTPおよびdNTP、加えて以下に概説する検出構成要素を要する。
【0054】
これらの構成要素は、単一のDNA二重らせんを生成する単一の出発RNAテンプレートを生じさせる;しかし、このDNA二重らせんは、次いで使用され再び反応を開始させ得る多重RNA鎖の創出という結果となるから、増幅は急速に進行される。
【0055】
好ましい実施態様では、標的増幅技法は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)、ときにライゲーション連鎖反応(LCR)として言及されるものである。該方法は、2つの異なるやり方で稼動することができる;第1実施態様では、たったひとつの標的配列を、ライゲーションのためのテンプレートとして使用し(OLA);代替的には両方の鎖を使用し得る(OLA)。オリゴヌクレオチドライゲーション増幅(「OLA」ときにここに、ライゲーション連鎖反応(LCR)として言及する)は、テンプレートとして標的配列を使用する、単一の長いプローブヘの2つのより小さいプローブのライゲーションに関係する。全般にすべて引用により全体を含ませる、米国特許5185243、5679524および5573907号;EP0320308B;EP0336731B1;EP0489182B1;WO90/01069;WO89/12696;およびWO89/09835および米国出願60/078102および60/073011参照。
【0056】
LCRの変形は、「化学的ライゲーション」の種類を利用し、両方ともここに明示的に引用により全体を含ませる、米国特許5616464および5767259に概説されるとおりである。この実施態様では、LCRに類似して、プライマーの対を利用し、ここに、該第1プライマーは、標的の第1ドメインに実質的に相補的であり、そして第2プライマーは、標的の隣接第2ドメインに実質的に相補的である(しかし、LCRのために、もし「ギャップ」が存在するならば、ポリメラーゼおよびdNTPを添加し該ギャップを充填し得る)。それぞれのプライマーは、「側鎖」として作用する部分を有し、これは標的配列に結合せず、そして水素結合、塩架橋、ファンデルワールス力等により非共有相互作用する幹構造の一方の半分を作用する。好ましい実施態様は、側鎖としての実質的に相補的な核酸を利用する。こうして、プライマーが標的配列へハイブリダイゼーションすると、該プライマーの側鎖を位置的接近をもたらし、そして、もし側鎖が核酸をまた含むならば、側鎖ハイブリダイゼーション複合体を形成できる。
【0057】
プライマーの側鎖の少なくとも1つは、活性化されると、化学的架橋または化学的ライゲーションを生じる活性化可能の架橋剤、一般に側鎖に共有付着されるものを含む。該活性化可能の基は、側鎖の架橋を可能とする任意の部分を含み得、そして化学的、光量子的、および熱的に活性化される基を含み、光活性化可能基が好ましい。ある実施態様では、側鎖の1つ上の単一の活性化可能基が、他の側鎖上の官能基との相互作用を介して架橋を生じるのに十分である;代替的態様では、活性化可能基は、それぞれの側鎖上に要する。
【0058】
ひとたびハイブリダイゼーション複合体が形成され、そして架橋剤が活性化され、その結果プライマーが共有結合すると、該反応は、ハイブリダイゼーション複合体の脱会合を可能とする条件に服し、こうして該標的を自由とし、次のライゲーションまたは架橋のためのテンプレートとして供する。このやりかたでは、シグナル増幅ががおこり、そしてここに概説のように検出することができる。
【0059】
好ましい実施態様では、標的増幅技法はRCAである。また遺伝子型決定のために使用できるOLAの変形は、「ローリングサークル増幅」またはRCAと呼ばれる。ローリングサークル増幅は、標的にハイブリダイズする単一のプローブを利用し、その結果プローブのそれぞれの末端が互いに隣接的にハイブリダイズする(または、代替的に、介入ヌクレオチドを、ポリメラーゼおよびdNTPを使用して「充填」できる)。次いで、該プローブの二つの末端がライゲートすると、環状プローブが形成され、また「パドロックプローブ」または「RCAプローブ」として言及される。次いで、プライマーおよびポリメラーゼが添加され、その結果プライマー配列が伸長する。しかし環状プローブは末端がないので、ポリメラーゼは反復的に該環状プローブを伸長させ、環状プローブのコンカタマーを生じる。そういうものとして、該プローブを増幅する。得られたアンプリコンをアッセイのさらなる使用のために種々のやり方で切断することができる。ローリングサークル増幅は全般に、すべて引用によりその全体を含ませる、Baner et al., (1998)Nuc. Acids Res. 26:5073-5078; Barany, F.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88; 189-193; Lizardi et al., (1998)Nat.Genet. 19:225-232; Zhang et al., Gene 211:177(1998);およびDaubendiek et al., Nature Biotech. 15:273(1997)に記載される。
【0060】
好ましい実施態様では、RCAプローブは、切断部位を含み、その結果ローリングサークル増幅の後または中のいずれかに、該RCAコンカタマーをアンプリコンに切断し得る。ある実施態様では、これは検出を促進し、なぜなら該アンプリコンは一般により小さく、そして表面上の好ましいハイブリダイゼーション力学を示すからである。当業者に認識されるように、切断部位は、限定しないが、プローブ中の制限部位の使用、リボザイム配列の使用、または核酸切断部分の取りこみを介してある数の形態をとり得る。
【0061】
好ましい実施態様では、パドロックプローブまたはRCAプローブは制限部位を含む。制限エンドヌクレアーゼ部位は、典型的にはRCAの結果である長いコンカタマーの、表面結合捕捉プローブへより効率的にまたはより速くハイブリダイズするより小さい個々の単位への切断を可能とする。こうして、RCAに続いて(またはある場合には反応中に)、産物核酸を、適当な制限エンドヌクレアーゼと接触させる。これは産物の、より小さいフラグメントへの切断という結果になる。該フラグメントを次いで、固定化される捕捉プローブとハイブリダイズさせ、検出電極上への産物フラグメントの濃縮という結果となる。
【0062】
好ましい実施態様では、切断部位は、リボザイム切断部位であり、引用により明示的にここに含まれる、Daubendiek et al., Nature Biotech. 15:273(1997)に全般に記載される通りである。この実施態様では、触媒性RNAをコードするRCAプローブ、NTPおおびRNAポリメラーゼを使用することによって、得られたコンカタマーを自己切断することができ、最終的にモノマーアンプリコンを形成する。
【0063】
好ましい実施態様では、切断を、DNA切断試薬を使用して達成する。例えば、当業界で知られるように、切断をもたらすことのできるある数のインターカレーティング部分、例えば光を使用することがある。
【0064】
こうして、好ましい実施態様では、OLA/RCAを溶液中で実施し、次いでRCA産物の制限エンドヌクレアーゼ切断。切断された産物を次いで、ここに記載のアレイに適用する。エンドヌクレアーゼ部位の取りこみは、短い、容易にハイブリダイズ可能配列の生成を可能とする。さらに、それぞれのローリングサークルパドロックプローブ配列中の独特な捕捉配列は、アレイ上で平行に分析されるべき核酸配列の広範なセットを可能とし、なぜならそれぞれの配列は、ハイブリダイゼーション特異性に基づいて決定されるからである。
【0065】
好ましい実施態様では、シグナル増幅技法はCPTである。CPT技法は、すべて引用によりその全体を明示的に含ませる、米国特許5011769、5403711、5660988および4876187号およびPCT公開出願WO95/05480、QO95/1416、およびWO95/00667および米国出願09/014304を含むある数の特許および特許出願に記載されている。CPTプライマー(またときにここに「切れやすい(scissile)プライマー」として言及する)は、切れやすい結合によって分離される2つのプローブ配列を含む。該CPTプライマーは標的配列に実質的に相補的であり、そしてこうしてそれにハイブリダイズしハイブリダイゼーション複合体を形成する。切れやすい連結は、標的配列の切断なく、切断され、分離されている2つのプローブ配列を生じる。該2つのプローブ配列をこうして、標的からより容易に脱会合することができ、そして反応を、任意の数のときに反復できる。切断されたプライマーを次いで検出する。「切れやすい連結」によってここに、プローブがハイブリダイゼーション複合体の一部であるとき、すなわち、二本鎖複合体が形成される時、切断されることができる切れやすいプローブ内の連結を意味する。該切れやすい連結は、該切れやすいプローブのみであるがそれがハイブリダイズする配列ではない(すなわち標的配列またはプローブ配列のいずれか)ものを切断し、その結果該標的配列をシグナルの増幅のための反応に再使用し得ることが重要である。
【0066】
好ましい実施態様では、Invader(登録商標)技法を使用する。Invader(登録商標)技法は、部位特異的態様で核酸を切断する構造特異的ポリメラーゼに基づく。2つのプローブを使用する:ある「インベーダー」プローブおよびある「シグナル化」プローブであって非相補的オーバーラップを有して標的配列に隣接してハイブリダイズするもの。酵素は、「尾部」のその認識のために該オーバーラップで切断し、該「尾部」を放出する。これを次いで検出する。該Invader(登録商標)技法は、すべて引用によりここに包含され米国特許5846717、5614402、5719028、5541311および5843669に記載される。
【0067】
「伸長酵素」によってここに、NTPの付加によって配列を伸長させる酵素を意味する。当業界で周知のように、広範の好適な伸長酵素であって、そのポリメラーゼが好ましいもの(標的配列およびプレサークル(precircle)プローブの組成に依存して、RNAおよびDNAの両方)がある。好ましいポリメラーゼは、鎖置換活性を欠き、その結果これらがプローブの末端の必要な塩基のみを付加し、標的化ドメインに相補的であるヌクレオチドを含むようにプローブをさらに伸張させることなく、こうして環形成を防止するものである。好適なポリメラーゼは限定しないが、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメント、SEQUENASE1.0およびSEQUENOSE2.0(U.S.Biochemical)、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼおよび種々のRNAポリメラーゼ、たとえばThermus sp.,またはバクテリオファージ由来のQベータレプリカーゼを含むDNAおよびRNAの両方のポリメラーゼを含み、またとりわけSP6、T3、T4およびT7 RNAポリメラーゼ使用し得る。
【0068】
なおより好ましいポリメラーゼは、5’ないし3’エキソヌクレアーゼ活性が本質的になく、プローブがプローブ5’末端を超えて伸長しないことを確保するものである。5’ないし3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く例示的酵素は、DNAポリメラーゼのクレノーフラグメントおよびDNAPTaqポリメラーゼのStoffelフラグメントを含む。例えばTaqDNAポリメラーゼのStoffelフラグメントは、遺伝的操作のため5’ないし3’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、それらはN末端289アミノ酸を欠く途切れタンパク質の生産という結果となる(例えばLawyer et al., J. Biol. Chem., 264:6427-6437(1989);およびLawyer et al., PCR Meth. Appl., 2:275-287(1993)参照)。類似の突然変異体ポリメラーゼが、T. Maritima、Tsps17、TZ05、ThtおよびTafに由来するポリメラーゼについて生成された。
【0069】
前記実施態様では、ポリメラーゼは、それぞれの場合に説明の通りまたはここに概説の通り独特の特徴を有する任意のポリメラーゼであることができ、好ましくは3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くもの(3’エキソ−)である。好適なポリメラーゼの例は限定しないが、エキソヌクレアーゼマイナスDNAポリメラーゼI大(クレノー)フラグメント、Phi29DNAポリメラーゼ、TaqDNAポリメラーゼ、Deep vent(exo-)、thermosequenase等を含む。加えて、ある実施態様では、一本鎖DNAを複製するポリメラーゼ(すなわち二本鎖区画を形成するプライマーのない)を使用することができる。
【0070】
好ましい実施態様では、該ポリメラーゼは、環状DNAの100より多いコピーを創出する。より好ましい実施態様では、該ポリメラーゼは、環状DNAの1000より多いコピーを創出する;一方最も好ましい実施態様では、該ポリメラーゼは、該テンプレートの10000より多いコピー、または50000より多いコピーを創出し、こうして、標的配列を増幅する。
【0071】
ある種の好ましい実施態様では、末端トランスフェラーゼを使用し、分離標識、例えばビオチンを含むヌクレオチドを、任意の直鎖状分子に付加することができ、それから該混合物を、ストレプトアビジン系により稼動させ、任意の直鎖状核酸を除去し、閉じた環状プローブのみを残す。例えば、RCA法におけるように、ゲノムDNAを標的として使用するとき、該DNAを、種々の技法を使用してビオチニル化し、そして前環(precircle)プローブを添加し、環形成させ得る。環形成されたプローブを、ゲノムDNA上に連鎖させ、該直鎖状非反応前環プローブを、洗い流すことができる。閉じた環プローブを次いで切断し、その結果それらはゲノムDNAから除去され、収集および増幅される。
【0072】
こうして、前記の増幅方法を使用して、ある数の標的分子を、本発明のアッセイにおいてプローブヘのハイブリダイゼーションのために作成する。一般に、増幅工程をある数のサイクルを可能とするある時間の期間、もとの標的配列のコピー数におよび検出の感度に依存して反復し、サイクルは1ないし数千の範囲、10ないし100サイクルが好ましくおよび20ないし50サイクルが特に好ましい。以下により十分に概説するように、これらの反応の産物はある数のやり方で検出でき、すべて引用により全体をここに明示的に含める、米国出願09/458553、09/458501、09/572187、09/495992、09/344217、WO00/31148、09/439889、09/438209、09/344620、PCTUS00/17422、09/478727に概説される通りである。また、結合リガンドまたはプローブが核酸であるとき、米国特許5591578、5824473、5705348、5780234および5770369、米国出願08/873598、08/911589、WO98/20162、WO98/12430、WO98/57158、WO00/16089)WO99/57317、WO99/67425、WO00/24941、PCTUS00/10903、WO00/38836、WO99/37819、WO99/57319およびPCTUS00/20476に概説される好ましい組成物および技法、および関連材料は、引用により全体をここに明示的に含める。
【0073】
好ましい実施態様では、増幅技法は、シグナル増幅である。シグナル増幅は、多重シグナル化プローブを生成するか、または多重シグナル化プローブの使用を可能とするための限定された数の標的分子の使用に関係する。シグナル増幅戦略は、LCR、CPT、Invader(登録商標)、およびサンドウィッチアッセイにおける増幅プローブの使用を含む。
【0074】
ほとんどの場合に、二本鎖標的核酸を変成し、それらを一本鎖にさせ、以下に記載のプローブのハイブリダイゼーションを可能とする。標的DNAを変性するため、好ましい実施態様は、熱的工程を利用し、一般には約95℃までの反応の温度をあげることによるが、pH変化および他の技法、例えば余分のプローブまたは核酸結合タンパク質の使用をまた使用し得る。
【0075】
増幅される標的DNAを次いで、以下に記載の種々の型のプローブと接触させ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる。
【0076】
「プローブ核酸」によって、標的配列のある部分またはドメインにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。プローブはまた、「捕捉プローブ」、「SBEプローブ」または「マイクロアレイプローブ」またはときに、「伸長プローブ」として言及する。プローブがWTまたは突然変異体配列に相補的であるかに依存して該プローブは時に、「WTプローブ」または「突然変異体プローブ」として言及し得る。本発明のプローブを、標的配列または標的配列のアンプリコンに相補的であるように設計し、その結果該標的配列および本発明のプローブハイブリダイゼーションが起こる。前記の様に、この相補性は、完全である必要はない;すなわち、標的配列と本発明の捕捉プローブの間のハイブリダイゼーションを妨害する任意の数の塩基対ミスマッチがあり得る。好ましい実施態様では、捕捉プローブは一本鎖である。別の好ましい実施態様では、該捕捉プローブを、以下に記載の用に修飾し、ここで該プローブは、「修飾された捕捉プローブ」または「修飾されたプローブ」として言及する。以下により十分に概説するように、ある実施態様では、該捕捉プローブは追加的塩基(通常は1つの追加的塩基)を含み、自己伸長を防止する。該プローブまたはプライマーを修飾し自己伸長を防止するとき、それはここに、「非自己伸長プローブ」として言及する。
【0077】
好ましい実施態様では、接触は、バイオチップに付着されたプローブへなされ、そして標的配列に「実質的に相補的」であるように設計され、その結果標的配列と本発明のプローブのハイブリダイゼーションが起こる。以下に概説するように、この相補性は、完全である必要はない;標的配列と本発明の捕捉プローブの間のハイブリダイゼーションを妨害する任意の数の塩基対ミスマッチがあってもよい。しかし、もし突然変異の数が、少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でさえ、起こることのできないほど大きいならば、該配列は相補的標的配列ではない。こうして、「実質的に相補的」によってここに、捕捉プローブが該標的配列に十分に相補的であり、通常の反応条件、特にここに概説するような高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを意味する。核酸配列の文脈では用語「相補的」は、第2核酸配列への配列関連性を有し、その結果両核酸配列の完全長にわたりワトソンクリック塩基対の完全な整列がある核酸配列を意味する。
【0078】
種々のハイブリダイゼーション条件を、本発明で使用し得、典型的には、高、中および低ストリンジェンシー条件を含む条件の「ストリンジェンシー」の程度によって分類し得る。例えば引用によりここに含めるManiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, 1989およびShort Protocols in Molecular Biology, ed Ausubel et al., 参照。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、そして異なる状況下で異なる。ストリンジェンシーを、限定しないが、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、かく乱塩濃度pH、有機溶媒濃度等を含む熱力学的可変である工程パラメーターを変化させることによって制御することができる。これらのパラメーターをまた使用し、米国特許5681697号に概説されるとおり、非特異的結合を制御し得る。こうしてより高度なストリンジェンシー条件でのある種の工程を実行し、非特異的結合を減少させるのが望ましくあり得る。
【0079】
Tmは、標的に相補的なプローブの50%が、平衡で標的配列にハイブリダイズする温度(定義されたイオン強度、pHおよび核酸濃度下での)である(標的配列が過剰に存在するので、Tmで、プローブの50%が平衡で占められる)。例えば、「最大ストリンジェンシー」は典型的に、約Tm−5℃(プローブのTmの5℃下)に、「高ストリンジェンシー」はTmの5−10℃下、「中程度ストリンジェンシー」はプローブのTmの約10−20℃下、そして「低ストリンジェンシー」はTmの約20−25℃下に存在する。いっぱんにハイブリダイゼーション条件は、例えば6xSSCまたは6xSSPEを使用する高イオン強度条件で実行する。高ストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼーションには、低塩溶液、例えば算出された温度で0.5xSSCでの2回洗浄が続く。中度ストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼーションには、中塩溶液、例えば2xSSCでの2回洗浄が続く。低ストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼーションには、高塩溶液、例えば6xSSCでの2回洗浄が続く。機能的には、最大ストリンジェンシー条件を使用し、ハイブリダイゼーションプローブとの厳格な同一性またはほとんど厳格な同一性を有する核酸配列を同定し得る;一方高ストリンジェンシー条件を使用し、該プローブとの約80%またはより多い配列同一性を有する核酸配列を同定する。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な案内はTijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, '' Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays''(1993)に見出される。
【0080】
こうして、ストリンジェント条件は、pH7.0−8.3および短いプローブ(例えば10ないし50ヌクレオチド)について温度がすくなくとも約30℃、長いプローブ(例えば50ヌクレオチドより長い)について少なくとも約60℃、塩濃度が、約1.0ナトリウムイオンより低い、典型的には、約0.01ないし1.0Mナトリウムイオン濃度(または他の塩)ものである。
【0081】
ストリンジェント条件はまた、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加で達成し得る。ハイブリダイゼーション条件はまた、非イオン骨格、すなわちPNAを使用するとき、当業界で知られるように、変化し得る。加えて、架橋剤を、標的結合後、ハイブリダイゼーション複合体の2本の鎖を架橋、すなわち共有付着するために添加し得る。本発明の好ましい実施態様は、アレイ上の「コンペチマー(competimers)」を使用し、非特異的結合を減少させ得る。
【0082】
こうして、本発明のアッセイを一般に、標的の存在下のみでハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とするストリンジェント条件下で稼動させるが、ときおり、より低いストリンジェント条件を使用し得る。例えば、酵素的伸長は、アッセイ選択性が酵素によって増強されるようなより低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件を要し得、当業界で一般に理解されるとおりである。本発明の好ましい実施態様での使用される条件の詳細は、以下にさらに記載される。さらに、好ましい条件はアレイを使用し、その結果捕捉プローブは、配列特異的態様で標的DNAに結合し、そして洗いさられるべき非結合材料を可能とする。
【0083】
本発明の好ましい実施態様は、ここに記載の単一塩基伸長(SBE;ときにまたミニシーケンシングと呼ばれる)アッセイおよびその変形を使用する。一般のSBRアッセイでは、それらの末端塩基のみが異なる2つの捕捉プローブ(野生型(WT)および突然変異体)を合成し、その結果該2つの捕捉プローブの1つが分析すべき標的配列の「クエリ塩基」または「質問位置」に完全に相補的である。すなわち、該捕捉プローブは、質問またはSNP塩基を含む。通常のハイブリダイゼーション条件下で、WTおよび突然変異体プローブの両方は、標的配列にハイブリダイズする。しかし、酵素、例えば前定義のリガーゼまたはポリメラーゼは、完全または不完全マッチを区別でき、その結果単一鎖終結化塩基による酵素的伸長(ときに検出のための標識を有する)が、完全な二重らせんが存在するときのみ起こる。すなわち、DNAポリメラーゼは4つの標識されたターミネーターヌクレオチドの存在下で、完全なハイブリダイゼーションがあるときのみ、1塩基によって捕捉プローブを伸長させることができる。他に、3’塩基ミスマッチが、プライマー伸長を息つかせまたはおもいとどまらせるという結果となる。「ターミネーターヌクレオチド」によって、ヌクレオチドが、さらなる伸長がおこらず、だから1ヌクレオチドのみが付加されるように誘導体化されていることを意味する。好ましい実施態様は、ジデオキシトリフォスフェートヌクレオチド(ddNTP)を利用し、そして一般に、ddATP、ddCTP、ddGTP、およびddTTPを含むヌクレオチドのセットを使用し、その少なくとも1つは、好ましくは4つ全部が標識を含む。標識は異なり、または同じであり得、前記のとおりである。ひとたび標識されたヌクレオチドが付加されると、標識の検出が以下に概説のように進行する。全般には、すべて引用によりここに明示的に含める、Sylvanen et al., Genomics 8: 684-92(1990)、米国特許5846710および5888819、Pastinen et al., Genomics Res. 7(6):606-14(1997)参照。こうして、標的中のSNPまたはクエリー塩基の同一性を、DNAポリメラーゼによって伸長されるプローブセットによって決定する。アッセイのこの型の変形において、プローブは標的のクエリー塩基の1塩基上流の位置で終結する。
【0084】
SBE法の限界は、標的核酸が十分濃度でないならば、反応物中の非伸長プライマーの量が、得られる伸長された標識されたプライマーを大きく超えることである。非伸長プライマーの過剰は、ここに記載のアッセイ中の標識されたプライマーの検出と競合する。よって、SBEを使用するとき、好ましい実施態様は、ここに概説の非伸長プライマーの除去のための方法を利用する。
【0085】
この限界に打ち勝つための1つの方法は、熱サイクラーおよび熱安定性ポリメラーゼを使用するアニーリング、プライマー伸長、および熱変性の繰り返しサイクルが、伸長プローブの増幅を可能とするサーモサイクリングミニシーケンシングであり、これは伸長されたプライマーの蓄積という結果となる。例えば、もしもとの非伸長プライマーと標的核酸濃度が100:1であり、かつ100熱サイクルおよび伸長を実施するならば、プライマーの多くは伸長するだろう。
【0086】
当業者に認識されるように、SBE系の構成はいくつかの形態をとることができる。SBE反応は、溶液中で実施し、それから新しく合成した鎖を、塩基特異的検出可能標識で検出できる。例えばこれらは、伸長プライマーに相補的である捕捉プローブに直接的にハイブリダイズすることができ、そして該標識の存在を次いで検出する。
【0087】
代替的に、SBE反応は表面で起こることができる。例えば標的核酸を、標的の第1表的ドメインにハイブリダイズする第1捕捉プローブを使用して捕捉し得、そして該反応を、第2標的ドメインで進行することができる。該伸長された標識されたプライマーを次いで、第2捕捉プローブに結合させ、そして検出する。
【0088】
こうして、SBE反応は、特定の順序ではなく、伸長プライマー、ポリメラーゼおよび少なくともその1つが標識されているdNTPを要する。
【0089】
SBEに関する以下の引用を、ここに明示的に引用をもって含める:米国出願5639611、米国出願5824476、米国出願5981176、米国出願4851331、米国出願5888819、米国出願6004744、米国出願5137806、米国出願6287778B1、米国出願5582970、米国出願6307039、米国出願6013431、米国出願5846710、米国出願5710028、米国出願6153379、米国出願5665539、米国出願6287778、米国出願5856092、WO92/15712、米国出願4656127、EPO371437B1、米国出願5595890、米国出願6015675、米国出願5578458.
【0090】
多くの現行の利用可能なSBEアッセイで特異性が問題として残る。プローブと標的の間の分子相補性の程度は、相互作用の特性を規定する。ハイブリダイゼーション媒体中のプローブ、標的および塩濃度の、反応温度の、およびプローブの長さの変異は、プローブ/標的相互作用の特異性を変え、または影響し得る。
【0091】
SNPの高度に平行的なスクリーニングについて2つの主要なハードルがある(1)再現可能なやり方での複合的ヒトゲノムの単一塩基変異を検出する十分な感度および特異性を達成するための、PCRによってSNPを横切るりDNA領域を増幅する必要性、および(2)二倍体ヒトゲノム中のホモ接合性およびヘテロ接合性アリル変異体の間を、あいまいでなく区別する能力。アリル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブでのディファレンシャルハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ形式で最も普通に使用される(引用によりここに明示的に含める、Pastinen et al., Genome Res. 10: 1031-42(2000)。
【0092】
SBEアッセイに付随する問題は、アッセイで使用される幾つかのプローブは、「幹−環構造」を形成し、プローブの標的非依存性「自己伸長」という結果となり、こうしてSNP塩基の識別を妨害する誤りの陽性シグナルを生じる。これらの問題を打ち勝つため、この発明は、ここに記載のいくつかの好ましい実施態様を列挙し、これらは捕捉プローブの新規設計および/または自己伸長を回避するため、ユニプレックス化標的調製および修飾されたポリメラーゼでのプライマー伸長に関係する方法の新規組み合わせの使用に関係する。
【0093】
すなわち、本発明は、アレイ上のプライマーの自己伸長を防止するための方法を提供する。本発明はまた、修飾されたプライマーを有するアレイを提供する。好ましくは、該プライマーは、ここに記載のように修飾される。ある実施態様では、アレイは、修飾されたヌクレオチドを含むプライマーを含む。修飾されたヌクレオチドは、2−チオチミン、2−アミノアデニン、アミン修飾されたシトシン、アミン修飾されたグアニン、または4−メチルインドールのようなターミネーター塩基のような環外アミン修飾された塩基を含む。本発明ある方法では、修飾されたヌクレオチドは、非自己伸長プローブの幹領域へのポリメラーゼ結合またはタンパク質結合を変え、ここに該修飾されたヌクレオチドが存在する。修飾されたヌクレオチドは、また糖およびフォスフェート修飾を含む。
【0094】
フォスフェート修飾のある好ましい実施態様は、限定しないが、フォスフォルチオエート、フォスフォルアミデート、メチルフォスフォネート、メチルフォスフォエート、H−フォスフォネートを含む。
別の好ましい実施態様では、自己伸長を防止するため、短い相補的オリゴヌクレオチドを使用し、これによって自己伸長を阻害する。
本発明の好ましい実施態様での使用の修飾されたヌクレオチドの詳細を、ここに記載する。
【0095】
ある好ましい実施態様では、捕捉プローブを、それがプローブ中のクエリーSNP部位の1または2以上の塩基下流で終結するように設計する。一般に、3または4以上の塩基対の幹が、自己伸長のために要求される。下流に付加される塩基はこれらが標的中の塩基に相補的であるが幹−環構造の3’末端でミスマッチであるように設計される。もし幹−環中の塩基の間のミスマッチがあるならば、息つき誘導しおよびDNAポリメラーゼが捕捉プローブを伸長させることから防止するバブルが形成され、こうして誤りの陽性シグナルを生じる。実際上、4またはそれ以上の塩基を付加することは実行可能ではなく、というのは該SNP位置はずっと上流であろうし、そして短い二重らせん形成およびポリメラーゼ依存性伸長を、そしてこうして誤りの陽性結果を誘導し得るからである。好ましい実施態様では、SNP部位の下流に付加された追加的塩基の数は、1または2または3塩基である。標的依存性伸長は、付加された塩基が標的に相補的であるので、追加的塩基によって影響を受けない。よって、質問位置は、3’末端ヌクレオチドである。代替的に、質問位置は、プライマーの終わりから2番目のヌクレオチドである。
【0096】
別の好ましい実施態様では、プローブ中のヘアピン構造を脱安定化するために、「修飾された塩基対」を、プローブに取りこませ、これは自己伸長を防止するが、標的ハイブリダイゼーションを妨害しない。そのような修飾された塩基対は、遺伝子治療の適用において前に使用され、ここにその「対」のそれぞれの修飾された塩基は、遺伝子治療に関係する、それぞれの相補的一本鎖核酸中に見出される。そのような修飾された対は、限定しないが(a)2−アミノ:2−チオ−T、(b)2−アミノプリン:2−チオ−T、(c)6−チオ−C、(d)2−チオ−C、(e)疎水性塩基例えば4−メチルインドール、ジフルオロトルエン等を含む。
【0097】
別の実施態様では、捕捉プローブはプローブの幹領域中の修飾されたホスフェートまたは糖を含み、幹−環構造、そうして誤りの陽性を減少させる。核酸のフォスフェート骨格が核酸−タンパク質相互作用において重要な役割を演じることが当業者に知られる。タンパク質の正に荷電したアミノ酸と負に荷電したフォスフェート骨格の間の静電的相互作用およびフォスフェート酸素とタンパク質の間の水素結合の形成は、特定タンパク質または酵素の、核酸ヘの結合アフィニティに寄与する。この好ましい実施態様では、プローブ骨格のフォスフェートまたは糖環を修飾することによって、ポリメラーゼ酵素の、幹領域についての結合アフィニティを減少させることができ、それによって非特異的ヌクレオチド取りこみの確率を減少させる。そのような修飾は、プローブのクエリー塩基で実施されず、それゆえプローブ−標的二重らせんの熱力学的安定性は変化しない。そのような修飾された核酸の例は以下に記載する。
【0098】
現行発明では、限定しないがフォスフェート骨格のフォスフォルチオネート、フォスフォルアミデート、メチルフォスフォネートおよびメチルフォスフェート修飾、および糖環上の2’O−メチル修飾を含むプローブについていくつかの表面荷電修飾を、ここに提唱する。フォスフォロチオネート(硫黄置換)およびフォスフォルアミデート(窒素置換)置換は、荷電分布、疎水性およびフォスフェート骨格と効率的水素結合を形成する酵素の能力を変える。メチルフォスフォネートおよびメチルフォスフェートは、フォスフェート荷電を全く排除し、こうして、酵素のDNAへの結合を全く阻害する(引用によりここに明示的に全体を含めるSmith, SA and McLaughlin, Biochemistry 36:606046-58(1997)およびDartinger et al., Biochemistry 39:55-63(2000)参照)。
【0099】
なおさらなる好ましい実施態様では、阻害性オリゴヌクレオチドを使用する。本発明は、プローブオリゴヌクレオチド上で平滑末端を創出し相補的な短いオリゴヌクレオチドの使用をなし、そしてプローブの酵素的自己伸長によって生成される誤りのシグナルの生成を防止する。目的のシグナルは、標的の存在下でのみ創出され、そして全ての他の時はシグナルはオフモードのままである(図33参照)。APOE321.T.ASNPプローブヘの短い相補的APOE321.T.Aオリゴは、APOE321.T.ASNPプローブ自己伸長を阻害できる。
【0100】
別の好ましい実施態様では、技法の組み合わせを使用し、ここに、該組み合わせ結果は自己伸長のための誤りの陽性結果の顕著な減少を生産する。ここに、3つの異なる技法、PEP(プライマー伸長予備増幅)、IVT(インビトロ転写)、および修飾された逆転写酵素でのプローブ伸長を使用し、これは多重PCRなく、RCAPなく(または他のシグナル増幅技法なく)およびプライマー伸長からの問題なくゲノム幅SNP遺伝子型決定を可能とする。該方法は、PEP(プライマー伸長予備増幅)反応(米国特許6183958;Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:5847-51(1992);Casas and Kirkpatrick, Biotechniques, 20:219-25(1996)で知られる)を、ランダムプライマーと実行し、1反応でゲノムDNAを増幅、次いでIVT反応(もしプライマーの1つがポリメラーゼプロモーター配列を有したら)する。産物、cRNAを、修飾された逆転写酵素(RT)を使用して伸長させるプローブにハイブリダイズさせ、ここに該DNA依存性DNAポリメラーゼ活性は排除されている。これは、自己伸長体は、RTによって伸長されないことを意味する。というのは、これらはDNA依存性伸長であり、そしてRNA標的に結合されたプローブのみが伸長し、というのはこれらはRNA依存性DNAポリメラーゼ活性によるからである。ゆえに、自己伸長は減少する。
【0101】
本発明の好ましい実施態様は、前記のようなクエリー塩基への、WTおよび突然変異体プローブを含む捕捉プローブの「アレイ」を含み、これらは、固体支持体に付着または固定化されている。標識の、固体支持体上の空間的配置は、標的との相補的配列を共有するアレイエレメント、すなわち、DNA標的中にWTまたは突然変異体塩基が存在するか、指摘する。もしWTと突然変異体プローブの両方が検出のシグナルを生じるならば、それはDNAサンプル中のヘテロ接合体の存在を指摘する。
【0102】
「アレイ」によってここに、アレイ形式の複数のプローブを意味する;アレイのサイズは、アレイの組成および末端使用に依存する。約2つの異なる転移プローブから何千もの多く含むアレイを作成できる。一般に、該アレイは、電極のサイズ、並びにアレイの末端使用に依存して、2から100000またはより多く含む。好ましい範囲は、約2ないし約10000で、約5ないし約1000が好ましく、および約10ないし約100が特に好ましい。加えてそれぞれのアレイはまた、第1染色体コントロールプローブおよび第2染色体コントロールプローブを含む。ある実施態様では、発明の組成物はアレイ形式でなくあり得る;すなわち、ある実施態様では、単一捕捉リガンドを含む組成物をまた作成し得る。加えて、あるアレイでは、異なるまたは同一の組成の、多重基質を使用し得る。こうして例えば、大アレイは、複数のより小さい基質を含み得る。
【0103】
よって、前記の様に、本発明は、プローブまたはプライマーが「非自己伸長プローブまたはプライマー」を含む、アレイを提供する。すなわち、アレイのプローブまたはプライマーは、これらがプライマ伸長反応中に自己伸長せず、そうしてSBEアッセイ中の誤りの陽性反応を最小化するように修飾または設計されている。
【0104】
好ましい実施態様では、発明は、前記のような非自己伸長可能プライマーを含むアレイを、P450SNPを含む標的サンプルと接触させる方法を含む。
【0105】
本発明の装置は、アレイを含む少なくとも1つの表面を有する基質、そして好ましい実施態様では電極のアレイを記載する。「電極」によってここに、電気的装置に接続されたとき電流または電荷を感じ、そしてそれをシグナルに変換する組成を意味する。代替的には、電極は、溶液中の種にまたはそれから、電圧を印画し、および/または電子を通過させることができる組成として定義できる。好ましい電極は、当業界で既知であり、限定しないが、ある種の金属およびそれらの酸化物であって、金、銅、銀、クロム、チタン、白金、パラジウム、シリコン、アルミニウムを含むもの、金属酸化物電極であって酸化白金、酸化チタニウム、酸化スズ、酸化インジウムスズ、酸化パラジウム、酸化シリコン、酸化アルミニウム、酸化モリブデン(Mo2O6)、酸化ランタニウム、および酸化亜鉛および酸化タングステン(WO3;その両方は透明である)を含むもの;伝導性プラスチック(例えばポリチオフェン、ポリアクリルアミド、ポリアニリン、ポリピロール、および金属浸透ポリマーのようなポリマー)、および炭素(ガラス性炭素電極、グラファイトおよびカーボンペーストを含む)を含む。好ましい電極は、金、シリコン、炭素および金属酸化物電極を含み、特に好ましいのは金である。
【0106】
ここに記載の電極は、平面表面として示され、これは該電極の可能な構成のたった1つである。電極の構成は、使用される検出方法で変化する。例えば平面平滑電極は、光学的検出方法のため、または核酸のアレイを作成し、そうして検出の接近可能配置を要するとき、好ましくあり得る。すなわち、それぞれの電極は、1の末端で電極に、および該電極を制御できる装置に付着された相互接続を有し、他の末端上にそれによってそれぞれの電極を独立的に接近可能とする。
【0107】
代替的に、電極は記載されるようにポリマー、そして内部表面に結合された核酸を含む管の形態であり得る。これは小体積サンプルに曝露すべき核酸を含む、最大の表面面積を可能とする。
【0108】
好ましい実施態様では、ポリマー層を、電極の検出表面上で使用する場合、該電極は、電極とETMの間または電極と溶媒中の荷電種の間の電気的接触の防止を援助できるポリマーを含む。
【0109】
これらの技法の全ては、標的配列の(サンプルの標的配列またはアッセイ中生成された配列)、表面上の捕捉プローブへのハイブリダイゼーションの結果としてのアッセイ複合体の形式による。該アッセイ複合体はさらに、検出標識を含み、複合体形成の検出を援助する。好ましい実施態様では、検出標識は電子転移部分(ETM)、または蛍光部分または標的に直接的または間接的に付着された任意の他の標識である。標識および種々の検出系は以下に記載する。
【0110】
加えて、本発明は、表面結合アレイの新規特性を利用する新規発明を指向し、非特手基結合を減少する「コンペチマー(competimers)」を使用する。
【0111】
核酸アレイは当業界で周知である。そしてある数のやり方で分類できる;整列されたアレイ(例えば区別部位での化学的性質を解析する能力)およびランダムアレイの両方が含まれる。整列されたアレイは限定しないが、フォトリソグラフィー技法(Affymetrix GenChip(登録商標))、スポッティング技法(Synteni and others)、プリンティグ技法(Hewlet Packard and Rosetta)、3次元「ゲルパッド」アレイ等を使用して作成されるものを含む。
【0112】
「基質」または「固体支持体」または他の文法的均等物によってここに、核酸の付着または会合のため適当な区別可能な個々の部位を含むよう修飾され得る任意の材料を意味する。当業者に認識されるように、ここに概説される「基質」は、限定しないがシリコン、例えばシリコンウエハー、シリコンジオキシド、シリコンニトライド、ガラス、融合シリカ、修飾シリコン、炭素、ガリウムアルセニド、インジウムホスファイド、アルミニウム、セラミック、ポリイミド、水晶、プラスチック、樹脂、および、ポリメチルメタクリレート、アクリル、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレンおよび他のスチレンコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、テフロン(登録商標)、ナイロンまたはニトロセルロース等を含むポリマー、多糖類、金属表面例えば超合金、ジルカロイ、スチール、金、銀、銅、タングステン、モリブデウム、タンタル、KOVAR、KEVLER、KAPTON、MYLAR、真鍮、サファイア等を含む広範の材料から作成できる。好ましい実施態様は、利用される試薬に依存して、ガラス、シリコンおよびセラミック材料である。当業者に認識されるように、基質を含む材料は、ここに概説した試薬と両立可能である。
【0113】
等業者に認識されるように、核酸プローブを、種々のやり方で固体支持体に付着または固定化することができる。「固定化」および文法的均等物によってここに、核酸プローブと固体支持体の間の会合または結合が、結合、洗浄、分析、および以下に概説されるような除去の条件下で安定であるのに十分であることを意味する。結合は、共有または非共有である。「非共有結合」および文法的均等物によってここに、静電気的、親水性、および疎水性相互作用の1または2以上を意味する。非共有結合に含まれるのは、分子の共有結合、例えば支持体に対するストレプトアビジンおよびビオチニル化プローブのストレプトアビジンヘの非共有結合である。「共有結合」および文法的均等物によってここに、2つの部分、固体支持体およびプローブが、シグマ結合、pi結合および配位結合を含む少なくとも1つの結合によって付着されることを意味する。共有結合は、プローブと固体支持体の間に直接的に形成でき、または架橋によって、または固体支持体またはプローブのいずれかまたは両方の分子上の特異的反応基の包含によって、形成できる。固定化はまた、共有または非共有相互作用の組み合わせに関係し得る。一般に、プローブはバイオチップへ種々のやり方で付着することができ、当業者に認識される通りである。ここに記載のように、核酸を最初に合成し、次にバイオチップに付着させるか、またはバイオチップ上に直接的に合成することができる。
【0114】
好ましい実施態様では、以下に十分に概説するように、基質は、電極、絶縁層、および限定しないが伝導性ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリピロール、SurModics(登録商標)ゲルマトリクスを含むポリマー層等を含むある数の異なる層を、プローブの支持体への付着のために含み、引用によりここに明示的に含ませるWO98/20162およびWO99/57317に一般に記載されるとおりである。代替的実施態様では、プローブを、マイクロ電極と接触しているポリマーへ付着させる。
【0115】
好ましい実施態様では、アレイのオリゴヌクレオチドプローブを付着させるため使用するポリマーは、SurModics(登録商標)ゲルマトリクスである。これはポリマー上へのオリゴヌクレオチドの共有結合を可能とするように誘導体化されている、ポリアクリルアミドに基づくゲルである。例えば、図37では、アシル置換反応の例を、記載し、活性化されたオリゴヌクレオチドを、それを介してポリマーに付着させることができる。SurModics(登録商標)ゲルマトリクスの構造は、図38にしめされる。方法およびプラットフォームは、基質、SurModics(登録商標)マトリクスおよびある数のオリゴヌクレオチドプローブを含む、もっとも一般的には基質はガラススライドである。ガラススライドヘ共有結合されるのは、薄いポリアクリルアミドマトリクスである。ポリアクリルアミドは、オリゴヌクレオチド付着基および光架橋基で官能化されている。おおむね20−30ヌクレオチドの種々のオリゴヌクレオチドを、AminoLink(登録商標)末端ヌクレオチドとともに標準的フォスフォルアミダイト化学を使用して合成し、これは(CH2)6−NH2リンカーを含む。これらのオリゴヌクレオチドを、マトリクス上の区別可能な位置にスポットする。プローブを、AminoLink(登録商標)アミノ基およびマトリックスないに存在するオリゴヌクレオチド付着基との相互作用を介して、マトリクスに共有結合させる。ひとたび形成されると、光架橋アクリルアミドマトリクスと、共有結合されたオリゴヌクレオチドプローブを、サンプルをアッセイすることにおいて使用する。
【0116】
この実施態様では、発明のプローブを、修飾Badged IIディスペンスロボット(Packard, Meridian, CT; Motorola Life Sciences, Tempe, AZ)を使用する、活性化(MHS)エステル(’’3D−Linkスライド;cat#:DN01-0025; Surmodics, Inc.; Eden Prairie, MN)を含むハイドロゲルのフィルムで被覆されたスライド上にアレイ化する。
【0117】
「絶縁層」によってここに、実質的に電子を輸送しない材料の層を意味する。好ましくは、絶縁層は、限定しないがセラミック、プラスチック、プリントされた回路ボード材料、ポリマー、金属オキシドまたはニトライド、例えばSiO2、SiNxまたはA10xを含む絶縁性材料である。
【0118】
好ましい実施態様では、ポリマー層は、限定しないがポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリフラン、ポリプリジン、ポリカルバゾール、ポリフェニレン、ポリ(フェニレンビニレン)、ポリフルオレン、ポリインドール、ポリアクリルアミド、アガロースゲル、ポリエチレングリコール、セルラー、ゾルゲル、デンドリマー、金属性ナノ粒子、カーボンナノチューブ、それらの誘導体、それらのコポリマー、およびそれらの組み合わせを含むポリマーを使用し、特定の部位のプローブ濃度の量を増加させる。好ましい実施態様では、該材料は、中性ピロールマトリクスを含む。プローブ負荷容量を増加させるため、多孔性マトリクス、例えばポリアクリルアミド、アガロース、またはゾルゲルが好ましい。これらの実施態様では、プローブ材料を、以下に述べる官能性化学を使用して電極の表面上の支持マトリクス上に付着させる。代替的実施態様では、プローブを、マイクロ電極と接触しているポリマーに付着させる。
【0119】
さらに、基質はまた、「バイオチップ」として言及する。「バイオチップ」または文法的均等物によってここに、区別可能なバイオ分子、特に核酸のアレイを含む基質を意味する。
【0120】
好ましい基質はまた、プリントされた回路ボード(PCB)材料を含む。すべて引用によりその全体を明示的にここに含ませる、米国出願09/796077、PCTUS00/34145.PCTUS01/02664、PCT/US00?33499、PCT/US00/33497、PCTUS99/23324、WO01/34302、WO98/20162、WO98/112430、WO00/16089、WO99/57317、WO99/67425、WO01/35100、WO00/62931、WO01/06016、WO01/07665およびPCTUS01/01150参照。
【0121】
好ましい実施態様では、基質はまた「アレイ位置(array locations)」を含む。よって、本発明は、複数のアレイ位置を有する基質を含む組成物を提供する。「アレイ位置」または「パッド」または「部位」によってここに、共有付着された核酸プローブを含む基質上の位置を意味する。追加的に、本系は、以下にさらに記載するアレイ形式の特定の単一性を見出し、ここでアドレスで呼び出せる検出電極のマトリックスがある(ここに一般に「パッド」、「アドレス」または「マイクロ位置」と言及)。
【0122】
ある好ましい実施態様では、該電極は、自己集合単層(self-assembled monolayers,SAM)を含む。「単層」または「自己集合単層」または「SAM」によってここに、表面上に自発的に化学吸着された分子の比較的整列された集合を意味し、ここで該分子は、互いに近似的に平行に、そして表面におおむね垂直に方向付けられている。該分子の多数は、表面に固着している官能基、および単層中の隣接分子と相互作用し比較的整列されたアレイを形成する部分を含む。「混合された」単層は、異種性単層を含み、すなわち少なくとも2種の異なる分子が、単層を作成する場合である。SAMはまた、以下に記載する伝導性オリゴマーを含むことができる。
【0123】
ここに概説するように、標的配列結合(例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション)の効率は、配列が検出電極からある距離にあるときに増加し得る。同様に、標的配列を含むバイオ分子の、検出電極ヘの非特異的結合は、単層が存在するときに、一般に減少する。こうして、単層は、電極表面からはなれた配列の維持を容易化する。加えて、この層は、電極とETMの間または電極と溶媒中の荷電種の間の電気的接触を防止するのを援助する。そのような接触は、サンプル中に存在し得る荷電性種を介する直接的「短回路」または間接的短回路という結果となる。よって、単層は好ましくは電極表面上の斉一層中の完全に堅固につめこまれ、その結果「ホール」の最小が存在する。該単層はこうして、検出電極への溶媒接近可能性を阻止する物理的障壁として供する。
【0124】
「伝導性オリゴマー」によってここに、実質的に伝導するオリゴマー、好ましくは線形であって、そのある実施態様では、「分子ワイヤ」として文献中では言及されるものを意味する。「実質的に伝導する」によってここに、100Hzで電子を移動させることのできるオリゴマーを意味する。一般に、伝導性オリゴマーは実質的に、伝導性オリゴマーのモノマー性単位の間のようなオーバーラップΠ軌道、すなわち共役Π軌道を有するが、該伝導性オリゴマーはまた、1または2以上のシグマ(σ)結合を含みうる。追加的に、伝導性オリゴマーは、会合RTMから、またはそこから電子を注入または受容するその能力によって、機能的に定義され得る。さらに、伝導性オリゴマーは、ここに定義のような絶縁体よりもより伝導性である。追加的に、発明の伝導性オリゴマーは、自身電子を供与または受容し得る、電気的活性ポリマーから区別されるべきである。他の好ましい実施態様では、単層は、エレクトロコンジット形成種を含む。「エレクトロコンジット形成種」または「EFS」によってここに、表面の電子またはETMの検出を可能とするために一般に絶縁体の単層中で、十分なエレクトロコンジットを生成できる分子を意味する。
【0125】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、約10−6ないし104Ω−1cm−1、好ましくは約10−5ないし約103Ωの間の伝導度Sを有し、これらのS値は、約20オングストロームないし約200オングストロームの範囲の分子について算出されている。以下に記載のように、絶縁体は、約10−7Ω−1cm−1またはより低を有し、好ましくは約10−8Ω−1cm−1より低い伝導度Sを有する。全般には、引用によりここに含めるGardner et al., Sensors and Actuators A 51(1995)57-66参照。
【0126】
伝導性オリゴマーに望まれる特性は、高伝導性、合成および本発明の組成物の使用のための有機溶媒および/または水中の十分な溶解性、そして好ましくは、(i)核酸合成中(導電性オリゴマーを含むヌクレオシドが本発明の組成物の合成中の核酸合成機へ添加し得るように)、(ii)電極への伝導性オリゴマーの付着中、または(iii)ハイブリダイゼーションアッセイ中に、起こる反応への化学的抵抗性を含む。加えて、自己集合単層の形成を促進する伝導性オリゴマーが好ましい。本発明のオリゴマーは、ここに記載のように少なくとも2つのモノマー性サブユニットを含む。以下に十分に記載のようオリゴマーは、ホモまたはヘテロオリゴマーを含みおよびポリマーを含む。
【0127】
一般に、EFSは、以下の質の1または2以上を含む:これらは、例えばアルキル鎖と比較して比較的強固な分子であり得;これらは他の単層形成種(例えばチオール基で金表面に付着されるアルキル鎖は、おおむね45度で付着されると考えられ、そしてチオールを介して金に付着されるフェニルアセチレン鎖は、90度角度で落ちると考えられる)と異なるジオメトリーを有して電極表面に付着され得る;これらは堅固に閉じ込められた単層の形成を、例えばアルキル基のような分枝基の包含、または高度に柔軟な種、例えばポリエチレングリコール単位の包含を介し、立体的に妨害または介入する構造を有し得る;またはこれらは活性化されエレクトロコンジットを形成することができる;例えば、光活性化すると表面から選択的に除去し、エレクトロコンジットを残すことのできる光活性化可能種であり得る。
【0128】
好ましいEFSは、以下に定義のように伝導性オリゴマー、およびフェニル−アセチレン−ポリエチレングリコール種、並びに不斉SAM形成ジスルフィド種、例えば引用によりここに明示的に含ませる1999年7月27日出願の米国出願60/145912の図に示されるものを含む。しかし、ある実施態様では、EFSは伝導性オリゴマーではない。
【0129】
当業者に認識されるように、核酸プローブは、種々のやり方で固体支持体に付着または固定化され得る。「固定化」および文法的均等物によってここに、核酸プローブと固体支持体の間の会合または結合が、以下に概説の結合、洗浄、分析および除去の条件下で安定であるにのに十分であることを意味する。結合は、共有または非共有であることができる。「非共有結合」および文法的均等物によってここに、1または2以上の静電的、親水性、および疎水性相互作用を意味する。非共有結合は、分子の共有付着、例えば支持対ヘのストレプトアビジン、およびストレプトアビジンヘのビオチニル化プローブの非共有結合を意味する。「共有結合」および文法的均等物によってここに、2つの部分である固体支持体およびプローブが、シグマ結合、pi結合および配位結合を含む少なくとも1つの結合によって付着されることを意味する。
【0130】
捕捉プローブの、検出表面ヘの付着の方法は、「捕捉結合リガンド」または「捕捉プローブ」の組成および検出表面の組成に依存して、種々のやり方によってなすことができる。直接的または間接的付着を使用できる。間接的付着は、付着リンカーを使用してなす。一般に、両方のやり方は、捕捉プローブ上の官能基、付着リンカーまたはスペーサー、および共有付着のための検出表面を利用する。付着のための好ましい官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、およびチオール基である。これらの官能基を次いで、直接的または間接的に、ときに「Z」、「リンカー」または「スペーサー」または「アンカー基」としてここに示される、リンカーを使用して付着されれ、当業界で周知である;例えばホモまたはヘテロ双官能リンカーが周知である(引用によりここに含める1994 Pierce Chemical Companyカタログ、クロスリンカーについての技術の部、155−200頁参照)。本発明の実施化で有用な好ましい修飾は、限定しないが−OH、−NH2、−SH、−COOR(ここでR=H、低級(C1−12)アルキル、アリール、複素環式アルキルまたはアリールまたは金属イオン)、−CNまたは−CHOを含む。そのような誘導体化プローブの固定化は、官能基例えば−OH、−SH、−NH2を介する検出表面上ヘのプローブ分子ヘの直接的付着によって達成する。
【0131】
本系は、アレイ形式で特別の利用性を見出し、ここでアドレス可能検出電極のマトリックスがある(ここに全般に「パッド」、「アドレス」または「マイクロ位置」と言及する)。
【0132】
いくつかのアレイ構成は、ここに記載する。好ましい実施態様では、CodeLink(登録商標)アレイ技法を使用する。CodeLink(登録商標)技法は、生物学的結合部位のアレイを有する基質を含むバイオチップ上の高容量生物学的系反応を可能とするための装置を提供する。1または2以上のアレイを有するハイブリダイゼーションチャンバー、好ましくは親水性、3−次元ゲルからなるアレイを含み、そしてもっとも好ましくは3次元ポリアクリルアミドゲルからなるアレイを含むものを提供し、ここに核酸ハイブリダイゼーションが、目的の標的分子を含む生物学的サンプルを、ゲル上に固定化された相補的オリゴヌクレオチドプローブと反応させることにより実行する。核酸ハイブリダイゼーションアレイは、有利には、プローブアレイ技法を使用して実施し、これは標的一本鎖DNAの、固定化オリゴヌクレオチドプローブヘの結合を利用する。好ましいアレイは、すべて引用によりここに明示的に含める、米国出願09/458501、09/459685、09/464490、09/605766、PCT/US00/34145、09/492013、PCT/US01/02664、WO01/54814、09/458533、09/344217、PCT/US99/277783、09/439889、PCT/US00/42053およびWO01/34292に概説されるものを含む。
【0133】
さらなる好ましい実施態様では、eSensor(登録商標)アレイ技法を使用する。eSensor(登録商標)技法は、生物学的分子の結合および検出のための表面上の自己集合単層(SAM)を使用する。SAMは、電極を、電気的活性剤(例えば塩)溶液から保護するアルキル鎖である。標識プローブに当初に結合されている、電気化学的標識(例えばフェロセン)は、電極へ流れ、そして検出シグナルを生産する。例えば、WO98/20162、PCTUS98/12430、PCTUS98/12082、PCTUS99/01705、PCT/US99/21683、PCT/US99/10104、PCT/US99/01703、PCT/US00/31233、米国特許5620850、6197515、6013459、6013170および6065573およびここに引用する引用参照。他の好ましい実施態様では、電気的アレイ技法を使用し、以下にさらに記載のとおりである。
【0134】
本発明はまた、同時的多重バイオチップ分析を可能とする装置を有する。特に、該装置は、核酸アレイを含む多重カートリッジを保持するように構成され、そしてサンプルの高処理量分析を可能とする。
【0135】
「カートリッジ」によってここに、バイオチップのためのカーシングまたはハウジングを意味する。ここに概説するように、そして当業者に認識されるように、該カートリッジは、ある数の構成を有し、そして種々の材料から作成することができる。好適な材料は限定しないg、ファイバーグラス、テフロン(登録商標)、セラミック、ガラス、シリコン、マイカ、プラスチック(アクリル、ポリスチレン、およびスチレンおよび他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、Tefdlon(登録商標)およびそれらの誘導体等を含む)等を含む。特に好ましいカートリッジ材料は、プラスチック(ポリカーボネートおよびポリプロピレンを含む)およびガラスである。
【0136】
当業者によって認識されるように、カートリッジは、反応チャンバー、インレットおよびアウトレットポート、熱電気構成要素を含む加熱要素、RFアンテナ、電磁気構成要素、メモリーチップ、シーリング構成要素、例えばガスケット、相互接続を含む電気的構成要素、マルチプレクサー、プロセッサーを含むある数の構成要素を含むことができる。
【0137】
該装置は、バイオチップ、同じまたは異なる型のバイオチップを受けるように構成されたカートリッジステーションのある数を含み、種々の型のバイオチップの分析を可能とする。該ステーションは、限定しないがサーモコントローラー、シグナリングシステム、漏れ検出のためのセンサー、英数字ディスプレイ、および検出器を含む広範の種々の構成要素を含むことができる。好ましい実施態様が電気化学的検出による電極を含むバイオチップの使用を含むとき、該装置および/またはステーションは、検出プロセスで使用される装置ボードおよびプロセッサーを含むことができる。バイオ分子のアレイを含むバイオチップカートリッジは、種々のやり方で形成されることができる。例えば、チップは、試薬の導入および除去のためのインレットオヨビアウトレットポートを有する反応チャンバーを含むことができる。加えて、該カートリッジは、マイクロ流体構成勝訴を有するキャップおよび蓋を含むことができ、その結果該サンプルを導入し試薬を添加し、反応をさせ、それから検出のためサンプルを除去することができ、引用によりここに全体を含ませる2001年7月11日出願米国出願09/904175に詳細に記載される通りである。
【0138】
好ましい実施態様では、該カートリッジは、反応チャンバーを含む。一般に、該反応チャンバーは、サンプルの、バイオチップアレイへの接触をもたらす空間および体積を含む。反応チャンバーの体積は、アレイのサイズおよびなされるアッセイに依存して変化することができる。一般に、反応チャンバーは、1nLないし約1mL、好ましくは約1ないし約250μL、特に好ましくは約10ないし約100μLの範囲であり得る。ある実施態様では、エアバブルの、反応チャンバーへの導入を避けるため(それは検出を破壊させうる)、反応チャンバーは、導入されるサンプルのサイズよりも小さく、わずかなオーバーフローを可能とし、そうしてエアーが少ないまたはない反応チャンバーを確保する。
【0139】
カートリッジの反応チャンバーは、分析されるべきサンプルの導入のためのインレットポートを含む。該インレットポートは、所望により、反応チャンバーからのサンプルまたは試薬の蒸発を防止または減少させるシールを含み得る。好ましい実施態様では、シールは、ピペットまたはシリンジを押すことができるガスケットを含む。該ガスケットは、ゴムまたはシリコンまたは他の好適な材料、例えばセルロースを含む材料であることができる。
【0140】
該反応チャンバーは、種々のやり方で構成できる。好ましい実施態様では、該反応チャンバーは、エアバブルまたは他のサンプル不純物の導入または保持を最小化するように構成される。こうして、好ましい実施態様では、該反応チャンバーはさらに、アウトレットポートを含み、エアや過剰のサンプルが反応チャンバーをでていくのを可能とする。こうして流体サンプルは、反応チャンバーに流れ、そしてアレイと接触する。ある実施態様では、該アウトレットポートは、排液貯蔵ウェル、チップまたはカートリッジの外部表面にはけ口をつくり、または、好ましい実施態様では、インレットポートに戻る。こうして例えば好ましい実施態様は、出口ポートがインレットポートへ、好ましくは、負荷の点の上にはけ口をつくる、システムを利用する。例えば、ピペットを使用し、カートリッジに負荷するとき、ピペットのティップは出口ポートの下に伸長し、その結果出口ポートからのエアーは、反応チャンバーに導入されない。加えて、カートリッジハウジングおよびバイオチップの材料は、親水性または疎水性において類似であるように選択し、エアーバブルの創出を回避できる。
【0141】
加えて好ましい実施態様では、反応チャンバー/インレットおよび/またはアウトレットポートは所望により、バルブの使用を含む。例えば半透性膜またはフィルターを使用し得、それは優先的に、気体の排出を可能とするがチャンバーないにサンプルを保持する。例えば、多孔性テフロン(登録商標)、例えばGortex(登録商標)は、流体でなくエアーの貫通を可能とする。
【0142】
当業界で認識されるように、このやり方で使用し得る種々の反応チャンバー幾何学がある。一般に、インレットポートと反応チャンバーのインターセクションを、小さい隙間口を有するカートリッジの「底」に、反応チャンバーを広げつつ、もたらすことが好ましい。加えて、反応チャンバーの「頂部」もまた狭まる。こうして反応チャンバーのサイズおよび形状について好ましい実施態様は、反応チャンバーの円滑な負荷を可能とする。好ましい実施態様は、鋭いコーナーまたはバブル形成のための点として供する他の構成要素の使用を回避する反応チャンバー幾何学を利用する。
【0143】
加えて、ある実施態様では、反応チャンバーは、サンプルの混合を可能とするように構成できる。例えば、サンプルおよび試薬を同時的にまたは別個にチャンバーに導入するとき、インレットポートおよび/または反応チャンバーは、堰、チャンネルまたはサンプルと試薬の混合を最大とする他の構成要素を含む。加えて、以下に概説するように、反応は、混合および/または分離のための磁性ビーズを利用し得る。
【0144】
好ましい実施態様では、該カートリッジは、シーリング機構を含み、サンプルまたは試薬の、基質の他の部分上への、特に(電気的検出の場合に)電極相互連結上ヘの漏れを防止する。当業者に認識されるように、これは種々の異なる形態をとりうる。ある実施態様では、アレイを含むバイオチップ基質と、シート、管またはストリップを含むカートリッジの間にガスケットがある。代替的には、使用されるゴムまたはシリコンストリップまたは管があり得る;例えばハウジングは、該ガスケットがはまり、それからハウジング、ガスケットおよびチップが一緒にしまるギザギザまたはチャンネルを含み得る。さらに、ガスケットをカートリッジを付着させるために使用できる接着剤、例えば両面接着剤を使用し得る;例えばシリコン、アクリル、および接着剤の組み合わせを使用し、ガスケットをバイオチップへ付着することができ、これを次いで、ここに記載のようなカートリッジないへ締めることができる。
【0145】
ある実施態様では、反応チャンバーおよびバイオチップ基質は、別個のシーリング機構が要されないように構成される。例えば、バイオチップ基質は内部のアレイとともに、反応チャンバーの「半分」として供することができ、反応チャンバーハウジングは、他の「半分」として供することができる。使用される材料に依存して、2つを付着させるための所望の接着剤があり得る。代替的に、基質の両側上のアレイがあるとき、該ハウジングは、基質を包含し得る。
【0146】
こうして、これらの実施態様では、反応チャンバーの体積は、カートリッジ中にウェルを形成させその結果バイオチップ基質の添加が、アレイ周辺に反応チャンバーを形成するようにすることによって、または平面カートリッジを使用することおよび規定の深さガスケットを使用することによって、または2つの組み合わせによってセットできる。
【0147】
好ましい実施態様では、カートリッジは、キャップまたは蓋を含む。キャップは、それがマイクロ流体構成要素を含むとき、以下に概説されるように機能性であり得る。加えて、キャップは安全目的のため、生物学的材料の漏出または交差汚染を防止するように設計し得る。追加的に、該キャップは取り外し可能に設計できる。当業者に認識されるように、キャップは、種々の構成をとることができる。例えばある実施態様では、該キャップは単にインレットポートをシールし、アッセイ中のサンプルの蒸発を防止することができる。好ましい実施態様では、該キャップは、サンプル取り扱いおよび試薬貯蔵における使用のために追加的要素のある数を含み得る。例えば、種々のマイクロ流体構成要素を、キャップに確立し、最終的に標的検体検出または定量をもたらすサンプル上のある数の操作をもたらすことができる。全般に、すべて引用により含める、PCTUS00/10903およびそこに概説される引用参照。これらの操作は、細胞取り扱い(細胞濃縮、細胞溶解、細胞除去、細胞分離等)、所望の標的検体の、他のサンプル構成要素からの分離、標的検体上の化学的または酵素的反応、標的検体の検出等を含むことができる。本発明の装置は、サンプル操作、廃液または試薬のための1または2以上のウェル;エレクトロフォレチック分離マトリクスを含むマイクロチャンネル、これらのウェルへおよびそれらの間のマイクロチャンネル(ときにフローチャンネルと称する);流体移動を制御するバルブ;チップ上ポンプ、例えば電気的浸透性、電気的流体力学的、または電気的力学的ポンプを含むことができる。加えて、ここに概説するように、装置の内部表面の部分は、必要により種々の被覆で被覆し、非特異的結合を減少させ、生物両立性、流動抵抗性等のために、結合リガンドの付着をもたらし得る。これらのマイクロ流体キャップは、種々のやり方で、当業者に認識されるように、作成できる、例えば引用によりここに明示的に含める、PCTUS00/10903およびそこに概説される引用参照。
【0148】
カートリッジのキャップをアッセイの部分として使用するとき、それを、ここに「モジュール」として言及する、1または2以上の種々の構成要素を含むように構成し得、これはその用途に依存しておよびマイクロチャンネルによって要求されるように任意の所定の装置上に存在する。これらのモジュールは限定しないが:サンプルインレットポート;サンプル導入または収集モジュール;細胞取り扱いモジュール(例えば細胞溶解、細胞除去、細胞濃縮、細胞分離または捕捉、細胞成長等);分離モジュール、例えば電気泳動、ジエレクトロフォレシス、ゲルろ過、イオン交換/アフィニティクロマトグラフィー(捕捉および放出)等;標的検体の増幅を含む(例えば標的検体が核酸であるとき、増幅技法は有用な、限定しないがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA);鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列に基づく増幅(NASBA)およびWO99/37819およびPCTUS/19889に概説される他の技法を含む)、サンプルの化学的または生物学的変化のための反応モジュール、標的検体の化学的、物理的または酵素的切断または変化、または標的の化学的修飾;流体ポンプ(限定しないが、電気的浸透性、電気的流体力学性、または電気的力学的ポンプを含む;流体バルブ;加熱または冷却のための熱的モジュール;アッセイ試薬のための貯蔵モジュール;混合チャンバー;および検出モジュールを含む。
【0149】
加えて、カートリッジのキャップと会合されるように、これらのマイクロ流体構成要素はここに記載される一方、当業者に認識される通り、これらのモジュールおよびチャンネル(並びにここに概説の他の構成要素)は、カートリッジまたは装置のいずれかの場所に位置し得る。加えて、巣構成要素は、装置中に存在し得;例えば「オフチップ」ポンプが、装置の1または2以上のステーションないに位置し得る。
【0150】
該カートリッジは、少なくとも1つのバイオチップを含み、ある実施態様は、カートリッジあたり1または2以上のバイオチップを利用する。
【0151】
標識の検出は、標的配列の存在を指摘する。以下に記載のすべての技法は、捕捉プローブまたはSBEプローブ配列に相補的な配列を含む標的配列のハイブリダイゼーションの結果として、表面上のアッセイ複合体の形成による。
【0152】
本発明のアッセイを稼動させる3つの一般的やり方がある。すなわち、ハイブリダイゼーションは、直接的または間接的(サンドイッチタイプ)であることができる。第1の実施態様では、「標的配列」または「標的検体」を標識する;標的配列の結合はこうして、固体指示体の表面に標識を提供する。代替的に第2に実施態様では、非標識標的配列を使用し、そして「サンドイッチ」形式を利用する;この実施態様では、標的配列分子あたり使用される少なくとも2つの結合リガンド;「捕捉」または「アンカー」結合リガンドであって(またここに「捕捉プローブ」として言及し、特に核酸結合リガンドと言及する)これはここに記載のように検出表面に付着されるもの、および可溶性結合リガンド(頻繁にここに「シグナリングプローブ」または「電子移動部分」として言及する)であって標的配列に独立的に結合し、そして少なくとも1つの標識を直接的または間接的に含むものがある。
【0153】
別の好ましい実施態様では、検出技法は、すべてここに引用により全体を含ませる、米国出願60/073011、米国特許5681702、5597909、5545730、5594117、5591584、5571670、5580731、5571670、5591584、5624802、5635352、5594118、5359100、5124246、および5681697に全般に記載される通りである「サンドイッチ」アッセイを含む。サンドイッチアッセイは、プライマーの変化という結果となるが、サンドイッチアッセイは、シグナル増幅技法を考えることができ、というのは、多重シグナル(すなわち標識プローブ)が、単一の標的に結合され、シグナルの増幅をもたらすからである。サンドイッチアッセイを、標的配列が標識を含まないときに;すなわち標識を含む二次的プローブを使用しシグナルを生成するときに使用する。ここに記載のように、サンドイッチアッセイは、一次的標的配列(例えば患者サンプル由来)の検出のために、または前記のような増幅反応の産物を検出するための方法として、使用できることが注意されるべきである。
【0154】
種々の検出方法を使用し得、限定しないが、蛍光、リン蛍光、発光、化学発光、電気化学発光、および屈折指数を含む、光学的検出(酸化還元状態が変化におけるスペクトル変化の結果として);および限定しないが、アムペロメトリー(amperommetry)、ボルタンメトリー、キャパシタンスおよびインピーダンスを含む電気的検出;および限定しないが遷移金属錯体、有機ETMおよび電極を含む電気化学的検出を含む。電子移動の検出は一般に、電子的に、好ましくは電位差により開始される。電圧はアッセイ複合体に印加される。印加されるで電圧の正確な制御および変化は、定電圧および3つの電極システム(1つの参照、1つのサンプル(または作動)および1つのカウンター電極)または2つの電極システム(1つのサンプルおよび1つのカウンター電極)を介するものである。これは、印加される電圧の、ピーク電圧ヘのマッチングを可能とし、これは一部はETMの選択(レポーターを使用するとき)および一部は他のシステム構成要素、単層の組成および強度、およびどの参照電極の型を使用するかに依存する。
【0155】
ある実施態様では、検出分子を、標的配列の光学的検出を可能とするように構成する。ここに、該検出表面は、前記の捕捉プローブの付着のために好適な任意の表面を含み得る。一般に、標的配列の光学的検出は、「標識として」標的配列上の着色または発光色素を提供することに関係する。好ましい標識は限定しないが、ユーリピウムおよびテルビウムのそれら、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、Malaciteグリーン、スチルベン、Lucifer Yellow、Cascade Blue(登録商標)、Texas Red、1,1’−[1,3−プロパンジイルビス[(ジメチルイミノ−3,1−プロパンジイル]]ビス[4−[(3−メチル−2(3H)−ベンズオキサゾリルイデン)メチル]]−、テトラヨージド(tetraioide)(これはYOYO−1の名前で売られ)、引用により明示的にここに含める、Molecular Probes Handbook by Richard P. Hauglandの第6版に記載されるその他を含む蛍光ランタニド錯体を含む。
【0156】
好ましい実施態様では、ストレプトアビジン−Alexaシステムを、検出のために使用する。ここにサンプルを当初に、ビオチニル化プライマーでの増幅により加工し、ビオチニル化アンプリコンを生じさせる。該アレイマトリックスを次いで、これらのビオチニル化アンプリコンと接触させる。アンプリコンの、オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションを、蛍光色素、Molecular Probes, Inc.から購入したAlexa色素へコンジュゲートしたストレプトアビジンの付加によって測定する。ビオチン−ストレプトアビジン相互作用のために、該色素は、アレイマトリクスのこれらの区別可能な位置へ局在化し、ここでオリゴヌクレオチドプローブがビオチニル化アンプリコンにハイブリダイズする。すべての他の位置は、ビオチニル化アンプリコンがなく、こうして該色素はない。色素の存在を、任意の種々のやり方で検出し得、そして検出は、自動化データ加工を可能とするため自動化し得る。
【0157】
結合後、種々の技法は、蛍光標識によって発される放射の検出を可能とする。これらの技法は、溶液中のまたは光ファイバーに付着された核酸プローブと光ファイバーセンサーを使用することを含む。蛍光を、光電子増幅管または光ファイバーに付着された他の光検出装置を使用して監視する。
【0158】
加えて、走査蛍光検出器、例えばMolecualr Dynamicsによって売られるFluorimagerを、固体表面上に配列された修飾された核酸分子の蛍光を監視するために理想的に適合化させる。このシステムの利点は、数千の区別可能な核酸プローブでカバーされるチップを使用して一度に走査できる電子移動プローブの多数である。
【0159】
さらに、光ダイオード、CCDカメラ、またはアクティブピクセルシステムを使用し、蛍光標識によって発される放射を画像化し得る。
【0160】
これらの方法はまた、直流または交流電流に基づく時間または頻度依存方法、パルス方法、ロックイン技法、ろ過(高通過、低通過、帯域通過)、および時間分解蛍光を含む時間分解技法を含む。
【0161】
電気化学的検出のために、標的配列は、電気化学的に活性なレポーター(またここに電子移動部分(ETM)として言及する)例えば以下に規定の遷移金属錯体を含むことができる。ETMは、核酸、標的配列、または可溶性結合リガンドのいずれかに付着でき、引用によりその全体をここに明示的に含めるWO98/20162に一般に概説される通りである。
【0162】
ひとたびアッセイ複合体が形成されると、ETMの存在または不存在を、以下に、およびすべて引用によりそれらの全体をここに明示的に含める、米国特許5591578、5824473、5770369、5705348および5780234、米国出願08/911589、09/135183、09/306653、09/134058、09/295691、09/238351、09/245105および09/338726およびPCT出願WO98/20162、WO00/16089、PCTUS99/01705、PCTUS99/01703、PCTUS00/10903およびPCTUS99/10104に記載される通り検出する。
【0163】
用語「電子供与体部分」、「電子受容体部分」および「ETM」(または文法的同等品はここに、ある種の条件下で電子移動が可能な分子を言及する。電子供与体および受容体能力は相対的であると理解されうべきであり;すなわちある種の実験条件下で電子を失うことのできる分子は、種々の実験条件下で電子を受容することができる。可能な電子供与体部分および電子受容体部分の数は、非常に大きくそして、電子移動化合物の当業者は、本発明の化合物のある数を利用することができることが理解されるべきである。好ましいETMは限定しないが、遷移金属錯体、有機ETMおよび電極を含む。
【0164】
好ましい実施態様では、ETMは遷移金属錯体である。遷移金属は、原子が、電子の部分的または完全なd殻を有するものである。本発明の用途のため好適な遷移金属は、限定しないが、カドミウム(Cd)、銅(Cu)、コバルト(Co)、パラジウム(Pd)、亜Rん(Zn)、鉄(Fe)、ルテニウム(Ru)、ロジウム(Rh)、オスミウム(Os)、レニウム(Re)、白金(Pt)、スカンジウム(Sc)、チタニウム(Ti)、バナジウム(V)、クロム(Cr)、マンガン(Mn)、ニッケル(Ni)、モリブデン(Mo)、テクネチウム(Tc)、タングステン(W)、およびイリジウム(Ir)を含む。すなわち、第1族遷移金属、白金属(Ru、Rh、Pd、Os、IrおよびPt)と、Fe、Re、W、MoおよびTcが好ましい。特に好ましいのは、ルテニウム、レニウム、オスミウム、白金、コバルトおよび鉄である。
【0165】
当業界で認識されるように、共リガンドは同じまたは異なることができる。好適なリガンド、2つのカテゴリに分類される:窒素、酸素、硫黄、炭素またはリン原子を使用するリガンド(金属イオンによる)であってコーディネーション原子(一般に文献でシグマ(σ)供与体として言及される)のようなもの、および有機金属リガンド、例えばメタロセンリガンド(一般に文献でpi(Π)供与体として言及され、ここにLmとして示す)。好適な窒素供与リガンドは、当業界で知られ、および限定しないがNH2;NHR;NRR’;ピリジン;ピラジン;イソニコチンアミド;イミダゾール;ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体;テルピリジンおよび置換誘導体;フェナントロリン、特に1,10−フェナントロリン(phenと略す)およびフェナントロリンの置換誘導体、例えば4,7−ジメチルフェナントロリンおよびジピリドル(dipyridol)[3,2−a:2’,3’−c]フェナジン(dppzと略す);ジピリドフェナジン;1,4,5,8,9,12−ヘキサアザトリフェニレン(hatと略す);9,10−フェナントレンキノンジイミン(phiと略す;1,4,5,8−テトラアザフェナントレン(tapと略す);1,4,8,11−テトラ−アザシクロテトラデカン(cyclamと略す)、EDTA、EGTAおよびイソシアニドを含む。縮合誘導体を含む置換誘導体をまた使用し得る。ある実施態様では、ポルフィリンおよびポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用し得る。例えばすべて引用によりここに明示的に含めるComprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., PErgammon Press, 1987, Chapter 13.2(pp73-98), 21.1(pp.813-898)and 21.3(pp.915-957)参照。
【0166】
遷移金属錯体に加えて、他の有機電子供与体および受容体を、本発明の用途のために核酸に共有付着させ得る。これらの有機分子は限定しないが、リボフラビン、キサンテン色素、アジン色素、アクリジンオレンジ、N,N’−ジメチル−2,7−ジアザピレニウムジクロリド(DAP2+)、メチルビオロゲン、エチジウムブロミド、キノン、例えばN,N’−ジメチルアントラ(2,1,9−def:6,5,10−d’,e’,f’)ジイソキノリンジクロリド(ADIQ2+);ポルフィリン([メソ−テトラキス(N−メチル−x−ピリジニウム)ポルフィリンテトラクロリド]、バルラミンブルーBヒドロクロリド、Bindschedlerの緑;2,6−ジクロロインドフェノール、2,6−ジブロモフェノールインドフェノール;Briliantクレストブルー(3−アミノ−9−ジメチル−アミノ−10−メチルフェノキシアジンクロリド)、メチレンブルー;NileブルーA(アミノアフトジエチルアミノフェノキシアジンサルフェート)、インジゴ−5,5’,7,7’−テトラスルホン酸、インジゴ−5,5’,7−トリスルホン酸;フェノサフラニン、インジゴ−5−モノスルホン酸;サフラニンT;ビス(ジメチルグリオキシマト)−鉄(II)クロリド;インヅリンスカーレット、中性赤、アントラセン、コロネン(coronene)、ピレン、9−フェニルアントラセン、ルブレン、ビナフチル、DPA、フェノチアゼン、フルオルアンセン、フェナントレン、クリセン、1,8−ジフェニル−1,3,5,7−オクタテトラセン、ナフタレン、アセナフタレン、ペリレン、TMPDおよびこれらの化合物のアナログおよび置換誘導体を含む。
【0167】
特異的ETMの選択は、使用される電子移動検出の型によって影響を受け、全体に以下に概説の通りである。好ましいETMは、メタロセンであり、フェロセンが特に好ましい。
【0168】
好ましい実施態様では、複数のETMを使用する。
なおさらなる好ましい実施態様では、Xanthon(登録商標)アレイ技法を、使用する。Xanthon技法は、サンプル精製、蛍光の増幅または使用、化学発光または放射性標識なく標的核酸を直接的に検出する電気化学的プラットフォームである。この技法は、可溶性電子移動メディエーターに基づき、表面上の酸化可能グアニン残基の数を定量する。すなわち、標的配列が存在するとき、グアニンの量が増加し、こうして電子移動の増加を生じる (例えば、 An ionic Liquid Form of DNA:Redox-Active Molten Salts of Nucleic Acids. A. M. Leone, S. C. Weatherly, M. E. Williams, R. W.Murray*, H. H. Thorp* J. Am. Chem. Soc., 2001,123,218-222. Mediated electrochemical detection of nucleic acids for drug discovery and clinical diagnostics. N. Popovich IVD Technology, 2001,7,36-42.Oxidation of 7-Deazaguanine : Mismatch-Dependent Electrochemistry and Selective Strand Scission. l. V. Yang, H. H. Thorp* Inorg. Chem., 2001,40,1690-1697. Oxidation Kinetics of Guanine in DNA Molecules Adsorbed to Indium Tin Oxide Electrodes. P. M. Armistead, H. H. Thorp* Anal. Chem., 2001,73,558-564. Proton-Coupled Electron Transfer in Duplex DNA: Driving Force Dependence and Isotope Effects on Electrocatalytic Oxidation of Guanine. S. C. Weather ! y, !. V. Yang, H. H. Thorp* J.Am. Chem. Soc., 2001,123,1236-1237. Effects of Base Stacking on Guanine Electron Transfer:Rate Constants for G and GG Sequences of Oligonucleotides from Catalytic Electrochemistry. M. F.Sistare, S. J. Codden, G. Heimlich, H. H. Thorp* J. Am. Chem. Soc., 2000,122,4742-4749.Electrocatalysis of Guanine Electron Transfer: New Insights from Submillimeter Carbon Electrodes. V.A. Szalai, H. H. Thorp* J. Phys. Chem. B., 2000,104,6851-6859. Electron Transfer in Tetrads:Adjacent Guanines are not Hole Traps in G Quartets. V. A. Szalai, H. H. Thorp* J. Am. Chem. Soc., 2000,122,4524-4525. Kinetics of Metal-Mediated, One-Electron Oxidation of Guanine in Polymeric DNA and Oligonucleotides Containing Trinucleotide Repeat Sequences. l. V. Yang, H. H. Thorp* Inorg. Chem., 2000,39,4969-4976. Modification of Metal Oxides with Nucleic Acids: Detection of Attomole Quantities of Immobilized DNA by Electrocatalysis. P. M. Armistead, H. H. Thorp* Anal.Chem., 2000,72,3764-3770. Electrochemical Detection of Single-Stranded DNA using Polymer-Modified Electrodes. A. C. Ontko, P. M. Armistead, S. R. Kircus, H. H. Thorp* Inorg. Chem., 1999, 38,1842-1846. Electrocatalytic Oxidation of Nucleic Acids at Electrodes Modified with Nylon and Nitrocellulose Membranes. Mary E. Napier and H. Holden Thorp J. Fluorescence, 1999, 9: 181-186. Electrochemical Studies of Polynucleotide Binding and Oxidation by Metal Complexes:effects of Scan Rate, Concentration, and Sequence. M. F. Sistare, R. C. Holmberg, H. H. Thorp* J.Phys. Chem. B, 1999,103,10718-10728. Site-Selective Electron Transfer from Purines to Electrocatalysts : Voltammetric Detection of a Biologically Relevant Deletion in Hybridized DNA Duplexes. Patricia A. Ropp and H. Holden Thorp Chem. and Biol., 1999. Electrochemical Detection of Single-Stranded DNA using Polymer-Modified Electrodes. A. C. Ontko, P. M. Armistead, S. R. Kircus,H. H. Thorp* Inorg. Chem. 1999,38,1842-1846. Electrocatalytic Oxidation of Nucleic Acids at Electrodes Modified with Nylon and Nitrocellulose Membranes. Mary E. Napier and H. Holden Thorp J.Fluorescence 1999,9: 181-186. Electrochemical Studies of Polynucleotide Binding and Oxidation by Metal Complexes : Effects of Scan Rate, Concentration, and Sequence. M. F. Sistare, R. C. Holmberg,H. H. Thorp* J. Phys. Chem. B 1999,103,10718-10728. Site-Selective Electron Transfer from Purines to Electrocatalysts : Voltammetric Detection of a Biologically Relevant Deletion in Hybridized DNA Duplexes. Patricia A. Ropp and H. Holden Thorp Chem. and Biol. 1999,6: 599-605. Cutting Out the Middleman: DNA Biosensors Based on Electrochemical Oxidation. H. H. Thorp Trends in Biotechnol. 1998,16: 117-121. Probing Biomolecule Recognition with Electron Transfer:Electrochemical Sensors for DNA Hybridization. M. E. Napier, C. R. Loomis, M. F. Sistare, J. Kim, A. E.Eckhardt and H. H. Thorp Bioconjugate Chem. 1997,8: 996-913. Cyclic Voltammetry Studies of Polynucleotide Binding and Oxidation by Metal Complexes: Homogenouos Electron-Transfer Kinetics.D. H. Johnston, H. H. Thorp* J. Phys. Chem. 1996,100,13837-13843. Electrochemical Measurement of the Solvent Accessibility of Nucleobases Using Electron Transfer Between DNA and Metal Complexes. D. H. Johnston, K. C. Glasgow, H. H. Thorp J. Am. Chem. Soc. 1995,117,89338937.) The aforementioned references are hereby incorporated by reference. The following U. S. Patents also describe the Xanthon technology and are hereby incorporated by reference: U. S.Patent No. 6,180,346, Electropolymerizable Film, and Method of Making and Use Thereof; U. S. Patent No. 6,132,971, Electrochemical Detection of Nucleic Acid Hybridization; U. S. Patent No. 6,127,127,Monolayer and Electrode For Detecting A Label-Bearing Target And Method Of Use Thereof; U. S.Patent No. 5,968,745, Polymer Electrodes for Detecting Nucleic Acid Hybridization and Method of Use Thereof; U. S. Patent No. 5,871,918, Electrochemical Detection of Nucleic Acid Hybridization; U. S.Patent No. 5,171,853, Process of Cleaving Nucleic Acids with Oxoruthenium (IV) Complexes参照。
【0169】
電子移動の検出は一般に、電子的に、好ましくは電位差で開始する。電位差をアッセイ複合体に印加する。適用される電位差の正確な制御および変化は、ポテンシオスタットを介しておよび3電極システム(1つは参照、1つはサンプル(または作業)および1つはカウンター電極)または二電極システム(1つはサンプルおよび1つはカウンター電極)のいずれかを介して測定できる。これは印加された電位差の、システムのピーク電位差への適合を可能とし、これあETMの選択に一部依存(レポーターを使用するとき)および一部は、単層の他のシステム構成要素、組成およびインテグリティ、およびどの型の参照電極を使用するかに依存する。
【0170】
核酸ハイブリダイゼーションの新規検出方法を可能とする、電極を含む、電子移動部分を含む核酸を含む、新規組成物を記載する、すべて引用により明示的にここに含める、PCT出願WO95/15971、PCT/US96/09769、PCT/US97/09739、PCTUS99/01705、WO96/40712およびWO98/20162参照。
【0171】
好ましい実施態様では、アンペロンメトリー、ボルタンメトリー、キャパシタンス、およびインピーダンスを含む電気的検出を使用する。好適な技法は限定しないが、電気的重力測定;クーロメトリー(制御電位差クーロメトリーおよび定常電流クーロメトリーを含む);voltametry(サイクリックvoltametry、パルスvoltametry(通常のvoltametry、方形波voltametry、ディファレンシャルパルスvoltametry、Osteryoung方形波voltametryおよびcoulostaticパルス技法);ストリッピング分析(アニオヂックストリッピング分析、カチオヂックストリッピング分析、方形波ストリッピングブルタンメトリー);コンダクタンス測定(電気分解的コンダクタンス、直接分析);時間依存電気化学分析(クロノアンペロメトリー、クロノポテンシオメトリー、サイクリッククロノポテンシオメトリーおよびアンペロメトリー、ACポログラフィ、クロノガルバメトリー、およびクロノクーロメトリー);ACインピーダンス測定;キャパシタンス測定;ACボルタメトリー;および光電気化学法を含む。
【0172】
好ましい実施態様では、電子移動をモニタリングすることは、アンペロメトリー検出を介する。この検出方法は、電位差を(別個の参照電極と比較して)、目的の標的遺伝子を含有するサンプル中の、核酸コンジュゲート電極および参照(カウンター)電極の間に印加する事に関係する。異なる効率の電子移動は、標的核酸の存在または不存在のサンプルに誘導される;すなわち標的核酸の存在または不存在、その結果標識プローブは、異なる電流を生じることができる。
【0173】
アンペロメトリー的に電子移動を測定するための装置は、敏感な電流検出に関係し、そして電位差電圧を制御する手段、通常ポテンシオスタットを含む。この電圧は、標識プローブ上の電子供与複合体の電圧に対する参照で最適化される。可能な電子供与複合体は、先に述べたものを含み、好ましくは鉄、オスミウム、白金、コバルト、レニウム、およびルテニウムの錯体、そして最も好ましくは鉄の錯体である。
【0174】
好ましい実施態様では、代替的電子検出様式を利用する。例えばポテンシオメトリック(またはボルタメトリック)測定は、非ファラデー性(非ネット電流フロー)プロセスに関係し、そして伝統的に、pHおよび他のイオンディテクターにおいて利用される。類似のセンサーを使用し、ETMと電極の間の電子移動を監視する。加えて、絶縁体の(例えば抵抗)および伝導体の(例えばコンダクティビティ、インピーダンスおよびキャpシタンス)の他の特性は、ETMと電極の間の電子移動を監視するために使用し得る。最終的に、電流を生成する任意のシステム(例えば電子移動)はまた、小さい磁場を生成し、これはある実施態様で監視し得る。
【0175】
好ましい実施態様では、電子移動を、交流(AC)方法を使用して開始する。理論に縛られることなく、電極に結合されたETMは、一般に、抵抗器およびコンデンサーを含む回路にわたるAC電位差に類似して応答する。
【0176】
代替的に、レポーターのないまたは標識のないシステムを使用する。この実施態様では、2つの検出電極を使用し、標的配列結合の結果としての、キャパシタンスまたはインピーダンスの変化を測定する。一般に、両方引用により明示的に含める、1999年12月9日出願米国出願09/458533およびCPTUS00/33497参照。
【0177】
この実施態様では、標識のないシステムを使用して、2つの検出電極の表面を、ポリマーマトリクスの層でカバーする。
【0178】
標識、例えばETMを使用しないとき、他の開始/検出システムが好ましくあり得る。この実施態様では、固定化プローブ分子とサンプル混合物中の標的分子の間の分子相互作用を、ACインピーダンスを使用して電気的シグナルを検出することによって検出する。他の実施態様では、そのような分子相互作用を、インピーダンススペクトロスコピー、サイクリックボルタンメトリー、ACボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー、方形波ボルタンメトリー、ACボルタンメトリー、流体力学モジュレーションボルタンメトリー、コンダクタンス、ポテンシャルステップ方法、ポテンシオメトリック測定、アンペロメトリック測定、電流段階方法、他の定常状態または一過性測定方法、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される電気的または電気化学的検出方法を使用して電気的シグナルを検出することによって検出する。
【0179】
本発明の装置のある実施態様では、それぞれの試験電極の電気的インピーダンスを生産するための手段は、Model 1260 Impedance/Gain Phase Analyzer とModel 1287 Electrochamical interface(Solartron Inc., Houston, TX)を使用して達成する。他の電気的インピーダンス測定手段は、限定しないが、電気化学的セル、例えばACブリッジおよびACボルタメトリーに印加されたDC電圧上に重ねたACシグナル摂動を使用する一過性方法を含む。該測定を、すぐに検出または他には有利であるべく決定される電気的シグナル変化を特異的に生産する任意の特定の周波数で実行できる。そのような特定の周波数は、有路異には、周波数生産を確保する走査周波数、例えば電気的シグナルの最大の相違によって決定する。プローブと標的分子の間の分子相互作用の結果としてそれぞれの試験部位電極のインピーダンスの変化を決定する手段は、前記装置のいずれかを使用することによって達成できる。
【0180】
以下の例は前記発明を使用する態様をより十分に記載、並びに発明の種々の側面を実施するための完全なベストモードを示すするために供する。これらの例は、この発明の真の範囲を限定する目的に供さず、むしろ例示もくていのため提示することが理解される。ここに引用のすべての引用は、引用により全体を含める。
【0181】
実施例
実施例1:ヒト
P450SNPアッセイ
P450遺伝子の可能な臨床目的の突然変異(アリル)のリストは同定された。図3AないしDのワークシートは、多型(SNP)および当初アッセイ計画に取りこまれた遺伝子のそれぞれについての文献引用を記載する。P450アッセイは、所定の個々のDNAサンプル中に存在する選択されたSNPの種々の多型状態(アリル)を区別するように設計される。アッセイプロトコルは、2つの主要なプロセス領域に分解できる;標的調製およびシグナル検出。シグナル検出は、単一塩基伸長(SBE)として既知の技法を介して達成する。標的集団は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技法を使用して、もし興味あるならばヒトゲノム領域の特異的増幅に基づく。
【0182】
PCR技法を介するDNA増幅は、伸長および増幅のため使用される短いプライマー配列の設計に高度に依存する。P450アッセイのため、これらのプライマー配列の設計における困難性は、緊密に関連するP450遺伝子ファミリーの性質にある。P450遺伝子の全ては、50+遺伝子および25+偽遺伝子のスーパーファミリーに属し、そして顕著なレベルの(領域)相同性、特に同じサブファミリー中のそれらを共有し得る(すなわち、サブファミリー2Cは、遺伝子2C8、2C9、2C18、2C19等を含む)。同じサブファミリー中の遺伝子メンバーは、同じ染色体上に位置し、そして通常は、イントロンとエキソンの同一数を含む。付着の表は、2D6ファミリー中の遺伝子によって共有される相対的相同性を例示する(図4参照)。
【0183】
目的の標的遺伝子のみに特異的なプライマーを設計するアプローチは、プライマーの特に3’末端に焦点がある遺伝子サブファミリー関連遺伝子に対する塩基対ミスマッチを有する領域を選択することであった。この態様では、アニーリングハイブリダイゼーション特異性と、プライマーの3’末端からヌクレオチドを伸長するPCRポリメラーゼの識別の両方に基づく。プライマー設計は、さらに、19bpより大きい長さ、およびGC含量と対あたりのTmの観点のバランスに限定された。可能ならいつでも、プライマーはまた、3’末端で−AA−3’またはーCA−3’出終わるように選択され、プライマーダイマー形成を防止する。すべてのプライマー候補を、コンパイル化P450配列ライブラリー(57遺伝子)に対するBLASTアルゴリズム(相同性分析アルゴリズム)を使用して分析し、任意の潜在的な交差反応性プライマー候補を除去した。相同性分析に加えて、プライマー候補は、また、反復性配列のデータベースに対してスクリーニングした。図5は、増幅のため現在使用されるすべてのP450プライマーをカテゴリー化する。
【0184】
プライマーは、これらの領域が比較的より保存されている原理のため、遺伝子配列のエキソン領域において設計した。多くの場合に、ミスマッチ区別を含むエキソン領域は、離れており、300−6500bpの長さで変化するアンプリコンを生じる。このアンプリコン長の分散は、長いPCR条件のための増幅形式を書き取る。任意の非特異的産物を減少させ、かつ収率を維持するPCR条件の最適化は、以下の領域に焦点が合った:アニーリング温度、伸長時間、Mg2+濃度、プライマー濃度および酵素濃度。ヒトP450Codelinkプロトコルは、現行の所望のPCR条件を反映する(以下の実施例2参照)。
【0185】
2つの遺伝子、CYP2D6およびCYP2C19は、最大の臨床的興味のものであり、そしてまた、その類縁(relative)サブファミリー遺伝子への最高の相同性を有する。CYP2D6およびCYP2C19プライマーの特異性を評価するため、2D8、2D7A、2D7Bおよび2C9へ特異的なプライマーを設計した。実験を、ゲノムDNA標的を使用してすべてのプライマーで稼動し(プライマーが作動することを評価するため)、そして次いで標的としてCYP2D6およびCYP2C19希釈したアンプリコンとすべてのプライマ−を使用して再増幅した。もし任意の交差種増幅がCYP2D6およびCYP2C19のPCR中に発生したならば、CYP2D6/2C19希釈アンプリコンが再増幅するとこれらの交差産物が見られるだろうと思われる。交差増幅が存在する証拠は、2D6および2C19プライマーで観察されず、設計の特異性ヘの信頼を与える。
【0186】
単一DNAサンプルから増幅されたP450アンプリコンは、すべてのアンプリコンを合わせ、貯留した溶液を精製し(過剰のdNTPとプライマーの除去)およびPCR産物のフラグメント化によるSNP検出のため調製する。完全なプロトコルおよび方法は、実施例2に概説する。ひとたび標的調製を完了すると、方法の次の部分は、単一塩基伸長(SBE)を介するシグナル検出である。
【0187】
それぞれの単一ヌクレオチド多型の検出を、5’末端上のポリマー表面に結合されたわれわれのプローブの3’末端のSBEを介して達成する。プローブを、SNP位置の3’末端またはSNP+1との対で設計する。存在する標的への完全なマッチは、ハイブリダイゼーション中に動力学的に好ましく、そして最大のシグナル強度を生じる。ヘテロ接合性突然変異の場合には、対の両方のプローブは、比較的等しい強度を示す。検出の質はしたがって、プローブ設計の特異性および質に依存する。すべての当初プローブ設計を、部ローブ設計ソフトウェア包装、例えば「Peobe Design」を使用して加工する。同一の固定化参照配列を、プライマー設計のため使用されるIUPAC命名法を使用して同定されたSNPと同一の固定化参照配列を、プローブ設計に使用した。
【0188】
それぞれのSNPについて、プローブ候補を、両方の配列方向、センスおよびアンチセンスから設計した。方向に加えて、プローブを2つの異なるTmのもの、60℃と70℃で設計した。ここにプローブ配列が緊密に接近する多重SNPをオーバーラップさせる場合について、dITP(デオキシ−イノシントリフォスフェート)をかわりに使用し、ここで多型が、検出される(3’末端で)のと他の位置のプローブ上に存在する。dITPは、結合においてよりストリンジェントでなく、そしてその特定の位置でのミスマッチを可能とする。
【0189】
アッセイ分析の信頼性を増加させるため、2型のコントロールプローブを又設計した。10独特アンプリコンのそれぞれの首尾よい増幅を検出するためのプローブを、保存され、そして検出されるSNPから比較的分離している遺伝子配列(アンプリコンによってカバーされる)上の領域において設計した。もしこれらのアンプリコンコントロールプローブ(ASP)の1つがシグナルをもたらさないならば、このアンプリコンによって検出されるSNPは、分析からマスクされ、該アンプリコンがPCRしなかったものと思われる。2D6がこのアッセイのSNPの近似的に半分を含むから、2D7A、2D7B、および2D8についての偽遺伝子コントロールプローブ(PCG)を設計し、PCR反応が特異的で、かつ混合遺伝子種が存在しないことの追加的確認とする。
【0190】
すべてのプローブ候補は、実際のチップ確立およびアッセイ試験を介して当初成績スクリーニングの反復を通過させた。突然変異を最良に識別するプローブを選択した(金標準として使用された配列決定データ)。当初成績スクリーニング後、可能な自己伸長のためのバックグラウンド上のシグナルを示すプローブの多くは、1−2塩基オーバーラップの付加で再設計した。図6は、現在のP450アッセイのための最終的プローブリストを示す。これらのプローブの識別能力についての成績データを図7に要約する。
【0191】
実施例2:ヒトP450Codelinkプロトコル:発明のチップを稼動させるための好ましいプロトコル(図11ないし16参照)
製品説明
CodeLink(登録商標)SNP Bioarrays:Human P450は、チトクロムP450遺伝子に関連する96単一ヌクレオチド多型(SNP)を遺伝子型決定するためのツールである。CodeLink SNP Bioarrays:Human P450は、7ヒトチトクロムP450遺伝子のサブセットについての一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含む。これらの遺伝子は、CYP1A1、1A2、1B1、2C19、2D6、2E1および3A4である。4つの独立的アッセイを、それぞれのCodeLink SNP Bioarrays: Human P450上で実施できる。
【0192】
成績明細
この産物は、95%の応答割合(call rate)と98%の正確性を有する。
貯蔵および取り扱い
受け入れたら、Codelink SNP Bioarrays:HumanP450は、もとの包装では室温で貯蔵すべきである。
Motorola SBE KitおよびUniplex PCRプライマープレートは、−20℃で貯蔵すべきである。
【0193】
製品は限定を使用する
CodeLink SNP Bioarrays:Human P450は、調査用途のみのためであり、そして診断目的のため使用すべきでない。
すべての生物学的標本および材料は、感染を伝達することが可能であり、そして連邦、州および局地的規則にしたがって妥当な警戒で処置すべきである。これらはOSHA Bloodborne Pathogensへの忠実な支持を含む。
血液由来について標準(29CFR1910.1030)および他のサンプルは、この行為により律される。
警告
この処理のすべての工程の間のサンプル、試薬およびアレイの交差汚染を回避するために訓練が必要である。
微生物汚染を回避する。高微粒子含量の領域を回避する。
【0194】
アッセイプロトコル:標的調製および単一塩基伸長(SBE)
1.0 始動
1.1 Motorola試薬/キット
CodeLink SNP バイオアレイ : P450 ベータキット, Motorola, Part# 20002
Data Disk CD, Motorola, Part# 20006 P450 ベータPCRプライマープレート, Motorola, Part# 30007
SBE キット, Motorola, Part# 20006
・ ビオチニル化Acycloターミネーターヌクレオチドミックス
・ SBEバッファー
1.2 処方された試薬/キット
Roche Biochemicals
PCR-等級デオキシ-ヌクレオチドセット, Roche Biochemicals, Part# 1969064
Applied Biosystems
GeneAmps(登録商標) XL DNA ポリメラーゼ(3.3X XL バッファー, 25 mM 酢酸マグネシウム (Mg (OAc)2を含む), Applied Biosystems, Par# N808-0187 [400 単位] または Part# N808
0188 [2400 単位]
Life Technologies, Inc. (LTI)
DNアーゼ I 増幅等級 (1 U/uL) は、DNアーゼI 10X バッファー, LTI, Part# 18068-015と同梱されている
Ultrapure ddH20 (ヌクレアーゼフリー), Life Technologies, Inc. (LTI), Part# 15230-170
Aldrich
エチルアルコール,無水 99.5+%, Aldrich, Part# 15,190-4,または均等物
Qiagen QlAquick 8 PCR 精製キット, Qiagen, Part# 28142
Amersham
Thermo Sequenase(登録商標)(酵素のみ), Amersham, Part# E79000Y [1000 単位]またはPart# E79000Z [10,000単位]
Sigma
1 M Tris-cl pH 7.6 ストック溶液, Sigma, Part# T2788
5 M 塩化ナトリウム溶液, Sigma, Part# S5150
20X SSC, Sigma, Part# S6639
Molecular Probes
ストレプトアビジン, Alexa Fluor(登録商標) 532コンジュゲート, Molecular Probes, Part# S-1 1224
Fisher
Tween 20 (ポリオキシエチルフェンソリビタンモノタウレート) 酵素等級, Fisher, Part# BP337-100
1.3 ゲノムDNA (gDNA) サンプル品質
サンプルゲノムDNA (gDNA)は、0.450 mg/mLないし0.300 mg/mLの濃度であるべきである。推奨されるバッファーは 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0である。OD 260/280 は、1.71および1.79の間であるべきであり、そしてタンパク質濃度は0.9 mg/mg DNAより低いべきである。
【0195】
1.4 供給要
ワイヤースライドラック, VWR, Part# 25461-014,または均等物
ミクロ遠心
1. 7 mL マイクロ遠心管およびラック
溶液基礎, 55 mL, 滅菌, VWR, Part# 21007-972, または同等品
マイクロピペット (2 μL, 20 μL, 200μL, 1000μL)
滅菌エアロゾル抵抗性ピペットティップ
広オリフィスティップ, Rainin, Part# HR250W
MicroAmps(登録商標)透明接着性プレートシール, Applied Biosystems, Part# 4306311
15 mL ファルコンチューブ, VWR, Part# 21008-918, または同等品
96-ウェル収集マイクロプレート RB, Qiagen, Part# 19581
0. 2 mL 96-ウェルプレート, Marsh Bio Products, Part# T0296PE
チャンバー除去取りつけ具, Motorola, Part# 100017
パウダーフリー手袋
スライド貯蔵箱
【0196】
1.5 ライセンス要
Applied Biosystems or Hoffman-LaRoche and F.Hoffman-LaRoche Ltd.からのPCR実施のためのライセンス
1.6 設備要
熱サイクラー, Applied Biosystems GeneAmp(登録商標) PCR System 9700, Part# N805-0001
96-ウェルプレート円筒状遠心, Qiagen, Part# 81010
QlAvac 6S, Qiagen, Part# 19503
QlAvacプレートホルダー, Qiagen, Part# 19548
ろ過済みddH2O源, Barnstead または同等品
Hybaid Omnislide Thermal Cycler, Motorola, Part# 600002
Hybaid Omnislide Wash Module, Motorola, Part# 60003
Hybaid Ambient Rack, Motorola, Part# 600074
GenePix(登録商標)4000 Axon Scanner, Motorola, Part# 600000
コンピューター, Motorola, Part# 600001
CodeLink(登録商標)システムソフトウェア:
・ 分析, Motorola, Part# 20004
・ 走査, Motorola, Part# 200003
【0197】
1.7 試薬調製
以下の試薬は、アッセイの開始前に調製すべきである。ただし染色溶液はこの限りでない。
標的調製試薬
全ての標的調製に使用される水は、LTIからの超純粋ddH2O (ヌクレアーゼフリー)であるべきである。
2. 5 mM dNTP 溶液
PCR-等級のデオキシヌクレオチドセットを使用して、以下を使用する20mLの溶液を作成:
0.5 mL 100 mM dTTP
0.5 mL 100 mM dATP
0.5 mL 100 mM dGTP
0.5 mL 100 mM dCTP
18 mL の超純粋 ddH2O
5,4 mL アリコートに分割しそしてdNTP ミックスを-20℃で15 mL管中で貯蔵する。
PCR マスターミックス
41 mL (1000 PCR 反応または83 サンプルのために十分) :
20.0 mL 超純粋 ddH20
15.0 mL GeneAmp XL 3.3X バッファー II (使用前に強撹拌する)
2.0 mL Mg (OAc) 2
4.0 mL 2.5 mM dNTP 溶液
5,8 mL アリコートに分割しそして-20℃で貯蔵する( 1 mL過剰があるであろう).
DNアーゼ 1X バッファー
1 mLとするために;
900 μL 超純粋ddH20
100 μL DNアーゼ 10X バッファー
-20℃で貯蔵する。
希釈されたゲノム DNA (gDNA)
60 μLとするために:
58 μL 超純粋 ddH20
2 μL gDNA
【0198】
反応後加工試薬
1 L 洗浄溶液を作成するため :
250 mL の 20X SSCを、750 mL のろ過したddH2Oに添加する。
良く混合する.室温で貯蔵し
使用前にHybaid Omnislide Wash Module中で60℃に予備加熱する。
1 L 染色希釈液を作成するため:
918 mL のろ過したddH20と30 mLの5 M NaClと50 mLの1 M Tris-HCl pH 7.6を合わせる。2 mLのTween 20を添加し良く混合する。室温で貯蔵する。
2 mLのストレプトアビジンAlexa希釈液とするため:
100μL の1 M Tris-HCl pH 7.6と、60 μLの 5 M NaClと 1840 pLの超純粋ddH2Oを合わせる。
1 mL ストレプトアビジン Alexa-Fluor 532 コンジュゲートとするため:
1 mL のストレプトアビジンAlexa希釈液を、結晶性ストレプトアビジンAlexa-Fluor 532コンジュゲートを含むバイアルに添加する.反転によって良く混合しそして4℃で貯蔵し、光から保護する。
染色溶液を作成するため:
使用の直前に調製する。
必要とされる染色溶液の体積を、
加工されたスライドの数に基づき(1-10スライドにつき300mL、11-20スライドにつき600mL)決定する。
300 mLの染色溶液のために,300 μLのストレプトアビジンAlexa-Fluor 532コンジュゲートと、
300 mL の染色希釈液を混合する. 600 mLの染色溶液のために、600μL のストレプトアビジン Alexa-Fluor 532コンジュゲート溶液と、600 mL の TNTを混合する。反転により良く混合する。
1 L 脱染色溶液を作成するため:
870 mLのろ過したddH2Oと、30 mLの5 M NaClおよび100 mLの1 M Tris-HCl pH 7.6を合わせる。良く混合し室温で貯蔵する。
【0199】
1.8 装置調製
具体的指示のために最初の製造者の使用者マニュアルを参照。
熱サイクラーGeneAmp 9700
以下のPCRプログラムを熱サイクラーに入力する:
a. 94℃で1: 00分
b. 94℃で0 : 30分
c. 68℃で4 : 00分
d. b と cを, 29回全部で30サイクル繰り返す。
e. 72℃で10: 00分
f. 4℃で永久
プログラムはそれが入力された最終工程を完了する後自動的に終わる。
"PCR"としてプログラムをセーブする。
熱サイクラー GeneAmp 9700
以下のプログラムをDNアーゼ標的フラグメント化のため、熱サイクラーに入力する:
a. 37℃で10: 00分
b. 95℃で10: 00分
c. 4℃で永久
プログラムは、それが入力された最終工程を完了する後に自動的に終わる。
プログラムを"フラグメント"としてセーブする。
Hybaid Omnislide熱サイクラー
模擬スライドプログラム型を選択しそして以下のSBE反応プラグラムを熱サイクラーに入力する:
a. 85℃で1 : 00分
b. 85℃で0: 30分
c. 60℃で10: 00分
d. 全部で8サイクルのためにステップbにさらに7サイクル行く。
プログラムは、入力された最終ステップをそれが完了する後に自動的に終わる。
プログラムを"01"として試みるときにセーブする。
【0200】
2.0 標的調製
2.1 PCR 反応
それぞれのサンプルのために45 uLのgDNAを近似的に10 ng/μLで必要とする。
それぞれのプライマープレートは、サンプルあたり12PCR反応で8サンプル収容する。
1. 適当な体積を使用して新しい1.7mLミクロ遠心管中でそれぞれのサンプルについて反応ミックスを調製する。
2. 45 μLの反応ミックスを、それぞれのサンプルのために配置されたプライマープレートにおける12ウェルレイアウトのそれぞえウェルに等分する(図12)。
3. 新しいApplied Biosystems接着プレートシールでプレートをシールする。
4. 1000 rpmで1分間遠心分離する。
5. すぐにGeneAmp PCR システム9700中のプレートに置く。セクション1.8で入力したプラグラム''PCR''を稼動させる。
表 1. それぞれのサンプルのためのPCR反応ミックスセットアップ。
【表1】 【0201】
2.2 PCR 貯留および精製
QlAquick 8 PCR精製キットを使用し、以下のプロトコルにしたがってプライマーおよびヌクレオチドを、PCR反応物から除去する。
1. PCRプログラム完了の12時間以内に熱サイクラーからプレートを除去する。
2. それぞれのサンプルのPCR反応物(12)を、それぞれのサンプルについて別個の新しい15mLコニカル管を貯留する。(総体積= それぞれの管あたり600μL)。
3.キットに提供される3,000 pLのPBバッファーを、ポールした標的を含む15mLの管のそれぞれに加える。ミックスを良く撹拌する。
4. 収集プレートないQIAvac 6Sバキュームマニフォールド上の新しいQlAquick 8-ウェルストリップを置く。
5. 15mLのコントロール管の全内容物を(あるとき3600mLあるとき9600mL)QlAquick 8-ウェルストリップのウェルの1つに、ハウス圧(150mbar)下でピペッティングする。
6. 他の7サンプルについて反復する。
7. キットに提供される1 mL の PE バッファー をサンプルを含むそれぞれのウェルに添加する。
8. PEバッファー添加を、ウェルあたり2mLの全部について反復する。
9.ハウス圧を切る。
10. 8-ウェル QlAquick トリップおよびスマックを除去しそして多量のペーパータオルをたたき、過剰のPEバッファーを除去する。
11.写し上の8ウェルQIAquickストリップを置換し、そしてハウス圧を5分間適用し、カラムを乾燥する。カバーを除去する。
12.新しいQIAquick収集プレートを、プレートホルダー上に置き、そして8ウェルQIAquickストリップ下に挿入する。カバーを除去する。
13.40μLのDNアーゼ1xバッファーをそれぞれのQIAquickウェルの中心に添加し、そして室温で1分間インキュベートする。
14.ハウス圧を1分間つけ、収集プレート中の精製されたPCR産物を収集する。
注:溶出のために提供されたEBバッファーを使用してはならない。
【0202】
2.3 DNAフラグメント化
以下のプロトコルにしたがってPCR産物を消化する:
1.QIAquick収集プレートからの精製されたPCR産物のそれぞれのウェルを、個々のサンプルの完全性および同一性を維持する新しい0.2mLのMarsh96ウェルプレートに移動する。
2.DNアーゼ1xバッファーの新しい1:300希釈を作成する。
3.10μLの希釈されたDNアーゼを、精製されたPCR産物を含むそれぞれのウェルに添加する。
4.すぐに、0.2mLのPCR96ウェルプレートを、熱サイクラー上に置き、そしてセクション1.8でプログラムした「フラグメント」プロトコルを稼動する。
注:フラグメント化を停止するためEDTAを使用してはならない;酵素は熱サイクリング中に熱不活性化する。
サンプルをここに、SBE反応のにおける直ちの使用のため用意し、またはSBE反応のため容易されるまでシールしたプレート注で−20℃でサンプルを貯蔵する。
【0203】
3.0 SBE反応
最大16スライドを、一度にHybaid Omnislide熱サイクラーで稼動することができる。
3.1 SBE反応マスターミックスを調製する
1.すべての反応構成要素(酵素を除く)を室温で融解する。これはPCR産物(もしまえに凍結されているならば)、10xヌクレオチドミックス、SBEバッファーおよび頂純粋ddH2Oを含む。
2.試薬を完全に融解するとき、それぞれを完全に強撹拌し、そして反応ミックスを調製する前にマイクロ遠心で15秒間回転する。
3.SBE反応マスターミックスを適当な体積で(酵素を除く)新しい1.7mLマイクロ遠心管に調製する(表2)。体積を稼動するアレイの総数に基づき調節する。(最大28アレイを、1つの1.7mL管中で調製できる)
4.酵素を、フリーザーから除去し、そして適当な体積(表2)を添加する。ピペッティングによってウェルを混合する。
5.直ちにすべての試薬を−20℃にもどす。
6.すべての試薬の添加後、管をおだやかに強撹拌する。15秒間マイクロ遠心を回転し、サンプルを合わせ、そして任意のバブルまたは泡を除去する。
表2 マスターミックスセットアップSBE反応
【表2】 【0204】
3.2 個々のSBE反応物を調製
1.混合および回転後、13μLのSBE反応マスターミックスを、それぞれの清浄で、ラベルされたマイクロ遠心管(図13)に移動する。
2.27μLの精製されたPCR標的を、それぞれの管に添加する。
3.3 反応混合物を、フレックスチャンバーに負荷する
フレックスチャンバーの負荷および熱サイクラー上の配置の間の時間は、45分を超えないべきである。スライドは、いずれのときも氷上に配置すべきではない。
1.それぞれのフレックスチャンバーのために、広オリフィスティップ中の40μLの反応混合物をアスピレートする(ティップ中にバブルがないのを確保する)。
2.適当なアレイポート上の90度の角度でピペットを配置し、そしてティップがポート上に接着しつつシールを形成するまで、下降圧力を適用する(図14)。これは該ポートの外部のもれを最小化し、そして導入チャンネルの阻止のリスクを減少する。
3.ピペッターの噴出し特性を使用することなく、ティップからかつアレイチャンバー内にサンプルをゆっくり射出する。アレイ領域を渡り移動する流体を見るであろう。滑らかで、平らな圧力を使用し、充填中の斉一割合を維持する。
4.流体が完全にチャンバーを充填し、かつわずかな過剰が反対のポートに出現した後、圧力を維持しそしてインプットポートからピペットを除去する。
5.フレックスチャンバーを充填し他後、エアーバブルの存在をチェックする。もし任意の大きい(>1.5mm)バブルが存在し、または任意のバブルがアレイの中心に出現するならば、該アレイは使用できない。ポート近くの小さいバブルは、成績に影響しないものとする。
【0205】
6.この負荷処理を、他のアレイチャンバーとスライドと、新しいティップを使用して、反復する。
注:ミス負荷の事象におけるフレックスチャンバーから流体を引き出すことを試みてはならない。
3.4 フレックスチャンバーをシールする
1.それぞれのスライド上のすべてのフレックスチャンバーが負荷された後、これらはシーリングのための用意ができている。
2.予備カットシーリングティップを選択肢、そして接着面を曝露するためピンセットを使用して裏材を除去する。注意深く取り扱い、該ストリップを、1の末端近くのスライドの端に適用する。ゆっくりと該チップを配置し、その結果それはスライドの1の側上の全4つのポートをカバーする(図15)。
注:接着は、チャンバーとの最初の接触で、かたくなる。チャンバー上にそれを配置するまえに、シーリングストリップが妥当な方向であることを確保するため、注意を用いる。ミス整列のシーリングストリップを除去することを試みてはならない。かわりに、任意の開いたポートをカバーするために、第2ストリップを配置する。
3.第2ストリップの適用を反復し、すべてのポートがシールされるまで残りの4つのポートおよびそれぞれのスライドをカバーする。
【0206】
4.すべてのストリップが適用されたとき、それぞれのポートを、ストリップ上にしっかりと加圧することによって安全にシールする。アレイ自体上に圧力を適用しないよう注意し、というのはこれは体積喪失を生じ得るからである。
3.5 熱サイクリング
1.50mLのろ過したddH2Oを、Hybaid Omnislide熱サイクラーの熱ブロック周辺のプラスチックチャンバーに加える。
2.それぞれの負荷されそしてシールされたスライド(フレックスチャンバーacing up)を、熱ブロック上に配置する。この工程には、通常使用されるラックを使用しない。スライドを、熱ブロック上直接的に、ブロックあたり8スライドで横たえる(図16)。
3.熱ブロックの上にカバーを配置し、そしてロックタブをまわすことによってしめる。
4.Omnislide制御パネル上の「メニュー」ボタンを押す。メニューから「Run」を選択し、それから「Enter」を押す。
5.プログラム「01」(セクション1.8でプログラムした)を入力する。ひとたび「01」プログラムを選択したら、「Enter」ボタンを押す。
注:100の適当なキャリブレーションファクターを、「Enter」ボタンを押したのちに置換する。
【0207】
4.0 反応後スライド加工
反応後スライド加工工程のために、使用したそれぞれの溶液の体積は、加工されるスライドの数に依存する。1−10スライドのために、300mLの指定溶液を使用する。11−20スライドのために、600mLの指定溶液を使用する。
4.1 Hybaid洗浄ステーションを調製する。
注:Hybaid洗浄機のために2つのスリーブおよび1つのラックがスライド加工のために必要となる。
1.スリーブ1を、適当な体積の予め加熱した洗浄溶液で満たす。ステーション中にスリーブを配置し、そして温度を60℃にセットする。
2.スリーブ2およびラックを、ろ過したddH2O源とともに流しにとり、そして適当体積でスリーブを満たす。
4.2 フレックスチャンバーを除去する
1.プログラム完了の15分以内に熱サイクラーからスライドを除去する。
注:この工程中にスライドを乾燥させてはならない。もし乾燥に気づいたら、バックグラウンドノイズの増加につながり得るので、発生の記録をする。
2.ここにラックおよびスリーブを配置される、流しにスライドをとる。ろ過したddH2O源をだす(ddH2Oで満たした500mLの油差しボトルを、また使用できる)。
【0208】
3.パウダーフリー手袋を着用し、スライドをチャンバー除去取りつけ具中に配置する。フレックスチャンバーの除去タブ部分を握り、そしてスライドを安全に保持しつつ、フレックスチャンバータブをゆっくりひきもどし、次いで最初のアレイ領域を曝露させる。
4.直ちに、曝露したアレイ領域を、ろ過したddH2Oですすぎ、そしてろ過したddH2O流中にチャンバー除去取りつけ具を保持することによって、SBE反応溶液をすすぎさる。
5.最初のアレイをリンスしたのち、フレックスチャンバーを引き戻すことを継続し、第2アレイを曝露させ、それから直ちにろ過したddH2Oでそれをすすぐ。
6.この方法を、4つのアレイが逐次的に曝露され、そしてできるだけ速やかにすすぐまで反復する。これは、アレイ間の交差汚染のリスクを最小にする。
7.フレックスチャンバーを除去した後、スライド全体を、ろ過したddH2Oですすぎ、次いですぐにそれをHybaidラック中のスロットに配置し、そして直ちに、ろ過したddH2Oのスリーブ(スリーブ2)にラックを沈める。
【0209】
8.この方法を、それぞれのスライドについて、すべてのスライドが、それらのチャンバーが除去され、そしてラック中に配置されるまで、反復する。
注:第1スライドを、ろ過したddH2Oに沈め、一方その後のスライドは、それらのチャンバーが除去される。
4.3 スライドの洗浄およびすすぎ
1.ろ過したddH2Oを有するスリーブ(スリーブ2)からのスライドを含むラックを、洗浄ステーション中に洗浄溶液を含むあらかじめ加熱したスリーブ(スリーブ1)内に配置する。
2.スライドを30分60℃でインキュベートする。この時間の間、洗浄スリーブを開け、10分後ごとにラックを5回上下に移動させることによって洗浄溶液をおだやかに撹拌する。
3.ろ過したddH2Oの適当な体積で、スリーブ2をすすぎそして満たす。インキュベーションが完了したとき、ラックを洗浄ステーション(スリーブ1)からろ過したddH2O(スリーブ2)まで移転させる。
注意:ラックおよび洗浄ステーションは熱い。注意して取り扱う。
4.両方のスリーブと使用の間の洗浄を使用して、ろ過したddH2O中のスライドのラックを、撹拌でもう2回すすぐ。スリーブ中に、最後のろ過したddH2Oすすぎ中に、ラックを残す。
スライドを洗浄溶液中でインキュベートしつつ、セクション1.7の希釈支持を使用して、適当な量の染色溶液を調製する。
【0210】
4.4 スライドを染色する
注:染色溶液は、加工されるべきスライドのそれぞれのバッチについてあたらしく調製すべきである。
1.利用可能なスリーブ(スリーブ1)を、適当な量の染色溶液で満たす。
2.最後のろ過したddH2O洗浄からのラックを、染色溶液のあるスリーブへ移転させる。
3.スリーブ1(ラックおよび染色溶液を含む)を、洗浄ステーション上の非加熱スロット注に配置する。
4.スライドを、染色溶液中で30分室温でインキュベートする。この時間の間に、洗浄スリーブを開け、そして10分ごとにスリーブ内でラックを上下に動かすことによって染色溶液をおだやかに撹拌する。
スライドを染色溶液中インキュベートする一方、適当な量の脱染色溶液を、セクション1.7の希釈指示を使用して調製する。
【0211】
4.5 スライドを脱染色する
1.利用可能なスリーブ(スリーブ2)を、適当な量の脱染色溶液で満たす。
2.スライドが、セクション4.4に記載のインキュベーションが完了したとき、スリーブを除去し、そしてそれを流しにとる。
3.ラックを、染色溶液から脱染色溶液へ移転させる。
4.スリーブ(ラックおよび脱染色溶液を含む)を、洗浄ステーション上の非加熱スロット内に配置する。
5.室温で5分間スライドをインキュベートし、そしてもう1回新鮮な脱染色溶液で反復する(スリーブ1)。
4.6 スライドをすすぐ
1.脱染色溶液中での最後のインキュベーション後、スリーブ1を除去し、そしてそれを流しに取る。
2.利用可能なスリーブ(スリーブ2)を、適当な量のろ過したddH2Oで満たす。脱染色溶液(スリーブ1)からラックを、ろ過したddH2Oスリーブ(スリーブ2)に移転させる。
3.1L保証シリンダーを、適当な量のろ過したddH2Oで満たす。
【0212】
4.ラックを保持し、ろ過したddH2Oでデカントする。直ちに、スリーブを、シリンダーからの水でふたたび満たし、すべてのスライドが完全にカバーされるのを確保する。
5.ろ過したddH2Oを使用してデカントおよび再び満たす工程をもう3回反復する。最後のろ過したddH2Oすすぎ中にラックを残す。
4.7 スライドを乾燥する
1.すすいだスライドを、洗浄ラック中のそのスロットから注意深く除去する。洗浄ラックを、ろ過ddH2Oで満たしたスリーブ中に配置する。
注:スライドは、それらのラベル末端または端のみによって取り扱うべきである。湿ったポリマー基質は、脆弱で容易に損傷する。
2.スライドを空気乾燥する。利用可能ならば、クリーン窒素(非油)の乾燥流が表面上を吹くことができ、乾燥を容易化する。湿ったポリマーの損傷を避けるために、窒素源を、少なくとお6インチスライド表面からはなして保持する。スライドが乾燥したとき、それをワイヤースライドラックに配置する。
3.乾燥処理をそれぞれのスライドについて反復する。
4.すべてのスライドが乾燥したとき、それらを個々に調査する。これらは、塩結晶または水スポットのサインがないべきである。もし塩結晶または水スポットがあるならば、個々のスライドをろ過したddH2Oですすぎ、そして乾燥する。
5.スライドをスライド貯蔵箱に貯蔵する。
6.スライドを、Genepix4000Axonスキャナーで走査する。波長を532nmに、そしてPMTを430にScaning User ManualのためのCodeLink System Softwareに従いセットする。
【0213】
実施例3:多重塩基付加のプローブ
誤りの陽性を生じる幹−環形成プローブによる標的に依存しない自己伸長を、議論する。シグナルの強度は、幹−環構造の安定性におおむね比例的である。約500プローブの調査は、約15%が自己伸長シグナルを示すことを指摘した。自己伸長するプローブ配列のいくつかの例は、図18に示す。ほとんどの場合、取りこまれた塩基は、幹−環構造のすぐに下流のテンプレート配列によって予測されるものである;この結果は、DNAポリメラーゼは、幹−環構造によって形成される二重らせんを伸長することを強く示唆する。一般に、3またはより多い塩基対の幹が、自己伸長に要求される。
【0214】
本発明は、1または2以上の塩基を、自己伸長するプローブの3’末端に付加する単純な戦略を記載する(図17参照)。ここに使用したプローブは、追加的塩基がプローブ内で自己相補的ではないが、標的に相補的である点で新規である。そのような追加的塩基(複数含む)を付加するとき、それは幹−環構造にそってミスマッチを創出し、それゆえDNAポリメラーゼは、自己アニールプローブを伸長せず、そしてゆえに、誤りの陽性検出は、起こらず、SNP塩基の正確な検出を生じる。
【0215】
標的依存性検出は、プローブに付加された追加的塩基(複数含む)によって影響を受けず、というのは追加的塩基は標的に相補的であるからである。実際上、3またはより多い塩基を追加するのは実行可能ではない。SNP塩基は、プローブの3’末端のずっと上流であり、そしてミスマッチは内部バルグ(Bulge)を創出するであろう。もし内部バルグの下流の短い二重らせんがポリメラーゼによって伸長するならば、ミスマッチは検出されない。
【0216】
すべての実験は、実施例1および2で記載のDNAマイクロアレイで実施した。プローブは、スライド上の支持体材料の5’末端に付着されたポリヌクレオチド(一般に10−40nt長)である。SBE反応は、バッファー、ハプテン標識したアシクロ(acyclo)ターミネーターヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼからなる。標的(目的のSNPを含むPCR増幅したゲノムDNA)を、反応物に添加しまたはしなかった。
【0217】
図19は、あるプローブについてのSBEアッセイ結果が、標的の不存在下で強い自己伸長を示すことを示す。単一塩基をプローブの3’末端に付加するとき、標的に依存しないシグナルが、顕著に減少する。標的依存性シグナルは変化せず、これは標的の存在または不存在下でプローブが妥当に機能することを指摘した。2または3以上の塩基の付加は、新しい幹-環構造を創出した;これらのプローブは、予測されたような強い標的に依存しないシグナルを示した。図20は、P450遺伝子についてレスキューされたプローブのセットの全体成績を示す。不正確な応答を生じた35プローブセットのうち、プローブに1または2塩基付加することによって修復された26(66%)セットが、そのときの100%正確に応答した。
【0218】
実施例4:修飾されたヌクレオチドを有するプローブ
単一塩基伸長(SBE)アッセイおよび自己伸長プローブ問題を説明した(図2)。ここにわれわれは、プローブに取りこませるとき、それが折り畳み、および/または安定な二次的構造を形成することから阻害する、修飾された塩基のセットを提示する(図21および24)。該修飾された塩基は、それ自体と安定的塩基対を形成しないが、個々の塩基は天然DNA/RNA塩基とよくハイブリダイズし、非常に安定な非天然塩基対を形成する。そのような塩基対(図22、23、25および26)は熱力学的に、自己折り畳み構造を脱安定化するが、プローブ−標的二重らせんの安定性に最小の影響を有する。こうして、これらは選択的に、自己折り畳み分子の形成および/または伸長を阻害する。
【0219】
例塩基対を図22に示す。そのような分子は先行技術で使用され、選択的に結合するオリゴ対を生成する(米国出願5912340およびPCTWO97/12896;Kytyabin IV, Rhinehart RL, Lukhatanov EA, Gorn VV, Meyer RB Kr., Gamper HB Jr. Biochemistry 1996)27:35(34):11170-6; Woo J, MeyerRB Jr., Gamper HB., Nucleic Acids Res.(1966)1:24(13)2470-5;3;Compagno, D, Lampe JN, Bourget C, Kutyabin IV, Yurchenko L, Lukhtanov EA, Gorn VV, Gamper HB Jr., Touleme JJ., J Biol Chem(1999)19:274(12)8191-8)。
【0220】
自己折り畳み構造はまた塩基対中の1または2塩基のみを使用して脱安定化し、これは自己折り畳み分子並びにプローブ−標的二重らせんの安定性を減少させ得る。その場合に、自己折り畳み構造の融解温度は、プローブ−標的二重らせんのそれより実質的に低化することができる。そのような効果を有し得るある例の塩基対/塩基は、限定しないがa)2−アミノ−A:2−チオ−T、b)2−アミニプリン:2−チオ−T、c)6−チオ−G、d)2−チオ−C、e)疎水性塩基、例えば4−メチルインドール、ジフルオロトルエン等(Moran, S, Ren RX, Sheils CJ, Rumney S 4th , Kool ET, Niucleic Acids Res(1966)1:24(11):2044-52)、4−チオ−T(図22)を含むことができる。
【0221】
プライマーダイマー発生へのある解決はまた、自己折り畳み発生へ適用できる。例えば、天然塩基のアナログを有するオリゴヌクレオチドのセットであって、環外アミン位置の修飾を有するものは(図23)、また自己塩基対形成から阻害される(米国特許6001611、PCTWO00/06779)。塩基のこの種をまた図21に記載と同じ様式で使用できる。
【0222】
自己折り畳み構造からのシグナルを抑圧するもう1つのやり方は、プローブ−標的二重らせんのみを伸長させることによる。これはDNAポリメラーゼによって複製されないプローブ分子中のある種の修飾を使用することによって達成できる(図24)。そのやり方、天然のみ、標的鎖をテンプレートとして使用し、こうしてポリメラーゼによって伸長させる。文献で知られるそのような修飾の2,3の既知の例がある(前記および米国特許6001611;Stump MD, Cherry JL, Weiss RB., Nucleic Acids Res.(1999)1:27(23),4642-8参照)。また、そのような修飾は以前、プライマー−ダイマー発生のためにのみ、そしてここで提唱の適用の種類ではなく使用された。例えばDNAテンプレート中に存在するとき、疎水性塩基、4−メチルインドールは、その部位のDNA重合化を終結させる。この塩基は、「ターミネーター」と呼ばれた。2’−O−メチルRNAヌクレオシドの取りこみはまた、該残基部位のDNA重合化を阻害することが示された。これらの型の「ターミネーター」塩基およびヌクレオシドをまた使用し、自己折り畳み分子の伸長を防止し、こうしてプローブ−標的二重らせんからのシグナルを選択的に増強することができる(図25)。
【0223】
実験を、我々の標準的SBEアッセイを使用して前記DNAマイクロアレイで実施し、これらの仮説を試験した。修飾なしまたは前議論修飾塩基のいずれかを含むプローブを、オペロンから取得し、そしてアミノ−NHSエステル化学を使用してゲルスラブに付着させた(Gen3化学)。使用したプローブの配列は、それぞれのグラフのトップに示される(図27−29)。すべてのデータは、Tiチャンバー、標準的SBE CYCLEパラメター、4TAMRAヌクレオチド、トリス−HClpH8.5プラス10mM KCl(バッファー)、DMSOなし中で稼動されるスライドからである。存在するとき、標的は、60μL体積のアレイあたり10ngで使用した。データは、「標的なし」アッセイのため8アレイ、および「標的あり」アッセイのため7アレイから合計した。
【0224】
結果を、以下のグラフに示し(図27−29)、そしてそのような修飾が、標的不存在に対し標的存在下で、何倍もシグナルを増加させ、該仮説が意図されたように実行されたことを提供する。こうして、標的の存在下の自己伸長プローブからのシグナルが、標的不存在下よりもたった3倍より高い(R=3.18)。しかし、工程−環中のA:T塩基対がその修飾されたアナログ塩基対X:Zで置換されたとき、この比率は、ほとんど10倍に増加する(図27)。これは明確に、該修飾された塩基対が意図された効果を有することを示す。伸長部位(3’末端)付近ヘの修飾された塩基対の配置は、なおより劇的な影響を有することができる。同様に、幹−環にすぐに隣接するアデノシンがその「ターミネーター型」アナログ4−メチルインドールで置換されたとき、該シグナルは、3倍からほとんど5倍に増加する(図27)。
【0225】
図28において、標的存在下の自己伸長プローブでのシグナルは、標的の不存在下よりもたった3倍より高いのみである(R=2.42)。しかし、工程−環中の1またはA:T塩基対の一方または両方のいずれかが、これらの修飾されたアナログ塩基対X:Zで置換されたとき、この比率は、ほとんど5倍に増加する。これは明確に、該修飾された塩基対が意図された効果を有することを示す。図29は、3つの異なるプローブ配列での類似の結果を示す。
【0226】
実施例5:ヘアピン構造のための伸長酵素結合を阻害する修飾された幹を有するプローブ
標的DNAの不存在下、ヘアピン環構造またはパリンドロム的配列のためのヌクレオチドの非特異的取りこみは、単一塩基伸長アッセイにおいてあやまりの陽性結果にしばしばつながることができる。ここに、捕捉プローブの「幹」領域に結合する、酵素の親和性を変化させることによって、標的DNAの不存在下での非特異的ヌクレオチド取りこみは、減少または排除できる(図30および31)。修飾は限定しないが、捕捉プローブの「幹」領域上の、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、キラルホスホジエステルアナログおよびメチルホスフェートを含む。核酸中のホスフェートは、核酸―タンパク質相互作用において決定的な役割を演ずる。正に荷電したアミノ酸と負に荷電したホスフェート骨格の間の静電的相互作用、およびホスフェート酸素とタンパク質の間の水素結合の形成は、結合親和性および酵素の特異性に貢献する(図32B(a))。「幹」領域のフォスフェートまたは糖環を修飾することによって、我々は酵素の結合親和性を減少させ、非特異的ヌクレオチド取りこみの確率を減少させることができる。修飾は塩基で実施するから、捕捉プローブと標的の間の熱力学的二重らせん安定性は、変化しない(図30と31)。
【0227】
いくつかの修飾を提唱するがこれらに限定しない。フォスフォロチオエート(硫黄置換)およびホスホロアミデート(窒素置換)は、荷電分布、疎水性、および酵素についての、ホスフェートバックボーンへの効率的水素結合を形成する能力を変化させることができる。メチルフォスフォネートおよびメチルフォスフェートは、フォスフェート荷電を全く排除し、これは該酵素がDNAに結合するのを阻害することができる(図32Aと32B(bないしd))。
糖環上の他の修飾をまた、導入することができ、例えば2’−O−メチルRNAおよびLNAである。
【0228】
実施例6:自己伸長を防止する阻害オリゴヌクレオチドの使用
発明は、プローブオリゴヌクレオチド上の平滑末端を創出し、そしてプローブの酵素的自己伸長によって生成される誤りのシグナルの生成を防止する相補的短いオリゴヌクレオチドの使用をなす。目的のシグナルは、標的の存在下でのみ創出され、そして全ての他のときシグナルは、オフモードのままである(図33参照)。短い相補的APO E321.T.A.SNPプローブへの短い相補的APO E321.T.A.オリゴは、APO E321.T.A SNPプローブ自己伸長を阻害できる。APO E321.T.A.プローブ(5’TACACTGCCAGGCA3’)は、すべての条件下で強い自己伸長誤りのシグナルを生産する強い自己伸長体である。これらの研究のため使用したアッセイは、SBE反応のための標的としてゲノム幅一本鎖RNAを使用することによる修飾されたSBEアッセイであった。
【0229】
実施例7:自己伸長を防止するための、技法の組み合わせおよび修飾された逆転写酵素の使用
発明は、多重PCRなく、RCA(または他のシグナル増幅技法)なく、およびプライマー伸長からの問題なく、ゲノム幅SNP遺伝子型決定を可能とする、新規方法(3つの異なる技法を含む)に基づく。該方法は、ランダムプライマーでPEP(プライマー伸長予備増幅)反応(米国特許6183958;Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.89:5847-51(1992); Casas and Kirkpatrick, Biotechniques, 20: 219-25(1996)で既知)を実施し1反応でゲノムDNAを増幅し、次いでインビトロ転写(IVT)反応(もしプライマーの1つがポリメラーゼプロモーター配列を有したならば)を増幅する事に関係する。産物、cRNAは、ハイブリダイズし、そして該プローブは逆転写酵素(RT)を使用して伸長される。これは、我々は、PEPを介してゲノムの複雑性を減少させ、そしてIVTで標的を増幅するであろう意味で、個々のSNP遺伝子座のPCRと同じ目的を供するであろう。こうして、SNP遺伝子座のすべてについて1標的調製(prep)が実施される(我々が発現アッセイでするように)。最終的に、修飾されたRT(ここで、該DNA依存性DNAポリメラーゼ活性が排除された)の使用は、自己伸長体がRTによって信用されないであろうことを意味し、というのはこれらはDNA依存性伸長であり、そしてRNA標的に結合されたプローブのみが存在するからであり、そしてRNA標的に結合されたプローブのみが伸長するであろうことを意味し、というのはこれらはRNA依存性DNAポリメラーゼ活性に依存するからである(図34参照)。
【0230】
この開示はマルチプレックス化PCRまたは何千ものPCR反応を必要としないSNP遺伝子型決定のための新規方法論を提示する。さらに自己伸長問題は顕在せず、というのはこれらの自己伸長体は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性のみを有するRTによって伸長されないであろうからである。
【0231】
該アプローチの技術的可能性は、3つの別個の断片において実証された。プライマー伸長予備増幅(PEP)の可能性は、多くの分子生物学実験室で実証された。IVTの可能性は、実証された。RNA標的ヘのハイブリダイゼーション後の、アレイ上のRT伸長オリゴプローブの可能性は、実証された(Pastinen, T., et al., (2000)Genome Research, 10:1031-42)。
【0232】
この方法は、ユニプレックス化標的調製およびプライマー伸長のためのすべての3つの技法が、他のプライマー伸長技法が服する自己伸長問題によって複雑化しないべく組み合わせられる点で、他の方法から区別される。
【0233】
該アプローチの新規性は、我々が修飾されたRTを使用してRNA依存性DNAポリメラーゼ活性のみを指向するという事実、および我々が、ユニプレックス化標的調製の新しい方法のためにPEPおよびIVTを組み合わせること、およびこれをプライマー伸長のためのオリゴヌクレオチドアレイ上で適用するという事実に基づく。
【0234】
戦略的利益は、PCRのコスト減少、ユニプレックス化標的調製の競合的有利、識別、および自己伸長の排除のためのよりよいデータ信頼性である。
【0235】
方法論
工程1
ヒトゲノムDNAおよび、3’末端の8縮重ヌクレオチドおよび5’末端のT7 RNAポリメラーゼ配列を有するように設計された、プライマーRRNOT7を使用するプライマー伸長。それは配列
【表3】 を有した。このプライマーでのプライマー伸長は、5’末端上にT7 RNAポリメラーゼ配列を有するヒトDNAのフラグメントを生じるべきである。該アッセイを2μgのヒトゲノムDNA、および5単位のAmplitag DNAポリメラーゼ、および100ngのRRNOT7プライマーで、PCR Amplification Buffer I(Perkin Elmer)を、最終体積の60μLで使用して実施した。該反応を、92℃1分、37℃2分、55℃まで10秒/℃のゆっくりの勾配で4分を、50サイクルで稼動させた。
【0236】
工程2
これらの標準的条件を使用するインビトロ転写:全部で325μgのcRNAを、2μgの標準的ヒトゲノムDNAから取得した。cRNAをUV吸光を使用して定量し、そしてアガロースゲル上で視覚化した。
【0237】
工程3
以下のオリゴヌクレオチドを、18μMに希釈し、そして手動でブランクのSurmodicsスライド上にスポットした。第1は非自己伸長体であり、一方第2は自己伸長体であり、というのは、それはそれ自体環にもどるからである。
【表4】 【0238】
スライドをブロックし、そして標準的Surmodicsプロトコルにしたがって加工した。追加的に、細菌性オリゴヌクレオチドYJEKをまたブランクのSurmodicスライド上にスポットおよび加工し、ネガティブコントロールとして供した。
【0239】
工程4
25μgのcRNAを、湿潤チャンバーで終夜(18時間)、37℃で、50%ホルムアミド、2xSSPE中で、オリゴヌクレオチドスポットあたりハイブリダイズさせた。スライドを洗浄および乾燥した。
【0240】
工程5
それぞれのハイブリダイズしたプローブを、rTth RNA依存性DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)を使用して、Mn2+とcy5−dUTPの存在下、50℃で20μLの最終体積で、5分間、インサイチュで伸長させた。スライドを洗浄、乾燥および600PMTでCy5チャンネル(635nm)を使用してAxonスキャナーで走査した。
【0241】
結果
rTth、すなわちMn2+イオンの存在下RNAテンプレートがオフでDNAを伸長させるのみである修飾された逆転写酵素の存在下でこのアッセイを実施したのち、自己伸長は、通常は自己伸長する、SNPオリゴヌクレオチドがオフで観察されなかった(図35および36参照)。
【0242】
【表5】 【表6】
Claims (48)
- (a)CPY1A1をコードする核酸のセンス鎖の部分に実質的に相同な、少なくとも1つの捕捉プローブ、
(b)CPY1A2をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な、少なくとも1つの捕捉プローブ、
(c)CPY1B1をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な、少なくとも1つの捕捉プローブ、
(d)CPY12C19をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な、少なくとも1つの捕捉プローブ、
(e)CPY2D6をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な、少なくとも1つの捕捉プローブ、
(f)CPY2E1をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な、少なくとも1つの捕捉プローブ、および
(g)CPY3A4をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な、少なくとも1つの捕捉プローブ、
を含むアレイを含む固体基質を含むバイオチップ。 - CPY2D6をコードする当該核酸の当該センス鎖の当該第1部分が、目的の単一ヌクレオチド多型(SNP)部分に隣接する、請求項1のバイオチップ。
- CPY2D6をコードする当該核酸の当該センス鎖の当該第1部分が目的の単一ヌクレオチド多型(SNP)部分を末端に含む、請求項1のバイオチップ。
- 当該アレイがさらに、CYP1A1;CYP1A2;CYP1B1;CYP2C19;CYP2D6;CYP2E1およびCYP3A4からなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸のアンチセンス鎖の一部に実質的に相同である少なくとも1つの捕捉プローブを含む、請求項1のバイオチップ。
- 当該アレイがさらに、CYP偽遺伝子の一部に実質的に相同な少なくとも1つの捕捉プローブを含む、請求項1のバイオチップ。
- 当該固体支持体が、ガラス、プラスチック、セラミック、およびPCボードからなる群より選択される、請求項1のバイオチップ。
- 当該アレイが電極のアレイを含む、請求項1のバイオチップ。
- 当該アレイが、ポリマーゲルパッドのアレイを含む、請求項1のバイオチップ。
- CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1およびCYP3A4からなる群より選択される少なくとも1の標的配列中の検出位置の、ヌクレオチドの同定を決定する方法であって、当該方法が、
(a)以下のものを含むアレイを提供すること、
(i)CPY1A1をコードする核酸の第1部分に実質的に相同な、少なくとも1つの第1捕捉プローブ、ここで当該第1捕捉プローブがその末端で、検出位置に直接的に隣接するかまたはそれを含む、
(ii)CPY1A2をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な、少なくとも1つの第2捕捉プローブ、ここで当該第2捕捉プローブはその末端で、検出位置に直接的に隣接するかそれを含む、
(iii)CPY1B1をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1つの第3捕捉プローブ、ここで当該第3捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
(iv)CPY2C19をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1つの第4捕捉プローブ、ここで当該第4捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
(v)CPY2D6をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1つの第5捕捉プローブ、ここで当該第5捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
(vi)CPY2E1をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1つの第6捕捉プローブ、ここで当該第6捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
(vii)CPY3A4をコードする核酸のセンス鎖の第1部分に実質的に相同な少なくとも1つの第7捕捉プローブ、ここで当該第7捕捉プローブは、その末端で、検出位置に直接的に隣接するか、それを含む、
(b)少なくとも1つの標的配列を、その対応する捕捉プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、
(c)ポリメラーゼおよび、標識を含む少なくとも1つのdNTPを、もし当該dNTPが、検出位置に完全に相補的であるあらば、当該dNTPが捕捉プローブに付加し伸長されたプローブを形成するような条件下で添加すること、
(d)当該伸長されたプローブの質問位置の、ヌクレオチドを決定すること、
を含む方法。 - 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、
(a)以下のものを含むアレイを提供すること、
(i)捕捉プローブのアレイを含むハイドロゲル層を含む第1表面を有する固体支持体、
(b)当該標的配列を、当該捕捉プローブの少なくとも1つにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、および
(c)当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
を含む方法。 - 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、
(a)少なくとも1つの非自己伸長プローブを含む第1表面を有する固体支持体を提供すること、ここで当該非自己伸長プローブの自己伸長は、当該標的の不存在下で起こらず、かつ、ここで当該非自己伸長プローブは、質問ヌクレオチドを含む、
(b)当該標的配列を、当該非自己伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、
(c)当該表面を以下のものと、
(i)伸長酵素、および
(ii)ハプテンを含む、少なくとも1つの鎖終結化ヌクレオチド、
もし当該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の当該非自己伸長プローブの3’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、当該鎖終結化ヌクレオチドが当該非自己伸長プローブに添加され、修飾された伸長プローブを形成するような条件下で接触させること、
(d)当該修飾された伸長プローブを、当該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで当該ハプテンは標識されている、および
(e)当該標識の存在を検出し、当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
を含む方法。 - 当該非自己伸長プローブ中の当該質問ヌクレオチドが、その3’末端の2塩基以内であり、かつここで、当該非自己伸長プローブの自己ハイブリダイズ化構造が形成されるとき、当該3’末端ヌクレオチドが対応する塩基に非相補的である、請求項11の方法。
- 当該質問ヌクレオチドが3’末端ヌクレオチドである、請求項12の方法。
- 当該質問ヌクレオチドが、終わりから2番目の3’末端ヌクレオチドである、請求項12の方法。
- 当該非自己伸長プローブが、少なくとも2つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項11の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドが、環外アミン修飾された塩基である、請求項15の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドがターミネーター塩基である、請求項15の方法。
- 当該環外アミン修飾された塩基が、2−チオチミン、2−アミノアデニン、アミノ修飾されたシトシンおよびアミン修飾されたグアニンからなる群より選択される、請求項16の方法。
- 当該ターミネーター塩基が、4−メチルインドールである、請求項17の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドが、タンパク質結合を変え、そして当該非自己伸長プローブの幹領域中に存在する、請求項15の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドが糖修飾を含む、請求項20の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドが、フォスフェート修飾を含む、請求項20の方法。
- 当該フォスフェート修飾が、フォスフォロチオエート、フォスフォルアミデート、メチルフォスフォネート、メチルフォスフェート、H−フォスフォネートからなる群より選択される、請求項22の方法。
- 当該非自己伸長プローブの自己伸長が、短い相補的オリゴヌクレオチドによって阻害される、請求項11の方法。
- 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって
(a)ランダムプライマーを使用して該標的DNAを増幅し、DNAアンプリコンを生成すること、
(b)当該DNAアンプリコンを転写し、RNA標的配列を生成すること(インビトロ転写)、
(c)少なくとも1つの伸長プローブを含む第1表面を有する固体支持体を提供すること、ここで当該伸長プローブは、質問ヌクレオチドを含む、
(b)当該RNA標的配列を、当該伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、
(c)当該表面を、
(i)修飾された逆転写酵素、および
(ii)ハプテンを含む、少なくとも1つの鎖終結化ヌクレオチド
と、もし当該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の当該非自己伸長プローブの3’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、当該鎖終結化ヌクレオチドが、当該非自己伸長プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成させること、
(d)当該修飾された伸長プローブを、当該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで当該結合パートナーは標識される、および
(e)当該標識の存在を検出し、当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
を含む方法。 - 当該修飾された逆転写酵素のみが、RNAに結合された伸長プローブを伸長させる、請求項25の方法。
- 当該ハプテンがビオチンである、請求項11または25の方法。
- 当該結合パートナーがストレプトアビジンである、請求項11または25の方法。
- 当該結合パートナーがAlexa色素標識されたストレプトアビジンである、請求項11または25の方法。
- 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、
(a)少なくとも1つの非自己伸長プローブを含むハイドロゲル層を含む第1表面を有する固体支持体を含む第1表面を有する固体支持体を提供すること、ここで当該非自己伸長プローブの自己伸長が、当該標的の不存在下では起こらず、かつ、ここで当該非自己伸長プローブが質問ヌクレオチドを含む、
(b)当該標的配列を、当該非自己伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、
(c)当該表面を、
(i)伸長酵素、および
(ii)ハプテンを含む少なくとも1つの鎖終結化ヌクレオチド
と、当該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の当該非自己伸長プローブの3’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、当該鎖終結化ヌクレオチドが、当該非自己伸長プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成させること、
(d)当該修飾された伸長プローブを、当該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで当該結合パートナーは標識される、および
(e)当該標識の存在を検出し、当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
を含む方法。 - 当該非自己伸長プローブ中の当該質問ヌクレオチドが、その3’末端の2塩基以内にあり、かつここで、当該非自己伸長プローブの自己ハイブリダイズ化構造が形成されるとき、当該3’末端ヌクレチドが、対応する塩基に非相補的である、請求項30の方法。
- 当該質問ヌクレオチドが3’末端ヌクレオチドである、請求項31の方法。
- 当該質問ヌクレオチドが、終わりから2番目の3’末端ヌクレオチドである、請求項31の方法。
- 当該非自己伸長プローブが少なくとも2つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項30の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドが環外アミン修飾された塩基である、請求項34の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドがターミネーター塩基である、請求項34の方法。
- 当該環外アミン修飾された塩基が、2−チオチミン、2−アミノアデニン、アミン修飾されたシトシンおよびアミン修飾されたグアニンからなる群より選択される、請求項35の方法。
- 当該ターミネーター塩基が、4−メチルインドールである、請求項36の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドが、タンパク質結合を変え、かつ、当該非自己伸長プローブが幹領域中に存在する、請求項34の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドが糖修飾を含む、請求項39の方法。
- 当該修飾されたヌクレオチドが、フォスフェート修飾を含む、請求項39の方法。
- 当該フォスフェート修飾が、フォスフォルチオエート、フォスフォルアミデート、メチルフォスフォネート、メチルフォスフェート、H−フォスフォネートからなる群より選択される請求項41の方法。
- 当該非自己伸長プローブの自己伸長が、短い相補的オリゴヌクレオチドによって阻害される、請求項30の方法。
- 標的配列中の検出位置のヌクレオチドの同定を決定する方法であって、
(a)ランダムプライマーを使用して該標的DNAを増幅し、DNAアンプリコンを生成すること、
(b)当該DNAアンプリコンを転写し、RNA標的配列を生成すること(インビトロ転写)、
(c)少なくとも1つの伸長プローブを含む第1表面を有する固体支持体を提供すること、ここで当該伸長プローブが質問ヌクレオチドを含む、
(b)当該RNA標的配列を、当該伸長プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成すること、
(c)当該表面を、
(i)修飾された逆転写酵素、および
(ii)ハプテンを含む、少なくとも1つの鎖終結化ヌクレオチド
と、もし当該鎖終結化ヌクレオチドが、該ハイブリダイゼーション複合体中の当該非自己伸長プローブの3’末端にすぐに隣接する標的配列の塩基に完全に相補的であるならば、当該鎖終結化ヌクレオチドが、当該非自己伸長プローブに付加され、修飾された伸長プローブを形成するような条件下で接触させること、
(d)当該修飾された伸長プローブを、当該ハプテンの結合パートナーと接触させること、ここで当該結合パートナーは、標識される、および
(e)当該標識の存在を検出し、当該検出位置のヌクレオチドを決定すること、
を含む方法。 - 当該修飾された逆転写酵素のみが、RNAに結合された伸長プローブを伸張させる、請求項44の方法。
- 当該ハプテンがビオチンである、請求項30または44の方法。
- 当該結合パートナーがストレプトアビジンである、請求項30または44の方法。
- 当該結合パートナーがAlexa色素標識されたストレプトアビジンである、請求項30または44の方法。
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