CN108369164B - 酶促样品纯化 - Google Patents

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Abstract

酶促样品纯化器包括含有酶的反应室、产物室和分离器。反应室具有接收包含蛋白降解产物的样品的端口。分离器保留由反应室中的蛋白降解产物与酶的反应产生的多肽，并且促进将包含靶分析物的样品的纯化的剩余部分运输至产物室。

Description

酶促样品纯化
背景
经常分析复杂样品，诸如血液、血清、细胞裂解物、细胞外液、乳和其他生物流体以鉴定样品内的分析物或表征样品内的分析物。鉴定或表征此类复杂样品的多个分子中的分析物经常是困难且耗时的。
附图简述
图1是实例酶促样品纯化系统的示意图。
图2是实例酶促样品纯化方法的流程图。
图3是说明实例酶促样品纯化方法的示意图。
图4是实例酶促样品纯化系统的示意图。
图5是说明实例酶促样品纯化方法的示意图。
图6是实例酶促样品纯化系统的示意图。
实例的详述
本文公开了利用酶以促进用于分析的样品的更快和更低成本的制备的酶促样品纯化系统和方法的不同实例。许多复杂样品诸如血液、血清、细胞裂解物、细胞外液、乳和其他生物流体都含有蛋白的降解产物，诸如氨基酸和肽，其干扰复杂样品中靶分析物的检测和感测。因为蛋白降解产物可以具有与许多靶分析物类似的尺寸和其他特性，所以此类蛋白降解产物的分离和去除可能是困难的。实例酶促样品纯化系统和方法利用与蛋白降解产物反应以形成尺寸大得多的多肽的酶。示例性酶促样品纯化系统和方法利用靶分析物和尺寸大得多的多肽之间的差异来分离出较大尺寸的多肽，留下纯化的靶分析物样品用于分析。
图1示意性说明实例酶促样品纯化系统20，其可以促进从用于分析的样品更快速、成本更低且更有效地纯化样品。系统20通过利用与蛋白降解产物反应以形成尺寸大得多的多肽的酶来纯化样品，其中系统20将尺寸大得多的多肽与小得多的靶分析物分离开，以形成纯化的样品。如图1所示，系统20包括反应室24、产物室26和分离器(S)30。
反应室24包括具有端口34以接收含有靶分析物(A)52和蛋白降解产物(PDP)54的样品50的腔室(示意性显示)。反应室24含有多肽合成酶60。基于待分析的样品50中的靶分析物52的特征来特定地选择酶60。特定地选择酶60以便与PDP 54反应以形成多肽，同时不与分析物52反应以形成多肽。不同的蛋白合成酶60的实例包括，但不限于，蛋白酶诸如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶等。根据靶分析物60，可以利用其他多肽合成酶60。
如图1中的虚线所示，在一些实施方式中，反应室24可以含有其他元件，诸如酶辅因子(CF)、助溶剂(CF)和缓冲液(B)61。酶辅因子是催化酶和PDP 54之间的反应的非蛋白分子。酶辅因子的实例包括，但不限于，铜离子。
助溶剂包含悬浮酶60并溶解其他物质以形成溶液的液体分子。在一个实施方式中，可以选择助溶剂以增强酶60与PDP 54的反应性。在一个实施方式中，所述助溶剂可以是有机的。在其他实施方式中，所述助溶剂可以是含水的。助溶剂的实例包括，但不限于，甘油。
缓冲液包含作为溶液的一部分抑制溶液的pH变化的分子。此类缓冲液可以充当将pH保持在几乎恒定值的手段。缓冲液的实例包括，但不限于，磷酸盐缓冲液。可以选择酶辅因子、助溶剂和缓冲液中的每一种以促进有利于形成、而不是断裂酰胺键以形成多肽的热力学条件。
在一个实施方式中，反应室24预先填充酶60以及酶辅因子、助溶剂和缓冲液，其中然后将反应室24“工厂密封(factory sealed)”，直至使用。在一个实施方式中，可以标记系统20，用于与特定类型的样品50、特定类型的PDP 54和/或特定类型的靶分析物52一起使用，其中反应室24预先填充适当量和相对量的所选的一种或多种酶60以及最适合于特定类型的样品50、特定类型的PDP 54和/或特定类型的靶分析物52的各自的辅因子、助溶剂和缓冲液。作为结果，可以特定地调整反应室24内具有不同组合的预先填充的溶液混合物的不同的系统20，用于排除特定PDPs 54、特定氨基酸和/或寡肽。因为系统20可以在受控的制造规范下大规模生产，可以在范围上减小或消除单独制备酶促“鸡尾酒”的任务，潜在地减少技术人员错误。此外，减少与单独制备纯化样品50的溶液相关的时间和成本。因为系统20是独立的(self-contained)，所以系统20可以改为便携式应用。
产物室26包括这样的腔室，其在已经通过基于尺寸的分离器(SBS)30从样品50中的PDP 54分离靶分析物52之后接收靶分析物52。在一个实施方式中，产物室26直接或间接连接至反应室24。在一个实施方式中，产物室26间接连接反应室24，其中SBS 30在腔室24和26之间延伸并且在相对侧连接至腔室24和26。在一些实施方式中，产物室26可以含有经选择用于保存或以其他方式进一步制备提取的靶分析物52用于分析的化学溶液。
分离器30包括这样的结构或装置，其相对于由反应室24中的酶60与PDP 54的反应产生的多肽分离靶分析物52。在一个实施方式中，分离器30可以包括这样的结构或装置，其基于靶分析物52的分子和形成的多肽的分子之间的尺寸差异从形成的多肽分离靶分析物52。在一个实施方式中，分离器30可以包括任何各种不同的基于尺寸的分离器，其选自由以下组成的基于尺寸的分离器组：尺寸排阻色谱分离器、透析分离器、电透析分离器和电泳分离器。在其他实施方式中，分离器30可以利用其他基于尺寸的分离技术。
在另一个实施方式中，分离器30可以包括含有分析物52的溶液和由酶60和PDP 54的反应形成的多肽流入其中的结构。在一个实施方式中，反应室24可以包含第一捕获部分，而分离器30包含和/或固定支持第二捕获部分，其中两个捕获部分变得彼此结合。选择反应室24内含有的第一捕获部分以引入形成的肽中。作为结果，形成的肽与分离器30的第二捕获部分组合，抑制多肽流出分离器30，同时允许靶分析物52从分离器30排出并进入产物室26。
在一个实施方式中，反应室24包含第一捕获部分，诸如氨基酸组氨酸。分离器30包含具有固定化的镍的多孔基质或其他膜，其中氨基酸组氨酸9被并入形成的多肽并结合多孔基质的镍。
在一个实施方式中，分离器30与反应室24和产物室26整体形成为单一整体，永久地固定在腔室24和26之间。例如，在一个实施方式中，分离器30可以包括允许特定尺寸的分子通过其中的膜或过滤器，其中所述膜或过滤器允许较小尺寸的靶分析物分子52从腔室24经过分离器30进入产物室26，而较大尺寸的形成的多肽(和PDP 54)被抑制经过分离器30进入反应室24。
在又另一个实施方式中，分离器30可以包括系统20的可移除单元或组件。对于本公开的目的，关于两个结构的附接或连接的术语“可释放地”或“可移除地”意味着两个结构可以与彼此重复地连接和断开，而不会对两个结构中的任一个或其行使功能有实质损害。例如，如1中的虚线所示，在一个实施方式中，腔室24和26可以通过在腔室24和26之间可移除地接收SBS 30的通道、槽或其他接收器64相互连接。在这样的一个实施方式中，接收器64促进分离器30的移除和更换，当分离器30不再可用时促进系统20的重新使用和/或促进系统20的修改以适应不同样品50的纯化。在一个实施方式中，接收器64促进不同分离器30的交换，其中不同的分离器30可以具有不同的过滤特征或基于尺寸的渗透性，这取决于预期的靶分析物52和由酶60和PDP 54的反应产生的多肽的尺寸。例如，可以从利用不同的SBS30的各个样品更好地纯化较小尺寸的靶分析物52和较大尺寸的靶分析物52。在另一个实施方式中，接收器64促进不同分离器30的交换，其中不同分离器30可以具有不同的捕获部分，所述捕获部分与反应室24中并入形成的多肽中的相应捕获部分配合。
在还有其他实施方式中，分离器30可以包括与腔室24和26中的一个或两个不同的分开的部件或装置。例如，在其他实施方式中，分离器30可以作为具有腔室24的单个单元的一部分来提供，其中靶分析物52通过分离器30被抽取至分开的产物室26中。
图2和3说明用于酶促纯化样品以制备样品用于分析的实例方法100。尽管方法100被描述为由系统20实施，但方法100可以可替代地由下文描述的任何其他酶促样品纯化系统或其他适当的酶促样品纯化系统实施。如方框102所示且在图3中的时间t0处所示，样品50通过端口34沉积至反应室24中。样品50包含靶分析物52(用星号示意性示出)和PDP 54(用实心圆形示意性示出为氨基酸)。样品50的实例包括，但不限于血液、血清、细胞裂解物、细胞外液、乳和/或其他生物流体。靶分析物52可以包含不能形成肽键(酰胺键)的小分子。此类靶标(markets)没有伯胺基团(primary and mine groups)或羧酸基团，且因此不能形成酰胺键。
分析物52可以额外或可替代地包含能够形成肽键、但在由于选择的特定酶60而在反应室24中存在的酶促条件或反应室24的其他条件下不能形成肽键的分子。此类分子可以具有伯胺基团或羧酸基团，但由于反应室24内的特定酶60而不能进行肽键形成。这种分析物可以包括从肽形成酶的活性位点空间排除的氨基酸或寡肽。此类分析物的实例包括，但不限于，生物标志物，诸如促甲状腺激素释放激素(三肽)、Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽(五肽)等。在一种方法中，样品50的分析物52和PDP 54在纯化前具有重叠或类似的分子量和回转半径，以使得难以仅通过尺寸进行分离。此外，在一些实施方式中，分析物52的分子和PDP54的分子也可以具有类似的电荷、电泳迁移率、分配系数(与疏水性有关)、蛋白激酶A(pKa)特性，使得离子选择性的、电泳的和/或基于液体和固体的分离变得困难。
如方框102进一步指示，样本50沉积于其中的反应室24含有酶(E)60、酶辅因子和助溶剂。在一个实施方式中，反应室24另外包含缓冲液。上文各自描述了酶60、酶辅因子、助溶剂和缓冲液。
如方框106所示和在图3中的时间t2处所示，允许酶60和PDP 54彼此反应以形成多肽70(用空心圆形示意性示出)。在一个实施方式中，在方框110中分离前允许该反应完成，达到平衡状态。在其他实施方式中，方框110中的分离在反应达到完成前进行，其中终止腔室24内正在进行的反应用于分离。
如方框110所示且在图3中的时间t3处所示，然后基于多肽70和靶分析物52之间的差异，通过分离器30将靶分析物52与形成或产生的多肽分离。在一个实施方式中，基于分析物52的分子和多肽之间的尺寸差异将靶分析物52与多肽分离。在一个实施方式中，多肽70各自具有比靶分析物52的分子的尺寸大得多的尺寸。在一个实施方式中，多肽70比靶分析物52大至少100％。在一个实施方式中，多肽70具有至少1000Da的尺寸且靶分析物具有不大于200Da的尺寸。
在所示的实例中，将分离出的靶分析物52运送至产物室26。作为结果，可以更好地检测和分析靶分析物52，且来自任何剩余PDP 54的干扰更少。如上所述，在一些实施方式中，分离器30可以包括选择性渗透膜或过滤器，其中使靶分析物52通过膜或过滤器进入产物室26，而较大的多肽70(和任何剩余的酶60)保持捕获在反应室24内。在其他实施方式中，可以采用其他分离技术。
图4示意性说明实例酶促样品纯化系统220，系统20的一个实例实施方式。与系统20一样，系统220可以促进更快速、成本更低且更有效地将样品纯化为用于分析的样品。系统220通过利用与蛋白降解产物反应以形成尺寸大得多的多肽的酶来纯化样品，其中系统220将尺寸大得多的多肽与小得多的靶分析物分离开，以形成纯化的样品。系统220类似于上述系统20，除了系统220额外包括多孔基质230，其替代并充当分离器。将对应于系统220的组件的系统220的那些剩余组件类似地编号。尽管未显示，但系统220的反应室24可以额外包含酶辅因子、助溶剂和缓冲液61，如关于图2所示和所述。
多孔基质230包含在反应室24内布置并在反应室24内含有的一种或多种材料的网格或基质。多孔基质30包含互相连接的内部空间或体积(称为小室或孔)的基质。在一个实施方式中，基质30的开放小室孔的尺寸大于靶分析物52的分子的尺寸，但小于待形成的多肽(其由酶60和PDP 54的反应产生)的尺寸。在所示实例中，多孔基质230在反应室24内熵驱动地(entropically)诱捕酶60。
在一个实施方式中，多孔基质230由第一捕获部分形成或固定地携带第一捕获部分，所述第一捕获部分经选择以促进与第二捕获部分结合，所述第二捕获部分并入或形成为待形成的多肽的一部分。在这样的一个实施方式中，作为并入形成的多肽中的部分的结果，形成的多肽更可能被捕获或固定至基质230上。例如，在一个实施方式中，部分232可以包含氨基酸组氨酸，而基质230由固定化的镍形成或携带固定化的镍，使得形成的多肽结合基质230上的镍。在其他实施方式中，可以采用反应室24内的溶液中和基质230上的捕获部分的其他组合。在一些实施方式中，使用如上所述的基于尺寸的分离和多肽中的捕获部分和多孔基质230中的捕获部分之间的结合来促进形成的多肽和靶分析物52的分离。
图5是示意性说明通过系统220纯化样品50的图。如在图5中的时间t0处所示，样品50通过端口34沉积至反应室24中。样品50包含靶分析物52(用星号示意性示出)和PDP 54(用实心圆形示意性示出为氨基酸)。样品50的实例包括，但不限于血液、血清、细胞裂解物、细胞外液、乳和/或其他生物流体。靶分析物52可以包含不能形成肽键(酰胺键)的小分子。此类分子没有伯胺基团或羧酸基团，且因此不能形成酰胺键。
分析物52可以额外或可替代地包含能够形成肽键、但在由于选择的特定酶60而在反应室24中存在的酶促条件或反应室24的其他条件下不能形成肽键的分子。此类分子可以具有伯胺基团或羧酸基团，但由于反应室24内的特定酶60而不能进行肽键形成。这种分析物可以包括从肽形成酶的活性位点空间排除的氨基酸或寡肽。此类分析物的实例包括，但不限于，生物标志物，诸如促甲状腺激素释放激素(三肽)、Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽(五肽)等。在一种方法中，样品50的分析物52和PDP 54在纯化前具有彼此重叠或彼此类似的分子量和回转半径，以使得难以仅通过尺寸进行分离。此外，在一些实施方式中，分析物52的分子和PDP 54的分子也可以具有类似的电荷、电泳迁移率、分配系数(与疏水性有关)、蛋白激酶A(pKa)特性，使得离子选择性的、电泳的和/或基于液体和固体的分离变得困难。
如图5进一步所示，样本50沉积于其中的反应室24含有酶(E)60、酶辅因子和助溶剂。在一个实施方式中，反应室24另外包含缓冲液。上文各自描述了酶60、酶辅因子、助溶剂和缓冲液。酶60可以被捕获或保留在多孔基质230内。
如在图5中的时间t2处所示，允许酶60和PDP 54彼此反应以形成多肽70(用空心圆形示意性示出)。在一个实施方式中，在分离前允许该反应完成，达到平衡状态。在其他实施方式中，分离在反应达到完成前进行，其中终止腔室24内正在进行的反应用于分离。
如在图5中的时间t3处所示，然后基于多肽70和靶分析物52之间的差异，通过多孔基质230将靶分析物52与形成或产生的多肽分离。在一个实施方式中，基于分析物52的分子和多肽之间的尺寸差异将靶分析物52与多肽分离。在一个实施方式中，多肽70各自具有比靶分析物52的分子的尺寸大得多的尺寸。在一个实施方式中，多肽70比靶分析物52大至少100％。在一个实施方式中，多肽70具有至少1000的尺寸且靶分析物具有不大于200的尺寸。
在所示实例中，将分离出的靶分析物52运送至产物室26。作为结果，可以更好地检测和分析靶分析物52，且来自任何剩余PDP 54的干扰更少。在一个实施方式中，将反应室24和含有的多肽和靶分析物52离心，由此多肽保持捕获在多孔基质230内，而靶分析物52从反应室230排出。在其他实施方式中，可以采用其他分离技术。
图6示意性说明了实例酶促样品纯化系统320。系统320类似于上述系统220，除了系统320额外包括温度控制系统370和运输机构372。将对应于系统20或220的结构的系统320的组件或结构类似地编号。
温度控制系统370提供了用于控制反应室24内的溶液的温度的闭环反馈，以促进反应室24内酶60和接收的样品50的PDP 54之间的酶促反应。温度控制系统370包括加热器374、传感器376和控制器378。加热器374包括生成并发热以便加热反应室24的内容物的装置。在一个实施方式中，加热器374包含通过对电流的电阻产热的导电材料。在另一个实施方式中，加热器374可以包括其他形式的产热和发热装置。
传感器376包括感测反应室24内的溶液的温度的装置。控制器378包括处理单元，其基于从传感器376接收的信号和感测的反应室24的内容物的温度来控制加热器374的操作。通过控制反应室24内的溶液的温度，可以增强通过酶60与PDP 54的反应形成肽。
为了本申请的目的，术语“处理单元”应意指执行在非临时性存储器中含有的指令序列的电子器件或硬件。指令序列的执行引起处理单元执行步骤，诸如生成控制信号。可以将指令加载于随机存取存储器(RAM)中用于处理单元从只读存储器(ROM)、大容量存储装置或一些其他永久性存储器执行。在其他实施方案中，硬接线电路可以替代软件指令使用或与软件指令结合使用来实现所述的功能。例如，控制器378可以体现为一个或多个应用专用的集成电路(ASIC)的一部分。除非另外具体指出，否则控制器不限于硬件电路和软件的任何特定组合，也不限于由处理单元执行的指令的任何特定来源。
运输机构372包括将样品50的纯化部分从反应室24移动至产物室26中的装置。在一个实施方式中，运输机构372包括加压的液体流运输器，其中将加压的液体施加至反应室24以便以箭头380所示的方向将反应室24内的溶液移动至产物室26中。在另一个实施方式中，运输机构372包括电泳运输器，其以箭头382所示的方向施加电场，获得样品50的溶液(包括靶分析物52)朝向产物室26的移动。在两种实施方式中，靶分析物52被移动至产物室26，而由酶60和PDP 54的反应形成的多肽仍然被多孔基质230捕获在反应室24内。
在一个实施方式中，控制器378进一步控制运输机构372的操作。在一个实施方式中，控制器378控制运输机构372被激活的时间。通过控制运输机构372被激活的时间或运输机构372操作的速率，控制器378可以控制在样品50被驱动至产物室26中时形成的多肽的尺寸。通过控制反应发生的溶液的其他特性中的反应时间以及温度，可以控制形成的多肽的长度和尺寸。作为结果，控制器378可以控制反应室24的温度和运输机构372激活的时刻，此时形成的多肽具有足够的长度并且尺寸足够大，使得形成的多肽具有这样的尺寸或其他特性，以便当由运输机构372施加液体偏流(liquid flow bias)时保持被捕获在多孔基质230内。
尽管已经参考实例实施方式描述了本公开，但本领域技术人员将认识到，可以在形式和细节上进行改变，而不脱离所请求保护的主题的精神和范围。例如，尽管不同的实例实施方式已经被描述为包括提供一种或多种益处的一个或多个特征，但考虑所述的特征可以彼此互换或者可替代地在所述的实例实施方式或在其他替代实施方式中与彼此组合。因为本公开的技术相对复杂，所以并非技术上的所有变化都是可预见的。参考实例实施方式描述并在以下权利要求中阐述的本公开显然旨在尽可能宽泛。例如，除非特别指出，否则记载单个特定要素的权利要求还涵盖多个此类特定要素。权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅仅区分不同的要素，并且除非另有说明，否则不与本公开中要素的特定顺序或特定编号具体相关。

Claims (15)

1.酶促样品纯化设备，其包括：
含有多肽合成酶的反应室，所述反应室具有接收包含靶分析物和蛋白降解产物的样品的端口，其中所述多肽合成酶能够与所述蛋白降解产物反应形成多肽，而不与所述靶分析物反应形成多肽；
产物室；和
分离器，其保留由反应室中的蛋白降解产物与多肽合成酶的反应产生的多肽，并且将包含靶分析物的样品的纯化的剩余部分运输至产物室，
其中所述多肽的尺寸比所述靶分析物的尺寸大至少100％。
2.权利要求1的设备，其进一步包括在所述反应室内固定所述多肽合成酶的多孔基质。
3.权利要求1的设备，其中所述分离器包括：
在反应室内固定所述多肽的多孔基质；和
运输机构，其将样品的纯化部分移动至产物室。
4.权利要求3的设备，其中所述运输机构选自由以下组成的运输机构组：电泳运输器和加压的液体流运输器。
5.权利要求1的设备，其中所述分离器选自由以下组成的分离器组：尺寸排阻色谱分离器、透析分离器、电透析分离器和电泳分离器。
6.权利要求1的设备，其进一步包括与所述反应室和所述产物室相互连接的接收器，所述接收器的尺寸被设置为可移除地接收和保留所述反应室和所述产物室之间的分离器。
7.权利要求1的设备，其进一步包括：
在反应室中待并入到所形成的多肽的第一捕获部分；和
由分离器携带的第二捕获部分，第二捕获部分与所形成的多肽的第一捕获部分结合。
8.酶促样品纯化方法，其包括：
将包含靶分析物和蛋白降解产物的样品沉积至含有多肽合成酶的反应室中，以在反应室中形成溶液，其中所述多肽合成酶能够与所述蛋白降解产物反应形成多肽，而不与所述靶分析物反应形成多肽；
使所述蛋白降解产物与多肽合成酶反应以产生多肽；和
分离所述多肽和所述靶分析物，
其中所述多肽的尺寸比所述靶分析物的尺寸大至少100％。
9.权利要求8的方法，其中分离所述多肽和所述靶分析物包括将所述多肽保留在所述反应室内并且将所述靶分析物运输至分开的产物室。
10.权利要求9的方法，其中用所述反应室内的多孔基质将所述多肽保留在所述反应室内。
11.权利要求8的方法，其中分离所述多肽和所述靶分析物包括向所述溶液施加电场，其中所述电场响应于所述多肽与所述靶分析物之间的尺寸差异以不同速率移动所述多肽和所述靶分析物。
12.权利要求8的方法，其进一步包括：
感测所述反应室的温度；
基于感测到的所述反应室的温度激活加热器以向所述反应室施加热量。
13.权利要求8的方法，其进一步包括防止所述靶分析物形成肽键。
14.权利要求8的方法，其中所述靶分析物和所述蛋白降解产物具有重叠的分子尺寸。
15.酶促样品纯化器，其包括：
含有多肽合成酶的反应室，所述反应室具有接收包含靶分析物和蛋白降解产物的样品的端口，其中所述多肽合成酶能够与所述蛋白降解产物反应形成多肽，而不与所述靶分析物反应形成多肽；和
在所述反应室内的多孔基质，所述多孔基质保留由所述反应室中的蛋白降解产物与多肽合成酶的反应产生的多肽，
其中所述多肽的尺寸比所述靶分析物的尺寸大至少100％。
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