CN105567713B

CN105567713B - 花生AhPLDα3蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105567713B
Application number: CN201610133239.5A
Authority: CN
Inventors: 陈四龙; 刘义杰; 李玉荣; 王瑾; 程增书; 宋亚辉
Original assignee: Institute of Grain and Oil Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Grain and Oil Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2016-03-09
Filing date: 2016-03-09
Publication date: 2019-01-08
Anticipated expiration: 2036-03-09
Also published as: CN105567713A

Abstract

本发明公开了一种花生AhPLDα3蛋白及其编码基因与应用，属于植物基因工程技术领域，一种花生AhPLDα3蛋白编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上述花生AhPLDα3蛋白编码基因表达的AhPLDα3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明AhPLDα3蛋白及其编码基因对植物耐旱性分子机理研究，以及提高植物耐旱性和相关性状的改良具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

Description

花生AhPLDα3蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及植物基因工程技术，具体地说是花生AhPLDα3蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

花生是我国重要的油料作物，年种植面积500万hm²左右，总产居世界首位，花生油年产量占国产植物油的23％(廖伯寿等，2008)。目前国内食用油过度依赖进口，油脂供给安全问题凸显，而花生在保障我国食用油供给安全、稳定国内油源方面，具有较大的潜力和优势。但是，干旱却成为花生生产水平进一步提高、种植面积扩大的严重障碍。我国花生集中种植在干旱半干旱内陆及丘陵地区，70％以上受干旱威胁，每年因干旱减产达30％-50％；并导致花生品质劣变，油脂含量和品质下降，黄曲霉毒素污染加重(姜慧芳和任小平，2004)，给消费者的健康带来巨大威胁。所以，采取有效措施提高花生抗旱性势在必行。近年来，转基因育种、分子育种等基因工程技术已成为提高作物抗旱性的重要手段，利用在干旱胁迫应答中起重要作用的基因进行遗传转化是获得耐旱新品种和新种质的重要途径。因此，发掘重要的抗旱基因资源，将为花生的耐旱遗传改良奠定坚实的基础。

磷脂酶D(PLD)是发生在膜上的一类重要信号因子，对植物适应多种逆境胁迫(干旱、低温、高渗、病害等)的保护机制有重要作用，主要通过影响膜质降解，改变膜质成分，特异性水解膜磷脂产生胞内第二信使磷脂酸(PA)，以及与功能蛋白Gα等直接偶联互作，来影响细胞调节过程和参与信号转导，进而响应逆境胁迫。在干旱胁迫膜脂信号传导通路上，PLD处于中心地位(Meijer和Munnik，2003)，能对水分亏缺迅速发生反应，介导细胞对干旱的应答(Chapman，1998)。植物PLD基因属于多基因家族，其中PLDα最普遍。目前，拟南芥、水稻、大豆等植物中均发现了3个以上不同类型的PLDα基因(Shen等，2011)。不同的PLDα在特定的细胞信号转导过程中执行独特的功能，作用机制各异，彼此无法取代(Li等，2009)。Hong等(2010a)发现拟南芥PLDα1和PLDα3均能提高植物对渗透胁迫的反应能力，但PLDα1是通过调节ABA促进气孔关闭以减少水分散失，而PLDα3则主要是通过促进根系生长以获取更多的水分来抵御渗透胁迫的威胁。美国Kansas州立大学的王学敏研究组围绕PLDα做了许多开创性的研究，发现拟南芥PLDα的活性变化与植物水分亏缺状态、叶片细胞膜水解及气孔运动是一致的(Wang，2000)，PLDα及其产物PA在保卫细胞ABA信号转导中起重要作用(Wang，2002)，可通过多种途径与其他信号通路“交叉对话”，响应干旱信号。Zhang等(2004)和Mishra等(2006)发现ABI1和Gα分别以PLDα1为分支参与调控气孔运动。Sang等(2001)发现PLDα基因抑制突变体的抗旱性比野生型显著降低，而离体叶片失水速率明显提高，指出PLDα被抑制后，气孔对ABA的敏感性降低，所以蒸腾失水速率增加，抗旱性下降。在蓖麻上，Hong等(2008)将蓖麻PLDα1在烟草中过量表达，转基因植株的水分蒸腾损失降低；干旱胁迫前期，PLDα1活性提高可促进气孔迅速关闭，减少水分散失；持续干旱伤害加重，PLDα1促进质膜水解，膜离子渗漏率和膜脂过氧化程度均大幅提高。在番茄和苜蓿上，Munnik等(2000)也发现了类似现象。在豇豆中，El Maarouf等(1999)发现干旱胁迫后PLD酶在干旱敏感品种中的增加量高于耐旱品种，促进气孔关闭减缓了植物受害程度。大量研究表明，在非生物胁迫中，PLDα家族蛋白对植物响应胁迫、自我保护的生物学过程起到了潜在的调节作用，但是目前尚未见PLDα基因在花生中克隆和功能研究的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种花生AhPLDα3蛋白及其编码基因与应用。

一种花生AhPLDα3蛋白编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种插入了SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体。

如上述花生AhPLDα3蛋白编码基因表达的AhPLDα3蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

由上述花生AhPLDα3蛋白编码基因在克隆过程中所用的引物名称与核苷酸序列如下：

ahPLD3F：5′–GTGTCCGATCACCCTCATCAAC–3′，

ahPLD3R：5′–TCTAGGCTTTTAGTTCTTAAGCCCA–3′。

上述花生AhPLDα3蛋白编码基因或上述载体在提高植物耐旱性中的应用。所述的植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明从花生中克隆了一个在干旱胁迫信号转导通路上发挥重要调节作用的基因AhPLDα3，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因mRNA表达分析表明其在干旱、ABA和高盐胁迫处理后表达量均有明显增加，并且维持在较高水平。该基因在花生或其他植物如拟南芥中过量表达可明显增强转基因植株的耐旱性。在干旱胁迫下，转基因植株的叶片相对含水量和脯氨酸含量显著高于野生型植株，细胞质离子外渗率和叶片丙二醛含量比野生型显著降低。本发明公开了利用该基因进行植物抗旱性改良的基因工程方法。该方法对转基因育种培育耐旱植物品种特别是花生品种具有一定的作用。本发明的蛋白及其编码基因对植物耐旱性分子机理研究，以及提高植物耐旱性和相关性状的改良具有重要的理论意义和潜在的应用价值，为分子育种提高作物抗旱性提供了新的基因资源。

附图说明

图1为AhPLDα3基因在PEG-6000、ABA、NaCl和低温处理下的表达模式分析显示图；

图2为pBarF3-AhPLDα3植物过表达载体构建示意图；

图3为AhPLDα3基因过表达转基因拟南芥株系转录水平分子鉴定示意图；

图4为转AhPLDα3基因拟南芥生理指标差异比较示意图；

其中，A：叶片相对含水量；B：叶片离子相对电导率；C：叶片脯氨酸含量；D：叶片丙二醛含量。

具体实施方式

下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为本领域常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

农杆菌GV3101菌株和植物过表达载体pBarF3由河北省农林科学院粮油作物研究所花生研究室保存。

哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下简称为野生型拟南芥。

实施例中的花生(Arachis hypogaea L.)品种冀花4号由河北省农林科学院粮油作物研究所花生研究室提供。

实施例1：花生AhPLDα3基因cDNA的克隆与鉴定

本发明以花生抗旱品种冀花4号为材料，筛选已经构建的花生幼苗水分胁迫24h诱导表达的cDNA文库，获得抗旱相关的EST序列。经大规模EST测序和序列拼接后，将得到的Cluster和Contig与NCBI、SWISSPROT等数据库进行大规模比对，获得了基因功能注释。选择在根、叶片中出现频数较高的序列，依据EST同源比对和基本功能注释信息，初步筛选出13个克隆。利用M13引物对全长cDNA文库质粒重新测序，核酸序列经ORF finder分析和全长同源基因比较，结果表明其中10个克隆包含完整的预测开放阅读框(ORF)，在ORF 5′-和3′-端均有同框架的终止密码子、polyA加尾信号及polyA尾。这些基因推测的氨基酸序列保守结构域分析表明，其中1个基因包含PLD蛋白家族的标志序列，即2个HXKXXXXD基序——HKD1和HKD2，它们是PLD催化水解的活性部位，还含有1个C2结构域，它是与Ca²⁺结合的折叠域。该基因片段的cDNA全长2717bp，编码区长度为2439bp，根据已知序列分段扩增该基因的基因组全长序列长度为3031bp，编码区内含有2个内含子和3个外显子，外显子长度分别为42bp、1931bp和466bp。该基因编码812个氨基酸，序列同源性分析及进化分析表明，它与蓖麻PLDα和拟南芥PLDα3的进化关系较近，但氨基酸序列一致性仅为48％，位于一个独立的进化分支，表明该蛋白是一个新的PLDα家族成员，命名为AhPLDα3，该蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.2，序列表中SEQ ID NO.1为其核苷酸序列。

实施例2：花生AhPLDα3基因在逆境胁迫下的表达模式

以冀花4号为实验材料，挑选大小一致的种子播种于温室，正常浇水培养20天，选择健壮、一致的花生幼苗，将其根系分别置于20％的PEG-6000水溶液、250mM NaCl水溶液中，进行干旱和高盐胁迫处理；直接将幼苗移至4℃光照培养箱培养进行低温胁迫处理；采用100μM ABA溶液进行喷雾直至叶片全部湿润，进行外源ABA胁迫处理。其中高盐、低温、ABA胁迫处理分别于0、0.5、1、3、6、8、12、24、48和72h后取相同部位叶片，液氮保存备用。干旱胁迫处理于0、1、3、6、12和24h以及复水后1、3h分别取相同部位叶片，液氮保存备用。

花生叶片总RNA的提取采用Trizol方法，先称取灭菌1.5ml无RNase离心管的质量，称取0.1g左右花生样品，迅速加入液氮中，充分研磨，粉末转入离心管中。加入1ml的Trizol溶液，充分振荡，混合均匀，室温下静置5min。加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15s，充分混合后，冰上静置10min。冷冻离心机中，4℃下14000×g离心15min。取上清液于另一新的1.5ml离心管中。加入2μl DNaseI(无RNase)，室温静置10min。加入0.5ml异丙醇，将离心管上下颠倒，轻轻混匀管中液体，室温静置10min，沉淀总RNA。冷冻离心机中，4℃，14000×g离心10min，弃上清液。加入1ml 75％乙醇(用DEPC水配制)，轻轻洗涤沉淀，轻弹管底，使RNA沉淀悬浮。4℃下7500g离心5min，弃去上清液。在超净工作台上干燥RNA沉淀10min，室温下微干，不可使RNA过干。加入适量的DEPC ddH₂O溶解RNA沉淀，轻弹管底使沉淀溶解。取少量RNA溶液用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量，然后在分光光度计上测定RNA浓度，其余置于–70℃保存备用。

使用RNA反转录试剂盒ReverTra Ace-α-第一链cDNA合成试剂盒(TOYOBO，Japan)进行反转录RT-PCR，合成cDNA第一链，RT-PCR反应程序如下：42℃反应50min，99℃变性5min，即得到反转录cDNA溶液。–20℃保存或直接进行荧光定量PCR反应(qRT-PCR)。

以AhPLDα3基因特异引物PLD3rt-F：5′–AACGGGAGGCTGCCAGATTTG–3′和PLD3rt-R：5′–GCCTTGCCACAATGAATGCTGA–3′，花生组成型表达的AhActin基因为内参照基因，特异引物AhActin：5′–TTCCGATGCCCTGAAGTT–3′，AhActin：5′–CGGTGCCAATGCTGTAAT–3′，以不同胁迫处理的花生叶片总RNA为模板，利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO，Japan)进行qRT-PCR反应。在BIO-RAD IQ5.0荧光定量PCR仪上进行。qRT-PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃复性20s，72℃延伸20s(收集荧光信号)，反应40个循环；72℃后延伸5min；4℃保温30min。在65–95℃间读板获取溶解曲线。采用2^–ΔΔCt法(Livak和Schmittgen，2001)分析目标基因表达差异。

qRT-PCR分析结果表明，在PEG-6000(20％)模拟干旱胁迫条件下，AhPLDα3的表达表现出较为规律的变化特征，随着胁迫时间的增加，mRNA的积累量也不断增加，复水后AhPLDα3的表达量比胁迫前显著升高。在ABA处理条件下，AhPLDα3的表达水平变化随胁迫时间的推移表现出先降低而后升高的“倒钟形”曲线变化，即ABA胁迫2h后AhPLDα3的表达量达到最低，而后随着胁迫时间的增加其表达水平逐渐升高，到48h达到最大值。在高盐、低温(4℃)胁迫下，AhPLDα3表达变化均无明显规律(图1)。从AhPLDα3表达的变化规律分析，干旱胁迫条件下，AhPLDα3对胁迫响应的表达变化与植物响应干旱过程的生理反应过程基本一致，说明AhPLDα3在花生响应干旱过程中发挥重要作用。

实施例3：花生AhPLDα3基因在提高拟南芥耐旱性中的应用

一、过表达AhPLDα3基因拟南芥株系的获得

1、AhPLDα3基因植物过量表达载体的构建

首先根据pBarF3载体上多克隆位点的酶切位点设计基因特异引物(带酶切位点和保护碱基)，引物序列如下：PLD3nco-F：5′–CATGCCATGGTCATGGCATTGAAGCTGCTACACG–3′，PLD3xba-R：5′–GCTCTAGACTAGACCCTCTCCACTAATTTTAGG–3′。以花生总RNA为模板，PCR扩增出目的基因编码区序列，然后T4连接到原核表达载体pEASY-T1Vector(TransGen，China)上，转化Trans5α感受态细胞，测序验证目标序列正确后，提取质粒，利用限制性内切酶XbaI和NcoI双酶切目的片段，同时用上述2种内切酶消化pBarF3质粒，回收外源片段和载体，连接2片段，将构建的带有目的基因的重组载体转化大肠杆菌，挑取抗性阳性克隆并提取质粒，进行双酶切验证，并经测序证实构建的过表达重组载体pBarF3-AhPLDα3构建完全正确(图2)，该重组载体为将序列SEQ ID NO.1插入到pBarF3植物表达载体的XbaI和NcoI酶切位点之间得到的重组质粒载体，且插入方向为AhPLDα3基因正向插入。

2、重组质粒电击转化根癌农杆菌细胞与鉴定

将重组质粒pBarF3-AhPLDα3用电击转化法导入GV3101感受态细胞。取出–80℃冻存的根癌农杆菌GV3101，在YEB固体培养基(含利福平50mg/l)平板上用牙签划线，纯化受体菌株，28℃下恒温培养2天。挑取单菌落接种于5ml含50mg/l利福平的YEB液体培养基中，28℃下230rpm振荡培养过夜。按1:50比例转接到50ml YEB液体抗性培养基中，按上述条件培养3h以上，直到OD600＝0.6–0.8。然后在4℃条件下5000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀在冰中放置20min。加入10m1预冷的灭菌ddH₂O，涡旋仪上重悬菌体。4℃条件下5000rpm再次离心10min，弃上清。重复以上重悬步骤1次。用10ml预冷灭菌ddH₂O重悬菌体。28℃条件下230rpm离心，弃上清。将菌体悬于1m1预冷10％灭菌甘油中，每个离心管中分装45μl，液氮中速冻后存于–80℃备用。

取1μl构建好重组质粒，电击转入20μl农杆菌感受态细胞GV3101菌株。将电转化杯用75％乙醇浸泡30min，然后用无水乙醇浸泡，无菌环境风干；使用前经紫外灭菌15min。放置于冰上预冷10min。将冰冻的农杆菌感受态细胞在冰上放置5min，解冻感受态细胞。取1μl重组质粒加入45μl感受态细胞中，混匀，冰上放置3min。菌液全部取出加入电转化杯中，并轻轻敲击使菌液落入转化杯底部。用BIO-RAD电转化仪在1800V电压下，电击1s。迅速加入980μl YEB液体培养基(无抗生素)到电转化杯中，混匀后，全部菌液移入无菌离心管中。然后用1ml YEB液体培养基28℃250rpm恢复培养2–4h。取10μl菌液涂布于含有50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的YEB固体培养基上，28℃倒置培养2–3天。提取农杆菌质粒，PCR检测目标基因，经双酶切鉴定，获得重组菌株GV3101/pBarF3-AhPLDα3。阳性菌液保存于-70℃冰箱备用。

2、过表达AhPLDα3基因拟南芥株系的获得

挑取GV3101/pBarF3-AhPLDα3的单菌落，加入5m1含Kan 50mg/l和利福平50mg/l的YEB液体培养基中。28℃下230rpm振荡培养3天。将菌液转入250ml YEB液体培养基，28℃条件下230rpm恒温振荡过夜。菌液OD600≈0.8时，4000rpm离心15min。弃去上清，加入农杆菌浸染法培养液。培养液配制为5％的蔗糖+0.05％的Silwet L77。

使用浸花法(floral dip)浸染转化野生型拟南芥Col-0(Clough和Bent，1998；Zhang等，2006)。将拟南芥花盆倒扣于装有250m1重悬菌液的培养皿上，使花序全部浸没在重悬菌液中，保持持续浸染20–30s。转化后的植株在黑暗条件下，于22℃保湿48h，然后正常培养。转化植株生长1周后，按照相同方法再转化1次。待植株正常开花结果后，收获种子，干燥后于4℃保存待用。

农杆菌浸染当代植株收获的种子即为T0代种子，T0种子混合收获，经30mg/l草胺膦除草剂Basta抗性筛选后获得阳性T1代植株种子即T1代株系。继续抗性筛选，选择抗：感分离比例为3:1的单株，按单株收获为T2代株系。然后，再次筛选全部为抗性、不发生分离的株系为T3代纯合转基因株系，做好标记，用于进一步鉴定实验。为保证拟南芥单株生长环境一致，减少外界条件对拟南芥生长发育的影响，生长期间保持光照、湿度、温度等均匀一致，并定期交叉调换拟南芥单株摆放位置。

3、过表达AhPLDα3基因拟南芥株系的分子鉴定

使用拟南芥总DNA简易批量小提方法提取转基因植株叶片DNA，方法如下：取新鲜拟南芥叶片2–3片，放入2.0ml离心管中，带管一起放入液氮中，取出立即用玻璃棒研碎。加入650μl DNA提取液，振荡混匀。在60℃下水浴20–60min。此步可较长时间放置。在4℃下12000rpm离心10min。取上清液至一新管中，加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，在4℃下12000rpm离心10min。取上清液至一新管中，加入0.7×体积的异丙醇，混匀，在4℃下12000rpm离心15min。弃上清，用70％乙醇洗沉淀2次，吹干后溶于30μl ddH₂O中(含0.1mg/ml RNase)。以提取的T0、T1代单株总DNA为模板，分别用AhPLDα3基因特异引物PLD3rt-F：5′–AACGGGAGGCTGCCAGATTTG–3′，PLD3rt-R：5′–GCCTTGCCACAATGAATGCTGA–3′，Bar基因引物Barrt-F：ACCATCGTCAACCACTACAT，Barrt-R：AGTCCAGCTGCCAGAAACCC，PCR扩增获得196bp和436bp目的片段，说明获得的转基因植株为阳性。

为了检测转基因植株中外源基因AhPLDα3的转录表达情况，以抗性筛选获得的阳性T3代纯合转基因植株叶片总RNA为模板，从转录水平上对转基因株系进行表达检测。采用Trizol方法提取叶片总RNA，然后采用ReverTra Ace-α-第一链cDNA合成试剂盒进行反转录合成cDNA第一链。使用野生型拟南芥作对照，用拟南芥内参基因AtActin7(Mu等，2008)特异引物AtActin7rt-F：5′–GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG–3′，AtActin7rt-R：5′–CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA–3′，扩增野生型和转基因植株的cDNA，使用SYBR GreenRealtime PCR Master Mix进行qRT-PCR扩增。检测了40个转基因植株，结果显示AhPLDα3基因在对照野生型拟南芥中的表达量几乎为0，大部分植株中有外源基因的表达，但不同单株在表达水平上存在差异，选择2株过量表达的转AhPLDα3株系19-1和19-2进行后续的表型分析和功能鉴定(图3)。

4、过表达AhPLDα3基因拟南芥株系表型分析

将T3代转AhPLDα3拟南芥纯系19-1和19-2与野生型拟南芥种植于相同的条件下，观察各植株的表型。结果显示，在正常培养条件下，野生型拟南芥Col-0和转基因纯系苗期、成株期、成熟期的表型均较为一致，在所有3个时期中，从长势、叶形、叶色、株高、开花期、角果长度和种子性状上均差异不明显，说明外源基因AhPLDα3的过表达并未影响转基因植株的正常生长发育。

二、过表达AhPLDα3基因拟南芥株系耐旱性鉴定

1、抗旱性鉴定

为了验证花生AhPLDα3在拟南芥中过表达对转基因植株耐旱性的影响，将拟南芥幼苗连续3周停止浇水，进行干旱胁迫，发现转基因植株个体大于野生型植株，推测这与转基因植株的根系较为发达、根系多有关，转基因株系的根长、须根数量较野生型明显增加。

将生长30天的拟南芥植株干旱胁迫20天，结果显示所有野生型植株叶片全部萎蔫、失绿，而转基因植株均保持绿色、健壮的叶片，萎蔫程度较野生型对照明显较轻，而且复水后转基因植株恢复正常生长的能力明显比野生型对照植株强，而野生型植株的恢复能力较差，最终失水枯死。

2、生理指标鉴定

转AhPLDα3基因拟南芥和野生型拟南芥出苗30天后，停止浇水，连续干旱胁迫处理20天，取转基因和野生型拟南芥植株叶片分别测定了相对含水量、相对离子电导率、脯氨酸含量和丙二醛含量等生理指标(图4)。

采用Barr和Weatherley(1962)的方法分别测定转基因和野生型拟南芥植株叶片的相对含水量，取大小、部位和叶龄均相同的叶片，立即称取鲜重FW，然后将叶片浸到无菌水中过夜，取出后擦干叶片表面，称取水分饱和的叶片重量TW，之后80℃烘干叶片24h，最后称取其干重DW，计算叶片相对含水量RWC＝(FW-DW)×100/(TW-DW)。结果表明野生型植株叶片相对含水量降低到15％，而过表达植株的叶片相对含水量保持在62％-82％。与野生型相比较，在干旱胁迫条件下转基因植株比野生型植株保持了更高的水分含量，差异达到显著水平，说明花生AhPLDα3过表达可以显著增强转基因植株的保水能力(图4A)。

用打孔器从相同部位的叶片上取1cm²的叶盘，迅速放入15ml蒸馏水中，室温下轻轻振荡，孵育3h，用电导仪测量此时溶液的初始离子电导率EC1。然后将放有叶盘的溶液在沸水中孵育15min，之后于室温静置冷却，用电导仪测量此时溶液的最终离子电导率EC2，分别获得转基因和野生型拟南芥植株离体叶片的相对离子电导率＝EC1×100/EC2，作为衡量干旱胁迫时细胞原生质膜透性变化和电解质外渗率的指标。分析结果表明，干旱胁迫条件下，转基因植株叶片细胞电解质外渗率比野生型叶片增加3.4-4.4倍(图4B)，说明AhPLDα3过表达可以降低干旱对细胞膜的伤害，减小细胞膜的透性。

干旱胁迫下转基因植株和野生型拟南芥叶片脯氨酸含量测定采用Bates等(1973)提出的标准方法，用磺基水杨酸溶液提取叶片脯氨酸，用酸性茚三酮加热处理，再用甲苯处理，将色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。实验结果表明，转基因拟南芥叶片脯氨酸含量比野生型高2.7-5.8倍(图4C)，说明转基因植株体内积累了大量的脯氨酸，脯氨酸作为细胞质内的渗透调节剂，在干旱条件下起到了调节细胞氧化还原势的重要作用。

叶片丙二醛含量采用Heath和Packer(1968)提出的方法测定。干旱胁迫下，转基因植株丙二醛含量比相同条件下野生型植株丙二醛含量降低71.8％-95.6％，说明AhPLDα3基因过表达增强了转基因植株细胞膜抗氧化分解能力，降低了干旱胁迫对质膜的破坏，提高了植物的抗旱性和耐旱能力(图4D)。

综上所述，在受到干旱胁迫条件下，转基因植株的叶片相对含水量、脯氨酸含量、离子电导率、丙二醛含量等生理生化指标与野生型相比，得到了明显改善，使转基因植株的耐旱性大大增强。因此，在受体植物中过量表达AhPLDα3基因，有望提高受体植物的耐旱性。

Claims

1.一种花生AhPLDα3蛋白编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种插入了SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体。

3.如权利要求1所述的花生AhPLDα3蛋白编码基因表达的AhPLDα3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求1所述的花生AhPLDα3蛋白编码基因，其特征在于：所述的AhPLDα3蛋白编码基因在克隆过程中所用的引物名称与核苷酸序列如下：

ahPLD3F：5′–GTGTCCGATCACCCTCATCAAC–3′，

ahPLD3R：5′–TCTAGGCTTTTAGTTCTTAAGCCCA–3′。

5.权利要求1所述的花生AhPLDα3蛋白编码基因或权利要求2所述的载体在提高拟南芥耐旱性中的应用。