ES2287935T3 - Secuencias de adn codificantes de enzimas capaces de facilitar la sintesis de a-1,4 glucanos lineales en plantas, hongos y microorganismos. - Google Patents

Secuencias de adn codificantes de enzimas capaces de facilitar la sintesis de a-1,4 glucanos lineales en plantas, hongos y microorganismos. Download PDF

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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA DE UNA AMILOSACARASA QUE PERMITE LA SINTESIS DE {AL}-1,4 GLUCANOS LINEALES A PARTIR DE UNA FUENTE DE SACAROSA POR BACTERIAS, HONGOS Y PLANTAS O POR SISTEMAS NO CELULARES. LA INVENCION DESCRIBE TAMBIEN PLASMIDOS Y BACTERIAS QUE CONTIENEN ESTAS SECUENCIAS DE ADN ASI COMO LOS PROCESOS PARA LA PRODUCCION DE PLANTAS Y MICROORGANISMOS CAPACES DE EXPRESAR INTRACELULAR O EXTRACELULARMENTE UN POLIPEPTIDO CON ACTIVIDAD AMILOSACAROSA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA PRODUCCION DE FRUCTOSA PURA UTILIZANDO PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA DE AMILOSACAROSA.

Description

Secuencias de ADN codificantes de enzimas capaces de facilitar la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales en plantas, hongos y microorganismos.
La presente invención se refiere a técnicas de ADN recombinante para producir plantas y microorganismos capaces de expresar intra- o extracelularmente una proteína que exhibe actividad de amilosacarasa y que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de la sacarosa.
La presente invención se refiere adicionalmente a nuevas secuencias de ADN y plásmidos que contienen dichas secuencias de ADN que, después de integración en un genoma de planta o después de transformación en microorganismos, particularmente bacterias u hongos, dan como resultado la expresión de una enzima que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de la sacarosa, así como a organismos transgénicos (es decir, plantas, hongos y microorganismos) que contienen las secuencias de ADN arriba mencionadas.
Los \alpha-1,4-glucanos lineales son polisacáridos constituidos por monómeros de glucosa, estando enlazados los últimos exclusivamente unos a otros por enlaces glicosídicos \alpha-1,4. El \alpha-1,4-glucano natural existente más abundantemente es la amilosa, un componente del almidón vegetal. Recientemente, se ha asignado cada vez mayor importancia al uso comercial de \alpha-1,4-glucanos lineales. Debido a sus propiedades físico-químicas, la amilosa puede utilizarse para producir películas que son incoloras, inodoras e insípidas, no tóxicas y biológicamente degradables. Hoy en día, existen ya diversas posibilidades de aplicación, v.g., en la industria alimentaria, la industria textil, la industria de las fibras de vidrio y en la producción de papel.
Se ha alcanzado éxito también en la producción de fibras a partir de amilosa cuyas propiedades son similares a las de las fibras naturales de celulosa y que permiten reemplazar parcial o incluso totalmente las mismas en la producción de papel.
Al ser el representante más importante de los \alpha-1,4-glucanos lineales, la amilosa se utiliza particularmente como aglomerante para la producción de tabletas, como espesante de pudines y cremas, como sustituto de la gelatina, como aglomerante en la producción de paneles de pared insonorizantes y para mejorar las propiedades de flujo de los aceites céreos.
Otra propiedad de los \alpha-1,4-glucanos, que ha adquirido recientemente atención creciente, es la capacidad de estas moléculas para formar compuestos de inclusión con complejantes orgánicos debido a su estructura helicoidal. Esta propiedad permite utilizar los \alpha-1,4-glucanos para una gran diversidad de aplicaciones. Consideraciones actuales se refieren a su uso para la encapsulación molecular de vitaminas, compuestos farmacéuticos y sustancias aromáticas, así como su uso para la separación cromatográfica de mezclas de sustancias sobre \alpha-1,4-glucanos lineales inmovili-
zados.
La amilosa sirve también como materia prima para la producción de las denominadas ciclodextrinas (a las que se hace referencia también como cicloamilosas, ciclomaltosas) que, a su vez, se utilizan ampliamente en la industria farmacéutica, la tecnología de procesamiento de alimentos, la industria cosmética y la tecnología de separación analítica. Estas ciclodextrinas son maltooligosacáridos cíclicos de 6 a 8 unidades de monosacárido, que son solubles en agua en todas proporciones pero tienen una cavidad hidrófoba que puede utilizarse para formar compuestos de inclusión.
Hoy en día, los \alpha-1,4-glucanos lineales se obtienen en la forma de amilosa a partir del almidón. El almidón propiamente dicho está constituido por dos componentes. Un componente forma la amilosa como cadena no ramificada de unidades glucosa unidas por enlaces \alpha-1,4. El otro componente constituye la amilopectina, un polímero altamente ramificado de unidades glucosa en el cual, además de los enlaces \alpha-1,4, las cadenas de glucosa pueden estar ramificadas también por enlaces \alpha-1,6. Debido a su diferente estructura y las propiedades fisicoquímicas resultantes, los dos componentes se utilizan también para campos de aplicación diferentes. Con objeto de poder utilizar directamente las propiedades de los componentes individuales, es necesario obtenerlos en forma pura. Ambos componentes pueden obtenerse a partir del almidón, requiriendo sin embargo el proceso varios pasos de purificación e implicando tiempo y dinero considerables.
Por esta razón, hay una necesidad urgente de encontrar posibilidades de obtención de ambos componentes del almidón de una manera uniforme. A este fin, las plantas productoras de almidón se han alterado hasta ahora por mejora genética o por manipulación genética para producir almidón con una proporción amilosa/amilopectina alterada. Mientras que el porcentaje normal de amilopectina del almidón de maíz es v.g., 70%, se ha alcanzado éxito en el establecimiento de una variedad de maíz (maíz céreo) por mejora genética, cuyo almidón está constituido casi en un 100% por amilopectina (Akatsuka y Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241: 2280-2285).
Adicionalmente, varias variedades de maíz que tienen un contenido incrementado de amilosa (60-70%) se han producido por mejora genética, v.g., las variedades amylose extender y dull (Wolf et al., 1955, J. Am. Chem. Soc. 77: 1654-1659; Boyer et al., 1976, Die Stärke: 28:405-410). Otras especies de plantas han sido utilizadas para obtener variedades que sintetizan almidones uniformes en forma de amilopectina, v.g. arroz (Sano, 1984, Theor. Appl. Genet. 68:467-473) y cebada (Shannon & Garwood, 1984, en: Whistler, Bemiller, Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, Orlando, 2ª edición: 25-86) o que sintetizan almidón con alto contenido de amilosa (v.g. guisantes). Además de los enfoques anteriores de mejora genética clásica, se ha informado de enfoques basados en la manipulación genética de plantas productoras de almidón.
Visser et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 255:289-296), por ejemplo, describen que variedades de patata que sintetizan almidón constituido sustancialmente por amilopectina pura pueden obtenerse por inhibición anti-sentido del gen que codifica la almidón-sintetasa fijada a los gránulos de almidón.
El documento WO 92/14827 describe la producción de plantas de patata que, debido a la inhibición anti-sentido de la expresión de la enzima ramificadora, producen un almidón que tiene una proporción amilosa/amilopectina incrementada. Sin embargo, las plantas descritas en WO 92/14827 no producen un almidón que contenga una proporción elevada de amilosa.
A pesar de numerosos intentos y diversos enfoques, no se ha logrado éxito hasta ahora en la obtención de plantas que produzcan un almidón constituido por amilosa pura.
Asimismo, hasta ahora no se ha descrito posibilidad alguna de producir amilosa de gran pureza o \alpha-1,4-glucanos lineales puros por utilización de otros procesos, v.g., microorganismos modificados por ingeniería genética.
Adicionalmente, no se ha encontrado hasta ahora secuencia alguna de ADN que codifique enzimas que pudieran ser capaces de catalizar la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales en plantas, hongos, microorganismos, o in vitro.
Por consiguiente, el objeto de la presente invención es proporcionar secuencias de ADN y procesos que son capaces de permitir la producción de plantas, hongos y microorganismos capaces de sintetizar \alpha-1,4-glucanos lineales.
El objeto de la presente invención se consigue por la provisión de las realizaciones caracterizadas por las reivindicaciones de patente.
La invención se refiere por tanto a una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa, seleccionada del grupo constituido por
(a)
secuencias de ADN que codifican una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la región codificante que codifica una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea tal como está contenida en la inserción de ADN del plásmido pNB2 (DSM 9196);
(b)
la secuencia de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la región codificante que codifica una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea tal como está contenida en la inserción de ADN del plásmido pNB2 (DSM 9196);
(c)
secuencias de ADN que se hibridan a cualquiera de las secuencias de (a) o (b);
(d)
secuencias de ADN que son idénticas al menos en un 40% a la secuencia de ADN que se define en (b); y
(e)
secuencias de ADN que están degeneradas debido al código genético en comparación con las secuencias mencionadas en (a), (b), (c) o (d).
Particularmente, la invención se refiere a secuencias de ADN que codifican una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la región codificante que codifica una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea tal como está contenida en la inserción de ADN del plásmido pNB2 (DSM 9196), y a la secuencia de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la región codificante que codifica una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea tal como está contenida en la inserción de ADN del plásmido pNB2 (DSM 9196). La presente invención se refiere adicionalmente a secuencias de ADN que se hibridan a las secuencias de la invención arriba mencionadas y que codifican una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa, así como a secuencias de ADN que, debido al código genético, están degeneradas en comparación con las secuencias de ADN de la invención arriba mencionadas.
El término "hibridación" significa en este contexto hibridación en condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente en condiciones rigurosas tales como se describen, v.g., en Sambrook et al. (1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Secuencias de ADN de acuerdo con la invención que codifican una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa pueden obtenerse por un proceso que comprende los pasos siguientes:
(a)
preparar una genoteca genómica o una genoteca de cADN sobre la base del ADN genómico o el mRNA de células de un organismo;
(b)
transformar un hospedador adecuado con la genoteca construida en el paso (a);
(c)
someter las células transformadas a vapor de yodo;
(d)
identificar las células que se tiñen de azul;
(e)
aislar y cultivar las células identificadas en el paso (d); y
(f)
aislar la inserción del ADN genómico o la inserción de cADN de las células transformadas.
Un hospedador adecuado como se menciona en el paso (d) es, v.g., E. coli.
En una realización preferida, la invención se refiere a secuencias de ADN que codifican una amilosacarasa de microorganismos, particularmente microorganismos Gram-negativos, preferiblemente de bacterias de las especies de Neisseria y de modo particularmente preferido de Neisseria polysaccharea.
Es asimismo posible modificar las secuencias de ADN de la invención por mutación o por una alteración de la secuencia por inserción, deleción, sustitución o recombinación a fin de alterar ciertas propiedades de la proteína a expresar. Una de estas modificaciones es, entre otras, la deleción de la secuencia señal que asegura la secreción de la enzima, y las inserciones de otras secuencias señal o secuencias de ADN que codifican péptidos de tránsito y que influyen por tanto en la localización de la proteína expresada.
Las secuencias de ADN de la invención, en particular la secuencia de ADN de la invención indicada en Seq ID No. 1 o partes de la misma, pueden utilizarse para determinar si están presentes secuencias de ADN homólogas en o son expresadas por ciertos organismos. Con objeto de conseguir esto, muestras de ADN o mRNA del organismo individual se hibridan a una secuencia de ADN de la invención en condiciones de hibridación apropiadas de acuerdo con métodos convencionales.
Es asimismo posible aislar de acuerdo con técnicas estándar del genoma de diversos organismos secuencias homólogas que codifican análogamente amilosacarasas o enzimas que tienen propiedades similares por utilización de una secuencia de ADN de la invención. En este contexto, homología significa una identidad de secuencias de al menos 40 a 60%, preferiblemente mayor que 60%, en particular mayor que 80% y de modo todavía más preferible una identidad de secuencia mayor que 95%. Adicionalmente, homología significa que las secuencias de ADN respectivas o secuencias de aminoácidos codificadas son funcional y/o estructuralmente equivalentes. Las secuencias que son homólogas a las secuencias de la invención y que se desvían de la secuencia de ADN o la secuencia de aminoácidos codificada de la invención en una o más posiciones son regularmente variaciones de dicha secuencia que representan modificaciones que tienen la misma función. Aquéllas pueden ser variaciones existentes naturalmente, tales como secuencias de otros organismos, o mutaciones. Estas mutaciones pueden ocurrir naturalmente o pueden conseguirse por mutagénesis específica. Adicionalmente, estas variaciones pueden ser secuencias producidas por síntesis. Todas estas secuencias de ADN están comprendidas análogamente por la invención.
Las proteínas codificadas por las diversas variantes de la secuencia de ADN de la invención comparten características específicas comunes, tales como actividad enzimática, reactividad inmunológica, conformación, etc., así como propiedades físicas tales como movilidad electroforética, comportamiento cromatográfico, coeficiente de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, etc.
A fin de determinar secuencias de ADN afines, deben obtenerse genotecas de genes del organismo a examinar que sean representativas del contenido de los genes en el organismo o de la expresión de los genes en el organismo o de un cierto tejido del organismo. El primer tipo mencionado son genotecas genómicas, y el último genotecas de cADN.
La identificación y el aislamiento de secuencias de ADN homólogas a partir de dichas genotecas se consigue por hibridación de acuerdo con técnicas estándar (véase, v.g., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Como sonda de hibridación pueden utilizarse moléculas de ADN que exhiben exacta o sustancialmente la secuencia de ADN indicada bajo Seq ID No. 1 o parte de dicha secuencia. Los fragmentos de ADN utilizados como sondas de hibridación pueden ser también fragmentos de ADN sintéticos que se han preparado de acuerdo con métodos convencionales de síntesis de ADN y son sustancialmente idénticos a una secuencia de la invención. Una vez que los genes que se hibridan a una secuencia de ADN de la invención han sido identificados y aislados, es necesario determinar la secuencia y analizar las propiedades de las proteínas codificadas por dicha secuencia.
La amilosacarasa (a la que se hace referencia también como sacarosa: 1,4-\alpha-glucano-4-\alpha-glucosiltransferasa, E.C. 2.4.1.4.) es una enzima para la cual se ha sugerido el esquema de reacción siguiente:
sacarosa + (\alpha-1,4-D-glucosil)_{n} \rightarrow D-fructosa + (\alpha-1,4-D-glucosil)_{n+1}
Esta reacción es una transglucosilación. Los productos de esta reacción son \alpha-1,4-glucanos lineales y fructosa. No se requieren cofactores. Hasta ahora se ha encontrado únicamente actividad de amilosacarasa en un pequeño número de especies de bacterias, entre ellas particularmente las especies de Neisseria (MacKenzie et al., 1978, Can. J. Microbiol. 24:357-362) y la enzima ha sido examinada únicamente en cuanto a su actividad enzimática. De acuerdo con Okada et al., la enzima parcialmente purificada de Neisseria perflava después de la adición de sacarosa da como resultado la síntesis de polisacáridos semejantes a glucógeno que están ramificados en pequeña proporción (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem. 249:126-135). Análogamente, los glucanos de Neisseria perflava y Neisseria polysaccharea sintetizados intra- o extracelularmente exhiben cierto grado de ramificación (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32:909-911). Si estas ramificaciones son introducidas por la amilosacarasa o por otra enzima que esté presente en las preparaciones de amilosacarasa purificadas como contaminación, no ha sido esclarecido hasta ahora. Dado que no se ha encontrado hasta ahora una enzima que introduzca ramificación, se supone que tanto las reacciones de polimerización como las de ramificación son catalizadas por la amilosacarasa (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem. 249:126-135).
La enzima que se expresa de manera constitutiva en Neisseria es extremadamente estable, se fija muy fuertemente a los productos de polimerización y es inhibida competitivamente por el producto fructosa (MacKenzie et al., 1977, Can. J. Microbiol. 23:1303-1307). La especie de Neisseria polysaccharea secreta la amilosacarasa (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32:909-911) mientras que en las otras especies de Neisseria la misma se mantiene en la célula.
Enzimas que tengan actividad de amilosacarasa han podido detectarse únicamente en microorganismos. No se conocen plantas que contengan amilosacarasas.
De acuerdo con la invención, ha podido demostrarse que el producto de la reacción catalizada por amilosacarasa son \alpha-1,4-glucanos lineales que no están ramificados como se ha supuesto hasta ahora (véase anteriormente).
La detección de la actividad enzimática de la amilosacarasa puede conseguirse por detección de los glucanos sintetizados, como se describe en el Ejemplo 3, más adelante. La detección se lleva a cabo usualmente por utilización de un tinte de yodo. Es posible identificar colonias bacterianas que expresan amilosacarasa mediante, v.g., tratamiento con vapor de yodo. Las colonias que sintetizan estos \alpha-1,4-glucanos lineales se tiñen de azul.
La actividad enzimática de la enzima purificada puede ser detectada, v.g., en placas de agarosa que contienen sacarosa. Si la proteína se aplica a una placa de este tipo y se incuba durante aproximadamente 1 hora o más a 37ºC, la misma se difunde en la agarosa y cataliza la síntesis de glucanos lineales. Los últimos pueden ser detectados por tratamiento con vapor de yodo. Adicionalmente, la proteína puede ser detectada en geles de poliacrilamida nativos. Después de una electroforesis en gel de poliacrilamida nativo, el gel se equilibra en tampón de citrato de sodio (50 mM, pH 6,5) y se incuba durante una noche en una solución de sacarosa (al 5% en tampón de citrato de sodio). Si el gel se tiñe subsiguientemente con solución de Lugol, las áreas en las cuales están localizadas proteínas que tienen actividad de amilosacarasa se tiñen de azul debido a la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales.
Con la ayuda de las secuencias de ADN de la invención es posible producir plantas que son capaces de producir almidón de amilosa pura, es decir, \alpha-1,4-glucanos lineales, y modificar las plantas productoras de almidón de tal manera que las mismas produzcan mayores rendimientos de almidón y una proporción amilosa/amilopectina simultáneamente incrementada. Las secuencias de ADN de la invención pueden utilizarse para producir microorganismos y hongos, particularmente levaduras, que son capaces de producir una enzima que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa.
Adicionalmente, es posible producir con costes de producción bajos jarabe de fructosa puro con la ayuda de las secuencias de ADN de la invención de las proteínas codificadas por ellas.
En otra realización, la invención se refiere a moléculas de ADN recombinante, tales como vectores, particularmente plásmidos, que contienen las secuencias de ADN de la invención o partes de las mismas, v.g., el plásmido pNB2 que ha sido depositado de acuerdo con DSM No. 9196. La invención se refiere particularmente a moléculas de ADN recombinante en las cuales una secuencia de ADN de la invención está enlazada a secuencias que aseguran la expresión de una proteína que tiene actividad de amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa en microorganismos, hongos o plantas, v.g., plásmidos que contienen las secuencias de ADN siguientes:
(a)
un promotor apropiado que es activo en microorganismos, que asegura que la secuencia codificante aguas abajo del mismo se transcribe en microorganismos, y
(b)
una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que exhibe actividad de amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa y que está enlazada al promotor de tal modo que la misma permite la formación de un RNA que puede traducirse en un polipéptido;
o plásmidos que contienen las secuencias de ADN siguientes:
(a)
un promotor apropiado que es activo en plantas que asegura que la secuencia codificante aguas abajo del mismo se transcribe en el tiempo apropiado o en una etapa de desarrollo apropiada de una planta transgénica o en ciertos tejidos de una planta transgénica, y
(b)
una secuencia de ADN codificante de un polipéptido que exhibe actividad de amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa y que está enlazada al promotor de tal modo que la misma permite la formación de un RNA traducible en un polipéptido.
Un objeto adicional de la invención son microorganismos, hongos y plantas que contienen las moléculas de ADN recombinante de la invención.
Otro objeto adicional de la invención son proteínas que tienen la actividad enzimática de una amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa y que están codificadas por una de las secuencias de ADN de la invención, particularmente las derivadas de microorganismos, preferiblemente de microorganismos Gram-negativos, específicamente de microorganismos del género Neisseria y de modo particularmente preferido de Neisseria polysaccharea. Un objeto de la invención son adicionalmente amilosacarasas que tienen un peso molecular de 63 \pm 20 kDA por electroforesis en gel, preferiblemente de 63 \pm 15 kDA y muy preferiblemente de 63 \pm 10 kDA.
Otro objeto adicional de la invención son particularmente proteínas que tienen la actividad enzimática de amilosacarasa que exhiben la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la región codificante que codifica una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea tal como está contenida en la inserción de ADN del plásmido pNB2 (DSN9196). La invención se refiere adicionalmente a proteínas que exhiben secuencias de aminoácidos que son sustancialmente idénticas a dicha secuencia de aminoácidos o que se desvían de dicha secuencia en una o más posiciones. Las desviaciones son preferentemente intercambios conservadores de aminoácidos y la proteína tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa. Así, la invención se refiere adicionalmente a amilosacarasas cuya secuencia de aminoácidos exhibe una alta homología con la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la región codificante que codifica una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea tal como está contenida en la inserción de ADN del plásmido pNB2 (DSN9196), en particular una homología de al menos 70%, preferiblemente mayor que 80%, más preferiblemente mayor que 90% y de modo particularmente preferible una homología de al menos
99%.
En una realización adicional, la invención se refiere al uso de las secuencias de ADN de la invención y de moléculas de ADN, particularmente de plásmidos, que contienen dichas secuencias de ADN para la transformación de células procariotas o eucariotas así como para la expresión de una amilosacarasa en células procariotas o eucariotas, y también a un proceso para la producción de las proteínas de la invención por cultivo de un microorganismo que contiene una molécula de ADN recombinante de la invención en un nutriente apropiado.
Específicamente, el objeto de la presente invención es un proceso para la producción de plantas que son capaces de sintetizar \alpha-1,4-glucanos lineales, caracterizado por introducir en células vegetales una secuencia de ADN de la invención que comprende una región que codifica una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa enlazada a secuencias de ADN que aseguran la expresión en células vegetales y la regeneración de plantas enteras a partir de las células transformadas.
Adicionalmente, la presente invención se refiere a un proceso para la producción de células vegetales y plantas que son capaces de sintetizar \alpha-1,4-glucanos lineales, que comprende las etapas de proceso siguientes:
(a)
producir una casete de expresión que tiene las secuencias parciales siguientes:
(i)
un promotor que es activo en plantas y que asegura la formación de un RNA en el tejido diana o células diana respectivos;
(ii)
al menos una secuencia de ADN de acuerdo con la invención que codifica una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa y que está fusionada al promotor en orientación de sentido;
(iii)
una señal que es funcional en plantas para la terminación de la transcripción y poliadenilación de una molécula de RNA;
(b)
transferir la casete de expresión en células vegetales;
(c)
regenerar plantas enteras intactas a partir de las células vegetales transformadas.
Promotores útiles son aquellos promotores que aseguran una expresión constitutiva del gen en todos los tejidos de las plantas tales como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) así como aquéllos que aseguran la expresión únicamente en ciertos órganos o en ciertos momentos del desarrollo de la planta. Se conocen promotores que aseguran una expresión especifica en los tubérculos de las plantas de patata, tales como el promotor B33 (Liu et al, 1990, Mol. Gen. Genet. 223:401-406) o aquéllos que permiten una expresión específica en las raíces de la remolacha azucarera. Se han descrito adicionalmente secuencias de ADN que permiten una expresión dependiente de la luz y específica de tejidos de secuencias de ADN aguas abajo de los mismos en las hojas (Orozco y Ogren, 1993, Plant. Mol. Biol. 23:1129-1138).
La secuencia de ADN mencionada en el paso de proceso (a)(ii) puede ser básicamente cualquier secuencia de ADN de acuerdo con la invención que comprende una región codificante que codifica una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa. Secuencias de ADN útiles son particularmente secuencias de ADN derivadas de microorganismos, preferiblemente de microorganismos Gram-negativos, específicamente del género Neisseria y particularmente de Neisseria polysaccharea.
De acuerdo con la invención, la secuencia de ADN que codifica una amilosacarasa está enlazada en orientación de sentido al promotor (el extremo 3' del promotor al extremo 5' de la secuencia codificante). Esta secuencia puede modificarse antes o después del enlace a los segmentos de control de la transcripción (promotor y señal de terminación) con objeto de modificar, en caso necesario, las propiedades del polipéptido o su localización como se describe más adelante con mayor detalle.
A fin de expresar la enzima en el citosol de las células vegetales, la secuencia señal que efectúa la secreción tiene que eliminarse. Si la enzima a expresar debe dirigirse a ciertos compartimientos subcelulares tales como cloroplastos, amiloplastos, la mitocondria o la vacuola, la secuencia señal que efectúa la secreción tiene que reemplazarse por una secuencia señal o una secuencia codificante de un péptido de tránsito que asegure el transporte de la proteína expresada al compartimiento respectivo. Tales secuencias son conocidas. Para el transporte a los plástidos, v.g., son útiles los péptidos de tránsito de las proteínas precursoras de la subunidad pequeña de la ribulosa-bisfosfato-carboxilasa (RUBISCO) de las patatas (Wolter et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:846-850) o de la proteína portadora de acilo (ACP). Para el transporte a la vacuola, v.g., puede utilizarse la secuencia señal de patatina (Sonnewald et al., 1991, Plant J. 1:95-106). Las secuencias utilizadas tienen que fusionarse en marco a la secuencia de ADN codificante de la enzima.
La transferencia de la casete de expresión construida en el paso de proceso (a) en células vegetales se lleva a cabo preferiblemente utilizando plásmidos, por ejemplo, plásmidos binarios.
Se prefiere utilizar técnicas que aseguren que la casete de expresión se integra de manera estable en el genoma de la célula vegetal transformada.
El proceso de la invención puede aplicarse básicamente a cualquier especie vegetal. Presentan interés plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las técnicas de transformación han sido ya descritas para diversas especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.
Las secuencias de ADN de la invención permiten modificar plantas de tal modo que las mismas expresen proteínas que tienen la actividad enzimática de una amilosacarasa, permitiendo con ello la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales en las plantas. Dado que los \alpha-1,4-glucanos lineales son idénticos a la amilosa sintetizada en las plantas en términos de su estructura química, es posible por consiguiente producir plantas que sinteticen la amilosa pura y modificar plantas productoras de almidón de tal modo que las mismas sinteticen un almidón que tenga una proporción incrementada de amilosa.
En la mayoría de las plantas, los foto-asimilados formados en el curso de la fotosíntesis se transportan dentro de la planta en forma de azúcares, de modo más específico principalmente en la forma de sacarosa, a los órganos diana respectivos. Dado que el sustrato para la reacción de polimerización de la amilosacarasa es sacarosa, el proceso arriba descrito permite básicamente modificar todas las plantas, tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, con respecto a la expresión de amilosacarasa. Se prefieren plantas de cosecha tales como maíz, arroz, trigo, cebada, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, patatas o mandioca, pero también especies de frutos y hortalizas tales como manzanas, ciruelas, zanahorias o tomates.
La expresión de la actividad de amilosacarasa en las plantas puede, entre otras cosas, utilizarse para cambiar la viscosidad de los extractos obtenidos a partir de las plantas por síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales. En este contexto, es interesante el tomate. Por la expresión de una amilosacarasa en el fruto del tomate se sintetizan \alpha-1,4-glucanos lineales, conduciendo con ello a una viscosidad incrementada de los extractos que se obtienen de estos frutos.
La expresión de amilosacarasa es además particularmente ventajosa en aquellos órganos de las plantas que almacenan grandes cantidades de sacarosa. Tales órganos son, v.g., la raíz de la remolacha azucarera o el tallo de la caña de azúcar. Dado que estas plantas no sintetizan normalmente cantidades apreciables de almidón, los \alpha-1,4-glucanos lineales sintetizados por la amilosacarasa podían ser aislados en forma pura a partir de estas plantas.
El lugar de la biosíntesis de la sacarosa en las células vegetales es el citosol. El lugar de almacenamiento, sin embargo, es la vacuola. Durante el transporte al tejido de almacenamiento de la remolacha azucarera o la patata o durante el transporte al endospermo de las semillas, la sacarosa tiene que pasar por el apoplasto. Por esta razón, los tres compartimientos, es decir, citosol, vacuola y apoplasto pueden ser considerados para la expresión de la amilosacarasa para la síntesis de glucanos lineales.
En las plantas productoras de almidón tales como patatas o maíz, en las cuales la síntesis del almidón y el almacenamiento del almidón tienen lugar normalmente en los amiloplastos, una expresión de la amilosacarasa en el apoplasto, en el citosol o en la vacuola podría conducir a una síntesis adicional de glucanos en estos compartimientos, significando con ello un aumento considerable en el rendimiento.
Dado que las patatas permiten separar el almidón sintetizado en los amiloplastos de los \alpha-1,4-glucanos lineales sintetizados por la amilosacarasa en el apoplasto, en el citosol o en la vacuola durante el aislamiento del almidón, podría utilizarse una sola y misma planta para obtener a la vez almidón y \alpha-1,4-glucanos lineales.
Adicionalmente, se conocen plantas transgénicas de patata y de maíz en las cuales, debido a una inhibición de la ADP-glucosa-pirofosforilasa por un constructo antisentido, la síntesis del almidón en los tubérculos y los granos, respectivamente, se inhibe por completo. En su lugar, v.g., en las patatas se acumulan en los tubérculos azúcares solubles, particularmente sacarosa y glucosa (Müller-Röber et al., 1992, EMBO J. 11: 1229-1238; documento EP-A-0 455 316). Por la expresión de una amilosacarasa en el citosol, la vacuola o el apoplasto de estas plantas, es decir, en compartimientos en los cuales no están presentes enzimas ramificadoras, puede conseguirse la síntesis del almidón que contiene proporciones elevadas de amilosa, es decir, almidón constituido principalmente por \alpha-1,4-glucanos lineales. El mecanismo de la reacción que está catalizada por la amilosacarasa se caracteriza por un residuo glucosa que se transfiere directamente desde la sacarosa a un glucano lineal. En la biosíntesis de glucanos lineales a partir de sacarosa en las plantas, la sacarosa se divide primeramente en glucosa y fructosa que se convierten a su vez en la forma intermedia activada de ADP-glucosa. A partir de la ADP-glucosa, el residuo glucosa es transferido por la enzima almidón-sintasa a un glucano ya existente, liberando con ello ADP. La conversión de la sacarosa en dos moléculas de ADP-glucosa requiere varias reacciones que consumen energía.
Por esta razón, el balance energético de la reacción catalizada por la amilosacarasa en comparación con el balance energético de la síntesis de amilosa a sacarosa en las células vegetales es sustancialmente mejor, conduciendo a un rendimiento incrementado en glucanos sintetizados en las plantas que expresan actividad de amilosacarasa.
Existen muchos vectores de clonación disponibles que contienen una señal de replicación para E. coli y un gen marcador para la selección de células bacterianas transformadas que pueden utilizarse para preparar la introducción de genes extraños en plantas superiores. Ejemplos de tales vectores son pBN322, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC184, etc. La secuencia deseada puede introducirse en el vector en un sitio de restricción apropiado. El plásmido obtenido se utiliza para transformar células de E. coli. Las células de E. coli transformadas se cultivan en un medio apropiado y se cosechan y lisan posteriormente. El plásmido se recupera. Los métodos de análisis utilizados generalmente para caracterizar el ADN plasmídico obtenido son análisis de restricción, electroforesis en gel, reacciones de secuenciación y métodos adicionales conocidos en bioquímica y biología molecular. Después de cada manipulación, el ADN plasmídico puede escindirse y enlazarse a otras secuencias de ADN. Cada secuencia de ADN plasmídico puede clonarse al mismo u otros plásmidos.
Están disponibles muchas técnicas para la introducción de ADN en una célula hospedadora vegetal. Estas técnicas comprenden la transformación de células vegetales con T-ADN utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agentes de transformación, la fusión de protoplastos, inyección, electroporación de ADN, introducción de ADN por el método biobalístico así como otras posibles técnicas. Dependiendo del método de introducción de los genes deseados en las células vegetales, pueden requerirse secuencias de ADN adicionales. Si, v.g., se utiliza el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, al menos la secuencia del borde derecho, pero a menudo la secuencia tanto del borde derecho como del borde izquierdo del T-ADN del plásmido Ti y Ri como área flanqueante tiene que enlazarse a los genes a introducir.
Si se utilizan Agrobacterias para la transformación, el ADN a introducir tiene que clonarse a plásmidos especiales, sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios pueden integrarse por recombinación homóloga en el plásmido Ti o Ri de las Agrobacterias debido a secuencias que son homólogas a secuencias existentes en el T-ADN. Dicho plásmido contiene la región vir necesaria para la transferencia del T-ADN. Los vectores intermedios no son capaces de replicarse en Agrobacterias. El vector intermedio puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens utilizando un plásmido adyuvante (conjugación). Los vectores binarios son capaces de replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterias. Aquéllos contienen un gen marcador de selección y un enlazador o polienlazador flanqueado por las regiones del borde derecho e izquierdo del T-ADN. Aquéllos pueden transformarse directamente en Agrobacterias (Holsters et al., 1978, Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). El Agrobacterium que sirve como célula hospedadora debería contener un plásmido portador de una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del T-ADN a la célula vegetal. Puede estar presente T-ADN adicional. El Agrobacterium así transformado se utiliza para transformar células vegetales.
El uso de T-ADN para la transformación de células vegetales ha sido examinado extensamente y está suficientemente descrito en el documento EP 120516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4:1-46 and An et al; 1985, EMBO J. 4:277-287.
Para la transferencia del ADN a las células vegetales pueden cocultivarse convenientemente explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. A partir del material vegetal infectado (v.g., trozos de hojas, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células vegetales cultivadas en suspensión) pueden regenerarse plantas enteras en un medio apropiado que puede contener antibióticos o biocidas para la selección de las células transformadas. Las plantas así obtenidas pueden investigarse respecto a la presencia del ADN introdu-
cido.
No existe requerimiento específico alguno en cuanto a los plásmidos utilizados para la inyección y electroporación del ADN en células vegetales. Pueden utilizarse plásmidos simples tales como derivados de pUC. No obstante, si se pretende regenerar plantas enteras a partir de las células así transformadas, se requiere la presencia de un marcador seleccionable.
Una vez que el ADN introducido se integra en el genoma de la célula vegetal, aquél permanece por regla general estable en el mismo, y puede encontrarse también en el sucesor de la célula transformada originalmente. Normalmente aquél contiene un marcador de selección que imparte a las células vegetales transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico tal como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o glufosinato, etc. El marcador seleccionado individualmente debería por tanto permitir la selección de células transformadas con respecto a las células que carecen del ADN introducido.
Las células transformadas crecen dentro de la célula normalmente (véase, v.g., McCornick et al., 1986, Plant Cell Reports 5:81-84). Estas plantas pueden cultivarse de la manera usual y pueden reproducirse por cruzamiento con plantas que poseen el mismo material genético transformado u otros materiales genéticos. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.
Deberían cultivarse dos o más generaciones a fin de asegurarse de que las características fenotípicas se retienen de manera estable y se heredan. Adicionalmente, deberían cosecharse semillas a fin de asegurarse de que se han retenido el fenotipo correspondiente u otras características.
Un objeto adicional de la invención son las células vegetales y plantas modificadas resultantes del proceso de la invención arriba mencionado, particularmente células vegetales y plantas que contienen una secuencia de ADN de la invención en combinación con secuencias de ADN que permiten la expresión de la secuencia de ADN de la invención en células vegetales. Dichas células vegetales se caracterizan por la expresión de una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa, dando por ello como resultado la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales en las células o en las plantas. Las células vegetales y plantas transgénicas se caracterizan adicionalmente por el hecho de que contienen una molécula de ADN recombinante integrada de manera estable en su genoma que comprende una casete de expresión, conteniendo dicha casete de expresión una secuencia de ADN que codifica una amilosacarasa.
Los \alpha-1,4-glucanos lineales formados en las células vegetales y plantas transgénicas con la ayuda de la amilosacarasa pueden aislarse a partir de las células vegetales y plantas transgénicas del mismo modo que el almidón que se forma normalmente.
La invención se refiere adicionalmente al uso de las secuencias de ADN de la invención o partes de las mismas para la expresión de un polipéptido que tiene actividad de amilosacarasa, preferiblemente en microorganismos que no tienen actividad alguna de amilosacarasa en sí mismos.
En esta solicitud, los microorganismos deben entenderse como bacterias así como todos los protistas tales como se definen, v.g., en Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1985, páginas 1-2).
Hoy en día, la investigación biotecnológica en gran escala utiliza microorganismos para sintetizar y procesar las sustancias más diversas. Esto ha sido posible por la provisión de una multitud de diversos sistemas para la expresión eficiente de genes procariotas y eucariotas en microorganismos (para una revisión véase, v.g., Methods in Enzymology 153:385-516). Son ampliamente utilizadas, v.g. las cepas de las especies bacterianas Escherichia coli y Bacillus subtilis. Por proporcionar las secuencias de ADN de la invención es ahora posible expresar una proteína que tiene actividad de amilosacarasa en microorganismos para los cuales están disponibles los sistemas de expresión apropiados.
La presente invención se refiere particularmente a un proceso para la producción de microorganismos capaces de sintetizar, sea intracelular o extracelularmente, \alpha-1,4-glucanos lineales, en los cuales una secuencia de ADN de la invención se introduce y se expresa en el microorganismo. Un proceso de este tipo puede comprender ilustrativamente los pasos siguientes:
(a)
producir una casete de expresión que tiene las secuencias parciales siguientes:
(i)
un promotor que es activo en el microorganismo seleccionado y que asegura la transcripción de la secuencia de ADN aguas abajo del mismo;
(ii)
una secuencia de ADN de acuerdo con la invención que codifica una amilosacarasa y está fusionada al promotor en orientación de sentido;
(iii)
una señal de terminación de la transcripción que es funcional en microorganismos;
(b)
transformar un microorganismo apropiado con la casete de expresión construida en el paso (a).
Los vectores de expresión han sido descritos extensamente en la técnica. Además de un gen marcador de selección y un origen de replicación que permite la replicación en el hospedador seleccionado, aquéllos contienen normalmente un promotor bacteriano o vírico y una señal de terminación de la transcripción. Entre el promotor y la señal de terminación existe al menos un sitio de restricción o un polienlazador que permite la inserción de una secuencia de ADN codificante. Como secuencia promotora puede utilizarse la secuencia de ADN que controla normalmente la transcripción del gen correspondiente con tal que la misma sea activa en el organismo seleccionado. Esta secuencia puede reemplazarse por otras secuencias promotoras. Pueden utilizarse promotores que efectúan la expresión constitutiva del gen o promotores inducibles que permiten una regulación selectiva de la expresión del gen aguas abajo de los mismos. Secuencias promotoras bacterianas y víricas que tienen estas propiedades han sido descritas extensamente en la técnica. Promotores que permiten una expresión particularmente fuerte del gen aguas abajo de los mismos, son, v.g., el promotor T7 (Studier et al., 1990, en Methods in Enzymology 185:60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., en Rodríguez R.L. and Chamberlin, M.J., (compiladores), Promoters, Structure and Function; Praeger, Nueva York, 1982, pp. 462-481; DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25), lp_{1}, rac (Boros et al., 1986, Gene 42:97-100) o el promotor ompF. La secuencia de ADN mencionada en el paso de proceso (a)(ii) pueden ser cualquier secuencia de ADN codificante de una proteína que tenga la actividad enzimática de una amilosacarasa. Preferiblemente, se utilizan secuencias de ADN derivadas de microorganismos, particularmente bacterias Gram-negativas, preferiblemente del género Neisseria y de modo particularmente preferido de Neisseria polysaccharea.
La secuencia utilizada puede modificarse antes o después de la integración en el vector de expresión para variar, en caso necesario, las propiedades del polipéptido o su localización, como se describe más adelante con mayor detalle.
En lugar de la secuencia codificante de una amilosacarasa para Neisseria polysaccharea como está contenida en el plásmido pNB2 (DSN 9196) se pueden utilizar secuencias de ADN que puedan derivarse de dicha secuencia por sustitución, inserción o deleción, con tal que no se deteriore la actividad enzimática de la proteína codificada. La transformación de los microorganismos en el paso (b) puede llevarse a cabo usualmente por técnicas estándar, tales como se describen en Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
El microorganismo transformado se cultiva en medios que deben ser apropiados para las necesidades del hospedador individual utilizado. Debería prestarse atención específica al valor de pH, la temperatura, la ventilación, etc.
Otro objeto de la invención son los microorganismos resultantes del proceso arriba descrito, que se caracterizan por contener una secuencia de ADN que codifica una amilosacarasa, formando dicha secuencia parte de una molécula de ADN recombinante. Dicha molécula de ADN recombinante - dependiendo del método de transformación utilizado - puede estar presente en las células sea fuera del genoma o puede estar integrada de manera estable en el genoma de las células del microorganismo utilizado.
La amilosacarasa expresada por Neisseria polysaccharea es una enzima extracelular que sintetiza \alpha-1,4-glucanos lineales fuera de las células sobre la base de sacarosa. Al contrario que en la mayoría de los caminos de síntesis para polisacáridos que tienen lugar en el interior de la célula, no se requieren derivados de glucosa activados ni cofactores. La energía que se requiere para la formación del enlace glucosídico \alpha-1,4 entre los residuos glucosa condensados se obtiene directamente de la hidrólisis del enlace entre las unidades de glucosa y fructosa en la molécula de sacarosa.
Por consiguiente, es posible cultivar microorganismos secretores de amilosacarasa, que se obtuvieron por los pasos de proceso arriba descritos, en un medio que contiene sacarosa, conduciendo la amilosacarasa secretada a una síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de la sacarosa contenida en el medio. Estos glucanos pueden aislarse del medio de cultivo.
Adicionalmente, es posible sintetizar \alpha-1,4-glucanos in vitro con ayuda de una preparación enzimática exenta de células. En este caso, se cultivan microorganismos secretores de amilosacarasa en un medio exento de sacarosa que permita la expresión de la amilosacarasa hasta que se alcanza la fase de crecimiento estacionario. Después de la eliminación de las células del medio de cultivo por centrifugación, la enzima secretada puede obtenerse a partir del sobrenadante. La enzima puede añadirse luego a soluciones que contienen sacarosa para sintetizar \alpha-1,4-glucanos lineales. En comparación con la síntesis de los \alpha-1,4-glucanos lineales directamente en un medio de cultivo que contiene sacarosa, este método es ventajoso en el sentido de que las condiciones de reacción pueden controlarse mejor y que los productos de reacción son sustancialmente más puros y pueden purificarse ulteriormente con mayor facilidad.
La enzima puede purificarse a partir del medio de cultivo por técnicas de purificación convencionales tales como precipitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, filtración en gel, cromatografía HPLC en fase inversa, etc.
Adicionalmente, es posible expresar un polipéptido por modificación de la secuencia de ADN insertada en el vector de expresión que conduce a un polipéptido que puede ser aislado más fácilmente del medio de cultivo debido a ciertas propiedades. Es posible expresar la enzima como una proteína de fusión junto con otra secuencia de polipéptido cuyas propiedades de fijación específica permiten el aislamiento de la proteína de fusión por cromatografía de afinidad.
Técnicas conocidas son, v.g., la expresión como proteína de fusión junto con glutatión-S-transferasa y purificación subsiguiente por cromatografía de afinidad en una columna de glutatión, haciendo uso de la afinidad de la glutatión-S-transferasa al glutatión (Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40). Otra técnica conocida es la expresión como proteína de fusión junto con la proteína de fijación de maltosa (MBP) y purificación subsiguiente en una columna de amilosa (Guan et al., 1988, Gene 67:21-30; Maina et al., 1988, Gene 74:365-373).
Además de la posibilidad de añadir directamente la enzima purificada a una solución que contiene sacarosa a fin de sintetizar \alpha-1,4-glucanos lineales, existe la alternativa de inmovilizar la enzima en un material vehículo. Dicha inmovilización ofrece la ventaja de que la enzima, como catalizador de síntesis, puede recuperarse fácilmente y puede utilizarse varias veces. Dado que la purificación de enzimas es usualmente muy intensiva en tiempo y costes, una inmovilización y reutilización de la enzima contribuye a una reducción considerable de los costes. Otra ventaja es el alto grado de pureza de los productos de reacción que, entre otras cosas, es debido al hecho de que las condiciones de reacción pueden controlarse mejor cuando se utilizan enzimas inmovilizadas. Los glucanos lineales insolubles obtenidos como productos de reacción pueden purificarse luego adicionalmente con facilidad.
Existen muchos materiales vehículo disponibles para la inmovilización de proteínas que pueden acoplarse al material vehículo sea por enlaces covalentes o no covalentes (para una revisión véase: Methods in Enzymology Vol. 135, 136 y 137). Materiales vehículo extensamente utilizados son v.g., agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílice o nailon.
Análogamente a la enzima purificada, pueden inmovilizarse también microorganismos que expresan el polipéptido deseado o que secretan un metabolito específico. La inmovilización se consigue generalmente por inclusión de las células en un material apropiado tal como, v.g., alginato, poliacrilamida, gelatina, celulosa o quitosano. Sin embargo, es posible también adsorber o enlazar covalentemente las células a un material vehículo (Brodelius y Mosbach, en Methods in Enzymology, Vol. 135:173-175). Una ventaja de la inmovilización de células es que pueden alcanzarse densidades de células considerablemente mayores que cultivándolas en un cultivo líquido, dando como resultado una mayor productividad. Asimismo, se reducen los costes para agitación y ventilación del cultivo así como para las medidas con objeto de mantener la esterilidad. Un aspecto importante es que la inmovilización permite una producción continua de tal manera que pueden evitarse las fases largas no productivas que ocurren usualmente en los procesos de fermentación, o al menos pueden reducirse considerablemente.
Al igual que en los microorganismos, las secuencias de ADN de la invención pueden utilizarse también para la expresión de una actividad de amilosacarasa en hongos, en particular en levaduras, v.g., Saccharomyces cerevisiae. Se han descrito vectores para la expresión de genes heterólogos en levaduras (v.g., Bitter et al., 1987, Methods in Enzymology 153:516-544). Estos vectores, además de un gen marcador de selección y un origen de replicación para la propagación en bacterias, contienen al menos un gen marcador de selección adicional que permite la identificación de células de levadura transformadas, una secuencia de ADN que permite la replicación en levaduras y un polienlazador para la inserción de la casete de expresión deseada. La casete de expresión se construye a partir de un promotor, la secuencia de ADN a expresar y una secuencia de ADN que permite la terminación de la transcripción y la poliadenilación del transcrito. Promotores y señales de terminación de la transcripción de Saccharomyces han sido también descritos y están disponibles. Un vector de expresión puede introducirse en células de levadura por transformación de acuerdo con técnicas estándar (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Las células que contienen el vector se seleccionan y se propagan en medios de selección apropiados. Las levaduras permiten adicionalmente integrar la casete de expresión por recombinación homóloga en el genoma de una célula utilizando un vector apropiado, lo que conduce a una herencia estable de la
característica.
Cepas de levadura que expresan amilosacarasa pueden utilizarse por analogía a los microorganismos a fin de obtener una amilosacarasa secretada. Métodos de cultivo para levaduras han sido descritos suficientemente (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). La inmovilización de las levaduras es también posible y se utiliza ya en la producción comercial de etanol (Nagashima et al., en Methods in Enzymology, Vol. 136:394-405; Nojima and Yamada, en Methods in Enzymology, Vol. 136:380-394).
Sin embargo, el uso de levaduras que secretan amilosacarasa para la síntesis de 1,4-glucanos lineales en medios que contienen sacarosa no es fácilmente posible dado que las levaduras secretan una invertasa que hidroliza la sacarosa extracelular. Las levaduras importan las hexosas resultantes por la vía de un transportador de hexosa. Gozalbo and Hohmann (1990, Current Genetics 17, 77-79), no obstante, describen una cepa de levadura que transporta un gen suc2 defectuoso y que por tanto no puede secretar invertasa. Asimismo, estas células de levadura no contienen un sistema de transporte para importar sacarosa en las células. Si se modifica una cepa de este tipo con la secuencia de ADN de la invención de tal modo que la misma secrete una amilosacarasa en el medio de cultivo, se sintetizarán 1,4-glucanos lineales por la amilosacarasa si el medio de cultivo contiene sacarosa. La fructosa que se forma como producto de reacción puede ser importada subsiguientemente por las levaduras.
Por consiguiente, la presente invención se refiere también a un proceso para la producción de células fúngicas capaces de sintetizar, sea intracelular o extracelularmente, 1,4-glucanos lineales en el cual una secuencia de ADN de acuerdo con la invención se introduce en las células fúngicas y se expresa. Un proceso de este tipo puede comprender ilustrativamente los pasos siguientes:
(a)
producir una casete de expresión que tiene las secuencias parciales siguientes:
(i)
un promotor que es activo en células del hongo seleccionado y que asegura la transcripción de la secuencia de ADN aguas abajo del mismo;
(ii)
una secuencia de ADN de acuerdo con la invención que codifica una amilosacarasa y está fusionada a dicho promotor en orientación de sentido;
(iii)
una señal de terminación de la transcripción que es funcional en dichas células fúngicas; y
(b)
transformar células fúngicas con la casete de expresión construida en el paso (a).
Otro aspecto de la presente invención es la posibilidad de producir de una manera económica jarabe de fructosa puro por utilización de las secuencias de ADN de la invención. Métodos convencionales para la producción de fructosa contemplan o bien la hidrólisis enzimática de la sacarosa utilizando una invertasa o la degradación del almidón en unidades de glucosa, a menudo por acidólisis, y conversión enzimática subsiguiente de la glucosa en fructosa por la acción de la glucosa-isomerasa. Ambos métodos dan como resultado mezclas de glucosa y fructosa. Los dos componentes tienen que separarse uno de otro por procesos cromatográficos.
La producción de fructosa pura o jarabe de fructosa puro utilizando una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa se lleva a cabo preferiblemente en un sistema exento de células utilizando la enzima purificada. La última puede inmovilizarse sobre un material vehículo apropiado o puede estar presente en forma soluble. La presencia de sacarosa da como resultado una síntesis de glucanos lineales y la liberación de fructosa. La separación del sustrato de los productos de reacción o la separación de los dos productos de reacción puede realizarse mediante, v.g., la utilización de membranas que permiten la permeación de fructosa pero no la de sacarosa o glucanos. Si la fructosa se retira continuamente por la vía de una membrana de este tipo, la sacarosa se convierte más o menos completamente en fructosa y glucanos lineales.
Asimismo, la amilosacarasa puede inmovilizarse preferiblemente sobre un material vehículo localizado entre dos membranas, una de las cuales permite la permeación de fructosa pero no la de sacarosa o glucanos en tanto que la otra permite la permeación de sacarosa pero no la de glucanos. El sustrato se suministra a través de la membrana que permite la permeación de sacarosa. Los glucanos sintetizados permanecen en el espacio entre las dos membranas y la fructosa liberada puede retirarse continuamente del equilibrio de reacción a través de la membrana que permite únicamente la permeación de fructosa. Una disposición de este tipo permite una separación eficiente de los productos de reacción y por tanto, entre otras cosas, la producción de fructosa pura.
El uso de amilosacarasas para la producción de fructosa pura ofrece la ventaja de que puede utilizarse como materia prima el sustrato sacarosa comparativamente económico y, adicionalmente, que la fructosa puede aislarse de la mezcla de reacción de una manera simple sin procesos cromatográficos.
La invención se refiere también por tanto al uso de proteínas que tienen la actividad enzimática de amilo-sacarasa para la producción de fructosa.
Una posibilidad adicional del uso de proteínas que tienen actividad de amilosacarasa consiste en utilizar las mismas para la producción de ciclodextrinas. Las ciclodextrinas son producidas por la degradación del almidón por la enzima ciclodextrin-transglicosilasa (EC 2.4.1.19) que se obtiene a partir de la bacteria Bacillus macerans. Debido a la ramificación del almidón, sólo aproximadamente 40% de las unidades glucosa pueden convertirse en ciclodextrinas utilizando este sistema. Proporcionando proteínas sustancialmente puras que tienen actividad de amilosacarasa, es posible sintetizar ciclodextrinas sobre la base de sacarosa bajo la acción simultánea de amilosacarasa y ciclodextrina-transglicosilasa, catalizando la amilosacarasa la síntesis de glucanos lineales a partir de sacarosa y catalizando la ciclodextrina-transglicosilasa la conversión de estos glucanos en ciclodextrinas.
El plásmido pNB2 de la invención fue depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Braunschweig, Alemania, en fecha 6 de mayo de 1994 de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest bajo el depósito nº. DSM 9196.
Abreviaturas utilizadas
IPTG isopropil \beta-D-tiogalacto-piranosido
Medios y soluciones utilizados
1
Descripción de las figuras
Fig. 1 muestra el plásmido pNB2 (DSM 9196)
La línea delgada corresponde a la secuencia del vector de clonación pBluescript SK(-). La línea gruesa representa la inserción de aprox. 4,2 kb de longitud de ADN genómico de Neisseria polysaccharea. La región codificante para amilosacarasa se representa en forma de una flecha bajo la inserción.
Encima de la inserción se representa la región secuenciada. Todos los valores numéricos se refieren a esta región de 2883 pb de longitud.
Fig. 2 muestra la expresión de una actividad de amilosacarasa en células de E. coli transformadas sometiéndolas a vapor de yodo.
Células de E. coli que se habían transformado con el plásmido pBluescript II SK (A) y células de E. coli que se habían transformado con el plásmido pNB2 (B) se extendieron sobre placas YT (1,5% agar; 100 \mug/ml ampicilina; 5% sacarosa; IPTG 0,2 mM) y se incubaron durante una noche a 37ºC. A continuación, las placas se sometieron a vapor de yodo. Las colonias de las células que se transformaron con el plásmido pNB2 exhibieron una corona azul diferenciada.
Los ejemplos sirven para ilustrar la invención.
Ejemplo 1
Aislamiento de una secuencia de ADN genómico que codifica una actividad de amilosacarasa de Neisseria polysaccharea
Para el aislamiento de una secuencia de ADN codificante de una actividad de amilosacarasa de Neisseria polysaccharea se estableció primeramente una genoteca de ADN genómico. Se cultivaron células de Neisseria polysaccharea sobre "agar sangre Columbia" (Difco) durante dos días a 37ºC. Las colonias resultantes se cosecharon de las placas. Se aisló ADN genómico de acuerdo con el método de Ausubel et al. (en: Current Protocols in Molecular Biology (1987), J. Wiley & Sons, NY) y se procesó. El ADN así obtenido se digirió parcialmente con la endonucleasa de restricción Sau3A. Los fragmentos de ADN resultantes se ligaron al vector pBluescript SK(-) digerido con BamHI. Los productos de ligación se transformaron en células de E. coli XL1-Blue. Para su selección, las células se extendieron sobre placas YT con ampicilina como marcador de selección. El medio de selección contenía adicionalmente 5% de sacarosa e IPTG 1 mM. Después de incubación durante una noche a 37ºC, las colonias bacterianas que se habían formado se tiñeron con yodo poniendo yodo cristalino en la tapa de una cápsula petri y poniendo las cápsulas de cultivo con las colonias de bacterias durante 10 min invertida cada una sobre la cápsula petri. El yodo que se evaporaba a la temperatura ambiente teñía algunas regiones de las cápsulas de cultivo que contenían glucanos semejantes a amilasa de azul. A partir de las colonias de bacterias que exhibían una corona azul se aisló ADN plasmídico de acuerdo con el método de Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523). Dicho ADN se retransformó en células SURE de E. coli. Las células transformadas se extendieron sobre placas YT con ampicilina como marcador de selección. Se aislaron las colonias positivas.
Ejemplo 2
Análisis de la secuencia de la inserción de ADN genómico del plásmido pNB2
A partir de un clon de E. coli obtenido de acuerdo con el ejemplo práctico 1 se aisló un plásmido recombinante. Los análisis de restricción demostraron que dicho plásmido era un producto de ligación constituido por dos moléculas vectoras y un fragmento genómico de aprox. 4,2 kb de longitud. El plásmido se digirió con la endonucleasa de restricción PstI y se aisló el fragmento genómico (GeneClean, Bio101). El fragmento así obtenido se ligó en un vector pBluescript II SK linealizado con PstI, dando como resultado una duplicación de los sitios de restricción PstI y SmaI. El producto de ligación se transformó en células de E. coli y las últimas se extendieron sobre placas de ampicilina para selección. Se aislaron los clones positivos. A partir de uno de estos clones se aisló el plásmido pNB2 (Fig. 1) y se determinó parte de la secuencia de su inserción de ADN genómico por técnicas estándar utilizando el método didesoxi (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467). La inserción entera tiene una longitud aproximada de 4,2 kpb.
Ejemplo 3
Expresión de una actividad de amilosacarasa extracelular en células de E. coli transformadas (a) Detección de una actividad de amilosacarasa durante el crecimiento en placas YT
Para la expresión de una actividad de amilosacarasa extracelular, se transformaron células de E. coli con el vector pNB2 de acuerdo con técnicas estándar. Una colonia de la cepa transformada se incubó en placas YT (1,5% agar; 100 \mug/ml ampicilina; 5% sacarosa; IPTG 0,2 mM) durante una noche a 37ºC. La actividad de amilosacarasa se detectó sometiendo las colonias a vapor de yodo (Fig. 2). Las colonias que expresan amilosacarasa exhiben una corona azul. La actividad de amilosacarasa pudo observarse aun cuando no está presente cantidad alguna de IPTG, debido probablemente a la actividad de los promotores de amilosacarasa endógenos.
(b) Detección de una actividad de amilosacarasa durante el crecimiento en medio YT
Para la expresión de una actividad de amilosacarasa extracelular, se transformaron E. coli con el vector pNB2 de acuerdo con técnicas estándar. Se inoculó medio YT (100 \mug/ml de ampicilina; 5% sacarosa) con una colonia de la cepa transformada. Las células se incubaron durante una noche a 37ºC bajo agitación constante (mezclador rotativo; 150-200 rpm). Los productos de la reacción catalizada por amilosacarasa se detectaron por adición de solución de Lugol al sobrenadante de cultivo, conduciendo a la tinción en azul.
(c) Detección de la actividad de amilosacarasa en los sobrenadantes de cultivo de células de E. coli transformadas que se cultivaron sin sacarosa
Para la expresión de una actividad de amilosacarasa extracelular, se transformaron células de E. coli con el vector pNB2 de acuerdo con técnicas estándar. Se inoculó medio YT (100 \mug/ml de ampicilina) con una colonia de la cepa transformada. Las células se incubaron durante una noche a 37ºC bajo agitación constante (mezclador rotativo; 150-200 rpm). A continuación se separaron las células por centrifugación (30 min, 4ºC, 5500 ppm, rotor Beckman JA 10). El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum (Schleicher & Schuell) en condiciones estériles).
La detección de una actividad de amilosacarasa se efectuó por
(i)
incubación del sobrenadante en una placa de agar que contenía sacarosa. Se pusieron 40 \mul del sobrenadante en un todo punzonado en una placa de agar (5% de sacarosa en tampón de citrato de sodio 50 mM de pH 6,5) y se incubaron al menos durante una hora a 37ºC. Los productos de la reacción catalizada por amilosacarasa se detectaron por tinción con vapor de yodo. La presencia de los productos de reacción produce una mancha azul;
(ii)
o por separación electroforética en gel de las proteínas del sobrenadante en un gel nativo y detección de los productos de reacción en el gel después de incubación con sacarosa. Se separaron 40-80 \mul del sobrenadante por electroforesis en gel sobre un gel nativo de poliacrilamida al 8% (Tris 0,375 M, pH 8,8) a un voltaje de 100 V). El gel se equilibró luego dos veces 15 min con aprox. 100 ml de tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 6,5) y se incubó durante una noche a 37ºC en tampón de citrato de sodio, de pH 6,5/5% sacarosa. A fin de hacer visible el producto de reacción de la reacción catalizada por amilosacarasa, el gel se lavó con solución de Lugol. Las bandas que tenían actividad de amilosacarasa se tiñeron en azul.
Ejemplo 4
Producción in vitro de glucanos con amilosacarasa parcialmente purificada
Para la expresión de una actividad de amilosacarasa extracelular, se transformaron células de E. coli con el vector pNB2 de acuerdo con técnicas estándar. Se inoculó medio YT (100 \mug/ml de ampicilina) con una colonia de la cepa transformada. Las células se incubaron durante una noche a 37ºC con agitación constante (mezclador rotativo; 150-200 rpm). A continuación se retiraron las células por centrifugación (30 min, 4ºC, 5500 rpm, rotor Beckman JA10). El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum (Schleicher & Schuell) en condiciones estériles.
El sobrenadante se concentró luego 200 veces utilizando una cámara Amicon (membrana YM30 que tenía un tamaño de exclusión de 30 kDa (compañía Amicon) a presión (p = 3 bar). El sobrenadante concentrado se añadió a 50 ml de una solución de sacarosa (5% de sacarosa en tampón de citrato de sodio 50 mM de pH 6,5). La solución entera se incubó a 37ºC. Se formaron polisacáridos blanquecinos insolubles.
Ejemplo 5
Caracterización de los productos de reacción sintetizados por amilosacarasa del Ejemplo 4
Los productos de reacción insolubles descritos en el Ejemplo 4 son solubles en NaOH 1 M. Los productos de reacción se caracterizaron por medida del máximo de absorción. Aprox. 100 mg de los productos de reacción aislados (peso húmedo) se disolvieron en 200 \mul de NaOH 1 M y se diluyeron con H_{2}O 1:10. Se añadieron 900 \mul de NaOH 0,1 M y 1 \mul de solución de Lugol a 100 \mul de esta dilución. El espectro de absorción se midió entre 400 y 700 nm. El máximo es 605 nm (máximo de absorción de la amilosa: aprox. 614 nm).
El análisis HPLC de la mezcla de reacción del Ejemplo 4 en una columna CARBOPAC PA1 (DIONEX) demostró que además de los productos insolubles se formaban también productos solubles. Estos productos solubles son polisacáridos de cadena corta. La longitud de cadena estaba comprendida entre aprox. 5 y aprox. 60 unidades de glucosa. En menor proporción, sin embargo, pudieron detectarse incluso moléculas más cortas o más largas.
Con los métodos analíticos disponibles, no fue posible detectar ramificación en los productos de síntesis.
Ejemplo 6
Expresión de una actividad de amilosacarasa intracelular en células de E. coli transformadas
Utilizando una reacción en cadena de polimerasa (PCR) se amplificó un fragmento a partir del plásmido pNB2 que comprende los nucleótidos 981 a 2871 de la secuencia representada en Seq ID No. 1. Se utilizaron como iniciadores los nucleótidos siguientes:
TPN2 5' - CTC ACC ATG GGC ATC TTG GAC ATC - 3' (Seq ID No. 3)
TPC1 5' - CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G - 3' (Seq ID No. 4)
El fragmento resultante contiene la región codificante para amilosacarasa excepto los nucleótidos codificantes de los 16 aminoácidos N-terminales. Estos aminoácidos comprenden las secuencias que son necesarias para la secreción de la enzima por la célula. Adicionalmente, este fragmento PCR contiene 88 pb de la región 3' no traducida. Por la vía de los iniciadores utilizados se introdujeron sitios de restricción NcoI en ambos extremos del fragmento.
Después de digestión con la endonucleasa de restricción NcoI, el fragmento resultante se ligó con el vector de expresión pMex 7 digerido con NcoI. Los productos de ligación se transformaron en células de E. coli y se seleccionaron los clones transformados. Los clones positivos se incubaron durante una noche a 37ºC sobre placas YT (1,5% agar; 100 \mug/ml ampicilina; 5% sacarosa; IPTG 0,2 mM). Después de someter las placas a vapor de yodo, no pudo observarse tinción azul alguna en el área que rodeaba las colonias bacterianas, pero pudo detectarse la producción intracelular de glucógeno (mancha parda de las células transformadas en contraste con la ausencia de mancha en las células XL1-Blue no transformadas). Con objeto de examinar la funcionalidad de la proteína, las células transformadas cultivadas en medio YT se disgregaron por ultrasonidos y el extracto bruto obtenido se pipeteó sobre placas de agar que contenían sacarosa. Después de someter las placas a vapor de yodo pudo observarse una mancha azul.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Ihnestrasse 63
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Berlin
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: DE
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 14195
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: +49 30 8300070
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: +49 30 83000736
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias de ADN codificantes de enzimas capaces de facilitar la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales en plantas, hongos y microorganismos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS/DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: DE P 44 17 879.4
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-MAYO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: DE P 44 47 388.5
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-DICIEMBRE-1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2883 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Neisseria polysaccharea 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
GENOTECA: genoteca genómica en pBluescript II SK
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: pNB2
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 939..2780
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
2
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 614 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
6
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Neisseria polysaccharea 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCACCATGG GCATCTTGGA CATC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Neisseria polysaccharea 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCCATGGT TCAGACGGCA TTTGG 
\hfill
25

Claims (34)

1. Una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa, seleccionada del grupo constituido por
(a)
secuencias de ADN que codifican una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la región codificante que codifica una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea tal como está contenida en la inserción de ADN del plásmido pNB2 (DSM 9196);
(b)
la secuencia de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la región codificante que codifica una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea tal como está contenida en la inserción de ADN del plásmido pNB2 (DSM 9196);
(c)
secuencias de ADN que se hibridan a cualquiera de las secuencias de (a) o (b);
(d)
secuencias de ADN que son idénticas al menos en un 40% a la secuencia de ADN que se define en (b); y
(e)
secuencias de ADN que están degeneradas debido al código genético en comparación con las secuencias mencionadas en (a), (b), (c) o (d).
2. La secuencia de ADN de la reivindicación 1(d) en la cual la identidad de secuencia es al menos 60%.
3. La secuencia de ADN de la reivindicación 1(d) en la cual la identidad de secuencia es al menos 80%.
4. La secuencia de ADN de la reivindicación 1(d) en la cual la identidad de secuencia es al menos 95%.
5. La secuencia de ADN de la reivindicación 1(c) en la cual las condiciones de hibridación son condiciones de hibridación rigurosas.
6. Una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. La molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, en la cual la secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa está enlazada con secuencias de ADN que permiten la transcripción en células procariotas o eucariotas.
8. El plásmido pNB2, depositado como DSM 9196.
9. Un microorganismo, que contiene una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
10. Un hongo, que contiene una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
11. Un proceso para la producción de una proteína que tiene actividad de amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa, que comprende cultivar un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 9 o un hongo de acuerdo con la reivindicación 10 en un medio de cultivo adecuado.
12. Una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa y que es codificada por una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
13. Un proceso para la producción de plantas capaces de sintetizar \alpha-1,4-glucanos lineales, caracterizado porque una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 enlazada a secuencias de ADN que aseguran la expresión de dicha secuencia de ADN se introduce en células vegetales y se regeneran plantas enteras a partir de dichas células vegetales.
14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende los pasos de proceso siguientes:
(a)
producir una casete de expresión que tiene las secuencias parciales siguientes:
(i)
un promotor que es activo en plantas y que asegura la formación de un RNA en el tejido diana o las células diana respectivos;
\newpage
(ii)
al menos una secuencia de ADN como se indica en la reivindicación 13 que codifica una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa y que está fusionada al promotor en orientación de sentido;
(iii)
una señal que es funcional en plantas para la terminación de la transcripción y poliadenilación de una molécula de RNA;
(b)
transferir la casete de expresión en células vegetales; y
(c)
regenerar plantas enteras intactas a partir de las células vegetales transformadas.
15. Un proceso para la producción de microorganismos capaces de sintetizar \alpha-1,4-glucanos lineales, en el cual una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 se introduce en el microorganismo y se expresa.
16. El proceso de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende los pasos de proceso siguientes:
(a)
producir una casete de expresión que tiene las secuencias parciales siguientes:
(i)
un promotor que es activo en el microorganismo seleccionado y que asegura la transcripción de la secuencia de ADN aguas abajo del mismo;
(ii)
una secuencia de ADN que codifica una amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa y que está fusionada al promotor en orientación de sentido;
(iii)
una señal de terminación de la transcripción que es funcional en microorganismos; y
(b)
transformar un microorganismo apropiado con la casete de expresión construida en el paso (a).
17. Un proceso para la producción de células fúngicas capaces de sintetizar \alpha-1,4-glucanos lineales en el cual una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 se introduce en células fúngicas y se expresa.
18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende los pasos siguientes:
(a)
producir una casete de expresión que tiene las secuencias parciales siguientes:
(i)
un promotor que es activo en células del hongo seleccionado y que asegura la transcripción de la secuencia de ADN aguas abajo del mismo;
(ii)
una secuencia de ADN que codifica una amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa y que está fusionada a dicho promotor en orientación de sentido;
(iii)
una señal de terminación de la transcripción que es funcional en dichas células fúngicas; y
(b)
transformar células fúngicas con la casete de expresión construida en el paso (a).
19. Células vegetales que contienen una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en combinación con secuencias de ADN que permiten la expresión de la secuencia de ADN en células vegetales.
20. Una planta que comprende células vegetales de acuerdo con la reivindicación 19.
21. La planta de acuerdo con la reivindicación 20 que es una planta de cosecha.
22. La planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 que es una planta de maíz, arroz, trigo, cebada, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, tomate o patata.
23. Un proceso para la producción de \alpha-1,4-glucanos lineales que comprende los pasos de cultivar el microorganismo de la reivindicación 9 o un hongo de la reivindicación 10 en un medio de cultivo que comprende sacarosa y recuperar los glucanos producidos a partir del cultivo.
24. Un proceso para la producción in vitro de \alpha-1,4-glucanos lineales, que comprende los pasos de poner en contacto la proteína de la reivindicación 12 con una solución que contiene sacarosa y recuperar los \alpha-1,4-glucanos producidos de la solución.
25. Un proceso para la producción de fructosa que comprende los pasos de poner en contacto la proteína de la reivindicación 12 con una solución que contiene sacarosa y recuperar la fructosa producida a partir de la solución.
26. El proceso de la reivindicación 24 ó 25, en el cual la proteína está inmovilizada.
27. Un proceso para la producción de ciclodextrina que comprende los pasos de poner en contacto una solución que contiene sacarosa con la proteína de la reivindicación 12 y una ciclodextrina-transglicosilasa.
28. Uso de una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de una molécula sonda derivada de la misma para el aislamiento de secuencias homólogas de ADN o RNA.
29. Uso de proteínas de acuerdo con la reivindicación 12 para la producción de \alpha-1,4-glucanos lineales.
30. Uso de proteínas de acuerdo con la reivindicación 12 para la producción de fructosa.
31. Un proceso para la producción de \alpha-1,4-glucanos lineales, que comprende los pasos del proceso de la reivindicación 13 ó 14 y que comprende adicionalmente el paso de aislar los \alpha-1,4-glucanos lineales sintetizados en las plantas a partir de las plantas.
32. El proceso de la reivindicación 31, en el cual la casete de expresión contiene una secuencia que codifica un péptido de tránsito que asegura el transporte de la proteína amilosacarasa a la vacuola o al apoplasto.
33. El proceso de la reivindicación 31, en el cual la secuencia de ADN como se indica en (ii) que codifica una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa que cataliza la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales a partir de sacarosa no contiene la secuencia señal que efectúa la secreción en el apoplasto.
34. El proceso de la reivindicación 31, en el cual el promotor definido en (i) asegura la expresión de amilosacarasa en órganos de la planta que almacenan sacarosa.
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