MXPA01003625A - Moleculas de acido nucleico que codifican una enzima de ramificacion de bacterias del genero neisseria, y un metodo para producir alfa-1,4-glucanos alfa-1,6-ramificados - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a moléculas deácido nucleico que codifican una enzima de ramificaci6n de una bacteria del género Neisseria, a vectores, células huésped, células vegetales y plantas que contienen tales moléculas deácido nucleico, asícomo también a almidón que puede obtenerse de dichas plantas. La invención también se refiere a un método in vitro para producir alfa-1,4-glucanos (alfa-1,6-ramificados en base a sacarosa y una combinación de enzima comprendida de una amilosucrasa y de una enzima de ramificación. Además, la invención se refiere a los alfa-1,4-glucanos (alfa-1,6-ramificados que pueden obtenerse utilizando el método.

Description

MOL ÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN UNA ENZIMA DE RAMIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL GENERO NEISSERIA, Y UN MÉTODO PARA PRODUCIR a-1 ,4-GLUCANOS a-1 ,6-RAMIFICADOS La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una enzima de ramificación de bacterias del género Neisseria, vectores, células huésped, células vegetales y plantas que contienen tales moléculas de ácido nucleico así como almidón obtenible de las plantas descritas. Además, la presente invención se refiere a métodos in vitro para la producción de a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados en la base de sacarosa y una combinación de enzimas de una amilosucrasa y una enzima de ramificación. Además, la invención se refiere a glucanos que se obtienen por el método descrito. En muchos aspectos, -1 ,4-glucanos -1 ,6-ramificados son de enorme interés ya que son adecuados, por ejemplo, en cuanto a la producción de productos en la industria cosmética y farmacéutica. Pueden utilizarse, por ejemplo, como aglutinante para tabletas, como substancias portadoras para agentes farmacéuticos, como material de empaque, como sustancia portadora para aditivos en polvo, como aditivo absorbedor de UV en crema solar y como sustancia portadora de saborizantes y esencias. En plantas, a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados pueden encontrarse principalmente como amilopectina, un componente de almidón. En animales y en bacterias, los glucanos ocurren principalmente en forma de glicógeno. El almidón de polisacárido se forma de bloques de construcción químicamente uniformes, es decir, las moléculas de glucosa, sin embargo, es una mezcla compleja de diferentes formas de moléculas que difieren con respecto al grado de polimerización y ramificación y que, de esta manera, difieren fuertemente en sus propiedades físico-químicas. Tiene que diferenciarse entre almidón de amilosa, que es un polímero esencialmente no ramificado de a-1 ,4-unidades de glucosa glicosidicamente enlazadas, y el almidón de amilopectina, que es un polímero ramificado en el cual las ramificaciones se forman debido a la presencia de a-1 ,6-enlaces glicosídicos. De acuerdo a lo libros de texto (Voet y Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990), las a-1 , 6-ramificaciones ocurren después de cada 24 a 30 residuos de glucosa en promedio, que corresponde a un grado de ramificación de aproximadamente 3% a 4%. Las indicaciones en cuanto al grado de ramificación varían y dependen del origen del almidón respectivo (por ejemplo, especies vegetales, variedad vegetal). En las plantas que se utilizan típicamente para la producción industrial de almidón, la porción de amilosa en la porción total de almidón varía entre 10% y 25%. Varios planteamientos para la producción de a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados con diferentes grados de ramificación ya se han descrito, con estos planteamientos comprendiendo el uso de plantas (transgénicas). La expresión heteróloga de una sintasa de glicógeno bacterial en plantas de papa, por ejemplo, conduce a una ligera reducción del contenido de amilosa, a un incremento en el grado de ramificación y a una modificación del patrón de ramificación de la amilopectina cuando se compara con plantas tipo silvestre (Shewmaker et al., Plant. Physiol. 1 04 (1994), 1 159-1 166). Además, se observó que la expresión heteróloga de la enzima de ramificación de E. coli (glgB) en mutantes de papa libres de amilosa (amf) (Jacobsen ef al., Euphytuca 44 (1989), 43-48) conduce a moléculas de amilopectina que tienen 25% más de puntos de ramificación (Kortstee et al., Plant J 10 (1996), 83-90) que el control (amf). Para aislar los glucanos con diferentes grados de ramificación, que se producen en plantas transgénicas, es necesario llevar a cabo etapas de purificación adicionales con objeto de remover, por ejemplo, el componente de amilosa. Estas etapas de purificación son laboriosas y, por lo tanto, consumen tiempo y de costo intensivo. Además, no es posible lograr un grado de ramificación particular por medio de estos planteamientos. Además, debido a las condiciones experimentales variables (factores ambientales, ubicación), tales métodos in vivo varían considerablemente con respecto a la calidad del producto. El glicógeno tiene un grado de ramificación más elevado que la amilipectina. Este polisacárido, también, contiene a-1 ,4-glucanos a-1 , 6-ramificados. El glicógeno también difiere del almidón en la longitud promedio de las cadenas laterales en el grado de polimerización. De acuerdo a los libros de texto (Voet y Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1 990), el glicógeno contiene, en promedio, un a-1 ,6-punto de ramificación después de cada 8 a 12 residuos de glucosa. Este corresponde a un grado de ramificación de aproximadamente 8% a 12%. Existen indicaciones variables en cuanto al peso molecular de glicógeno, que varían de 1 millón a más de 1000 millones (D. J. Manners in: Advances in Carbohydrate Chemistry, Carbohydr. Res. 261 (1 994), 79-89).

Estas indicaciones, también, dependen fuertemente del organismo respectivo de origen, su estado de nutrición y la clase de aislamiento del glicógeno. El glicógeno usualmente se recupera de mejillones (por ejemplo, Mytillus edulis), de músculos o hígado de mamífero (por ejemplo, conejo, rata) (Bell ef al., Biochem. J. 28 (1 934), 882; Bueding y Orell, J. Biol. Chem. 236 (1961 ), 2854). Esto convierte a la producción, en una escala industrial, muy consumidora de tiempo y de costo intensivo. Los a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados que ocurren naturalmente descritos, almidón y glicógeno, son muy diferentes dependiendo de su contenido de ramificaciones 1 ,6-glicosídicas. Esto permanece verdadero, entre otras, con respecto a la solubilidad, transparencia, hidrólisis enzimática, reología, formación de gel y propiedades de retrogradación. Para muchas aplicaciones industriales, tales variaciones en las propiedades, sin embargo, no siempre pueden tolerarse. En planteamientos in vitro son una alternativa para la recuperación de a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados de plantas u organismos animales. En comparación a los métodos in vivo, los métodos in vitro generalmente son mejores de controlar y son reproducibles a un mayor grado ya que las condiciones de reacción in vitro pueden ajustarse exactamente en comparación con las condiciones en un organismo vivo. Esto usualmente permite la producción de productos invariables con un alto grado de uniformidad y pureza y, de esta manera, de calidad elevada, que es muy importante para cualquier aplicación industrial. La preparación de productos de una calidad fija conduce a una reducción de costos ya que los parámetros procesales que son necesarios para la preparación no tienen que perfeccionarse para cada preparación establecida. Otra ventaja de ciertos métodos in vitro es el hecho de que los productos son libres de los organismo utilizados en el método in vivo. Esto es absolutamente necesario para aplicaciones particulares en las industrias farmacéuticas y de alimentos. En general, los métodos in vitro pueden dividirse en dos grupos diferentes. En el primer grupo de métodos, varios substratos, tales como amilosa, amilopectina y glicógeno, se someten a la actividad de una enzima de ramificación. Borovsky et al. (Eur. J. Biochem. 59 (1975), 615-625) fueron capaces de probar que el uso de la enzima de ramificación de papa en conexión con la amilosa de substrato conduce a productos que son similares a la amilipectina, pero que difieren de ella en su estructura. Boyer y Preiss (Biochemistry 16 (1977), 3693-3699) mostraron, además, que una enzima de ramificación, purificada (a-1 ,4-glucano: a-1 , 4-glucan 6-glicosiltransferasa) de E. coli puede utilizarse para incrementar el grado de ramificación de amilosa o amilopectina. Sin embargo, sin el glicógeno de E. coli o de hígado de conejo se incuba con la enzima de ramificación de E. coli, solamente puede lograrse un incremento ligero en el grado de ramificación (Bpyer y Preiss, loe. cit.) Rumbak et al. (J. Bacteriol. 173 (1 991 ), 6732-6741 ), también, podría incrementar subsecuentemente el grado de ramificación de amilosa, amilopectina y glicógeno al incubar estos substratos con la enzima de ramificación de Butyrivibrio fibrisolvens. Okada ef al hizo un planteamiento similar (no. de Patente de E.U. 4454161 ) para mejorar las propiedades de los productos alimenticios que contienen almidón. Incuban las sustancias, tal como amilosa, amilopectina, almidón o dexctrina con una enzima de ramificación. Esto tuvo efectos ventajosos en la durabilidad de los productos alimenticios que contiene sustancias que se modificaron correspondientemente. Además, la solicitud de patente EP-A1 0 690 170 describe la reacción de almidón gelatinado en una solución acuosa utilizando una enzima de ramificación. Esto da como resultado almidones que tienen propiedades ventajosas en la producción de papel. Sin embargo, los métodos in vitro arriba mencionados tienen la desventaja de que, debido al grado de ramificación variable de los eductos (por ejemplo, almidón, amilopectoina, etc), hacen imposible producir productos uniformes. Además, no es posible controlar intencionalmente el grado de ramificación y, que además, los substratos utilizados son muy costosos. El otro grupo de métodos in vitro comprende la síntesis de-novo de a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados que inician de varios substratos (glucosa-1 -fosfato, ADP glucosa, UDP glucosa) utilizando una combinación de enzimas que consiste de una enzima de formación de cadena 1 ,4-glucan (fosforilasa, sintasa de almidón, sintasa de glicógeno) y una enzima de ramificación. illingwort ef al., (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 47 (1 961 ), 469-478) fue capaz de mostrar para un método in vitro el uso de una fosforilasa A de músculos (organismo desconocidos) en combinación con una enzima de ramificación (organismo desconocido) que la síntesis de-novo de moléculas similar al glicógeno utilizando el substrato de glucosa-1 -fosfato fue posible. Boyer y Preiss (loe. cit.) combinaron la actividad enzimática de una fosforilasa de músculos de conejo o una sintasa de glicógeno de E. coli con la actividad de una enzima de ramificación de E. coli utilizando el substrato de glucosa-1 -fosfato o glucosa UDP y de esta manera generaron a-glucanos ramificados. Borovsky ef al. (Eur. J. Biochem. 59 (1975), 615-625), también, analizó la síntesis de-novo de a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados de glucosa-1 -fosfato utilizando una enzima de ramificación de papa en combinación con una fosforilasa (1 ,4-a-D-gluca: ortofosfato a-glicosiltransferasa [EC 2.4.1 .1 ] de maíz. Doi (Biochimica et Biophysia Acta 184 (1969), 477-485) mostró que la combinación de enzima de una sintasa de almidón (ADP-D-glucosa: a-1 , 4-glucan a-4-glucosiltransferasa) de espinaca y una enzima de ramificación de papa utilizando el substrato de glucosa ADP dio como resultado productos similares a amilopectina. Parodi ef al. (Arch. Biochem. Biophys. 132 (1 969), 1 1 -1 17) utilizó una sintasa de glicógeno de hígado de rata combinada con una enzima de ramificación de hígado de rata de la síntesis de-novo de glucanos ramificados de glucosa UDP. Obtuvieron un polímero que fue similar al glicógeno nativo y que difiere de los polímeros que se basan en glucosa-1 -fosfato. Este segundo grupo de métodos in vitro, también, tiene la desventaja de que los substratos, por ejemplo glucosa-1 -fosfato, glucosa de UDP y glucosa de ADP, son muy costosas. Además, no parece ser posible controlar intencionalmente el grado de ramificación. Bütcher ef al., (J. Bacteriol. 179 (1997), 3324-3330) describe un método in vitro para la producción de a-1 ,4-glucanos solubles en agua utilizando una amilosucrasa y sacarosa como substratos. Sin embargo, solamente los a-1 ,4-glucanos lineales sin ramificaciones se sintetizan. De esta manera, el problema técnico que precede la presente invención es proporcionar un método que permite la producción barata de a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados para propósitos industriales, así como moléculas de ácido nucleico que codifican las enzimas que pueden utilizarse en dichos métodos, en particular enzimas ramificadas. Este problema técnico se ha resuelto al proporcionar las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones. Por lo tanto, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una enzima de ramificación (EC 2.4.1 .18) de bacterias del género Neisseria seleccionadas del grupos que consiste de (a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO 2; (b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótido de la región de codificación que se representa en SEQ ID NO 1 ; (c) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se codifica por la inserción del plásmido DSM 12425; (d) moléculas de ácido nucleico que comprenden la región de la inserción del plásmido DSM 12425, que codifica una enzima de ramificación de Neisseria denitrificans; (e) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de la secuencia de la cual tiene dentro los primeros 100 aminoácidos una homología de al menos 65% con respecto a la secuencia representada en SEQ ID NO. 2; (f) moléculas de ácido nucleico, el filamento complementario del cual se hibridiza a una molécula de ácido nucleico de acuerdo a (a), (b), (c), (d) y/o (e) y que codifica una enzima de ramificación de una bacteria del género Neisseria; y (g) moléculas de ácido nucleico, la secuencia de ácido nucleico de la cual difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de acuerdo a (f) debido a la degeneración del código genético. La secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO. 1 es una secuencia genómica que comprende una región de codificación para una enzima de ramificación de Neisseria denitrificans. Un plásmido que contienen dicha secuencia de ADN se ha colocado como DSM 12425. por medio de dicha secuencia o dicha molécula, la persona experta en la materia puede ahora aislar las secuencias homologas de otras especies Neisseria o cepas de Neisseria. El/ella lo puede hacer utilizando métodos convencionales, como selección de cADN o bibliotecas genómicas con sondas de hibridización adecuadas. Las secuencias homologas también pueden aislarse como se describe en el Ejemplo 1 . De esta manera, es posible, por ejemplo, identificar y aislar moléculas de ácido nucleico que se hibridizan a la secuencia representada en SEQ ID NO. 1 y que codifican una enzima de ramificación. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden, en principio, codificar una enzima de ramificación de cualquier bacteria del genero Neisseria, codifican preferentemente una enzima de ramificación de Neisseria denitrificans. De acuerdo a la presente invención, el término "hibridización" significa hibridización bajo condiciones de hibridización convencionales, preferentemente bajo condiciones exigentes como se ha descrito, por ejemplo, en Sambrook ef al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. El término "hibridización" se prefiere particularmente para significar una hibridización bajo las siguientes condiciones: regulador de hibridización: 2xSSC; 10x solución Denhardt (Fikoll 400+PEG+BSA; en una proporción de 1 : 1 : 1 ); 0.1 % SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 µg/ml de ADN de esperma de arenque; 50 µg/ml tARN; o 25 M de regulador de fosfato de sodio; pH 7.2; 1 mM EDTA; 7% SDS temperatura de hibridización: T = 65 A 68°C regulador de lavado: 0.2xSSC; 0.1 % SDS temperatura de lavado: T = 65 a 68°C Las moléculas de ácido nucleico que se hibridizan a las moléculas de ácido nucleico de la invención, pueden, en principio, derivarse de cualquier bacteria del género Neisseria que expresa una proteína correspondiente, preferentemente se derivan de Neisseria denitrificans. Las moléculas de ácido nucleico que se hibridizan a las moléculas de la invención, pueden, por ejemplo, aislarse de bibliotecas de cADN o genómicas. Tales moléculas de ácido nucleico pueden identificarse y aislarse utilizando las moléculas de ácido nucleico de la invención o partes de dichas moléculas o los complementos inversos de dichas moléculas, por ejemplo, al hibridizar de acuerdo a las técnicas estándar (cf. Sambrook ef al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spríng Harbor, NY) o por amplificación por medio de PCR. Como sonda de hibridización, las moléculas de ácido nucleico pueden utilizarse, tienen exactamente o esencialmente la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO. 1 o partes de la misma. Los fragmentos utilizados como sondas de hibridización también pueden ser fragmentos sintéticos que se han producido por medio de técnicas de síntesis convencionales y la secuencia de que es esencialmente idéntica a aquella de una molécula de ácido nucleico de la invención. Si los genes se han identificado y aislado, a los cuales las secuencias de ácido nucleico de la invención se hibridizan, la secuencia debe determinarse y las propiedades de las proteínas codificadas por dicha secuencian deben analizarse para encontrar si son enzimas ramificadas. Para este propósito, es particularmente adecuado comparar la homología en el nivel de la secuencia de aminoácidos y ácido nucleico y determinar la actividad enzimática. Las moléculas que se hibridizan a las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden, en particular, fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas que codifican una enzima de ramificación de bacterias del género Neisseria, preferentemente de Neisseria denitrificans. En este contexto, el término "derivado" significa que las secuencias de dichas moléculas difieren de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico arriba mencionadas en una o más posiciones y tienen un alto grado de homología a dichas secuencias. Homología, en este contexto, significa que existe, sobre la longitud completa, una identidad de secuencia de al menos 60%, en particular una identidad de al menos 70%, preferentemente de más de 80%, más preferentemente de más de 90% y más preferentemente de al menos 95%. Las desviaciones de " las moléculas de ácido nucleico arriba descritas pueden causarse por, por ejemplo, eliminación, adición, sustitución, inserción o recombinación. Además, homología significa que existe una equivalencia estructural y/o funcional entre las moléculas de ácido nucleico respectivas o las proteínas codificas por estas. Las moléculas de ácido nucleico que son homologas a las moléculas arriba mencionadas y que son derivados de dichas moléculas son usualmente variaciones de dichas moléculas que son modificaciones que tienen las mismas funciones biológicas. Estas pueden ser tanto variaciones que ocurren de manera natural, por ejemplo, secuencias de otras especies de Neisseria o cepas de Neisseria y mutaciones con estas mutaciones que ocurren de manera natural o introduciéndose por mutagénesis dirigida. Además, las variaciones pueden ser secuencias producidas sintéticamente. Las variantes alélicas pueden ser tanto variantes que ocurren de manera natural como variantes que se han producido sintéticamente o por técnicas de ADN recombinantes. Las proteínas codificadas por las diferentes variantes de las moléculas de ácido nucleico de la invención tienen ciertas características en común. Estas pueden incluir, por ejemplo, actividad biológica, peso molecular, reactividad inmunológica, conformación, etc, así como también propiedades físicas, tales como la conducta de migración en electroforosas de gel, conducta cromatográfica, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, pH óptimo, temperatura óptima, etc. El peso molecular de la enzima de ramificación de Neisseria denitrificans es 86.3 kDa, con el peso molecular deduciéndose de la secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, el peso molecular deducido de una proteína de la invención varía preferentemente de 70 kDa a 100 kDa, más preferentemente de 77 kDa a 95 kDa y más preferentemente es aproximadamente 86 kDa. La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene la actividad enzimática de una enzima de ramificación con la proteína de codificación que tiene una homología de al menos 65%, preferentemente de al menos 80% y más preferentemente de al menos 95% en ia región del término N , preferentemente en los primeros 100 aminoácidos, más preferentemente en los primeros 1 10 aminoácidos y más preferentemente en los primeros 120 aminoácidos a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO. 2. En otra modalidad, la presente solicitud se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene actividad de una enzima de ramificación, la proteína comprendiendo al menos, uno, preferentemente al menos 5, más preferentemente la menos 10 y más preferentemente al menos 20 de los siguientes motivos de péptido: (a) MNRNRHI (SEQ ID NO. 8), (b) RPDAHH (SEQ ID NO. 9), (c) HAPDYAL (SEQ ID NO. 1 0), (d) EGEAA (SEQ ID NO. 1 1 ), (e) DDYRF (SEQ ID NO. 12), (f) SALQH (SEQ ID NO. 13), (g) YETLG (SEQ ID NO. 14), (h) VSGVR (SEQ ID NO. 1 5), (i) VSVIG (SEQ ID NO. 16), (j) FNGWD (SEQ ID NO. 1 7), (k) LYKFS (SEQ ID NO. 1 8), (I) PYAFG (SEQ ID NO. 19), (m) RPTTAS (SEQ ID NO. 20), (n) FRRRA (SEQ ID NO. 21 ), (o) DELVNY (SEQ ID NO. 22), (p) LPLSEY (SEQ ID NO. 23), (q) YQATGL (SEQ ID NO. 24), (r) DDHGL (SEQ ID NO. 25), (s) HQDWN (SEQ ID NO. 26), (t) DGIRV (SEQ ID NO. 27), (u) YGGSEN (SEQ ID NO. 28), (v) SFAEES (SEQ ID NO. 29), (w) DPVHR (SEQ ID NO. 30), (x) WQQFAN (SEQ ID NO. 31 ), (y) EILNS (SEQ ID NO. 32), (z) ATEIQTAL (SEQ ID NO. 33). (aa)VKDKQAKAK (SEQ ID NO. 34). Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser cualquier molécula de ácido nucleico, en particular moléculas de ARN o ADN, por ejemplo, cADN, ADN genómico, mARN, etc. Pueden ser moléculas que ocurren de manera natural o moléculas producidas por medio de técnicas de síntesis química o genética. Pueden ser moléculas de un solo filamento que contienen ya sea el filamento de codificación o de no codificación, o también pueden ser moléculas de doble filamento. Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que son de al menos 15, preferentemente más de 50 y más preferentemente más de 200 nucleótidos en longitud, estas moléculas de ácido nucleico se hibridizan específicamente a al menos una molécula de ácido nucleico de la invención. En este contexto, el término "hibridizan específicamente" significa que dichas moléculas de hibridizan a las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de la invención, sin embargo, no a las moléculas de ácido nucleico que codifican otras proteínas. El término "híbridizar" significa preferentemente hibridizar bajo condiciones exigentes (ver arriba). En particular, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que se hibridizan a transcripciones de moléculas de ácido nucleico de la invención y que, de esta manera, pueden prevenir la traducción de las mismas. Tales moléculas de ácido nucleico que se hibridizan específicamente a las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden, por ejemplo, ser componentes de construcciones anti-sensibles o ribozimas o pueden utilizarse como cargas iniciadoras para amplificación por medio de PCR. Además, la invención se refiere a vectores, en particular plásmtdos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores que se utilizan usualmente en ingeniería genética y que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención. En una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico contenidas en los vectores se enlazan en orientación de sentido a los elementos reguladores garantizando la expresión en células eucarióticas o procarióticas. En este contexto, el término "expresión " significa tanto transcripción o transcripción y traducción. La expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención en células procarióticas, por ejemplo, en Escherichia coli, permite, por ejemplo, una caracterización más exacta de las actividades enzimáticas de las proteínas codificadas. Además, es posible introducir varias mutaciones en las moléculas de ácido nucleico de la invención por medio de técnicas convencionales de biología molecular (cf. por ejemplo, Sambrook et al. , loe. cit). Esto conduce a la síntesis de proteína, las propiedades de la cual se han modificado opcionalmente. Es posible producir mutantes de eliminación por eliminación continua del extremo 5' o 3' de la secuencia de ADN de codificación, que da como resultan la generación de las moléculas de ácido nucleico que conducen a la síntesis proteínas correspondientemente cortadas. Además, es posible introducir mutaciones de punto en posiciones que influencian, por ejemplo, la actividad de la enzima o la regulación de la enzima. De esta manera, pueden generarse los mutantes que tiene un valor KM modificado o que no se someten más a los mecanismos de regulación usuales en ias células a través de regulación alostérica o modificación covalente. Además, pueden producirse los mutantes que tienen un substrato modificado o especificidad de producto. Además, pueden producirse los mutantes que tienen un perfil de actividad-temperatura modificado. La manipulación gética en células procarióticas puede llevarse a cabo de acuerdo a los métodos conocidos por la persona experta (cf. Sambrook ef al., loe. cit.). Las secuencias reguladoras para la expresión en organismos procarióticos, por ejemplo E. coli, y en organismo eucarióticos se han descrito suficientemente en la literatura, en particular las secuencias para la expresión en levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 y Bitter et al., (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-554) dan un resumen de varios sistemas para la expresión para proteínas en varios organismos huésped. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico de la invención que se ha insertado en un vector de la invención se modifica de tal manera que es más fácil de aislar que la proteína codificada del medio de cultivo después de que se ha expresado en un organismo huésped adecuado. Existe, por ejemplo, la posibilidad de expresar la enzima de ramificación codificada como una proteína de fusión junto con una secuencia de polipéptido adicional, las propiedades de unión específicas de la cual permiten el aislamiento de la proteína de fusión por medio de cromatografía por afinidad (cf. Chong ef al., Gene (1997), 271 -281 ; Hopp ef al. , Bio/Techonology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93). Además, la molécula de ácido nucleico contenida en vector de la invención se prefiere que comprenda las secuencias de nucleótidos que permiten la secreción de la enzima de ramificación en el medio de cultivo. Preferentemente, se utiliza una secuencia que codifica el péptido de señal de a-CGTasa de Klebisiella oxitoca M5A1 (Fiedler ef al., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291 ; Banco de Genes no. de acceso X8601 , CDS 1 1529-1 1618). La recuperación y la purificación se hace más fácil por la secreción de la enzima en el medio de cultivo. Una interrupción de las células se evita y la enzima puede recuperarse del medio de cultivo con los métodos convencionales, tales como diálisis, osmosis, métodos cromatográficos, etc, utilizándose para remover los componentes residuales del medio de cultivo. Además, los vectores de la invención pueden comprende otras unidades funcionales que pueden originar una estabilización del vector en un organismo huésped, tal como un origen de replicación bacterial o el 2µ-ADN para la estabilización en S. cerevisiae. En otra modalidad, la invención se refiere a células huésped , en particular a células eucarióticas o procarióticas que se han transformado con una molécula de ácido nucleico o un vector como se describe arriba, así como también a células que se derivan de dichas células huésped y que contienen las moléculas de ácido nucleico descritas o vectores. Las células huésped pueden ser células bacteriales (por ejemplo, E. coli) o células fúngicas (por ejemplo, levadura, en particular, S. cerevisiae), así como también células animales o vegetales. El término "transformado" significa que las células de la invención se han modificado generalmente con una molécula de ácido nucleico de la invención que hasta ahora contiene al menos una molécula de ácido nucleico de la invención además de su genoma natural. Dicha molécula de ácido nucleico puede estar presente libre en la célula, opcionalmente como molécula auto-replicante, o puede integrarse establemente en el genoma de la célula huésped. Se prefiere que las células huésped sean microorganismos.

Dentro de la presente invención, tales microorganismos pueden ser todos bacterias y todos protista (por ejemplo, hongos, en particular levaduras y algas) como se ha definido, por ejemplo, en Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag (1985), 1 -2). Es particularmente preferido que las células huésped de la invención sean células vegetales. En principio, estas pueden incluir células vegetales de cualquier especie de planta, es decir, tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Preferentemente, dichas células son plantas vegetales de plantas útiles agrícolas, es decir, plantas que la gente cultiva para propósitos técnicos o nutricionales, en particular, para propósitos industriales. La invención se refiere preferentemente a células vegetales de plantas que forman fibra (por ejemplo, lino, cáñamo, algodón), plantas que almacenan aceite (por ejemplo uva, girasol, semilla de soya), plantas que almacena azúcar (por ejempio, remolacha, caña de azúcar, mijo de azúcar, plátano) y plantas que almacenan proteínas (por ejemplo, leguminosas). En otra modalidad, la invención se refiere a células vegetales de plantas de follaje (por ejemplo, pasto de follaje y pasto de pastura (alfalfa, trébol, etc.)), plantas vegetales (por ejemplo, tomate, lechuga, achicoria). En una modalidad preferida, la invención se refiere a células vegetales de plantas que almacenan almidón (por ejemplo, trigo, cebada, avena, centeno, papa, maíz, arroz, guisante, mandioca, semilla de mungo). Las células vegetales de plantas de maíz, arroz, trigo y papa se prefieren particularmente. Además, la presente invención se refiere a un método para producir una enzima de ramificación de bacterias del género Neisseria. En dicho método, las células huésped de la invención se cultivan bajo condiciones que permiten que la proteína se exprese y la proteína se recupere del cultivo, es decir, de las células y/o el medio de cultivo. Preferentemente, se utiliza un organismo huésped que secreta la enzima de ramificación. Además, la presente invención se refiere a un método para producir una enzima de ramificación de bacterias del género Neisseria con ia proteína produciéndose en un sistema de transcripción y traducción in 'fro utilizando una molécula de ácido nucleico de la invención. La persona experta en la materia esta familiarizada con tales sistemas. La invención también se refiere a proteínas que se codifican por las moléculas de ácido nucleico de la invención o que se obtienen por un método de la invención. Además, la presente invención se refiere a anticuerpos que reconocen específicamente una proteína de la invención. Estos anticuerpos pueden, por ejemplo, ser anticuerpos monoclonales o policlonales. También pueden ser fragmentos de anticuerpos que reconocen las proteínas de la invención. La persona experta en la materia es familiar con los métodos para producir dichos anticuerpos o fragmentos. Además, la presente invención se refiere al uso de una enzima de ramificación de la invención para la producción de a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados en sistemas in vitro. En particular, la presente invención también se refiere a células vegetales transgénicas que contienen las moléculas de ácido nucleico o vectores de la invención. Preferentemente, las células de la invención se caracterizan en que la molécula de ácido nucleico de la invención que se ha introducido se integra establemente en el genoma y se controla por un promotor activo en las células vegetales. Existe una pluralidad de promotores o elementos reguladores en disposición para expresar una molécula de ácido nucleico de la invención en células vegetales. En principio, todos los promotores, intensificadores, terminadores, etc. , que son activos en las plantas son elementos reguladores para la expresión en células vegetales. Básicamente, cualquier promotor que es funcional en las plantas seleccionado para la transformación puede utilizarse. Con respecto a las especies de planta utilizadas, el promotor puede ser homólogo o heterólogo. Dicho promotor puede seleccionarse de tal manera que la expresión tiene lugar en una manera constitutiva o solamente en un tejido particular, en cierto tiempo en el desarrollo de la planta o en el tiempo que se determina por influencia externa. Ejemplos de promotores adecuados son el promotor 35S del virus de mosaico de coliflor (Odell ef al., Nature 313 (1985), 810-812 o E.U. 5 352 605), que asegura una expresión constitutiva en todos los tejidos de una planta, y la construcción de promotor descrita en WO/9401 571 . El promotor de ubiquitina (cf. por ejemplo, E. U. 5 614 399) y los promotores de los genes de poliubiquitina de maíz (Christensen ef al., loe. cit.) son ejemplos adicionales. Sin embargo, también los promotores que solamente se activan en un tiempo determinado por influencia externa (cf. por ejemplo, WO/9307279) pueden utilizarse. Los promotores de proteína de impacto térmico que permiten una simple inducción pueden ser de particular interés. Además, pueden utilizarse los promotores que conducen a la expresión de secuencias aguas abajo en un cierto tejido de la planta, por ejemplo, en tejido fotosintéticamente activo. Los ejemplos de los mismos son el promotor ST-LS1 (Stockhaus ef al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhouse ef al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451 ), ei promotor Ca/b (cf. por ejemplo, E.U . 5 656 496, E.U. 5 639 952, Bansal ef al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1 992); 3654-3658) y el promotor SSU Rubisco (cf. por ejemplo, E.U. 5 034 322 y E.U. 4 962 028). Además, los promotores que son activos en los órganos que almacenan almidón de plantas a transformarse están por mencionarse. Son, por ejemplo, los granos de maíz en maíz, mientras que en papas, son los tubérculos. Para sobre-expresar las moléculas de ácido nucleico de la invención en papa, puede utilizarse el promotor de gen de patatina específico de tubérculo B33 (Rocha-Sosa ef al., EMBO J. 8 (1989), 23-29). Los promotores específicos de semilla se han descrito ya para varias especies de planta. El promotor USP de Vicia faba, que garantiza una expresión específica de semilla en V. faba y otras plantas (Fiedler ef al., Plant Mol. Biol. 22 (1 993), 669-679; Büumlein ef al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991 ), 459-467) es un ejemplo del mismo. Además, los promotores específicos de fruta como se describe en WO 91 /01373 también pueden utilizarse. Los promotores para una expresión específica de endoesperma, tal como el promotor de gluteína (Leisy ef al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41 -50; Zheng ef al. , Plant J. 4 (1993), 357-366), el promotor HMG de trigo, el promotor USP, el promotor de faseolina o promotores de genes zein de maíz (Pedersen ef al. , Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio ef al. , Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81 -93) son particularmente preferidos. Por medio de promotores específicos de endoesperma es posible incrementar las cantidades de transcripciones de las moléculas de ácido nucleico de la invención en el endoesperma en comparación con el endoesperma de plantas de tipo silvestre correspondientes. El promotor-shrunken-1 (sh-1 ) de maíz (Werr et al., EMBO J. 4 (1 985), 1373-1380) es particularmente preferido. Además, pueden haber una secuencia terminadora que es responsable de la terminación correcta de la transcripción y la adición de una cola poli-A a la transcripción que tiene la función de estabilizar las transcripciones. Tales elementos se han descrito en la literatura (cf. por ejemplo, Gielen ?t al. , EMBO J. 8 (1989), 23-29) y pueden intercambiarse. Por lo tanto, es posible expresar las moléculas de ácido nucleico de la invención en células vegetales. De esta manera, la presente invención también se refiere a un método para producir células vegetales transgénicas que comprende introducir una molécula de ácido nucleico o un vector de la invención en células vegetales. La persona experta en la materia tiene varios sistemas de transformación de planta en disposición, por ejemplo, el uso de T-ADN para transformar células vegetales se ha examinado extensivamente y se ha descrito en EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanter B.V. , Alblasserdam (1985), Capítulo V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1 -456 y An, EMBO J. 4 (1985), 277-287. Para transferir el ADN en las células vegetales, las explantas vegetales pueden co-cultivarse adecuadamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rizogenes. Las plantas completas pueden entonces regenerarse del material de planta infectado (por ejemplo, partes de las hojas, segmentos del tallo, raíces y protoplastos o células vegetales cultivadas en suspensiones) en un medio adecuado que puede contener antibióticos o insecticidas para seleccionar las células transformadas. Las plantas obtenidas en esa manera pueden entonces examinarse para la presencia del ADN introducido. Otras posibilidades para introducir ADN externo utilizando el método biolístico o por transformación de protoplasto se conocen (cf, Willmitzer, L. 1993 Transgenic plants. En: Biotechnology, A Multi-Voiume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-Nueva York-Basel-Cambridge). Los sistemas alternativos para transformar las plantas monocotiledóneas son la transformación por medio del método biolístico, la absorción de ADN químicamente o eléctricamente inducido en protoplastos, la electroporación de células parcialmente permeabilizadas, la microinyección de ADN en la inflorescencia, la microinyección de ADN en microesporas y pro-embriones, la absorción de ADN a través de los pólenes de germinación y la absorción de ADN en embriones mediante hinchazón (cf. por ejemplo, Lusardi, Plant J. 5 (1994), 571 -582; Paszowski, Biotechnology 24 (1992), 387-392). Aunque la transformación de plantas dicotiledóneas a través de los sistemas de vector Ti-plásmido por medio de Agrobacterium tumefaciens se establece bien, los estudios más recientes señalan el hecho de que las plantas monocotiledóneas, también, pueden sin embargo transformarse por medio de vectores en base a Agrobacterium (Chan, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491 -506; Hiei, Plant J. 6 (1994), 271 -282; Byetebier, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri, Bio/Technology 8 (1 990), 33-38; Gould, Plant Physiol, 95 (1991 ), 426-434; Mooney, Plant, Cell Tiss. & Org . Cult. 25 (1 991 ), 209-21 8; Li, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1 037-1048).

En el pasado, tres de los sistemas de transformación anteriores podrían establecerse para varios cereales: la electroporación de tejido, la transformación de protoplastos y la transferencia de ADN por bombardeo de partículas en células y tejido regenerativo (para un resumen ver Jáhne, Euphytica 85 (1995), 35-44). La transformación de trigo se ha descrilo varias veces en la literatura (para un resumen ver Maheshwari, Critical Reviews en Plant Science 14 (2) (1995), 149-178). En particular, la transformación de maíz se ha descrito varias veces en la literatura (cf. por ejemplo, WO 95/06128, EP 0513849, EO 0465875, EP 292435; Fromm ef al., Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel ef al., Biotechnology 1 1 (1993), 194-200; Moroc ef al., Theor. Appl. Genet. 80 (1990), 721 -726). La transformación exitosa de otras clases de cereales también se ha descrito, por ejemplo, para cebada (Wan y Lemaux, loe. cit. ; Rítala ef al., loe. cit. ; Krens ef al., Nature 296 (1 982), 72-74) y para trigo (Nehra ef al. , Plant J. 5 (1 994), 285-297). Para expresar las moléculas de ácido nucleico de la invención en plantas es, en principio, posible para la proteína sintetizada ubicarse en cualquier compartimiento de la célula vegetal. La región de codificación debe enlazarse opcionalmente a secuencias de ADN que garantizan la ubicación en el compartimiento respectivo con objeto de lograr la localización en un compartimiento particular. Tales secuencias se conocen (cf. por ejemplo, Braun, EMBO J. 1 1 (1 992), 321 9-3227; Soneewaid, Plant J. 1 (1 991 ), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989); 23-29). Una secuencia de señal plastidial, por ejemplo, aquella de ferrodoxin:oxidoreductasa NADP+ (FNR) de espinaca puede utilizarse. Dicha secuencia contiene la región sin traducir 5' y la secuencia de péptido de transito lateral del cADN de la proteína plastidial ferrodoxin:oxidoreductasa NADP+ de espinaca (nucleótido -171 a +165; Jansen ef al., Current Genetics 13 (1988), 517-522). Además, el péptido de tránsito de la proteína cerosa de maíz más los primeros 34 aminoácidos de la proteína cerosa madura (Klósgen ef al., Mol. Gen. 217 (1989), 155-161 ) también puede utilizarse como secuencia de señal plastidial. Además, el péptido de tránsito de la proteína de maíz (cf. arriba) también puede utilizarse sin los 34 aminoácidos de la proteína cerosa madura. Además, también es pensable utilizar las siguientes señales plastidiales: la secuencia de señal de la subunidad pequeña de carboxilasa de bifosfato de ribulosa (Wolter ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Nawrath ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 (1994) 12760-12764); la secuencia de señal de la dehidrogenasa de malato NADP (Gallardo ef al., Planta 197 (1 995); 324-332); la secuencia de señal de la reductasa de glutationa (Creissen ef al., Plant J. 8 (1995), 167-1 75). Por lo tanto, la presente invención también se refiere a células vegetales transgénicas que se transformaron con una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención, así como también a células vegetales transgénicas que se derivan de células transformadas en tal manera. Tales células contiene una o más moléculas de ácido nucleico de la invención con dicha(s) molécula(s) preferentemente enlazándose a elementos de ADN reguladores que garantizan la transcripción en células vegetales, en particular con un promotor. Tales células pueden diferenciarse de células vegetales que ocurren de manera natural en que contienen al menos una molécula de ácido nucleico de la invención. Las células vegetales transgénicas pueden regenerarse a plantas completas utilizando técnicas bien conocidos por la persona experta en la materia. Las plantas obtenibles por medio de regeneración de las células vegetales transgénicas de la invención también son una materia sujeto de la presente invención. Además, las plantas que contienen las células vegetales arriba mencionadas son una materia sujeto de la presente invención. Las plantas de la invención pueden, en principio, ser plantas de cualquier especie de planta, es decir, tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se prefiere que sean plantas útiles, es decir, plantas que se cultivan para propósitos nutricionales o técnicos, en particular, propósitos industriales. Preferentemente, la invención se refiere a células vegetales de plantas que forman fibra (por ejemplo, lino, cáñamo, algodón), plantas que almacenan aceite (por ejemplo uva, girasol, semilla de soya), plantas que almacena azúcar (por ejemplo, remolacha, caña de azúcar, mijo de azúcar, plátano) y plantas que almacenan proteínas (por ejemplo, leguminosas). En otra modalidad, la invención se refiere a plantas de follaje (por ejemplo, pasto de follaje y pasto de pastura (alfalfa, trébol, etc.)), plantas vegetales (por ejemplo, tomate, lechuga, achicoria).

En una modalidad preferida, la invención se refiere a plantas que almacenan almidón (por ejemplo, trigo, cebada, avena, centeno, papa, maíz, arroz, guisante, mandioca, semilla de mungo, las células vegetales de plantas de maíz, arroz, trigo y papa se prefieren particularmente. En una modalidad preferida, las células de las plantas de la invención tienen una actividad incrementada de la proteína de la invención en comparación con las células vegetales correspondientes de plantas tipo silvestre que no se han modificado genéticamente. Estas son preferentemente células de tejido que almacena almidón, en particular, células de tubérculos o del endoesperma, más preferentemente células de tubérculos de papa o el endoesperma de plantas de maíz, trigo o arroz. Dentro del significado de la presente invención, el término "incremento de la actividad" significa un incremento en la expresión de una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica una proteína con actividad de la enzima de ramificación, un incremento en la cantidad de proteína con actividad de la enzima de ramificación y/o un incremento en la actividad de una proteína con actividad de la enzima de ramificación en las plantas. El incremento en la expresión puede, por ejemplo, determinarse al medir la cantidad de transcripciones que codifican dichas proteínas, por ejemplo, por medio del análisis Northern biot o RT-PCR. En este contexto, el término "incremento" preferentemente significa un incremento en la cantidad de transcripciones por al menos 10%, preferentemente por al menos 20%, más preferentemente por al menos 50% y más preferentemente por al menos 75% en comparación con las células vegetales que no se han modificado genéticamente. La cantidad de proteínas con actividad de la enzima de ramificación puede, por ejemplo, determinarse por análisis Western blot. En este contexto, el término "incremento" preferentemente significa que la cantidad de proteínas con actividad de la enzima de ramificación se incrementa por al menos 10%, preferentemente por al menos 20%, más preferentemente por al menos 50% y más preferentemente por al menos 75% en comparación con las células correspondientes que no se han modificado genéticamente. Un incremento en la actividad de la enzima de ramificación puede, por ejemplo, determinarse de acuerdo al método descrito en Lloyd et al., (Biochem. J. 338 (1999), 515-521 ). En este contexto, el término "incremento" significa preferentemente que la actividad de la enzima de ramificación se incrementa por al menos 10%, preferentemente por al menos 20%, más preferentemente por al menos 50% y más preferentemente por al menos 75%. Sorprendentemente, se encontró que las plantas que contiene células vegetales de la invención con una actividad incrementada de una enzima de ramificación sintetizan un almidón modificado en comparación con las plantas de tipo silvestre correspondientes que no se han modificado genéticamente. El almidón modificado puede, por ejemplo, modificarse con respecto a sus propiedades físico-químicas, en particular la proporción amilosa/amilipectina, el grado de ramificación, la longitud de cadena promedio, el contenido de fosfato, ia viscosidad, el tamaño del granulo de almidón, la distribución de las cadenas laterales y/o la forma del granulo de almidón en comparación con el almidón sintetizado en plantas tipo silvestre. Como una consecuencia, el almidón modificado es más adecuado para propósitos particulares. Además, se encontró sorprendentemente que en células vegetales en las cuales la actividad de la enzima de ramificación de la invención se incrementa, la comparación del almidón se modifica de tal manera que tiene una textura de gel más elevada y/o un contenido de fosfato reducido y/o una viscosidad pico reducida y/o una temperatura de pastificación reducida y/o un tamaño reducido del granulo de almidón y/o una distribución modificada de las cadenas laterales en comparación con el almidón de plantas de tipo silvestre correspondientes. En este contexto, el término "textura de gel incrementada" significa un incremento por al menos 10%, preferentemente por al menos 50%, más preferentemente por al menos 100%, por al menos 200% y más preferentemente por al menos 300% en comparación con la textura de gel de almidón de plantas tipo silvestre. La textura de gel se determina como se describe abajo. Dentro del significado de la presente invención, el término "contenido de fosfato reducido" significa que el contenido total del fosfato covalentemente unido y/o el contenido de fosfato en la posición C-6 del almidón sintetizado en las células vegetales de la invención se reduce por al menos 20%, preferentemente por al menos 40%, más preferentemente por al menos 60% y más preferentemente por al menos 80% en comparación con el almidón de células vegetales de plantas de tipo silvestre correspondientes.

El contenido de fosfato total o el contenido de fosfato en la posición C-6 puede determinarse de acuerdo al método como se describe abajo. Dentro del significado de la presente invención, el término "viscosidad pico reducida" significa que la viscosidad pico se reduce por al menos 10%, preferentemente por al menos 25%, más preferentemente por la menos 50% y más preferentemente por la menos 75% en comparación con la viscosidad pico de almidones de plantas de tipo silvestre. Dentro del significado de la presente invención, el término "temperatura de pastificación reducida" significa que la temperatura de pastificación se reduce por al menos 0.5°C, preferentemente por al menos 1 .0°C, más preferentemente por al menos 2.0°C, más preferentemente por al menos 3.0°C en comparación con la temperatura de pastificación de almidones de las plantas tipo silvestre. La viscosidad pico y la temperatura de pastificación pueden determinarse con un Analizador Visco Rápido en la materia descrita abajo. La persona experta en la materia esta familiarizada con los términos "viscosidad pico" y "temperatura de pastificación". El término "tamaño reducido del granulo de almidón" significa que al proporción de porcentaje de los granulos de almidón que tienen un tamaño de hasta 1 5 µm se incrementa por al menos 10%, preferentemente por al menos 30%, más preferentemente por al menos 50%, 100% y más preferentemente por al menos 1 50% en comparación con plantas de tipo silvestre. El tamaño de los granulos de almidón se determina por medio de un fotosedimentómetro del tipo "Lumosed" por Retsch, GMBH, Alemania en la manera descrita abajo. En este contexto, el término "distribución modificada de las cadenas laterales" significa que la proporción de cadenas laterales con un DP de 6 a 9 se incrementa por al menos 25%, preferentemente por al menos 50%, más preferentemente por al menos 100% y más preferentemente por al menos 200% en comparación con la proporción de cadenas laterales de un DO de 6 a 9 de amilopectina de plantas de tipo silvestre. En otra modalidad de la invención, el término una "distribución modificada de cadenas laterales" significa que la proporción de cadenas laterales con un DO de 6 a 8, preferentemente de 6 a 7 se incrementa por al menos 25%, preferentemente por al menos 50%, más preferentemente por la menos 100% y más preferentemente por la menos 200% en comparación con la proporción de cadenas laterales con el grado correspondiente de polimerización de amilopectina de plantas de tipo silvestre. La proporción de cadenas laterales se establece al determinar la proporción de porcentaje de una cadena lateral particular con respecto al compartimiento de todas las cadenas laterales. El compartimiento total de todas las cadenas laterales se establece al determinar el área total debajo de los picos que representan los grados de polimerización de DP 6 a 30 en el cromatografía HPLC. La proporción de porcentaje de una cadena lateral particular con respecto al compartimiento total de todas las cadenas laterales se establece al determinar la proporción del área por debajo del pico que representa dicha cadena lateral en la cromatografía HPLC para el área total. Preferentemente, se utiliza el programa AI-450, versión 3.31 por Dionex, EUA. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un almidón, la amilopectina del cual tiene cadenas laterales con un DP de 5 comparado con la amilopectina de almidones de plantas de tipo silvestre. Además, la presente invención se refiere a un método para producir una planta transgénica que sintetiza un almidón modificado, en donde (a) una célula vegetal se modifica genéticamente al introducir una molécula de ácido nucleico de la invención y/o un vector de la invención en presencia o expresión del cual conduce a un incremento en la actividad de una proteína que tiene la actividad de una enzima de ramificación; (b) una planta se regenera de la célula producida de acuerdo a la etapa (a); y (c) opcionalmente las plantas adicionales se producen de la planta producida de acuerdo a la etapa (c). En una modalidad preferida del método, el almidón se modifica de tal manera que tiene una textura de gel incrementada y/o un contenido de fosfato reducido y/o una viscosidad pico reducida y/o una temperatura de plastificación reducida y/o un tamaño reducido de los granulos de almidón y/o una distribución modificada de las cadenas laterales en comparación con el almidón de las plantas de tipo silvestre correspondientes.

En este contexto, los término "textura de gel incrementada", "contenido de fosfato reducido", "viscosidad pico reducida", "temperatura de pastificación reducida", "tamaño reducido de los granulos de almidón" y "distribución modificada de las cadenas laterales" se definen como arriba. Con respecto a la modificación genética introducida de acuerdo a la etapa (a), ia misma aplica como se ha explicado en un contexto diferente con respecto a las plantas de la invención. La regeneración de las plantas de acuerdo a la etapa (b) puede lograrse por métodos conocidos por la persona experta. Las plantas adicionales de acuerdo a la etapa (b) del método de la invención pueden, por ejemplo, producirse por propagación vegetativa (por ejemplo, por medio de cortes, tubérculos o a través de cultivo de callo y regeneración de plantas completas) o por reproducción sexual. Preferentemente, la reproducción sexual se controla, es decir, las plantas seleccionadas que tienen propiedades particulares se cruzan y propagan. La presente invención también se refiere a las plantas obtenibles por el método de la invención. La presente invención también se refiere a material de propagación de plantas de la invención así como también de las plantas transgénicas producidas de acuerdo al método de la invención. En este contexto, el término "material de propagación" comprende aquellos componentes de la planta que son adecuados para producir progenies en una manera vegetativa o generativa son, por ejemplo, cortes, cultivos de callo, rizomas o tubérculos son adecuados para la propagación vegetativa.

Otro material de propagación comprende, por ejemplo, fruto, semillas, plantas de viveros, protoplastos, cultivos celulares, etc. El material de propagación se prefiere que sean tubérculos y semillas. El almidón obtenible de las células vegetales transgénicas y las plantas de la invención así como también del material de propagación es un materia sujeto adicional de la invención. Debido a ia expresión de una molécula de ácido nucleico de la invención o de un vector de la invención, la presencia de expresión de la cual conduce a un incremento en la actividad de una enzima de ramificación comparada con las células vegetales de plantas de tipo silvestre que no se han modificado genéticamente, las células vegetales transgénicas y las plantas de la invención sintetizan un almidón que se modifica con respecto a sus propiedades físico-químicas, en particular con respecto a la textura de gel y/o conducta de pastificación y/o el tamaño del granulo de almidón y/o el contenido de fosfato y/o la distribución de las cadenas laterales en comparación con el almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre. Además, la presente invención también se refiere a almidones caracterizados en que tienen una textura de gel incrementada y/o un contenido de fosfato reducido y/o una viscosidad pico reducida y/o una temperatura de plastificación reducida y/o un tamaño reducido de los granulos de almidón y/o una distribución modificada de las cadenas laterales. En una modalidad particularmente preferida, la presente invención se refiere a almidones de papa.

En este contexto, los término "textura de gel incrementada", "contenido de fosfato reducido", "viscosidad pico reducida", "temperatura de pastificación reducida", "tamaño reducido de los granulos de almidón" y "distribución modificada de las cadenas laterales" se definen como arriba. Además, la presente invención se refiere a un método para producir un almidón modificado que comprende la etapa de extraer el almidón de una planta (célula) de la invención como se describe arriba y/o de partes que almacenan almidón de tal planta. Preferentemente, tal método también comprende la etapa de recolectar las plantas cultivadas y/o las partes que almacenan almidón de dichas plantas antes de que el almidón se extraiga y, más preferentemente, también la etapa de cultivar plantas de la invención antes de recolectarlas. La persona experta esta familiarizada con los métodos para extraer el almidón de plantas o de partes que almacenan almidón de plantas. Además, los métodos para extraer el almidón de varias plantas que almacenan almidón se han descrito, por ejemplo, en "Starch: Chemistry and Technology (ed. : Whistler, BeMiller y Paschall (1994), 2da edición, Academic Press Inc. Londeres Ltd, :; ISBN 0-12-746270-8; cf. por ejemplo, capítulo XII, página 412-468: Maize y Sorghum Starches: Production; por Watson; capítulo XIII, página 469-479; Tapioca, Arrow Root y Sago Starches: Production, por Corbishley y Miller; capítulo XIV, página 479-490: Potato Starch; Production and Applications; por Mitch; capítulo XV, página 491 a 506; Wheat Starch: Production, Modification and Applications; por Knight y Oson ; y capítulo XVI, página 507-528: Rice Starch: Production and Applications; por Rohmer y KIem; Maizse Starch: Eckhoff ef al. , Cereal Chem. 73 (1996), 54-57, la extracción de almidón de maíz en una escala industrial se logra usualmente por medio de la así llamada molienda en húmedo)). Los aparatos que usualmente se utilizan para los métodos de extraer almidón del material de planta incluyen separadores, decantadores, hidrociclones, rociadores de spray y secadores de lecho fluido. El almidón obtenido por el método descrito arriba también es una materia sujeto de la presente invención. Los almidones de la invención pueden modificarse de acuerdo a los métodos conocidos por la persona experta en la materia y son adecuados para varias aplicaciones en la industria de productos alimenticios y de no productos alimenticios en una forma modificada o sin modificar. En principio, las posibilidades de uso pueden dividirse en dos grandes áreas. Un área comprende los productos de hidrólisis del almidón, principalmente glucosa y bloques que construyen glucano obtenidos a través de métodos químicos o enzimáticos. Sirven como materiales de inicio para procesos y modificaciones químicas adicionales tales como fermentación. Para una reducción de costos la simplicidad y la realización no costosa de un método de hidrólisis pueden ser de importancia. En el presente, el método es esencialmente enzimático con uso de amiloglucosidasa. Sería posible ahorrar costos al reducir el uso de enzimas. Esto podría lograrse al cambiar la estructura del almidón, por ejemplo, alargamiento de superficie del granulo, digestibilidad más fácil debido al bajo grado de ramificación o una estructura estérica que limita la accesibilidad para las enzimas utilizadas. La otra área en donde el almidón se utiliza se llama almidón nativo debido a que su estructura polimérica pueden subdividirse en dos campos adicionales de aplicación: 1 . Uso en productos alimenticios El almidón es un aditivo clásico de varios productos alimenticios, en los cuales sirve esencialmente al propósito de unir aditivos acuosos y/o causar una viscosidad incrementada o una formación de gel incrementada. Las propiedades características importantes son conducta de absorción y flujo, temperatura de pastificación e hinchamiento, viscosidad y desempeño de grosor, solubilidad del almidón, transparencia y estructura de la plasta, calor, compartimiento y resistencia al ácido, tendencia a la retrodegradación, capacidad de formación de película, resistencia a congelamiento/descongelado, digestibilidad así como la capacidad de formación compleja con por ejemplo, iones orgánicos o inorgánicos. 2. Uso en productos no alimenticios El otro campo principal de aplicación es el uso de almidón como un adyuvante en varios procesos de producción o como un aditivo en productos técnicos. Los campos principales de aplicación para el uso de almidón como un adyuvante son, antes que nada, la industria de cartón y papel. En este campo, el almidón se usa principalmente para retención (sólidos posteriores de sujeción), para dimensionar el relleno y partículas finas, como sustancia solidificante y para deshidratación. Además, las propiedades ventajosas de almidón con respecto a inflexibilidad, dureza, sonido, sujeción, brillo, suavidad, resistencia a la rasgadura así como las superficies se utilizan. 2.1 Industria de cartón y papel Dentro del proceso de producción de papel, puede hacerse una diferenciación entre cuatro campos de aplicación, principalmente superficie, revestimiento, masa y rocío. Los requerimientos el almidón con respecto al tratamiento de superficie son esencialmente un alto grado de brillo, viscosidad correspondiente, alta estabilidad de viscosidad, buena formación de película así como baja formación de polvo. Cuando se utiliza en revestimiento, el contenido sólido, una viscosidad correspondiente, una alta capacidad para unirse así como una alta afinidad de pigmento juegan un papel importante. Como un aditivo a la masa rápida, la alta estabilidad mecánica, dispersión libre de pérdida, uniforme y la retención completa en la pulpa de papel son de importancia. Cuando se utiliza el almidón en rocío, que corresponde al contenido de sólidos, la alta viscosidad así como la alta capacidad a unirse también son significativas. 2.2 Industria Adhesiva Un campo principal de aplicación es, por ejemplo, en la industria adhesiva, en donde los campos de aplicación se subdividen en cuatro áreas: el uso como pegamento de almidón puro, el uso en pegamentos de almidón preparados con químicos especiales, el uso de almidón como un aditivo para resinas sintéticas y dispersiones de polímero así como también el uso de almidones como extensores para adhesivos sintéticos, 90% de todos los adhesivos en base a almidón se utilizan en la producción de bolsas y sacos de papel, cartulina corrugada, materiales compuestos para papel y aluminio, cajas y pegamento húmedo para envolturas, estampas, etc. 2.3 Textiles y productos de cuidado textil Otro uso posible como adyuvante y aditivo se encuentra en la producción de textiles y productos de cuidado de textil. Dentro de la industria textil, puede hacerse una diferenciación entre los siguientes cuatro campos de aplicación: el uso de almidón como un encolante, es decir, como un adyuvante para uniformar y reforzar la conducta de rebabado para la protección contra fuerzas de tracción activas en tejido así como también para el incremento de la resistencia al desgaste durante el tejido, como un agente para mejora textil principalmente después de los pretratamientos que deterioran la calidad, tales como blanqueo, tinte, etc. , como espesador en la producción de pastas de tinte para la prevención de difusión de tinte y como una aditivo para agentes distorsión para hilos de costura. 2.4 Industria de ia Construcción Además, el almidón puede utilizarse como un aditivo en materiales de construcción. Un ejemplo es la producción de placas para tabicar de yeso, en los cuales el almidón mezclado en el emplasto delgado se pastifica con el agua, difunde en la superficie la placa para tabicar y de esta manera une el cartón a la placa. Otros campos de aplicación son mezclarlo con el emplasto y fibras minerales. En concentra ya mezclado, el almidón puede utilizarse para la deceleración del proceso de dimensionamiento. 2.5 Estabilización de terreno Además, el almidón es ventajosos para la producción de medios para estabilización de terreno utilizados para la protección temporal de partículas de terreno contra agua en desplazamiento de tierra artificial. De acuerdo al conocimiento del estado de la materia, los productos de combinación que consisten de almidón y emulsiones de polímero pueden considerarse por tener el mismo efecto reductor de encrustación y erosión que los productos utilizados hasta ahora; sin embargo son considerablemente menos costosos. 2.6 Uso en fertilizantes y protectores de plantas Otro capo de aplicación es el uso de almidón en protectores de planta para la modificación de las propiedades específicas de estas preparaciones. Por ejemplo, el almidón se utiliza para mejorar la humectación de los fertilizantes y protectores de planta, para la liberación dosificada de los ingredientes activos, para la conversión de líquido, ingredientes volátiles y/o activos olorosos en sustancias deformables, estables, microcristalinas para mezclar las composiciones incompatibles y para la prolongación de la duración del efecto debido a una desintegración reducida. 2.7 Industria de cosméticos, medicina y medicamentos El almidón también puede utilizarse en los campos de la industria de cosméticos, medicina y medicamentos. En la industria farmacéutica, el almidón puede utilizarse como un aglutinante para las tabletas o para la dilución del aglutinante en cápsulas. Además, el almidón es adecuado como desintegrantes para las tabletas ya que al tragarlas, absorbe el fluido y después de un corto periodo se hincha tanto que el ingrediente activo se libera. Por razones cualitativas, los polvos vulnerables y lubricantes médicos son campos adicionales de aplicación. En el campo de cosméticos, el almidón puede por ejemplo utilizarse como un vehículo de aditivos en polvo, tales como esencias y ácido salicílico. Un campo relativamente extenso de aplicación para el almidón es la pasta dental. 2.8 Almidón como un aditivo en briquetas y carbón El almidón también puede utilizarse como un aditivo en carbón y briquetas. Al agregar almidón, el carbón puede aglomerarse cuantitativamente y/o briquetearse en alta calidad, previniendo así la desintegración prematura de las briquetas. El carbón de control termal pasivo contiene entre 4 y 6% de almidón agregado, carbón calorado entre 0.1 y 0.5%. Además, el almidón es adecuado como un aglutinante ya que al agregarlo al carbón y briqueta puede reducir considerablemente la emisión de sustancias tóxicas. 2.9 Procesamiento de mezcla de carbón y mineral Además, el almidón puede utilizarse como un floculante en el procesamiento de mezcla de carbón y mineral. 2.10 Aditivo para materiales de fusión Otro campo de aplicación es el uso como un aditivo para procesar materiales en fusión. Para varios procesos de fusión los núcleos producidos de arenas mezcladas con aglutinantes son necesarios. A la fecha, el aglutinante utilizado más comúnmente es bentonita mezclada con almidones modificados, principalmente almidones de hinchamiento. El propósito de agregar almidón se incrementar la resistencia de flujo así como mejorar la intensidad de unión. Además, los almidones de hinchamiento pueden cumplir más prerrequisito para el proceso de producción, tales como dispersión en agua fría, rehidratisabilidad, buena mezcla en arena y alta capacidad de unir agua. 2.1 1 Industria de hule En la industria de hule el almidón puede utilizarse para mejorar la calidad óptica y técnica. Las razones para esto son brillo de superficie mejorada, sujeción y apariencia. Para este propósito, el almidón se dispersa en las superficies de hule pegajosas de sustancias de hule antes de la vulcanización en frío. También puede utilizarse para mejorar la impresión de hule. 2.12 Producción de sustitutos de cuero Otro campo de aplicación para almidón modificado es la producción de sustitutos de cuero. 2.1 3 Almidón en polímeros sintéticos En el mercado de plásticos los siguientes campos de aplicación emergen: la integración de productos derivados de almidón en el proceso de procesamiento (almidón es solamente un relleno, no hay unión directa entre el polímero sintético y el almidón) o, alternativamente, ia integración de productos derivados de almidón en la producción de polímeros (almidón y polímero forman una unión estable). El uso de almidón como un relleno puro no puede competir con otras sustancias tales como talco. Esta situación es diferente cuando las propiedades específicas del almidón se vuelven efectivas y el perfil de propiedad de ios productos finales se cambia sí claramente. Un ejemplo es el uso de productos de almidón en el procesamiento de materiales termoplásticos, tales como polietileno. Mediante esto, el almidón y el polímero sintético se combinan en una proporción de 1 : 1 por medio de la coexpresión para formar un 'grupo maestro', del cual varios productos se producen por medio de técnicas comunes utilizando polietileno granulado. La integración de almidón en películas de polietileno puede causar una permeabilidad de sustancia incrementada en cuerpos huecos, permeabilidad de vapor de agua mejorada, conducta antiestática mejorada, conducta anti-bloque mejorada así como también impresión mejorada con tintes acuosos. Otra posibilidad es el uso del almidón en espumas de poliuretano. Debido a la adaptación de los derivados de almidón así como debido a la optimización de las técnicas de procesamiento, es posible controlar específicamente la reacción entre polímeros sintéticos y los grupos hidroxi del almidón. Los resultados son películas de poliuretano que tienen los siguientes perfiles de propiedad debido al uso de almidón: un coeficiente reducido de expansión térmica, conducta de compresión reducida, conducta de tensión/presión mejorada, permeabilidad de vapor de agua incrementada sin un cambio en aceptación de agua, inflamabilidad reducida y densidad de rompimiento, sin caída de partes de combustible, sin haluros y envejecimiento reducido. Las desventajas que actualmente existen son intensidad de impacto y presión reducida. El desarrollo del producto de película no es la única opción. También los productos plásticos sólidos, tales como recipientes, platos y tazones pueden producirse por medio de un contenido de almidón de más del 50%. Además, las mezclas de almidón/polímero ofrecen la ventaja de que se biodegradan más fácilmente. Además, debido a su capacidad extrema de unir agua, los polímeros de injerto de almidón han obtenido mucha importancia. Estos son productos que tienen una estructura de almidón y un enrejado lateral de un monómero sintético injertado de acuerdo al principio de mecanismo de cadena radical. Los polímeros de injerto de almidón disponibles a la fecha se caracteriza por una capacidad de retención y unión mejorada de hasta 1 000 g de agua por g de almidón a una alta viscosidad. Estos super absorbedores se utilizan principalmente en el campo de higiene, por ejemplo, en productos tales como hojas y pañales, así como también el sector agrícola, por ejemplo, en pastillas de semilla. Lo que es decisivo para el uso del nuevo almidón modificado por las técnicas de ADN recombinante son, por el otro lado, estructura, contenido de agua, contenido de proteína, contenido de lípido, contenido de fibra, contenido de cenizas/fosfato, proporción de amilosa/amilopectina, distribución de la masa molar relativa, grado de ramificación, tamaño de granulo y forma así como también cristalización, y por el otro lado, las propiedades que resultan de las siguientes características; conducta de absorción y flujo, temperatura de pastificación, viscosidad, desempeño de engrosamiento, solubilidad, estructura de la pata, transparencia, calor, compartimiento y resistencia al ácido, tendencia a retrodegradación, capacidad de formación de gel, resistencia al congelamiento/descongelamiento, capacidad de formación compleja, unión de yodo, formación de película, resistencia adhesiva, estabilidad de la enzima, digestibilidad y reactividad. La producción de almidón modificado al operar genéticamente con una planta transgénica puede modificar las propiedades del almidón obtenido de la planta de tal manera para convertir las modificaciones adicionales por medio de métodos químicos o físicos superfluos. Por el otro lado, los almidones modificados por medio de técnicas de ADN recombinante pueden someterse a modificación química adicional, que resultará en mejora adicional de la calidad para ciertos de los campos arriba descritos de aplicación. Estas modificaciones químicas se conocen principalmente. Estas son modificaciones particularmente por medio de tratamiento de calor tratamiento de ácido - formación de éteres de almidón éter de alquilo de almidón, éter de O-alilo, éter de hidroxialquilo, éter de O-carboximetilo, éteres de almidón que contienen N. éteres de almidón que contienen P, éteres de almidón que contienen S. - formación de almidones ramificados - formación de polímeros de injerto de almidón. - oxidación y - esterificación que conduce a la formación de almidones de fosfato, nitrato, sulfato, xantato, acetato y citrato. Otros ácidos orgánicos también pueden utilizarse para la esterificación. En otra modalidad, la presente invención se refiere a las partes de plantas de la invención que pueden recolectarse, por ejemplo, fruto, raíces de almacenamiento, raíces, brotes, yemas, retoños o tallos, preferentemente semillas o tubérculos con dichas partes que pueden recolectarse que contiene células vegetales de la invención. En otro aspecto , la presente invención se refiere a una región reguladora que controla naturalmente, en células bacteriales, la transcripción de una molécula de ácido nucleico arriba descrita de la invención que codifica una enzima de ramificación de bacterias del género Neisseria. Dentro del significado de la presente invención, el término "región reguladora" se refiere a una región que influencia la especificad y/o el grado de la expresión de una secuencia de gen, por ejemplo, en tal manera que la expresión tiene lugar en respuesta a ciertos estímulos externos o en un cierto periodo. Tales regiones reguladoras usualmente se ubican en una región que se llama promotor. Dentro del significado de la presente invención, el término "promotor" comprende secuencias de nucleótido que son necesarias para iniciar la transcripción, es decir, para unir la polimerasa de ARN, y también puede comprender la(s) caja(s) TATA. En una modalidad preferida, la región reguladora de la invención comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) secuencias de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1 a 169 de la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO. 1 ; (b) la secuencia de nucleótidos de la región reguladora contenida en la inserción del plásmido DSM 12425 o partes del mismo; y (c) secuencias de nucleótidos que se hibridizan con las secuencias de (a) o (b) bajo condiciones exigentes. Los nucleótidos 1 a 169 de la secuencia representada en SEQ ID NO. 1 de parte de la región reguladora del gen de la enzima de ramificación de Neisseria denitrificans. Las secuencias promotoras putativas se ubican en las posiciones 36 a 44, 51 a 55 y 157 a 162, en donde la secuencia "GGGAGA" posiblemente es una secuencia Shine-Dalgarno. La presente invención también se refiere a regiones reguladoras que tienen una homología a las regiones reguladoras arriba mencionadas que esta tan elevada que se hibridizan a la menos una de dichas regiones, preferentemente bajo condiciones exigentes. Las regiones reguladoras que tienen una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente de al menos 90% y más preferentemente de al menos 95% a cualquier región reguladora antes mencionada, en particular a aquella representada en SEQ ID NO. 1 son particularmente preferidas. También comprenden regiones reguladoras que se modifican con respecto a las regiones reguladoras arriba descritas, por ejemplo debido a eliminaciones, inserciones, sustituciones, adiciones y/o recombinaciones y/o modificaciones. La persona experta esta familiarizada con los métodos para introducir tales modificaciones en las regiones reguladoras. Además, la persona experta en la materia sabe que las regiones reguladoras de la invención pueden acoplarse con elementos adicionales que influencian la transcripción de células bacteriales, por ejemplo, con elementos intensificadores. La presente invención también se refiere a moléculas de ADN recombinante que comprenden una región reguladora de la invención. En tal molécula de ADN recombinante, se prefiere que la región reguladora se enlace a una secuencia de ADN heteróloga. En este contexto, el término "heterólogo" significa que dicha secuencia no se enlaza naturalmente a la región reguladora. Además, una molécula de ADN recombinante de la invención puede contener elementos reguladores adicionales que son de importancia como respecto a la transcripción y/o traducción en células bacteriales, por ejemplo, intensificadores de traducción o transcripción. Además, la presente invención se refiere a células huésped que se transforman con una región reguladora, una molécula de ADN recombinante o un vector de la invención. Además, la presente invención se refiere a vectores que contienen una región reguladora de la invención o una molécula de ADN recombinante de la invención. Dichos vectores comprenden, por ejemplo, también plásmidos, cósmidos, bacteriófagos, virus, etc. que usualmente se utilizan para métodos en genéticas moleculares. Además, la invención se refiere a un método in vitro para producir a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados utilizando la sucrosa de substrato y una combinación de enzima de una amilosucrasa y una enzima de ramificación. Dentro del significado de la presente invención, el término "método in vitro" se refiere a una conversión, es decir, una reacción, que tiene lugar fuera del organismo vivo. En particular, el término "in vitro" significa que el método de la invención tiene lugar en un recipiente de reacción. Más preferentemente, el término "in vitro" significa que la reacción tiene lugar en ausencia de células vivas. La ventaja del método de la invención es que es posible controlar el grado de ramificación y que es posible, por medio de dicho control, adaptar las propiedades de los glucanos sintetizados al uso planeado de los glucanos. De esta manera, con respecto a la aplicación como material de encapsulación en farmacéuticos, existe la posibilidad de optimizar la velocidad de liberación de agentes farmacéuticos al ajustar a propósito el grado de ramificación. Dentro del significado de la presente invención, una amilosucrasa (sucrosa: 1 ,4-a-D-glucano 4-a-glucosiltransferasa, E.C. 2.4.1 .4) es una enzima que cataliza la conversión de sucrosa a fructosa y a-1 ,4-glucanos insolubles en agua. Para dicha enzima, se sugiere el siguiente esquema de reacción: sucrosa + (a-1 ,4-D-glucan)n ? D-fructosa + (a-1 ,4-D-glucan)n+ 1 Esta es una reacción de transglicosilación. Los productos de dicha reacción son fructosa y a-1 ,4-glucanos insolubles en agua. La transglicosilación puede tener lugar en la ausencia o en la presencia de moléculas aceptoras. Tales moléculas aceptoras pueden, por ejemplo, ser polisacáridos como malto-oligosacáridos, dextrina o glicógeno. Si dicha molécula aceptora es un a-1 ,4-glucano oligomérico, lineal, el producto que resulta de la reacción de transglicosilación por medio de la amilosucrasa es un a-1 ,4-glucano lineal polimérico. Si la reacción de transglicosilación por medio de amilosucrasa se lleva a cabo sin ninguna moléculas aceptora, un glucano que tiene una molécula de fructosa terminal se obtiene. Dentro del significado de la presente invención, todos los productos obtenidos por medio de una amilosucrasa en la ausencia o en la presencia de moléculas aceptoras se llaman a-1 ,4-glucanos. Para el mecanismo de reacción de una transglicosiiación por medo de una amilosucrasa en la ausencia de una molécula aceptora, se sugiere el siguiente esquema de reacción: G-F+ n(G-F) ? Gn-G-F +nF, en donde G-F es sucrosa, G es glucosa, F es fructosa y Gn-G-F es un a-1 ,4-glucano. Para el mecanismo de reacción de una transglicosilación por medio de amilosucrasa en la presencia de una molécula aceptora, se sugiere el sistema reacción : mG-F + Gn ? Gp-m + mF, en donde Gn es una molécula aceptora de polisacárido, Gn-m es un polisacárido que consiste de un aceptador más una cadena de a-1 , 4-glucano sintetizada al mismo, G-F es sucrosa, F es fructosa y G es glucosa. Ningún co-factor es necesario para la transglicosilación por medio de una amilosucrasa. En principio, todas las amilosucrasas que catalizan la síntesis de a-1 ,4-glucanos lineales que inician de sucrosa son adecuadas para llevar a cabo el método de la invención. Hasta ahora, las amilosucrasas de varias especies de bacterias se han conocido, en particular principalmente de especies Neisseria (MacKenzie et al. , Can . J . Microbiol. 24 (1 978), 357-362).

De esta manera, una amilosucrasa de origen procari?tico se prefiere para utilizarse. Las amilosucrasas se han conocido, por ejemplo, de Neisseria perflava (Okada y Hehre, J. Biol. Chem. 249 (1974), 126-135; MacKenzie ef al., Can. J. Microbiol. 23 (1977), 1303-1 307) o de Neisseria canis, Neisseria cinérea, Neisseria denitrificans, Neisseria sicca y Neisseria subflava (MacKenzie ef al., Can. J. Microbiol. 24 (1978), 357-362). Además, WO 95/31553 describe una amilosucrasa de Neisseria polysaccharea. Se prefiere utilizar una amilosucrasa que se secreta naturalmente por un procarioto. En una modalidad preferida de la invención, una amilosucrasa de Neisseria polysaccharea se utiliza. La enzima que se expresa en Neisseria polysaccharea es extremadamente estable y se une muy apretada a los productos de polimerización y se inhibe competitivamente por la fructosa de producto de reacción (MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 23 (1977), 1303-1307). Con respecto a las especies de Neisseria de Neisseria polysaccharea, la amilosucrasa se secreta (Riou et al., Can. J. Microbiol. 32 (1 986), 909-91 1 ), mientras que en otras especies Neisseria, permanece en la célula. Particularmente se prefiere utilizar una amilosucrasa que tiene la secuencia representada en SEQ ID NO. 5. En otra modalidad preferida de la invención, se utiliza una amilosucrasa purificada. En este contexto, una amilosucrasa purificada es una enzima que se encuentra sustancialmente libre de componentes celulares de las células en las cuales la proteína se sintetiza. Preferentemente, el término "amilosucrasa purificada" se refiere a una amilosucrasa que tiene un grado de pureza de al menos 70%, preferentemente de al menos 85% y más preferentemente de al menos 90%. El uso de una proteína purificada para producir a-1 .4-glucanos tiene varias ventajas. En contraste a los métodos que utilizan extractos de proteína parcialmente purificados, el medio de reacción del método de la invención no contiene ningún residuo de la cepa de producción (microorganismo) que se utiliza para purificar la proteína o para producirla por medio de ingeniería genética. Además, existen ventajas en las industrias farmacéutica y de alimentos si se utiliza la proteína purificada. Los componentes del producto se definen de manera más exacta, también, si el medio de reacción se defina y si todos los componentes no necesarios se han removido. Esto conduce a un procedimiento menos extenso para comercializar la autorización para estos productos, que se han fabricado por medio de biotecnología, en la industria farmacéutica y de alimentos, en particular, ya que dichos productos se supone que no muestran indicio de un microorganismos transgénicos. Dentro del significado de la presente invención, una enzima de ramificación (a-1 ,4-glucano; a-1 ,4-glucano 6-glicosiltransferasa, E.C. 2.4.1 . 1 8) es una proteína que cataliza una reacción de transglicosilación en la cual los a-1 ,4-enlaces de un donador de a-1 ,4-glucano se hidrolizan y las cadenas de a-1 ,4-glucano liberadas se transfieren a una cadena aceptora de a-1 ,4-glucano y se convierte en a-1 ,6-enlaces. En principio, todas las enzimas ramificadas de cualquier origen (bacterial, fúngico, vegetal, animal) son adecuadas para llevar a cabo el método de la invención (cf. por ejemplo Baba ef al., Biochem. Biophys. Res. Common. 181 (1991 ), 87-94; Kossmann ef al., Mol. Gen. Genet. 203 (1991 ), 237-244; Nakamura y Yamanouchi, Plant Physiol. 99 (1992), 1265-1266; Baecker ef al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 8738-8743; Kiel ?t al., Gene (1989), 9-17, etc.). La persona experta en la materia puede aislar los genes correspondientes por medio de métodos estándar de biología molecular, como se ha descrito, entre otros , en Sambrook ef al., (Sambrook ef al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EUA (1989)). En una modalidad preferida de la invención, la enzima de ramificación es una enzima de ramificación de un procarioto, preferentemente de una bacteria del género Neisseria, más preferentemente de Neisseria denitrificans y más preferentemente de una enzima de ramificación de la invención como se describe abajo. Una enzima de ramificación que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO. 1 es particularmente preferida. En otra modalidad preferida, la enzima de ramificación es una enzima de ramificación purificada. En este contexto, una enzima de ramificación purificada es una enzima que es sustancialmente libre de componentes celulares de las células en las cuales la proteína se sintetiza. Preferentemente, el término "enzima de ramificación purificada" significa que la enzima tiene un grado de pureza de al menos 70%, preferentemente de al menos 85% y más preferentemente de al menos 90%.

Además, en el método de la invención, se prefiere utilizar las proteínas que se han producido de manera recombinante. Dentro del significado de la presente invención, dichas proteínas son proteínas que se han producido al introducir una secuencia de ADN que codifica dicha proteína en una célula huésped y que la expresa ahí. La proteína puede recuperarse sustancialmente de la célula huésped y/o el medio de cultivo. Se prefiere que la célula huésped sea una bacteria o un protisto (por ejemplo, hongos en particular levaduras, algas), tal como se define, por ejemplo en Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1 985, 1 -2). En particular, se prefiere que las proteínas se secreten por la célula huésped. Tales células huésped para producir una proteína recombinante pueden generarse utilizando métodos que son conocidos por la persona experta en la materia. Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, Bitter et al., (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544; Sawers ef al. , Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1 -9; Billmann-Jacobe, Current Opinión in Biotechnology 7 (1996), 500-504; Hockney, Trends ¡n Biotechnology 12 (1994), 456-463 y Griffiths ef al. , Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440 dan un resumen de diferentes sistemas de expression. Los vectores de expresión se han descrito extensivamente en la literatura. Aparte de un gen marcador de selección y un origen de replicación que garantiza la replicación en el huésped seleccionado, usualmente contienen un promotor viral o bacterial, y principalmente una señal de terminación para la transcripción. Entre el promotor y la señal de terminación, existe al menos un sitio de restricción o un polienlazador que permite la inserción de una secuencia de ADN de codificación. La secuencia de ADN de codificación que controla de manera natural la transcripción del gen correspondiente puede utilizarse como secuencia promotora si se encuentra activa en el organismo huésped seleccionado. Sin embargo, dicha secuencia también puede intercambiarse por otras secuencias promotoras. Ambos promotores que afectan la expresión constitutiva del gen y los promotores inducibles que permiten una regulación dirigida de la expresión del gen aguas abajo puede utilizarse. Las secuencias promotoras virales y bacteriales que tienen estas propiedades se han descrito extensamente en la literatura. Las secuencias reguladoras para la expresión en microorganismos (por ejemplo, E. coli, S. cerevisiae) se han descrito suficientemente en la literatura. Los promotores que permiten una expresión particularmente fuerte del gen aguas abajo incluyen, por ejemplo, el promotor T7 (Studier ef al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), lacuvd, trp, trp-laclV5 (DeBoer ef al., en Rodríguez y Chamberlin (eds.) Promoters, Structure and Function: Praeger, Nueva York (1982), 462-481 ; DeBoer ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1983), 21 -25), ?p1 , rae (Boros ef al., Gene 42 (1986), 97-100). Normalmente, las cantidades de proteínas alcanza su nivel superior de la parte media a aproximadamente el final de la fase logarítmica del ciclo de crecimiento de los microorganismos. Por lo tanto, preferentemente los promotores inducibles se utilizan para ia síntesis de proteínas. Estos promotores inducibles con frecuencia dan como resultado una producción más elevada de proteínas que los promotores constitutivos. Debido a la traducción y transcripción constante de un gen clonado, el uso de promotores constitutivos fuertes con frecuencia tiene el efecto de que la energía de otras funciones celulares esenciales es pierde y que, de esta manera, el crecimiento celular disminuye (Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak.Molekulare Biotechnologie (1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin Oxford, p. 342). Por lo tanto, un método de dos etapas con frecuencia se utiliza para lograr la cantidad óptima de proteínas. Primero, las células huésped se cultivan bajo condiciones óptimas que alcanzan una densidad de célula relativamente elevada. En la segunda etapa, la transcripción se induce dependiendo de la clase de promotor utilizado. En este contexto, un promotor tac que es inducible por lactosa o IPTG (=isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida) es particularmente adecuado (DeBoer ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80 (1 983), 21 -25). Las señales de terminación para ia transcripción también se han descrito en la literatura. La transformación de la célula huésped con el ADN que codifica un ADN de proteína correspondiente puede llevarse a cabo normalmente de acuerdo a métodos estándar, como se describe, por ejemplo, en Sambrook ef al., (Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2da edición (1989), Cold Spring Harbor Press, Nueva York). La célula huésped se cultiva en medio de cultivo que corresponde a las necesidad de la célula huésped respectiva. En particular, el valor de pH, temperatura, concentración de sal, aeración, antibióticos, vitaminas y elementos de indicio, etc. se toman en consideración. La enzima producida por las células huésped pueden purificarse de acuerdo a técnicas de purificación estándar, tales como precipitación, cromatografía de intercambio de ion, cromatografía por afinidad, filtración de gel, cromatografía de fase inversa de HPLC, etc. Al modificar el ADN expresado en las células huésped, es posible producir un polipéptido en la célula huésped, que es más fácil de aislarse del medio de cultivo debido a ciertas propiedades. De esta manera, existe la posibilidad de expresar la proteína a expresarse como una proteína de fusión junto con otra secuencia de polipéptidos, ia propiedad de unión específica de la cual permite el aislamiento de la proteína de fusión a través de cromatografía por afinidad (por ejemplo, Hopp et al., Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990) 88-93). En una modalidad preferida del método de la invención, se utilizan las enzimas que se han producido de manera recombinante y que se han secretado por la célula huésped en el medio de cultivo de manera que no es necesario interrumpir las células o purificar la proteína más ya que la proteína secretada puede recuperarse del sobrenadante. Los métodos conocidos en la ingeniería de proceso, tales como diálisis, osmosis inversa, métodos cromatográficos, etc. pueden utilizarse para remover los componentes residuales del medio de cultivo. Lo mismo aplica a la reconcentración de la proteína secretada en el medio de cultivo. Normalmente, la secreción de proteínas por microorganismo se media por los péptidos de señal de terminal N (secuencia de señal, péptido guía). Las proteínas que tienen dicha secuencia de señal pueden pasar a través de la membrana celular del microorganismo. La secreción de proteínas puede lograrse mediante el enlace de la secuencia de ADN que codifica dicho péptido de señal a la región correspondiente que codifica la enzima. Un péptido de señal que ocurre opcionalmente de manera natural se prefiere, por ejemplo, el péptido de señal de la amilosucrasa de Neisseria polysaccharea. El péptido de señal de la a-CGTasa de Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler ef al. , J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291 ) o un péptido de señal como se codifica por los nucleótidos 1 1529-1 1618 de la secuencia accesible en el Banco de Genes bajo en número de acceso X86014 es particularmente preferido. Como una alternativa, las enzimas utilizadas en el método de la invención también pueden producirse utilizando un sistema de traducción y transcripción in vitro que conduce a la expresión de las proteína sin utilizar microorganismos. En otra modalidad preferida, la amilosucrasa y/o la enzima de ramificación se inmovilizan en un material de soporte. La inmovilización de las enzimas tiene la ventaja de que las enzimas pueden recuperarse de la mezcla de reacción en una manera simple como catalizadores de la reacción de síntesis y puede utilizarse varias veces. Ya que la purificación de las enzima usualmente requiere mucho tiempo y dinero, la inmovilización y reciclaje pueden ahorrar costos considerablemente. El grado de pureza de los productos de reacción que no contienen ninguna proteína restante es otra ventaja. Existe una pluralidad de materiales de soporte en disposición de inmovilizar las proteínas en donde el acoplamiento con el material de soporte puede tener lugar a través de enlaces covaientes y no covalentes (para un resumen ver: Methods in Enzymology 135, 136, 137). Por ejemplo, agarosa, alginato, celulosa, poliacrilaida, sílice o nylon se utilizan extensamente como material de soporte. En otra modalidad preferida del método, un (parcialmente purificado) extracto crudo de enzima de una amilosucrasa y/o una enzima de ramificación se utiliza. En este contexto, un extracto crudo es una preparación de amiiosucrasa y/o enzima de ramificación que tiene un grado reducido de pureza en comparación con una enzima purificada (cf. Ejemplos 5 y 6). En una modalidad preferida, en el método de la invención el grado de ramificación de los a-1 .4-glucanos a-1 .6-ramificados se modifica al cambiar la proporción de la actividad de la proteína de la enzima de ramificación y amilosucrasa. En este contexto, la proporción de la actividad de la proteína es la proporción de las actividades de la proteína (u) de amilosucrasa y enzima de ramificación. Las actividades de la proteína pueden determinarse como se describe en los Ejemplos 7 y 8. Cuando el método de ia invención se lleva a cabo (cf. Ejemplo 9), la proporción de la actividad de la proteína (unidades de amilosucrasa/unidades de enzima de ramificación) puede variar de 1 /4000 a 2000/1 . En una modalidad preferida, la proporción de la actividad de la proteína varía de 1 /1 500 a 1 500/1 . En otra modalidad preferida, la proporción de la actividad de ia proteína varía de 1 /800 a 1 300/1 .

En una modalidad particularmente preferida, la proporción de la actividad de la proteína varía de 1 /400 a 1200/1 . Es posible modificar el grado de ramificación de los a-1 , 4-glucanos a-1 ,6-ramificados obtenidos de 0.05% a 35% al cambiar la proporción de la actividad de la proteína. En una modalidad preferida, es posible cambiar el grado de ramificación de los a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados en la posición 6 de 0.15% a 25%, más preferentemente de 0.20% a 15% y más preferentemente de 0.25% a 12%. Si el método de la invención se utiliza, es posible, en particular, producir productos que tienen un grado de ramificación más elevado que el glicógeno. Dentro del - significado de la presente invención, el grado de ramificación es el compartimiento preferido de ramificaciones en la posición O-6 comparada con todas las unidades de glucosa enlazadas de manera diferente. El grado de ramificación puede determinarse mediante análisis de metilación (cf. Ejemplo 10). En otra modalidad preferida, en el método de la invención, el peso molecular de los productos se modifica al cambiar la proporción de actividad de la proteína. Es, en particular, posible cambiar la proporción de actividad de la proteína durante la reacción que conduce a la síntesis de los a-1 ,4-glucanos a-1 , 6-ramificados. En otra modalidad preferida del método de la invención, el método es para llevarse a cabo en diferentes concentraciones de sucrosa. En principio, es posible para el método llevarse a cabo en una concentración preferentemente que varía de 1 % a 80% de sucrosa (p/v), más preferentemente que varía de 5% a 50% y más preferentemente de 10% a 40%. En la presente invención, el peso molecular se determina por experimentos de dispersión de la luz (Light Scattering from Polymer Solutions, editor: Huglin. M. B. , Academic Press, Londres, 1972) de acuerdo a Berry (J. Chem. Phys. 44 (1966), pp. 4550). Por medio del método de la invención, es posible, en particular, ajustar el peso molecular de los a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados producidos por dicho método a un rango de 1000 a 3000 x 10ß. preferentemente, los a-1 ,4-glucanos a-1 , 6-ramificados tienen un peso molecular que varía de 100,000 a 1500 x 106, más preferentemente de 100,000 a 1000 x 106, aún más preferentemente de 262,000 a 1000 x 106 y más preferentemente de 262,000 a 499 x 106. Además, la invención se refiere a a-1 ,4-glucanos a-1 , 6 ramificados obtenibles por el método arriba descrito de la invención. Dichos a-1 ,4-glucanos a-1 , 6 ramificados tienen un grado de ramificación que es más elevado que aquel que se logra si solamente la actividad de una amilosucrasa se utiliza y que es 25% de mol en la mayoría. En una modalidad preferida de la invención, estos a-1 , 4-glucanos a-1 ,6-ramificados que tienen un grado de ramificación que varía de 0.05% a 20%, preferentemente de 0.15% a 17%, más preferentemente de 0.2% a 15%, aún más preferentemente de 0.25% a 13% y más preferentemente de 0.3% a 1 2%. En otra modalidad preferida de la invención , ei grado de ramificación varía de 0.35% a 1 1 % y, en particular, de 0.4 % a 1 0.5%.

Los a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados de la invención pueden utilizarse en las industrias de alimentos y de no alimentos y se han descrito arriba con respecto al almidón de la invención. El plásmido pBB48, el cual se ha producido dentro de la presente invención, se depositó con ia Colección Alemana de microorganismo y cultivos celulares (DSMZ) en Braunschweig, que se aprueba como el depositante internacional, el 25 de Septiembre de 1998 con el número de acceso DSM 12425 de acuerdo a los requerimientos del Tratado de Budapest. La Figura 1 muestra de manera esquemática la estructura del plásmido pBB48 (DSM 12425). La Figura 2 muestra un número de a-1 ,4-glucanos que tienen un grado variable de a-1 ,6-ramificaciones que se producen por medio del método de la invención y que se tiñen subsecuentemente con solución de Lugol. De izquierda a derecha; amilosucrasa (izquierda), amilosucrasa + cantidades de reducción de la actividad de la enzima de ramificación. La absorción máxima de las muestras correspondientes fue: 61 5 nm, 483 nm, 500 nm, 526 nm, 534 nm, 560 nm, 577 nm. La Figura 3 muestra una cromatografía de HPLC de un producto de proceso altamente ramificado (A) que se ha desramificado con isoamilasa y una muestra de glicógeno de hígado de rata (B) que se ha desramificado con isoamilasa. La Figura 4 muestra el esquema del análisis de metilación. La Figura 5 muestra un diagrama de los resultados del análisis de la muestra 7 descrita en los Ejemplos 9 y 10 después de una y después de dos etapas de metilación. Los valores para la 2, 3, 6-metilación son 96.12% y 96.36%, respectivamente. La Figura 6 muestra una ilustración gráfica de los compartimientos en unidades de glucosa de 6-enlazada ("23 Me") y terminal ("22346 Me") de las muestras de glucano examinadas. Las Figuras 7 y 8 muestran cromatografías de gas de las muestras 3 y 7 descritas en los Ejemplos. La Figura 9 muestra esquemáticamente el plásmido pBE-fnr-Km. La Figura 10 muestra un gel de actividad para la enzima de ramificación. La Figura 1 1 muestra la ilustración esquemática de un perfil RVA. La Figura 12 muestra la distribución del tamaño de granulo de las líneas 143-143A y 143-59A comparas con el tipo silvestre. La Figura 1 3 muestra la magnificación microscópica de los granulos de almidón de las líneas 143-13A, 143-34A y 143-59A en comparación con los granulos de almidón de las plantas de tipo silvestre (microscopio de luz por Leitz, Alemania). La Figura 14 muestra la textura de gel de los almidones de diferentes líneas transgénicas compradas con los almidones de plantas de tipo silvestre. La textura se determinó por medio de un analizador de textura. La Figura 15 muestra el perfil RVA de los almidones de las líneas 143-1 1A, 143-13A, 143-59A comparados con el tipo silvestre. Las Figuras 16 a 18 muestran los resultados de las cromatografías de HPLC que representan el patrón de la distribución de las cadenas laterales de las líneas 143-WT (=tipo silvestre), 143-13A y 143-59A. La Figura 19 muestra el gradiente de elusión que se utilizó para las cromatografías representadas en las Figuras 16 a 18. La Figura 20 muestra el porcentaje de desviación de las cadenas laterales que tienen ciertas longitudes de cadena de los almidones analizados en las Figuras 16 a 18 del tipo silvestre. Los siguientes Ejemplos ilustran la invención: Materiales: regulador de interrupción: 100 mM Tris/HCI, pH 8.5; 5 mM Na2EDTA; 2 mM DTT; 1 mM Pefabloc® regulador de enjuague: 50 mM Tris/HCI, pH 8.5; 5 mM Na2EDTA, 10% de glicerol regulador HIC: 50 mM de regulador de fosfato de potasio, pH 7.0; 5 mM EDTA; 2 mM DTT; 10% de glicerol glicógeno de ostra tipo II de ostra (Sigma G8751 ). Métodos: Análisis de Almidón (a) Determinación de la proporción de amilosa/amilopectina El almidón se aisló de plantas de papa de acuerdo a los métodos estándar y la proporción de amilosa a amilopectina se determinó de acuerdo al método descrito por Hovenkamp-Hermelink et al. , (Potato Research 31 (1988), 241 -246). (b) Determinación del contenido de fosfato En almidón, las posiciones C2, C3 y C6 de las unidades de glucosa pueden fosforilarse. Para determinar el contenido de grupos de fosfato en la posición C6, 100 mg de almidón se hidrolizó en 1 ml de 0.7 M HCl durante 4 horas a 95°C (Nielsen et al., Plant Physiol. 105 (1994), 1 1 -1 17). Después de neutralizar con 0.7 M KOH, 50 ml del hidrolisato se sometieron a una prueba enzimática óptica para determinar la glucosa-6-fosfato. En 334 nm, el cambio en la absorción de la mezcla de prueba (100 mM ¡midazola/HCI; 1 0 mM MgCI2; 0.4 mM NAD; 2 unidades de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa de Leuconostoc mesenteroides; 30°C) se determinó. El contenido total de fosfato se determinó de acuerdo al método por Ames (Methods in Enzymology VIII (1966), 1 1 5-1 18). Aproximadamente, 50 mg de almidón se agregaron a 30 µl de una solución de nitrato de magnesio etanólico y se calcinaron durante 3 horas a 500°C en un horno de mufla. 300 µl de 0.5 M de ácido hidroclórico se agregaron al residuo e incubaron durante 30 min a 60°C. después, una alícuota se llenó hasta 300 µl de 0.5 M de ácido hidroclórico, agregó a una mezcla de 100 µl de 10% de ácido ascórbico y 600 µl de 0.42% de molibdato de amonio en 2 M de ácido sulfúrico e incubó durante 20 min a 45°C. Después, una determinación fotométrica en 820 nm se lleva a cabo con una curva de calibración utilizando estándares de fosfato. (c) Determinación de la textura de gel (analizador de textura) 2 g de almidón (TS) se pastificaron en 25 ml de H2O (cf. RVA) y se sellaron subsecuentemente herméticos al aire y almacenaron a 25°C durante 24 horas. Las muestras se fijan bajo la sonda (estampa redonda) de un analizador de texturas TA-XT2 por Micro Sistemas Estables y la textura de gel se determina con respecto a los siguientes parámetros: - velocidad de prueba 0.5 mm(s - profundidad de penetración 7 mm - área de contacto 1 13 mm2 - presión 3 g (d) Perfil de viscosidad 2 g de almidón (TS) se agregaron a 25 ml de H2O y pusieron en un Analizador Visco Rápido (Newport Scientific Pty Ltd. Investment Support Group, Warrieword NSW 2102, Australia) para su análisis. El dispositivo se operó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para determinar la viscosidad de la solución acuosa del almidón, antes que nada, la suspensión del almidón se calienta de 50°C a 95°C a una velocidad de 12°C por minuto. Después, la temperatura se mantiene por 2.5 minutos a 95°C. Subsecuentemente, la solución se enfría por debajo de 95°C a 50°C a una velocidad de 1 2°C por minuto. La viscosidad se determina durante el tiempo completo. La temperatura de pastificación se determina por medio de la inclinación de la gráfica de viscosidad dependiendo del tiempo. Si la inclinación de la gráfica es más elevada que 1 .2 (este valor se establece por el usuario), el programa de la computadora identifica la temperatura medida en este momento como temperatura de pastificación. (e) Determinación de glucosa, fructosa v sucrosa El contenido de glucosa, fructosa y sucrosa se determina de acuerdo al método descrito por Stitt et al. , (Methods in Enzymology 174 (1989), 518-552). (f) Análisis de la distribución de las cadenas laterales de la amilopectina La distribución de las cadenas laterales y la preparación se determina como se describe en Lloyd ef al., (Biochem. J. 338 (1999), 515-521 ). Se señala el hecho de que, utilizando dicho método, solamente la amilopectina se desramifica y que la amilosa se separa de la amilopectina antes de desramificarse por medio de precipitación de timol. Las siguientes condiciones para la elusión se seleccionan (ilustración simplificada, el perfil de elusión exacto se muestra en la Figura 19): tiempo 0.15 M NaOH 1 M NaAc en 0.15 M NaOH min % % 0 100 0 5 100 0 20 85 15 35 70 30 45 68 32 60 0 100 70 0 100 72 100 0 80 100 0 (9) Déte rminación del tamaño de granulo El tamaño de los granulos se determinó con un fotosedimentómetro del tipo "Lumosed" por Retsch GmbH, Alemania. La distribución del tamaño de granulo se determinó en una solución acuosa y se llevo a cabo de acuerdo a las indicaciones del fabricante así como también en la base de la literatura, por ejemplo, H. Pitsch, Korngróßenbestimmung; LABO-1988/3 Fachzeitschrift für Labortechnik, Darmstadt. (h) Determinación de la capacidad de unión de agua Para determinar la capacidad de unión de agua, el residuo se pesó después de separar las partes solubles del almidón hinchado a 70°C por medio de centrifugación. La capacidad de unión de agua (WBV) del almidón se determinó con referencia al peso inicial que se corrigió por la masa soluble. WBV (g/g) = (residuo - (peso inicial - proporción soluble))/(peso inicial -proporción soluble). Ejemplo 1 Aislamiento de una secuencia de ADN genómico que codifica una enzima de ramificación de Neisseria denitrificans- Para aislar la enzima de ramificación de Neisseria denitrificans, antes que nada, se establece una librería genómica. Para este propósito, las células de Neisseria denitrificans de la cepa depositada como ATCC 14686 en el ATCC se cultivaron en placas agrá de sangre Colombia y subsecuentemente se recolectaron. El ADN genómico se aisló y purificó de acuerdo al método por Ausubel ef al., (en: Current Protocols in Molecular Biology (1987); J. Wiley & Sons, NY). Después de una digestión de restricción parcial con la endonucleasa de restricción Sau3A, una ligación con ADN de vector de fago separado BamHI (lamdaZAPExprees por Stratagene) se llevó a cabo. Después de la escisión in vivo de la librería de fago, los plásmidos obtenidos se transformaron en el mutante de E. coli (PGM-) (Adhya y Schwartz, J. Bacteriol. 108 (1971 ), 621 -626). Cuando crece en maltosa, dicho mutante forma polisacáridos lineales que se vuelven azules después de colorear con yodo. 60,000 transformantes se colocaron en placas de agrá YT con IPTG (1 mM), canamicina (12.5 mg/l) y maltosa (1 %) y después de la incubación por 16 horas a 37°C, se vaporizaron con yodo. 60 colonias de bacterias que tuvieron un color rojo, café o amarillo después de la vaporización con yodo se seleccionaron y el ADN de plásmido se aisló a partir del mismo (Birnboim-Doly, Nucleic Acid Res. 7, 1513-1523). Los plásmidos aislados se utilizaron entonces para la retransformación del mismo mutanto de E.co//-(PMG) (Adhya y Schwartz, J. Bacteriol. 108 (1971 ), 621 -626). Después de la vaporización y colocación repetida con yodo, los clones podrían reducirse de 60 aislados a 40 aislados. Un análisis de restricción se llevó a cabo con estos cuatro plásmidos mostrando un fragmento EcoRI (1 .6 kb) que tuvo el mismo tamaño en todos los cuatro plásmidos (Figura 1 ): Ejemplo 2 Análisis de secuencia del fragmento genómico del piásmido pBB48 El fragmento EcoRI 1 .6 kb se aisló (Geneclean, Bio101 ) de un clon obtenido de acuerdo al Ejemplo 1 (pBB48) que tuvo una inserción de aproximadamente 3.9 kb en el vector pBK-CMV (Stratagene). Para secuenciación de ADN, el fragmento se clonó en el vector pBluescript que se ha dividido con EcoRI. El plásmido obtenido en esta manera se secuencia. Entonces, la secuencia de ADN completa que codifica la enzima de ramificación así como también la secuencia de las regiones laterales se determinaron por medio del plásmido pBB48 (SEQ ID NO. 1 ). El plásmido pBB48 se muestra en la Figura 1 . El plásmido se deposita bajo DSM 12425. Ejemplo 3 Expresión de la enzima de ramificación en células de E. coli recombinante En general, la enzima de ramificación endógena (glgB) se expresa en las cepas de laboratorio de E. coli. Por esta razón, el mutante de E. coli G6MD2 se utilizó para detectar la actividad de la enzima de ramificación. La cepa de E. coil Hfr G6MD2 (E. coli Centro de Almacenamiento Genético, Universidad de Yale, CGSC#5080) tuvo una eliminación extendida en la región de los genes de síntesis de glucano (glgA, glgB, glgC). Para detectar la actividad de la enzima de ramificación, dicho mutante se transformó con el plásmido pBB48 y un extracto crudo se preparó de las células propagadas. Las proteínas de dicho extracto crudo se separaron electroforéticamente en un gel de poliacrilamida y después se incubaron con y sin fosforilasa de conejo B (100 mM de citrato de sodio, pH 7.01 ; AMP; glucosa-1 -fosfato) para determinar la actividad de la enzima de ramificación. Las bandas violetas solamente aparecen en el gel estimulado con fosforilasa, que indicaron una fuerte actividad de la enzima de ramificación.

Ejemplo 4 Producción in vitro de a-1.4-glucanos a-1 ,6-ramificadas con extractos de proteína crudos en un sistema libre de célula Para la expresión de la enzima de ramificación, el mutante de E. coli G6MD2 se transformó con el plásmido pBB48. Las células se cultivaron con medio YT con canamicina (12.5 mg/l) durante 16 horas mientras se agita en un matraz Erlenmeyer. Después de la centrifugación (5000 x g), la pastilla obtenida se enjuagó con 100 mM de Tris/HCI pH 7.5, 1 mM DTT y, después de la suspensión en el mismo regulador, las células se interrumpieron con una sonda ultrasónica. Mediante otra centrifugación (10,000 x g), los residuos celulares se separaron de las proteínas solubles y un sobrenadante amarillento que tienen una concentración de proteína de aproximadamente 10 mg/ml se obtuvo. Del extracto crudo de proteína obtenido en esa manera, las diferentes cantidades (100 µl, 1 0 µl, 1 µi, 0.1 µl, 0.01 µl. 0.001 µl) se agregaron a una cantidad sin cambiar de una amilosucrasa en 50 ml de 100 mM de citrato de sodio, pH 7.0 con 20% de sucrosa y 0.02% de azida de sodio. Después de pocas horas, una primer nebulización se observó en la mezcla de reacción. Después de tres días, la mezcla se centrifugó y los productos formados se enjuagaron con agua desionizada. Los productos son solubles en DMSO y pueden caracterizarse al medir un espectro de absorción con solución de Lugol por medio de los cual el grado de ramificación de los productos formados puede estimarse. Para este propósito, la solución de DMSO se diluyó fuertemente con agua y la solución de Lugol se agregó y el espectro de 400 nm a 700 nm se midió inmediatamente en un espectrómetro Beckmann (cf. Figura 2). La separación de las cadenas laterales que se eliminaron con isoamilasa en una columna PA100 de Carbopak por medio de HPLC (DIONEX, agente de funcionamiento: 150 mM de NaOH con 1 M de gradiente de acetato de sodio) muestra el mismo patrón para un producto fuertemente ramificada como un glicógeno de hígado de rata desramificada con isoamilasa (Figura 3). Después de la incubación con una pululanasa, las cadenas laterales solamente se eliminaron a un grado muy pequeño. Ejemplo 5 Purificación de la enzima de ramificación y secuenciación de terminal N de la proteína Para aislar ia enzima de ramificación de Neisseria denitrificans de células de E. coli G6MD2 Hfr recombinante (ver arriba), que se han transformado con pBB48, primero un cultivo nocturno de dichas células se centrifugó. El precipitado celular se suspendió entonces en 3 volúmenes del regulador de interrupción y se interrumpió en la prensa Francesa a una presión de aproximadamente 16,000 a 17,000 psi. Después de la centrifugación a 10,000 g por una hora, el sobrenadante de diluyó para alcanzar 4 veces el volumen al agregar regulador de enjuague. Después, se unió a celulosa DEAE DE52 utilizando el método de carga y se llenó en una columna de cromatografía que se enjuagó con 2 a 3 volúmenes de regulador de enjuague. Subsecuentemente, un gradiente de 1 M NaCI lineal se aplicó para elusión . Las fracciones con la actividad de la enzima de ramificación se combinaron (ver Ejemplo 8), (NH4)2SO4 se agregó (concentración final 20% (p/p)) y se aplicó a una columna de TSK butilo Toyopearl 650M. Después de enjuagar con 2 a 3 volúmenes de columna de regulador HIC, al cual adicionalmente una solución de sulfato de amonio con un grado de saturación de 20% (1 14 g de sulfato de amonio por litro) se ha agregado antes, la enzima de ramificación se eluyó con regulador HIC utilizando un gradiente de sulfato de amonio que cae linealmente de 20% a 0%. Las fracciones con la actividad de la enzima de ramificación se combinaron. Para concentrar esta proteína, la etapa de purificación con las fracciones combinadas se repitió subsecuentemente utilizando una columna de TSK butilo Toyopear 650M pequeña (Tose Haas (Montgomery Ville, Pensilvania)). La proteína purificada se aplicó entonces a un gel de poliacrilamida, marcado en una membrana PVDF, disuelto de nuevo y secuenciado terminalmente en N por WITA GMBH, Teltow, Alemania, de acuerdo al método Edman. La secuencia obtenida fue: MNRNXH (SEQ ID NO. 3). Ejemplo 6 Purificación de una amilosucrasa Para producir una amilosucrasa, se utilizaron las células £. coli que se han transformado con un ADN que codifica una amilosucrasa de Neisseria polysaccharea. El ADN tiene ia secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO. 4 y se deriva de una biblioteca genómica de N. polysaccharea. Un cultivo nocturno de dichas células £. coli que secretan la amilosucrasa de Neisseria polysaccharea se centrifugaron y volvieron a suspender en aproxim . 1 /20 de volumen de 50 mM de regulador de citrato de sodio (pH 6.5), 10 mM DTT (ditiotreitol), 1 mM PMSF (fenilmetilsulfoniifluoruro). Después, las células se interrumpieron dos veces con una prensa Francesa a 16,000 psi. Subsecuentemente, 1 mM de MgCI2 y benzonasa (por Merck; 100,000 unidades; 250 unidades µl"1) se agregaron al extracto celular en una concentración final de 12.5 unidades ml" Después de eso, la mezcla se incubó a 37°C por al menos 30 min mientras se agita gentilmente. El extracto se dejó permanecer en hielo durante al menos 1 .5 horas. Después, se centrifugó a 4°C durante 30 min en aproximadamente 40,000 g hasta que el sobrenadante estuvo relativamente claro. Se llevó a cabo una pre-filtración con una membrana PVDF (Millipore "Durapore", o similar), que tuvo un diámetro de poro de 0.45 µm. El extracto se dejo permanecer durante la noche a 4°C. Antes de llevar a cabo la cromatografía Hl-(interacción hidrofóbica), se agregó NaCI sólido al extracto y se ajustó a una concentración de 2 M NaCl. Después, la mezcla se centrifugó de nuevo a 4°C durante 30 min a aproximadamente 40,000 mg. Subsecuentemente, los residuos restantes de E. coli se removieron del extracto al filtrarlo con una membrana PVDF (Millipore, "Durapore" de similar) que tuvo un diámetro de poro de 0.22 µm. El extracto filtrado se separó en una columna de butilsefarosa-4B (Pharmacia) (volumen de la columna: 93 ml, longitud: 17.5 cm). Aprox. 50 ml de! extracto que tiene una actividad de amilosa de 1 a 5 unidades µl" 1 se aplicaron a la columna. De esta manera, las proteínas sin unir se eliminaron por enjuague de la columna con 150 ml de regulador B (regulador B: 50 mM de citrato de sodio, pH 6.5, 2 M NaCI). Finalmente, la amilosucrasa se eluyó por medio de un gradiente NACÍ lineal que cae (de 2 M a 0 M de NaCI en 50 mM de citrato de sodio en un volumen de 433 ml a una velocidad de influjo de 1 .5 ml min"1) que se ha generado por medio de un sistema de bombeo automático (FPLC, Pharmacia). La elusión de la amilosucrasa ocurrió entre 0.7 M y 0.1 M de NaCl. Las fracciones se recolectaron, desalaron en una columna sefadex PD10 (Pharmacia), estabilizaron con 8.7% de glicerol, examinaron para actividad de sucrosa de amilosa y finalmente se criotrataron en regulador de almacenamiento (8.7% de glicerol, 50 mM de citrato). Ejemplo 7 Determinación de la actividad de amilosucrasa La actividad de amilosucrasa se determinó al incubar proteína purificada o extracto crudo de proteína en diferentes diluciones a 37°C en 1 ml de mezclas de reacción que contienen 5% de sucrosa,. 0.1 % de dextrin y 100 mM de citrato, pH 6.5. después de 0 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 240 min, 300 min y 360 min, 10 µl de cada uno se toman de dicha mezcla, y la actividad enzimática de la amilosucrasa se detuvo mediante el calentamiento inmediato a 95°C. Después, la proporción de la fructosa liberada por la amilosucrasa se determinó en una prueba fotométrica combinada. 1 µl a 10 µl de la muestra inactivada se pusieron en 1 ml de 50 mM de regulador de imidazola, pH 6.9, 2 mM MgCI2, 1 mM ATP, 0.4 mM NAD+ y 0.5 U/ml de hexoquinasa. Después de la adición secuencial de desgidrogenasa de glucosa-6-fosfato (de Leuconostoc mesenteroides) e isomerasa de fosfoglucosa, el cambio en la absorción se mide en 340 nm. subsecuentemente, la cantidad de fructosa liberada se calcula por medio de la ley Lambert-Beer. Si el valor obtenido se trae en relación con el tiempo cuando la muestra se toma, el número de unidades (1 U = µmol de fructosa/min) (por µl de extracto de proteína o µg de proteína purificada) puede determinarse. Ejemplo 8 Determinación de la actividad de la enzima de una enzima de ramificación de Neisseria denitrificans La actividad enzimática de la enzima de ramificación se determinó de acuerdo con un método descrito en la literatura (Krisman ef al., Analytical Biochemistry 147 (1985), 491 -496, Brown y Brown, Meth.

Enzymol. 8 (1966), 395-403). El método se basa en el principio de afinidad de unión de yodo reducida de glucanos ramificados en comparación con los a-1 ,4-glucanos no ramificados. Para determinar la actividad enzimática de la enzima de ramificación, una serie de muestras de varias diluciones de la enzima de ramificación se puso en una placa de micro-concentración enfriada.

Después, la reacción se inició al agregar 190 µl de una mezcla de reacción de amilosa (preparación ver arriba) e incubó a 37°C en un incubador.

Exactamente después de 30 min, la reacción se detuvo ai agregar 100 µl de solución de Lugol (0.5 mM) y las muestras se midieron en un dispositivo de lectura de micro-concentración (Dispositivos Moleculares) a 650 nm.

Una mezcla sin amilosa sirvió como control. La muestra de referencia con el valor de extinción máximo que contuvo amilosa pero la enzima de ramificación no tuvo un OD6o de 1 .2. Con objeto de comparar mejor los análisis independientes, solamente la dilución de muestra se utiliza para el cálculo que conduce a una reducción del ODßso por 0.5 unidades durante un tiempo de incubación de 30 min. Definición de una unidad de actividad (U) de la enzima de ramificación: La cantidad de enzimas que causa una reducción del OD6so por 0.5 unidades de 1.2 a 0.7 en 30 min en la prueba descrita se la mitad de una unidad de la enzima de ramificación. Preparación de la mezcla de reacción de amilosa: Mientras se agita, 1 ml de una solución de amilosa al 0.5% (fabricante: Fluka; amilosa de papa) p/v en DMSO se agregó a 10 ml de regulador de citrato de sodio (100 mM, pH 6.5, 0.02% p/v NaN3). Para medir, la solución de almacenamiento clara se diluye de nuevo con regulador de citrato de sodio a una proporción de 1 :4 a 1 :8. En la prueba, la absorción con solución de Lugol debe ser al menos 1 .2 en la muestra de referencia utilizada (máximo). Ejemplo 9 Producción de a-1 ,4-glucanos a-1 , 6-ramif icados que tienen diferentes grados de ramificación Para producir a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados que tienen diferentes grados de ramificación, ia amilosucrasa purificada de Neisseria polysaccharea (cf. Ejemplo 6) y una enzima de ramificación purificada de Neisseria denitrificans (cf. Ejemplo 5) se agregaron a una solución de sucrosa al 20% (p/v) en un volumen de reacción de 1 0.86 ml.

Dependiendo de la mezcia de la prueba, las dos enzimas se utilizaron en diferentes proporciones de actividad de proteína para cada uno (para la determinación de amilosucrasa ver Ejemplo 7; para la determinación de la enzima de ramificación ver Ejemplo 8) (ver Tabla 1 ): preparación de amilosucrasa: 6.2 U/mg; 1 .8 mg/ml preparación de enzima de ramificación: 75 U/mg; 6.9 mg/ml Tabla 1 Amsu = amilosucrasa unidades = para su determinación ver Ejemplos 7 y 8 Ejemplo 10 Determinación del grado de ramificación por medio de análisis de metilación El grado de ramificación de los glucanos obtenidos se determinó subsecuentemente por medio de un análisis de metilación. 1. Se llevaron a cabo examinaciones - metilación de todos los grupos OH libres de las muestras de glucano, cada vez de la doble determinación - hidrólisis de los polímero permetílados seguida por una reducción en C-1 y acetilación de la mezcla de monómero - análisis cromatográfico de gas y cuantificación de los productos de reacción. El grado de ramificación de las muestras de glucano se estableció por medio de un análisis de metiiación (cf. Figura 4). Los grupos OH libres del polímero se marcaron por conversión en metiléter. La degradación a monómeros se llevó a cabo en una manera hidrolítica de ácido y conduce a moléculas de glucosa parcialmente metiladas que se presentan en forma piranosídica/furanosídica y como a-y a-glucósidos. Estas variantes se enfoca por la reducción con NaBH4 en el derivado de sorbito parcialmente metilado. Mediante la acetilación subsecuente de los grupos OH libres los productos de reacción pueden examinarse por medio de cromatografía de gas. La siguiente tabla muestra la textura y la solubilidad de DMSO de los glucanos obtenidos.

Tabla 2 n.d. = no determinado 2. Parte Experimental a) Preparación de soluciones DMSO 1 % de soluciones (p/v) se prepararon en DMSO. No todas las muestras fueron solubles en agua temperatura ambiente: 1 , 3 y 1 3 tuvieron que calentarse durante 30 min a 1 10°C. Aparte de las soluciones 1 y 3, que fueron ligeramente nebulosas, hubo soluciones ópticamente claras (cf. Tabla 2). b) Metilación 2 ml de la solución DMSO (es decir, 20 mg de polímero) se transfirieron a un matraz de 50 ml de nitrógeno, agregaron a 5 equivaientes/OH (eq/OH) de solución de dimisilo recientemente preparada en un vapor de N2 y agitó durante 30 minutos. Las soluciones se volvieron nebulosas y viscosas. El contenido del matraz se congeló en un baño de hielo. 10 eq/OH de metilyodo se agregaron y, después del descongelado, la mezcla se agitó por al menos 2 horas. Antes de la segunda etapa de metilación y desprotonación, se removió metilyodo surplus al vacío. Después de remover el metilyodo surplus, el procesamiento se llevó a cabo al agregar 50 ml de agua y después extraer 5 veces con 10 ml de diclorometano. Cualquier indicio de DMSO se removió de la fase orgánica al extraer 3 veces con agua, después la fase orgánica se secó con CaCI2, filtró y concentró. Los productos fueron películas amarillentas, transparentes. Por medio de la muestra 7, se verificó primero cuantas etapas de metilación son necesarias para la permeación de los grupos hidroxilo. Después de la primer metilación, la mitad de la mezcla se procesó, la otra mitad se metilo de nuevo. Después de que ambas muestras se han degradado, los resultados de los análisis GC se compararon. Primero, se encontró que la reacción ha sido casi cuantitativamente después de una etapa de metilación (cf. Figura 5). Para identificar una ramificación posible en C-3, que también solamente parece estar presente debido a la sumetilación en dicha posición, una segunda metilación se llevó a cabo en cualquier caso. La Figura 5 muestra un diagrama de los resultados del análisis de la muestra 7 después de una y después de dos etapas de metilación; los valores para 2,3,6-metilación son 96.12% y 96.36%, respectivamente. c) Hidrólisis 2 mg de la muestra metilada se pesaron en un vidrio de presión de 1 ml, 0.9 ml de 2 M de ácido trifluoracético se agregaron y se agitó durante 2.5 horas a 120°C. Después de enfriar el vidrio, la mezcla se concentró en un vapor de N2. Para remover los indicios de ácido, se agregó tres veces tolueno y se extrajo. Tabla 3: Datos de la metilación muestra ! muestra 3. muestra 5 muestra ! muestra g muestra 11 muestra 13 método 1 peso inicial 21.9 22.7 21.7 32.5 23.4 22.6 23.5 (mg) (mmol) 0.135 0.140 0.134 0.200 0.144 0.139 0.145 peso resudante 30.4 29.2 28.0 251' 27.7 28.8 30.4 (mg) (mmol) 0.149 0.143 0.137 0.1221' 0.136 0.141 0.149 % de teoría 110 102 102 94 101 103 método 2 peso inicial 23.7 22.1 20.7 20.8 23.1 21.5 19.5 (mg) (mmol) 0.146 0.136 0.128 0.128 0.142 0.133 0.120 peso resultante 31.1 30.6 27.5 16.02> 31.4 29.4 25.5 (mg) (mmol) 0.152 0.150 0.135 0.0782' 0.154 0.144 0.125 % de teoría 104 110 105 6121 108 108 104 ~T5~ La mitad de esta muestra ya se tomó y procesó después de la primer etapa de metilación , de esta manera, ningún dato exacto se encuentra disponible. 2) La cantidad pequeña se debe a un error en procesamiento d) Reducción 0.5 ml de 0.5 M de solución de NaBD4 de amoniaco se agregó al resto de la etapa de reacción previa y se agitó durante 1 hora a 60°C. El reactivo se destruyó cuidadosamente con unas pocas gotas de ácido acético glacial. El borato resultante se removió al agregar cinco veces un 15% de ácido acético metanólico y subsecuentemente se extrajo como trimetiléster de ácido bórico. e) Acetilación 50 µl de piridina y 250 µl de anhídrido de ácido acético se agregaron al resto de la etapa de reacción previa y agitaron durante 2 horas a 95°C. Después de enfriar, la mezcla de reacción se goteó en 10 ml de NaHCO3 saturado y extrajo cinco veces con diclorometano. Los productos de reacción en la fase orgánica se examinaron por medio de cromatografía de gas (producto, cf. Figura 4). f) Cromatografía de gas Las examinaciones por medio de cromatografía de gas se llevaron a cabo utilizando un dispositivo por Cario Erby GC 6000 Serie Vega 2 con una entrada en columna y detector FID. Las separaciones se condujeron en una columna capilar de sílice fusionada llamada Supelco SPB5 (diámetro interior 0.2 mm, longitud 30 m), utilizando hidrógeno como un gas portador y una presión de 80 kPa. El siguiente programa de temperatura se utilizó: 60°C (1 min) -25°C/min ?1 30°C-4°C/min?280oC. 3. Resultados Las cromatografías de gas se analizaron al identificar los picos, integrar las áreas pico y corregir los datos por medio del concepto ECR por Sweet ef al., (Sweet ef al., Carbohydr, Res. 40 (1975), 217): Los compuestos 1 ,6-anhídros que podrían observarse en las muestras 1 y 3 se deben al alto grado de ramificación en C-6. Durante la hidrólisis, esto conduce a monómeros que tienen un grupo OH libre en C-6 que puede reaccionar además para formar estos derivados bajo las condiciones de reacción. Cuando se calcula el grado de ramificación, estas proporciones tienen que agregarse al valor "2,3-Me". La Figura 6 es una ilustración de las proporciones de unidades de glucosa ("23" Me) 6-enlazada y terminal (2346Me") de las muestras de glucano examinadas. Tabla 4: Resultados de los análisis en mol%: las abreviaciones (A, B; etc) corresponden a aquellas en la Figura 1 : "16AnhPy" = 1 ,6-anhidro-4-O-acetil-2,3-di-O-meti!-D-glucopiranosa, "16AnhFu" = 1 ,6 anhidro-5-O-acetil-2,3-di-O-metil-D-giucofuranosa; "Me1 " y "Me2" denotan dos análisis de metilación independientes de las muestras respectivas. muestra 1 muestra 3 Me1 Me2 valor promedio Me1 e2 valor promedio 16AnhPy 0.37 Indicios 0.19 Indicios Indicios - 16AnhFu 0.53 0.47 0.50 Indicios Indicios - 2346- e (A) 11.73 11.94 11.84 9.49 10.68 10.08 234- e (B) indicios Indicios - - - - 236- e (C) 76.37 77.80 77.09 82.97 80.67 81.82 23-Me (D) 9.75 9.16 9.46 7.54 8.34 7.94 26- e (E) 0.45 0.31 0.38 indicios 0.32 0.16 36-Me 0.44 0.31 0.38 indicios indicios - 2-Me 0.20 - 0.10 - - - 3-Me - - - - - - 6-Me - - - - - - Un- e 0.20 - 0.10 - - - muestrag muestra 7. e1 e2 valor promedio Me1 Me2 valor promedio 16AnhPy - - - - - - 16AnhFu - - - - - - 2346- e (A) 2.42 2.51 2.47 2.60 2.77 2.69 234- e(B) - - - - - - 236-Me (C) 95.54 96.18 95.86 96.36 96.89 96.63 23-Me (D) 1.36 1.05 1.21 0.48 0.33 0.41 26-Me (E) 0.37 indicios 0.19 0.26 indicios 0.13 36- e 0.30 0.26 0.28 0.29 indicios 0.15 2-Me - - - - 3-Me - - - - 6-Me - - - - Un- e - - - - muestra g muestra 11 Me1 Me2 valor promedio e1 Me2 valor promedio 16AnhPy - - - - - - 16AnhFu - - - - - - 2346- e (A) 2.89 2.79 2.84 2.60 2.49 2.55 234-Me (B) - - - - - - 236-Me (C) 95.62 95.62 95.62 96.21 97.20 96.70 23-Me (D) 0.67 0.69 0.68 0.52 0.31 0.42 26-Me (E) 0.36 0.42 0.39 0.36 indicios 0.18 36-Me 0.47 0.48 1.47 0.30 indicios 0.15 2-Me - - - - - - 3-Me - - - - - - 6- e - - - - - - Un-Me - - - - - - muestra 15 Me1 Me2 valor promedio 16AnhPy indicios indicios - 16AnhFu indicios indicios - 2346-Me (A) 8.91 7.46 8.19 234-Me (B) indicios indicios - 236-Me (C) 83.71 85.45 84.58 23-Me(D) 7.07 6.87 6.97 26-Me (E) 0.32 0.22 0.27 36-Me indicios indicios - 2-Me - - - 3-Me - - - 6-Me - - - Un-Me - - - Ejemplo 11 Producción de a-1 ,4-glucanos a-1.6-ra if icados que tienen diferentes pesos moleculares Para producir a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados que tienen diferentes pesos moleculares, una amilosucrasa purificada de Neisseria polysaccharea (cf. Ejemplo 6) y una enzima de ramificación purificada de Neisseria denitrificans (cf. Ejemplo 5) se agregaron a solución de sucrosa al 20% (p/v) en un volumen de reacción de 10.86 ml. Dependiendo de la mezcla de prueba, las dos enzimas se utilizaron en diferentes proporciones de actividad de la proteína (para la determinación de la actividad de la amilosucraa ver Ejemplo 7; para la enzima de ramificación ver Ejemplo 8 (cf. Tabla 1 ). Los pesos moleculares y el radio de inercia Rg se determinaron por medio de difusión de la luz (Light Scattering from Polymer Solutions, editor: Huglin. M. B. , Academic Press, Londres, 1972). Las muestras secas 1 -1 1 se disolvieron en DMSO, H2O (en una proporción de 90: 1 0) y diferentes diluciones (aprox. 2.5 g/l a 0.25 g/l) se analizaron en un dispositivo para medir la difusión de la luz (SOFICA, Societé francais d'instrumentos de controle et d'analyses. Le Mesnil Saint-Denis, Francia). Los datos obtenidos en esta manera fueron [... ]1 de acuerdo a Berry (J: Chem. Phys. 44 (1966), 4550 et seq.). Tabla 5 n.d. = no determinado nota del traductor: falta verbo Ejemplo 12 Construcción de un casette de expresión para transformar plantas para la expresión plastidial de una enzima de ramificación de Neisseria denitrificans Los oligonucleótidos BE-5' y BE-30 (SEQ ID NO. 6 y SEQ ID NO. 7) se utilizaron para amplificar la secuencia que codifica la enzima de ramificación de Neisseria denitrificans por medio de PCR iniciando del plásmido pBB48 (depositado con la Colección Alemana de microorganismos y cultivos celulares, DSMZ) en Braunschweig con el número de acceso DSM 12425). Las secuencias amplificadas resultantes del mismo se digirieron con las endonucleasas de restricción Salí y Sdal y se clonaron en el plásmido pBinAR-fnr que se dividió con Salí y Sdal. El plásmido que resulta de los mismos se denotó pBE-fnr-Km (Figura 9). Condiciones del PCR: El regulador y polimerasa por Boehringer Mannheim (polimerasa Pwo no.: 1644947) ADN 0.2 ng 10xregulador + MgSO4 5 µl dNTPs (10 mM cada uno) 1 µl carga inicial BE-5' 120 nM carga inicial BE-3' 120 nM polimerasa Pwo 1 .0 unidades agua destilada ad 50 µi Condiciones de reacción etapa 1 95°C 2:00 min etapa 2 95°C 0:30 min etapa 3 66°C 0:30 min etapa 4 72°C 2:00 min (más 1 seg. por ciclo) etapa 5 72°C 8:00 min Las etapas 2 a 4 se repitieron en 40 ciclos El plásmido pBE-fnr-Km se utilizó para transformar las plantas de papa de acuerdo a los métodos estándar (ver arriba). Ejemplo 13 Identificación y detección de plantas de papa transgénicas con actividad de la enzima de ramificación Por medio de análisis Northern blot, fue posible identificar de las plantas de papa transgénicas producidas de acuerdo al Ejemplo 12 plantas que despliegan un mARN de una enzima de ramificación de Neisseria denitrificans. Para detectar la actividad de la enzima de ramificación se criotrató en nitrógeno líquido y después se trituró en un mortero pre-enfriado con nitrógeno líquido. Antes de que el material triturado se descongele, el regulador de extracción se agregó (50 mM de citrato de sodio, pH 6.5, 4 Mm DTT, 2 mM de cloruro de calcio). Aprox. 200 µl de regulador de extracción se agregó a aproxi. 100 mg (peso fresco) de material de planta. Los componentes sólidos de la suspensión del material de planta triturado y el regulador de extracción se separaron por medio de centrifugación (10,000 x g). una alícuota del sobrenadante claro obtenido del mismo se mezcló con un cuarto del volumen de extracción del regulador de funcionamiento (40% de glicerol, 250 mM de Tris, pH 8.8, 0.02% de bromofenol azul) y se separó en un gel de poliacrilamida (ver abajo) en una intensidad constante de corriente de 20 mA por gel. (Antes de que los extractos de proteína se apliquen, una electrofóresis de los geles se llevó a cabo por 20 min bajo las condiciones arriba indicadas. Después de que el tinte de bromofenol azul en el regulador de funcionamiento ha pasado fuera del gel, la electrofóresis se detuvo. Entonces, el gel se equilibró cinco veces en regulador de enjuague (100 mM de citrato de sodio, pH 6.5) a temperatura ambiente a un volumen que fue cinco veces el volumen de gel durante 20 min cada uno mientras se agita. Subsecuentemente, el gel se incubó en regulador de incubación (100 mM de citrato de sodio, pH 6.5%, 5% de sucrosa, 0.625 unidades de amilosucrasa purificada de Neisseria polysaccharea (para purificación de la enzima y determinación de la actividad vista arriba) en una cantidad que es cinco veces la cantidad del volumen de gel a 30°C durante 16 horas. Después de decantar el regulador de incubación y después de agregar solución de Lugol (diluida en una proporción de 1 :5), el glucano que se forma por la amilosucrasa en combinación con la enzima de ramificación se vuelve visible como una banda azul-café (Figura 10). El gei de poliacrilamida restante completo se vuelve azul debido a la actividad de la amilosucrasa en el regulador de incubación. Composición del gel de poliacrilamida: a) gel de separación 375 Mm Tris, pH 8.8 7.5% de poliacrilamida (Biorad no. EC-890) para la polimerización: 1 /2 volúmenes de TEMED 1/100 volúmenes de persulfato de amonio b) gel de recolección 125 mM Tris, pH 6.8 4% de poliacrilamida (Biorad no. EC-890) para la polimerización; 1/2000 volúmenes de TEMED 1/100 volúmenes de persulfato de amonio c) regulador de electrofóresis 375 mM Tris, pH 8.8 200 Mmm de glicina Ejemplo 14 Análisis del almidón de plantas que tienen una actividad de la enzima de ramificación incrementada De acuerdo a las técnicas estándar, el almidón se aisló de plantas de papa transgénicas que se han producid de acuerdo a los Ejemplos 12 y 13 y se examinó con respecto a sus propiedades químicas y físicas. Se encontró que el almidón formado por las plantas de papa transgénicas difiere del almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre, por ejemplo en su contenido de fosfato y en la viscosidad y propiedades de pastificación determinadas por medio de RVA. Los resultados de la caracterización físico-química de los almidones modificados en base a las técnicas de análisis arriba descritas se muestran en la siguiente tabla.

Leyenda: 143-13A, 143-1 1A, 143-59A = plantas de papa transgénicas que sobreexpresan la enzima de ramificación de Neisseria denitrificans. RVA = Analizador Visco Rápido max. = viscosidad máxima = viscosidad pico min. = viscosidad mínima, fin. = viscosidad al final de la medición set. = retroceso = diferencia entre min y fin. T = temperatura de pasificación Excepto para el contenido de amilosa, los valores en por ciento se refieren al tipo silvestre (=100 %). Los resultados de los análisis RVA, el análisis de la distribución del tamaño de los granulos de almidón y la textura de gel también se muestran en la Figura 1 1 a 1 5. Además, la Figura 16 a 18 muestran los resultados de las cromatografías de HPLC que ilustran el patrón de la distribución de las cadenas laterales de las líneas 143-WT (=tipo silvestre), 143-1 3A y 143- 59A. La Figura 20, se muestra el porcentaje de desviación de las cadenas laterales que tienen una cierta longitud de cadena del tipo silvestre. Las siguientes dos tablas explican como las proporciones de las cadenas laterales se calcula. Tabla 7 Las áreas pico en las columnas A1 , A2, C1 y C2 se han determinado por medio del programa de aplicación Al 450, versión 3.31 por Dionex. Tabla 8 - Listado de Secuencias <110> PlantTec Biotechnclogie GmbH Max-?lanck-Gßsellschaft zur F?r erung der Wissenschaften ß.V. <120> Moléculas de ácido nucleico que codifican una enzima de ramificación de bacterias del genero Neisseria, y un método para producir aHa-1 ,4-glucanos alfa-1 ,6-tamificados <13Q> C1434PCT <140> <141> Seq ID.1: 2475 bp <160> 34 <1?0> Satentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2475 <212> ADN <213> Neisseria denitrificans <220> <221> CDS <222> (170) .. (2458) <400> 1 actgtatgcc gtgcagctgg aaaacctgct gggcgtacgc gacaacctca atattcccgg 60 cgtggccgaa ggctatccga actgggcgcg caaaatgccg cagcctctgg aagcctttgc 120 ccgccacccg caaatgggca agcagctfcgc catgatggga gacatccgc atg aac cga 178 Met Asn Arg 1 aac cgc cat ate cga cgc ggc tac cac^ ceg gaa ges gga gaa cgc caá 226 &sn Arg Bis He Arg Arg Gly Tyr His" Pro Glu Ala Gly Glu Arg Gln 5 10 15 ate ate gac age ctg ttt gee gee acc cae age gat ceg ttt gee tat 274 lie He Asp Ser Leu Phß Ala Ala Thr His Ser Asp Pro Phe Ala Tyr 25 30 35 ctt ggg cgg cat cgt gtc aac gac gaa cgc gaa gee gtg cgc gtg ctg 322 Leu Gly Arg His Arg Val Asn Asp Glu Arg Glu Ala Val Arg Val Leu 40 45 50 cgt ecc gac gcg cae cae ate gac ate ate gac cgc cae acá ggc gca 370 Arg Pro Asp Ma His His He Asp lie lie Asp Arg His Thr- Gly Ala 55 60 65 gtc ate atg ceg tet gaa aaa ate gac gag egc ggc ctg ttt gee gee 418 Val He Met Pro Ser Glu Lys He Asp Glu Arg Gly Leu Ehe Ala Ala 70 75 80 gta ttg ecc gaa cae gcg ecc gac tac gee ctg ctg gtg ac tac cae 466 Val Leu Pro Glu His Ala Pro Asp Tyr Ala Leu Leu Val Thr Tyr His 85 90 95 gag ggc gaa gee gee gta cgc gaa gaa gat gac tac cgc ttc ggc age 514 - Glu Gly Glu Ala Ala Val Arg Glu Glu Asp Asp Tyr Arg Phe Gly Ser 100 105 110 115 gcg ctg caá cat acc gat gcc tgg ctg ctg ggc gaa ggc acg cae ctg 562 Ala Leu Gln His Thr Asp Ala Trp Leu Leu Gly Glu Gly Thr His Leu 120 125 130 cgc ect tat gaa acg ctg ggc gca cat ttc gcc gaa atg gac ggc gta 610 Arg Pro Tyr Glu Thr Leu Gly Ala His Phß Ala Glu Met Asp Gly Val 135 140 145 tec ggc gtg cgc ttt gcc gtt tgg gcg ecc aac gcg cgg cgg gta teg 658 Ser Gly Val Arg Phe Ala Val Trp Ala Pro Aan Ala Arg Arg Val Ser 150 155 160 gtc ate ggc gaa ttc aac ggc tgg gac age cgc cgc cat gcc atg cgt 706 Val He Gly Glu Fhe Asn Gly Trp Asp Ser Ajrg Arg His Ala Met Arg 165 170 175 ceg cae acá ggc aac ggc ctg tgg gac ate ttt ate ecc ggc gtc ggc 754 Pro His Thr Giy Asn Gly Leu Trp Asp lie Phe He Pro Gly Val Gly 180 185 190 195 etc aac gcg ctg tat aaa tec tec gta etc gat gcc aac ggc aac ate 802 Leu Asn Ala Leu Tyr Lys Phe Ser Val Leu Asp Ala Asn Gly Asa He 200 205 210 cgc gaa aaa gcc gac cec tac gca ttc ggc gcg gag otg cgc ceg acc 850 Arg Glu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Gly Ala Glu Leu Arg Pro Thr 215 220 225 acc gca tec gtg gtg cgc ggc ttg ceg gcc aaa gec gaa gcg ecc get 898 Thr Ala Ser Val Val Arg Gly Leu Pro Ala Lys Ala Glu Ala Pro Ala 230 235 ; 240 ttc cgc cgc cgc gcc aac tce gtg gaa gcg ecc ate age att tac gaa 946 Phe Arg Arg Arg Ala Asn Ser Val Glu Ala Pro He Ser lie Tyr Glu 245 250 255 gtc cat etc ggc teg tgg egg cgc aat ecc gaa aac aac tac tgg etc 994 Val His Leu Gly Ser Trp Arg Arg Asn Pro Glu Asn Asr. Tyr Trp Leu 260 265 270 275 acc tac acg cag ctg gcc gac gaa ttg gtg aac tat gta aaa gac atg 1042 Thr Tyr Thr Gln Leu Ala Asp Giu Leu Val Asn Tyr Val Lys Asp Met 280 285 290 ggc ttc aec cae ate gág ctg ctg ecc ttg tec gaa tat ceg ttc gac 1090 Gly Phe Thr His He Glu Leu Leu Pro Leu Ser Glu Tyr Pro Phe Asp 295 300 305 ggc tea tgg ggc tac caá gcc acc ggc ctg tat gca ceg acc age cgc 1138 Giy Ser Trp Gly Tyr Gln Ala Thr Gly Leu Tyr Ala Pro Thr Ser Arg 310 315 320 ttc ggc teg ecc gat gag ctg aaa gcc ctg att gac gcc gcc cae gcc 1186 Phe Gly Ser Pro Asp Glu Leu Lys Ala Leu He Asp Ala Ala His Ala 325 330 " 335 gcc ggc ate age gtg att etc gac tgg gta gcg ggg cae ttc ecc acc 1234 Ala Gly Ha Ser Val He Lau Asp Trp Val Ala Gly Kis Phe Pro Thr 340 345 350 355 - - gac gac cae ggc etc aac acc ttc gac ggc acg gcg ctt tac gaa cae 1282 Asp Asp H?s Gly Leu Asn Thr Phe Asp Gly Thr Ala Leu Tyr Glu His 360 365 370 gcc gac ceg cgc gaa ggc tac cat cag gat tgg aac acg ctg att tac 1330 Ala Asp Pro Arg Glu Gly Tyr His Gin Asp Trp Asn Thr Leu He Tyr 375 380 385 aac ttc ggc cgc aac gaa gtc aaa aac ttc ctg cag ggc aac gcg etc 1378 ñsn Phe Gly Arg Asn Glu Val Lys Asn Phe Leu Gln Gly Asn Ala Leu 390 395 400 tac tgg att gag cgt ttc ggc ttc gac ggc ate cgc gtg gac gcc gtg 1426 Tyr Trp He Glu Arg Phe Giy Phe Asp Gly He Arg Val Asp Ala Val 405 410 415 gcc teg atg att tac cgc aac tac teg cgc aaa gac ggc gag tgg att 1474 Ala Ser Met He Tyr Arg Asn Tyr Ser Arg Lys Asp Gly Glu Trp He 420 425 430 435 eco aae cgc tac gge ggc age gaa aat ctg gaa gcc ate gcc ttt ttg 1522 Pro Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Glu Asn Leu Glu Ala He Ala Phe Leu 440 445 450 cgc caá acc aat gcc gtc tta aaa age gaa aea ecc ggc gcc ggc teg 1570 Arg Gln Thr Asn Ala Val Leu Lys Ser Glu Thr Pro Gly Ala Gly Ser 455 460 465 ttt goc gaa gaa teg act tec ttt gcc gac gta acc cge gaa gcc ggc 1618 Phe Ala Glu Glu Ser Thr Ser Phe Ala Asp Val Thr Arg Glu Ala Gly 47C 475 430 ctg aac ttc gat ttc aaa tgg aat atg ggc tgg atg aac gac acc ctg 1666 Leu Asn Phe Aso Phe Lys Trp Asn Met Gly Trp Me't Asn Asp Thr Leu 485 * 430 495 cge tat atg cag gaa gac ecc gtc cae cgc aaa Cae cae cae ggc aaa 1714 Arg Tyr Met Gln Glu Asp Pro Val His Arg Lys Tyr His His Gly Lys 500 505 510 515 atg acá ttc ggc atg atg tac ca tac age gaa aac ttc gtt ctg ecc 1762 Met Thr Phe Gly Met Met Tyr Gln Tyr Ser Glu Asn Phe Val Leu Pro 520 525 530 ctg teg cae gae gaa gtg gta cae ggc aaa cgc teg ctg ctg ggc aaa 1810 Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Arg Ser Leu Leu Gly Lys 535 540 545 atg ceg ggc gac tgc tgg cag cag ttt gcc aac ctg cge gcc tat tac 1858 Met Pro Gly Asp Cys Trp Gln Gln Phe Ala Asn Leu Arg Ala Tyr Tyr 550 555 ' 560 ggc ttt ^g tac ggc ttc ecc ggc aaa a=a etc cta ttt atg ggc aac 1906 Gly Phe Met Tyr- Gly Phe Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Asn S65 570 575 gaa ttt gcc ca ggc cgc gag tgg aat tat cag gaa gga erg gat tgg 1954 Glu Phe Ala Gln Gly Arg Glu Trp Asn Tyr Gln Glu Gly Leu Asp Trp 580 535 590 595 cat ctg etc gac gaa gcg ggc gge tgg cae aaa ggc gtg cag gat tat 2002 His Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Trp His Lys G,ly Val Gln Asp Tyr 600 605 610 gta cgc gac ctg aac cae ate tac at:c gcc cae gcc ceg etc tac eag 2050 Val Arg Asp "Leu Asn His He Tyr Thr Ala His Ala Pro Leu Tyr Gln 615 620 "625 etc gac cag cag ecc gag ggc ttt gaa tgg ctg gtg gcc gac gac age 2098 Leu Asp Gln Gln Pro Glu Gly Phe Glu trp Leu Val Ala Asp Asp Ser 630 635 640 gac aat teg gta ttc gta ttc gag cgc cgc gac cgc gca ggc aac cgc 2146 Asp Asn Ser Val Phe Val Phe Glu Arg Arg Asp Arg Ala Gly Asn Arg 645 650 655 ate ate gtc ate age aac ttt acc ceg gtg gtg cgc gaa cae tac cgc 2194 He He Val He Ser Asn Phe Thr Pro Val Val Arg Glu His Tyr Arg 660 665 670 675 ttc ggc gtc aac gcg ecc ggc cgc tat acc gaa ate ctg aat tec gac 2242 Phe GJ.y Val Asn Ala Pro Gly Arg Tyr Thr Glu He Leu Asn Ser Asp 680 685 690 cgc acg cag tat caá ggc age ggc ate gca aac ggc gcg gac ate acg 2290 Arg Thr Gln Tyr Gln Gly Ser Gly He Ala Asr. Gly Ala Asp He Thr 695 700 705 gcg gaa aac gtg ect teg cae ggc aaa gcg cag teg ctg age etg acc 2338 Ala Glu Asn Val Pro Ser His Gly Lys Ala Gln Ser Leu Ser Leu Thr 710 715 720 ctg ceg ecg ctg gcc acg gtc tat ctg tat cag aáa gcc gcg ecc gca 2385 Leu Pro Pro Leu Ala Thr Val Tyr Leu Tyr Gln Lys Ala Ala Pro Ala 725 730 735 acg gaa att cag acg gcc ttg cgc gcc gac aag cag ceg gcg gta aaa 2434 Thr Glu He Gln Thr Ala Leu Arg Ala Asp Lys Gln. Pro Ala Val Lys 740 745 750 755 gat aag cag gca aaa gcc aaa taa agcggcacca tactgee 2475 Asp Lys Gln Ala Lys Ala Lys 76C <210> 2 Seq IP :2:762a a. <211> 762 <212> PRT <213 Meisseria denitrificans <400> 2 Met Asn Arg Asn Arg His He Arg Arg Gly Tyr His Pro Glu Ala Gly -1 5 10 15 Glu Arg Gln Xle He Asp Ser Leu Phe Ala Ala Thr His Ser Asp Pro 20 25 30 Fhe Ala Tyr Leu Gly Arg His Arg Val Asn Asp Glu Arg Glu Ala Val 35 40 45 Arg Val Leu Arg Pro Asp Ala His His lie Asp He He A.sp Arg His 50 55 60 - - Thr Gly Ala Val He Met Pro Ser Glu Lys He Aep Glu Arg Gly Leu 65 70 75 80 Phe Ala Ala Val Leu Pro Glu His Ala Pro Asp Tyr Ala Leu Leu Val 85 90 95 Thr Tyr His Glu Gly Glu Ala Ala Val Arg Glu Glu Asp Aßp Tyr Arg 100 105 110 Phe Gly Ser Ala Leu Gln His Thr Asp Ala Trp Leu Leu Gly Glu Gly 115 120 125 Thr His Leu Arg Pro Tyr Glu Thr Leu Gly Ala His Phe Ala Glu Met 130 135 140 Asp Gly Val Ser Gly Val Arg Phe Ala Val Trp Ala Pro Asn Ala Arg 145 1S0 155 160 Arg Val Ser Val He Gly Glu Phe Asn Gly Trp Asp Ser Arg Arg His 165 170 175 Ala Met Axg Pro His Thr Gly Asn Gly Leu Trp Asp He Phe He Pro 180 185 190 Gly Val Gly Leu Asn Ala Leu Tyr Lys Phe Ser Val Leu Asp Ala Asn 195 200 205 Gly Asn He Arg Glu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe Gly Ala Glu Leu 210 215 220 Arg Pro Thr Thr Ala Ser Val Val Arg Gly Leu Pro Ala Lys Ala Glu 225 230 235 240 Ala Pro Ala Phe Arg Arg Arg Ala Asn Ser Val Giu Ala Pro He Ser 245 250 255 He Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg Arg Asn Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Trp Leu Thr Tyr Thr Gln Leu Ala Asp Glu Leu Val Asn Tyr Val 275 280 285 Lys Asp Met Gly Phe Thr His He Glu Leu Leu Pro Leu Ser Glu Tyr 290 295 300 Pro Phe Asp Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Ala Thr Gly Leu Tyr Ala Pro 305 310 315 320 Thr Ser Arg Phe Gly Ser Pro Asp Giu Leu Lys Ala Leu He A3p Ala 325 330 335 Ala His Ala Ala Gly He Ser Val He Leu Asp .Trp Val Ala Gly His 340 345 350 Phe Pro Thr Asp Asp His Gly Leu Asn Thr Phe Asp Gly Thr Ala Leu 355 360 365 Tyr Glu His Ala Asp Pro Arg Glu Giy Tyr His Gln Asp Trp Asn Thr 370 375 380 Leu He Tyr Asn Phe Gly Arg Asn Glu Val Lys Asn Phe Leu Gln Gly 385 390 395 400 Asn Ala Leu Tyr Trp He Glu Arg Fhe Gly Fha Asp Gly He Arg Val 405 410 415 Aso Ala Val Ala Ser Met He Tyr Arg Asn Tyr Ser Arg Lys Aso Gly 420 425 430 Glu Trp He Pro Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Glu Asn Leu Glu Ala He 435 440 445 Ala Phe Leu Arg Gln Thr Asn Ala Val Leu Lys Ser Glu Thr Pro Gly 450 455 460 *Ala Gly Ser Phe Ala Glu Glu Ser Thr Ser Phe Ala Aso Val Thr Arg 465 47C 475 " 480 Glu Ala Gly Leu Asn Phß Asp Phe Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn 485 490 495 Asp Thr Leu Arg Tyr Met Gln Glu Asp Pro Val His Arg Lys Tyr His 500 505 510 Hiß Gly Lys Met Thr Phe Gly Met Met Tyr Gln Tyr Ser Glu Asr. Phe 515 520 525 Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Arg Ser Leu 530 535 540 Leu Gly Lys Met Pro Gly Asp Cys Trp Gln Gln Phe Ala Asn Leu Arg 545 550 555 560 Ala Tyr Tyr Gly Phe Met Tyr Gly Phe Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe 565 570 575 Met Gly Asr. Glu Phe Ala Gln Gly Arg Glu Trp Asn Tyr Gln Glu Gly 580 585 590 Leu Asp Trp His Leu Leu Asp Glu Ala Gly Gly Trp His Lys Gly Val 595 600 605 Gln Asp Tyr Val Arg Asp Leu Asn Kis He Xyr Thr Ala His Ala Pro 610 615 62C Leu Tyr Gln Leu Asp Gln Gln Pro Giu Gly Phe Glu Trp Leu Val Ala 625 63C 635 640 Asp Asp Ser Asp Asn Ser Val Phe Val Fhe Glu Arg Arg Asp Arg Ala 645 650 655 Gly Asn Arg He He Val He Ser Asn Phe Thr Pro Val Val Arg Glu 660 665 670 His Tyr A g Phe Gly Val Asn Ala Pro Gly Arg Tyr Thr Glu Ha Leu 675 680 685 Asn Ser Asp Arg Thr Gln Tyr Gln Giy Ser Gly He Ala Asn Gly Ala 590 695 700 Asp He Thr Ala Glu Asn Val Pro Ser His Gly Lys Ala Gln Ser Leu 705 710 715 720 Ser Leu Thr Leu Pro Pro Leu Ala Thr Val Tyr Leu Tyr Gln Ly3 Ala - 725 730 735 Ala Pro Ala Thr Glu He Gln Thr Ala Leu Arg Ala Asp Lys Gln Pro 740 745 750 Ala Val Lys Asp Lys Gln Ala Lys Ala Lys 755 760 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 3 Met Asn Arg Asn Xaa His 1 5 <210> 4 <211> 2914 <212> ADN <213> Neisseria poiysaccharea <220 <221> CDS <222> (957) .. (2867} <400> 4 gagttttgcg ttcccgaacc gaacgtgatg -ettgagccga acacctgtcc ggcaaggcgg 60 ctgaccgccc ccttttgccc catcgaeatc gtaacaatcg gtttgg ggc aagctctttc 120 gctttgagcg tggeagaaag caaagtcagc acgtcttccg egctttgcgg catcaccgca 180 attttgcaga tgtccgcgcc gcagtcctcc atctgtttca gacggcatac gatttcttct 240 tgcggcggcg tgcggtgaaa ctcatgattg cagagcaggg cggcgatgcc gtttttttga 300 gcatgcgcca cggegcgccg gacggcggtt tcgccggaaa aaagctcgat atcgataatg 360 tcgggcaggc ggctttcaat cagcgagtcg agcagttcaa aataataatc gtccgaacac 420 gggaacgagc cgccttcgcc atgccgtctg aacgtaaaca gcagcggctt gtcgggcagc 480 gcgtcgcgga eggtetgogt gtggcgcaat acttcgccga tgctgeccgc gcattccaaa 540 aaateggcgc ggaactcgac gatatcgaag ggcaggtttt tgatttggtc aagtacggcg 6C0 gaaagtacgg cggcatcgcg ggcgacaagc ggcacggoga ttttggtgcg tcogcttocg 660 ataacggtgt ttttgacggt caggctggtg tgcatggc g ttgt gcggc tgaaaggaae 720 ggtaaagacg caattatagc aaaggcacag gcaatgttte agacggcatt tctgbgcggc 780 cggettgata tgaatcaagc agcatccgca tatcggaatg cagacttggc acaagccctg 840 tcttttctag tcagtccgca gttcttgcag t=tgattgca cgacacgccc taeacggcat 900 ttgcaggata cggcggcaga ccgccggtcg gaaacttcag aatc gagca ggcatc atg ¡¿59 Met 1 - ttg acc ecc acg eag caá gtc ggt ttg att tta cag tac etc aaa acá 1007 Leu Thr Pro Thr Gln Gln Val Gly Leu He Leu Gln Tyr Leu Lys Thr 5 10 15 cgc ate ttg gae ate tac acg ecc gaa cag cgc gec ggc ate gaa aaa 1CS5 Arg He Leu Asp He Tyr Thr Pro Glu Gln Arg Ala Gly He Glu Lys 20 25 30 toe gaa gac tgg egg e.ag ttt teg cgc cgc atg gat acg cat ttc ecc 1103 Ser Glu Asp Trp Arg Gln Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe Pro 35 40 45 aaa ctg atg aac gaa etc gac age gtg tac ggc aac aac gaa gee ctg 1151 Lys Leu Met Asn Glu Leu Asp Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Ala Leu 50 55 60 65 ctg ect atg ctg gaa atg ctg ctg gcg cag gca tgg caá age tat tec 119S Leu í?ro Met Leu Glu Met Leu Leu Ala Gln Ala Trp Gln Ser Tyr Ser 70 75 80 caá cgc aac tea tec tta aaa gat ate gat ate gcg cgc gaa aac aac 1247 Gln Arg Asn Ser Ser Leu Lys Asp He Asp He Ala Arg Glu Asn Asn 85 90 95 ecc gat tgg att ttg tec aac aaa caá gtc ggc ggc gtg tgc tac gtt 1295 Pro Asp Trp He Leu Ser Asn Lys Gln Val Gly Gly Val Cys Tyr Val 100 105 110 gat ttg ttt gcc ggc gat ttg aag ggc ttg aaa gat aaa att ect tat 1343 Asp Leu Phe Ala Gly Asp eu Lys Gly Leu Lys Asp Lys He Pro Tyr 115 120 125 ttt caá gag ett ggt ttg act tac. ctg cae ctg atg ceg ctg ttt aaa 1391 Phe Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Phe Lys 130 135 140 145 tge ect gaa ggc aaa age gae ggc ggc tat gcg gtc age age tac cgc 1439 Cys Pro Glu Gly Lys Ser Asp Gly Gly Tyr Ala Val Ser Ser Tyr Arg 150 155 160 gat gtc aat ceg gca ctg ggc acá ata ggc gac ttg cge gaa stc att 1487 Asp Val Asn Pro Ala Leu Gly Thr He Gly Asp Leu Arg Glu Val He 165 170 175 gct gcg ctg cae gaa gcc ggc att tec goc gtc gtc gat ttt ate ttc 1535 Ala Ala Leu His Glu Ala Gly He Ser Ala Val Val Asp Phe He Phe 180 185 190 aac cae acc tec aae gaa cae gaa tgg gcg caá cgc tgc gcc gcc ggc 1583 Asn His Thr Ser Asn Glu His Glu Trp Ala Gln Arg Cys Ala Ala Gly 195 200 205 gac ceg ett ttc gac aat ttc tac tat att ttc eco gac cgc cgg atg 1631 Asp Pro Leu Phe Asp Asn Phe Tyr Tyx He Phe Pro Asp Arg Arg Met 210 215 220 225 ecc gae caá tac gac cgc acc ctg cgc gaa ate ttc ecc gac cag cae 1679 Pro Asp Gln Tyr Asp Arg Thr Leu Arg Glu He Phe Pro Aso Gln His 230 235 " 240 ceg ggc ggc ttc teg caá ctg gaa gac gga cgc tgg gtg tgg acg acc 1727 Pro Gly Gly Phe Ser Gln Leu Glu Asp Gly Arg Trp Val Trp Thr Thr 245 250 255 ttc aat tec ttc ca tgg gac ttg aat £ac age aac ceg tgg gta ttc 1775 Phe Asn Ser Phe Gln Trp Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Val Phe 260 265 " 270 cgc gca atg gcg ggc gaa atg ctg ttc ett gcc aac ttg ggc gtt gac 1823 Ar? Ala Met Ala Gly Glu Met Leu Phe Leu Ala Asn Leu Gly Val Asp 275 280 285 ate ctg cgt atg gat gcg gtt gcc ttt att tgg aaa ca atg ggg ac 1371 lie Leu Arg Met Asp Ala Val Ala Phe He Trp Lys Gln Met Gly Thr 290 295 300 305 age tgc gaa aac ctg ceg eag gcg cae gcc etc ate cgc gcg ttc aat 1919 Ser Cys Glu Asn Leu Pro Gln Ala His Ala Leu He Arg Ala Phe Asn 310 315 320 gec gtt atg egt att gcc gcg cce gec gtg ttc ttc aaa tce gaa gcc 1967 Ala Val Met Arg Hs Ala Ala Pro Ala Val Phe Phe Lys Ser Glu Ala 325 330" 335 ate gtc cae cec gac ca gtc gtc ca tac ate ggg cag gac gaa tgc 2015 He Val His Pro Asp Gln Val Val Gln Tyr He Gly Gln Asp Glu Cys 340 345 350 caá ate ggt tac aac cec ctg caá atg gca ttg ttg tgg aac acc ett 2063 Gln He Gly Tyr Asn Pro Leu Gln Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr Leu 355 360 365 gcc acg cgc gaa gtc aac ctg etc cat cag gcg ctg ace tac cgc cae 2111 Ala Thr Arg Glu Val Asn Leu Leu His Gln Ala Leu Thr Tyr Arg His 370 375 380 385 aac ctg ecc gag cat acc gcc tgg gtc aac tac gtc cgc age cae gac 2159 Asr. Leu Pro Glu His Thr Ala Trp Val Asn Tyr Val Arg Ser His Asp 390 395 400 gao ate ggc tgg acg ttt gcc gat gaa gac gcg- gca tat ctg ggc ata 2207 Asp He Gly Trp Thr Phe Ala Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu Gly He 405 410 4.15 age ggc tac gac cae cgc caá ttc etc aac cgc ttc ttc gtc aac cgt 2255 Ser Gly Tyr Asp His Arg Gln Phe Leu Asn Arg Phe Phe Val Asn Arg 420 425 430 ttc gac ggc age ttc gct cgt gge gta ceg ttc caá tac aac cea age 2303 Phe Asp Gly Ser Phe Ala Arg Gly Val Pro Phe Gln Tyr Asn Pro Ser 435 440 445 acá ggc gac tgc cgt gtc agt ggt acá gcc gcg gca ttg gtc ggc ttg 2351 Thr Gly Asp Cys Arg Val Ser Gly Thr Ala Ala Ala Leu Val Gly Leu 450 455 460 465 gcg caá gac gat ecc cae gcc gtt gac cgc ate aaa etc ttg tac age 2399 Ala Gln Asp Asp Pro His Ala Val Asp Arg He Lys Leu Leu Tyr Ser 470 475 " 480 att gct ttg agt acc ggc ggt ctg ceg ctg att tac cta ggc gac gaa 2447 He Ala Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu Xle Tyr Leu Gly Asp Glu 485 490 95 gtg ggt acg etc aat gac gac gac tgg teg caá gac age aat aag age 2495 Val Gly Thr Leu Asn Asp Aso Asp Trp Ser Gln Asp Ser Asn Lys Ser 500 " 505 510 gac gac age cgt tgg gcg cae egt ceg cgc tac aac gaa gcc ctg tac 2543 Aso Asp Ser Arg Trp Ala His Arg Pro Arg Tyr Asn Glu Ala Leu Tyr 515 520 525 gcg eaa cgc aac gat ceg teg ace gca gcc ggg ca ate tat cag ggc 2591 Ala Gln Arg Asn Asp Pro Ser Thr Ala Ala Gly Gln He Tyr Gln Gly 530 535 540 545 ttg cge cat atg att gec gtc cgc caá age aat ecg cgc ttc gac ggc 2639 Leu Arg His Met He Ala Val Arg Gln Ser Asn Pro Arg Phe Asp Gly 550 555 560 ggc agg ctg gtt acá ttc aac acc aac aac aag cae ate ate ggc tac 2687 Gly Arg Leu Val Thr Phe A-sn Thr Asn Asn Lys His He He Gly Tyr 565 570 S75 ate cgc aac aat gcg ett ttg gea tte ggt aac ttc age gaa tat ocg 2735 lie Arg Asn Asn Ala Leu Leu Ala Phe Gly Asn Phe Ser Glu Tyr Pro 580 585 590 caá acc gtt acc gcg cat aeo ctg caá gec atg eco ttc aag gcg cae 2783 Gln Thr Val Thr Ala His Thr Leu Gln Ala Met Pro Phe Lys Ala His 595 600 605 gac etc ate ggt ggc aaa act gtc age ctg aat cag gat ttg acg ett 2331 Asp Leu He Gly Gly Lys Thr Val Ser Leu Asn Gln Asp Leu Thr Leu 610 615 620 625 cag ecc tat cag gte atg tgg etc gaa ate gcc tga cgcacgcttc 2377 Gln Pro Tyr Gln Val Met Trp Leu Glu He Ala 630 635 ccaaatgccg tctgaaccgt ttcagaeggc atttgcg 2914 <210> 5 <211> 636 <212> PRT <213> eisseria polysaccharea <400> 5 Met Leu Thr Ero Thr Gln Gln Val Gly Leu He Leu Gln Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Thr Arg He Leu Asp He Tyr Thr Pro Glu Gln Arg Ala Gly He Glu 20 25 30 Lys Ser Glu Aso Trp Arg Gln Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe 35 " 40 45 Pro Lys Leu Met Asn Glu Leu Asp Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Ala 50 55 60 Leu Leu Pro Met Leu Giu Met Leu Leu Ala Gln Ala Trp Gln Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Arg Asn Ser Ser Leu Lys Asp He Asp He Ala Arg Glu Asn 85 90 95 Asn Pro Asp Trp He Leu Ser Asn ys Gln Val Gly Gly Val Cys Tyr 100 105 110 Val Aso Leu Phe Ala Gly Asp Leu Lys Gly Leu Lys Asp Lys He Pro 115 " 120 125 Tyr Phe Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Phe 130 135 140 Lys Cys Pro Glu Gly Lys Ser Asp Gly Gly Tyr Ala Val Ser Ser Tyr 145 150 155 160 Arg Aap Val Asn Pro Ala Leu Gly Thr He Gly Aso Leu Arg Glu Val 165 170 " 175 He Ala Ala Leu His Glu Ala Gly He Ser Ala Val Val Asp Phe He 180 185 190 Phe Asn His Thr Ser Asn Glu His Glu Trp Ala Gln Arg Cys Ala Ala 195 200 205 Gly Asp Peo Leu Phe Asp Asa Phe Tyr Tyr He Phe Pro Asp Arg Arg 210 215 220 Met Pro Asp Gln Tyr Asp Arg Thr Leu Arg Giu He Phe Pro Asp Gln 225 230 235 240 His Pro Gly Gly Phe Ser Gln Leu Glu Asp Gly Arg Trp Val Trp Thr 245 250 255 Thr Ehe Asn Ser Phe Gln Trp Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Val 260 265 270 Phe Arg Ala Met Ala Gly Glu Met Leu Phe Leu Ala Asn Leu Gly Val 275 280 285 Asp He Leu Arg Met Asp Ala Val Ala Phe He Trp Lys Gln Met Gly 290 295 300 Thr Ser Cyß Glu Aßn Leu Pro Gln Ala His Ala Leu He Arg Ala Phe 305 310 315 320 Asn Ala Val Met Arg He Ala Ala Pro Ala Val Phe Phe Lys Ser Glu 325 330 335 Ala He Val His Pro Asp Gln Val Val Gln Tyr He Gly Gln As? Glu 340 345 350 Cys Gln He Gly Tyr Asn Pro Leu Gln Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr 355 360 365 Leu Ala Thr Arg Glu Val Asn Leu Leu His Gln Ala Leu Thr Tyr Arg 370 375 380 His Asn Leu Pro Glu His Thr Ala Trp Val Asn Tyr Val Arg Ser Hrs 385 390 395 400 Asp Asp He Gly Trp Thr Phe Ala Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu Gly 405 410 415 He Ser Gly Tyr Asp His Arg Gln Phe Leu Asn Arg Phe Phe Val Asn 420 425 430 Arg Phe Asp Gly Ser Phe Ala Arg Gly Val Pro Phe Gln Tyr Asn Pro 435 440 445 Ser Thr Gly Asp Cys Arg Val Ser Gly Thr Ala Ala Ala Lßd- Val Gly 450 455 460 Leu Ala Gln Asp Asp Pro His Ala Val Asp Arg He Lys Leu Leu Tyr 465 470 475 480 Ser He Ala Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu He Tyr Leu Gly Asp 485 490 495 Glu Val Gly Thr Leu Asn Asp Asp A3p Trp Ser Gln Asp Ser Asn Lys 500 505 510 Ser Asp Asp Ser Arg Trp Ala Kis Arg Pro Arg Tyr Asn Glu Ala Leu 515 520 525 Tyr Ala Gln Arg Asn Asp Pro Ser Thr Ala Ala Gly Gln He Tyr Gln 530 535 540 Gly Leu Arg His Met He Ala Val Arg Gln Ser Asn Pro Arg Phe Asp 545 550 555 560 Gly Gly Arg Leu Val Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys His He He Giy 565 570 575 Tyr Xle Arg Asn Asn Ala Leu Leu Ala Phe Gly Asn Phe Ser Glu Tyr 580 585 590 Pro Gln Thr Val Thr Ala His Thr Leu Gln Ala Met Pro Phe Lys Ala 595 600 605 His Asp Leu He Gly Gly Lys Thr Val Ser Leu Asn Gln Asp Leu Thr 610 615 620 Leu Gin Pro Tyr Gln Val Met Trp Leu Glu He Ala 625 630 635 <210> 6 <211> 27 <212> ADN < 13 > Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia Artificial <400> 6 gtcgacatga accgaaaccg ccaratc <210> 7 <2H> 29 <212> ADN < 13 > Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia Artificial <400> 7 :ctgcaggta tggtgocgct tfcatttggc 29 :212> PRT :213> Neisseria denitrificans í400> 8 4et Asn Arg Asn Arg His He 1 5 <210> 9 C211> 6 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 9 Arg Pro Asp Ala His His 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 10 His Ala Pro Asp Tyr Ala Leu 1 5 <21Q 11 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 11 Glu Gly Glu Ala Ala 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 12 Asp Asp Tyr Arg Phe 1 5 - - <210> 13 <211> 5" <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 13 Ser Ala Leu Gln His 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 14 Tyr Glu Thr Leu Gly 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 15 Val Ser Gly Val Arg 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 16 Val Sar Val He Gly 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 17 Phe Asn Gly Trp Asp 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 18 Leu Tyr Lys Phe Ser 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 19 Pro Tyr Ala Phe Gly 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 20 Arg Ero Thr Thr Ala Ser 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 21 Phe Arg Arg Arg Ala 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 22 Asp Glu Leu Val Asn Tyr 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseriá denitrificans <400> 23 Leu Pro Leu Ser Glu Tyr 1 5 - <210> 24 <211> S <212> PRT <213> Weisseria denitrificans <400> 24 Tyr Gln Ala Thr Gly Leu 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> t?eisseria denitrificans <400> 25 Asp Asp His Gly Leu 1 5 <210> 26 <211> 5 <2Í2> PRT <213> Neisseria denitrifícans <400> 26 His Gln Asp Trp Asn 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 27 Asp Giy He Arg Val 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 28 Tyr Gly Gly Ser Glu Asn 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 29 Ser Phe Ala Glu Glu Ser - <210 30 <211> 5 <212> l'RT <213> Weisseria denitrifieans <400> 30 Asp Pro Val His Arg 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Neissßria denitrifieans <400> 31 Trp Gln Gln Phe Ala Asn 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Neiaseria denitrificans <400> 32 Glu He Leu Asn Ser 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Neisseria denirrificans <400> 33 Ala Thr Glu He Gln Thr Ala Leu 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Neisseria denitrificaps <400> 34 Val Lys Asp Lys Gln Ala Lys Ala Lys 1 5 2C4 17

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima de ramificación de una bacteria del género Neisseria seleccionada del grupo que consiste de (a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO. 2; (b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la región de codificación representada en la SEQ ID NO. 1 ; (c) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la inserción en el plásmido DSM 12425; (d) moléculas de ácido nucleico que comprenden la región de codificación para una enzima de ramificación, que se contiene en la inserción del plásmido DSM 12425; (e) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, la secuencia de la cual tiene, en los primeros 100 aminoácidos, una homología de al menos 65% a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO. 2; (f) moléculas de ácido nucleico, la cepa complementaria de las cuales, se hibridiza una molécula de ácido nucleico de (a), (b), (c), (d) y/o (e) y que codifican una enzima de ramificación de una bacteria del género Neisseria; y (g) moléculas de ácido nucleico, la secuencia de las cuales, se desvía de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (f) debido a la degeneración del código genético.
2. 2. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1 .
3. 3. El vector según la reivindicación 2, caracterizado porque la moíécula de ácido nucleico se enlaza en orientación de sentido a secuencias reguladoras que garantizan la transcripción en células eucarióticos o procarióticos.
4. 4. Una célula huésped que se modifica genéticamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1 o con un vector de acuerdo a la reivindicación 2 o 3.
5. 5. Un método para producir una enzima de ramificación de una bacteria del género Neisseria, en donde una célula huésped de acuerdo a la reivindicación 4 se cultiva bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína, y en donde la proteína se aisla de las células cultivadas y/o el medio de cultivo.
6. 6. Un método para producir una enzima de ramificación de una bacteria del género Neisseria, en donde la proteína se produce en un sistema de traducción y transcripción in vitro utilizando una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación.
7. 7. Una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1 u obtenible por un método de acuerdo a la reivindicación 5 o 6.
8. 8. Un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína de acuerdo a la reivindicación 7.
9. 9. El uso de una proteíná de acuerdo a la reivindicación 7 para producir a-1 ,4-glucanos a-1 ,6-ramificados en sistemas in vitro.
10. 10. Una célula de planta transgénica que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se enlaza a secuencias reguladoras que garantizan la transcripción en células vegetales. 1 1 . La célula de planta transgénica según la reivindicación 10, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se enlaza a una secuencia que codifica una secuencia de señal que garantiza la ubicación de la proteína codificada en los plástidos de las células. 12. Una planta transgénica que contiene células vegetales de acuerdo a la reivindicación 10 u 1 1 . 13. Un método para producir una planta transgénica, en donde (a) una célula vegetal se modifica genéticamente al introducir una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1 o un vector de acuerdo a la reivindicación 2 o 3; (b) una planta se regenera de la célula producida de acuerdo a la etapa (a); y (c) opcionalmente plantas adicionales se producen de la planta producida de acuerdo a la etapa (b). 14. Las partes que se pueden recolectar de las plantas de acuerdo a la reivindicación 1 2 o de las plantas obtenibles por un método de acuerdo a la reivindicación 1 3, en donde dichas partes de las plantas contienen células de planta transgénica de acuerdo a la reivindicación 10 u 1 1 . 15. El almidón obtenible de células de planta transgénica de acuerdo a la reivindicación 10 u 1 1 , de plantas transgénicas de acuerdo a la reivindicación 12, de plantas transgénicas obtenibles por un método de acuerdo a la reivindicación 13 o de partes de plantas de acuerdo a la reivindicación 14. 16. El almidón según la reivindicación 15, caracterizado porque la composición del almidón se modifica en tal manera que tiene una textura de gel incrementada y/o un contenido de fosfato reducido y/o una viscosidad pico reducida y/o una temperatura de pastificación reducida y/o un tamaño reducido de los granulos de almidón y/o una distribución modificada de las cadenas laterales en comparación con el almidón de las plantas de tipo silvestre correspondientes. 17. Una región reguladora que controla naturalmente la transcripción de una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1 en células bacteriales. 18. La región reguladora de acuerdo a la reivindicación 17 que contiene una secuencia nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) secuencias de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1 a 169 de la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO. 1 ; (b) la secuencia de nucleótidos de la región reguladora que se contiene en la inserción del plásmido DSM 1 2425, o partes de la misma; (c) secuencias de nucleótidos que se hibridizan a las secuencias de (a) o (b) bajo condiciones exigentes. 19. Un método in vitro para producir a-1 ,4-glucanos a-1 , 6-ramificados utilizando una sucrosa de substrato y una combinación de enzimas de una amilosucrasa y una enzima de ramificación. 20. El método según la reivindicación 19, caracterizado porque la enzima de ramificación se codifica por una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1 .