CN101386864B - 编码奈瑟氏球菌属细菌分支酶的核酸分子以及α-1,6-分支α-1,4-葡聚糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码奈瑟氏球菌属细菌分支酶的核酸分子，含有该核酸分子的载体、宿主细胞、植物细胞和植物，以及可从所述植物获得的淀粉。本发明还涉及基于蔗糖和淀粉蔗糖酶与分支酶的酶组合体外制备α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的方法。此外，本发明涉及可采用该方法获得的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖。

Description

编码奈瑟氏球菌属细菌分支酶的核酸分子以及α-1,6-分支α-1,4-葡聚糖的制备方法

本发明涉及编码奈瑟氏球菌属(Neisseria)细菌分支酶的核酸分子，含有该核酸分子的载体、宿主细胞、植物细胞和植物，以及可从所述植物获得的淀粉。而且，本发明涉及基于蔗糖和淀粉蔗糖酶和分支酶的酶组合体外制备α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的方法。此外，本发明涉及可通过所述方法获得的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖。 

在许多方面，α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖有着极大的意义，因为它们适用于例如制药和化妆品工业中产品的生产。它们可用作例如片剂的粘合剂、药物的载体物质、包装材料、粉末添加剂的载体物质、防晒霜中吸收紫外光的添加剂和调味剂与香水的载体物质。 

在植物中，α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖主要以支链淀粉(一种淀粉成分)的形式存在。在动物和细菌中，葡聚糖主要以糖原形式存在。 

多糖类淀粉由化学上一致的基本结构单元葡萄糖分子形成。然而它是一种不同形式分子的复杂混合物，这些分子在聚合和分枝程度上不同，因此这些分子的物理和化学性质也极为不同。必须区分直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉是α-1，4-糖苷键连接的葡萄糖单位形成的基本上不分支的聚合物，而支链淀粉是一种分支聚合物，其中分支链是由于存在另外的α-1，6-糖苷键连接而形成的。根据教科书(Voet和Voet，生物化学(Biochemisty)，John Wiley & Sons，1990)，平均每24-30个葡萄糖残基出现一个α-1，6-分支链，这相应于大约3％-4％的分支程度。分支程度依据相应淀粉的来源(即植物种，植物品种)而不同。在典型用于淀粉工业生产的植物中，总淀粉中直链淀粉的含量在10％-25％之间。制备具有不同分支程度的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的各种方法已有描述，这些方法包括(转基因)植物的使用。 

例如，与野生型植物相比，细菌糖原合成酶在马铃薯植物中的异源表 达导致直链淀粉含量的轻度降低、分支程度的增加以及支链淀粉分支方式的改变(Shewmaker等，Plant.Physiol.104(1994)，1159-1166)。而且观察到，大肠杆菌的分支酶(glgB)在无直链淀粉的马铃薯突变体(amf)(Jacobsen等，Euphytica 44(1989)，43-48)中的异源表达导致支链淀粉的分支点比对照(amf)多25％(Korestee等，植物杂志(Plant J.)10(1996)，83-90)。为了分离转基因植物中产生的具有不同分支程度的葡聚糖，必须进行额外的纯化步骤以除去例如直链淀粉成分。这些纯化步骤是繁琐的，因此也耗时和昂贵。而且，依靠这些方法是不可能获得特定的分枝程度。况且，由于实验条件(环境因素，场所)的变化，就产品质量而言这些体内方法变化甚大。 

糖原比支链淀粉具有更高的分支程度。该多糖也含有α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖。在侧链平均长度和聚合度方面糖原也不同于淀粉。根据教科书(Voet和Voet，Biochemistry，John Wiley & Sons，1990)，糖原中平均每8-12个葡萄糖残基后有一个α-1，6-分支点。这相应于大约8％-12％的分支程度。对于糖原的分子量有不同的数值，范围从1百万至10亿以上(D.J.Manners著：糖化学进展(Advances in CarbohydrateChemistry)，M.L.Wolfrom编，Academic Press，纽约(1957)，261-298；Geddes等，Carbohydr.Res.261(1994)，79-89)。这些数值还极大地取决于相应生物来源、其营养状态和分离糖原的方法种类。通常糖原回收自贝类(如贻贝(Mytillus edulis))、哺乳动物的肝脏或肌肉(例如兔，大鼠)(Bell等，Biochem.J.28(1934)，882；Bueding和Orrell，J.Biol.Chem.263(1961)，2854)。这使得工业化规模的生产非常耗时和昂贵。 

所描述的天然存在的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖，即淀粉和糖原，随其1，6-糖苷键支链的含量不同而有非常大的差异。同样，其溶解性、透明度、酶水解性质、流变能力、胶体形成和退化性质也有非常大的差异。然而，对于许多工业应用，并不是总能允许这些性质的变化。体外方法是从植物或动物有机体回收α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的替代方法。与体内方法相比，体外方法一般可获得更好的控制，而且具有更大程度的可重复性，这是因为与活体中的条件相比，体外反应条件可被精 确调节。通常这允许产生具有高度均一性和纯度，并因此具有高质量的固定产物，这对于任何进一步的工业应用均是非常重要的。具有稳定质量的产物的制备降低了费用，因为制备必需的程序参数并不需对每一个制备装置进行优化。某些体外方法的另一个优点是产物不含有用于体内方法的有机组织。这对于食品和制药工业中的特定应用而言是绝对必需。 

一般地，体外方法可分为不同的两组。在第一组方法中，不同底物例如直链淀粉、支链淀粉和糖原均受到分支酶活性的作用。Borovsky等(Eur.J.Biochem.59(1975)，615-625)证明，采用马铃薯的分支酶和直链淀粉底物，可产生与支链淀粉类似但结构不同的产物。此外，Boyer和Preiss(Biochemistry 16(1977)，3693-3699)指出，可使用从大肠杆菌纯化的分支酶(α-1，4-葡聚糖：α-1，4-葡聚糖6-糖基转移酶)以增加直链淀粉或支链淀粉的分支程度。然而，如果将大肠杆菌或家兔肝的糖原与大肠杆菌的分支酶一起孵育时，仅可获得分支程度的轻度增加(Boyer和Preiss，同上)。 

之后Rumbak等(J.Bacterial.173(1991)，6732-6741)也通过溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的分支酶与直链淀粉、支链淀粉和糖原的共孵育，增加了这些底物的分支程度。Okada等采用相似的方法(美国专利4454161)改善了含淀粉食物的性质。他们将底物如直链淀粉、支链淀粉、淀粉或糊精与分支酶一起孵育。这对含有相应被改性物质的食物的稳定性(durability)产生有利的影响。而且，专利申请EP-A10 690 170描述了，当使用分支酶时胶状淀粉在水溶液中的反应。这产生在造纸方面具有有利性质的淀粉。 

然而，由于离析物(educt)的不同分支程度(如淀粉、支链淀粉等)，前述体外方法具有不可能产生均一产物的缺点。此外，分支程度不能随意地控制，而且所用底物是非常昂贵的。 

另一组体外方法包括采用α-1，4-葡聚糖链形成酶(磷酸化酶、淀粉合成酶、糖原合成酶)和分支酶的酶组合，从各种底物(葡萄糖-1-磷酸、ADP葡萄糖、UDP葡萄糖)从头合成α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖。Illingwort等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 47(1961)，469-478)显示， 对于使用肌肉的磷酸化酶A(生物体未知)与分支酶(生物体未知)组合的体外方法，采用葡萄糖-1-磷酸底物可从头合成糖原类似分子是可能的。Boyer和Preiss(同上)采用葡萄糖-1-磷酸底物或UDP葡萄糖，将家兔肌肉磷酸化酶或大肠杆菌糖原合成酶的酶活性与大肠杆菌分支酶的活性结合在一起，并通过这种方式产生了分支α-葡聚糖。Borovsky等(Eur.J.Biochem.59(1975)，615-625)也使用马铃薯分支酶和玉米磷酸化酶(1，4-α-D-葡聚糖：正磷酸α-糖基转移酶[EC 2.4.1.1])的组合，分析了从葡萄糖-1-磷酸从头合成α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖。Doi(Biochimica et Biophysica Acta 184(1969)，477-485)显示，使用ADP葡萄糖底物，菠菜淀粉合成酶(ADP-D-葡萄糖：α-1，4-葡聚糖α-1，4葡糖基转移酶)和马铃薯分支酶的酶组合，产生与支链淀粉类似的产物。Parodi等(Arch.Biochem.Biophys.132(1969)，11-117)使用大鼠肝的糖原合成酶联合大鼠肝的分支酶，从UDP葡萄糖从头合成分支葡聚糖。他们获得了与天然糖原相似的聚合物，并且该聚合物不同于基于葡萄糖-1-磷酸的聚合物。 

该第二组体外方法也有底物如葡萄糖-1磷酸、UDP葡萄糖和ADP葡萄糖非常昂贵的缺点。而且，似乎也不能对分支程度进行有目的的控制。 

Buttcher等(J.Bacteriol.179(1997)，3324-3330)描述了使用淀粉蔗糖酶和蔗糖底物，产生水不溶性α-1，4-葡聚糖的体外方法。然而，仅合成了线性无分支α-1，4-葡聚糖。 

因此，本发明的技术问题是提供允许廉价生产工业用途的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的方法，以及编码可用于所述方法的酶、尤其是分支酶的核酸分子。 

因此，本发明涉及选自下组的奈瑟氏球菌属细菌分支酶(EC2.4.1.18)的编码核酸分子： 

因此，本发明涉及选自下组的奈瑟氏球菌属细菌分支酶(EC2.4.1.18)的编码核酸分子： 

(a)含有SEQ ID NO.2中所示氨基酸序列的蛋白的编码核酸分子； 

(b)含有SEQ ID NO.1中所示编码区核苷酸序列的核酸分子； 

(c)含有质粒DSM12425插入片段编码的氨基酸序列的蛋白的编码核 酸分子； 

(d)含有质粒DSM12425插入片段区域的核酸分子，该区域编码反硝化奈瑟氏球菌(Neisseria denitrificans)的分支酶； 

(e)其序列的头100个氨基酸与SEQ ID NO.2中所示序列有至少65％同源性的蛋白的编码核酸分子； 

(f)其互补链可与根据(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)的核酸分子杂交，并且编码奈瑟氏球菌属细菌分支酶的核酸分子；和 

(g)其核酸序列由于遗传密码的简并性而不同于根据(f)的核酸分子的序列的核酸分子。 

SEQ ID NO.1中所描述的核酸序列是含有反硝化奈瑟氏球菌分支酶编码区的基因组序列。含有所述DNA序列的质粒保藏为DSM12425。依靠所述序列或所述分子，本领域技术人员现在可分离其它奈瑟氏球菌种或奈瑟氏球菌株的同源序列。该分离可采用常规方法如用合适的杂交探针筛选cDNA或基因组文库。同源序列也可按实施例1所述进行分离。因此，可以例如鉴定和分离可与SEQ ID NO.1所述序列杂交并编码分支酶的核酸分子。 

原则上，本发明的核酸分子可编码奈瑟氏球菌属任何细菌的分支酶，但优选编码反硝化奈瑟氏球菌的分支酶。 

根据本发明，术语“杂交”是指常规杂交条件下进行的杂交，优选严谨条件，这些条件描述于例如Sambrook等，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。术语“杂交”尤其优选指在如下条件下进行的杂交： 

杂交缓冲液：2×SSC；10×Denhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA；比例为1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na₂HPO₄；250ug/ml鲱鱼精子DNA；50ug/ml tRNA；或25M磷酸钠缓冲液，pH7.2；1mM EDTA；7％SDS 

杂交温度：T＝65-68℃ 

洗涤缓冲液：0.2×SSC；0.1％SDS 

洗涤温度：T＝65-68℃。 

原则上，与本发明核酸分子杂交的核酸分子可来源于任何表达相应蛋白的奈瑟氏球菌属细菌，但优选来源于反硝化奈瑟氏球菌。与本发明分子杂交的核酸分子可以，例如分离自基因组或cDNA文库。这些核酸分子可采用本发明核酸分子或所述分子的部分或所述分子的反向互补链，例如通过根据标准技术的杂交(参照Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)或通过PCR扩增来鉴定和分离。 

完全或基本具有SEQ ID NO.1中所述核苷酸序列或其部分的核酸分子可用作杂交探针。用作杂交探针的片段还可是通过常规合成技术制备的、其序列与本发明核酸分子之一的序列基本一致的合成片段。如果与本发明核酸序列杂交的基因已获得鉴定和分离，就应当对序列进行确定，并分析所述序列编码的蛋白的性质以检查它们是否分支酶。对于该目的，尤其适合在核酸和氨基酸序列水平上进行同源性比较，并测定酶活性。 

与本发明核酸分子杂交的分子尤其包括编码奈瑟氏球菌属细菌优选反硝化奈瑟氏球菌分支酶的上述核酸分子的片段、衍生物和等位基因变体。在本文中，术语“衍生物”是指所述分子的序列在一或多个位置不同于前述核酸分子的序列，但与所述序列具有高度同源性。本文中，同源性是指就整个长度而言，序列一致性达到至少60％，尤其是至少70％，优选80％以上，更优选90％以上，最优选至少95％。上述核酸分子的衍生物可通过例如缺失、添加、替换、插入或重组产生。 

而且，同源性意味着相应核酸分子或它们编码的蛋白之间具有等同的功能和/或结构。与前述分子同源并是所述分子衍生物的核酸分子，通常是具有相同生物学功能的所述分子的修饰变体。这些变体既可以是天然存在的变体，例如其它奈瑟氏球菌种或奈瑟氏球菌株的序列，又可以是含有天然存在的或通过定点诱变引入的这些突变的突变体。而且，这些变体可以是合成产生的序列。等位基因变体既可以是天然存在的变体，也可以是通过合成或重组DNA技术产生的变体。 

由本发明核酸分子的不同变体编码的蛋白质具有某些共同特征。这些 特征包括例如生物学活性、分子量、免疫学反应性、构象等，以及物理性质如在凝胶电泳中的迁移行为、亲合层析行为、沉降系数、溶解性、分光光度性质、稳定性；最适pH值、最适温度等。 

反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的分子量为86.3kDa，该分子量是从氨基酸序列推测出的。因此，本发明蛋白的推测分子量优选在70kDa-100kDa之间，更优选在77kDa-95kDa之间，最优选为大约86kDa。 

本发明还涉及编码具有分支酶酶活性的蛋白的核酸分子，其中编码蛋白与SEQ ID NO.2中所描述的氨基酸序列在N端区，优选在头100个氨基酸中，更优选在头110个氨基酸中，最优选在头120个氨基酸中，有至少65％的同源性，优选至少80％同源性，最优选至少95％同源性。 

在另一个实施方案中，本申请涉及编码具有分支酶活性的蛋白的核酸分子，所述蛋白含有至少1个，优选至少5个，更优选至少10个，最优选至少20个下列肽基序： 

(a)MNRNRHI(SEQ ID NO.8)， 

(b)RPDAHH(SEQ ID NO.9)， 

(c)HAPDYAL(SEQ ID NO.10)， 

(d)EGEAA(SEQ ID NO.11)， 

(e)DDYRF(SEQ ID NO.12)， 

(f)SALQH(SEQ ID NO.13)， 

(g)YETLG(SEQ ID NO.14)， 

(h)VSGVR(SEQ ID NO.15)， 

(i)VSVIG(SEQ ID NO.16)， 

(j)FNGWD(SEQ ID NO.17)， 

(k)LYKFS(SEQ ID NO.18)， 

(l)PYAFG(SEQ ID NO.19)， 

(m)RPTTAS(SEQ ID NO.20)， 

(n)FRRRA(SEQ ID NO.21)， 

(o)DELVNY(SEQ ID NO.22)， 

(p)LPLSEY(SEQ ID NO.23)， 

(q)YQATGL(SEQ ID NO.24)， 

(r)DDHGL(SEQ ID NO.25)， 

(s)HQDWN(SEQ ID NO.26)， 

(t)DGIRV(SEQ ID NO.27)， 

(u)YGGSEN(SEQ ID NO.28)， 

(v)SFAEES(SEQ ID NO.29)， 

(w)DPVHR(SEQ ID NO.30)， 

(x)WQQFAN(SEQ ID NO.31)， 

(y)EILNS(SEQ ID NO.32)， 

(z)ATEIQTAL(SEQ ID NO.33)， 

(aa)VKDKQAKAK(SEQ ID NO.34)。 

本发明的核酸分子可是任何核酸分子，尤其是DNA或RNA分子，如cDNA，基因组DNA，mRNA，等。它们可是天然存在的分子，或是通过遗传或化学合成技术产生的分子。它们可是含有编码链或非编码链的单链分子，也可是双链分子。 

而且，本发明涉及长度有至少15个、优选50个以上和最优选200个以上核苷酸的核酸分子，这些核酸分子特异地与本发明的至少一个核酸分子杂交。在本文中，术语“特异地杂交”是指所述分子与编码本发明蛋白的核酸分子杂交，而不与编码其它蛋白的核酸分子杂交。术语“杂交”优选指在严谨条件下进行的杂交(见上文)。特别地，本发明涉及与本发明核酸分子的转录物杂交，并由此可阻止其翻译的核酸分子。特异地与本发明核酸分子杂交的这些核酸分子可以是例如反义结构或核酶的成分，或可用作PCR扩增的引物。 

而且，本发明涉及在遗传工程中常用的含有上述本发明核酸分子的载体，尤其是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它载体。 

在一个优选实施方案中，这些载体含有的核酸分子按有义链方向与保证原核或真核细胞中表达的调节元件连接。在本文中，术语“表达”是指转录，或转录与翻译。 

本发明核酸分子在原核细胞如大肠杆菌中的表达，使得可以例如对所 编码蛋白的酶活性进行更为确切的表征。此外，可以通过分子生物学常规技术(参照Sambrook等，同上)将各种突变引入本发明的核酸分子中。这样导致合成其性质被任选性修饰的蛋白。还可通过编码DNA序列的5’或3’端的连续缺失制备缺失突变体，这样产生的核酸分子将导致合成相应缩短的蛋白。而且，可以在影响例如酶活性或酶调节的位置引入点突变。通过这种方式，可产生具有如下性质的突变体：具有改变的Km值，或在细胞中不再受经由变构调节或共价修饰进行的常规调节机制。此外，可产生具有改变的底物或产物特异性的突变体。而且，可产生具有改变的活性-温度曲线的突变体。在原核细胞中的遗传操作可根据技术人员已知的方法来进行(参照Sambrook等，同上)。 

用于原核生物体如大肠杆菌和真核生物体中表达的调节序列在文献中已有充分描述，尤其是用于酵母如酿酒酵母(Sacchomyces cerevisiae)中表达的序列。酶学方法(Methods in Enzymology)153(1987)，383-516和Bitter等(酶学方法153(1987)，516-544)综述了各种用于在不同宿主生物体中表达蛋白的系统。 

优选地，插在本发明载体中的本发明核酸分子经过修饰，导致所述核酸分子在合适宿主生物体中表达后，其编码蛋白可较为容易地从培养基中分离出来。例如，可以将编码的分支酶表达为含有另一个多肽序列的融合蛋白，其中所述多肽序列的特异结合性质可使融合蛋白通过亲和层析分离(参照Chong等，基因(Gene)192(1997)，271-281；Hopp等，Bio/Technology 6(1988)，1204-1210；Sassenfeld，Trends Biotechnol.8(1990)，88-93)。 

而且，本发明载体含有的核酸分子优选含有可使分支酶分泌到培养基中的核苷酸序列。优选地，所用序列编码辛酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)M5A1的α-CGTase的信号肽(Fiedler等，J.Mol.Biol.256(1996)，279-291；Genebank索引号X86014，CDS 11529-11618)。通过将酶分泌至培养基中可使回收和纯化更为容易地进行。避免了破碎细胞，并可通过用于除去培养基残余成分的常规方法如透析、渗透、层析法等从培养基中回收酶。 

而且，本发明载体可含有导致载体在宿主生物体中稳定化的其它功能性单位，例如用于酿酒酵母中稳定化的细菌复制原点或2μ-DNA。 

在另一个实施方案中，本发明涉及上述核酸分子或载体转化的宿主细胞，尤其是原核或真核细胞，以及所述宿主细胞来源的并含有所述核酸分子或载体的细胞。宿主细胞可以是细菌细胞(如大肠杆菌)或真菌细胞(如酵母，尤其是，酿酒酵母)，以及植物或动物细胞。术语“转化的”是指本发明细胞已被本发明核酸分子进行了遗传修饰，以至它们除了含有其天然基因组外还含有至少一个本发明核酸分子。所述核酸分子可选择地作为自主复制分子，以游离形式存在于细胞中，或可稳定整合在宿主细胞的基因组中。 

宿主细胞优选微生物。在本发明中，正如例如Schlegel“AllgemeineMikrobiologie”(Georg Thieme Verlag(1985)，1-2)中所定义的，该微生物可以是所有细菌和所有原生生物(如真菌，尤其是酵母和藻类)。 

本发明宿主细胞尤其优选是植物细胞。原则上，这些细胞可包括任何植物种，即单子叶和双子叶植物，来源的细胞。优选地，所述细胞来源于农业上有用的植物，即人们为了营养或技术目的，特别是工业目的种植的植物。本发明优选涉及来自纤维形成植物(如亚麻、大麻、棉)，储油植物(如油菜、向日葵、大豆)，储糖植物(如甜菜、甘蔗、甜小米(sugarmillet)、香蕉)和储存蛋白的植物(如豆科植物)的细胞。 

在另一个实施方案中，本发明涉及来源于饲料植物(如饲料草、牧场草(紫花苜蓿、苜蓿等))，蔬菜植物(如蕃茄、莴苣、菊苣)的植物细胞。 

在一个优选实施方案中，本发明涉及来自淀粉储存植物(如小麦、大麦、燕麦、黑麦、马铃薯、玉米、水稻、豌豆、木薯、绿豆)的植物细胞。尤其优选来自玉米、水稻、小麦和马铃薯植物的植物细胞。 

而且，本发明涉及从奈瑟氏球菌属细菌制备分支酶的方法。在所述方法中，本发明宿主细胞在允许该蛋白表达的条件下培养，并从培养物即细胞和/或培养基回收该蛋白。优选使用分泌该分支酶的宿主生物。 

而且，本发明涉及使用本发明核酸分子在体外转录和翻译系统中制备 奈瑟氏球菌属细菌分支酶蛋白的方法。这些系统是本领域技术人员熟知的。 

本发明还涉及本发明核酸分子编码的蛋白或通过本发明方法可获得的蛋白。 

而且，本发明涉及特异识别本发明蛋白的抗体。这些抗体可以是例如单克隆或多克隆抗体。它们还可以是识别本发明蛋白的抗体的片段。制备所述抗体或片段的方法是本领域技术人员熟知的。 

而且，本发明涉及本发明分支酶在体外系统中制备α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的应用。 

特别地，本发明还涉及含有本发明核酸分子或载体的转基因植物细胞。优选地，本发明细胞的特征在于引入的本发明核酸分子稳定地整合在基因组中，并受控于在植物细胞中有活性的启动子。 

有许多启动子或调节元件可供本发明核酸分子在植物细胞中表达使用。原则上，在植物中有活性的所有启动子、增强子、终止子等均是植物细胞中表达的调节元件。基本上，可使用任何在选择用于转化的植物中发挥功能的启动子。对于所用的植物种，该启动子可是同源的或异源的。所述启动子可按如下方式选择，使表达以组成方式或仅在特定组织中，在植物发育的某个时期或在外来影响决定的时间发生。合适启动子的例子是花椰菜花叶病毒的35S启动子(该启动子确保在植物的所有组织中进行组成型表达)(Odell等，自然(Nature)313(1985)，810-812或US 5 352 605)，和WO/9401571中所描述的启动子结构。另一些例子是泛素启动子(参照如US 5 614 399)和玉米的多聚泛素基因启动子(Christensen等，同上)。然而，也可使用仅在由外来影响决定的时间被激活的启动子(参照例如WO/9307279)。允许简单诱导的热休克蛋白的启动子可能尤其有意义。而且，可使用导致下游序列在植物特定组织如光合作用活跃的组织中表达的启动子。其例子是ST-LS1启动子(Stockhaus等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84(1987)，7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-2451)，Ca/b启动子(参照例如US 5656 496，US 5 639 952，Bansal等，美国国家科学院院刊89(1992)， 3654-3658)以及核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶SSU启动子(参见例如US 5034 322和US 4 962 028)。此外，值得提及的是在待转化植物的淀粉储存器官中活跃的启动子。这些植物的淀粉储存器官例如在玉米中是玉米种子，而在马铃薯中是块茎。为了在马铃薯中过表达本发明的核酸分子，可使用例如块茎特异的patatin基因启动子B33(Rocha-Sosa等，EMBOJ.8(1989)，23-29)。各种植物种类的种子特异性启动子已有描述。其中一个例子是蚕豆(Vicia faba)的USP启动子，该启动子在蚕豆和其它植物中保证种子特异性表达(Fiedler等，PlantMol.Biol.22(1993)，669-679；B

umle in等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。 

而且，还可使用WO 91/01373中所描述的果实特异性启动子。尤其优选负责胚乳特异性表达的启动子如谷蛋白启动子(Leisy等，PlantMol.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366)，小麦的HMG启动子，USP启动子，菜豆蛋白启动子或玉米的玉米醇溶蛋白基因的启动子(Pedersen等，细胞(Cell)29(1982)，1015-1026；Quatroccio等，Plant Mol.Biol.15(1990)，81-93)。与相应野生型植物的胚乳相比，胚乳特异性启动子可增加本发明核酸分子在胚乳中的转录物的量。 

尤其优选玉米的Shrunkeh-1启动子(sh-1)(Werr等，EMBO J.4(1985)，1373-1380)。 

此外，可含有终止序列，该序列负责转录的正确终止和向转录物添加具有稳定转录物功能的poly-A尾。这些元件在文献(参照例如Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)中已有描述，并且可随意互换。 

因此，可以在植物细胞中表达本发明的核酸分子。 

由此，本发明还涉及制备转基因植物细胞的方法，该方法包括向植物细胞中引入本发明的核酸分子或载体。本领域技术人员有多种植物转化系统供使用，例如用于转化植物细胞的T-DNA的使用已有大量研究，并描述于EP-A-120 516；Hoekema：二元植物载体系统(Binary Plant VectorSystem)，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第五章，Fraley，Crit.Rev.Plant.Sci.，4，1-46和An，EMBO J.4(1985)， 277-287。 

为了向植物细胞中转移DNA，可适宜地将植物外植体与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)一起共培养。然后在合适的培养基中从感染的植物材料(如叶的部分、茎片段、根、和原生质体或悬浮培养的植物细胞)再生整个植株，其中所述培养基可含有筛选转化细胞用的抗生素或杀生物剂。然后，检测由此方法获得的植物中是否存在导入的DNA。采用生物轰击方法或通过原生质体转化法导入外源DNA的其它可能性是已知的(参照Willmitzer，L.1993，转基因植物(Transgenic plants)：生物技术，多卷综合性专题论文集(Biotechnology，A Multi-Volume ComprehensiveTreatise(H.J.Rehm，G.Reed，A.Puhler，P.Stadler编)，第二卷，627-659，VCH Weinheim-New York-Basel-Cambrige)。 

用于转化单子叶植物的其它系统是通过以下方法进行的转化，这些方法包括生物轰击法、电或化学诱导的原生质体对DNA的吸收、部分可渗透细胞的电穿孔、向花序中微注射DNA、向花粉粒和原胚中微注射DNA、通过萌发花粉进行的DNA吸收、和通过溶胀将DNA吸收入胚胎中(参见例如Lusardi，Plant J.5(1994)，571-582；Paszowski，Biotechnology24(1992)，387-392)。 

尽管通过根癌农杆菌和Ti质粒系统转化双子叶植物的方法已被良好确立，但目前更多研究指出事实上单子叶植物也可通过基于农杆菌的载体进行转似Chan，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)22(1993)，491-506；Hiei，植物杂志(Plant J.)6(1994)，271-282；Bytebier，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84(1987)，5345-5349；Raineri，Bio/Technology 8(1990)，33-38；Gould，植物生理学(Plant Physiol.)95(1991)，426-434；Mooney，Plant，Cell Tiss.& Org.Cult.25(1991)，209-218；Li，植物分子生物学20(1992)，1037-1048)。 

在过去，以上三种转化系统均可用于各种谷类植物：组织电穿孔、原生质体转化和在可再生组织和细胞中通过微粒轰击转移DNA(综述见J

hne，Euphytica 85(1995)，35-44)。小麦的转化在文献中已有多次描述(综 述见Maheshwari，植物科学评论(Critical Reviews in Plant Science)14(2)(1995)，149-178)。 

特别地，玉米的转化已在文献中有多次描述(参照例如WO 95/06128，EP 0513849，EO 0465875，EP 292435；Fromm等，生物技术(Biotechnology)8(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，植物细胞(PlantCell)2(1990)，603-618；Koziel等，生物技术11(1993)，194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80(1990)，721-726)。 

其它谷类物质的成功转化也已有描述，例如大麦的(Wan和Lemaux，同上；Ritala等，同上；Krens等，自然296(1982)，72-74)和小麦的(Nehra等，植物杂志(Plant J.)5(1994)，285-297)转化。 

对于本发明核酸分子在植物中的表达，原则上可使合成的蛋白定位在植物细胞的任何区室中。为了获得在特定区室中的定位，编码区必须选择性地与保证在相应区室中定位的DNA序列连接。这些序列均是已知的(参照例如Braun，EMBO J.11(1992)，3219-3227；Sonnewald，植物杂志(Plant J.)1(1991)，95-106；Rocha-Sosa，EMBO J.8(1989)，23-29)。例如，对于质体信号序列，可使用菠菜铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶(FNR)的质体信号序列。所述序列含有菠菜铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶(FNR)cDNA的5’非翻译区和侧翼转运肽序列(核苷酸第-171至+165位；Jansen等，Current Genetics 13(1988)，517-522)。 

而且，还可使用外加了成熟蜡质蛋白的头34个氨基酸的玉米蜡质蛋白转运肽作为质体信号序列(Klosgen等，Mol.Gen.Genet.217(1989)，155-161)。此外，也可使用无成熟蜡质蛋白34个氨基酸的玉米蜡质蛋白转运肽(见上)。 

而且，也可考虑使用如下质体信号序列：核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的信号序列(Wolter等，美国国家科学院院刊85(1988)，846-850；Nawrath等，美国国家科学院院刊91(1994)，12760-12764)；NADP苹果酸脱氢酶的信号序列(Gallardo等，Planta 197(1995)，324-332)；谷胱甘肽还原酶的信号序列(Creissen等，植物杂志8(1995)，167-175)。 

因此，本发明还涉及被一个或多个本发明核酸分子转化的转基因植物 细胞，以及来源于该方式转化的细胞的转基因植物细胞。这些细胞含有一个或多个本发明核酸分子，而且所述分子优选与保证在植物细胞中转录的调节DNA元件，尤其是启动子连接。由于这些细胞中含有至少一个本发明核酸分子，故可将其与天然存在的植物细胞区分开来。 

采用本领域技术人员熟知的技术，可将这些转基因植物细胞再生成整个植株。通过本发明转基因植物细胞再生可获得的植物也是本发明的一个主题。 

而且，含有前述植物细胞的植物也是本发明的一个主题。原则上，本发明植物可以是任何植物种类的植物，即双子叶植物和单子叶植物。它们优选是有用植物，即为营养或技术目的，尤其是工业目的种植的植物。优选地，本发明涉及如下植物的植物细胞：纤维形成植物(如亚麻、大麻、棉)、储油植物(如油菜、向日葵、大豆)，储糖植物(如甜菜、甘蔗、甜小米、香蕉)和储存蛋白的植物(如豆科植物)。 

在另一个实施方案中，本发明涉及饲料植物(如饲料草、牧场草(紫花苜蓿、苜蓿等))，蔬菜植物(如蕃茄、莴苣、菊苣)的植物细胞。 

在一个优选实施方案中，本发明涉及淀粉储存植物(如小麦、大麦、燕麦、黑麦、马铃薯、玉米、水稻、豌豆、木薯、绿豆)，尤其优选玉米、水稻、小麦和马铃薯植物的植物细胞。 

在一个优选实施方案中，与未经遗传修饰的野生型植物的相应植物细胞比较，本发明植物的细胞具有增加活性的本发明蛋白质。这些细胞优选淀粉储存组织的细胞，尤其是块茎或胚乳的细胞，最优选马铃薯块茎细胞，或玉米、小麦或水稻植物的胚乳细胞。 

在本发明中，术语“活性的增加”是指在植物中编码具有分支酶活性的蛋白的本发明核酸分子的表达增加，具有分支酶活性的蛋白的量增加和/或具有分支酶活性的蛋白的活性增加。 

表达增加例如可通过测量编码所述蛋白的转录物的量来确定，如通过Northern印迹分析或RT-PCR。在本文中，术语“增加”优选指，与未经遗传修饰的植物细胞相比，转录物的量增加至少10％，优选至少20％，更优选至少50％，最优选至少75％。 

具有分支酶活性的蛋白的量例如可通过Western印迹分析来确定。在本文中，术语“增加”优选指，与未经遗传修饰的相应细胞相比，具有分支酶活性的蛋白的量增加至少10％，优选至少20％，更优选至少50％，最优选至少75％。 

分支酶活性的增加例如可根据描述于Lloyd等(生物化学杂志(Biochem.J.)338(1999)，515-521)中的方法来测定。在本文中，术语“增加”优选指，分枝酶活性增加至少10％，优选至少20％，更优选至少50％，最优选至少75％。 

令人惊奇的是，发现与未经遗传修饰的相应野生型植物比较，含有本发明具有增加分支酶活性的植物细胞的植物合成修饰的淀粉。该改性淀粉可以例如与野生型植物合成的淀粉相比，在物理化学性质，尤其是直链淀粉/支链淀粉的比、分支程度、平均链长度、磷酸含量、粘度、淀粉颗粒的大小、侧链的分布和/或淀粉颗粒的形状方面发生改变。因此，该改性淀粉更适合于特定目的。 

而且，令人惊奇地发现，在本发明分支酶活性增加的植物细胞中，淀粉的组成发生改变，以至其与相应野生型植物的淀粉比较，具有更高的胶体质地和/或降低的磷酸含量和/或降低的峰值粘度和/或降低的成浆温度和/或减小的淀粉颗粒大小和/或改变的侧链分布。 

在本文中，术语“增加的胶体质地”是指与野生型植物的淀粉胶体质地相比，增加至少10％，优选至少50％，更优选至少100％，至少200％，最优选至少300％。胶体质地的测定描述于下文。 

本发明中，术语“降低的磷酸含量”是指与相应野生型植物的植物细胞淀粉相比，本发明植物细胞中合成的淀粉的总共价结合磷酸含量和/或C-6位磷酸含量降低至少20％，优选至少40％，更优选至少60％，最优选至少80％。 

总磷酸含量或C-6位磷酸含量可根据如下描述的方法进行测定。 

本发明中，术语“降低的峰值粘度”是指与野生型植物淀粉的峰值粘度相比，峰值粘度降低至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，最优选至少75％。 

本发明中，术语“降低的成浆温度”是指与野生型植物淀粉的成浆温度相比，成浆温度降低至少0.5℃，优选至少1.0℃，更优选至少2.0℃，最优选至少3.0℃ 

峰值粘度和成浆温度可按如下所述方式用Rapid Visco Analyzer测定。 

技术人员对术语“峰值粘度”和“成浆温度”是熟悉的。 

术语“减小的淀粉颗粒大小”是指与野生型植物相比，不大于15μum的淀粉颗粒的百分比例增加至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，100％，最优选至少150％。 

淀粉颗粒的大小按下述方式利用Retsch，GmbH(德国)产“Lumosed”型光沉降测定计(photosedimentometer)测定。 

本文中，术语“改变的侧链分布”是指与野生型植物支链淀粉具有6-9聚合度的侧链所占比例相比，具有6-9聚合度的侧链的比例增加至少25％，优选至少50％，更优选至少100％，最优选至少200％。 

在本发明另一个实施方案中，术语“改变的侧链分布”是指与野生型植物支链淀粉具有相应聚合度的侧链所占比例相比，具有6-8聚合度，优选6-7聚合度的侧链比例增加至少25％，优选至少50％，更优选至少100％，最优选至少200％。 

通过测量特定侧链在所有侧链总份额中的百分比例来确定侧链比例。所有侧链的总份额通过测量在HLPC层析中代表6-30聚合度的峰下总面积来确定。特定侧链在所有侧链总份额中的百分比例可通过测量HPLC层析中代表所述侧链的峰下面积与总面积的比值来确定。优选地，使用Dionex(美国)生产的3.31版AI-450程序。 

在另一个实施方案中，本发明涉及与野生型植物淀粉的支链淀粉相比，其支链淀粉具有5聚合度侧链的淀粉。 

而且，本发明涉及制备合成改性淀粉的转基因植物的方法，其中 

(a)通过导入本发明核酸分子和/或本发明载体遗传修饰植物细胞，其中所述分子和/或载体的存在或表达导致具有分支酶活性的蛋白的活性增加； 

(b)从根据步骤(a)产生的细胞再生植物；并 

(c)可选择地，从根据步骤(c)产生的植物产生更多植物。 

在该方法的一个优选实施方案中，对淀粉进行修饰，以使其与相应野生型植物的淀粉相比，具有增加的胶体质地和/或降低的磷酸含量和/或降低的峰值粘度和/或降低的成浆温度和/或降低的淀粉颗粒大小和/或改变的侧链分布。 

在本文中，术语“增加的胶体质地”、“降低的磷酸含量”、“降低的峰值粘度”、“降低成浆温度”、“降低的淀粉颗粒大小”、和“改变的侧链分布”的定义如上。 

关于根据步骤(a)引入的遗传修饰，关于本发明植物的不同情形中所阐述的内容同样适用。 

根据步骤(b)的植物再生可通过技术人员已知的方法实现。 

根据本发明方法步骤(b)的更多植物可以例如通过无性繁殖(例如利用插条、块茎或通过愈伤组织培养和全株的再生)或有性繁殖产生。优选地，所述有性繁殖是被控制的，即杂交并繁殖具有特定性质的所选植物。 

本发明还涉及通过本发明方法可获得的植物。 

本发明还涉及本发明植物的繁殖材料，以及根据本发明方法产生的转基因植物。在本文中，术语“繁殖材料”包括那些适于以无性繁殖或有性繁殖方式产生后代的植物成分，例如适于无性繁殖的插条、愈伤组织培养物、根茎或块茎。其它繁殖材料包括例如果实、种子、籽苗、原生质体、细胞培养物等。所述繁殖材料优选块茎和种子。 

可从本发明的转基因植物细胞和植物以及繁殖材料获得的淀粉是本发明的又一主题。 

由于本发明核酸分子或本发明载体的表达，与未经遗传修饰的野生型植物的植物细胞相比，其表达的存在导致分支酶活性的增加，本发明转基因植物细胞和植物合成与野生型植物中合成的淀粉相比其物理化学性质改变的淀粉，其中所述物理化学性质尤其包括胶体的质地和/或成浆形为和/或淀粉颗粒的大小和/或磷酸含量和/或侧链的分布。 

而且，本发明还涉及淀粉，其特征在于它们具有增加的胶体质地和/或降低的磷酸含量和/或降低的峰值粘度和/或降低的成浆温度和/或减小的淀粉颗粒大小和/或改变的侧链分布。 

在一个尤其优选的实施方案中，本发明涉及马铃薯的淀粉。 

在本文中，术语“增加的胶体质地”、“降低的磷酸含量”、“降低的峰值粘度”、“降低的成浆温度”、“减小的淀粉颗粒大小”和“改变的侧链分布”的定义同上。 

此外，本发明涉及产生改性淀粉的方法，包括步骤：从以上描述的本发明植物(细胞)和/或从该植物的淀粉储存部分提取淀粉。优选地，该方法还包括步骤：在提取淀粉之前收获种植的植物和/或所述植物的淀粉储存部分，并且更优选地还包括步骤：收获前种植本发明植物。从植物或植物淀粉储存部分提取淀粉的方法是技术人员所熟悉的。而且，从各种淀粉储存植物提取淀粉的方法已有描述，例如“淀粉：化学性质和技术(Starch：Chemistry and Technology)”(编者：Whistler，BeMiller和Paschall(1994)，第二版，Academic Press Inc.London Ltd.；ISBN0-12-746270-8；参照例如第XII章，第412-468页：玉米和高粱淀粉：制备(Maize and Sorghum Starches：Production)(Watson著)；第XIII章，第469-479页：木薯、竹芋和西米淀粉：制备(Tapioca，Arrow Rootand Sago Starches：Production)(Corbishley和Miller著)；第XIV章，第479-490页：马铃薯淀粉：制备和应用(Potato Starch：Productionand Applications)(Mitch著)；第XV章，第491-506页：小麦淀粉：制备、改良和应用(Wheat Starch：Production，Modification andApplications)(Knight和Oson著)；和第XVI章，第507-528页：水稻淀粉：制备和应用(Rice Starch：Production and Applications)(Rohmer和Klem著)；玉米淀粉(Maize Starch)：Eckhoff等，CerealChem.73(1996)，54-57，工业化水平的玉米淀粉提取通常利用所谓的湿磨实现)。一般用于从植物材料提取淀粉的方法的用具包括分离器、滗析器、水力旋流器、喷雾干燥器和流化床干燥器。 

通过上述方法可获得的淀粉也是本发明的一个主题。 

本发明淀粉可根据本领域技术人员已知的方法进行修饰，而且其修饰或未修饰形式适合于食品或非食品工业中的各种应用。 

大体上，应用的可能范围可划分为两大领域。一个领域包括淀粉的水解产物，主要是通过酶学或化学方法获得的葡萄糖和葡聚糖组成部件。这些产物可充当进一步化学修饰和加工如发酵的起始材料。为了降低费用，水解方法操作的简单性和廉价性可能是重要的。目前，该方法基本上是使用淀粉葡萄糖苷酶的酶学方法。通过减少酶的使用将有可能节省开销。这可通过改变淀粉的结构例如颗粒的表面扩大、由于低分支程度或限制所用酶接近的空间结构减少导致的更为容易的消化性来实现。 

另一个领域中淀粉由于其聚合结构而作为所谓的天然淀粉使用，该领域可进一步划分为两个应用领域： 

1.在食品中的使用 

淀粉是一种用于各种食物的经典添加剂，在这些食物中其本质上起着结合水性添加剂的作用，和/或导致粘度或胶体形成的增加。重要的特征性性质是流动和吸收行为，溶胀和成浆温度，粘度和稠化性能，淀粉的溶解性，透明度和浆的结构，热量，剪切力和耐酸性，退化趋势，成膜能力、对冻/融的抗性，消化性以及与例如无机或有机离子形成复合物的能力。 

2.在非食品中的使用 

其它主要应用领域是淀粉作为辅佐试剂在各种加工过程中或作为添加剂在技术性产品中的使用。淀粉用作辅佐试剂的主要应用领域首先是纸和纸板工业。在该领域，淀粉主要用于滞留(挡住固体)，粘附填充物和细颗粒，使物质固化和脱水。此外，可利用淀粉在如下方面的有利性质：刚性、硬度、声音、握裹力、光泽、平滑性、磨损强度以及表面。 

2.1纸和纸板工业 

在纸的生产工艺中，可区分出4个应用领域，即表面、涂层、物料和喷涂。 

对于表面处理，淀粉的要求基本上是高明亮度、相应的粘度、高 粘度稳定性、良好的成膜性以及低粉尘形成。当用于涂布固体内容物时，高的结合能力和高的色素亲合力则起着重要作用。作为物料的添加剂时，在纸浆中的快速、均一、无损失扩散，高机械稳定性和完全的保持力则是重要的。当在喷涂中使用淀粉时，相应的固体含量、高粘度和高的结合能力也是重要的。 

2.2胶粘剂工业 

应用的一个主要领域是例如胶粘剂工业，其中该应用领域可再划分为4个方面：作为纯淀粉胶的应用，在特殊化学物质制备的淀粉胶中的应用，淀粉作为合成树脂和多聚分散体添加剂的应用以及淀粉作为合成胶粘剂的搀杂剂的应用。所有基于淀粉的胶粘剂的90％用于生产瓦楞纸板、纸袋和袋子、纸和铝的复合材料、盒子和信封、邮票用的湿胶等。 

2.3纺织品和纺织品维护产品 

另一个可能作为辅助试剂和添加剂使用的方面是纺织品和纺织品维护产品的生产。在纺织工业中，可区分出以下4个应用领域：淀粉作为上浆剂的使用即为防止编织过程中的张力并增加编织过程中的耐磨性用以润滑和增强去毛边性能的辅佐试剂，主要在引起品质退化的预处理如漂白、染色等之后用于改善纺织物的试剂，为了在染料浆的生产中作为防止染料弥散的增稠剂，以及作为缝纫线变形试剂的添加剂。 

2.4建筑工业 

而且，淀粉可用作建筑材料中的添加剂。一个例子是石膏壁板的生产，其中混在薄板中的淀粉与水成浆，在石膏板的表面扩散并由此将卡片结合到板上。其它应用领域是使其与石膏和矿物纤维混合。在掺水即可使用的混凝土中，淀粉可用于减缓胶浆过程。 

2.5土壤稳定化 

而且，淀粉对于土壤稳定化产品的产生是有利的，土壤稳定化产品在人为的土壤移动中用于土壤颗粒的暂时性防水。根据目前的知识，淀粉与聚合物乳液的复合产物可被认为具有与目前使用的 产品相同的降低侵蚀和结壳的作用；然而，其显著地便宜。 

2.6在植物保护剂和肥料中的使用 

另一个应用领域是淀粉在植物保护剂中的使用，以改变这些制品的特定性质。例如，淀粉用于改善植物保护剂和肥料的润湿性，活性成分的定量释放，将液体的、挥发性的和/或有气味的活性成分转化为微晶、稳定、可变形的物质，与非相容性成分混合，及降低崩解以延长作用的持续时间。 

2.7药品、医学和化妆品工业 

淀粉还可用于药品、医学领域和化妆品工业。在制药工业中，淀粉可用作片剂的粘合剂或用于胶囊中粘合剂的稀释。而且，淀粉作为崩解物质适合用于片剂，因为吞咽后，它可吸收液体并在短时间内胀大导致活性成分的释放。由于其性质，另一个应用领域是医疗润滑和医治创伤的扑粉。在化妆品领域，淀粉可例如用作粉末添加剂如香剂和水杨酸的载体。淀粉应用的一个相对广泛的领域是牙膏。 

2.8淀粉作为煤和煤砖的添加剂 

淀粉还可用作煤和煤砖的添加剂。通过添加淀粉，煤可定量积聚和/或以更高的质量形成煤块，从而防止煤砖的过早崩解。烤肉用的煤含有4-6％的外加淀粉，高热(calorated)煤含有0.1-0.5％的外加淀粉。而且，淀粉适合用作粘合剂，因为给煤和煤砖添加淀粉可显著地降低毒性物质的释放。 

2.9矿泥和煤泥的加工 

另外，淀粉可在矿泥和煤泥的加工中用作凝聚剂。 

2.10铸造材料的添加剂 

另一个应用领域是在铸造中用作加工材料的添加剂。对于各种铸造工艺，需要将从矿砂制备的核心部分与粘合剂混合。目前，最常用的粘合剂是与改性淀粉、主要是溶胀淀粉混合的膨润土。添加淀粉的目的是增加流动抗性和改善结合强度。而且，对于生产过程，溶胀淀粉可满足更多的先决条件，例如在冷水中的分散能 力、重水化能力、在矿砂中的良好混合能力和高水结合容量。 

2.11橡胶工业 

在橡胶工业中，淀粉可用于改善技术和光学品质。原因是表面光泽、握裹力和外观的改善。为了该目的，在冷硫化之前，将淀粉分散在橡胶物质的粘性橡胶化表面。淀粉还可用于改善橡胶的可印刷性。 

2.12皮革代用品的生产 

改性淀粉的另一个应用领域是皮革代用品的生产。 

2.13合成聚合物中的淀粉 

在塑料制品市场，正在出现以下应用领域：在加工工艺中引入来源于淀粉的产物(淀粉仅是一种填料，合成聚合物和淀粉之间没有直接的键结合)，或是作为另一种选择，淀粉来源的产品被引入聚合物的生产中(淀粉和聚合物形成稳定键结合)。 

淀粉用作一种纯填料是不能与其它物质如滑石相竞争的。当特定淀粉性质发挥作用时，这种情况就不同了，而且终产物的性质也由此而有明显改变。一个例子是淀粉产品在热塑性材料如聚乙烯的加工中的使用。因此，通过共表达，淀粉和合成聚合物按1∶1的比例结合，形成‘母料(master batch)’，采用颗粒化聚乙烯的普通技术即可从其中制备各种产品。淀粉引入聚乙烯薄膜中可增加中空支架中的物质渗透性，改善水蒸气的渗透性，提高抗静电性能，提高抗阻塞性能，以及改善水性染料的印刷能力。 

另一个可能性是淀粉在聚氨酯泡沫中的使用。由于淀粉衍生物的适应性和加工技术的优化，可以特异地控制合成聚合物和淀粉羟基之间的反应。结果是由于淀粉的使用产生具有如下性质的聚氨酯薄膜：降低的热膨胀系数、减小的收缩性、改善的压力/张力性能、增加的水蒸气渗透性但不改变水的接收性能、降低的可燃性和开裂密度、没有燃烧物的流出、不含卤化物并且退化降低。目前仍存在的缺点是压力和冲击强度的降低。 

薄膜产品的开发并不是唯一的选择。固体塑料产品如罐、盘和碗也可通过包含大于50％淀粉的材料来制备。而且，淀粉/聚合物混合物具有更 容易被生物降解的优点。 

另外，由于淀粉接枝聚合物与水结合的能力极强，从而获得了极大的重视。这些聚合物是含有淀粉主链和根据自由基链机制接枝在其上的合成单体侧格的产品。目前可获得的淀粉接枝聚合物的特征在于每克高粘度淀粉具有结合和保持高达1000克水的能力。这些极好的吸收剂主要用于卫生领域例如尿布和被单等产品中，以及用于农业领域如种子团粒中。 

经重组DNA技术修饰的这种新型淀粉应用的决定因素，一方面是结构、水含量、蛋白含量、脂含量、纤维含量、灰粉/磷酸盐含量、直链淀粉/支链淀粉比、相对分子量分布、分支程度、颗粒大小和形状以及结晶化，另一方面是导致如下特征的性质：流动和吸收行为、成浆温度、粘度、增稠能力、可溶性、浆结构、透明度、热量、剪切力和酸抗性、退化趋势、胶体形成能力、抗冻/融能力、复合物形成能力、碘结合、薄膜形成、粘合强度、酶稳定性、可消化性和反应性。 

通过遗传操作转基因植物产生改性淀粉，可改变从该植物获得的淀粉的性质，以使得可通过其它化学或物理方法作进一步改变。另一方面，通过重组DNA技术改性的淀粉可作为进一步化学改性的对象，该改性将导致对于上述特定应用领域而言质量的进一步提高。这些化学改性大体上是已知的。这些改性尤其是通过如下方法进行的改性： 

-热处理 

-酸处理 

-淀粉醚的形成 

淀粉烷基醚、O-烯丙基醚、羟烷基醚、O-羧甲基醚、含N淀粉醚、含P淀粉醚和含S淀粉醚。 

-分支淀粉的形成 

-淀粉接枝聚合物的形成 

-氧化和 

-酯化作用 

导致形成磷酸淀粉、硝酸淀粉、硫酸淀粉、黄原酸淀粉和柠檬酸淀粉。其它有机酸也可用于酯化作用。 

在另一个实施方案中，本发明涉及可收获的本发明植物的部分，例如果实、储存根、根、花、芽、抽条或茎，优选种子或块茎，可收获的所述部分含有本发明的植物细胞。 

在另一个方面，本发明涉及在细菌中天然控制上述本发明核酸分子转录的调节区域，其中所述核酸分子编码奈瑟氏球菌属细菌的分支酶。 

在本发明中，术语“调节区域”涉及影响基因序列表达的特异性和/或程度的区域，例如使表达响应某些外在刺激或在特定时间发生的区域。这些调节区域通常位于称作启动子的区域。在本发明中，术语“启动子”包括起始转录如结合RNA聚合酶所必需的核苷酸序列，还可包括(一或多个)TATA盒。 

在一个优选的实施方案中，本发明调节区域包括选自下组的核苷酸序列： 

(a)含有SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列第1-169位核苷酸的核苷酸序列； 

(b)包含质粒DSM 12425的插入片段中所含调节区域或其部分的核苷酸序列；和 

(c)在严谨条件下与(a)或(b)序列杂交的核苷酸序列。 

SEQ ID NO.1中所示序列的核苷酸第1-169位形成了反硝化奈瑟氏球菌分支酶基因的部分调节区。推测的启动子区域位于36-44、51-55和157-162位，其中序列“GGGAGA”可能是Shine-Dalgarno序列。 

本发明还涉及与上述调节区域有同源性的调节区域，其中所述同源性足够高以至其与至少一个所述区域杂交，优选在严谨条件下杂交。尤其优选调节区域与前述调节区域，尤其是与SEQ ID NO.1中所示调节区域有至少80％、优选至少90％、最优选至少95％的序列一致性。 

调节区还包括对于上述调节区而言，例如由于缺失、插入、替换、添加和/或重组和/或修饰而改变的调节区。 

向这些调节区引入这些修饰的方法是技术人员所熟悉的。而且，本领域技术人员了解，本发明调节区域可与其它影响细菌细胞中转录的元件如增强子元件偶联。 

本发明还涉及含有本发明调节区的重组DNA分子。在该重组DNA分子中，调节区优选与异源性DNA序列连接。在本文中，术语“异源”是指所述序列并非天然就与该调节区连接的。此外，本发明重组DNA分子可含有其它对于细菌细胞中转录和/或翻译重要的调节元件如转录或翻译的增强子。 

另外，本发明涉及被本发明调节区、重组DNA分子或载体转化的宿主细胞。 

而且，本发明涉及含有本发明调节区或本发明重组DNA分子的载体。所述载体还包括例如通常用于分子遗传学方法的质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。 

此外，本发明涉及采用蔗糖底物和淀粉蔗糖酶与分支酶的酶组合制备α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的体外方法。在本发明中，术语“体外方法”涉及在活生物体外发生的转换即反应。特别地，术语“体外”是指本发明方法在反应容器中发生。最优选地，术语“体外”是指反应在缺乏活细胞时发生。 

本发明方法的优点是可以控制分支程度，而且通过所述控制可以使合成的葡聚糖的性质适合于该葡聚糖的计划应用。因此，对于在制药中作为胶囊材料的应用，通过有目的地调节分支程度可以优化药物试剂的释放速率。 

在本发明中，淀粉蔗糖酶(蔗糖：1，4-α-D-葡聚糖4-α-葡糖基转移酶，E.C.2.4.1.4)是催化蔗糖转化成水不溶性α-1，4-葡聚糖和果糖的酶。对于所述酶，可能有如下反应路线： 

蔗糖+(α-1，4-D-葡聚糖)_n→D-果糖+(α-1，4-D-葡聚糖)_n+1

这就是糖基转移反应。所述反应的产物是水不溶性α-1，4-葡聚糖和果糖。在有或没有接受分子时均可发生糖基转移。该接受分子可以是例如多糖如麦芽寡糖、糊精或糖原。如果所述接受分子是线型α-1，4-葡聚糖寡聚物，则利用淀粉蔗糖酶进行的糖基转移反应的产物是线型α-1，4-葡聚糖聚合物。如果利用淀粉蔗糖酶在没有任何受体分子的情况下进行糖基转移反应，则获得具有末端果糖分子的葡聚糖。在本发明中，利用 淀粉蔗糖酶在有或没有接受分子的情况下获得的所有产物均称为α-1，4-葡聚糖。 

对于在没有接受分子情况下利用淀粉蔗糖酶进行的糖基转移的反应机制，可以认为是如下反应路线： 

G-F+n(G-F)→G_n-G-F+nF， 

其中G-F是蔗糖，G是葡萄糖，F是果糖，G_n-G-F是α-1，4-葡聚糖。 

对于在有接受体分子情况下利用淀粉蔗糖酶进行的糖基转移的反应机制，可以认为是如下反应路线： 

mG-F+G_n→G_n-m+mF， 

其中G_n为多糖接受体分子，G_n-m是由接受体和由此合成的α-1，4-葡聚糖链组成的多糖，G-F是蔗糖，F是果糖，G是葡萄糖。 

对于利用淀粉蔗糖酶进行的糖基转移不需要辅因子。原则上，所有催化从蔗糖起始合成线型α-1，4-葡聚糖的淀粉蔗糖酶均适于实施本发明的方法。 

至今，已知来源于几种细菌种类，尤其是主要来源于奈瑟氏球菌种的淀粉蔗糖酶(MacKenzie等，Can.J.Microbio.24(1978)，357-362)。 

因此，优选使用原核生物来源的淀粉蔗糖酶。已知的淀粉蔗糖酶例如来自深黄奈瑟氏球菌(Neisseria perflava)(Okada和Hehre，J.Biol.Chem.249(1974)，126-135；MacKenzie等，Can.J.Microbiol.23(1977)，1303-1307)，或来自狗奈瑟氏球菌(Neisseria canis)、灰色奈瑟氏球菌(Neisseria cinerea)、反硝化奈瑟氏球菌、干燥奈瑟氏球菌(Neisseriasicca)和微黄奈瑟氏球菌(Neisseria subflava)(MacKenzie等，Can.J.Microbiol.24(1978)，357-362)。而且，WO 95/31553描述了一种来自多糖奈瑟氏球菌(Neisseria polysaccharea)的淀粉蔗糖酶。优选使用原核生物天然分泌的淀粉蔗糖酶。 

在本发明的一个优选实施方案中，使用多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶。在多糖奈瑟氏球菌中表达的该酶极为稳定，并且与聚合产物结合非常紧密，并被反应产物果糖竞争性抑制(MacKenzie等，Can.J.Microbio.23(1977)，1303-1307)。对于奈瑟氏球菌种多糖奈瑟氏 球菌，淀粉蔗糖酶是分泌的(Riou等，Can.J.Microbiol.32(1986)，909-911)，而在其它奈瑟氏球菌种中，该酶存在于细胞中。尤其优选使用具有SEQ ID NO.5中所示氨基酸序列的淀粉蔗糖酶。 

在本发明的另一个优选实施方案中，使用纯化的淀粉蔗糖酶。在此情形中，纯化的淀粉蔗糖酶是基本上不含蛋白合成所在细胞的细胞成分的酶。优选地，术语“纯化的淀粉蔗糖酶”涉及纯度达到至少70％、优选至少85％、最优选至少90％的淀粉蔗糖酶。 

使用纯化蛋白制备α-1，4-葡聚糖有几个优点。与使用部分纯化的蛋白提取物的方法比较，本发明方法的反应介质不含生产菌株(微生物)的任何残余物，所述生产菌株系用于通过遗传工程的方式纯化或生产该蛋白。 

而且，在食品和制药工业中使用纯化蛋白有有利之处。如果确定了反应介质并已除去所有不必要的成分，则也可更为确切地确定产物的成分。在食品和制药工业中，对于通过生物技术生产的这些产品的市场核准，这将导致程序简化，特别是因为所述产物被认为不含有丝毫转基因微生物。 

在本发明中，分支酶(α-1，4-葡聚糖：α-1，4-葡聚糖6-糖基转移酶，E.C.2.4.1.18)是一种催化糖基转移反应的蛋白，在所述反应中，α-1，4-葡聚糖供体的α-1，4连接被水解，释放的α-1，4-葡聚糖链被转移至α-1，4-葡聚糖受体链上并转变为α-1，6连接。 

原则上，任何来源(细菌、真菌、植物、动物)的分支酶均适用于实施本发明方法(参照例如Baba等，Biochem.Biophys.Res.Commun.181(1991)，87-94；Kossmann等，Mol.Gen.Genet.203(1991)，237-244；Nakamura和Yamanouchi，植物生理学(Plant Physiol)99(1992)，1265-1266；Baecker等，J.Biol.Chem.261(1986)，8738-8743；Kiel等，基因(Gene)(1989)，9-17，等)。 

本领域技术人员可利用分子生物学的标准方法分离相应的基因，这些方法包括如Sambrook等(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY，USA(1989))所述的那些。 

在本发明的一个优选实施方案中，分支酶是原核生物的分支酶，优选来自奈瑟氏球菌属细菌，更优选来自反硝化奈瑟氏球菌，最优选来自如下所描述的本发明分支酶。尤其优选具有SEQ ID NO.1中描述的氨基酸序列的分支酶。 

在另一个实施方案中，分支酶是纯化的分支酶。在这种情况中，纯化分支酶是基本上不含蛋白合成所在细胞的细胞成分的酶。优选地，术语“纯化的分支酶”是指具有至少70％、优选至少80％和最优选至少90％纯度的酶。 

而且，在本发明方法中，优选使用重组制备的蛋白。在本发明中，所述蛋白是通过将编码所述蛋白的DNA序列引入宿主细胞并在其中表达而产生的蛋白。之后该蛋白可从宿主细胞和/或培养基中回收。宿主细胞优选细菌或原生生物(如真菌、尤其是酵母、藻类)，正如在如Schlegel“Allgemeine Mikrobiologie”(Georg Thieme Verlag，1985，1-2)中所定义的那样。特别地，优选由宿主细胞分泌的蛋白质。产生重组蛋白的这些宿主细胞可采用本领域技术人员已知的方法产生。 

酶学方法153(1987)，385-516，Bitter等(酶学方法153(1987)，516-544；Sawers等，应用微生物学和生物技术(Applied Microbiology andBiotechnology)46(1996)，1-9；Billmann-Jacobe，Current Opinion inBiotechnology 7(1996)，500-504；Hockney，Trends in Biotechnology12(1994)，456-463；和Griffiths等，分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)75(1997)，427-440综述了不同的表达系统。表达载体在文献中已有广泛的描述。除了筛选标记基因和保证在所选宿主中复制的复制原点外，这些表达载体通常还含有细菌或病毒启动子，大多数还含有转录终止信号。在启动子和终止信号之间，至少有一个限制性位点或多聚接头以允许编码DNA序列的插入。天然控制相应基因转录的DNA序列，如果其在所选宿主生物体中具有活性，则可用作启动子序列。然而，也可将所述序列换成其它启动子序列。既可使用实现基因的组成型表达的启动子，又可使用允许定向调节下游基因表达的诱导型启动子。具有这些性质的细菌和病毒启动子序列在文献中有广泛的描述。微生物 中的表达调节序列(例如大肠杆菌、酿酒酵母)在文献中已有充分的描述。允许下游基因的特异强表达的启动子包括，例如T7启动子(Studier等，酶学方法185(1990)，60-89)，lacuv5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等，Rodriguez和Chamberlin(编)的启动子、结构和功能(Promoters，Structure and Function)；Praeger，New York(1982)，462-481；DeBoer等，美国国家科学院院刊(1983)，21-25)、λp1、rac(Boros等，基因42(1986)，97-100)。通常，蛋白量在微生物生长循环的对数生长中期至大约末期达到其最高水平。因此，对于蛋白合成，优选使用诱导型启动子。这些诱导型启动子通常比组成型启动子导致更高的蛋白产量。由于克隆基因的恒定转录和翻译，强组成型启动子的使用经常导致用于其它必需细胞功能的能量的丧失，并由此减慢细胞生长(Bernard R.Glick/JackJ.Pasternak，Molekulare Biotechnologie(1995)，SpektrumAkademischer Verlag GmbH，Heidelberg Berlin Oxford，第342页)。因此，通常使用两步法来获得最佳蛋白产量。首先，在最佳条件下培养宿主细胞直到其达到相对高的细胞密度。在第二个步骤中，根据所用的启动子类型诱导转录。在此情形中，可被乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导的tac启动子尤其适合(DeBoer等，美国国家科学院院刊80(1983)，21-25)。转录终止信号在文献中也已有描述。 

通常可根据标准方法如描述于Sambrook等(分子生物学实验手册，第二版(1989)，Cold Spring Harbor Press，New York)中的方法，用编码相应蛋白质的DNA转化宿主细胞。宿主细胞培养在符合相应宿主细胞需要的培养基中。尤其应注意pH值、温度、盐浓度、通气情况、抗生素、维生素和痕量元素等。 

宿主细胞产生的酶可根据标准纯化技术纯化，这些技术如沉淀、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤、HPLC反相层析等。 

通过修饰在宿主细胞中表达的DNA，可以在宿主细胞中产生多肽，而且该多肽由于某些性质而更易于从培养基中分离出来。因此，可以将蛋白质和另一个多肽序列表达为融合蛋白，其中所述多肽序列具有特异结合性质以允许融合蛋白通过亲和层析进行分离(如Hopp等， Bio/Technology 6(1988)，1204-1210；Sassenfeld，TrendsBiotechnol.8(1990)，88-93)。 

在本发明方法的一个优选实施方案中，使用重组产生并由宿主细胞分泌至培养基的酶，这样由于分泌蛋白可从上清液中回收而无需破化细胞或作任何进一步的纯化。工艺过程中已知的方法如透析、逆向渗透、层析方法等可用于除去培养基的残余成分。同样的方法可用于将分泌至培养基的蛋白进行再浓缩。通常，微生物的蛋白分泌是通过N端信号肽(信号序列、前导肽)介导的。具有所述信号序列的蛋白可跨越微生物的细胞膜。蛋白的分泌可通过编码所述信号肽的DNA序列与编码酶的相应区域的连接来实现。 

优选(任选为天然存在的)信号肽为例如多糖奈瑟氏球菌淀粉蔗糖酶的信号肽。 

尤其优选产酸克雷伯氏菌M5A1的α-CGTase的信号肽(Fiedler等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)256(1996)，279-291)或GenBank中索引号X86014序列的第11529-11618位核苷酸编码的信号肽。 

作为可选择的方法，本发明方法中使用的酶还可采用体外转录和翻译系统产生，所述系统不使用微生物即可导致蛋白的表达。 

在另一个优选实施方案中，淀粉蔗糖酶和/或分支酶被固定在支持材料上。 

固定化酶具有如下优点，该酶作为合成反应的催化剂可以以简单的方式从反应混合物中回收，并可使用数次。因为酶的纯化通常需要大量的时间和金钱，固定化和再循环可相当大地节约成本。另一个优点是反应产物的纯度不含任何残余蛋白。 

用于固定化蛋白的可用支持材料有许多种，其中与支持材料的连接可通过共价或非共价结合来进行(综述见：酶学方法135、136、137)。例如琼脂糖、藻酸盐、纤维素、聚丙烯酰胺、二氧化硅或尼龙广泛用作支持材料。 

在该方法的另一个优选实施方案中，使用淀粉蔗糖酶和/或分支酶的(部分纯化)酶粗提物。在这种情况下，粗提物是与纯化酶相比，纯度 降低的淀粉蔗糖酶和/或分支酶制品(见实施例5和6)。 

在本发明的一个优选实施方案中，通过改变分支酶和淀粉蔗糖酶的蛋白活性比，改变α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的分支程度。在这种情况下，蛋白活性比是淀粉蔗糖酶和分支酶的蛋白活性比(u)。蛋白活性可按实施例7和8所述测定。当实施本发明方法时(见实施例9)，蛋白活性比(淀粉蔗糖酶单位/分支酶单位)的范围是1/4000-2000/1。 

在一个优选实施方案中，蛋白活性比的范围是1/1500-1500/1。在另一个优选实施方案中，蛋白活性比的范围是1/800-1300/1。在一个特别优选实施方案中，蛋白活性比的范围是1/400-1200/1。 

可通过改变蛋白活性比，使所获得的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的分支程度在0.05％至35％之间变化。在一个优选实施方案中，可在6位上改变α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的分支程度，从0.15％到25％，更优选从0.20％-15％，最优选从0.25％-12％。 

如果使用本发明的方法，尤其可产生分支程度比糖原更高的产物。 

在本发明中，分支程度是与所有不同方式连接的葡萄糖单位比较，O-6位分支链所占的平均份额。分支程度可通过甲基化分析来测定(参照实施例10)。 

在本发明方法的另一个优选实施方案中，通过改变蛋白活性比改变产物的分子量。尤其是，可以导致α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的合成的在反应过程中改变蛋白活性比。 

在本发明方法的另一个优选实施方案中，在不同的蔗糖浓度下实施该方法。原则上，对于该方法的实施可以采用的蔗糖浓度范围优选从1％至80％(w/v)，更优选从5％至50％，最优选从10％至40％。 

本发明中，分子量的测定采用Berry(J.Chem.Phys.44(1966)，第4550页)的光散射实验测定(聚合物溶液的光散射(Light Scattering fromPolymer Solutions)，编者：Huglin，M.B.，Academic Press，London，1972)。利用本发明方法，尤其可以将通过所述方法产生的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的分子量调节到1000-3000×10⁶的范围内。优选地，α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖具有100,000-1500×10⁶的分子量，更优选 100,000-1000×10⁶的分子量，更优选262,000-1000×10⁶的分子量，最优选262,000-499×10⁶的分子量。 

而且，本发明涉及通过上述本发明方法可获得的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖。所述α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的分支程度高于仅使用淀粉蔗糖酶活性时获得的至多25mol％的分支程度。 

在本发明的一个优选实施方案中，α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的分支程度为从0.05％-20％，优选0.15％-17％，更优选0.2％-15％，甚至更优选0.25％-13％，最优选0.3％-12％。在本发明的另一个实施方案中，分支程度从0.35％-11％，尤其是0.4％-10.5％。 

本发明的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖可用于上文关于本发明淀粉所述的食品和非食品工业。 

本发明中构建的质粒pBB48已根据布达佩斯条约的要求，于1988年9月25日保藏在国际保藏单位Braunschweig的Deutsche Sammlung yonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏号为DSM12425。 

图1用示意图显示质粒pBB48(DSM12425)的结构。 

图2显示了一些具有不同程度的α-1，6-分支链的α-1，4-葡聚糖，这些葡聚糖均是通过本发明方法产生的，并且之后经Lugol溶液染色。 

从左至右：淀粉蔗糖酶(左)，淀粉蔗糖酶+减少量的分支酶活性。相应样品的最大吸收是：615nm、486nm、500nm、526nm、534nm、560nm、577nm。 

图3显示了经异淀粉酶脱分支的高度分支加工产物(A)，和经异淀粉酶脱分支的大鼠肝糖原样品(B)的HPLC层析。 

图4显示了甲基化分析的示意图。 

图5显示了实施例9和10中描述的样品7在一个和两个甲基化步骤后的分析结果图。2，3，6-甲基化的值分别是96.12％和96.36％。 

图6图解说明检测的葡聚糖样品的末端(”2346Me”)和6-连接(“23Me”)葡萄糖单位的份额。 

图7和8显示了实施例中描述的样品3和7的气相色谱。 

图9以示意图形式显示了质粒pBE-fnr-Km。 

图10显示了分支酶的活性凝胶图谱。 

图11图解说明RVA的分布图。 

图12显示了与野生型比较，143-13A和143-59A系的颗粒大小分布。 

图13显示了与野生型植物的淀粉颗粒比较，显微放大的143-13A、143-43A和143-59A系的淀粉颗粒(德国Leitz的光学显微镜)。 

图14显示了与野生型植物的淀粉比较，不同转基因株系的淀粉胶体质地。该质地的测定采用了质地分析仪。 

图15显示了与野生型比较，143-11A、143-13A和143-59A系淀粉的RVA分布图。 

图16-18显示了HPLC色谱分析的结果，表现了143-WT(＝野生型)、143-13A和143-59A系的侧链分布情况。 

图19显示了图16-18中描述的色谱分析所使用的洗脱梯度。 

图20显示了图16-18中所分析淀粉中具有特定链长度的侧链分布偏离野生型的百分数。 

如下实施例阐明了本发明。 

材料： 

溶胞缓冲液：100mM Tris/HCl，pH8.5；5mM Na₂EDTA；2mM DTT；1mMPefabloc

洗涤缓冲液：50mM Tris/HCl，pH8.5；5mM Na₂EDTA；10％甘油 

HIC缓冲液：50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.0；5mM EDTA；2mM DTT；10％甘油 

牡蛎的II型牡蛎糖原(Sigma G8751) 

方法： 

淀粉分析 

(a)直链淀粉/支链淀粉比值的测定 

根据标准方法从马铃薯植物中分离淀粉，并根据Hovenkamp- Hermelink等(马铃薯研究(Potato Research)31(1988)，241-246)描述的方法测量直链淀粉与支链淀粉的比值。 

(b)磷酸含量的测定 

在淀粉中，葡萄糖单位的C2、C3和C6位可被磷酸化。为测定C6位的磷酸基团含量，在1ml 0.7M HCl中95℃水解100mg淀粉4小时(Nielsen等，Plant Physiol.105(1994)，11-117)。用0.7M KOH中和后，将50ml水解物用于光学酶学测试以测定葡萄糖-6-磷酸。在334nm处，测量试验混合物(100mM咪唑/HCl；10mM MgCl₂；0.4mM NAD；2个单位的肠膜明串珠菌葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；30℃)的吸光度改变。 

根据Ames(酶学方法VIII(1966)，115-118)的方法测定总磷酸含量。 

在30ul硝酸镁乙醇溶液中加入大约50mg淀粉，并在马弗炉中500℃灰化3小时。在残余物中加入300ul 0.5M盐酸，60℃孵育30分钟。然后，等分试样用0.5M盐酸补至300ul，并加入到100ul 10％维生素C与600ul溶于2M硫酸的0.42％钼酸铵的混合物之中，45℃孵育20分钟。 

然后，在820nm进行光密度测量，采用磷酸标准品作校准曲线。 

(c)胶体质地的测定(质地分析仪) 

在25ml水中剧烈搅拌2g淀粉(TS)(参照RVA)，之后将其密封并于25℃储存24小时。样品通过Stable Micro Systems固定在质地分析仪TA-XT2的探头(圆形头)之下，采用如下参数测量胶体质地： 

-测试速度0.5mm/s 

-透入深度7mm 

-接触面积113mm²

-压力    2g 

(d)粘度分布 

在25ml水中加入2g淀粉(TS)，并放置在Rapid Visco Analyzer(Newport Scientific Pty Ltd.，Investment Support Group，Warriewod NSW 2102，澳大利亚)中进行分析。该装置按厂家说明书进行操作。为测量淀粉水溶液的粘度，首先，将淀粉悬浮液从50℃加热至95℃，加热速度为每分钟12℃。然后，温度在95℃维持2.5分钟。接着，将该溶液以每分钟12℃的速度从95℃冷却至50℃。在整个时间内对粘度进行测量。 

利用依赖时间的粘度图的斜率确定成浆温度。如果该图的斜率高于1.2(该值是由使用者设定的)，计算机程序就将此刻测量的温度定为成浆温度。 

(e)葡萄糖、果糖和蔗糖的测量 

根据Stitt等描述的方法(酶学方法174(1989)，518-552)，测量葡萄糖、果糖和蔗糖的含量。 

(f)支链淀粉侧链分布的分析 

按Lloyd等所述方法(Biochem.J.338(1999)，515-521)，测量侧链的分布和制剂。应该指出，使用所述方法，仅有支链淀粉脱分支，而且在脱分支前通过百里酚沉淀将直链淀粉与支链淀粉分离开。选择如下条件进行洗脱(简要说明，提取物的洗脱分布图显示于图19)： 

(g)颗粒大小的测量 

采用德国Retsch GmbH的“Lumosed”型光沉降分析仪测量颗粒大小。 

在水溶液中测量颗粒大小的分布，并按厂家指示和根据文献如H.Pitsch，Korngr

βenbestimmung；LABO-1988/3Fachzeitschrift für Labortechnik，Darmstadt进行。 

(h)水结合容量的测量 

为测量水结合容量，通过离心分离70℃溶胀淀粉的可溶性部分之后，称重残留物。参考经可溶物校正的初始重量确定淀粉的水结合容量(WBV)。 

WBV(g/g)＝(残留物-(初始重量-可溶部分))/(初始重量-可溶部分)。 

                      实施例1 

     编码反硝化奈瑟氏球菌分支酶的基因组DNA的分离 

为了分离反硝化奈瑟氏球菌的分支酶，首先，建立基因组文库。为了该目的，保藏在ATCC保藏号为ATCC 14686的反硝化奈瑟氏球菌菌株细胞培养在Columbia血琼脂平板上，之后进行收获。根据Ausubel等的方法分离并纯化基因组DNA(当代分子生物学实验指南(1987)；J.Wiley&Sons，NY)。经限制性酶内切酶Sau3A的部分限制性消化后，与BamHI消化的噬菌体载体DNA(Stratagene的lambdaZAPExpress)进行连接。在进行噬菌体文库的体内切割后，获得的质粒转化大肠杆菌突变株(PGM-)(Adhya和Schwartz，J.Bacteriol.108(1971)，621-626)。当生长于麦芽糖上时，所述突变体形成线性多糖，该多糖在经碘染色后转变成蓝色。将60,000个转化体铺在含有IPTG(1mM)、卡那霉素(12.5mg/l)和麦芽糖(1％)的YT琼脂平板上，37℃孵育16小时后用碘蒸气作用。碘蒸后，筛选出60个红、棕或黄色的细菌菌落，并从其中分离出质粒DNA(Birnboim-Doly，核酸研究(Nucleic Acid Res.)7，1513-1523)。然后将分离的质粒用于再转化相同的大肠杆菌-(PGM)-突变体(Adhya和Schwartz，J.Bacteriol.108(1971)，621-626)。在重复铺板和碘蒸后，可将克隆从60个分离物减至4个。用这4个质粒进行限制性分析，在所有4个质粒中均有相同大小的一个EcoRI片段(1.6kb)(图1)。 

                    实施例2 

             质粒pBB48基因组片段的序列分析 

从实施例1获得的克隆(pBB48)分离1.6kb EcoRI片段，该克隆在载体pBK-CMV(Stratagene)中含有大约3.9kb的插入片段。为了进行DNA测序，将该片段克隆在经EcoRI切割的载体pBluescript中。对用该方法获得的质粒进行测序。然后，利用起始质粒pBB48确定编码分支酶的完整DNA序列和侧翼区序列(SEQ ID NO.1)。质粒pBB48显示于图1。该质粒的保藏号为DSM 12425。 

                    实施例3 

            在重组大肠杆菌细胞中表达分支酶 

一般地，大肠杆菌实验室菌株中表达内源性分支酶(glg B)。为此原因，使用大肠杆菌的G6MD2突变体，以检测分支酶的活性。大肠杆菌HfrG6MD2株(大肠杆菌遗传原种中心(E.coli Genetic Stock Center)，Yale大学，CGSC#5080)在葡聚糖合成基因区域有大范围的缺失(glgA，glgB，glgC)。为了检测分支酶活性，用质粒pBB48转化所述突变体，并制备增殖细胞的粗提取物。在聚丙烯凝胶上电泳分离所述粗提取物的蛋白质，然后在有或没有兔磷酸化酶B(100mM柠檬酸钠，pH7.0；AMP，葡萄糖-1-磷酸)的情况下进行孵育，以测量分支酶活性。紫色条带仅出现在磷酸酶刺激的凝胶中，该颜色指示强烈的分支酶活性。 

                        实施例4 

在无细胞系统中用蛋白粗提取物体外制备α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖 

为了表达分支酶，用质粒pBB48转化突变大肠杆菌G6MD2。将细胞培养在含有卡那霉素(12.5mg/l)的YT培养基中，在三角瓶中振荡培养16小时。离心(5000×g)后，用100mM Tris/HCl，pH7.5，1mM DTT洗涤获得的沉淀，悬浮在相同的缓冲液中后，用超声探头破碎细胞。再次离心(10,000×g)后，细胞碎片与可溶性蛋白分离开，获得蛋白浓度为大约10mg/ml的黄色上清液。 

从以该方式获得的蛋白粗提取物中取出不同的量(100ul，10ul，1ul，0.1ul，0.01ul，0.001ul)，加入恒定量的淀粉蔗糖酶，该酶溶在50ml 含有20％蔗糖和0.02％叠氮化钠的100mM柠檬酸钠，pH7.0中。几小时后，在反应混合液中观察到最初的混浊。三天后，离心混合物，并用去离子水洗涤形成的产物。 

产物在DMSO中是可溶的，而且通过使用Lugol溶液测量吸光谱可对其进行特征分析，从而可估计所形成产物的分支程度。为了该目的，用水高倍稀释DMSO溶液，并加入Lugol溶液，立即在Beckmann分光光度计中测量400nm-700nm的光谱(见图2)。 

通过HPLC(DIONEX；流动试剂：具有1M乙酸钠梯度的150mM NaOH)在Carbopak PA100柱上对异淀粉酶裂解下来的侧链进行分离，结果显示出强分支产物和经异淀粉酶脱分支的大鼠肝糖原具有相似的分离图谱(图3)。 

在与支链淀粉酶一起孵育后，侧链仅在非常小的程度上发生裂解。 

                        实施例5 

                分支酶的纯化和蛋白的N-端测序 

为了从pBB48转化的重组Hfr G5MD2大肠杆菌细胞(见上)中分离反硝化奈瑟氏球菌的分支酶，首先离心所述细胞的过夜培养物。然后将细胞沉淀重悬在3倍体积的溶胞缓冲液中，在弗氏压碎器中以大约16,000-17,000psi的压力进行破碎。10,000g离心1小时后，通过加入洗涤缓冲液将上清液稀释至4倍体积。然后，采用批量方法将其结合在DEAE纤维素DE52上，并装入层析柱，该层析柱用2-3倍体积的洗涤缓冲液洗涤。之后，线性1M NaCl梯度用于洗脱。合并具有分支酶活性的各部分(见实施例8)，加入(NH₄)₂SO₄(终浓度20％(w/v))，并施于TSK丁基Toyopearl 650M柱上。用2-3倍体积的HIC缓冲液洗涤后，之前HIC缓冲液中已加入20％饱和度的硫酸铵溶液(114g硫酸铵/升)，在HIC缓冲液中采用20％-0％的线性硫酸铵梯度洗脱分支酶。合并具有分支酶活性的各部分。为了浓缩该蛋白，之后采用小的TSK丁基Toyopearl 650M柱(ToseHaas(Montgomery Ville，Pennsylvania))对混合样品重复纯化步骤。然后，将该纯化蛋白施于聚丙烯酰胺凝胶，并转印至PVDF膜上，再次溶解并由德国Teltow的WITA GmbH，根据Edman方法进行N端测序。获得 的序列是：MNRNXH(SEQ ID NO.3)。 

                     实施例6 

                 淀粉蔗糖酶的纯化 

为了制备淀粉蔗糖酶，使用转化了编码多糖奈瑟氏球菌淀粉蔗糖酶的DNA的大肠杆菌细胞。该DNA具有SEQ ID NO.4中所示的核苷酸序列，来源于多糖奈瑟氏球菌的基因组文库。 

离心分泌多糖奈瑟氏球菌淀粉蔗糖酶的所述大肠杆菌细胞的过夜培养物，重悬在大约1/20体积的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)、10mM DTT(二硫苏糖醇)、1mM PSMF(苯甲基磺酰氟)中。然后，用弗氏压碎器以16,000psi的压力破碎细胞两次。之后，将1mM MgCl₂和benzonase(Merck产；100,000单位；250单位/ul)加入该细胞提取物至终浓度12.5单位/ml。之后，混合物在37℃孵育至少30分钟并伴随轻柔振荡。将提取物置于冰上至少1.5小时。然后，4℃以大约40,000g离心30分钟，直到上清液相对清亮为止。 

用孔直径为0.45um的PVDF膜(Millipore“Durapore”，或类似物)进行预过滤。将提取物置于4℃过夜。在进行HI-(疏水相互作用)层析前，向提取物加入固体NaCl，并将浓度调节至2M NaCl。然后，4℃以大约40,000mg离心力再次离心混合物30分钟。之后，通过孔直径0.22um的PVDF膜(类似于Millipore“Durapore”)过滤，从提取物中除去大肠杆菌的剩余残渣。过滤的提取物在丁基琼脂糖-4B柱(Pharmacia)(柱体积：93ml，长：17.5cm)上分离。将大约50ml具有1-5单位/ul直链淀粉活性的提取物上柱。然后，用150ml缓冲液B(缓冲液B：50mM柠檬酸钠，pH6.5，2MNaCl)将非结合蛋白从柱上洗脱下来。最后，用线性NaCl梯度(433ml体积溶于50mM柠檬酸钠的2M-OM NaCl，流速为1.5ml/分钟)洗脱淀粉蔗糖酶，其中所述梯度利用自动泵系统(FPLC，Parmacia)产生。淀粉蔗糖酶的洗脱发生在0.7M和0.1M NaCl之间。收集各部分，在PD10sephadex柱(Pharmacia)进行脱盐，用8.7％甘油稳定，检测直链淀粉蔗糖活性并最终在储存缓冲液(8.7％甘油，50mM柠檬酸盐)中深度冷冻。 

                    实施例7 

                测定淀粉蔗糖酶活性 

在1ml反应混合液(含有5％蔗糖，0.1％糊精和100mM柠檬酸盐，pH6.5)中37℃孵育不同稀释度的纯化蛋白或蛋白粗提取物以测定淀粉蔗糖酶活性。0分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟和360分钟后，从所述混合液中每次取10ul，立即加热至95℃以终止淀粉蔗糖酶的酶活性。然后，在混合光密度实验中测定淀粉蔗糖酶释放的果糖比例。将1-10ul失活样品置于1ml 50mM咪唑缓冲液，pH6.9，2mMMgCl₂，1mM ATP，0.4mM NAD+和0.5U/ml己糖激酶中。顺序加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(来源于肠膜明串珠菌)和磷酸葡萄糖异构酶之后，在340nm测量吸光度的改变。之后，通过Lambert-Beer规则计算释放的果糖量。 

如果将获得的值与取样时间相关联，则可确定单位数(1U＝umol果糖/分钟)(每ul蛋白提取物或ug纯化蛋白)。 

                        实施例8 

            测定反硝化奈瑟氏球菌分支酶的酶活性 

根据文献(Krisman等，分析生物化学(Analytical Biochemistry)147(1985)，491-496；Brown和Brown，酶学方法8(1966)，395-403)描述的方法，测定分支酶的酶活性。该方法基于的原则是：分支葡聚糖比非分支α-1，4-葡聚糖具有低的碘结合亲和性。 

为测定分支酶的酶活性，将一系列不同稀释度的分支酶样品置于冷却的微滴定板中。然后，通过加入190ul直链淀粉反应混合物(其制备见下文)起始反应，并在恒温箱中37℃孵育。正好30分钟后，加入100ul Lugol溶液(0.5mM)终止反应，在微滴定读数装置(Molecular Devices)中650nm测量样品。无直链淀粉的混合物作用对照。具有最大消光值的含有直链淀粉但不含分支酶的参考样品的OD₆₅₀为1.2。 

为了能更好地比较独立实验，仅将在30分钟孵育时间内导致OD₆₅₀降低0.5单位的样品稀释液用于计算。 

分支酶的活性单位(U)定义：

在所述测试中30分钟内引起OD₆₅₀从1.2至0.7降低0.5单位的酶量是1/2单位的分支酶。 

直链淀粉反应混合物的制备：

在1ml DMSO中的0.5％(w/v)直链淀粉溶液(厂家：Fluka；直链淀粉来自马铃薯)中搅拌加入10ml柠檬酸缓冲液(100mM，pH6.5，0.02％w/vNaN₃).为了进行测量，用柠檬酸缓冲液按1∶4-1∶8的比例再次稀释澄清的储存液。在测试中，所用参考样品的Lugol溶液吸光度值应为1.2(最大)。 

                        实施例9 

        制备具有不同分支程度的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖 

为了制备具有不同分支程度的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖，在20％蔗糖溶液(w/v)中加入纯化的多糖奈瑟氏球菌淀粉蔗糖酶(参照实施例6)和纯化的反硝化奈瑟氏球菌分支酶(参照实施例5)，反应体积为10.86ml。根据测试混合物，这两种酶按不同蛋白活性比值进行使用(对于淀粉蔗糖酶的测定见实施例7；对于分支酶的测定见实施例8)(见表1)： 

淀粉蔗糖酶制剂：6.2U/mg；1.8mg/ml 

分支酶制剂：75U/mg；6.9mg/ml 

                            表1 

BE＝分支酶 

Amsu＝淀粉蔗糖酶 

单位＝测定见实施例7和8 

                            实施例10 

                   利用甲基化分析测定分支程度 

利用甲基化分析测定所获葡聚糖的分支程度。 

1.进行的实验 

-对葡聚糖样品的所有游离OH基团进行甲基化，每次进行两次测量 

-水解完全甲基化聚合物，之后在C-1进行还原并对单体混合物进行乙酰化 

-对反应产物进行气相色谱分析和定量 

利用甲基化分析确定葡聚糖样品的分支程度(见图4)。通过转化成甲基醚标记聚合物的游离OH基团。 

以酸水解方式降解成单体，并产生部分甲基化葡萄糖分子，该分子以 吡喃糖苷/呋喃糖苷形式和以α-和α-葡糖苷存在。在相应部分甲基化的山梨糖醇衍生物中通过NaBH₄还原显示(focus)这些变体。随后通过游离OH基团的乙酰化，可利用气相色谱检测反应产物。 

下表显示了所获葡聚糖的质地和DMSO溶解性。 

                        表2 

n.d.＝未测定 

2.实验部分 

a)DMSO溶液的制备 

在DMSO中制备1％的溶液(w/v)。并不是所有的样品在室温均有良好的可溶性：1、3和13必需在110℃加热30分钟。除了溶液1和3有轻微浑浊外，其它均是光学透明溶液(参照表2)。 

b)甲基化 

将2ml DMSO溶液(即20mg聚合物)转移至含有50ml氮气烧瓶中，在N₂流中将其加入5当量/OH(eq/OH)新鲜制备的dimsyl 溶液中，搅拌30分钟。溶液变得浑浊和粘稠。在冰浴中冷却烧瓶中的内容物，加入10eq/OH碘甲烷并在融化后搅拌混合液至少2小时。在第二次去质子化和甲基化步骤之前，在真空装置中除去多余的碘甲烷。 

在除去多余碘甲烷后，每次10ml二氯甲抽提5次之后，加入50ml水进行处理。用水抽提3次从有机相去除痕量DMSO，然后用CaCl₂ 干燥有机相，过滤并浓缩。产物为透明黄色薄膜。 

利用样品7，首先检查对于羟基基团的完全甲基化需要多少甲基化步骤。在第一次甲基化后，对一半混合物进行处理，另一半再次甲基化。在两个样品均发生降解后，比较GC分析结果。首先，发现在一个甲基化步骤后反应几乎是定量的(参照图5)。为鉴定C-3位的可能分支，该分支似乎也可能仅因所述位置的继甲基化而存在，在任何情况下均进行第二次甲基化。 

图5显示了在一个和两个甲基化步骤后样品7分析结果的图表；2，3，6-甲基化的值分别是96.12％和96.36％。 

c)水解 

2mg甲基化样品在1ml压力玻璃器皿中称重，加入0.9ml 2M三氟乙酸，并在120℃搅拌2.5小时。冷却玻璃器皿后，混合物在N₂流中浓缩。为了除去痕量的酸，三次加入甲苯并排除。 

                                    表3甲基化数据 

¹⁾在第一个甲基化步骤后取出了该样品的一半并进行了处理，因此，没有获得确切数据。 

²⁾小量是由于处理中的错误所致。 

d)还原 

在前一个反应步骤的剩余物中加入0.5ml 0.5M含氨NaBD₄溶液，并于60℃搅拌1小时。用几滴冰乙酸小心破坏该试剂。通过5次加入15％乙酸甲醇溶液以及之后以硼酸三甲基酯的形式进行挥发，除去产生的硼酸酯。 

e)乙酰化 

在前一步骤的剩余物中加入50ul吡啶和250ul乙酸酐，95℃搅拌2小时。冷却后，将反应混合物滴入10ml饱和NaHCO₃溶液 中，并用二氯甲抽提5次。利用气相色谱检查有机相的反应产物(产物，参照图4)。 

f)气相色谱分析 

采用具有柱上入口和FID检测器的Carlo Erby GC 6000Vega系列2进行气相色谱测定。在称作Supelco SPB5的融合硅胶毛细管柱(内直径0.2mm，长30m)上，采用氢作为载气并在80kPa压力下进行分离。使用如下温度程序：60℃(1min)-25℃/min→130℃-4℃/min→280℃。 

3.结果 

按Sweet等的方法(Sweet等，Carbohydr.Res.40(1975)，217)，通过鉴定波峰，对波峰面积进行积分并利用ECR原理校正数据，分析气相色谱。 

在样品1和3中可观察到的1，6-脱水化合物是由于C-6位的高分支度造成的。在水解过程中，这导致产生C-6位具有游离OH基团的单体，这些单体在该反应条件下可进一步反应形成其衍生物。当计算分支程度时，这些部分必须加在“2，3-Me”值上。图6说明了所检葡聚糖样品的末端(“2345Me”)和6-连接(“23Me”)葡萄糖单位的比例。 

表4：以mol％表示的分析结果：简写(A、B等)与图1中的相应；“16AnhPy”＝1，6-脱水-4-O-乙酰-2，3-二-O-甲基-D-吡喃葡萄糖；“16AnhFu”＝1，6-脱水-5-O-乙酰-2，3-二-O-甲基-D-呋喃葡萄糖；“Me1”和“Me2”代表相应样品的两个独立的甲基化分析。 

[0394] 

[0396]                         实施例11 

    制备具有不同分子量的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖 

为了制备具有不同分子量的α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖，在20％蔗糖溶液(w/v)中加入纯化的多糖奈瑟氏球菌淀粉蔗糖酶(参照实施例6)和纯化的反硝化奈瑟氏球菌分支酶(参照实施例5)，反应体积为10.86ml。根据测试混合物，这两种酶按不同蛋白活性比值使用(对于淀粉蔗糖酶的测定见实施例7；对于分支酶的测定见实施例8)(参照表1)。利用光散射(聚合物溶液的光散射；编者：Huglin，M.B.，Academic Press，London，1972)测量分子量和惰性半径R_g。将干燥样品1-11溶解在DMSO，水中(比例为90∶10)，在光散射测量装置(SOFICA，法国检测及分析仪器公司，LeMesnil Saint-Denis，法国)中分析不同稀释液(大约2.5g/l-0.25g/l)。根据Berry(J.Chem.Phys.44(1996)，4550页及随后页)对以该方式获得的数据进行处理。 

                             表5 

n.d.＝未测定 

                    实施例12 

        构建用于转化植物以实现反硝化奈瑟氏球菌 

                分支酶质体表达的表达盒 

通过PCR使用寡核苷酸BE-5’和BE-3’(SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7)从质粒pBB48(保藏在Braunschweig的Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心)中，保藏号为DSM 12425)扩增编码反硝化奈瑟氏球菌分支酶的序列。用限制性内切酶Sall和Sdal消化由此获得的扩增序列，并将其克隆至Sall和Sdal消化的质粒pBinAR-fnr中。所获质粒表示为pBE-fnr-Km(图9)。 

PCR条件： 

缓冲液和聚合酶是Boehringer Mannheim产品(Pwo聚合酶号：1644947) 

DNA                     0.2ng 

10×缓冲液+MgSO₄        5ul 

dNTP(各10mM)            1ul 

引物BE-5’              120nM 

引物BE-3’              120nM 

Pwo聚合酶               1.0单位 

蒸馏水                  补足50ul 

反应条件： 

步骤1    95℃            2:00分钟 

步骤2    95℃            0:30分钟 

步骤3    66℃            0:30分钟 

步骤4    72℃            2:00分钟(每个循环增加1秒) 

步骤5    72℃            8:00分钟 

步骤2-4重复40个循环。 

根据标准方法(见上)使用质粒pBE-fnr-Km转化马铃薯植物。 

                    实施例13 

    鉴定和检测具有分支酶活性的转基因马铃薯植物 

利用Northern印迹杂交分析，可以从根据实施例12产生的转基因马铃薯植物中鉴定出表达反硝化奈瑟氏球菌分支酶mRNA的植物。为了检测稳定转化植物中的分支酶活性，将待检植物的叶材料在液氮中深冻，然后在液氮预冷的研钵内磨碎。在磨碎材料融化前，加入抽提缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH6.5，4mM DTT，2mM氯化钙)。大约100mg(鲜重)植物材料加入约200ul抽提缓冲液。通过离心(10,000×g)分离抽提缓冲液和磨碎的植物材料悬浮物的固体成分。取一份由此获得的清澈上清液与四分之一抽提体积的电泳缓冲液(40％甘油，250mM Tris，pH8.8，0.02％溴酚蓝)混合，并以每块胶20mA恒定电流强度在聚丙烯酰胺凝胶(见下)上分离。(蛋白提取物上样前，凝胶在上述条件下电泳20分钟)。在电泳缓冲液中的溴酚蓝染料跑出凝胶后，终止电泳。然后，在5倍凝胶体积的洗涤缓冲液(100mM柠檬酸钠，pH6.5)中室温搅动下平衡凝胶5次，每次20分钟。之后，在5倍凝胶体积的孵育缓冲液(100mM柠檬酸钠，pH6.5，5％蔗糖，0.625单位纯化的多糖奈瑟氏球菌淀粉蔗糖酶(对于该酶的纯化和活性测定见上))中30℃孵育凝胶16小时。轻轻倒出孵育缓冲液并加入Lugol溶液(按1∶5稀释)之后，通过淀粉蔗糖酶与分支酶组合，形成的葡聚糖变为可见的蓝棕色条带(图10)。整个剩余的聚丙烯酰胺凝胶由于孵育缓冲液中的淀粉蔗糖酶活性转变成蓝色。 

聚丙烯酰胺凝胶的组成： 

a)分离胶 

375mM Tris，pH8.8 

7.5％聚丙烯酰胺(Biorad no.EC-890) 

为了聚合加入： 

1/2000体积的TEMED 

1/100体积的过硫酸铵 

b)积层胶 

125mM Tris，pH6.8 

4％聚丙烯酰胺(Biorad no.EC-890) 

为了聚合加入： 

1/2000体积的TEMED 

1/100体积的过硫酸铵 

c)电泳缓冲液 

375mM Tris，pH8.8 

200mM甘氨酸 

                    实施例14 

            分析分支酶活性提高的植物的淀粉 

根据标准技术，从根据实施例12和13产生的转基因马铃薯植物中分离淀粉，并检测其物理和化学性质。发现该转基因马铃薯植物形成的淀粉不同于野生型植物合成的淀粉，例如在其磷酸含量、粘度和通过RVA测定的成浆性质方面均不同。基于上述分析技术获得的改性淀粉物理化学性质的结果显示在下表中。 

图例： 

143-13A、143-11A、143-59A＝过表达反硝化奈瑟氏球菌分支酶的转基因马铃薯植物。 

RVA＝快速粘度分析仪(Rapid Visco Analyzer) 

max.＝最大粘度＝峰值粘度 

min.＝最小粘度 

fin.＝测量结束时的粘度 

set.＝逆转＝min.与fin.之间的差 

T＝成浆温度 

除了直链淀粉含量外，百分数值是相对野生型(＝100％)而言的。 

RVA分析、淀粉颗粒大小分布和胶体质地分析的结果也显示在图11- 15中。 

而且，图16-18显示了HPLC色谱分析的结果，说明了143-WT(＝野生型)、143-13A和143-59A系的侧链分布情况。图19显示了用于HPLC分析的洗脱梯度。在图20中，显示了具有特定链长度的侧链偏离野生型的百分数。 

以下两个表解释了侧链比例的计算方式。 

                                    表7 

A1、A2、C1和C2栏中的峰面积是通过Dionex的应用程序AI 450，3.31版测量的。 

                            表8 

[0463]                         序列表 

Claims (16)

1.选自下组的编码奈瑟氏球菌属细菌分支酶的核酸分子：

(a)由SEQ ID NO.2中所示氨基酸序列组成的蛋白的编码核酸分子；

(b)由SEQ ID NO.1中所示编码区组成的核酸分子；

(c)由质粒DSM 12425中插入片段编码的氨基酸序列组成的蛋白质的编码核酸分子；

(d)由包括在质粒DSM 12425插入片段中的分支酶的编码区组成的核酸分子；和

(e)其序列由于遗传密码的简并性而不同于(a)、(b)、(c)或(d)的核酸分子的序列的核酸分子。

2.含有根据权利要求1的核酸分子的载体。

3.根据权利要求2的载体，其中所述核酸分子按有义链方向与保证原核或真核细胞中转录的调节序列连接。

4.经权利要求1的核酸分子，或权利要求2或3的载体遗传修饰的宿主细胞。

5.制备奈瑟氏球菌属细菌分支酶的方法，其中权利要求4的宿主细胞在允许该蛋白表达的条件下培养，并从培养细胞和/或培养基分离该蛋白。

6.制备奈瑟氏球菌属细菌分支酶的方法，其中使用权利要求1的核酸分子在体外转录和翻译系统中产生该蛋白。

7.由权利要求1的核酸分子编码的、或通过权利要求5或6的方法可获得的蛋白质。

8.特异识别权利要求7的蛋白质的抗体。

9.权利要求7的蛋白质在体外系统中制备α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖中的应用。

10.含有权利要求1的核酸分子的转基因植物细胞，其中所述核酸分子与保证在植物细胞中转录的调节序列连接。

11.含有权利要求10的转基因植物细胞，其中所述核酸分子与保证编码蛋白在细胞质体中定位的信号序列的编码序列连接。

12.制备转基因植物的方法，其中：

(a)通过引入权利要求1的核酸分子或权利要求2或3的载体遗传修饰植物细胞；

(b)从根据步骤(a)产生的细胞再生植物；并且

(c)任选性地从根据步骤(b)产生的植物产生更多植物。

13.可从权利要求10或11的转基因植物细胞、含有权利要求10或11的植物细胞的转基因植物或通过权利要求12的方法可获得的转基因植物获得的淀粉。

14.根据权利要求13的淀粉，其中所述淀粉的组成被改变，以致与相应野生型植物的淀粉比较，其具有增加的胶体质地和/或降低的磷酸含量和/或降低的峰值粘度和/或降低的成浆温度和/或降低的淀粉颗粒大小和/或改变的侧链分布。

15.在细菌细胞中天然控制权利要求1的核酸分子的转录的调节区，其由选自下组的核苷酸序列组成：

(a)由SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列的第1-169位核苷酸组成的核苷酸序列；和

(b)包含在质粒DSM 12425的插入片段中的调节区的核苷酸序列。

16.使用蔗糖底物和淀粉蔗糖酶与分支酶的酶组合制备α-1，6-分支α-1，4-葡聚糖的体外方法，其中通过分支酶和淀粉蔗糖酶的蛋白活性比来控制分支程度和分子量，其中所述分支酶是由权利要求1的核酸分子编码的。

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