CN100489090C - 具有提高的淀粉蔗糖酶蛋白和提高的分支酶活性的遗传修饰的植物细胞和植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有提高的淀粉蔗糖酶蛋白活性和提高的分支酶活性的转基因植物细胞和植物。这类植物细胞和植物合成改性淀粉和/或合成在O-6-位上带有改变的支化度的α-1，6支链α-1，4-葡聚糖类和/或与相应的非遗传修饰的野生型植物(植物细胞)相比获得较高产量。

Description

具有提高的淀粉蔗糖酶蛋白和提高的分支酶活性的遗传修饰的植物细胞和植物
本发明涉及具有提高的淀粉蔗糖酶蛋白活性和提高的分支酶活性的转基因植物细胞和植物。这类植物细胞和植物与相应非遗传修饰的野生型植物(植物细胞)相比可合成改性淀粉和/或合成在0-6-位上带有改变的支化度的α-1，6支链α-1，4-葡聚糖类和/或获得较高产量。
在农业和林业领域中，生产具有提高的产量的植物，特别是为了确保持续增长的世界人口的食品需求和保证再生原料的供应，已经成为一个持久的努力方向。在传统上，已经进行了通过培育获得高产植物的尝试。对于每一所关注的植物物种来说，必须进行相应的培育程序。然而，这要花费大量的时间和劳动。已经部分通过对植物的遗传操作、即通过在植物中有目的的引入和表达重组核酸分子而取得了进展。这类手段具有如下优点：一般来说，它们并不限于一个植物物种，而可以将一个植物物种转化成其它植物物种。因此，看起来需要提供可得到高产量的植物细胞和植物并提供用于生产这类植物细胞和植物的方法。
鉴于近来正在逐步增长的与作为再生原料来源的植物物质结合的重要性，为生产工业的要求而调整这些植物原料作努力是生物技术研究中的任务之一。为了有利于在尽可能多的应用领域中使用再生原料，另外必不可少的是获得大量的各种物质。此外，必须增加这些植物物质的产量以便提高生产再生植物原料来源的效率。
除油、脂肪和蛋白质外，多糖是最重要的再生植物原料。除纤维素外，淀粉与多糖一起起重要作用，因为它是高等植物中最重要的储备物质之一。
除多糖淀粉在食品中的应用外，它还可以广泛用作生产工业化产品的再生原料。
多糖淀粉由化学上一致的基本成分，葡萄糖分子组成，但它可以形成具有不同聚合度和支化度且由此主要在其物理和化学特性方面存在差异的不同分子的复杂的混合物。
在主要由α-1，4-糖苷键连接的葡萄糖单位组成的非支化聚合物直链淀粉与支化是因存在其它α-1，6-糖苷键而产生的支化聚合物支链淀粉之间进行区分。按照文献中所述(Voet和Voet，《生物化学》(Biochemistry)，John Wiley & Sons，1990)，平均每24-30个葡萄糖残基出现一个α-1，6-糖苷键。这符合约3％-4％的支化度。具体的支化度是可变的且取决于各淀粉的来源(例如，植物物种、植物变种等)。通常用于淀粉的工业化生产的植物的总淀粉含量中的直链淀粉含量在10-25％之间改变。
为了有利于广泛应用诸如例如淀粉这样的多糖，看起来需要提供在多糖组成上改变的植物，且例如这些植物能够合成特别适合于不同应用的改性淀粉和/或高度支化的α-1，6-α-1，4-葡聚糖类。除培育法外，生产这类植物的一种可能性是有目的的通过遗传工程法改变产淀粉的植物中的淀粉代谢。然而，有关的先决条件是对淀粉合成和/或改性过程中起作用的酶进行鉴定和特征记述并分离编码这些酶的相应DNA分子。
使淀粉形成的生物化学合成途径基本上是公知的。植物细胞中的淀粉合成发生在质体中。在光合活性组织中，它们发生在叶绿体中，在储藏淀粉的无光合活性组织中，它们发生在造粉体中。
参与淀粉合成的最重要的酶是淀粉合酶(例如，参见专利申请WO96/15248)、R1-酶(例如，参见WO 97/11188)以及分支酶(例如，参见WO 92/14827)。在淀粉的生物合成过程中诸如例如淀粉磷酸化酶(例如，参见WO 98/40503)这样的其它酶的确切作用尚未了解。
为了以植物合成改性淀粉这样一种方式进一步提供改变任意植物的可能性，也可能引入在野生型植物中不存在且编码参与多糖合成的蛋白质的外源核酸分子，诸如例如细菌或真菌的。例如，可以证实能够通过在造粉体中对细菌果糖基转移酶进行造粉粒表达来合成所谓的“淀粉果聚糖”(Smeekens，《植物科学趋势》(Trends in Plant Science)第2卷第8期(1997)，286-288)。
对马铃薯植物中的细菌糖原合酶进行异源表达导致与野生型植物相比直链淀粉的含量轻度下降、支化度增加且支链淀粉的支化模式改变(Shewmaker等，《植物生理学》(Plant.Physiol.)104(1994)，1159-1166)。
此外，细菌分支酶在不含直链淀粉的马铃薯突变株(amf)(Jacobsen等，Euphytica，44(1989)，43-48)中的马铃薯植物中的表达导致支链淀粉分子具有的分支点(Kortsee等，《植物杂志》(The Plant Journal)10(1)，(1996)，83-90)比对照分子(amf)多25％。这种分支点的增加是由于改变较长侧链的链长分布有利于较短侧链所造成的。在碘染色后平均链长的下降和λmax的减少也是转化植物中支链淀粉的支化结构多于未转化植物中支链淀粉的支化结构的标志(Kortstee等，参见上文)。然而，通过这种手段不能够获得约10％的糖原支化度。主要在动物和细菌中发现的一种多糖即糖原含有高度支化的α-1，6-α-1，4-葡聚糖类。糖原在侧链的平均长度和聚合度方面也不同于淀粉。按照文献中所述(Voet和Voet，《生物化学》(Biochemistry)，John Wiley & Sons，1990)，糖原平均每8-12个葡萄糖残基含有一个α-1，6-分支点。这符合约8％-12％的支化度。糖原分子量存在在1百万-大于10亿之间改变的各种数值(D.J.Manners：《碳水化合物化学进展》(Advances in CarbohydrateChemistry)，编辑：M.L.Wolfrom，Academic Press，New York(1957)，261-298；Geddes等，《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)，261(1994)，79-89)。这些数值也非常依赖于相应的生物体来源、其营养状态以及所分离糖原的种类。通常通过昂贵和耗时的方法从贝类(例如壳菜紫贻贝)、哺乳动物肝脏或肌肉(例如家兔、大鼠)中获得它(Bell等，《生物化学杂志》(Biochem.J.)28(1934)，882；Bueding和Orrell，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)236(1961)，2854)。此外，在植物中，例如在玉米的su1-突变株中发现了所谓的藻糖原，它具有约10％的支化度且与支链淀粉相比表现出改变的侧链分布(Yun和Matheson，《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)，243(1993)，307-321)和不同的溶解度特性。然而，这类累积藻糖原的植物表现出最高达90％的淀粉含量下降(Zeeman等，《植物细胞》(PlantCell)10，(1998)，1699-1711)。
此外，描述了使用淀粉蔗糖酶和分支酶合成α-1，6-支链α-1，4-葡聚糖类的体外方法，其中包括生产高度支化的(类似糖原的)葡聚糖类(德国专利申请DE 19846635.8)。然而，其中并未描述在植物中生产这类糖原。
因此，看起来需要提供以合理的价格生产改性淀粉和/或与植物中的野生型植物相比在0-6-位上具有改变的支化度的α-1，6-α-1，4-葡聚糖类的另一种方法。
因此，构成本发明基础的技术问题是提供与相应未修饰的野生型植物细胞和野生型植物相比含有在植物细胞和植物中含有的改变的多糖组成且如果可能还表现出较高产量的植物细胞和植物。
这一问题已经通过提供权利要求中所表征的实施方案而得到了解决。
因此，本发明涉及遗传修饰的转基因植物细胞，其中所述的遗传修饰是引入一种外源核酸分子或几种外源核酸分子，与相应的非遗传修饰的野生型植物的植物细胞相比所述外源核酸分子的存在或表达可导致淀粉蔗糖酶蛋白的活性和分支酶蛋白的活性提高。
所述的遗传修饰可以是导致淀粉蔗糖酶活性提高和分支酶活性提高的任意遗传修饰。
在一个优选的实施方案中，所述的遗传修饰是将编码淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶的一种外源核酸分子引入植物细胞的基因组中。
例如，这种外源核酸分子可以是所谓的“双构建体”，它是一种用于植物转化的含有既编码淀粉蔗糖酶蛋白和也编码分支酶的遗传信息的单一载体。
编码均包含在所述“外源核酸分子”中的淀粉蔗糖酶和分支酶的核酸分子可以彼此独立地在各自启动子的控制下或它们在融合成翻译单元后可以在相同启动子的控制下。
在另一个优选的实施方案中，将几种外源核酸分子引入植物细胞的基因组，其中一种外源核酸分子编码淀粉蔗糖酶蛋白且另一种核酸分子编码分支酶。
由此可以将所述的外源核酸分子同时或连续引入植物细胞的基因组。在第一种情况中，将其称作“共转化”，在后一种情况中，将其称作“超转化”。
因此术语“转基因”指的是本发明的植物细胞含有可稳定地整合入基因组的至少一种外源，优选两种外源核酸分子，优选一种或两种编码淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶的核酸分子。
术语“外源核酸分子”优选指的是编码具有淀粉蔗糖酶活性的蛋白质和具有分支酶活性的蛋白质且不会天然存在于相应植物中或不会以确切的空间次序天然存在于植物中或定位于不会天然存在的植物基因组中的一定位置上的核酸分子。优选所述的外源核酸分子是一种由不同元件组成的重组分子，这些不同元件的组合或特定空间次序不会天然存在于植物中。本发明的植物含有至少一种外源核酸分子，这种核酸分子可编码优选与调节DNA元件连接的具有淀粉蔗糖酶活性的蛋白质和具有分支酶活性的蛋白质，所述的调节DNA元件可保证植物中的转录，特别是使用启动子的转录。
术语“几种外源核酸分子”优选指的是两种核酸分子，其中一种外源核酸分子编码淀粉蔗糖酶蛋白且第二种外源核酸分子编码分支酶。
原则上，所述的外源核酸分子可以是编码淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶的任意核酸分子。
在本发明中，淀粉蔗糖酶蛋白(蔗糖：1，4-α-D-葡聚糖4-α-葡糖基转移酶，E.C.2.4.1.4.)指的是一种优选在体外催化蔗糖转化成水不溶性α-1，4-葡聚糖类和果糖的酶。提出了有关这种酶的下列反应图解：
蔗糖+(α-1，4-D-葡聚糖)n→D-果糖+(α-1，4-D-葡聚糖)n+1
这是一种转糖基反应。这种体外反应的产物是水不溶性α-1，4-葡聚糖类和果糖。
核苷酸活化的糖类或辅因子对该反应来说并非必要。然而，在体外由存在的诸如例如麦芽寡糖类、糊精或糖原这样的葡糖基受体(或引物)刺激所述酶，在所述的葡糖基受体上按照上述反应图解转化蔗糖的糖残基，同时伴随有α-1，4-葡聚糖的链延伸(Remaud-Simeon等，S.B.Petersen，B.Svenson和S.Pedersen(编辑)：《碳水化合物生物工程》(Carbohydrate  bioengineering)313-320(1995)；ElsevierScience B.V.，Amsterdam，Netherlands)。
一般来说，在本发明中，所有催化由蔗糖合成直链α-1，4-葡聚糖的淀粉蔗糖酶均是合适的。
迄今为止仅已知淀粉蔗糖酶来源于细菌种类，特别是主要来自奈瑟氏球菌属的种类(MacKenzie等《加拿大微生物学杂志》(Can.J.Microbiol.)24(1978)，357-362)。
因此，优选使用来源于原核生物的淀粉蔗糖酶。例如，已知淀粉蔗糖酶来源于深黄奈瑟氏球菌(Okada和Hehre，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)249(1974)，126-135；MacKenzie等《加拿大微生物学杂志》(Can.J.Microbiol.)23(1977)，1303-1307)或狗奈瑟氏球菌、灰色奈瑟氏球菌、反硝化奈瑟氏球菌、干燥奈瑟氏球菌和微黄奈瑟氏球菌(MacKenzie等《加拿大微生物学杂志》(Can.J.Microbiol.)24(1978)，357-362)。此外，WO 95/31553和PCT/EP98/05573中描述了来源于多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶。
在本发明另一个优选的实施方案中，所述的外源核酸分子编码来自奈瑟氏球菌属的细菌的淀粉蔗糖酶。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述的外源核酸分子编码来源于多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶，更优选编码具有如国际专利申请PCT/EP98/05573中所公开的核酸或氨基酸序列的淀粉蔗糖酶。
在多糖奈瑟氏球菌中表达的酶是极其稳定的，它与聚合产物牢固连接并以竞争性方式被反应产物果糖所抑制(MacKenzie等《加拿大微生物学杂志》(Can.J.Microbiol.)23(1977)，1303-1307)。使用奈瑟氏球菌属的种类多糖奈瑟氏球菌分泌淀粉蔗糖酶(Riou等《加拿大微生物学杂志》(Can.J.Microbiol.)32(1986)，909-911)，而在使用其它奈瑟氏球菌属的种类时，淀粉蔗糖酶保留在细胞中。
分支酶(α-1，4-葡聚糖：α-1，4-葡聚糖6-葡糖基转移酶，E.C.2.4.1.18)是一种催化转糖基反应的蛋白质，其中α-1，4-葡聚糖供体的α-1，4-键被水解且在此过程中处于游离状态的α-1，4-葡聚糖链被转到α-1，4-葡聚糖受体链上且由此被转化成α-1，6-键。
一般来说，与本发明有关的任意来源(细菌、真菌、植物、动物)的所有分支酶均是合适的，例如：来自玉米的分支酶(例如，参见Baba等《生物化学和生物物理学通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)181(1991)，87-94；基因库登记号AF072724、AF072725)；来自马铃薯的分支酶(Kossmann等《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Henet.)203(1991)，237-244；Jobling等，基因库登记号AJ011885)；来自稻米的分支酶(Mizuno等《生物化学杂志》(J.Biochem.)112(1992)，643-651；Kawasaki等《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Genet.)237(1993)，10-16；Mizuno等《生物学与生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)268(1993)，19084-19091；Nakamura和Yamanouchi《植物生理学》(Plant Physiol.)99(1992)，1265-1266)；来自小麦的分支酶(Baga等《植物分子生物学》(PlantMol.Biol.)40(1999)，1019-1030；Rahman等《应用遗传学理论)》(Theor.Appl.Genet.)98(1999)，156-163和基因库登记号Y12320)；来自大麦的分支酶(基因库登记号AF064561)；来自集胞蓝细菌属的分支酶(基因库登记号D63999)；来自大肠杆菌的分支酶(Baecker等《生物学与生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)261(1986)，8738-8743；基因库登记号M13751)；来自嗜热脂肪芽孢杆菌的分支酶(基因库登记号M35089)；来自金霉素链霉菌的分支酶(基因库登记号L11647)；来自热溶芽孢杆菌的分支酶(基因库登记号Z14057)；来自聚球蓝细菌属PCC6301的分支酶(基因库登记号M31544)；来自聚球蓝细菌属PCC7942的分支酶(Kiel等《基因》(Gene)78(1989)，9-17)和来自根癌土壤杆菌的分支酶(基因库登记号AF033856)。
对于本领域技术人员来说，能够通过分子生物学标准方法，尤其如Sambrook等所述(Sambrook等《分子克隆：实验指南》(Molecularcloning：A laboratory manual)第2版，美国冷泉港实验室出版(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，NY，USA(1989))分离相应的基因。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述的外源核酸分子编码来自原核生物，优选来自奈瑟氏球菌属的细菌，特别优选来自反硝化奈瑟氏球菌的分支酶且甚至更优选编码具有用SEQ ID No.1表示的核苷酸序列或具有用SEQ ID No.2描述的氨基酸序列的分支酶。
在另一个优选的实施方案中，所述的外源核酸分子编码植物分支酶。
存在各种将DNA引入植物宿主细胞的技术。这些技术包括：使用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌作为转化剂以T-DNA转化植物细胞；原生质体融合；注射；DNA的电穿孔；使用生物(biolistic)手段引入DNA；以及其它可能的方法。
集中检验农杆菌属介导的对植物细胞的转化的应用且充分描述在下列文献中：EP 0 120516；Hoekema：《二元植物载体系统》(The BinaryPlant Vector System)，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)第V章；Fraley等《植物科学评论综述》(Crit.Rev.Plant Sci.)4，1-46；和An等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBOJ.)4，(1985)，277-287。有关马铃薯的转化，例如参见Rocha-Sosa等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)8，(1989)，29-33。
描述了通过基于农杆菌属的载体转化单子叶植物(Chan等《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)22，(1993)，491-506；Hiei等《植物杂志》(Plant J.)6(1994)271-282；Deng等《科学在中国》(Sciencein China)33，(1990)，28-34；Wilmink等《植物细胞报导》(Pant CellReports)11，(1992)，76-80)；May等《生物/技术》(Bio/Technology)13，(1995)，486-492；Connor和Domisse《国际植物科学杂志》(Int.J.Plant.Sci.)153(1992)，550-555；Ritchie等《转基因研究》(Trangenic Res.)2，(1993)，252-265)。用于转化单子叶植物的可选择的系统有：使用生物(biolistic)手段进行转化(Wan和Lemaux《植物生理学》(Plant Physiol.)104，(1994)，37-48；Vasil等《生物/技术》(Bio/Technology)11，(1993)，1553-1558；Ritala等《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)24，(1994)，317-325；Spencer等《应用遗传学理论》(Theor.Appl.Genet.)79，(1990)，625-631)；原生质体转化；部分通透细胞的电穿孔；通过玻璃纤维引入DNA。特别地，文献中已经反复描述了玉米的转化(例如，参见WO95/06128、EP 0513849、EP 0465875、EP 0 292435；Fromm等《生物技术》(Biotechnology)8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等《植物细胞》(Plant Cell)2，(1990)，603-618；Koziel等《生物技术》(Biotechnology)11，(1993)，194-200；Moroc等《应用遗传学理论》(Theor.Appl.Genet.)80，(1990)，721-726))。
已经描述了对其它种类谷物的成功转化，例如对大麦的成功转化(Wan和Lemaux，参见上文；Ritala等，参见上文；Krens等《自然》(Nature)296，(1982)，72-74)和对小麦的成功转化(Nehra等《植物杂志》(Plant J.)5，(1994)，285-297)。
一般来说，可以将在植物细胞中具有活性的任意启动子用于表达外源核酸分子(多种外源核酸分子)。可以这样一种方式选择启动子，即在本发明植物中的表达组成上或仅在某种组织中发生、在植物发育的某一时间点上发生或在由外部影响因素决定的某一时间发生。就所述植物而言，启动子可以是同源的或异源的。
合适的启动子有：例如花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子和用于组成型表达的玉米的遍在蛋白质启动子；用于在马铃薯中的块茎特异性表达的patatin基因启动子B33(Rocha-Sosa等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)8，(1989)，23-29)或确保仅在光合活性组织中表达的启动子，例如ST-LS1启动子(Stockhaus等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84(1987)：7943-7947；Stockhaus等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)8，(1989)，2445-2451)；Ca/b启动子(例如，参见US 5656496、US 5639952、Bansal等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89(1992)：3654-3658)和Rubisco SSU启动子(例如，参见US 5034322、US 4962028)或用于胚乳特异性表达的谷蛋白启动子(Leisy等《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)14，(1990)，41-50；Zheng等《植物杂志》(PlantJ.)4，(1993)，357-366；Yoshihara等《FEBS通讯》(FEBS Lett.)383，(1996)，213-218)；shrunken-1启动子(Werr等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)4，(1985)，1373-1380)；小麦的HMG启动子；USP启动子；菜豆异类黄酮灵启动子或玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等《细胞》(Cell)29，(1982)，1015-1026；Quatroccio等《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)15，(1990)，81-93)。
外源核酸分子(多种外源核酸分子)的表达在那些具有增加的蔗糖含量或储备蔗糖的植物器官中特别有利。这类器官有：例如甜菜中的芜菁或甘蔗或糖小米(sugar millet)的茎。因此，优选使用的启动子是那些介导这些器官中的表达的启动子。然而，也可以使用其它启动子，即那些在由外部因素决定的时间点上具有活性的启动子(例如，参见WO 9307279)。此处，热激蛋白的启动子可能具有特殊意义，因为它们允许简单的诱导。此外，可以使用种子特异性启动子，诸如，例如来自蚕豆的USP启动子，它可确保蚕豆和其它植物中的种子特异性表达(Fiedler等《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)22，(1993)，669-679；
Figure C00807908D0013105118QIETU
等《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Genet.)225，(1991)，459-467)。此外，可以例如按WO 91/01373、WO 99/16879中所述和van Haaren和Houck所述(《植物分子生物学》(PlantMol.Biol.)21，(1993)，625-640)使用果实特异性启动子。
此外，可以存在终止序列，它用于正确终止转录和用于因转录物稳定化中的作用所引起的将聚腺苷酸尾添加到所述转录物上。文献中已经描述了这类元件(例如，参见Gielen等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)8，(1989)，23-29)且它们是可任意互换的。
本发明的植物细胞可以区别于天然存在的植物细胞，尤其是由于下列事实：它们含有一种或多种在这些细胞中并非天然存在的外源核酸分子或发现这类分子被整合入所述植物的基因组中的一定位置，在该位置所述的外源核酸分子通常不存在，即被整合入另一个基因组的环境中。此外，本发明的这类转基因植物细胞可以区别于天然存在的植物细胞，因为可能除了天然存在于植物细胞中的这类分子的拷贝之外，它们还含有稳定整合入其基因组的外源核酸分子(多种外源核酸分子)的至少一个拷贝。如果引入所述细胞的核酸分子是天然存在于植物中的分子的附加拷贝，那么本发明的植物细胞可以区别于天然存在的植物细胞，特别是由于这种(这些)附加的拷贝定位于它(它们)并不天然存在的基因组中的一定位置上这一事实。例如，可以通过DNA印迹分析来检测这种情况。
此外，本发明的植物细胞可以区别于天然存在的植物细胞，优选通过下列特征之一：如果所引入的核酸分子相对于植物来说是异源的，那么转基因植物细胞显示出所引入核酸分子的转录物。例如，可以用RNA印迹分析检测它们。优选本发明的植物细胞含有由所引入的外源核酸分子编码的蛋白质。例如可以通过免疫方法，特别是通过蛋白质印迹分析进行检测。
如果所引入的分子相对于所述植物而言是同源的，那么本发明的转基因植物细胞可以例如因所引入的外源核酸分子的附加表达而区别于天然存在的植物细胞。这种转基因植物细胞优选含有所述外源核酸分子的多种转录物。例如，可以通过RNA印迹分析进行检测。
术语“遗传修饰的”指的是植物细胞在其遗传信息方面通过引入一种外源核酸分子或几种外源核酸分子而得到改变且所述外源核酸分子的存在或表达导致表型改变。由此表型改变优选指的是植物(植物细胞)的一种或多种功能的可测定改变。例如，本发明的植物细胞因所引入的核酸分子的存在或表达而表现出具有淀粉蔗糖酶活性的蛋白质的活性提高和具有分支酶活性的蛋白质的活性提高。
在本发明的框架内，术语“活性提高”指的是在植物中编码具有淀粉蔗糖酶活性的蛋白质和编码具有分支酶活性的蛋白质的核酸分子(几种核酸分子)的表达增加、具有淀粉蔗糖酶活性和具有分支酶活性的蛋白质的量增加或具有淀粉蔗糖酶活性的蛋白质的活性和具有分支酶活性的蛋白质的活性提高。
例如，可以通过测定编码这类蛋白质的转录物的量，例如通过RNA印迹分析来确定所述表达的增加。在这里，增加优选指的是与相应非遗传修饰的植物细胞相比转录物的量至少增加10％，优选至少增加20％，特别优选至少增加50％且尤其优选至少增加75％。
例如，可以通过DNA印迹分析来测定具有淀粉蔗糖酶活性或具有分支酶活性的蛋白质的量的增加。在这里，增加优选指的是与相应非遗传修饰的细胞相比具有淀粉蔗糖酶活性或具有分支酶活性的蛋白质的量至少增加10％，优选至少增加20％，特别优选至少增加50％且尤其优选至少增加75％。
例如，可以如实施例中所述测试淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶的活性。此外，可以如Lloyd等所述测定分支酶的活性(《生物化学杂志》(Biochem.J.)338(1999)，515-521)。还可以如下面的部分“材料和方法…”，部分3中所述测定淀粉蔗糖酶的活性。
令人意外地发现含有具有提高活性的淀粉蔗糖酶和提高活性的分支酶的这类植物细胞的植物可合成无法由相应的非遗传修饰的野生型植物细胞合成的在0-6-位上带有改变的支化度的α-1，6支链α-1，4-葡聚糖类。
在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞含有在0-6-位上带有至少2％的支化度，优选至少4％支化度的α-1，6-支链α-1，4-葡聚糖类。在另一个实施方案中，所述的支化度至少为6％，优选至少为8％，特别优选至少为10％且尤其优选至少为12％。
在本发明的框架内，“支化度”指的是与按不同方式连接的葡萄糖单位相比0-6-位上分支的平均数量。
可以通过甲基化分析，例如如下进一步所述来测定支化度。例如，有关这种方法的一般信息还可以在《通过GLC和MS分析碳水化合物》(Analysis of Carbohydrates by GLC and MS)(Biermann，C.J.和McGinnis，G.D.(编辑)CRC Press(1989)，第9章，Carpita，N.C.和Shea，E.M.，157-216)或
Figure C00807908D0016105153QIETU
 H.等(Angew.Chem.，82，(1970)，643-652；Int.Ed.Engl.9，(1970)，610-619)中找到。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的植物细胞合成了不同于相应野生型植物细胞的淀粉的改性淀粉，所述的不同在于物理化学特性，特别是直链淀粉/支链淀粉的比例、支化度、平均链长、磷酸酯含量、糊化特性、淀粉颗粒的大小和/或形状方面。特别地，与野生型淀粉相比，这类淀粉在有关粘度和/或淀粉糊的胶凝能力方面可以得到改变。
在本发明的另一个实施方案中，含有本发明植物细胞的植物比相应非遗传修饰的野生型植物具有更高的产量。
在本发明范围内，术语“野生型植物”指的是用作产生本发明植物的原料的植物，即在不考虑引入的遗传修饰的情况下，其遗传信息符合本发明的植物的遗传信息。
本文的术语“产量提高”指的是产量至少提高5％，优选至少提高10％，特别优选至少提高20％且尤其优选至少提高30％。术语“产量提高”优选指的是特别当以每株植物的鲜重为基准测定时物质和/或生物质产量的提高。
这类产量的提高优选涉及可以采收的植物部位，诸如种子、果实、贮藏根、根、块茎、花、芽、枝条、茎或木材。
根据本发明，如果在相同条件下栽培，那么与相应的相同基因组型的未转化植物相比涉及生物质和/或内含物的产量至少比野生型植物提高3％，优选至少提高10％，特别优选至少提高20％且尤其优选至少提高30％乃至40％。
在本发明的另一个实施方案中，本发明植物细胞具有比相应非遗传修饰的野生型植物细胞增加的热值。
将术语“热值”定义为身体通过消化食物获取和用于满足能量需求的能量的量(以卡或焦耳给出)。
术语“增加的热值”指的是热值至少增加5％，优选至少增加10％，特别优选至少增加20％且尤其优选至少增加30％。
具有高热值的植物对食品工业，特别是诸如例如病人或老年人这样具有高能量需求的人的饮食、婴儿或参加竞赛的运动员的饮食具有意义。
在一个优选的实施方案中，编码淀粉蔗糖酶和分支酶的核苷酸序列包括确保在诸如液泡或质体这样的特定细胞区室内定位的蛋白质引导信号序列。在一个特别优选的实施方案中，编码所述两种酶的核苷酸序列包括确保两种酶定位于相同细胞区室内的蛋白质引导信号序列。在这方面，所述的外源核酸分子可以包括确保淀粉蔗糖酶和分支酶定位于相同细胞区室内的一种或多种蛋白质引导信号序列。特别有可能的是编码淀粉蔗糖酶或分支酶的每一编码区包括一种以上的信号序列或不同信号序列的组合。
在本发明的另一个实施方案中，所述的外源核酸分子带有一种或多种介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶的液泡定位的蛋白质引导信号序列。
编码“外源核酸分子”中含有的淀粉蔗糖酶和分支酶的核酸分子可以在一种或几种彼此独立的蛋白质引导信号序列的控制下或它们可以在作为翻译单位融合后的一种或几种蛋白质引导信号序列的共同控制下。
在本发明的另一个实施方案中，所述的外源核酸分子带有一种或几种各自介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶的液泡定位的蛋白质引导信号序列。
在这个实施方案中，将几种外源核酸分子引入植物细胞的基因组，其中一种外源核酸分子编码淀粉蔗糖酶蛋白且另一种核酸分子编码分支酶。如上所述，可以将所述的外源核酸分子同时或连续引入植物细胞的基因组。
各外源核酸分子含有一种或多种介导各淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶的液泡定位的蛋白质引导信号序列，其中所述的蛋白质引导信号序列可以彼此相同或可以彼此不同。
例如，可以将patatin蛋白质的N-末端序列(146个氨基酸)用作液泡引导序列(Sonnewald等，《植物杂志》(Plant J.)1，(1998)，95-106)。在一个优选的实施方案中，使用用SEQ ID No.7描述的信号序列。此外，可以将下列信号序列用作液泡引导序列：番茄酸性转化酶的N-末端信号序列(基因库登记号LM81081)或马铃薯酸性转化酶的N-末端信号序列(基因库登记号L29099)；甜马铃薯sporamin的N-末端信号序列(Koide等《植物生理学》(Plant Physiol.)114(1997)，863-870)；大麦aleurain的N-末端信号序列(Vitale和Raikhel《植物科学趋势》(Trends in Plant Science)4(1999)，149-155)；马铃薯蛋白酶抑制剂的N-末端信号序列(基因库登记号X04118)；和大麦凝集素的C-末端液泡引导信号肽(Vitale和Raikhel，上述文献中所述)。
其它液泡信号序列描述在下列文献中：例如Matsuoka和Neuhaus《实验植物学杂志》(Journal of Experimental Botany)50，(1999)，165-174；Chrispeels和Raikhel《细胞》(Cell)68，(1992)，613-616；Matsuoka和Nakamura《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88，(1991)：834-838；Bednarek和Raikhel《植物细胞》(Plant Cell)3，(1991)，1195-1206；Nakamura和Matsuoka《植物生理学》(Plant Phys.)101(1993)，1-5。一般来说，可以使用包括确保将相应蛋白质转运入内质网的N-末端信号序列与C-末端液泡引导序列的组合。有关液泡引导序列的概述可以在Chrispeels和Raikhel的《细胞》(Cell)68(1992)，613-616中找到。
由于液泡通常可以储备大量的用作淀粉蔗糖酶底物的蔗糖，所以该区室适合于产生因淀粉蔗糖酶蛋白活性提高和分支酶活性提高而在液泡中合成α-1，6支链α-1，4-葡聚糖类的植物细胞。在本发明的一个实施方案中，这些葡聚糖在0-6-位上带有的支化度至少为1％，优选至少为4％，特别优选至少为7％且尤其优选至少为10％。
在本发明的另一个实施方案中，可以通过选择显示出不同比例分支酶活性与淀粉蔗糖酶活性的转基因植物来控制0-6-位上的支化度。
在一个特别优选的实施方案中，淀粉蔗糖酶和分支酶均定位在液泡中的本发明植物细胞表现出热值增加。对于该术语的定义参见上文。
在本发明的另一个实施方案中，外源核酸分子具有一种或多种介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶蛋白的质体定位的蛋白质引导信号序列。
编码“外源核酸分子”中含有的淀粉蔗糖酶和分支酶的核酸分子可以各自彼此独立地在一种或多种蛋白质引导信号序列的控制下或它们可以在作为翻译单位融合后的一种或多种蛋白质引导信号序列的控制下。
在本发明的另一个实施方案中，外源核酸分子具有一种或多种各自介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶蛋白的质体定位的蛋白质引导信号序列。
在该实施方案中，将几种外源核酸分子引入植物细胞的基因组，其中一种外源核酸分子编码淀粉蔗糖酶蛋白且另一种外源核酸分子编码分支酶。如上所述，可以将所述的外源核酸分子同时或连续引入植物细胞的基因组。
所引入的外源核酸分子各自含有一种或多种介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶蛋白各自的质体定位的蛋白质引导信号序列，其中所述的蛋白质引导信号序列彼此相同或彼此不同。
例如，可以将来自菠菜的ferrodoxin：NADP+氧化还原酶(FNR)的信号序列用作信号序列。该序列含有来自菠菜的质体蛋白质ferrodoxin：NADP+氧化还原酶cDNA的5’非翻译区和侧翼转运肽序列(核苷酸-171-+165；Jansen等《最新遗传学》(Current Genetics)13，(1988)，517-522)。
此外，例如可以将来自玉米的蜡质蛋白的转运肽和成熟蜡质蛋白的前34个氨基酸(
Figure C00807908D00191
等《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Get.)217，(1989)，155-161)用作信号序列。
可以使用的其它质体引导序列有：核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位的信号序列(Wolter等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85，(1988)：846-850；Nawrath等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91，(1994)：12760-12764)；NADP-苹果酸脱氢酶的信号序列(Gallardo等《植物》(Planta)197(1995)，324-332)；和谷胱甘肽还原酶的信号序列(Creissen等《植物杂志》(Plant J.)8(1995)，167-175)。
在本发明的一个优选的实施方案中，使用不含成熟蜡质蛋白前34个氨基酸的玉米蜡质蛋白的转运肽(参见上文)(参见实施例1)。
在一个特别优选的实施方案中，使用来自马铃薯的R1蛋白质的质体信号序列(Lorberth等《天然生物技术》(NatureBiotechnology)16(1998)，473-477)。
通过细菌果糖基转移酶的造粉粒表达可以证实质体还含有可以在造粉体中通过果糖基转移酶转化成“淀粉果聚糖”的蔗糖(Smeekens《植物科学趋势》(Trends in Plant Science)第2卷第8期(1997)，286-288)。因此，该区室还适合于共同表达淀粉蔗糖酶基因和分支酶基因且允许合成与在野生型植物中合成的淀粉相比被改变的改性淀粉，所述的改变例如是在其物理化学特性、特别是直链淀粉/支链淀粉比例、支化度、平均链长、磷酸酯含量、糊化特性、淀粉颗粒的大小和/或形状方面。
因此，在本发明的另一个实施方案中，本发明的转基因植物细胞合成了改性淀粉。
在本发明的一个优选的实施方案中，这些淀粉的凝胶稳定性与提取自野生型植物的淀粉相比得到了改变。在一个特别优选的实施方案中，最大凝胶稳定性比提取自野生型植物的淀粉至少增加了20％，更优选至少增加了50％，甚至更优选至少增加了100％且尤其优选至少增加了200％。
可以如实施例9中所述测定凝胶稳定性。
还可以按照本领域技术人员所公知的方法对分离自本发明植物细胞的淀粉进行改性且该淀粉以未改性或改性的形式适合于食品和非食品领域的各种应用。
原则上，可以将淀粉的应用领域再分成两个大的领域。一个领域包括淀粉的水解产物，主要是通过酶促或化学方法获得的葡萄糖和葡聚糖成分。它们用作进一步化学改性和加工、诸如发酵的原料。就降低成本而言，水解方法的简便性和成本有效传输可能具有重要性。目前，当使用淀粉葡糖苷酶时，主要是酶促反应。可以设想通过减少酶的用量来节约成本。例如谷物表面延伸、通过低支化度的易消化性或限制所用酶的可及性的空间结构这样的对淀粉结构的修饰可以实现上述目的。
可以将因其聚合物结构而作为所谓的天然淀粉使用淀粉的另一领域分成两个进一步的应用领域：
1.食品工业
淀粉是传统的各种食品的添加剂，其中它主要用于结合水添加剂的目的或使粘度增加或胶凝增加。重要特征是流动性和吸着性、溶胀温度和糊化温度、粘度和增稠性、淀粉的溶解性、透明度和糊化结构、耐热性、抗剪强度和耐酸性、退减趋势、成膜能力、抗冻/融性、可消化性以及与例如无机或有机离子形成复合物的能力。
2.非食品工业
在这种广大的领域内，可以将淀粉用作各种生产过程中的辅助剂或用作工业产品的添加剂。淀粉用作辅助剂的主要领域是造纸业和纸板工业。在该领域中，淀粉主要用于留着(滞留固体)、用于压平填料和细颗粒、作为固化物质和用于脱水。此外，可充分利用有关劲度、硬度、固定性、手感、光泽、平滑性、撕裂强度以及表面积的淀粉的有利特性。
2.1造纸工业和纸板工业
在纸的生产过程中，可以在4个应用领域即表面、涂布、团块和喷雾之间进行区分。
对有关淀粉表面处理的要求主要是高度的亮度、相应的粘度、高粘度稳定性、良好的成膜性以及几乎不形成灰尘。当用于涂布固体内含物时，相应的粘度、高结合能力和高色素亲合性起重要作用。作为团块的添加剂快速，均匀、无损耗分散、高机械稳定性和在纸浆中完全的保留性具有重要性。当使用淀粉喷雾时，相应的固体含量、高粘度和高结合能力也是显著的。
2.2粘合剂工业
主要的应用领域例如是在粘合剂工业中，其中将淀粉用于4个领域：用作纯淀粉胶、用于用特殊化学物质制备的淀粉胶、将淀粉用作合成树脂和聚合物分散体的添加剂以及将淀粉用作合成粘合剂的补充剂。将全部基于淀粉的粘合剂的90％用于生产波面纸板、纸囊和纸袋、纸和铝的复合材料、信封用盒和胶水、邮票等。
2.3纺织工业和纺织品护理工业
淀粉作为辅助剂和添加剂的另一个可能的应用是用于织物和织物护理产品的生产过程中。在纺织工业中，可以在下列4个应用领域中进行区分：将淀粉用作浆料，即作为熨平和加强用于防止编织过程中主动张力和用于增加编织过程中耐磨性的去毛刺特性的辅助剂；作为主要在变质预处理后织物的改善剂，诸如漂白剂、染色剂等；作为用于防止染料扩散的染料浆生产过程中的增稠剂；和作为用于缝线用缠绕剂的添加剂。
2.4建筑业
淀粉的第4个应用领域是将其用作建筑材料的添加剂。一个实例是生产石膏板，其中薄石膏粉中混合的淀粉与水成膏状、在石膏板表面扩散且由此使纸板与所述石膏板粘合。其它应用领域是将淀粉与石膏粉和矿物纤维混合。在预拌混凝土中，可以将淀粉用于使上浆过程减速。
2.5土壤稳定化
此外，淀粉有利地用于生产暂时防止土壤颗粒受到人为地层移动中水的影响的土壤稳定化工具。根据现有技术的知识，可以将由淀粉和聚合物乳液组成的组合产品看作与迄今为止所用产品具有相同的减侵蚀和减结壳作用；然而，它们相当低廉。
2.6淀粉在植物保护剂和肥料中的应用
另一个应用领域是淀粉在用于改变这些制品的特殊特性的植物保护剂中的应用。例如，将淀粉用于改善植物保护剂和肥料的湿润性；用于活性成分的定量释放；用于将液体、挥发性和/或有气味的活性成分转化成微晶、稳定、可变形的物质；用于混合不相容的组成；和因分解较缓慢而用于延长作用期限。
2.7药物、医疗和化妆品工业
还可以将淀粉用于药物、医疗和化妆品工业领域。在制药工业中，可以将淀粉用作片剂的粘合剂或用于稀释胶囊中的粘合剂。此外，淀粉适合用作片剂的崩解剂，这是因为在吞咽时它吸收液体并在短时后它溶胀到使活性成分释放。由于性质上的原因，伤口用的医用润滑粉和医用粉以淀粉为基础。在化妆品领域中，例如，将淀粉用作诸如香料和水杨酸这样的粉末添加剂的载体。淀粉相对广泛的应用领域是牙膏。
2.8淀粉作为煤和煤砖的添加剂
还可以将淀粉用作煤和煤砖的添加剂。通过添加淀粉，煤可以定量地成块和/或团成高质量的煤砖，由此防止了煤砖的过早崩解。烧煤含有4-6％的添加淀粉、0.1-0.5％的热量煤。此外，淀粉作为粘合剂变得越来越重要，因为向煤和煤砖中添加它可以明显减少毒性物质的散发。
2.9矿石和煤泥的加工
此外，可以将淀粉用作加工矿石和煤泥中的絮凝剂。
2.10淀粉作为浇铸中的添加剂
另一个应用领域是将淀粉用作浇铸中加工物料的添加剂。就各种浇铸工艺而言，需要由混有粘合剂的砂子生产的芯。目前，最常用的粘合剂是混有改性淀粉，大部分是溶胀淀粉的膨润土。
添加淀粉的目的在于增加流阻和改善粘合强度。此外，溶胀淀粉可以满足生产工艺的其它先决条件，诸如在冷水中的分散性、再水化程度、在砂子中良好的混溶性和高度结合水的能力。
2.11淀粉在橡胶工业中的应用
在橡胶工业中，可以将淀粉用于改善工艺和光学质量。由于这一原因就要求改善表面光泽、手感和外观。为了这一目的，在冷硫化前将淀粉分散在橡胶物质的粘性涂胶表面上。还可以将淀粉用于改善橡胶的可印性。
2.12皮革替代物的生产
改性淀粉的另一个应用领域是生产皮革替代物。
2.13.合成聚合物中的淀粉
在塑料市场上，正在涌现出下列应用领域：将来源于淀粉的产物整合入加工过程(淀粉仅是填料，在合成聚合物与淀粉之间不存在直接粘合)或另一方面将来源于淀粉的产物整合入聚合物的产生过程中(淀粉和聚合物形成稳定的粘合)。
淀粉用作纯填料不能与诸如滑石这样的其它物质竞争。当特殊的淀粉特性变得有效且终产品的特性分布由此明显改变时，上述情况可以改变。一个实例是将淀粉产品用于加工诸如聚乙烯这样的热塑性材料。因此，通过共表达将淀粉和合成聚合物按1:1的比例混合而形成“母炼胶”，由此可以通过使用成粒的聚乙烯的常规技术生产不同产品。聚乙烯薄膜中淀粉的整合可以使物质在空心体中的透性增加、水蒸汽渗透性改善、抗静电性能改善、防结块性能改善和使用含水染料的可印性改善。
另一种可能性是淀粉在聚氨酯泡沫塑料中的应用。由于淀粉衍生物的采用且由于加工技术的最优化，所以能够对合成聚合物与淀粉羟基之间的反应进行特定控制。结果是因应用了淀粉而使聚氨酯薄膜获得了下列特性分布：热膨胀系数降低；收缩性能降低；压力/张力性能改善；水蒸汽渗透性增加而吸水性没有改变；可燃性和裂化密度降低；没有易燃部分溢出；不含卤素且老化减少。目前仍然存在的缺陷在于压力和冲击强度降低。
薄膜产品的研发不再是唯一的选择。还可以生产诸如罐、盘子和碗这样具有50％以上淀粉含量的固体塑料产品。此外，淀粉/聚合物混合物提供了它们可生物降解至较大程度的优点。
此外，由于淀粉接枝聚合物具有极强的结合水的能力，所以它们已经获得了极大的重要性。它们是具有淀粉的主链和按照自由基链机理接枝上的合成单体的侧链晶格的产品。目前可获得的淀粉接枝聚合物的特征在于改善的粘合和保留能力高达1000g水/g淀粉的高粘度。在过去的几年中，已经更为广泛地应用了这些超级吸收剂-主要是在卫生保健领域，例如应用在诸如尿布和床单这样的产品中以及应用在例如种子颗粒这样的农业领域中。
应用通过重组DNA技术改性的新型淀粉的决定性因素一方面是结构、含水量、蛋白质含量、脂类含量、纤维含量、灰分/磷酸酯含量、直链淀粉/支链淀粉比例、相对摩尔质量的分布、支化度、颗粒大小和形状以及晶形，而另一方面是产生下列特征的特性：流动性和吸着性、糊化温度、粘度、在盐水溶液中的粘度稳定性、增稠性、溶解性、糊状结构和透明性、耐热性、抗剪强度和耐酸性、退减趋势、胶凝能力、抗冷冻/融化性、复合物形成能力、碘结合能力、成膜性、粘合强度、酶稳定性、可消化性和反应性。
通过使用转基因植物进行遗传操作生产的改性淀粉可以以使通过化学或物理方法进一步修饰变得多余的方式来改变获自植物的淀粉的特性。另一方面，可以对通过重组DNA技术改性的淀粉进行进一步的化学修饰，这会导致某些上述应用领域中的质量的进一步改善。这些化学修饰对本领域技术人员来说大部分是公知的。它们特别是通过下列手段进行的修饰：
-热处理；
-酸处理；
-氧化和
-酯化，
从而形成磷酸酯、硝酸酯、硫酸酯、黄原酸酯、乙酸酯和柠檬酸酯淀粉。还可以将其它有机酸用于酯化：
-形成淀粉醚
淀粉烷基醚、O-烯丙基醚、羟烷基醚、O-羧甲基醚、含N的淀粉醚、含P的淀粉醚和含S的淀粉醚；
-形成支链淀粉
-形成淀粉接枝聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，外源核酸分子具有一种或多种介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶的细胞壁特异性定位的蛋白质引导信号序列。
编码“外源核酸分子”中含有的淀粉蔗糖酶和分支酶的核酸分子可以在一种或几种彼此独立的蛋白质引导信号序列的控制下或它们可以在作为翻译单位融合后的一种或几种蛋白质引导信号序列的共同控制下。
在本发明的另一个实施方案中，外源核酸分子具有一种或多种各自介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶蛋白的细胞壁特异性定位的蛋白质引导信号序列。
在该实施方案中，将几种外源核酸分子引入植物细胞的基因组，其中一种外源核酸分子编码淀粉蔗糖酶蛋白且另一种外源核酸分子编码分支酶。如上所述，可以将所述的外源核酸分子同时或连续引入植物细胞的基因组。在第一种情况中，将其称作“共转化”，在后一种情况中，将其称作“超转化”。
所引入的外源核酸分子各自含有一种或多种介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶蛋白各自的细胞壁特异性定位的蛋白质引导信号序列，其中所述的蛋白质引导信号序列彼此相同或彼此不同。
作为信号序列，可以使用来自马铃薯的蛋白酶抑制剂II的信号序列(von Schaewen等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)9，(1990)，3033-3044；Keil等《核酸研究》(Nucleic Acid Research)14，(1986)，5641-5650)。
在本发明的另一个实施方案中，所述的外源核酸分子介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶的胞质定位。
此外，本发明涉及含有具有活性提高的淀粉蔗糖酶和分支酶的这类植物细胞的转基因植物。
本发明的植物可以属于任意植物种类，即它们可以是单子叶植物或双子叶植物。优选它们是来自农业上有用植物的植物，即它们是来自由人栽培用作食品或用于加工工艺，特别是工业化应用的植物的植物。本发明优选涉及成纤植物(例如亚麻、大麻、棉花)、储油植物(例如油菜、向日葵、大豆)、储藏淀粉的植物(例如小麦、大麦、燕麦、黑麦、马铃薯、玉米、稻米、豌豆、木薯)、储糖植物(例如甜菜、甘蔗、糖小米(sugar millet))和储藏蛋白质的植物(例如豆科植物)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及食品植物(例如饲料作物和放牧植物(苜蓿、三叶草等))、蔬菜植物(例如番茄、生菜、菊苣)。特别优选的是甜菜、甘蔗、玉米、小麦和稻米。
本发明还涉及一种用于生产与野生型植物相比获得高产量的转基因植物的方法，其中：
(a)通过引入一种(几种)外源核酸分子对植物细胞进行遗传修饰，所述的外源核酸分子的存在或表达使得具有淀粉蔗糖酶活性的蛋白质的活性和具有分支酶活性的蛋白质的活性均得到提高；
(b)从按照(a)生产的细胞中再生植物；和
(c)选择性地由按照步骤(b)生产的植物生产其它植物。
此外，本发明涉及一种用于生产与相应非遗传修饰的野生型植物相比可合成在0-6-位上带有改变的支化度的α-1，6支链α-1，4-葡聚糖类的转基因植物的方法，其中：
(a)通过引入一种或多种外源核酸分子对植物细胞进行遗传修饰，所述的外源核酸分子的存在或表达使得具有淀粉蔗糖酶活性的蛋白质的活性和具有分支酶活性的蛋白质的活性均得到提高；
(b)从按照(a)生产的细胞中再生植物；和
(c)选择性地由按照步骤(b)生产的植物生产其它植物。
本发明的另一个主题是一种用于生产与相应非遗传修饰的野生型植物相比可合成改性淀粉的转基因植物方法，其中：
(a)通过引入一种或多种外源核酸分子对植物细胞进行遗传修饰，所述的外源核酸分子的存在或表达使得具有淀粉蔗糖酶活性的蛋白质的活性和具有分支酶活性的蛋白质的活性均得到提高；
(b)从按照(a)生产的细胞中再生植物；和
(c)选择性地由按照步骤(b)生产的植物生产其它植物。
在涉及本发明植物的另一个方面如上所述的方法同样适用于按照步骤a)引入的遗传修饰。
可以按照本领域技术人员所公知的方法进行步骤b)的植物再生。
例如，通过无性繁殖(例如通过插条、块茎或通过愈伤组织培养和再生完整植物)或通过有性繁殖按照本发明方法的步骤c)再生其它植物。有性繁殖优选在控制下进行，即使所选择的具有某些特性的植物彼此杂交并繁殖。
本发明还涉及能通过本发明方法获得的植物。
本领域技术人员已知他不仅可以通过本发明的上述方法，而且可以例如通过将具有因引入了外源核酸分子而具有淀粉蔗糖酶活性的蛋白质的提高活性的遗传修饰植物与具有因引入了外源核酸分子而具有分支酶活性的蛋白质的提高活性的转基因植物杂交获得本发明的植物。此外，本领域技术人员已知上述超转化并不一定使用初级转化体进行，但优选使用此前已经选择且已经有利地在有关例如能育性、外源基因的稳定表达、半合子性和纯合性等的相应实验中得到测试的稳定转基因植物来进行。因此，可通过上述方法获得的且表现出上述实施方案中所述表型的转基因植物细胞和植物也是本发明的主题。
本发明还涉及本发明植物的繁殖材料和按照本发明方法生产的转基因植物的繁殖材料。术语“繁殖材料”包括那些适合于以无性或有性方式产生后代的那些植物组分。就无性繁殖而言，例如，合适的是插条、愈伤组织培养物、根茎或块茎。其它繁殖材料包括：例如果实、种子、幼苗、原生质体、细胞培养物等。优选所述的繁殖材料是块茎和种子。
此外，本发明涉及一种或多种编码具有淀粉蔗糖酶的酶活性的蛋白质和具有分支酶的酶活性的蛋白质的核酸分子在生产植物中的应用，其中所生产的植物与野生型植物相比可以获得提高的产量和/或合成与来自野生型植物的淀粉相比得到改性的淀粉和/或与相应非遗传修饰的野生型植物相比合成在0-6-位上带有改变的支化度的α-1，6支链α-1，4-葡聚糖类。
附图的描述：
附图1：带有修饰的“多克隆位点”(MCS)的pBinAR。
附图2：质粒图pAmsu-wxy-Hyg。
附图3：质粒图pAmsu-pat-Hyg。
附图4：质粒图pBE-fnt-Km。
附图5：质粒图pBE-pat-Km。
附图6：质粒图pAmsu-cyt-Km。
附图7：淀粉蔗糖酶活性凝胶。
附图8：分支酶活性凝胶。
附图11：来自实施例7中所述的转基因烟草植物(变种Samsung NN)的蛋白质提取物的活性凝胶。在本实验中使用FNR信号肽(实施例6)。
25-32、33-37、39和40：来自不同的独立的转基因烟草品系的蛋白质提取物(75μg总蛋白质)。
K＝对照品；如专利申请WO 99/67412中所述在大肠杆菌中生产的纯化的重组淀粉蔗糖酶；50ng蛋白质。
Wt：来自烟草野生型植物(Samsung NN)的蛋白质提取物(75μg总蛋白质)。
附图12：来自实施例7中所述的转基因烟草植物(变种Samsung NN)的蛋白质提取物的活性凝胶。在本实验中使用R1信号肽(实施例6)。
9-16和41-48：来自不同的独立的转基因烟草品系的蛋白质提取物(75μg总蛋白质)。
K＝对照品；如专利申请WO 99/67412中所述在大肠杆菌中生产的纯化的重组淀粉蔗糖酶；50ng蛋白质。
Wt：来自烟草野生型植物(Samsung NN)的蛋白质提取物(75μg总蛋白质)。
附图13：来自实施例8中所述的转基因烟草植物(变种Desirée)的蛋白质提取物的活性凝胶。
8-12、14、16、32和35-40：来自不同的独立的转基因烟草品系的蛋白质提取物(75μg总蛋白质)。
K＝对照品；如专利申请WO 99/67412中所述在大肠杆菌中生产的纯化的重组淀粉蔗糖酶；50ng蛋白质。
Wt：来自马铃薯的野生型植物(Desirée)的蛋白质提取物(75μg总蛋白质)。
BE：在质体中表达来自反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的转基因马铃薯植物的蛋白质提取物(实施例5)。
附图14：转基因植物(参见实施例9)、对照品(如实施例5中所述表达来自反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的转基因植物)和野生型植物的结构分析仪显示的分布图。
对附图11-13的注解：
来自已经通过实施例4中所述淀粉蔗糖酶活性试验分析的植物的所有蛋白质凝胶恰在对淀粉蔗糖酶具有特异性的带上方显示出淡褐色带。当使用用于生产蛋白质提取物的绿色植物材料时，这种淡褐色带特别明显(例如，参见附图12的第9、42和43行)。这种淡褐色带在野生型植物中也存在。在电泳后作为绿色带已经非常明显。在含有蔗糖的缓冲液中进行的凝胶培养过程中(实施例4)，在用鲁戈氏液染色前绿色变成淡褐色。从这些观察结果中可以推断这条带不是由于淀粉蔗糖酶的活性所产生的。
在来自具有高淀粉蔗糖酶表达的植物的凝胶中，非特异性淡褐色带迭加在因淀粉蔗糖酶活性产生的带上。
有关描述中重要的且用于实施例中的材料和方法：
1.通过甲基化分析测定支化度
可以通过甲基化分析测定所得到的葡聚糖的支化度。
一般方法
-使葡聚糖样品的所有游离OH-基团甲基化，每份样品重复测定两次；
-使预甲基化的聚合物水解，随后在C-1上还原并使单体混合物乙酰化；
-对反应产物进行气相色谱分析并定量。
通过甲基化分析检验葡聚糖样品的支化度。通过转化成甲基醚标明聚合物的游离OH-基团。
通过酸水解降解成单体并产生以吡喃糖苷/呋喃糖苷形式存在的部分甲基化的葡萄糖分子以及α-和β-葡糖苷。通过用NaBH4或NaBD4还原而使这些变体集中于相应的部分甲基化的山梨糖醇衍生物中。最终的游离OH-基团的乙酰化使得通过气相色谱法分析反应产物成为可能。
实验部分
a)DMSO-溶液的制备
制备1％的DMSO溶液(w/v)。
b)甲基化
将2ml的DMSO-溶液(即20mg聚合物)转入50ml氮瓶中，在N2气环境中加入5个当量/OH(eq/OH)新制二甲亚砜(dimsyl)溶液并搅拌30分钟。将该烧瓶的内含物在冰浴上冷冻，加入10eq/OH甲基碘并在融化后将该体系至少搅拌2小时。在第二次脱质子化和甲基化步骤前在真空中除去过量的甲基碘。此后，通过加入50ml水并通过每次用10ml二氯甲烷提取(5次)而除去过量的甲基碘。为了从有机相中除去微量DMSO，用水提取3次。首先使用样品测试就预甲基化羟基而言多少次甲基化步骤是必不可少的。在第一次甲基化步骤后，一半制备物得到了进一步加工处理，对另一半再次进行甲基化。在将两份样品降解后，比较GC分析结果。随后始终进行第二次甲基化以便检验可以通过C-3位上的亚甲基化模拟的C-3上可能的分支。
c)水解
将2mg甲基化样品称重入1ml压力玻璃瓶中，加入0.9ml 2M的三氟乙酸并在20℃下搅拌2.5小时。在将玻璃瓶冷却后，在N2气中浓缩。为了除去微量的酸，加入3次甲苯并放出。
d)还原
首先向来自反应步骤的残余物中加入0.5ml的0.5M氨碱性NaBD4-溶液并在60℃下搅拌1小时。用几滴冰醋酸谨慎研磨试剂，通过添加5次含有15％甲醇的乙酸且随后放出而将产生的硼酸盐作为硼酸三甲基醚除去。
e)乙酰化
首先向反应步骤的残余物中加入50μl吡啶和250μl乙酐并在95℃下搅拌2小时。在冷却后将反应混合物滴入10ml饱和NaHCO3-溶液并用二氯甲烷提取5次。通过气相色谱法分析有机相中的反应产物。
f)气相色谱
通过应用带有柱上入口和FID-检测器的稳定Carlo Erba GC 6000Vega Seies 2进行气相色谱分析。使用熔凝硅石毛细管柱SupelcoSPB5(内径0.2mm，长30m)、应用氢作为载气并使用80kPa的压力进行分离。使用下列温度程序：
60℃(1分钟)-25℃/分钟→130℃-4℃/分钟→280℃。
结果
通过鉴定峰、对峰面积进行积分并通过来自Sweet等(Sweet等《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)40(1975)，217)ECR-理论校准数据评价气相色谱图。
2.来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的纯化
为了生产淀粉蔗糖酶，使用用来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶转化的大肠杆菌细胞。DNA来源于多糖奈瑟氏球菌的基因组文库且具有国际专利申请PCT/EP98/05573中给出的核苷酸序列。
将表达编码来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的基因的这些大肠杆菌细胞过夜培养物离心并重新悬浮于约1/20个体积的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)、10mM DTT(二硫苏糖醇)、1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)中。然后用弗氏压碎器以16,000p.s.i..将所述细胞破碎2次。此后，向细胞提取物中加入1mM MgCl2和终浓度为12.5个单位ml-1的benzonase(来自Merck；100,000个单位；250个单位μl-1)。接着在37℃下将制备物至少培养30分钟，同时轻度搅拌。使提取物在冰上稳定至少1.5小时。接下来将其在4℃下以约40,000g离心30分钟，直到上清液相对澄清为止。用具有0.45μm孔径的PVDF膜(微孔“Durapore”或类似物)进行预过滤。使该提取物在4℃下稳定过夜。在进行HI-(疏水作用)层析前，向所述提取物中加入固体NaCl并调整至浓度为2M NaCl。然后在4℃和约40,000g下再次将其离心30分钟。此后，通过使用具有0.22μm孔径的PVDF膜(微孔“Durapore”或类似物)过滤使提取物从最终的大肠杆菌残余物中释放出来。通过上丁基琼脂糖-4B-柱(Pharmacia)(柱体积：93ml；长：17.5cm)分离过滤的提取物。将约50ml具有1-5个单位μl-1淀粉蔗糖酶活性的提取物上柱。然后用150ml缓冲液B(缓冲液B：50mM柠檬酸钠，pH6.5、2M NaCl)将未结合的蛋白质从柱上洗涤下来。最终通过降低借助于自动泵系统(FPLC，Pharmacia)产生的线性NaCl-梯度(NaCl在50mM、433ml体积的柠檬酸钠中以1.5ml分钟-1的速率从2M降至0M)洗脱淀粉蔗糖酶。淀粉蔗糖酶的洗脱发生在0.7M-0.1M NaCl之间。收集级分、使其在PD10Sephadex柱(Pharmacia)上脱盐、用8.7％甘油使之稳定、测试淀粉蔗糖酶活性并最终将其冷冻在储存缓冲液(8.7％甘油、50mM柠檬酸盐)中。
3.淀粉蔗糖酶活性的测定
将不同稀释度的纯化蛋白质或蛋白质粗提取物制成1ml含有5％蔗糖、0.1％糖原和100mM柠檬酸盐(pH6.5)的制备物并在37℃下培养。5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和30分钟后，每次从该制备物中取出10μl并通过即刻加热至95℃来终止淀粉蔗糖酶的酶活性。然后在偶联光度试验中测定由淀粉蔗糖酶释放的果糖的比例。因此，将1μl-10μl失活的样品放入1ml50mM咪唑缓冲液(pH6.9)、2mM MgCl2、1mM ATP、0.4mM NAD和0.5U/ml己糖激酶中。在依次添加葡糖-6-磷酸脱氢酶(来自肠系膜状明串珠菌)和磷酸葡糖异构酶后，在340nm处测定吸收的改变。接着按照朗伯定律计算释放的果糖的量。
当获得的计算值与取样时间相关时，可以分别测定单位数(1U＝μmol果糖/ml)(每μl蛋白质提取物或μg纯化蛋白质)。
用于实施例中的载体：
1.pBinAR-N
在质粒pBinAR(和Willmitzer，《植物科学》(PlantScience)66，(1990)，221-230)中，使用核酸寡核苷酸、通过分子生物学标准方法(例如，参见Sambrook等《分子克隆实验指南》(Molecular cloning：A laboratory manual)第2版，美国冷泉港实验室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，NY USA(1989))交换35S启动子与OCS终止子之间的多接头。这就是如何获得质粒pBinAR-N。
2.pBinAR-Hyg-N
通过使用分子生物学标准方法(例如，参见Sambrook等《分子克隆实验指南》(Molecular cloning：A laboratory manual)第2版，美国冷泉港实验室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，NYUSA(1989))将来自含有35S启动子、下列多接头和OCS终止子的pBinAR-N的EcoRI/HinDIII片段克隆入质粒pBIB-Hyg的相同限制位点(Becker《核酸研究》(Nucleic Acids Research)18，(1990)，203)。将所得的质粒称作pBinAR-Hyg-N。
3.pBinAR-wxy-Hyg
为了克隆编码来自玉米的蜡质蛋白信号肽的序列(例如，参见
Figure C00807908D0035105612QIETU
等《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Genet.)217，(1989)，155-161)，通过使用寡核苷酸(参见SEQ ID Nos.3和4)的PCR、从来自玉米(Stratagene)的基因组DNA作为模板开始扩增相应的序列。将由此获得的DNA片段用限制性内切核酸酶Xbal和Sall培养并克隆入用Spel和Sall切割的载体pBinAR-Hyg-N中。将所得的质粒称作pBinAR-wxy-Hyg。
PCR条件：
缓冲液和聚合酶来自Gibco BRL(PlantinumTaq DNA聚合酶高保真度号：11304-011)
DNA                       0.2μg
10x缓冲液                 5μl
MgSO4(50mM)               2.0μl
dNTPs(各10mM)             1μl
引物Sp-wxy-5’            100nM
引物Sp-wxy-3’            100nM
Taq Platinum Hifi聚合酶   1.5个单位
去稳定水                  加至50μl
反应条件
步骤1         95℃ 2:30分钟
步骤2         95℃ 0:30分钟
步骤3         60℃ 0:30分钟
步骤4         68℃ 0:25分钟(每个循环+1秒)
步骤5         68℃ 3:00分钟
在循环中将步骤2-4重复35次。
4.pBinAR-pat-Hyg和DBinAR-pat
使用寡核苷酸Sp-pat-5’和Sp-pat-3’(参见SEQ ID Nos.5和6)从质粒pgT5扩增编码来自马铃薯的patatin基因信号肽的序列(Rosahl等《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Genet.)203，(1986)，214-220；Sonnewald等《植物杂志》(Plant J.)1，(1998)，95-106)。将获得的片段用限制性内切核酸酶Xbal和Sall消化并分别克隆入用Spel和Sall切割的质粒pBinAR-N和pBinAR-Hyg中。分别将所得的质粒称作pBinAR-pat-Hyg和pBinAR-pat。将这些质粒中包含的编码所用patatin蛋白质信号肽的核酸序列用SEQ ID No.7表示，因为它不同于公开的信号肽(第3位氨基酸的氨基酸互换)。
PCR条件：
缓冲液和聚合酶来自Boehringer Mannhe im(Pwo聚合酶号：1644947)
DNA                   0.2μg
10x缓冲液+MgSO4       5μl
dNTPs(各10mM)         1μl
引物Sp-pat-5’        20nM
引物Sp-pat-3’        120nM
Pwo聚合酶             1.0个单位
去稳定水              加至50μl
反应条件
步骤1        95℃ 2:30分钟
步骤2        95℃ 0:30分钟
步骤3        64℃ 0:30分钟
步骤4        72℃ 0:30分钟(每个循环+1秒)
步骤5        72℃ 5:00分钟
在循环中将步骤2-4重复35次。
5.来自菠菜的FNR信号肽的克隆
使用引物Sp-fnr-5’和Sp-fnr-3’(参见SEQ ID No.8和SEQ ID No.9)和质粒p6SocFNR-15作为模板(Jansen等《最新遗传学》(CurrentGenetics)13，(1988)，517-522)扩增编码FNR信号肽的来自菠菜的序列。在用限制性内切核酸酶Xbal和Sall消化获得的片段后，将它们克隆入用Spel和Sall切割的质粒pBinAR-N中。将所得的质粒称作pBinAR-fnr-N。
PCR条件：
缓冲液和聚合酶来自Gibco BRL(PlantinumTaq DNA聚合酶高保真度号11304-011)
DNA                       0.2μg
10x缓冲液                 5μl
MgSO4                     2.0μl
dNTPs(各10mM)             1μl
引物Sp-fnr-5’            150nM
引物Sp-fnr-3’            150nM
Taq Platinum Hifi聚合酶   1.5个单位
去稳定水                  加至50μl
反应条件
步骤1                     95℃ 2:00分钟
步骤2                     95℃ 0:30分钟
步骤3                     58℃ 0:30分钟
步骤4                     68℃ 0:20分钟(每个循环+1秒)
步骤5                     68℃ 3:00分钟
在循环中将步骤2-4重复35次。
6.pBinAR-R1-Hyg
为了克隆来自马铃薯的R1蛋白质信号肽的编码序列(Lorberth等《天然生物技术》(Nature Biotechnology)16(1998)，473-477)，通过使用cDNA克隆RL2作为模板(Lorberth，PhDthesis，“Charakterisierung von RL1：ein neues Enzym des
Figure C00807908D0037105752QIETU
”，Freie 
Figure C00807908D0037105805QIETU
 Berlin(1996))和寡核苷酸SEQ ID NO14和15作为引物的PCR扩增相应序列。将所得的DNA片段用限制性内切核酸酶Xbal和Sall消化且然后克隆入用Spel和Sall切割的载体pBinAR-Hyg-N中。将所得的质粒称作pBinAR-R1-Hyg。
PCR反应条件：
缓冲液和聚合酶来自Boehringer Mannheim(Pwo聚合酶，Boehringer Mannheim号：1644955)
DNA               0.05μg
10x缓冲液         5μl
dNTPs(各10mM)     1μl
引物Sp-R1-5’     100nM
引物Sp-R1-3’     100nM
Pwo聚合酶         1.0个单位
去稳定水          加至50μl
反应条件
步骤1             95℃ 2:30分钟
步骤2             95℃ 0:30分钟
步骤3             60℃ 0:30分钟
步骤4             72℃ 0:25分钟(每个循环+1秒)
步骤5             72℃ 3:00分钟
在循环中将步骤2-4重复30次。
7.pBinAR-fnr-Hyg
通过使用质粒p6SocFNR-15作为模板(Jansen等《最新遗传学》(Current Genetics)13，(1988)，517-522)和引物Sp-fnr-5’和Sp-fnr-3’(参见SEQ ID No.8和SEQ ID No.9)扩增编码来自菠菜的FNR信号肽的序列。将所得的DNA片段用限制性内切核酸酶Xbal和Sall消化并克隆入用Spel和Sall切割的载体pBinAR-Hyg-N中。将所得的质粒称作pBinAR-fnr-Hyg。
PCR反应条件：
缓冲液和聚合酶来自Gibco BRL(Taq Platinum Hifi DNA聚合酶号：11304-011)
DNA                      0.05μg
10x缓冲液                5μl
dNTPs(各10mM)            1μl
引物Sp-fnr-5’           100nM
引物Sp-fnr-3’           100nM
Taq Platinum Hifi聚合酶  1.0个单位
去稳定水                 加至50μl
反应条件
步骤1                    95℃ 2:30分钟
步骤2                    95℃ 0:30分钟
步骤3                    58℃ 0:30分钟
步骤4                    72℃ 0:30分钟(每个循环+1秒)
步骤5                    72℃ 5:00分钟
在循环中将步骤2-4重复35次。
实施例1
用于转化植物的表达弹夹的生产：来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的液泡和质体的分别表达
使用寡核苷酸AS-5’和AS-3’(参见SEQ ID No.10和SEQ ID No.11)、通过应用质粒pNB2(参见国际专利申请WO 95/31553，寄存在德国Braunschweig的“Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen”(DSMZ)，寄存号为DSM9196)作为模板扩增编码淀粉蔗糖酶的序列。将获得的其扩增物用限制性内切核酸酶Xhol和Pstl消化并分别克隆入用Sall和Sdal切割的质粒pBinAR-wxy-Hyg和pBinAR-pat-Hyg中。分别将所得的质粒称作pAmsu-wxy-Hyg(附图2)和pAmsu-pat-Hyg(附图3)。
PCR条件：
缓冲液和聚合酶来自Boehringer Mannheim(Pwo聚合酶号：1644947)
DNA                    0.2μg
10x缓冲液+MgSO4        5μl
dNTPs(各10mM)          1μl
引物Sp-AS-5’          100nM
引物Sp-AS-3’          100nM
Pwo聚合酶              1.0个单位
去稳定水               加至50μl
反应条件
步骤1                  95℃ 2:00分钟
步骤2                  95℃ 0:30分钟
步骤3                  56℃ 0:30分钟
步骤4                  68℃ 2:00分钟(每个循环+1秒)
步骤5                  68℃ 5:00分钟
在循环中将步骤2-4重复40次。
可以按照标准方法分别将质粒pAmsu-wxy-Hyg和pAmsu-pat-Hyg用于转化植物(参见上文)。
实施例2
用于转化植物的表达弹夹的生产：来自反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的液泡和质体的分别表达
使用寡核苷酸BE-5’和BE-3’(参见SEQ ID No.12和SEQ ID No.13)、通过应用质粒pBB48(寄存在德国Braunschweig的“DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen”(DSMZ)，寄存号为DSM12425)作为模板扩增编码来自反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的序列。将由此获得的扩增物用限制性内切核酸酶Sall和Sdal消化并分别克隆入用Sall和Sdal切割的质粒pBinAR-fnr-Hyg和pBinAR-pat中。分别将所得的质粒称作pBE-fnr-Km(附图4)和pBE-pat-Km(附图5)。
PCR条件：
缓冲液和聚合酶来自Boehringer Mannheim(Pwo聚合酶号：1644947)
DNA                  0.2μg
10x缓冲液+MgSO4      5μl
dNTPs(各10mM)        1μl
引物BE-5’           120nM
引物BE-3’           120nM
Pwo聚合酶            1.0个单位
去稳定水             加至50μl
反应条件
步骤1                95℃ 2:00分钟
步骤2                95℃ 0:30分钟
步骤3                66℃ 0:30分钟
步骤4                72℃ 2:00分钟(每个循环+1秒)
步骤5                72℃ 8:00分钟
在循环中将步骤2-4重复40次。
可以按照标准方法分别将质粒pBE-fnr-Km和pBE-pat-Km用于转化植物(参见上文)。
实施例3
用于转化植物的表达弹夹的生产：来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的胞质表达
用来自质粒pNB2(参见上文)的限制性内切核酸酶Xmn I和Eag I分离编码来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的片段并将该片段的末端填充克列诺DNA聚合酶。然后将该片段克隆入质粒pBinAR中、随后用Smal切割所得质粒(Hfgen和Willmitzer，《植物科学》(PlantScience)66，(1990)，221-230)。将所得的质粒称作pAmsu-cyt-Km(附图6)并将其用于转化植物。
实施例4
具有淀粉蔗糖酶活性的转基因马铃薯植物的鉴定和检测
通过RNA印迹分析可以鉴定具有来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶mRNA的转基因马铃薯植物。然后可以证实所述淀粉蔗糖酶在这类植物中具有活性。
为了检测淀粉蔗糖酶在稳定转化植物中的活性，将检测用植物的叶物质冷冻在液氮中且然后用研钵研磨已经用液氮预冷却的叶物质。在解冻研磨的物质前，加入提取缓冲液(50mM柠檬酸钠(pH6.5)、4mMDTT、2mM氯化钙)。将约500μl提取缓冲液加入到约100mg植物物质(鲜重)中。通过离心(10,000×g)分离破碎植物物质和提取缓冲液的混悬液中的固体成分。将获得澄清上清液的等分部分与四分之一提取体积的试验缓冲液(40％甘油、250mM Tris pH 8.8、0.02％溴酚蓝)混合并以20mA/凝胶的恒定电流强度用聚丙烯酰胺凝胶分离(参见下文)。(在将蛋白质提取物施用于凝胶前，在上述条件下使凝胶电泳进行20分钟)。在着色剂溴酚蓝从凝胶中耗尽后，终止电泳。接着用各含5倍凝胶体积的洗涤缓冲液(100mM柠檬酸钠，pH 6.5)将凝胶平衡5次，各20分钟，同时在室温下旋转。接下来在37℃下将该凝胶在含有5倍量凝胶体积的培养缓冲液(100mM柠檬酸钠，pH 6.5；5％蔗糖)中培养16小时。在滗析培养缓冲液后，由淀粉蔗糖酶产生的葡聚糖在加入鲁戈氏液(按1:5稀释)时被检测为褐色-浅蓝色带(附图7)。
聚丙烯酰胺凝胶的组成：
a)分离凝胶
375mM Tris，pH 8.8
7.5％聚丙烯酰胺(Biorad No.EC-890)
为进行聚合：
1/2000体积的TEMED
1/100体积的过硫酸铵
b)收集凝胶
125mM Tris，pH 6.8
4％聚丙烯酰胺(Biorad No.EC-890)
为进行聚合：
1/2000体积的TEMED
1/100体积的过硫酸铵
c)电泳缓冲液
375mM Tris，pH 8.8
200mM 甘氨酸
实施例5
具有分支酶活性的转基因马铃薯植物的鉴定和检测
通过RNA印迹分析可以鉴定具有来自反硝化奈瑟氏球菌的分支酶mRNA的转基因马铃薯植物。为了检测淀粉蔗糖酶在稳定转化植物中的活性，将检测用植物的叶物质冷冻在液氮中且然后用研钵研磨已经用液氮预冷却的叶物质。在解冻研磨的物质前，加入提取缓冲液(50mM柠檬酸钠(pH6.5)、4mM DTT、2mM氯化钙)。将约200μl提取缓冲液加入到约100mg植物物质(鲜重)中。通过离心(10,000×g)分离破碎植物物质和提取缓冲液的混悬液中的固体成分。将获得澄清上清液的等分部分与四分之一提取体积的试验缓冲液(40％甘油、250mM Tris pH8.8、0.02％溴酚蓝)混合并以20mA/凝胶的恒定电流强度用聚丙烯酰胺凝胶分离(参见上文)。(在将蛋白质提取物施用于凝胶前，在上述条件下使凝胶电泳进行20分钟)。在存在于试验缓冲液中的着色剂溴酚蓝从凝胶中耗尽后，终止电泳。接着用各含5倍凝胶体积的洗涤缓冲液(100mM柠檬酸钠，pH6.5)将凝胶平衡5次，各20分钟，同时在室温下旋转。接下来在30℃下将该凝胶在含有5倍量凝胶体积的培养缓冲液(100mM柠檬酸钠，pH6.5；5％蔗糖；0.625个单位的来自多糖奈瑟氏球菌的纯化淀粉蔗糖酶(参见上文纯化该酶并测定活性))中培养16小时。在滗析培养缓冲液后，由淀粉蔗糖酶和分支酶生产的葡聚糖在加入鲁戈氏液(按1∶5稀释)时被检测为褐色-浅蓝色带(附图8)。所有剩余的聚丙烯酰胺凝胶因培养缓冲液中存在淀粉蔗糖酶活性而变成蓝色。
聚丙烯酰胺凝胶的组成：
a)分离凝胶
375mM Tris，pH8.8
7.5％聚丙烯酰胺(Biorad No.EC-890)
为进行聚合：
1/2000体积的TEMED
1/100体积的过硫酸铵
b)收集凝胶
125mM Tris，pH6.8
4％聚丙烯酰胺(Biorad No.EC-890)
为进行聚合：
1/2000体积的TEMED
1/100体积的过硫酸铵
c)电泳缓冲液
375mM Tris，pH8.8
200mM甘氨酸
实施例6
用于植物的表达弹夹的构建：来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的质体表达
通过应用质粒pNB2(德国Braunschweig的“Deutsche Sammlungfür Mikroorganismen und Zellkulturen”(DSMZ)，寄存号为DSM9196)作为模板和寡核苷酸AS-5’和AS-3’(SEQ ID No.10和SEQ ID No.11)作为PCR引物扩增来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的编码区。然后用限制性内切核酸酶Xhol和Pstl消化PCR产物。将所得的含有该编码区的片段克隆入用Sall-和Sdal-消化的质粒pBinAR-R1-Hyg和pBinAR-fnr-Hyg中。分别将所得的质粒称作pAmsu-R1-Hyg(附图9)和pAmsu-fnr-Hyg(附图10)。
PCR条件：
缓冲液和聚合酶来自Boehringer Mannheim(Pwo聚合酶号：1644947)
DNA                0.2μg
10x缓冲液+MgSO4    5μl
dNTPs(各10mM)      1μl
引物Sp-AS-5’      100nM
引物Sp-AS-3’      100nM
Pwo聚合酶          1.0个单位
去稳定水           加至50μl
反应条件
步骤1              95℃ 2:00分钟
步骤2              95℃ 0:30分钟
步骤3              56℃ 0:30分钟
步骤4              72℃ 2:00分钟(每个循环+1秒)
步骤5              72℃ 5:00分钟
在一个循环的方式中将步骤2-4重复40次。
可以按照标准方法将质粒pAmsu-R1-Hyg和pAmsu-fnr-Hyg用于转化植物。
实施例7
显示出淀粉蔗糖酶活性的转基因烟草植物的鉴定
按照Rosahl等(《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)6(1987)，1155-1159)所述将实施例6中所述的构建体pAmsu-R1-Hyg(附图9)和pAmsu-fnr-Hyg(附图10)用于转化烟草植物。通过进行RNA印迹分析鉴定含有淀粉蔗糖酶mRNA的转基因烟草植物。此外，在质体中表达淀粉蔗糖酶基因的那些植物也显示出淀粉蔗糖酶的酶活性(附图11和12)。如实施例4中所述检测所述的酶活性。
实施例8
表达编码来自反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的基因和编码来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的基因的转基因马铃薯植物的生产和鉴定
选择已经预先用质粒pBE-fnr-Km(实施例2)转化并显示出定位于质体中的分支酶活性(如实施例5所述进行酶活性检测，附图8)的2个品系的转基因马铃薯植物。
此后，通过带有质粒pAmsu-R1-Hyg的农杆菌属再次转化来自这些植物叶的外植体(实施例6)。通过使用实施例4和5中所述的活性试验鉴定同时显示出淀粉蔗糖酶蛋白活性和分支酶活性的植物(附图13)，其中所述的两种酶均定位于质体中。
实施例9
通过应用结构分析仪测定淀粉的凝胶稳定性
将提取自如实施例8中所述转基因植物的2g淀粉(dw)加入到适当体积的蒸馏水中而制成含有8％终浓度淀粉(w/v)的混悬液。然后在快速粘性分析仪(Newport Scientfic Pty Ltd.，Investment SupportGroup，Warriewood NSW 2102，Australia)中通过使用下列温度分布加热该混悬液：
首先，通过以每分钟增加12℃的温度的速率将混悬液从50℃加热至95℃。然后在95℃下将温度保持2.5分钟。最终以每分钟12℃的速率将混悬液冷却至50℃。
在25℃下将所得探针在气密下储存24小时。然后将该探针固定在由Stable Micro Systems(Haslemere，England)生产的TA-XT2型结构分析仪中。使用圆形捣击机。通过设定下列参数来测定凝胶稳定性：
-测试速度：0.5mm/s
-距离：7mm
-接触面积：113mm2
-触发力：2g
转基因品系006和035与野生型植物和对照品植物(如实施例5中所述表达来自反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的转基因植物)相比得到的分布图如附图14中所示。
来自转基因植物的淀粉的结构分析仪显示的分布图(参见附图14)显示出与来自野生型植物和对照品植物的淀粉的分布图的差异。
如果将所述的“距离”设定在7.0mm，那么可以将转基因植物的分布图描述为“树冠样”。
序列表
<110>
Figure C00807908D0048110114QIETU
 Biotechnologie，Forschung & Entwicklung
<120>具有提高的淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶活性的遗传修饰的植物细胞和植物
<130>D 1703 US
<140>
<141>
<160>15
<170>PatencIn Ver.2.1
<210>1
<211>2475
<212>DNA
<213>反硝化奈瑟氏球菌
<220>
<221>CDS
<222>(170)..(2458)
<400>1
Figure C00807908D00481
Figure C00807908D00491
Figure C00807908D00501
Figure C00807908D00511
<210>2
<211>762
<212>PRT
<213>反硝化奈瑟氏球菌
<400>2
Figure C00807908D00521
Figure C00807908D00531
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>3
Figure C00807908D00532
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>4
Figure C00807908D00533
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>5
Figure C00807908D00534
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>6
Figure C00807908D00541
<210>7
<211>92
<212>PRT
<213>马铃薯
<400>7
Figure C00807908D00542
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>8
Figure C00807908D00543
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>9
Figure C00807908D00544
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>10
Figure C00807908D00551
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>11
<210>12
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>12
Figure C00807908D00553
<210>13
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>13
Figure C00807908D00554
<210>14
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>14
Figure C00807908D00555
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：人工序列
<400>15

Claims (9)

1.一种遗传修饰的转基因植物细胞，其中所述的遗传修饰是引入一种或几种编码来源于奈瑟氏球菌属的细菌的淀粉蔗糖酶蛋白和来源于反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的外源核酸分子，它们的表达使得来源于奈瑟氏球菌属的细菌的淀粉蔗糖酶蛋白的活性和来源于反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的活性比相应的遗传未改变的野生型植物细胞得到提高。
2.根据权利要求1所述的转基因植物细胞，其中所述的外源核酸分子带有一种或多种介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶蛋白的液泡定位的蛋白质引导信号序列。
3.根据权利要求1所述的转基因植物细胞，其中所述的外源核酸分子带有一种或多种介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶蛋白的质体定位的蛋白质引导信号序列。
4.根据权利要求1所述的转基因植物细胞，其中所述的外源核酸分子带有一种或多种介导淀粉蔗糖酶蛋白和分支酶蛋白的细胞壁特异性定位的蛋白质引导信号序列。
5.权利要求1所述的转基因植物细胞，它是一种纤维化的或储藏油的或储藏淀粉的或储藏蛋白质的植物的植物细胞。
6.权利要求1所述的转基因植物细胞，它是一种食物或蔬菜植物的植物细胞。
7.一种用于生产可获得比相应非遗传修饰的野生型植物提高的产量的转基因植物的方法，其中
(a)通过引入一种或多种编码来源于奈瑟氏球菌属的细菌的淀粉蔗糖酶蛋白和来源于反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的外源核酸分子对植物细胞进行遗传修饰，所述的外源核酸分子的存在或表达使得来源于奈瑟氏球菌属的细菌的淀粉蔗糖酶蛋白的活性和来源于反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的活性均得到提高；
(b)从按照(a)生产的细胞中再生植物；和
(c)选择性地由按照步骤(b)生产的植物生产其它植物。
8.一种用于生产可合成无法由相应的非遗传修饰的野生型植物细胞合成的在0-6-位上带有改变的支化度的α-1，6支链α-1，4-葡聚糖类的转基因植物的方法，其中
(a)通过引入一种或多种编码来源于奈瑟氏球菌属的细菌的淀粉蔗糖酶蛋白和来源于反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的外源核酸分子对植物细胞进行遗传修饰，所述的外源核酸分子的存在或表达使得来源于奈瑟氏球菌属的细菌的淀粉蔗糖酶蛋白的活性和来源于反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的活性均得到提高；
(b)从按照(a)生产的细胞中再生植物；和
(c)选择性地由按照步骤(b)生产的植物生产其它植物。
9.一种用于生产与相应非遗传修饰的野生型植物相比可合成改性淀粉的转基因植物的方法，其中
(a)通过引入一种或多种编码来源于奈瑟氏球菌属的细菌的淀粉蔗糖酶蛋白和来源于反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的外源核酸分子对植物细胞进行遗传修饰，所述的外源核酸分子的存在或表达使得来源于奈瑟氏球菌属的细菌的淀粉蔗糖酶蛋白的活性和来源于反硝化奈瑟氏球菌的分支酶的活性均得到提高；
(b)从按照(a)生产的细胞中再生植物；和
(c)选择性地由按照步骤(b)生产的植物生产其它植物。
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