ES2295033T3 - Celulas vegetales y plantas modificadas geneticamente con una actividad incrementada de una proteina amilosacarasa y una enzima ramificadora. - Google Patents
Celulas vegetales y plantas modificadas geneticamente con una actividad incrementada de una proteina amilosacarasa y una enzima ramificadora. Download PDFInfo
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Abstract
Una célula de planta transgénica que está modificada genéticamente, en la cual la modificación genética consiste en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraño o de varias moléculas de ácido nucleico extraño, codificando la o las moléculas de ácido nucleico una proteína que tiene la actividad enzimática de una amilosacarasa y una proteína que tiene la actividad enzimática de una enzima ramificadora, y cuya expresión conduce a una actividad incrementada de una proteína amilosacarasa y a una actividad incrementada de una enzima ramificadora en comparación con células vegetales correspondientes de tipo salvaje no modificadas genética-mente.
Description
Células vegetales y plantas modificadas
genéticamente con una actividad incrementada de una proteína
amilosacarasa y una enzima ramificadora.
La presente invención se refiere a células
vegetales y plantas transgénicas con una actividad incrementada de
una proteína amilosacarasa y una actividad incrementada de una
enzima ramificadora. Dichas células vegetales y plantas sintetizan
un almidón modificado y/o sintetizan
\alpha-1,4-glucanos ramificados
con \alpha-1,6 con un grado de ramificación
modificado en posición O-6 y/o dan un rendimiento
mayor en comparación con plantas (células vegetales)
correspondientes de tipo salvaje no modificadas genéticamente.
En el área de la agricultura y silvicultura ha
sido un empeño permanente producir plantas con rendimiento
incrementado, en particular, con objeto de asegurar el alimento para
la población mundial continuamente creciente y garantizar el
suministro de materias primas regenerables. Tradicionalmente, se han
realizado intentos para obtener plantas productivas por
reproducción. Para cada especie de plantas de interés debe
desarrollarse un programa de reproducción correspondiente. Esto es,
sin embargo, intensivo en tiempo y trabajo. Se han hecho progresos,
parcialmente por manipulación genética de plantas, es decir, por
introducción y expresión intencionadas de moléculas de ácido
nucleico recombinante en plantas. Tales enfoques tienen la ventaja
de que, por lo general, no están limitados a una especie de plantas
sino que pueden transferirse a otras especies de plantas. Por esta
razón, resulta deseable proporcionar células vegetales y plantas
que den rendimientos incrementados y ofrezcan además métodos para la
producción de células vegetales y plantas de este tipo.
Con relación a la importancia creciente que se
ha asignado a las sustancias vegetales como fuente de materias
primas regenerables recientemente, es una de las tareas en la
investigación biotecnológica realizar esfuerzos para ajustar estas
materias primas vegetales a las demandas de la industria
manufacturera. Con objeto de facilitar el uso de materias primas
regenerables en tantas áreas de aplicación como sea posible, es
esencial adicionalmente obtener una gran diversidad de sustancias.
Además, es necesario aumentar el rendimiento de estas sustancias
vegetales a fin aumentar la eficiencia de la producción de fuentes
de materias primas vegetales regenerables.
Aparte de aceites, grasas y proteínas, los
polisacáridos son las materias primas vegetales regenerables más
importantes. Aparte de la celulosa, el almidón juega un papel vital
con los polisacáridos, dado que es una de las sustancias de reserva
más importantes en las plantas superiores.
Aparte de su uso en alimentos, el polisacárido
almidón es también utilizado extensamente como materia prima
regenerable para la obtención de productos industriales.
El polisacárido almidón está compuesto de
componentes básicos químicamente uniformes, las moléculas de
glucosa, pero forma una mezcla compleja de diversas moléculas que
tienen grados diferentes de polimerización y ramificación y por
consiguiente difieren sustancialmente en sus propiedades físicas y
químicas.
Se hace una diferenciación entre almidón de
amilosa, un polímero básicamente no ramificado compuesto de unidades
glucosa unidas por enlaces glicosídicos
\alpha-1,4, y el almidón de amilopectina, un
polímero ramificado en el cual la ramificación está causada por la
existencia de enlaces glicosídicos \alpha-1,6. De
acuerdo con la bibliografía (Voet y Voet, Biochemistry, John Wiley
& Sons, 1990) los enlaces glicosídicos
\alpha-1,6 ocurren como promedio en cada
24-avo a 30-avo residuo de glucosa.
Esto corresponde a un grado de ramificación de aproximadamente
3%-4%. Los detalles del grado de ramificación son variables y
dependen la fuente (v.g. la especie de planta, la variedad de
planta, etc.) del almidón individual. Las plantas utilizadas
típicamente para la producción industrial del almidón varían en su
contenido de amilosa referido al contenido de almidón total entre 10
y 25%.
Con objeto de facilitar un uso muy extendido de
polisacáridos tales como p. ej. almidón, parece deseable
proporcionar plantas que estén modificadas en su composición de
polisacáridos y, por ejemplo, sean capaces de sintetizar almidón
modificado y/o
\alpha-1,6-\alpha-1,4-glucanos
altamente ramificados que son particularmente adecuados para
diversos usos. Una posibilidad de producir tales plantas es - aparte
de los métodos de reproducción - la modificación intencionada del
metabolismo del almidón en las plantas productoras de almidón por
métodos de ingeniería genética. Un requisito previo para ello, sin
embargo, es la identificación y caracterización de las enzimas que
juegan un papel en la síntesis y/o modificación del almidón así como
el aislamiento de las moléculas de DNA correspondientes que
codifican estas enzimas.
Los caminos de síntesis bioquímica que conducen
a la formación de almidón son esencialmente conocidos. La síntesis
del almidón en las células vegetales tiene lugar en los plástidos.
En los tejidos fotosintéticamente activos, éstos son los
cloroplastos, y en los tejidos fotosintéticamente inactivos que
almacenan almidón, los amiloplastos.
Las enzimas más importantes que participan en la
síntesis del almidón son las almidón-sintasas
(véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente WO 96/15248), la
enzima R1 (véase por ejemplo el documento WO 97/11118), así como
las enzimas de ramificación (véanse por ejemplo los documentos WO
92/14821, y WO 94/09144). El papel exacto de otras enzimas tales
como v.g. las almidón-fosforilasas (véase por
ejemplo el documento WO 98/40503) durante la biosíntesis del almidón
se desconoce todavía.
Con objeto de proporcionar posibilidades
adicionales para modificar cualesquiera plantas de tal modo que las
mismas sinteticen almidón modificado, es también posible introducir
moléculas de ácido nucleico extraños, como v.g. bacterianas o
fúngicas, que no están presentes en las plantas de tipo salvaje y
que codifican proteínas que participan en la síntesis de los
polisacáridos. Ha podido demostrarse, por ejemplo, que la síntesis
del denominado "amilofructano" es posible por expresión
amiloplastídica de fluctosiltransferasas bacterianas en los
amiloplastos (Smeekens, Trends in Plant Science, Vol. 2, No. 8
(1997), 286-288).
La expresión heteróloga de una
glucógeno-sintasa bacteriana en las plantas de
patata conduce a una ligera disminución en el contenido de amilosa,
un aumento en el grado de ramificación y un cambio en el patrón de
ramificación de la amilopectina en comparación con las plantas de
tipo salvaje (Shewmaker et al., Plant. Physiol., 104 (1994),
1159-1166).
Además, la expresión de una enzima ramificadora
bacteriana en plantas de patata en mutantes de patata exentos de
amilosa (amf) (Jacobsen et al., Euphytica, 44 (1989),
43-48) conduce a moléculas de amilopectina que
tienen 25% más de puntos de ramificación (Kortstee et al.,
The Plant Journal, 10 (1), (1996), 83-90) que las
moléculas de control (amf). El aumento en puntos de ramificación se
debía a una modificación de la distribución de la longitud de
cadena de cadenas laterales más largas a favor de cadenas laterales
más cortas. La reducción de la longitud media de la cadena y la
reducción en el valor \lambdamax después de tinción con yodo son
también una indicación de una estructura de mayor ramificación de
la amilopectina en las plantas transformadas en comparación con las
plantas no transformadas (Kortstee et al., véase arriba). El
grado de ramificación del glucógeno de aproximadamente 10%, no pudo
alcanzarse sin embargo por este enfoque. El glucógeno, un
polisacárido que se encuentra principalmente en animales y
bacterias, contiene
\alpha-1,6-\alpha-1,4-glucanos
altamente ramificados. El glucógeno difiere del almidón también en
la longitud media de las cadenas laterales y en el grado de
polimerización. De acuerdo con la bibliografía (Voet y Voet,
Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990) el mismo contiene un
punto de ramificación \alpha-1,6 en cada octavo a
duodécimo residuo de glucosa como promedio. Esto corresponde a un
grado de ramificación de aproximadamente 8% a 12%. Existen varias
cifras para el peso molecular del glucógeno que varían entre 1
millón y más de 1000 millones (D.J. Manners en: Advances in
Carbohydrate Chemistry, compilador M.L. Wolfrom, Academic Press,
Nueva York (1957), 261-298; Geddes et al.,
Carbohydr. Res., 261 (1994), 69-89). Estas cifras,
asimismo, dependen mucho del organismo fuente correspondiente, su
estado nutricional así como la clase de aislamiento del glucógeno.
Usualmente se obtiene el mismo por métodos costosos e intensivos en
tiempo a partir de mejillones (v.g. Mytillus edulis), de
hígados o músculos de mamífero (v.g. conejos, ratas) (Bell et
al., Biochem. J. 28 (1934), 882; Bueding and Orrell, J. Biol.
Chem., 236 (1961), 2854). Además, en las plantas se encuentra por
ejemplo, en el mutante su1 del maíz el denominado
fitoglucógeno, que tiene un grado de ramificación de
aproximadamente 10% y que exhibe, en comparación con la
amilopectina, una distribución de cadenas laterales modificada (Yun
y Materson, Carbohydrate Research 243 (1993),
307-321) y un comportamiento de solubilidad
diferente. Tales plantas que acumulan fitoglucógeno, sin embargo,
exhiben una reducción en el contenido de almidón de hasta 90%
(Zeeman et al., Plant Cell 10, (1998),
1699-1711).
Adicionalmente, se ha descrito un método in
vitro que utiliza amilosacarasa y una enzima ramificadora para
la síntesis de \alpha-1,4-glucanos
ramificados en \alpha-1,6 que entre otras cosas
permite la producción de glucanos altamente ramificados (similares
al glucógeno) (Solicitud de Patente Alemana DE 19846635.8). La
producción de tales glucanos en plantas, sin embargo, no se describe
en esta memoria.
Por consiguiente, parece deseable proporcionar
medios alternativos que permitan la producción a precios razonables
en las plantas de almidones modificados y/o de
\alpha-1,6-\alpha-1,4-glucanos
con un grado de ramificación modificado en la posición
O-6 en comparación con las plantas de tipo
salvaje.
Así pues, el problema técnico que constituye la
base de la presente invención es proporcionar células vegetales y
plantas que, en comparación con las células vegetales y las plantas
de tipo salvaje no modificadas correspondientes, contienen una
composición modificada de los polisacáridos contenidos en las
células vegetales y las plantas y, si es posible, exhiban también un
rendimiento mayor.
Este problema ha sido resuelto proporcionando
las realizaciones identificadas en las reivindicaciones.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a células vegetales transgénicas que están modificadas
genéticamente en las cuales la modificación genética es la
introducción de una molécula de ácido nucleico extraño o varias
moléculas de ácido nucleico extraños, codificando cada molécula de
ácido nucleico una proteína que tiene la actividad de una
amilosacarasa y una proteína que tiene la actividad enzimática de
una enzima ramificadora, y cuya expresión conduce a una actividad
incrementada de una proteína amilosacarasa y una actividad
incrementada de una proteína de enzima ramificadora en comparación
con las células vegetales o plantas correspondientes de tipo salvaje
no modificadas genéticamente.
La modificación genética puede ser cualquier
modificación genética de este tipo que conduzca a un aumento en la
actividad de amilosacarasa y a un aumento en la actividad de la
enzima ramificadora.
En una realización preferida, la modificación
genética consiste en la introducción de una molécula de ácido
nucleico extraño que codifica una proteína amilosacarasa y una
enzima ramificadora en el genoma de una célula
vegetal.
vegetal.
Esta molécula de ácido nucleico extraño puede
ser, por ejemplo, un denominado "constructo doble" que es un
vector simple para transformación de plantas que contiene la
información genética que codifica a la vez la proteína amilosacarasa
y una enzima ramificadora.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican la
enzima amilosacarasa y la enzima ramificadora, que están contenidas
ambas en la "molécula de ácido nucleico extraño" pueden,
independientemente unas de otras, estar cada una bajo control de un
promotor o pueden, después de fusión como unidad de traducción,
estar bajo control del mismo promotor.
En otra realización preferida, varias moléculas
de ácido nucleico extraño se introducen en el genoma de la célula
vegetal en donde una molécula de ácido nucleico extraño codifica una
proteína amilosacarasa y otra molécula de ácido nucleico extraño
codifica una enzima ramificadora.
De este modo, las moléculas de ácido nucleico
extraño pueden introducirse en el genoma de la célula vegetal al
mismo tiempo o consecutivamente. En el primer caso se habla de una
"cotransformación", y en el último de una
"supertransformación".
El término "transgénico" significa por
tanto que la célula vegetal de la invención contiene al menos una,
preferiblemente dos moléculas de ácido nucleico extraño integradas
de manera estable en el genoma, preferiblemente una o dos moléculas
de ácido nucleico que codifican una proteína amilosacarasa y una
enzima ramificadora.
La expresión "molécula de ácido nucleico
extraño" significa preferiblemente una molécula de ácido nucleico
que codifica una proteína con actividad de amilosacarasa y una
proteína con actividad de enzima ramificadora y que no existe en
las plantas correspondientes naturalmente o que no existe
naturalmente en el orden espacial actual en las plantas o que está
localizada en un lugar del genoma de la planta en donde la misma no
existe naturalmente. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico
extraño es una molécula recombinante constituida por diversos
elementos, cuya combinación u orden espacial específico no existe
naturalmente en las plantas. Las plantas de la invención contienen
al menos una molécula de ácido nucleico extraño que codifica una
proteína por actividad de amilosacarasa y una proteína con
actividad de enzima ramificadora, enlazadas preferiblemente con
elementos de DNA reguladores que garantizan la transcripción en
plantas, en particular con un promotor.
La expresión "varias moléculas de ácido
nucleico extraño" significa preferiblemente dos moléculas de
ácido nucleico en las cuales una molécula de ácido nucleico extraño
codifica una proteína amilosacarasa y la segunda molécula de ácido
nucleico extraño codifica una enzima ramificadora.
En principio, la o las moléculas de ácido
nucleico extraño pueden ser cualesquiera moléculas de ácido nucleico
que codifiquen una proteína amilosacarasa y una enzima
ramificadora.
Dentro de la presente invención, una proteína
amilosacarasa (sacarosa [sic]:
1,4-\alpha-D-glucano-4-\alpha-1,6-transferasa,
E.C. 2.4.1.4) hace referencia a una enzima que, preferiblemente
in vitro, cataliza la conversión de sacarosa en
\alpha-1,4-glucanos insolubles en
agua y fructosa. El esquema de reacción siguiente se sugiere para
esta enzima:
Sacarosa +
(\alpha-1,4-D-glucano)_{n}
\rightarrow D-fructosa +
(\alpha-1,4-D-glucano)_{n+1}
Ésta es una reacción de transglicosilación. Los
productos de esta reacción in vitro son
\alpha-1,4-glucanos insolubles en
agua y fructosa.
Para esta reacción no son necesarios azúcares o
cofactores activados por nucleótidos. La enzima, sin embargo, es
estimulada in vitro por la presencia de aceptores (o
iniciadores) del grupo glucosilo, como v.g.
malto-oligosacáridos, dextrina o glucógeno a los
cuales se transfiere el residuo glucosilo de la sacarosa de acuerdo
con el esquema de reacción anterior con extensión concomitante de
la cadena de \alpha-1,4-glucano
(Remaud-Simeon et al., en S.B. Pedersen, P.
Svenson y S. Pedersen (compiladores), Carbohydrate Bioengineering,
313-320 (1995); Elsevier Science B.V., Ámsterdam,
Países Bajos).
En la presente invención, en principio, son
adecuadas todas las amilosacarasas que catalizan la síntesis de
\alpha-1,4-glucanos lineales a
partir de sacarosa.
Las amilosacarasas se han conocido únicamente
hasta ahora en especies de bacterias, en particular principalmente
de las especies de Neisseria (MacKenzie et al., Can. J.
Microbiol. 24 (1978), 357-362).
Por esta razón se utiliza preferiblemente una
amilosacarasa de origen procariota. Se conocen amilosacarasas, por
ejemplo, de Neisseria perflava (Okada y Hehre, J. Biol. Chem.
249 (1974), 126-135; MacKenzie et al., Can.
J. Microbiol. 23 (1977), 1303-1307) o Neisseria
canis, Neisseria cinerea, Neisseria denitrificans, Neisseria
sicca y Neisseria subflava (MacKenzie et al., Can.
J. Microbiol. 24 (1978), 357-362). Adicionalmente,
WO 95/31553 y PCT/EP 98/05573 (WO 00/14249) describen una
amilosacarasa de Neisseria polysaccharea.
\newpage
En otra realización previa de la invención, la
molécula de ácido nucleico extraño codifica una amilosacarasa de una
bacteria del género Neisseria.
En una realización particularmente preferida de
la invención, la molécula de ácido nucleico extraño codifica una
amilosacarasa de Neisseria polysaccharea, más preferiblemente
una amilosacarasa con la secuencia de ácido nucleico o de
aminoácidos que se describe en la Solicitud de Patente Internacional
PCT/EP 98/05573 (WO 00/14249).
La enzima que se expresa en Neisseria
polysaccharea es extremadamente estable, está unida firmemente a
los productos de polimerización y es inhibida competitivamente por
el producto de reacción fructosa (MacKenzie et al., Can. J.
Microbiol. 23 (1977), 1303-1307). En el caso de la
especie de Neisseria Neisseria polysaccharea, la
amilosacarasa es secretada (Riou et al., Can. J. Microbiol.
32 (1986), 909-911), mientras que en otras especies
de Neisseria permanece en la célula.
Una enzima ramificadora
(\alpha-1,4-glucano:
\alpha-1,4-glucano-6-glicosiltransferasa,
E.C. 2.4.1.18) es una proteína de cataliza una reacción de
transglicosilación en la cual los enlaces
\alpha-1,4 de un donante de
\alpha-1,4-glucano se hidrolizan y
las cadenas de \alpha-1,4-glucano
que se liberan en este proceso se transfieren a una cadena aceptora
de \alpha-1,4-glucano y se
transforman con ello en enlaces \alpha-1,6.
En conexión con la presente invención, en
principio, todas las enzimas ramificadoras de cualquier origen
(bacteriano, fúngico, vegetal, animal) son adecuadas, por ejemplo,
enzimas ramificadoras de maíz (véase v.g. Baba et al.,
Biochem. Biophys Res. Commun. 181 (1991), 87-94;
Genbank Acc. No. AF072724, AF072725), de patata (Kossmann et
al., Mol. Gen. Genet. 203 (1991), 237-244;
Jobling et al, Genbank Acc. No. AJ011885), de arroz (Mizuno
et al., J. Biochem. 112 (1992), 643-651;
Kawasaki et al., Mol Gen. Genet. 237 (1993),
10-16; Mizuno et al., J. Biol. Chem. 268
(1993), 190844-19091; Nakamura and Yamanouchi, Plant
Physiol. 99 (1992), 1265-1266), de trigo (Baga
et al., Plant Mol. Biol. 40 (1999),
1019-1030; Rahman et al., Theor. Appl. Genet.
98 (1999), 156-163 and Genbank Acc. No. Y12320), de
cebada (Genbank Acc. No. AF064561), de Synechocystis (Genbank Aec.
No. D63999), de E. coli (Baecker et al., J. Biol.
Chem. 261 (1986), 8738-8743; Genbank Acc. No.
M13751), de Bacillus stearothermophilus (Genbank Acc. No.
M35089), Streptomyces aureofaciens (Genbank Acc. No. L11647),
Bacillus caldolyticus (Genbank Acc. No. Z14057),
Synechococcus PCC6301 (Genbank Acc. No. M31544), Synechococcus sp.
PCC7942 (Kiel et al., Gene 78 (1989), 9-17) y
de Agrobacterium tumefaciens (Genbank Acc. No. AF033856).
El aislamiento de los genes correspondientes es
posible para las personas expertas en la técnica por medio de
procedimientos estándar de biología molecular, como ha sido descrito
entre otros por Sambrook et al. (Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU.
(1989)).
(1989)).
En una realización preferida de la invención, la
molécula de ácido nucleico extraño codifica una enzima ramificadora
de un procariota, preferiblemente de una bacteria del género
Neisseria, de modo particularmente preferible de Neisseria
denitrificans y de modo todavía más preferible una enzima
ramificadora con la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID
No. 1 o con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No.
2.
En una realización adicionalmente preferida, la
molécula de ácido nucleico extraño codifica una enzima ramificadora
vegetal.
Existe una diversidad de técnicas para la
introducción de DNA en una célula hospedadora vegetal. Estas
técnicas comprenden la transformación de células vegetales con
T-DNA utilizando Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, la
fusión de protoplastos, la inyección, la electroporación de DNA, la
introducción de DNA con el enfoque biolístico y otras
posibilidades.
El uso de la transformación mediada por
Agrobacterium de células vegetales se ha examinado intensivamente y
ha sido descrito suficientemente en el documento EP 0120516;
Hoekema, en: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters
B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit.
Rev. Plant Sci. 4, 1-46 and An et al. EMBO
J. 4, (1985), 277-287. Para la transformación de la
patata, véase v.g. Rocha-Sosa et al., EMBO J.
8, (1989), 29-33).
La transformación de plantas monocotiledóneas
por medio de vectores basados en Agrobacterium ha sido descrita
(Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993),
491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994)
271-282; Deng et al., Science in China 33,
(1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell
Reports 11, (1992), 76-80; May et al.,
Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Connor and
Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555;
Ritchie et al., Transgenic Res. 2, (1993),
25-265). Un sistema alternativo para la
transformación de plantas monocotiledóneas es la transformación con
el enfoque biolístico (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994),
37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11
(1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol.
Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer et al.,
Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), la
transformación de protoplastos, la electroporación de células
parcialmente permeabilizadas, y la introducción de DNA por medio de
fibras de vidrio. La transformación del maíz, en particular, ha sido
descrita repetidas veces en la bibliografía (compárese, v.g. WO
95/06128, EP 0513849, EP 0465875, EP 0 292435; Fromm et al.,
Biotechnology 8, (1990), 833-844;
Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990),
603-618; Koziel et al., Biotechnology 11
(1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl.
Genet. 80, (1990), 721-726).
Asimismo, ha sido ya descrita la transformación
con éxito de otras especies de cereales, v.g. para la cebada (Wan y
Lemaux, véase arriba; Ritala et al., véase arriba; Krens
et al., Nature 296, (1982), 72-74) y para el
trigo (Nehra et al., Plant J. 5, (1994),
285-297).
En general, cualquier promotor activo en células
vegetales puede utilizarse para la expresión de la molécula de
ácido nucleico extraño (o las moléculas de ácido nucleico extraño).
El promotor puede seleccionarse de tal manera que la expresión en
las plantas de la invención ocurra constitutivamente o sólo en un
cierto tejido, en un cierto momento del desarrollo de la planta o
en un momento determinado por factores de influencia externa. Con
relación a la planta, el promotor puede ser homólogo o
heterólogo.
Promotores apropiados son v.g. el promotor del
RNA 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor y el promotor
ubiquitina del maíz para una expresión constitutiva, el promotor del
gen patatina B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J.
8 (1989), 23-29) para una expresión específica de
tubérculo en las patatas o un promotor que garantiza únicamente
expresión en un tejido fotosintéticamente activo, v.g. el promotor
ST-LS1 (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et
al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), el promotor
Ca/b (véanse por ejemplo los documentos US 5656496, US 5639952,
Bansal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, (1992),
3654-3658) y el promotor rubisco SSU (véanse por
ejemplo los documentos US 5034322 y US 4962028) o el promotor
glutelina para una expresión específica del endospermo (Leisy et
al., Plant Mol. Biol. 14, (1990), 41-50; Zheng
et al., Plant J. 4, (1993), 357-366;
Yoshihara et al., FEBS Lett. 383, (1996),
213-218), el promotor contraído-1
(Werr et al., EMBO J. 4, (1985), 1373-1380),
el promotor HMG del trigo, el promotor USP, el promotor faseolina o
promotores de genes de zeína del maíz (Pedersen et al., Cell
29, (1982), 1015-1026; Quatroccio et al.,
Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93).
La expresión de la molécula de ácido nucleico
extraño (las moléculas de ácido nucleico extraño) es particularmente
ventajosa en aquéllos órganos de la planta que tienen un contenido
incrementado de sacarosa o que almacenan sacarosa. Tales órganos
son v.g. el nabo [sic] de la remolacha azucarera o el tallo de la
caña de azúcar o del mijo dulce. Por consiguiente promotores
preferiblemente utilizados son aquéllos que median la expresión en
estos órganos. Sin embargo, pueden utilizarse también otros
promotores, a saber aquéllos que son únicamente activos en un
momento determinado por factores de influencia externos (véase por
ejemplo el documento WO 9307279). En este caso, pueden ser
especialmente interesantes los promotores de las proteínas del
choque térmico dado que permiten una inducción simple.
Adicionalmente, pueden utilizarse promotores específicos de semillas
tales como v.g. el promotor USP de Vicia faba, que garantiza una
expresión específica de semilla en Vicia faba y otras plantas
(Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993),
669-679; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet.
225, (1991), 459-467). Además, pueden utilizarse
promotores específicos de frutas, como se describe v.g. en los
documentos WO 91/01373, WO 99/16879, y en van Haaren and Houck
(Plant Mol. Biol. 21, (1993), 625-640).
Adicionalmente, puede estar presente una
secuencia de terminación que es útil para la terminación correcta
de la transcripción así como para la adición de una cola
poli-A al transcrito al que se adscribe una función
en la estabilización de los transcritos. Tales elementos han sido
descritos en la bibliografía (véase v.g. Gielen et al., EMBO
J. 8 (1989), 23-29 y son intercambiables
arbitrariamente.
Las células vegetales de la invención pueden
diferenciarse de células vegetales existentes naturalmente, entre
otras cosas, por el hecho de que aquéllas contienen uno o más
moléculas de ácido nucleico extraño que no existe(n)
naturalmente en estas células o porque dicha o dichas moléculas se
encuentra(n) integrada(s) en un lugar tal en el
genoma de las plantas en el que no se encuentra(n)
aquélla(s) normalmente, es decir en otro entorno genómico.
Adicionalmente, tales células vegetales transgénicas de la invención
pueden diferenciarse de las células vegetales existentes
naturalmente porque aquéllas contienen al menos una copia de la
molécula de ácido nucleico extraño (moléculas de ácido nucleico
extraño) integrada(s) establemente en su genoma, posiblemente
además de copias de una molécula de este tipo que existen
naturalmente en las células de la planta. Si la o las moléculas de
ácido nucleico que se introduce(n)
en la célula es(son) una o más copias adicionales de moléculas existentes naturalmente en las plantas, entonces las células de la planta de la invención pueden diferenciarse de las células de la planta existentes naturalmente en particular por el hecho de que esta o estas copia(s) adicional(es) está(n) localizada(s) en lugares del genoma en donde aquélla(s) no se encuentran naturalmente. Esto puede ensayarse, por ejemplo, por análisis mediante transferencia
Southern.
en la célula es(son) una o más copias adicionales de moléculas existentes naturalmente en las plantas, entonces las células de la planta de la invención pueden diferenciarse de las células de la planta existentes naturalmente en particular por el hecho de que esta o estas copia(s) adicional(es) está(n) localizada(s) en lugares del genoma en donde aquélla(s) no se encuentran naturalmente. Esto puede ensayarse, por ejemplo, por análisis mediante transferencia
Southern.
Además, las células vegetales de la invención
pueden diferenciarse de las células vegetales existentes
naturalmente, preferiblemente por una de las características
siguientes: si la o las moléculas de ácido nucleico
introducida(s) es(son) heterólogas con relación a la
planta, las células de la planta transgénica exhiben transcritos de
las moléculas de ácido nucleico introducidas. Éstos pueden
detectarse, por ejemplo, en el análisis por transferencia Northern.
Preferiblemente, las células vegetales de la invención contienen
proteínas que son codificadas por la molécula o las moléculas del
ácido nucleico extraño introducidas. Esto puede ensayarse, por
ejemplo, por métodos inmunológicos, en particular por análisis
mediante transferencia Western.
Si la molécula introducida es homóloga con
respecto a la planta, las células de la planta transgénica de la
invención pueden diferenciarse de las células vegetales existentes
naturalmente, por ejemplo debido a la expresión adicional de las
moléculas de ácido nucleico extraño introducidas. Las células de las
plantas transgénicas contienen preferiblemente más transcritos de
las moléculas de ácido nucleico extraño. Esto puede ensayarse, por
ejemplo, por análisis mediante transferencia Northern.
La expresión "genéticamente modificada"
significa que la célula vegetal está modificada en su información
genética por introducción de una molécula de ácido nucleico extraño
o varias moléculas de ácido nucleico extraño y que la presencia o
la expresión de la o las moléculas de ácido nucleico extraño conduce
a un cambio fenotípico. En este caso, cambio fenotípico significa
preferiblemente un cambio medible de una o más funciones de las
plantas (células vegetales). Las células vegetales de la invención,
por ejemplo, exhiben una actividad incrementada de una proteína con
actividad de amilosacarasa y de una proteína con actividad de enzima
ramificadora debido a la presencia o la expresión de la molécula de
ácido nucleico introducida.
En el marco de la presente invención, la
expresión "actividad incrementada" significa una expresión
incrementada de la molécula de ácido nucleico (varias moléculas de
ácido nucleico) que codifica una proteína con actividad de
amilosacarasa y una proteína con actividad de enzima ramificadora,
un aumento en la cantidad de proteínas con actividad de
amilosacarasa y con actividad de enzima ramificadora o un aumento en
la actividad de una proteína con actividad de amilosacarasa y de
una proteína con actividad de enzima ramificadora en las
plantas.
Un aumento de la expresión puede determinarse,
por ejemplo, por medida de la cantidad de transcritos que codifican
tales proteínas, v.g. por análisis mediante transferencia Northern.
En este caso, un aumento significa preferiblemente un aumento en la
cantidad de transcritos en comparación con células correspondientes
de la planta no modificadas genéticamente de al menos un 10%,
preferiblemente al menos un 20%, de modo particularmente preferido
al menos un 50%, y de modo especialmente preferido al menos un
75%.
El aumento en la cantidad de proteína con
actividad de amilosacarasa o con actividad de enzima ramificadora
puede determinarse, por ejemplo, por análisis mediante transferencia
Western. En este caso, un aumento significa preferiblemente un
aumento en la cantidad de proteína con actividad de amilosacarasa o
con actividad de enzima ramificadora y/o un aumento en la actividad
de amilosacarasa o la actividad de enzima ramificadora en
comparación con células correspondientes no modificadas
genéticamente al menos un 10%, preferiblemente al menos un 20%, de
modo particularmente preferido al menos un 50% y de modo
especialmente preferido al menos un 75%.
La actividad de la proteína amilosacarasa y la
enzima ramificadora puede, por ejemplo, ensayarse como se describe
en los ejemplos. Adicionalmente, la actividad de una enzima
ramificadora puede determinarse como se describe en Lloyd et
al., (Biochem. J. 338 (1999), 515-521). La
actividad de amilosacarasa puede determinarse también como se
describe más adelante en la sección "Materiales y Métodos ...",
sección 3.
Sorprendentemente, se ha encontrado que las
plantas que contienen tales células vegetales con actividad
incrementada de una amilosacarasa y de una enzima ramificadora
sintetizan \alpha-1,4-glucanos
ramificados en \alpha-1,6 con un grado de
ramificación modificado en posición O-6 que no son
sintetizados por las células vegetales correspondientes de tipo
salvaje no modificadas genéticamente.
En una realización de la invención, las células
vegetales de la invención contienen
\alpha-1,4-glucanos ramificados
en \alpha-1,6 con un grado de ramificación en
posición O-6 de al menos 2%, preferiblemente de al
menos 4%. En otra realización, el grado de ramificación es al menos
6%, preferiblemente al menos 8%, de modo particularmente preferido
al menos 10% y de modo especialmente preferido al menos 12%.
Dentro del marco de la presente invención,
"grado de ramificación" significa el número medio de
ramificaciones en posición O-6 en comparación con
todas las unidades de glucosa enlazadas de manera diferente.
El grado de ramificación puede determinarse por
un análisis de metilación, como, por ejemplo, se describe más
adelante con mayor detalle. Información general acerca de este
método puede encontrarse también, por ejemplo, en "Analysis of
Carbohydrates by GLC and MS" (Biermann, C.J. and McGinnis, G.L.
(compiladores) CRC Press (1989), capítulo 9 por Carpita, N.C. y
Shea, E.M., 157-216) o en Björndal H. et al.
(Angew. Chem., 82, (1970), 643-652; Int. Ed. Engl.
9, (1970), 610-619).
En otra realización de la invención, las células
vegetales de la invención sintetizan almidones modificados que
difieren de los almidones de las células de las plantas de tipo
salvaje correspondientes en sus propiedades
físico-químicas, en particular la relación
amilosa/amilopectina, el grado de ramificación, la longitud media
de la cadena, el contenido de fosfato, las propiedades de encolado,
el tamaño y/o la forma del gránulo de almidón. En particular, un
almidón de este tipo puede modificarse con relación a la viscosidad
y/o la capacidad de formación de gel de los engrudos de almidón en
comparación con el almidón de tipo salvaje.
En una realización adicional de la invención,
las plantas que contienen las células vegetales de la invención
tienen un rendimiento mayor en comparación con las plantas
correspondientes de tipo salvaje no modificadas
genética-
mente.
mente.
Dentro de la presente invención, la expresión
"planta de tipo salvaje" significa que las plantas han servido
como materia prima para la producción de las plantas de la
invención, es decir cuya información genética, aparte de la
modificación genética introducida, corresponde a la de una planta de
la invención.
En este caso, la expresión "rendimiento
incrementado" Significa un aumento de rendimiento de al menos 5%,
preferiblemente al menos 10%, de modo particularmente preferido al
menos 20%, y de modo especialmente preferido al menos 30%. La
expresión "rendimiento incrementado" significa preferiblemente
un aumento en la producción de sustancias y/o biomasa, en
particular cuando se mide basado en el peso fresco por planta.
Un aumento de rendimiento de este tipo se
refiere preferiblemente a partes de plantas que pueden ser
recolectadas tales como semillas, frutos, raíces de almacenamiento,
raíces ordinarias, tubérculos, inflorescencias, yemas, brotes,
tallos o madera.
De acuerdo con la invención, el aumento de
rendimiento es al menos 3% con referencia a la biomasa y/o el
contenido de sustancias en comparación con plantas correspondientes
no transformadas del mismo tipo de genoma si se cultivan en las
mismas condiciones, preferiblemente al menos 10%, de modo
particularmente preferido al menos 20% y de modo especialmente
preferido al menos 30% o incluso 40% en comparación con plantas de
tipo salvaje.
En una realización adicional de la presente
invención, las células vegetales de la invención tienen un valor
calórico incrementado en comparación con las células vegetales
correspondientes de tipo salvaje no modificadas genéticamente.
El término "valor calórico" se define como
la cantidad de energía (dada en calorías o joule) que obtiene el
cuerpo con la digestión del alimento y que se utiliza para cubrir
las necesidades de energía. La expresión "valor calórico
incrementado" significa un aumento en el valor calorífico de al
menos 5%, preferiblemente al menos 10%, de modo particularmente
preferible al menos 20% y de modo especialmente preferible al menos
30%.
Las plantas con valores calóricos altos son
interesantes para la industria alimentaria, en particular para la
dieta de las personas con altas necesidades de energía, tales como
v.g. personas enfermas o ancianas, de niños pequeños o de atletas de
competición.
En una realización preferida, la secuencia de
nucleótidos que codifica una enzima amilosacarasa y una enzima
ramificadora comprende una secuencia señal de direccionamiento de
proteínas que asegura la localización en un compartimiento celular
específico, tal como la vacuola o los plástidos. En una realización
particularmente preferida, las secuencias de nucleótidos que
codifican las dos enzimas comprenden una secuencia señal de
direccionamiento de proteínas que asegura que ambas enzimas se
localizan en el mismo compartimiento celular. En este contexto, la
molécula de ácido nucleico extraño puede comprender una o más
secuencias señal de direccionamiento de proteínas que
asegura(n) la localización de la enzima amilosacarasa y la
enzima ramificadora en el mismo compartimiento celular.
Particularmente, es posible que cada región codificante que codifica
la amilosacarasa o la enzima ramificadora comprenda más de una
secuencia señal o una combinación de secuencias señal
diferentes.
En una realización adicional de la invención, la
molécula de ácido nucleico extraño tiene una o más secuencias señal
de direccionamiento de proteínas que media(n) una
localización vacuolar de la proteína amilosacarasa y de la enzima
ramificadora.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican la
enzima amilosacarasa y la enzima ramificadora que están contenidas
ambas en la "molécula de ácido nucleico extraño" pueden estar
bajo el control de una o de varias secuencias señal de
direccionamiento de proteínas, independientes unas de otras, o bien
pueden estar bajo control de una o de varias secuencias señal de
direccionamiento de proteínas juntas después de la fusión como
unidad de traducción.
En otra realización de la invención, cada una de
las moléculas de ácido nucleico extraño tiene una o varias
secuencias señal de direccionamiento de proteínas, cada una de las
cuales media una localización vacuolar de la proteína amilosacarasa
y de la enzima ramificadora.
En esta realización, se introducen varias
moléculas de ácido nucleico extraño en el genoma de la célula
vegetal en donde una molécula de ácido nucleico extraño codifica
una proteína amilosacarasa y otra molécula de ácido nucleico
codifica una enzima ramificadora. Como se ha mencionado
anteriormente, las moléculas de ácido nucleico extraño pueden
introducirse en el genoma de la célula de la planta simultánea o
consecutivamente.
Cada una de las moléculas de ácido nucleico
extraño contiene una o más secuencias señal de direccionamiento de
proteínas que media(n) una localización vacuolar de cada una
de la proteína amilosacarasa y la enzima ramificadora en donde la o
las secuencias señal de direccionamiento de proteínas pueden ser
idénticas o pueden ser diferentes una de otra.
La secuencia N-terminal (146
aminoácidos) de la proteína patatina, por ejemplo, puede utilizarse
como secuencia de direccionamiento vacuolar (Sonnewald et
al., Plant. J. 1, (1998), 95-106). En una
realización preferida, se utiliza la secuencia señal descrita en
SEQ ID No. 7. Adicionalmente, las secuencias señal siguientes pueden
utilizarse como secuencias de direccionamiento vacuolar: la
secuencia señal N-terminal de la invertasa ácida
del tomate (Genbank Acc. No. LM81081) o de la patata (Genbank Acc.
No. L29099), la secuencia señal N-terminal de la
esporamina de la batata (Koide et al., Plant Physiol. 114
(1997), 863-870), la secuencia señal
N-terminal de la aleuraína de la cebada (Vitale y
Raikhel, Trends in Plant Science 4 (1999), 149-155),
la secuencia señal N-terminal del inhibidor
proteinasa de la patata (Genbank Acc. No. X04118) en combinación con
el péptido señal de direccionamiento vacuolar del terminal C de la
lectina de cebada (Vitale y Raikhel. loc.cit.).
\newpage
Secuencias señal vacuolares adicionales han sido
descritas por ejemplo por Matsuoka y Neuhaus, Journal of
Experimental Botany 50, (1999), 165-174; Chrispeels
y Raikhel, Cell 68, (1992), 613-616; Matsuoka y
Nakamura, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, (1991),
834-838; Bednarek y Raikhel, Plant Cell 3, (1991),
1195-1206; Nakamura y Matsuoka, Plant Phys. 101,
(1993), 1-5. En general, puede utilizarse una
combinación que comprende una secuencia señal
N-terminal, que asegura el transporte de la proteína
respectiva al retículo endoplasmático, y una secuencia de
direccionamiento vacuolar C-terminal. Una revisión
acerca de secuencias de direccionamiento vacuolar puede encontrarse
en Chrispeels y Raikhel, (Cell 68, (1992),
613-616).
Dado que la vacuola puede almacenar usualmente
grandes cantidades de sacarosa que sirven como sustrato para la
amilosacarasa, este compartimiento es adecuado para producir células
vegetales que, debido a una actividad incrementada de una proteína
amilosacarasa y una actividad incrementada de una enzima
ramificadora sintetizan
\alpha-1,4-glucanos ramificados en
\alpha-1,6 en la vacuola. En una realización de la
invención, estos glucanos en posición O-6 tienen un
grado de ramificación de al menos 1%, preferiblemente al menos 4%,
de modo particularmente preferido al menos 7% y de modo
especialmente preferido al menos 10%.
En una realización adicional de la invención, el
grado de ramificación en posición O-6 puede
controlarse por selección de plantas transgénicas que exhiben
relaciones diferentes de actividad de enzima ramificadora a
actividad de amilosacarasa.
En una realización particularmente preferida,
las células vegetales de acuerdo con la invención en las cuales
están localizadas tanto la amilosacarasa como la enzima ramificadora
en la vacuola, exhiben un valor calórico incrementado. Para la
definición de este término, véase arriba.
En una realización adicional de la invención, la
molécula de ácido nucleico extraño tiene una o más secuencias señal
de direccionamiento de proteínas que media(n) una
localización plastídica de la proteína amilosacarasa y la proteína
enzima ramificadora.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican la
enzima amilosacarasa y la enzima ramificadora que están contenidas
ambas en la "molécula de ácido nucleico extraño" pueden, o bien
estar cada una, independientemente una de otra, bajo control de una
o más secuencias señal de direccionamiento de proteínas, o bien,
después de fusión como unidad de traducción, estar bajo control de
una o más secuencias señal de direccionamiento de proteínas.
En otra realización de la invención, las
moléculas de ácido nucleico extraño tienen una o más secuencias
señal de direccionamiento de proteínas cada una de las cuales media
(median) una localización plastídica de la proteína amilosacarasa y
la proteína enzima ramificadora.
En esta realización, se introducen varias
moléculas de ácido nucleico extraño en el genoma de la célula
vegetal en donde una molécula de ácido nucleico extraño codifica
una proteína amilosacarasa y otra molécula de ácido nucleico
extraño codifica una enzima ramificadora. Como se ha mencionado
anteriormente, las moléculas de ácido nucleico extraño pueden
introducirse en el genoma de la célula vegetal simultánea o
consecutivamente.
Cada una de las moléculas de ácido nucleico
extraño introducidas contiene una o más secuencias señal de
direccionamiento de proteínas que median una localización
plastídica de cada una de la proteína amilosacarasa y la proteína
enzima ramificadora en donde las secuencias señal de
direccionamiento de proteínas son idénticas o diferentes una de
otra.
La secuencia señal de
ferrodoxina:NADP^{+}-oxidorreductasa (FNR) de la
espinaca, por ejemplo, puede utilizarse como secuencia señal. La
secuencia contiene la región no traducida 5' así como la secuencia
del péptido de tránsito flanqueante del cDNA de la proteína
plastídica ferrodoxina:NADP^{+}-oxidorreductasa de
la espinaca (nucleótido -171 a +165; Jansen et al., Current
Genetics 13, (1988), 517-522).
Adicionalmente, por ejemplo, el péptido de
tránsito de la proteína cérea del maíz más los 34 primeros
amino-ácidos de la proteína cérea madura (Klösgen et al.,
Mol. Gen. Genet. 217, (1989), 155-161 puede
utilizarse como secuencia señal.
Otras secuencias de direccionamiento plastídico
que pueden utilizarse son: la secuencia señal de la subunidad
pequeña de rubisco (Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85 (1988), 846-850; Nawrath et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 12760-12764), la
secuencia señal de la
NADP-malato-deshidrogenasa (Gallardo
et al., Planta 197 (1995), 324-332) y la
secuencia señal de la glutation-reductasa (Creissen
et al., Plant J. 8 (1995), 167-175).
En una realización preferida de la invención, se
utiliza el péptido de tránsito de la proteína cérea del maíz (véase
arriba) (véase Ejemplo 1) sin los 34 primeros aminoácidos de la
proteína cérea madura.
En una realización particularmente preferida, se
utiliza la secuencia señal plastídica de la proteína R1 de la patata
(Lorberth et al., Nature Biotechnology 16 (1998),
473-477).
Con la expresión en los amiloplastos de las
fructosiltransferasas bacterianas podría demostrarse que los
plástidos contienen también sacarosa que puede ser transformada en
"amilofructano" por las fructosiltransferasas contenidas en
los amiloplastos (Smeekens, Trends in Plant Science, Vol. 2 No. 8,
(1997), 286-288). Por esta razón, dicho
compartimiento es también adecuado para la expresión combinada de un
gen de amilosacarasa y un gen de la enzima ramificadora y permite
la síntesis de almidón modificado, que está modificado, por ejemplo,
en sus propiedades fisicoquímicas, particularmente en la relación
amilosa/amilopectina, el grado de ramificación, la longitud media
de la cadena, el contenido de fosfato, las propiedades de empastado,
el tamaño y/o la forma del gránulo de almidón en comparación con el
almidón sintetizado en las plantas de tipo salvaje.
Por esta razón, en una realización adicional de
la invención, las células de las plantas transgénicas de la
invención sintetizan almidones modificados.
En una realización preferida de la invención, la
estabilidad del gen de estos almidones se cambia en comparación con
los almidones extraídos de plantas de tipo salvaje. En una
realización particularmente preferida, la estabilidad máxima del
gel se incrementa al menos un 20%, más preferiblemente al menos un
50%, todavía más preferiblemente al menos un 100% y de modo
especialmente preferido al menos un 200%, en comparación con los
almidones extraídos de plantas de tipo salvaje.
La estabilidad del gel puede determinarse como
se describe en el Ejemplo 9.
Los almidones aislados de las células vegetales
de la invención pueden modificarse también de acuerdo con métodos
conocidos por las personas expertas en la técnica, y son adecuados
tanto en forma no modificada como en forma modificada para diversas
aplicaciones en los sectores alimentarios y no alimentarios.
En principio, el área de aplicación del almidón
puede subdividirse en dos grandes áreas. Un área comprende los
productos de hidrólisis del almidón, principalmente componentes de
glucosa y glucano que se obtienen por métodos enzimáticos o
químicos. Los mismos sirven como material de partida para
modificaciones y procesos químicos ulteriores, tales como
fermentación. Con relación a la reducción de costes, pueden ser
importantes la sencillez y la conducción eficiente en costes de un
método de hidrólisis. En el momento actual, el mismo es
principalmente enzimático cuando se utiliza amiloglucosidasa. Sería
imaginable economizar costes por reducción de la cantidad de
enzimas utilizadas. Una modificación de la estructura del almidón,
v.g. extensión del grano en superficie, digestibilidad más fácil
debido a un menor grado de ramificación de una estructura estérica
que limite la accesibilidad de las enzimas utilizadas podría
conseguir esto.
La otra área en la cual se utiliza el almidón
debido a su estructura polímera como el denominado almidón nativo
puede dividirse en dos áreas de aplicación ulteriores:
El almidón es un aditivo clásico para diversos
alimentos, sirviendo el mismo esencialmente para el propósito de
fijar aditivos acuosos o causa una viscosidad incrementada o
formación incrementada de gel. Características importantes son:
comportamiento del flujo y de sorción, hinchamiento y temperatura de
empastado, viscosidad y comportamiento de espesamiento, solubilidad
del almidón, transparencia y estructura del engrudo, calor,
cizallamiento y resistencia a los ácidos, tendencia a la
retrogradación, capacidad de formación de película, resistencia a
la helada y al deshielo, digestibilidad así como la capacidad de
formación de complejos con v.g. iones inorgánicos u orgánicos.
En esta vasta área, el almidón puede utilizarse
como adyuvante en diversos procesos de producción o como aditivo en
productos técnicos. El campo principal en el que se utiliza almidón
como adyuvante es la industria del papel y del cartón. En este
campo, el almidón se utiliza principalmente para retención
(retención de sólidos), para carga de apresto y partículas finas,
como sustancia solidificante y para deshidratación. Adicionalmente,
se hace uso de las propiedades ventajosas del almidón con relación a
rigidez, dureza, solidez, agarre, brillo, suavidad, resistencia al
desgarro así como las superficies.
Dentro del proceso de producción del papel,
puede hacerse una diferenciación entre cuatro campos de aplicación,
a saber superficie, recubrimiento, masa y pulverización. Los
requerimientos en cuanto al almidón con relación al tratamiento de
la superficie, son esencialmente un alto grado de brillo, viscosidad
correspondiente, alta estabilidad de la viscosidad, formación de
película satisfactoria y poca formación de polvo. Cuando se utiliza
en el recubrimiento del contenido de sólidos, una viscosidad
correspondiente, una alta capacidad de fijación así como una alta
afinidad de pigmentos juegan un papel importante. Como aditivo para
la masa, son importantes dispersión rápida, uniforme, y exenta de
pérdidas, alta estabilidad mecánica y retención completa en la pasta
de papel. Cuando se utiliza el almidón en pulverización, son
importantes también el contenido de sólidos correspondiente,
viscosidad alta y alta capacidad de fijación.
\newpage
Un campo principal de aplicación es, por
ejemplo, en la industria de adhesivos, donde el almidón se utiliza
en 4 áreas: el uso como cola de almidón pura, el uso en colas de
almidón preparadas con productos químicos especiales, el uso de
almidón como aditivo para resinas sintéticas y dispersiones de
polímeros, así como el uso de almidones como extendedores para
adhesivos sintéticos. El 90% de todos los adhesivos basados en
almidón se utilizan en la producción de cartón ondulado, sacos y
bolsas de papel, materiales compuestos para papel y aluminio, cajas
y cola humectable para sobres, sellos, etc.
Otro posible uso del almidón como adyuvante y
aditivo es en la producción de tejidos y productos para el cuidado
de tejidos. Dentro de la industria textil, puede hacerse una
diferenciación entre los 4 campos de aplicación siguientes: el uso
de almidón como agente de apresto, es decir como adyuvante para
alisado y refuerzo del comportamiento de desmotado para la
protección contra fuerzas de tracción activas en la tejedura así
como para el aumento de la resistencia al desgaste durante la
tejedura, como agente para mejora de los productos textiles
principalmente después del pretratamiento contra el deterioro de la
calidad, tal como blanqueo, tinción, etc., como espesante en la
producción de pastas de tinción para la prevención de la difusión de
los tintes y como aditivo para agentes de alabeo para la costura de
los hilos.
La cuarta área de aplicación del almidón es su
uso como aditivo en materiales de construcción. Un ejemplo es la
producción de láminas de cartón-yeso, en las cuales
el almidón mezclado en el yeso fino se empasta con agua, se difunde
en la superficie del cartón-yeso y fija así el
cartón a la lámina. Otros campos de aplicación son la mezcla del
mismo con yeso y fibras minerales. En el hormigón preparado, puede
utilizarse almidón para la desaceleración del proceso de
endurecimiento.
Adicionalmente, el almidón es ventajoso para la
producción de medios para estabilización de tierras utilizados en
la protección temporal de las partículas de suelo contra el agua en
el desplazamiento artificial de tierras. De acuerdo con el
conocimiento de la técnica anterior, puede considerarse que
productos de combinación constituidos por almidón y emulsiones de
polímero tienen el mismo efecto reductor de la erosión y las
incrustaciones que los productos utilizados hasta ahora; sin
embargo, aquéllos son considerablemente más económicos.
Otro campo de aplicación es el uso de almidón en
protectores de plantas para la modificación de las propiedades
específicas de estas preparaciones. Por ejemplo, los almidones se
utilizan para mejorar la humectación de protectores de plantas y
fertilizantes, para la liberación dosificada de los ingredientes
activos, para la conversión de ingredientes activos líquidos
volátiles y/u olorosos en sustancias microcristalinas, estables,
deformables, para la mezcla de composiciones incompatibles y para la
prolongación de la duración del efecto debido a una descomposición
más lenta.
El almidón puede utilizarse también en los
campos de fármacos, medicina y en la industria de los cosméticos.
En la industria farmacéutica, el almidón puede utilizarse como
aglomerante para tabletas o para la dilución del aglomerante en
cápsulas. Adicionalmente, el almidón es adecuado como desintegrante
para tabletas dado que, durante la deglución, el mismo absorbe
fluido y después de un corto tiempo se hincha tanto que se libera
el ingrediente activo. Por razones cualitativas, los polvos
lubricantes medicinales y polvos medicinales para heridas están
basados en almidón. En el campo de los cosméticos, se utiliza
almidón, por ejemplo, como vehículo de aditivos en polvo, tales
como perfumes y ácido salicílico. Un campo relativamente vasto de
aplicación para el almidón es la pasta dentífrica.
El almidón puede utilizarse también como aditivo
en carbón y briquetas. Por adición de almidón, el carbón puede
aglomerarse y/o briquetearse cuantitativamente con alta calidad,
previniendo así la desintegración prematura de las briquetas. El
carbón de barbacoa contiene entre 4 y 6% de almidón añadido, carbón
calorizado [sic] entre 0,1 y 0,5%. Adicionalmente, el almidón se
hace cada vez más importante como agente aglomerante dado que la
adición del mismo al carbón y las briquetas puede reducir
considerablemente la emisión de sustancias tóxicas.
Adicionalmente, el almidón puede utilizarse como
agente de floculación en el procesamiento de lodos minerales y de
carbón.
Otro campo de aplicación es el uso de almidón
como aditivo al procesamiento de materiales en la colada. Para
diversos procesos de colada, son necesarios núcleos producidos a
partir de arenas mezcladas con agentes aglomerantes. En la
actualidad, el agente aglomerante utilizado más frecuentemente es
bentonita mezclada con almidones modificados, en la mayoría de los
casos almidones hinchables.
El propósito de la adición de almidón es el
aumento de la resistencia al flujo así como una fuerza de unión
incrementada. Además, los almidones hinchables pueden satisfacer
otros requisitos previos para el proceso de producción, tales como
dispersabilidad en agua fría, rehidratabilidad, susceptibilidad de
mezcla satisfactoria en arena y alta capacidad de fijación de
agua.
En la industria del caucho puede utilizarse
almidón para mejorar la calidad técnica y óptica. Razones para esto
son el brillo superficial incrementado, el agarre y el aspecto. Para
este propósito, el almidón se dispersa sobre las superficies
adherentes engomadas de las sustancias de caucho antes de la
vulcanización en frío. El mismo puede utilizarse también para
aumentar la susceptibilidad de estampación del caucho.
Otro campo de aplicación para el almidón
modificado es la producción de sucedáneos del cuero.
En el mercado de los plásticos, están surgiendo
los campos de aplicación siguientes: La integración de productos
derivados de almidón en el proceso de fabricación (el almidón es
solamente una carga, no existe enlace directo alguno entre el
polímero sintético y el almidón) o, alternativamente, la integración
de productos derivados de almidón en la producción de polímeros (el
almidón y el polímero forman una unión estable).
El uso del almidón como carga pura no puede
competir con otras sustancias tales como el talco. Esta situación
cambia cuando las propiedades específicas del almidón se hacen
efectivas y el perfil de propiedades de los productos finales se
modifica con ello claramente. Un ejemplo es el uso de productos de
almidón en el procesamiento de materiales termoplásticos, tales
como el polietileno. En este caso, el almidón y el polímero
sintético se combinan en una relación de 1:1 por medio de
coexpresión para formar una 'mezcla madre', a partir de la cual se
fabrican diversos productos por medio de técnicas comunes utilizando
polietileno granulado. La integración de almidón en películas de
polietileno puede causar una permeabilidad incrementada de la
sustancia en cuerpos huecos, permeabilidad mejorada al vapor de
agua, comportamiento antiestático mejorado, comportamiento
antibloqueo mejorado así como una mejora de la susceptibilidad de
estampación con tintes acuosos.
Otra posibilidad es el uso del almidón en
espumas de poliuretano. Debido a la adaptación de derivados de
almidón y debido también a la optimización de las técnicas de
procesamiento, es posible controlar de modo específico la reacción
entre los polímeros sintéticos y los grupos hidroxi del almidón. Los
resultados son películas de poliuretano que consiguen los perfiles
de propiedades siguientes debido al uso de almidón: un coeficiente
de expansión térmica reducido, disminución del comportamiento de
contracción, comportamiento mejorado presión/tensión, permeabilidad
incrementada al vapor de agua sin cambio en la aceptación de agua,
inflamabilidad y densidad de agrietamiento reducidas, ausencia de
goteo de partes inflamables, ausencia de halógenos y envejecimiento
reducido. Desventajas que existen todavía actualmente son
resistencia reducida a la presión y el impacto.
El desarrollo de productos de película no es ya
la única opción. Pueden producirse también productos plásticos
sólidos, tales como cazuelas, platos y tazones con contenido de
almidón mayor que 50%. Adicionalmente, las mezclas almidón/polímero
ofrecen la ventaja de que son biodegradables en mayor
proporción.
Adicionalmente, debido a su extrema capacidad
para fijar agua, los polímeros de injerto de almidón han alcanzado
una gran importancia. Éstos son productos que tienen una cadena
principal de almidón y una red lateral de un monómero sintético
insertada en ella de acuerdo con el principio del mecanismo de
cadenas radicales. Los polímeros de injerto de almidón disponibles
actualmente se caracterizan por una capacidad incrementada de
fijación y retención de hasta 1000 g de agua por g de almidón con
una viscosidad alta. En los últimos años estos
super-absorbedores han sido utilizados más
ampliamente - principalmente en el campo de la higiene. V.g. en
productos tales como pañales y hojas, así como en el sector
agrícola, v.g. en pelets de semillas.
Factores decisivos para el uso del nuevo almidón
modificado por las técnicas de DNA recombinante son, por una parte,
estructura, contenido de agua, contenido de proteínas, contenido de
lípidos, contenido de fibras, contenido de cenizas/fosfato,
relación amilosa/amilopectina, distribución de la masa molecular
relativa, grado de ramificación, tamaño y forma de los gránulos así
como cristalización, y por otra parte, propiedades que dan como
resultado las características siguientes: comportamiento de flujo y
sorción, temperatura de empastado, viscosidad, estabilidad de la
viscosidad en solución salina, eficiencia de espesamiento,
solubilidad, estructura y transparencia de la pasta, resistencia al
calor, al cizallamiento y a los ácidos, tendencia a la
retrogradación, capacidad de formación de gel, resistencia a la
congelación/descongelación, capacidad de formación de complejos,
fijación de yodo, formación de película, resistencia de adhesión,
estabilidad enzimática, digestibilidad y reactividad.
La producción de almidón modificado por
operación genética con una planta transgénica puede modificar las
propiedades del almidón obtenido de la planta de tal manera que haga
superfluas modificaciones adicionales por medio de métodos químicos
o físicos. Por otra parte, los almidones modificados por medio de
técnicas de DNA recombinante podrían someterse a modificación
química ulterior, lo que dará como resultado mejoras ulteriores de
la calidad para algunos de los campos de aplicación arriba
descritos. Estas modificaciones químicas son conocidas
principalmente por las personas expertas en la técnica. Estas son
particularmente modificaciones por medio de
- -
- tratamiento térmico
- -
- tratamiento ácido
- -
- oxidación y
- -
- esterificación
que conducen a la formación de almidones de
fosfato, nitrato, sulfato, xantato, acetato y citrato. Otros ácidos
orgánicos pueden utilizarse también para la esterificación:
- -
- formación de éteres de almidón
- alquil-éter de almidón, O-alil-éter, hidroxialquil-éter, O-carboxilmetil-éter, éteres de almidón que contienen N, éteres de almidón que contienen P y éteres de almidón que contienen S.
- -
- formación de almidones ramificados
- -
- formación de polímeros de injerto de almidón.
En una realización adicional de la invención, la
molécula de ácido nucleico extraño tiene una o más secuencias señal
de direccionamiento de proteínas que median una localización
específica en la pared celular de la proteína amilosacarasa y la
enzima ramificadora.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican la
enzima amilosacarasa y la enzima ramificadora que están contenidas
ambas en la "molécula de ácido nucleico extraño" pueden
encontrarse o bien bajo control de una o de varias secuencias señal
de direccionamiento de proteínas con independencia unas de otras, o
bien pueden estar bajo control de una o de varias secuencias señal
de direccionamiento de proteínas juntas después de fusión como
unidad de traducción.
En otra realización de la invención, las
moléculas de ácido nucleico extraños tienen una o más secuencias
señal de direccionamiento de proteínas, cada una de las cuales media
una localización específica en la pared celular de la proteína
amilosacarasa y la proteína enzima ramificadora.
En esta realización, se introducen varias
moléculas de ácido nucleico extraño en el genoma de la célula
vegetal en donde una molécula de ácido nucleico extraño codifica
una proteína amilosacarasa y otra molécula de ácido nucleico
extraño codifica una enzima ramificadora. Como se ha mencionado
anteriormente, las moléculas de ácido nucleico extraño pueden
introducirse en el genoma de la célula vegetal simultánea o
consecutivamente. En el primer caso, se habla de
"cotransformación", y en el último de
"supertransformación".
Cada una de las moléculas de ácido nucleico
extraño introducidas contiene una o más secuencias señal de
direccionamiento de proteínas que median cada una una localización
específica en la pared celular de la proteína amilosacarasa y la
proteína enzima ramificadora, en donde las secuencias señal de
direccionamiento de proteínas son idénticas o diferentes una de
otra.
Como secuencia señal puede utilizarse la del
inhibidor II de proteinasas de la patata (von Schaewen et
al., EMBO J. 9, (1990), 3033-3044; Keil et
al., Nucleic Acids Research 14, (1986),
5641-5650).
En una realización adicional de la invención, la
o las moléculas de ácido nucleico extraño media(n) una
localización citosólica de la proteína amilosacarasa y la enzima
ramificadora.
Además, la presente invención se refiere a
plantas transgénicas que contienen dichas células vegetales con
actividad incrementada de una amilosacarasa y de una enzima
ramificadora.
Las plantas de la invención pueden pertenece a
cualquier especie de plantas, es decir pueden ser plantas
monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas. Preferiblemente, se
trata de plantas de utilidad agrícola, es decir plantas que son
cultivadas por el hombre para uso como alimento o para uso
industrial, particularmente industrial. La invención se refiere
preferiblemente a plantas formadoras de fibra (v.g. lino, cáñamo,
algodón), plantas oleaginosas (v.g. colza, girasol, soja), plantas
que almacenan almidón (v.g. trigo, cebada, avena, centeno, patata,
maíz, arroz, guisante, mandioca), plantas que almacenan azúcar
(v.g. remolacha azucarera, caña de azúcar, mijo dulce) y plantas que
almacenan proteínas (v.g. plantas leguminosas).
En una realización preferida adicional, la
invención se refiere a plantas alimenticias (v.g. cosechas
forrajeras y plantas de pasto (alfalfa, trébol, etc.)), hortalizas
(v.g. tomates, ensalada, escarola). Son particularmente preferidas
remolacha azucarera, caña de azúcar, maíz, trigo y arroz.
La presente descripción se refiere también a un
método para la producción de plantas transgénicas que proporcionan
un rendimiento incrementado en comparación con las plantas de tipo
salvaje en donde
- a)
- se modifica genéticamente una célula vegetal por la introducción de una (o varias) moléculas de ácido nucleico extraño cuya presencia o expresión conduce a una actividad incrementada de una proteína con actividad de amilosacarasa y un aumento en la actividad de una proteína con actividad de enzima ramificadora;
- b)
- se regenera una planta a partir de la célula producida de acuerdo con a); y
- c)
- se producen opcionalmente plantas adicionales a partir de la planta producida de acuerdo con el paso b).
Además, la presente descripción se refiere a un
método para la producción de una planta transgénica que sintetiza
\alpha-1,4-glucanos ramificados en
\alpha-1,6 con un grado de ramificación modificado
en la posición O-6 en comparación con las plantas
correspondientes de tipo salvaje no modificadas genéticamente, en
donde
- a)
- se modifica genéticamente una célula vegetal por la introducción de una (o varias) moléculas de ácido nucleico extraño cuya presencia o expresión conduce a una actividad incrementada de una proteína con actividad de amilosacarasa y una actividad incrementada de una proteína con actividad de enzima ramificadora;
- b)
- se regenera una planta a partir de la célula producida de acuerdo con a); y
- c)
- se producen opcionalmente plantas adicionales a partir de la planta producida de acuerdo con el paso b).
Otro objeto de la presente exposición es un
método para la producción de una planta transgénica que sintetiza
un almidón modificado en comparación con plantas correspondientes de
tipo salvaje no modificadas genéticamente, en donde
- a)
- se modifica genéticamente una célula vegetal por la introducción de una (o varias) moléculas de ácido nucleico extraño cuya presencia o expresión conduce a una actividad incrementada de una proteína con actividad de amilosacarasa y una actividad incrementada de una proteína con actividad de enzima ramificadora;
- b)
- se regenera una planta a partir de la célula producida de acuerdo con a); y
- c)
- se producen opcionalmente plantas adicionales a partir de la planta producida de acuerdo con el paso b).
Lo mismo que se ha descrito arriba en otro
contexto concerniente a las plantas de la invención es aplicable a
la modificación genética introducida de acuerdo con el paso a).
La regeneración de plantas de acuerdo con el
paso b) puede realizarse de acuerdo con métodos conocidos por las
personas expertas en la técnica.
La regeneración de plantas adicionales de
acuerdo con el paso c) del método descrito puede lograrse v.g. por
propagación vegetativa (por ejemplo mediante esquejes, tubérculos o
por cultivo de callo y regeneración de plantas enteras) o por
reproducción sexual. La reproducción sexual se lleva a cabo
preferiblemente bajo control, es decir, de tal modo que plantas
seleccionadas con ciertas propiedades se cruzan unas con otras y se
propagan.
Las plantas transgénicas de la presente
invención pueden obtenerse también por los métodos arriba
descritos.
Las personas expertas en la técnica saben que
pueden obtenerse las plantas de la invención no sólo por los
métodos mencionados anteriormente, sino también por cruzamiento, por
ejemplo, de una planta modificada genéticamente que tiene una
actividad incrementada de una proteína con actividad de
amilosacarasa debido a la introducción de una molécula de ácido
nucleico extraño con una planta transgénica que tiene una actividad
incrementada de una proteína con actividad de enzima ramificadora
debido a la introducción de una molécula de ácido nucleico extraño.
Adicionalmente, es conocido por las personas expertas en la técnica
que la supertransformación arriba descrita no tiene que llevarse a
cabo forzosamente con transformantes primarios sino preferiblemente
con plantas transgénicas estables que se han seleccionado con
anterioridad y que, favorablemente, han sido ensayadas en
experimentos correspondientes en lo que respecta, por ejemplo, a
fertilidad, expresión estable del gen extraño, hemi- y
homozigosidad, etc.. Por esta razón, también las células vegetales y
las plantas transgénicas son objeto de la presente invención que
pueden alcanzarse por métodos arriba mencionados y que exhiben el
fenotipo descrito en las realizaciones anteriores.
La presente invención se refiere también a la
propagación de material de cosecha de las plantas de la invención
así como de plantas transgénicas producidas de acuerdo con los
métodos arriba descritos, comprendiendo dicho material de
propagación o de cosecha células vegetales transgénicas de la
invención. La expresión "material de propagación" comprende
aquéllos componentes de la planta que son adecuados para la
producción de descendientes de una manera vegetativa o generativa.
Para la propagación vegetativa son adecuados, por ejemplo, esquejes,
cultivos de callo, rizomas o tubérculos. Otro material de
propagación comprende, por ejemplo, frutos, semillas, plantas
jóvenes, protoplastos, cultivos de células etc. Preferiblemente, el
material de propagación son tubérculos y semillas.
Adicionalmente, la presente invención se refiere
al uso de una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una
proteína con la actividad enzimática de una amilosacarasa y una
proteína con actividad enzimática de una enzima ramificadora para
la producción de plantas transgénicas que proporcionan un
rendimiento incrementado en comparación con plantas de tipo salvaje
y/o sintetizan almidón que está modificado en comparación con el
almidón de las plantas de tipo salvaje y/o sintetizan
\alpha-1,4-glucanos ramificados
con \alpha-1,6 con un grado de ramificación
modificado en posición O-6 en comparación con las
plantas correspondientes de tipo salvaje no modificadas
genéticamente.
Figura 1: pBinAR con "sitio de clonación
múltiple" (MCS) modificado
Figura 2: mapa del plásmido
pAmsu-wxy-Hyg
Figura 3: mapa del plásmido
pAmsu-pat-Hyg
Figura 4: mapa del plásmido
pBE-fnr-Km
Figura 5: mapa del plásmido
pBE-pat-Km
Figura 6: mapa del plásmido
pAmsu-cyt-Km
Figura 7: gel de actividad de amilosacarasa
Figura 8: gel de actividad de la enzima
ramificadora
Figura 11: Gel de actividad de un extracto de
proteínas de plantas transgénicas de tabaco (variedad Samsung NN)
descrita en el Ejemplo 7. En este experimento se utilizó el péptido
señal FNR (Ejemplo 6).
25-32, 33-37, 39
y 40: extractos de proteínas (75 \mug de proteína total) de
diferentes líneas de tabaco transgénicas independientes.
K = control; amilosacarasa recombinante
purificada producida en E. coli como se describe en la
solicitud de patente WO 99/67412; 50 ng de proteína
Wt: extracto de proteínas (75 \mug de proteína
total) de una planta de tabaco de tipo salvaje (Samsung NN).
Figura 12: Gel de actividad de un extracto de
proteínas de plantas transgénicas de tabaco (variedad Samsung NN)
descritas en el Ejemplo 7. En este experimento se utilizó el péptido
señal R1 (Ejemplo 6).
9-16 y 41-48:
extractos de proteínas (75 \mug de proteína total) de diferentes
líneas de tabaco transgénicas independientes.
K = control; amilosacarasa recombinante
purificada producida en E. coli como se describe en la
solicitud de patente WO 99/67412; 50 ng de proteína
Wt: extracto de proteínas (75 \mug de proteína
total) de una planta de tabaco de tipo salvaje (Samsung NN).
Figura 13: Gel de actividad de un extracto de
proteína de plantas de patata transgénicas (variedad Desirée)
descrita en el Ejemplo 8.
8 a 12, 14, 16, 32 y 35-40:
extractos de proteínas (75 \mug de proteína total) de líneas
diferentes de patata transgénica independientes.
K = control; amilosacarasa recombinante
purificada producida en E. coli como se describe en la
solicitud de patente WO 99/67412; 50 ng de proteína
Wt: extracto de proteínas (75 \mug de proteína
total) de una planta de patata de tipo salvaje (Desirée).
BE: extracto de proteínas de una planta de
patata transgénica que expresa la enzima ramificadora de
Neisseria denitrificans en los plástidos (Ejemplo 5).
Figura 14: Perfiles del analizador de textura de
plantas transgénicas (véase el Ejemplo 9), plantas de control
(plantas transgénicas que expresan la enzima ramificadora de
Neisseria denitrificans como se describe en el Ejemplo 5) y
plantas de tipo salvaje.
Todos los geles de proteínas procedentes de
plantas que han sido analizadas por el test de actividad de
amilosacarasa descrito en el Ejemplo 4 exhiben una banda pardusca
inmediatamente por encima de la banda que es específica para la
amilosacarasa. Esta banda pardusca es particularmente visible cuando
se utiliza material de plantas verdes para la producción de
extractos de proteínas (véase por ejemplo Fig. 12, líneas 9, 42 y
43). Esta banda pardusca existe también en plantas de tipo salvaje.
La misma es visible ya como banda verde después de la
electroforesis. Durante la incubación del gel en un tampón que
contiene sacarosa (Ejemplo 4) el color verde cambia a pardusco
antes de la tinción con solución de Lugol. A partir de estas
observaciones puede llegarse a la conclusión de que esta banda no
surge debido a la actividad de amilosacarasa.
En los geles de plantas que tienen una expresión
elevada de amilosacarasa, la banda pardusca inespecífica se
superpone a la banda que surge debido a la actividad de
amilosacarasa.
\vskip1.000000\baselineskip
El grado de ramificación de los glucanos
obtenidos puede determinarse por medio de un análisis de
metilación.
- -
- Metilación de todos los grupos OH libres de las muestras de glucano, determinaciones dobles en cada caso
- -
- hidrólisis de los polímeros permetilados, seguida por reducción en C-1 y acetilación de la mezcla de monómeros
- -
- análisis por cromatografía de gases y cuantificación de los productos de reacción
El examen del grado de ramificación de las
muestras de glucano se llevó a cabo por análisis de metilación. Los
grupos OH libres de los polímeros se marcan por conversión en éter
metílico.
La degradación en monómeros se lleva a cabo por
hidrólisis ácida y conduce a moléculas de glucosa parcialmente
metiladas que están presentes en forma de piranosido/furanosido así
como \alpha- y \beta-glucosidos. Estas
variantes se enfocan en el derivado de sorbita parcialmente metilado
correspondiente por reducción con NaBH_{4} o NaBD_{4}. La
acetilación final de los grupos OH libres permite que los productos
de la reacción se analicen por cromatografía de gases.
\vskip1.000000\baselineskip
Se producen soluciones al 1% (p/v) en DMSO.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfieren 2 ml de la solución en DMSO (es
decir 20 mg de polímero) a un frasco de nitrógeno de 50 ml, se
añaden en atmósfera de N_{2} 5 equivalentes/OH (eq/OH) de solución
reciente de dimsil y se agita durante 30 minutos. El contenido del
frasco se agita en un baño de hielo, se añaden 10 eq/OH de yoduro de
metilo y después de descongelación se agita durante al menos 2
horas. Se retira el exceso de yoduro de metilo a vacío antes del
segundo paso de desprotonización y metilación.
Después de ello, se retiró el exceso de yoduro
de metilo por adición de 50 ml de agua y por extracción con 10 ml
de diclorometano cada vez (5 veces). Para eliminar las trazas de
DMSO de la fase orgánica se extrajo la misma 3 veces con agua.
Antes de utilizar una muestra por primera vez, se prueba cuántos
pasos de metilación son necesarios para la permetilación de los
grupos hidroxilo. Después que se ha procesado la primera mitad de
metilación de la preparación, se metila de nuevo la otra mitad.
Después de la degradación de ambas muestras, se comparan los
resultados de los análisis GC. Sigue siempre una segunda metilación
a fin de comprobar la posible ramificación en C-3
que puede simularse por una sub-metilación en esta
posición.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pesan 2 mg de la muestra metilada en un
frasco de presión de 1 ml, se añaden 0,9 ml de ácido
trifluoroacético 2 M y se agita durante 2,5 horas a 120ºC. Después
que se ha enfriado el frasco, sigue una concentración en la
atmósfera de N_{2}. Para la eliminación de trazas de ácido se
añade tolueno 3 veces y se elimina por soplado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden 0,5 ml de una solución alcalina de
NaBD_{4} en amoníaco 0,5 M al residuo del paso de reacción
anterior y se agita durante una hora a 60ºC. Se desintegra
cuidadosamente el reactivo con unas cuantas gotas de ácido acético
glacial, se elimina el borato producido como trimetil-éter de ácido
bórico por 5 adiciones de ácido acético que contiene metanol al 15%
y se elimina posteriormente por soplado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden 50 \mul de piridina y 250 \mul de
anhídrido acético al residuo del paso de reacción anterior y se
agita durante 2 horas a 95ºC. Después de enfriar, la mezcla de
reacción se vierte por goteo en 10 ml de solución saturada de
NaHCO_{3} y se extrae 5 veces con diclorometano. Los productos de
reacción en la fase orgánica se analizan por cromatografía de
gases.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis por cromatografía de gases se
realizan con un equipo de la firma Carlo Erba GC 6000 Vega Series 2
con entrada en la columna y detector FID. Las separaciones se llevan
a cabo con una columna capilar de sílice fundida Supelco SPB5
(diámetro interior 0,2 mm, longitud 30 m) con hidrógeno como gas
portador y con una presión de 80 kPa. Se utiliza el programa de
temperatura siguiente:
60ºC (1
min)-25ºC/min \rightarrow
130ºC-4ºC/min \rightarrow
280ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La valoración de los cromatogramas de gases se
lleva a cabo por identificación de los picos, integración de las
áreas de los picos y corrección de los datos por medio del concepto
ECR de Sweet et al. (Sweet et al., Carbohydr. Res. 40
(1975), 217).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la producción de una amilosacarasa se
utilizaron células de E. coli que se transformaron con una
amilosacarasa de Neisseria polysaccharea. El DNA procede de
una genoteca genómica de N. polysaccharea y tiene la
secuencia de nucleótidos dada en la Solicitud de Patente
Internacional PCT/EP 98/05573 (WO 00/14249).
Un cultivo producido durante una noche de estas
células de E. coli que expresan el gen que codifica la
amilosacarasa de Neisseria polysaccharea se centrifugó y se
resuspendió en un volumen de aproximadamente 1/20 de tampón de
citrato de sodio 50 mM (pH 6,5), DTT (ditiotreitol) 10 mM, PMSF
(fluoruro de fenilmetilsulfonilo) 1 mM. A continuación se
desintegraron dos veces las células con una prensa francesa a 16.000
psi (1125 kg/cm^{2}). Después de ello, se añadió MgCl_{2} 1 mM
al extracto de células así como benzonasa (Merck; 100.000 unidades;
250 unidades \mul^{-1}) en una concentración final de 12,5
unidades ml^{-1}). Se incubó luego la preparación a 37ºC durante
al menos 30 minutos mientras se agitaba ligeramente. El extracto se
dejó en reposo sobre hielo durante al menos 1,5 horas. Se
centrifugó luego a 4ºC a aproximadamente 40.000 g durante 30 minutos
hasta que el sobrenadante era relativamente transparente.
Se llevó a cabo una prefiltración con una
membrana de PVDF (Millipore "Durapore", o similar) que tenía un
diámetro de poro de 0,45 \mum. El extracto se dejó en reposo
durante una noche a 4ºC. Antes de llevar a cabo la cromografía
HI-(interacción hidrófoba), se añadió NaCl sólido al extracto y se
ajustó a una concentración de NaCl 2 M. Después de ello, se
centrifugó nuevamente a 4ºC y aproximadamente 40.000 g durante 30
min. Después de ello se liberó el extracto de los últimos residuos
de E. coli por filtración, utilizando una membrana de PVDF
(Millipore "Durapore", o similar) que tenía un diámetro de poro
de 0,22 \mum. El extracto filtrado se separó haciendo pasar el
mismo a través de una columna de
butil-Sepharose-4B (Pharmacia)
(volumen de la columna: 93 ml, longitud: 17,5 cm). Se introdujeron
luego en la columna aproximadamente 50 ml de extracto con una
actividad de amilosacarasa de 1 a 5 unidades \mul^{-1}. Las
proteínas que no se fijaban se eliminaron luego por lavado de la
columna con 150 ml de tampón B (tampón B: citrato de sodio 50 mM, pH
6,5, NaCl 2 M). La amilosacarasa se eluyó finalmente por medio de
un gradiente lineal y decreciente de NaCl (NaCl desde 2 M hasta 0 M
en citrato de sodio 50 mM en un volumen de 433 ml a un caudal de 1,5
ml min^{-1}) que se generó por medio de un sistema de bombeo
automático (FPLC, Pharmacia). La elución de la amilosacarasa tiene
lugar con NaCl entre 0,7 M y 0,1 M. Se recogieron las fracciones,
se desalaron en una columna Sephadex PD10 (Pharmacia), se
estabilizaron con glicerol al 8,7%, se ensayaron respecto a
actividad de amilosacarasa y finalmente se congelaron en tampón de
almacenamiento (glicerol al 8,7%, citrato 50 mM).
Se pone proteína purificada o extracto bruto de
proteínas en diversas diluciones en preparaciones de 1 ml que
contienen sacarosa al 5%, glucógeno al 0,1% y citrato 100 mM de pH
6,5, y se incuban a 37ºC. Después de 5 min, 10 min, 15 min, 20 min,
25 min y 30 min, se toman 10 \mul cada vez de esta preparación y
se detiene la actividad enzimática de la amilosacarasa por
calentamiento inmediato a 95ºC. En el ensayo fotométrico acoplado,
se determina la proporción de la fructosa liberada por la
amilosacarasa. Para ello, se ponen de 1 \mul a 10 \mul de la
muestra desactivada en 1 ml de tampón de imidazol 50 mM, de pH 6,9,
MgCl_{2} 2 mM, ATP 1 mM, NAD 0,4 mM y 0,5 U/ml de hexoquinasa.
Después de la adición secuencial de
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
(de Leuconostoc mesenteroides) y
fosfoglucosa-isomerasa, se mide el cambio de
absorción a 340 nm. Después de ello se calcula la cantidad de
fructosa liberada de acuerdo con la ley de Lambert. Cuando el valor
obtenido se refiere al tiempo de toma de la muestra, puede
determinarse el número de unidades (1 U = \mumol fructosa/min)
(por \mul de extracto de proteína o \mug de proteína
purificada), respectivamente.
En el plásmido pBinAR (Höfgen y Willmitzer,
Plant Science 66, (1990), 221-230) se intercambió el
polienlazador entre el promotor 35S y el terminador OCS (Fig. 1)
utilizando oligonucleótidos de ácido nucleico por métodos estándar
de biología molecular (véase por ejemplo Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU. (1989)). De este modo se obtuvo
el plásmido pBinAR-N.
El fragmento EcoRI/HinDIII de
pBinAR-N que contenía el promotor 35S, el
polienlazador siguiente y el terminador OCS se clonó en los mismos
sitios de restricción del plásmido pBIB-Hyg (Becker,
Nucleic Acids Research 18, (1990), 203) utilizando métodos estándar
de biología molecular (véase por ejemplo Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU. (1989)). El plásmido resultante
se designa pBinAR-Hyg-N.
Para la clonación de las secuencias codificantes
del péptido señal de la proteína cérea de Zea mays (véase por
ejemplo Klösgen et al., Mol. Gen. Genet. 217, (1989),
155-161) se amplificaron las secuencias
correspondientes por medio de PCR utilizando los oligonucleótidos
(véanse SEQ ID Nos. 3 y 4), a partir de DNA genómico de Zea mays
(Stratagene) como molde. Los fragmentos de DNA así obtenidos se
incubaron con las endonucleasas de restricción XbaI y SalI y se
clonaron en el vector pBinAR-HyG-N
escindido con SpeI y SalI. El plásmido resultante se designó
pBinAR-wxy-Hyg.
Condiciones de la PCR:
Tampón y polimerasa de Gibco BRL
(DNA-polimerasa Platinum Taq High Fidelity No.
11304-011)
Condiciones para la reacción:
Los pasos 2 a 4 se repitieron en ciclos 35
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias codificantes del péptido señal
del gen patatina de la patata (Rosahl et al., Mol. Gen.
Genet. 203, (1986), 214-220; Sonnewald et
al., Plant J. 1, (1998), 95-106) se amplificaron
a partir del plásmido pgT5 utilizando los oligonucleótidos
Sp-pat-5' y
Sp-pat-3' (véanse SEQ ID No. 5 y SEQ
ID No. 6). Los fragmentos obtenidos se digirieron con las
endonucleasas de restricción XbaI y SalI y se clonaron en los
plásmidos pBinAR-N y pBinAR-Hyg,
respectivamente, escindidos con SpeI y SalI. Los plásmidos
resultantes se designaron pBinAR-pat y
pBinAR-pat-Hyg, respectivamente. La
secuencia de ácido nucleico contenida en estos plásmidos que
codificaban el péptido señal utilizado de la proteína patatina se
ilustra en SEQ ID No. 7, dado que se desvía de la secuencia señal
publicada (cambio de aminoácido en el tercer aminoácido).
Condiciones para la PCR:
Tampón y polimerasa de Boehringer Mannheim
(polimerasa Pwo No.: 1644947)
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones para la reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
Los pasos 2 a 4 se repitieron en ciclos 35
veces.
\newpage
Las secuencias de espinaca que codificaban el
péptido señal FNR se amplificaron utilizando los iniciadores
Sp-fnr-5' y
Sp-fnr-3' (véase SEQ ID No. 8 y SEQ
ID No. 9) y el plásmido p6SocFNR-15 como molde
(Jansen et al., Current Genetics 13, (1988),
517-522). Después de digestión de los fragmentos
obtenidos con las endonucleasas de restricción XbaI y SalI se
clonaron los mismos en el plásmido pBinAR-N
escindido con SpeI y SalI. El plásmido resultante se designó
pBinAR-fnr-N.
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones para la PCR:
Tampón y polimerasa de Gibco BRL (Platinum Tac
DNA-Polimerasa High Fidelity No.:
11304-011)
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones para la reacción:
Los pasos 2 a 4 se repitieron en ciclos 35
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Con objeto de clonar la secuencia codificante
del péptido señal de la proteína R1 de Solanum tuberosum (Lorberth
et al., Nature Biotechnology 16 (1998),
473-477), se amplificaron las secuencias
correspondientes por PCR utilizando el clon de cDNA RL2 como molde
(Lorberth, tesis doctoral "Charakterisierung von RL1: ein neues
Enzym des Stärkemetabolismus", Universidad libre de Berlín
(1996)) y los oligonucleótidos SEQ ID No. 14 y 15 como iniciador.
Los fragmentos de DNA resultantes se clonaron en el vector
pBinAR-Hyg-N escindido con SpeI y
SalI. El plásmido resultante se designó
pBinAR-R1-Hyg.
\newpage
Condiciones para la reacción PCR:
Tampón y polimerasa de
Boehringer-Mannheim (Pwo DNA Polymerase,
Boehringer-Mannheim No.: 1644955)
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones para la reacción:
Los pasos 2 a 4 se repitieron en ciclos 30
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias codificantes para el péptido
señal fnr de la espinaca se amplificaron utilizando el
plásmido
P6SocFNR-15 (Jansen et al., Current Genetics 13 (1988), 517-522) como molde y los iniciadores Sp-fnr-5' y Sp-fnr-3' (SEQ ID No. 8 y SEQ ID No. 9). Los fragmentos de DNA resultantes se digirieron con las endonucleasas de restricción XbaI y SalI, y se clonaron en el vector pBinAR-Hyg-N escindido con SpeI y SalI. El plásmido resultante designó pBinAR-fnr-Hyg.
P6SocFNR-15 (Jansen et al., Current Genetics 13 (1988), 517-522) como molde y los iniciadores Sp-fnr-5' y Sp-fnr-3' (SEQ ID No. 8 y SEQ ID No. 9). Los fragmentos de DNA resultantes se digirieron con las endonucleasas de restricción XbaI y SalI, y se clonaron en el vector pBinAR-Hyg-N escindido con SpeI y SalI. El plásmido resultante designó pBinAR-fnr-Hyg.
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones para la reacción PCR:
Tampón y polimerasa de Gibco BRL (Tac Platinum
Hifi Polymerase No.: 11304-011)
\newpage
Condiciones para la reacción:
Los pasos 2 a 4 se repitieron en ciclos 35
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando los oligonucleótidos
AS-5' y AS-3' (véanse SEQ ID No. 10
y SEQ ID No. 11) las secuencias que codificaban amilosacarasa se
amplificaron por medio de PCR utilizando el plásmido pNB2 como molde
(véase la Solicitud de Patente Internacional WO 95/31553,
depositada en la "Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen" (DSMZ) en Braunschweig, Alemania, bajo el número
de acceso DSM 9196). Los productos amplificados obtenidos de lo
anterior se digirieron con las endonucleasas de restricción XhoI y
PstI y se clonaron en los plásmidos
pBinAR-wxy-Hyg y
pBinAR-pat-Hyg, respectivamente,
escindidos con SalI y SdaI. Los plasmados resultantes se designaron
pAmsu-wxy-Hyg (Fig. 2) y
pAmsu-pat-Hyg (Fig. 3),
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones para PCR:
Tampón y polimerasa de
Boehringer-Mannheim (Polimerasa Pwo No.:
1644947)
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones para la reacción:
Los pasos 2 a 4 se repitieron en ciclos 40
veces.
Los plásmidos
pAmsu-wxy-Hyg y
pAmsu-pat-Hyg, respectivamente,
pueden utilizarse para la transformación de plantas de acuerdo con
métodos estándar (véase arriba).
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando los oligonucleótidos
BE-5' y BE-3' (véanse SEQ ID No. 12
y SEQ ID No. 13) se amplificó la secuencia codificante de la enzima
ramificadora de Neisseria denitrificans por medio de PCR
utilizando el plásmido pBB48 como molde (depositado en la Solicitud
de Patente Internacional WO 95/31553, depositada en la "Deutsche
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSMZ) en
Braunschweig, Alemania, bajo el número de acceso DSM 12425). Los
productos amplificados obtenidos de este modo se digirieron con las
endonucleasas de restricción SalI y SdaI, y se clonaron en los
plásmidos pBinAR-fnr y pBinAR-pat,
respectivamente, escindidos con SalI y SdaI. Los plasmados
resultantes se designaron pBE-fnr-Km
(Fig. 4) y pBE-pat-Km (Fig. 5),
respectivamente.
Condiciones para la PCR:
Tampón y polimerasa de
Boehringer-Mannheim (Polimerasa Pwo No.:
1644947)
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones para la reacción:
Los pasos 2 a 4 se repitieron en ciclos 40
veces.
Los plásmidos
pFE-fnr-Km y
pFE-pat-Km, respectivamente, pueden
utilizarse para la transformación de plantas de acuerdo con métodos
estándar (véase arriba).
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento codificante de amilosacarasa de
Neisseria polysaccharea se aisló con las endonucleasas de
restricción XmnI y EagI del plásmido pNB2 (véase arriba) y los
extremos del fragmento se rellenaron con
DNA-polimerasa Klenow. Después de ello, se efectuó
la clonación del fragmento en el plásmido pBinAR escindido con SmaI
(Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66, (1990),
221-230). El plásmido resultante se designó
pAmsu-cyt-Km (Fig. 6) y puede
utilizarse para la transformación de plantas.
Por análisis mediante transferencia Northern
pudieron identificarse plantas transgénicas de patata que tienen el
mRNA de una amilosacarasa de Neisseria polysaccharea. Después
de ello pudo demostrarse que la amilosacarasa contenida en dichas
plantas es activa.
Para la detección de la actividad de la
amilosacarasa en plantas transformadas establemente, se congeló en
nitrógeno líquido material foliar de las plantas a ensayar y se
trituró luego en un mortero que se había enfriado previamente con
nitrógeno líquido. Antes de descongelar el material triturado, se
añadió tampón de extracción (citrato de sodio 50 mM, pH 6,5, DTT 4
mM, cloruro de calcio 2 mM). Se añadieron aproximadamente 500 \mul
de tampón de extracción a aproximadamente 100 mg de material
vegetal (peso fresco). Los componentes sólidos de la suspensión del
material vegetal desintegrado y el tampón de extracción se separaron
por medio de centrifugación (10.000 x g). Una parte alícuota del
sobrenadante claro obtenido se mezcló con una cuarta parte del
tampón corriente de volumen de extracto (glicerina al 40%, Tris 250
mM de pH 8,8, azul de bromofenol al 0,02%) y se separó en gel de
poliacrilamida (véase abajo) a intensidad de corriente constante de
20 mA por gel. (Antes de aplicar los extractos proteínicos al gel,
se efectuó una electroforesis de los geles durante 20 minutos en
las condiciones arriba descritas.) Después que el agente colorante
azul de bromofenol hubo escurrido del gel se paró la
electroforesis. Se equilibró luego el gel 5 veces en tampón de
lavado (citrato de sodio 100 mM, pH 6,5) con 5 veces el volumen de
gel, cada vez durante 20 min, mientras se mantenía en rotación a la
temperatura ambiente. Se incubó luego el gel en tampón de incubación
(citrato de sodio 100 mM, pH 6,5, sacarosa al 5%) con 5 veces la
cantidad del volumen de gel a 37ºC durante 16 horas. Después de
decantar el tampón de incubación, el glucano producido por la
amilosacarasa era detectable como una banda
pardusca-azulada cuando se añadió solución Lugol
(diluida 1:5) (Fig. 7).
- a)
- Gel de separación
- Tris 375 mM, pH 8,8
- Poliacrilamida al 7,5% (Biorad No. EC-890)
- Para polimerización:
- 1/2000 volumen TEMED
- 1/100 volumen de persulfato de amonio
\vskip1.000000\baselineskip
- b)
- Gel de recogida
- Tris 125 mM, pH 6,8
- Poliacrilamida al 4% (Biorad No. EC-890)
- Para polimerización:
- 1/2000 volumen TEMED
- 1/100 volúmenes de persulfato de amonio
\vskip1.000000\baselineskip
- c)
- Tampón de electroforesis
- Tris 375 mM, pH 8,8
- Glicina 200 mM
\vskip1.000000\baselineskip
Por análisis de transferencia Northern, pudieron
identificarse plantas de patata transgénicas que tenían el mRNA de
una enzima ramificadora de Neisseria dinitrificans. Para la
detección de la actividad de la enzima ramificadora en plantas
transformadas de manera estable, se congeló material foliar de las
plantas en nitrógeno líquido y se trituró luego en un mortero que
se había enfriado previamente con nitrógeno líquido. Antes de la
descongelación del material triturado, se añadió tampón de
extracción (citrato de sodio 50 mM, pH 6,5, DTT 4 mM, cloruro de
calcio 2 mM). Se añadieron aproximadamente 200 \mul de tampón de
extracción a aproximadamente 100 mg de material de las plantas
(peso fresco). Los componentes sólidos de la suspensión del material
de plantas desintegrado y el tampón de extracción se separaron por
medio de centrifugación (10.000 x g). Una parte alícuota del
sobrenadante claro obtenido se mezcló con una cuarta parte del
tampón de pasada del volumen de extracto (glicerina al 40%, Tris
250 mM, pH 8,8, azul de bromofenol al 0,02%) y se separó en gel de
poliacrilamida (véase abajo) a intensidad de corriente constante de
20 mA por gel. (Antes de aplicar los extractos de proteínas al gel,
se llevó a cabo una electroforesis de los geles durante 20 minutos
en las condiciones arriba descritas.) Después que el agente
colorante azul de bromofenol presente en el tampón de pasada hubo
escurrido del gel, se paró la electroforesis. El gel se equilibró
luego 5 veces en tampón de lavado (citrato de sodio 100 mM, pH 6,5)
con 5 veces el volumen de gel, durante 20 min cada vez, mientras se
mantenía en rotación a la temperatura ambiente. Se incubó luego el
gel en tampón de incubación (citrato de sodio 100 mM de pH 6,5,
sacarosa al 5%, 0,625 unidades de amilosacarasa purificada de
Neisseria polysaccharea (para purificación de la enzima y
determinación de la actividad véase arriba)) con 5 veces la
cantidad del volumen de gel a 30ºC durante 16 horas. Después de
decantar el tampón de incubación, el glucano producido por la
amilosacarasa en combinación con la enzima ramificadora era
detectable como una banda pardusca-azulada cuando se
añadió solución Lugol (diluida en relación 1:5) (Fig. 8). Todos los
geles de poliacrilamida restantes se vuelven de color azul debido a
la actividad de amilosacarasa presente en el tampón de
incubación.
- a)
- Gel de separación
- Tris 375 mM, pH 8,8
- Poliacrilamida al 7,5% (Biorad No. EC-890)
- Para polimerización:
- 1/2000 volumen TEMED
- 1/100 volumen de persulfato de amonio
\vskip1.000000\baselineskip
- b)
- Gel de recogida
- Tris 125 mM, pH 6,8
- Poliacrilamida al 4% (Biorad No. EC-890)
- Para polimerización:
- 1/2000 volumen TEMED
- 1/100 volúmenes de persulfato de amonio
\vskip1.000000\baselineskip
- c)
- Tampón de electroforesis
- Tris 375 mM, pH 8,8
- Glicina 200 mM
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando el plásmido pNB2 (Deutsche Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) Braunschweig, Alemania,
número de depósito DSM 9196) como molde y los oligonucleótidos
AS-5' y AS-3' (SEQ ID Nos. 10 y 11)
como iniciadores de la PCR, se amplificó la región codificante de
amilosacarasa de Neisseria polysaccharea. El producto de la
PCR se digirió luego con las enzimas de restricción XHoI y PstI. El
fragmento resultante que contenía la región codificante se clonó en
los plásmidos pBinAR-R1-Hyg y
pBinAR-fnr-Hyg digeridos con SalI y
SdaI. Los plásmidos resultantes se designaron
pAmsu-R1-Hyg (Fig. 9) y
pAmsu-fnr-Hyg (Fig. 10),
respectivamente.
\newpage
Condiciones de la PCR:
Tampón y polimerasa de Boehringer Mannheim
(Polimerasa Pwo No.: 1644947)
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de reacción:
Los pasos 2 a 4 se repitieron 40 veces de una
manera cíclica.
Los plásmidos
pAmsu-R1-Hyg y
pAmsu-fnr-Hyg pueden utilizarse para
la transformación de plantas de acuerdo con métodos estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los constructos
pAmsu-R1-Hyg (Fig. 9) y
pAmsu-fnr-Hyg (Fig. 10) descritos en
el Ejemplo 6 se utilizaron para transformar plantas de tabaco de
acuerdo con Rosahl et al. (EMBO J. 6 (1987),
1155-1159). Por realización de un análisis de
transferencia Northern, se identificaron plantas transgénicas de
tabaco que poseían el mRNA de una amilosacarasa. Adicionalmente,
dichas plantas que expresan el gen de amilosacarasa en los plástidos
exhiben también la actividad enzimática de una amilosacarasa (Fig.
11 y 12). La actividad enzimática se ensayó como se describe en el
Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron tres líneas de plantas
transgénicas de patata, que se habían transformado previamente con
los plásmidos pBE-fnr-Km (Ejemplo 2)
y que exhiben la actividad enzimática de una enzima ramificadora
localizada en los plástidos (el ensayo de la actividad enzimática se
realizó como se describe en el Ejemplo 5, Fig. 8).
Después de ello, se transformaron de nuevo
explantes de hojas de estas plantas por medio de agrobacterias con
el plásmido pAmsu-R1-Hyg (Ejemplo
6). Utilizando los ensayos de actividad descritos en los Ejemplos 4
y 5, se identificaron plantas que exhiben en paralelo la actividad
de una proteína amilosacarasa y una enzima ramificadora (Fig. 13)
con ambas enzimas localizadas en los plástidos.
Se añadieron 2 g de almidón (peso seco) extraído
de plantas transgénicas como se describe en el Ejemplo 8 a un
volumen apropiado de agua destilada para preparar una suspensión que
contenía 8% de concentración final de almidón (p/v). Esta
suspensión se calentó luego en un Analizador Rapid Visco (Newport
Scientific Pty Ltd., Investment Support Group, Warriwood NSW 2102,
Australia) utilizando el perfil de temperatura siguiente:
En primer lugar, se calentó la suspensión desde
50ºC a 95ºC con una tasa de aumento de temperatura de 12ºC por
minuto. A continuación, se mantuvo la temperatura durante 2,5
minutos a 95ºC. Por último, se enfrió la suspensión a 50ºC con una
tasa de 12ºC por minuto. La muestra resultante se guardó en
condiciones herméticas al aire durante 24 h a 25ºC. Las muestras se
fijaron luego en un analizador de textura, modelo
TA-XT2, producido por Stable Micro Systems
(Haslemere, Inglaterra). Se utilizó un punzón redondo. La
estabilidad del gel se determinó por ajuste de los parámetros como
sigue:
- -
- Velocidad de ensayo 0,5 mm/s
- -
- Distancia 7 mm
- -
- Área de contacto 113 mm^{2}
- -
- Fuerza de excitación 2 g
\vskip1.000000\baselineskip
Los perfiles resultantes de las líneas
transgénicas 006 y 035 en comparación con las plantas de tipo
salvaje y con plantas de control (plantas transgénicas que expresan
la enzima ramificadora de Neisseria denitrificans como se
describe en el Ejemplo 5) se muestran en la Figura 14.
Los perfiles analizadores de textura (véase
Figura 14) de los almidones de plantas transgénicas exhiben
diferencias importantes respecto al perfil de los almidones de
plantas de tipo salvaje y plantas de control.
En el caso en que la "distancia" se ajusta
a 7,0 mm, el perfil de las plantas transgénicas puede describirse
como "semejante a una corona".
<110> PlantTec Biotechnologie, Forschung
& Entwicklung
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Células vegetales y plantas
modificas genéticamente con una actividad incrementada de una
proteína amilosacarasa y una enzima ramificadora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D 1703 US
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria denitrificans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (170)..(2458)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 762
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria denitrificans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctagaggaa ttaatcggca tggcggc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacgctg gcgcacacga cgagc
\hfill25
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<210> 5
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctagactgc aaaatggcaa ctacta
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 26
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacggtt tcatttggag tagtta
\hfill26
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<210> 7
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<211> 92
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<212> PRT
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<213> Solanum tuberosum
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskiptctagacgta ctccgccatg accac
\hfill25
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<210> 9
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacgatc tgggccctga tggg
\hfill24
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<210> 10
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipctcgagatg tgacccccac gcagca
\hfill26
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<210> 11
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipctgcagacgg catttgggaa gcg
\hfill23
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<210> 12
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacatga accgaaaccg ccatatc
\hfill27
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<210> 13
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<211> 29
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 13
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\hfill29
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 14
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\hfill35
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgccggtcg acagcatgag gagaactaga aaaagc
\hfill36
Claims (12)
1. Una célula de planta transgénica que está
modificada genéticamente, en la cual la modificación genética
consiste en la introducción de una molécula de ácido nucleico
extraño o de varias moléculas de ácido nucleico extraño, codificando
la o las moléculas de ácido nucleico una proteína que tiene la
actividad enzimática de una amilosacarasa y una proteína que tiene
la actividad enzimática de una enzima ramificadora, y cuya expresión
conduce a una actividad incrementada de una proteína amilosacarasa y
a una actividad incrementada de una enzima ramificadora en
comparación con células vegetales correspondientes de tipo salvaje
no modificadas genéticamente.
2. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1, en donde la amilosacarasa es de una bacteria del
género Neisseria.
3. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 1 ó 2, en la cual la enzima ramificadora es de una
bacteria del género Neisseria.
4. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde la enzima
ramificadora es de Neisseria denitrificans.
5. La célula de planta transgénica de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la o las
moléculas de ácido nucleico extraño tiene(n) una o más
secuencias señal de direccionamiento de proteínas que
media(n) una localización vacuolar de la proteína
amilosacarasa y de la proteína enzima ramificadora.
6. La célula de planta transgénica de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la o las
moléculas de ácido nucleico extraño tiene(n) una o más
secuencias señal de direccionamiento de proteínas que
media(n) una localización plastídica de la proteína
amilosacarasa y de la proteína enzima ramificadora.
7. La célula de planta transgénica de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la o las
moléculas de ácido nucleico extraño tiene(n) una o más
secuencias señal de direccionamiento de proteínas que
media(n) una localización específica de la pared celular de
la proteína amilosacarasa y de la proteína enzima ramificadora.
8. Una planta transgénica que contiene las
células de planta transgénica de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
9. La planta transgénica de la reivindicación 8,
que es una planta formuladora de fibras, o almacenadora de aceite o
almacenadora de almidón o almacenadora de azúcar o almacenadora de
proteínas.
10. La planta transgénica de la reivindicación 8
ó 9, que es una planta alimenticia o de verdura.
11. Material de propagación de cosecha de
plantas de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde
dicho material de propagación o de cosecha comprende la célula de
planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
7.
12. Uso de una o más moléculas de ácido nucleico
que codifica(n) una proteína que tiene la actividad
enzimática de una amilosacarasa y una proteína que tiene la
actividad enzimática de una enzima ramificadora, para la producción
de plantas transgénicas que proporcionan un rendimiento incrementado
en comparación con plantas de tipo salvaje y/o que sintetizan un
almidón que está modificado en comparación con el almidón de las
plantas de tipo salvaje y/o sintetizan
\alpha-1,4-glucanos ramificados en
\alpha-1,6 con un grado de ramificación modificado
en posición O-6 en comparación con plantas
correspondientes de tipo salvaje no modificadas genéticamente.
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