ES2339619T3

ES2339619T3 - Moleculas de acidos nucleicos que codifican una enzima ramificadora procedente de bacterias del genero neisseria, asi como procedimientos para la preparacion de alfa-1,4-glucanos ramnificados en las posiciones alfa-1,6.

Info

Publication number: ES2339619T3
Application number: ES99952542T
Authority: ES
Inventors: Volker Buttcher; Martin Quanz
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Bayer Bioscience GmbH
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2010-05-21
Anticipated expiration: 2019-10-08
Also published as: CZ20011125A3; EP1806399A2; US20080020429A1; AU765131B2; JP2002527068A; US7732164B2; US20080020432A1; US20120046456A1; US20040110254A1; AU6469799A; AU765131C; US6699694B1; EP1806399A3; EP1117802B1; US7638311B2; DE59915126D1; US7666623B2; US20080020427A1; US20110136183A1; DK1117802T3

Abstract

Molécula de ácido nucleico que codifica una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria, seleccionada entre el conjunto que se compone de (a) moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, que comprende la secuencia de aminoácidos que se indica dentro de SEQ ID NO: 2; (b) moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la región codificadora que se indica dentro de SEQ ID NO: 1; (c) moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, que comprende la secuencia de aminoácidos, que es codificada por la inserción en el plásmido DSM 12425; (d) moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la región codificadora contenida en la inserción en el plásmido DSM 12425 para una enzima ramificadora; (e) moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria, cuya secuencia en la región de los primeros 100 aminoácidos presenta una identidad entre secuencias de por lo menos un 65% con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada dentro de SEQ ID NO: 2; (f) moléculas de ácidos nucleicos, cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a), (b), (c), (d) y/o (e), y que codifican una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria; y (g) moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia se diferencia de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (f) a causa de la degeneración del código genético.

Description

Moléculas de ácidos nucleicos que codifican una enzima ramificadora procedente de bacterias del género Neisseria, así como procedimientos para la preparación de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6.

El presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican una enzima ramificadora procedente de bacterias de género Neisseria, a vectores, a células anfitrionas, a células de plantas y a plantas que contienen dichas moléculas de ácidos nucleicos, así como a procedimientos para la producción de un almidón.

Los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 presentan un extraordinario interés en diferentes aspectos, puesto que ellos son idóneos por ejemplo para la producción de productos en el sector de las industrias farmacéutica y cosmética. Por ejemplo, ellos se pueden utilizar como agentes aglutinantes para tabletas, como materiales de vehículo para sustancias activas farmacéuticas, como un material para envasar, como un material de soporte para sustancias aditivas a polvos para espolvorear, como sustancia aditiva absorbente de los rayos UV (ultravioletas), en cremas de protección contra el sol y como material de soporte o de vehículo de sustancias aromatizantes u odoríferas.

Los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 se presentan en el reino vegetal principalmente como una amilopectina como un componente del almidón. En el reino animal y en bacterias estos glucanos ramificados aparecen principalmente en forma de glicógeno.

El polisacárido almidón está constituido a base de eslabones fundamentales químicamente uniformes, a saber las moléculas de glucosa, pero constituye una compleja mezcla de diferentes formas de moléculas, que presentan diferencias en lo que se refiere al grado de polimerización y al grado de ramificación, y por consiguiente se diferencian grandemente unas de otras en sus propiedades físicas y químicas. Se establece diferencia entre el almidón de amilosa, que es un polímero esencialmente no ramificado a base de unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos en las posiciones \alpha-1,4, y el almidón de amilopectina, que es un polímero ramificado en el que las ramificaciones pueden realizarse mediante la aparición de adicionales enlaces glicosídicos en las posiciones \alpha-1,6. De acuerdo con los datos de un manual (Voet y Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990), las ramificaciones en las posiciones \alpha-1,6 aparecen en promedio por cada 24 a 30 radicales de glucosa. Esto corresponde a un grado de ramificación de aproximadamente 3%-4%. Los datos acerca del grado de ramificación son variables y dependientes de la procedencia (p.ej. una especie de planta, una variedad vegetal, etc.) del respectivo almidón. En unas típicas plantas utilizadas para la producción de almidón a escala industrial, la proporción de amilosa en el contenido global de almidón varía entre 10 y 25%. Para la preparación de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6, con diverso grado de ramificación, ya se describieron diferentes enfoques, que comprenden la utilización de plantas (transgénicas).

Así, por ejemplo, la expresión heteróloga de una glicógeno sintasa bacteriana en plantas de patata conduce a una ligera disminución del contenido de amilosa, a un aumento del grado de ramificación y a una modificación del modelo de ramificaciones de la amilopectina en comparación con plantas de tipo salvaje (Shewmaker y colaboradores, Plant. Physiol. 104 (1994), 1159-1166). Además, se observó que la expresión heteróloga de la enzima ramificadora procedente de E. coli (glgB) en unas mutantes de patatas exentas de amilosa (amf) (Jacobsen y colaboradores, Euphytica 44 (1989), 43-48) conducía a unas moléculas de amilopectina con un 25% más de sitios de ramificación (Kortstee y colaboradores, Plant J. 10 (1996), 83-90) que el testigo (amf). El aislamiento de los glucanos con diverso grado de ramificación, producidos en plantas transgénicas, necesita para la eliminación p.ej. del componente amilosa, unas etapas de purificación adicionales, que son muy costosas y por lo tanto necesitan una intensa dedicación de tiempo y de costos. Además, no es posible un ajuste deliberado del grado de ramificación con tales enfoques. Por lo demás, tales procedimientos in vivo, a causa de las condiciones fluctuantes de los ensayos (factores medioambientales, sitio de localización) poseen una alta variabilidad en lo que se refiere a la calidad de los productos.

Un grado de ramificación más alto que el de la amilopectina lo tiene el glicógeno. También este polisacárido contiene \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6. El glicógeno se diferencia del almidón también en la longitud media de las cadenas laterales y en el grado de polimerización. El glicógeno, de acuerdo con los datos de un manual (Voet y Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990) contiene en promedio por cada 8 a 12 radicales de glucosa un sitio de ramificación en \alpha-1,6. Esto corresponde a un grado de ramificación de aproximadamente 8% a 12%. Para el peso molecular de un glicógeno se encuentran diferentes datos, que se extienden desde 1 millón hasta de más 1.000 millones (D. J. Manners en: Advances in Carbohydrate Chemistry (Avances en la química de los hidratos de carbono), coordinador de edición M. L. Wolfrom, Academic Press, Nueva York (1957), 261-298; Geddes y colaboradores Carbohydr. Res. 261 (1994), 79-89). También estos datos son grandemente dependientes del respectivo organismo de origen, de su estado de nutrición, así como del modo de realizar el aislamiento del glicógeno. Un glicógeno es obtenido por regla general a partir de moluscos (p.ej. Mytillus edulis), a partir de hígados o músculos de mamíferos (p.ej. conejos, ratas) (Bell y colaboradores Biochem. J. 28 (1934), 882; Bueding y Orrell, J. Biol. Chem. 236 (1961), 2854). Esto hace que una producción a la escala industrial necesite una intensa dedicación de tiempo y de costos.

Los descritos \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6, almidón y glicógeno, que aparecen de un modo natural, que se han descrito, se comportan de una manera muy diversa, dependiendo de su proporción de ramificaciones glicosídicas en las posiciones 1,6. Esto es válido, entre otras cosas, en lo que se refiere a su solubilidad, su transparencia, su hidrólisis enzimática, su reología, y sus propiedades de formación de geles y de retrogradación. Sin embargo, una tal fluctuación en las propiedades no siempre es tolerable para muchas aplicaciones industriales.

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Una alternativa para la obtención de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 a partir de plantas u organismos animales la constituyen unos enfoques in vitro. Estos se distinguen, en comparación con los procedimientos in vivo, por lo general, por una mejor regulabilidad y por una reproducibilidad más alta, puesto que las condiciones de reacción in vitro se pueden ajustar de una manera definida, al contrario que las condiciones que se presentan en un organismo vivo. Esto hace posible por regla general la producción de productos invariables con una gran uniformidad y una gran pureza y por consiguiente una gran calidad, lo que es de gran importancia para el uso industrial ulterior. El tratamiento de productos con una calidad invariable conduce a disminuciones de los costos, puesto que los parámetros de procedimiento, que son necesarios para el tratamiento, no tienen que volver a ser optimizados de nuevo para cada tanda de tratamiento. Otra ventaja adicional de determinados procedimientos in vitro consiste en que los productos están libres de los organismos que se utilizan en el procedimiento in vivo. Para determinadas aplicaciones en la industria alimentaria y en la industria farmacéutica esto es imperativamente necesario.

Los procedimientos in vitro se pueden subdividir en términos generales en dos diferentes conjuntos.

En el caso de uno de los conjuntos de procedimientos, se someten diferentes substratos, tales como p.ej. amilosa, amilopectina y glicógeno, a la actividad de una enzima ramificadora.

Así, Borovsky y colaboradores (Eur. J. Biochem. 59 (1975), 615-625) pudieron mostrar que la utilización de la enzima ramificadora procedente de patata, en unión con el substrato amilosa, conduce a unos productos, que ciertamente son similares a una amilopectina, pero sin embargo se diferencian estructuralmente de ésta.

Boyer y Preiss (Biochemistry 16 (1977), 3693-3699) mostraron además que se puede utilizar una enzima ramificadora purificada (\alpha-1,4-glucano: \alpha-1,4-glucano 6-glicosil-transferasa) procedente de E. coli, con el fin de aumentar el grado de ramificación de la amilosa o amilopectina.

Si, por el contrario, un glicógeno procedente de E. coli o del hígado de un conejo es incubado con la enzima ramificadora procedente de E. coli, entonces se consigue solamente un débil aumento del grado de ramificación (Boyer y Preiss, véase cita anterior).

También Rumbak y colaboradores (J. Bacteriol. 173 (1991), 6732-6741) pudieron aumentar adicionalmente el grado de ramificación de una amilosa, una amilopectina y un glicógeno, al incubar ella a estos substratos con la enzima ramificadora procedente de Butyrivibrio fibrisolvens.

Un enfoque similar fue seguido por Okada y colaboradores, (documento de patente de los EE.UU. nº US 4454161), con el fin de mejorar las propiedades de unos alimentos que contienen almidón. En tal caso se incubaron unas sustancias, tales como una amilosa, una amilopectina, un almidón o una dextrina, en común con una enzima ramificadora. Esto tenía unos efectos ventajosos sobre la estabilidad de los alimentos, que contenían las sustancias correspondientemente modificadas. Además, el documento de solicitud de patente europea EP-A1 0.690.170 describe la reacción de un almidón gelificado en una solución acuosa mediando utilización de una enzima ramificadora. Esto conduce a unos almidones que tienen propiedades ventajosas en la producción de papel.

Los procedimientos in vitro descritos precedentemente tienen sin embargo la desventaja de que ya a causa del grado de ramificación fluctuante de los eductos (productos de partida) (p.ej. un almidón, una amilopectina, etc.) no es posible la producción de productos uniformes. Además, no es posible una regulación deliberada del grado de ramificación, y además de esto los substratos utilizados son relativamente caros.

El otro conjunto de procedimientos in vitro comprende la síntesis de novo de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 (glucosa-1-fosfato, ADP-glucosa, UDP-glucosa) mediando utilización de una combinación de enzimas, que se compone de una enzima formadora de cadenas de glucanos en las posiciones 1,4 (fosforilasa, sintasa de almidón, sintasa de glicógeno) y de una enzima ramificadora.

Así, Illingwort y colaboradores (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 47 (1961), 469-478) pudieron mostrar para un procedimiento in vitro, mediando utilización de una fosforilasa a procedente de músculos (de un organismo desconocido) en combinación con una enzima ramificadora (de un organismo desconocido), que es posible la síntesis de novo de moléculas similares al glicógeno mediando utilización del substrato glucosa-1-fosfato. Boyer y Preiss (véase cita anterior) combinaron la actividad enzimática de una fosforilasa procedente de músculos de conejo o respectivamente de una glicógeno sintasa procedente de E. coli, con la de una enzima ramificadora procedente de E. coli mediando utilización del substrato glucosa-1-fosfato o respectivamente UDP-glucosa, y produjeron de esta manera unos \alpha-glucanos ramificados. También, Borovsky y colaboradores (Eur. J. Biochem. 59 (1975), 615-625) investigaron la síntesis de novo de 1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 a partir de un glucosa-1-fosfato mediando utilización de una enzima ramificadora procedente de patata en combinación con una fosforilasa (1,4-\alpha-D-glucano: ortofosfato \alpha-glicosiltransferasa [EC 2.4.1.1]) procedente de maíz. Doi (Biochimica et Biophysica Acta 184 (1969), 477-485) mostró que la combinación de enzimas, de una sintasa de almidón (ADP-D-glucosa: \alpha-1,4-glucano \alpha-4-glucosiltransferasa) procedente de espinaca y de una enzima ramificadora procedente de patata mediando empleo del substrato ADP-glucosa, conduce a unos productos similares a las amilopectinas. Parodi y colaboradores (Arch. Biochem. Biophys. 132 (1969), 11-117) utilizaron, para la síntesis de novo de glucanos ramificados a partir de una UDP-glucosa, una glicógeno sintasa procedente de hígados de ratas, combinada con una enzima ramificadora procedente de hígados de ratas. Ellos obtuvieron un polímero, que se asemeja al glicógeno natural y que se diferencia de los polímeros que están basados en un glucosa-1-fosfato.

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También este segundo conjunto de procedimientos in vitro presenta la desventaja de que los substratos, p.ej. glucosa-1-fosfato, UDP-glucosa y ADP-glucosa, son muy caros. Además, también en este caso parece no ser posible una regulación deliberada del grado de ramificación.

Büttcher y colaboradores (J. Bacteriol. 179 (1997), 3324-3330) describen un procedimiento in vitro para la preparación de \alpha-1,4-glucanos insolubles en agua, mediando utilización de una amilosacarasa y de sacarosa como substrato. En este caso se sintetizan sin embargo solamente \alpha-1,4-glucanos lineales sin ramificaciones.

El presente invento está basado por consiguiente en la misión de poner a disposición un procedimiento que haga posible la preparación barata de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 para finalidades industriales, así como la de poner a disposición unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifiquen unas enzimas empleables en tales procedimientos, en particular enzimas ramificadoras.

El problema planteado por esta misión es resuelto mediante las formas de realización designadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, el presente invento se refiere a unas moléculas de ácidos nucleicos que codifican una enzima ramificadora (EC 2.4.1.18) procedente de bacterias del género Neisseria, seleccionadas entre el conjunto que se compone de

(a): moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, que comprende la secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO: 2;

(b): moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la secuencia de nucleótidos de la región codificadora, que se representa en SEQ ID NO: 1;

(c): moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, que comprende la secuencia de aminoácidos, que es codificada por la inserción en el plásmido DSM 12425;

(d): moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la región de la inserción en el plásmido DSM 12425, que codifica una enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans;

(e): moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, cuya secuencia tiene en la región de los primeros 100 aminoácidos una identidad entre secuencias de por lo menos un 65% con respecto a la secuencia indicada dentro de SEQ ID NO: 2;

(f): moléculas de ácidos nucleicos, cuya cadena complementaria se hibrida con una molécula de ácido nucleico según (a), (b), (c), (d) y/o (e), y que codifican una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria; y

(g): moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia de nucleótidos se diferencia de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (f) a causa de la degeneración del código genético.

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La secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO:1 es una secuencia genómica, que comprende una región codificadora para una enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans. Un plásmido que contiene esta secuencia de ADN fue depositado como DSM 12425. Con ayuda de esta secuencia o respectivamente de esta molécula se ha hecho posible por fin para un experto en la especialidad aislar secuencias homólogas procedentes de otras especies o cepas de Neisseria. Esto se puede efectuar, por ejemplo, con ayuda de métodos convencionales tales como el escrutinio de ADNc (cromosómico) o de bancos genómicos con unas apropiadas sondas de hibridación. El aislamiento de secuencias homólogas puede efectuarse también tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. De este modo es posible por ejemplo identificar y aislar unas moléculas de ácido nucleico, que se hibridan con la secuencia indicada dentro de SEQ ID NO:1 y que codifican una enzima ramificadora.

Las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento pueden codificar en principio una enzima ramificadora procedente de cualquier bacteria arbitraria del género Neisseria, preferiblemente ellas codifican una enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans.

El concepto de "hibridación" significa, en el marco del presente invento, una hibridación en condiciones convencionales de hibridación, de manera preferida en condiciones rigurosas, tal como ellas se han descrito por ejemplo en la obra de Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (clonación molecular, un manual de laboratorio), 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). De manera especialmente preferida el concepto de "hibridación" significa una hibridación en las siguientes condiciones:

Tampón de hibridación:: 2xSSC; 10x solución de Denhardt (Fikoll 400+PEG+BSA; relación 1:1:1); 0,1% de SDS; 5 mM de EDTA; 50 mM de Na_{2}HPO_{4}; 250 \mug/ml de ADN de esperma de arenque; 50 \mug/ml de ARNt (ARN de transferencia); o 25 M de un tampón fosfato de sodio de pH 7,2; 1 mM de EDTA; 7% de SDS

Temperatura de hibridación:: T = de 65 a 68ºC

Tampón de lavado:: 0,2xSSC; 0,1% de SDS

Temperatura de lavado:: T = de 65 a 68ºC.

Las moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, pueden proceder en principio de cualquier bacteria arbitraria del género Neisseria, que exprese una correspondiente proteína, de manera preferida ellas proceden de Neisseria denitrificans. Las moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas conformes al invento, se pueden aislar p.ej. a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc. La identificación y el aislamiento de tales moléculas de ácidos nucleicos se pueden efectuar en tal caso mediando utilización de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, o de partes de estas moléculas o respectivamente de los complementos inversos de estas moléculas, p.ej. mediante una hibridación de acuerdo con procedimientos clásicos (véase p.ej. Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o por amplificación mediante una PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

Como sonda de hibridación se pueden utilizar p.ej. unas moléculas de ácidos nucleicos que tienen exactamente o en esencial la secuencia de nucleótidos que se indica dentro de SEQ ID NO:1, o partes de esta secuencia. En el caso de los fragmentos utilizados como sonda de hibridación puede tratarse también de unos fragmentos sintéticos, que se habían producido con ayuda de las técnicas de síntesis corrientes, y cuya secuencia coincide en lo esencial con la de una molécula de ácido nucleico conforme al invento. Si se han identificado y aislado unos genes, que se hibridan con las secuencias de ácidos nucleicos conformes al invento, deberían efectuarse una determinación de la secuencia y un análisis de las propiedades de las proteínas codificadas por esta secuencia, con el fin de comprobar si se trata de una enzima ramificadora. Para esto, son apropiadas en particular unas comparaciones de homologías en el plano de la secuencia de ácido nucleico o de la secuencia de aminoácidos, así como la determinación de la actividad enzimática.

Las moléculas que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento comprenden en particular fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácidos nucleicos que más arriba se han descrito, las cuales codifican una enzima ramificadora procedente de bacterias del género Neisseria, preferiblemente procedentes de Neisseria denitrificans. La expresión derivado significa en este contexto el hecho de que las secuencias de estas moléculas se diferencian de las secuencias de los ácidos nucleicos, que más arriba se han descrito, en una o varias posiciones, y presentan un alto grado de homología con respecto de estas secuencias. Homología significa en este contexto una identidad entre secuencias a lo largo de toda la longitud, de por lo menos un 60%, en particular una identidad de por lo menos un 70%, de manera preferida situada por encima de un 80%, de manera especialmente preferida por encima de un 90% y en particular de por lo menos un 95%. Las desviaciones con respecto de las moléculas de ácidos nucleicos que más arriba se han descrito pueden haber resultado en este contexto p.ej. por deleción, adición, sustitución, inserción o recombinación.

Homología significa además el hecho de que existe una equivalencia funcional y/o estructural entre las correspondientes moléculas de ácidos nucleicos o entre las proteínas codificadas por ellas. En el caso de las moléculas de ácidos nucleicos, que son homólogas con respecto a las moléculas que se han descrito más arriba y que constituyen derivados de estas moléculas, se trata por regla general de unas variaciones de estas moléculas, que constituyen unas modificaciones, que ejercen la misma función biológica. En este contexto, puede tratarse tanto de variaciones que aparecen de un modo natural, por ejemplo puede tratarse de secuencias de otras especies o cepas de Neisseria o de unas mutaciones, realizándose que estas mutaciones pueden haber aparecido de una manera natural o habían sido introducidas mediante una mutagénesis deliberada. Además, en el caso de las variaciones puede tratarse de unas secuencias producidas por síntesis. En el caso de las variantes alélicas, puede tratarse tanto de unas variantes que aparecen de una manera natural como también de unas variantes producidas por síntesis o por técnicas de ADN recombinantes.

Las proteínas codificadas por las diferentes variantes de las moléculas de ácidos nucleicos, presentan determinadas características en común. A éstas pueden pertenecer p.ej. la actividad biológica, el peso molecular, la reactividad inmunológica, la conformación, etc., así como ciertas propiedades físicas tales como p.ej. el comportamiento de elución en electroforesis en gel, el comportamiento cromatográfico, los coeficientes de sedimentación, la solubilidad, las propiedades espectroscópicas, la estabilidad; el valor óptimo del pH, el valor óptimo de la temperatura, etc.

El peso molecular de la enzima ramificadora que se deriva de la secuencia de aminoácidos, procedente de Neisseria denitrificans, es de 86,3 kDa (kilodalton). El peso molecular que se deriva de una proteína conforme al invento está situado por lo tanto de manera preferida en el intervalo de 70 kDa a 100 kDa, de manera más preferida en el intervalo de 77 kDa a 95 kDa y de manera especialmente preferida en alrededor de 86 kDa.

El presente invento concierne también a unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína con la actividad enzimática de una enzima ramificadora, presentando la proteína codificada en la región del extremo terminal de N, de manera preferida en los primeros 110 aminoácidos y de manera especialmente preferida en los primeros 120 aminoácidos, una homología de por lo menos un 65%, de manera preferida de por lo menos un 80% y de manera especialmente preferida de por lo menos un 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos que se indica dentro de SEQ ID NO:2.

En otra forma de realización adicional, la presente solicitud concierne a unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína con una actividad de enzima ramificadora, que comprende por lo menos uno, de manera preferida por lo menos 5, en particular por lo menos 10 y de manera especialmente preferida por lo menos 20 de los siguientes motivos de péptidos:

(a): MNRNRHI (SEQ ID NO:8),

(b): RPDAHH (SEQ ID NO:9),

(c): HAPDYAL (SEQ ID NO:10),

(d): EGEAA (SEQ ID NO:11),

(e): DDYRF (SEQ ID NO:12),

(f): SALQH (SEQ ID NO:13),

(g): YETLG (SEQ ID NO:14),

(h): VSGVR (SEQ ID NO:15),

(i): VSVIG (SEQ ID NO:16),

(j): FNGWD (SEQ ID NO:17),

(k): LYKFS (SEQ ID NO:18),

(l): PYAFG (SEQ ID NO:19),

(m): RPTTAS (SEQ ID NO:20),

(n): FRRRA (SEQ ID NO:21),

(o): DELVNY (SEQ ID NO:22),

(p): LPLSEY (SEQ ID NO:23),

(q): YQATGL (SEQ ID NO:24).

(r): DDHGL (SEQ ID NO:25),

(s): HQDWN (SEQ ID NO:26),

(t): DGIRV (SEQ ID NO:27),

(u): YGGSEN (SEQ ID NO:28),

(v): SFAEES (SEQ ID NO:29),

(w): DPVHR (SEQ ID NO:30),

(x): WQQFAN (SEQ ID NO:31),

(y): EILNS (SEQ ID NO:32),

(z): ATEIQTAL (SEQ ID NO:33),

(aa): VKDKQAKAK (SEQ ID NO:34).

Las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento pueden ser unas arbitrarias moléculas de ácidos nucleicos, en particular unas moléculas de ADN o ARN, por ejemplo de ADNc, ADN genómico, ARNm (ARN mensajero), etc. Ellas pueden ser unas moléculas que se presentan de un modo natural o pueden ser unas moléculas producidas por procedimientos de tecnología genética o de síntesis química. Ellas pueden ser unas moléculas monocatenarias, que contienen o bien la cadena codificadora o la cadena no codificadora, o unas moléculas bicatenarias.

Además, la presente divulgación concierne a unas moléculas de ácidos nucleicos que tienen una longitud de por lo menos 15, de manera preferida de más de 50 y de manera especialmente preferida de más de 200 nucleótidos, que se hibridan específicamente con por lo menos una molécula de ácido nucleico conforme al invento. El concepto de hibridarse específicamente significa en este contexto que estas moléculas se hibridan con unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína conforme al invento, pero no con unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican otras proteínas. El concepto de hibridarse significa en este contexto preferiblemente una hibridación en condiciones rigurosas (véanse más arriba). En particular, la divulgación se refiere a aquellas moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con unos transcritos de moléculas conformes al invento y de esta manera pueden impedir su traducción. Tales moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan específicamente con las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, pueden ser por ejemplo partes componentes de construcciones artificiales antisentido o ribozimas o se pueden utilizar como cebadores para la amplificación mediante una PCR.

Además, el invento se refiere a unos vectores, en particular a plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores, que son corrientes en la tecnología genética, los cuales contienen las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento que más arriba se han descrito.

En una forma preferida de realización, las moléculas de ácidos nucleicos contenidas en los vectores están unidas en una orientación en el mismo sentido (in sense) con unos elementos reguladores, que garantizan la expresión en células procarióticas o eucarióticas. El concepto de "expresión" puede significar en tal contexto una transcripción así como también una transcripción y una traducción.

La expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en células procarióticas, por ejemplo en Escherichia coli, hace posible por ejemplo una caracterización más exacta de las actividades enzimáticas de las proteínas codificadas. Además de esto, es posible introducir, mediante técnicas corrientes de biología molecular (compárese p.ej. Sambrook y colaboradores, véase cita anterior), mutaciones de diversos tipos en las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, con lo cual se llega a la síntesis de unas proteínas que tienen unas propiedades biológicas eventualmente modificadas. Es posible la producción de unas mutantes por deleción, en las cuales, mediante deleciones progresivas desde el extremo 5' o desde el extremo 3' de la secuencia de ADN codificadora, se producen unas moléculas de ácidos nucleicos que conducen a la síntesis de unas proteínas correspondientemente acortadas. Es posible también la introducción de mutaciones puntuales en unas posiciones, que tienen una cierta influencia por ejemplo sobre la actividad enzimática o sobre la regulación de la enzima. De esta manera, se pueden producir p.ej. unas mutantes que poseen un valor de K_{m} modificado o que ya no están sujetas a los mecanismos de regulación que normalmente están presentes en la célula, a través de una regulación alostérica o de una modificación covalente. Además, se pueden producir unas mutantes, que presentan una especificidad modificada para ciertos substratos o productos. Además, se pueden producir unas mutantes que presentan un perfil modificado de actividades y temperaturas. La manipulación por tecnología genética en células eucarióticas puede efectuarse de acuerdo con los métodos conocidos por un experto en la especialidad (compárese Sambrook y colaboradores, véase cita anterior).

Unas secuencias reguladoras de la expresión en organismos procarióticos, p.ej. E. coli, y en organismos eucarióticos, se han descrito suficientemente en la bibliografía, en particular las destinadas a la expresión en levaduras, tales como p.ej. Saccharomyces cerevisiae. Una recopilación de los diferentes sistemas para la expresión de proteínas en diferentes organismos anfitriones, se encuentra p.ej. en la cita de Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 y en la cita de Bitter y colaboradores (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544).

De manera preferida, la molécula de ácido nucleico conforme al invento, insertada en un vector conforme al invento, está modificada de una manera tal que la proteína codificada, después de una expresión en un apropiado organismo anfitrión, puede ser aislada con mayor facilidad a partir del medio de cultivo. Así, existe por ejemplo la posibilidad de expresar el sistema de ramificación codificado como una proteína de fusión con una secuencia de polipéptido adicional, cuyas propiedades específicas de fijación permiten el aislamiento de la proteína de fusión a través de una cromatografía de afinidad (véanse p.ej. las citas de Chong y colaboradores, Gene 192 (1997), 271-281; Hopp y colaboradores, Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93).

Además, es preferido que la molécula de ácido nucleico, que está contenida en un vector conforme al invento, abarque unas secuencias de nucleótidos, que permitan la secreción de la enzima ramificadora en el medio de cultivo. De manera preferida, se utiliza una secuencia que codifica el péptido de señal de la \alpha-CGTase procedente de Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler y colaboradores, J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291; nº de acceso al Genebank X86014, CDS 11529-11618). Mediante la secreción de la enzima dentro del medio de cultivo se simplifican la recuperación y la purificación. Se evita una disgregación de las células y la enzima se puede recuperar a partir del medio de cultivo, pudiéndose emplear para la eliminación de los componentes residuales del medio de cultivo unos métodos corrientes, tales como p.ej., diálisis, ósmosis, métodos cromatográficos, etc.

Además, los vectores conformes al invento pueden comprender otras unidades funcionales adicionales, que producen una estabilización del vector en un organismo anfitrión, tal como p.ej. un origen de replicación bacteriano o el ADN 2\mu para la estabilización en S. cerevisiae.

En una forma de realización adicional, el invento se refiere a unas células anfitrionas, en particular a unas células procarióticas o eucarióticas, que habían sido transformadas con un vector descrito más arriba, así como unas células que proceden de tales células anfitrionas y que contienen los vectores descritos. Las células anfitrionas pueden ser células de bacterias (p.ej. de E. coli) o de hongos (p.ej. de levaduras, en particular de S. cerevisiae), así como células de plantas o animales. El concepto "transformado" significa en este contexto que las células conformes al invento están modificadas genéticamente con una molécula de ácido nucleico conforme al invento, por cuanto que ellas, adicionalmente a su genoma natural, contienen por lo menos una molécula de ácido nucleico conforme al invento. Ésta puede presentarse libremente en la célula, eventualmente como una molécula autorreplicante, o puede presentarse integrada establemente en el genoma de la célula anfitriona.

De manera preferida, las células anfitrionas son microorganismos. Dentro de este concepto se entienden en el marco de la presente solicitud todas las bacterias y todos los protistas (p.ej. hongos, en particular levaduras y algas), tal como ellas/os se han descrito p.ej. en la obra de Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Microbiología general) (editorial Georg Thieme (1985), 1-2).

De manera especialmente preferida, las células anfitrionas conformes al invento son células de plantas. En tal contexto puede tratarse en principio de células de plantas procedentes de cualquier especie arbitraria de plantas, es decir plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. De manera preferida, se trata de células de plantas procedentes de plantas útiles agrícolas, es decir procedentes de plantas que son cultivadas por los seres humanos con finalidades de nutrición o para finalidades técnicas, en particular industriales. De manera preferida, el invento se refiere a unas células de plantas procedentes de plantas que forman fibras (p.ej. lino, cáñamo, algodón), que almacenan aceite (p.ej. colza, girasol, soja), que almacenan azúcares (p.ej. remolacha azucarera, caña de azúcar, mijo azucarero, bananos) y plantas que almacenan proteínas (p.ej. leguminosas).

En otra forma de realización adicional, el invento se refiere a unas células de plantas procedentes de plantas forrajeras (p.ej. hierbas forrajeras y de prado (alfalfa, trébol, etc.)), plantas de hortalizas (p.ej. tomate, lechuga, achicoria).

En una forma preferida de realización, el invento se refiere a unas células de plantas procedentes de plantas que almacenan almidón (p.ej. trigo, cebada, avena, centeno, patata, maíz, arroz, guisante, mandioca, haba de mung), son especialmente preferidas unas células de plantas procedentes de plantas de maíz, arroz, trigo y patata.

Además, el presente invento se refiere a un procedimiento para la producción de una enzima ramificadora procedente de bacterias del género Neisseria, en el que se cultivan células anfitrionas conformes al invento en unas condiciones, que permiten la expresión de la proteína, y la proteína es recuperada a partir del cultivo, es decir a partir de las células y/o del medio de cultivo. De manera preferida se utiliza en tal caso un organismo hospedante, que secreta la enzima ramificadora.

Además, el presente invento se refiere a un procedimiento para la producción de una enzima ramificadora procedente de bacterias del género Neisseria, siendo producida la proteína en un sistema de transcripción y traducción in vitro mediando utilización de una molécula de ácido nucleico conforme al invento. Tales sistemas son habituales para un experto en la especialidad.

El invento se refiere también a unas proteínas, que son codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, o que son obtenibles mediante un procedimiento conforme al invento.

El presente invento se refiere además a unos anticuerpos, que reconocen específicamente a una proteína conforme al invento. Éstos pueden ser p.ej. anticuerpos monoclonales o policlonales. También pueden ser fragmentos de anticuerpos, que reconocen a las proteínas conformes al invento. Los métodos para la producción de tales anticuerpos o respectivamente fragmentos son habituales para un experto en la especialidad.

Además, el presente invento se refiere a la utilización de una enzima ramificadora conforme al invento destinada a la preparación de \alpha-1.4-glucanos, ramificados en las posiciones \alpha-1,6, en unos sistemas in vitro.

El presente invento se refiere en particular también a unas células de plantas transgénicas, que contienen las moléculas de ácidos nucleicos o los vectores conformes al invento. De manera preferida, las células conformes al invento están caracterizadas por el hecho de que la molécula de ácido nucleico, que se ha introducido conforme al invento, está integrada de una manera estable en el genoma y se encuentra bajo el control de un promotor que es activo en células de plantas.

Para la expresión de una molécula de ácido nucleico conforme al invento en células de plantas, están a disposición un gran número de promotores o respectivamente de elementos reguladores. Los elementos reguladores para la expresión en células de plantas son en este contexto en principio todos los promotores, intensificadores, terminadores, etc., que son activos en células de plantas. En principio se puede utilizar cualquier promotor que sea funcional en las plantas escogidas para la transformación. El promotor puede ser homólogo o heterólogo en relación con la especie de planta utilizada. En este caso, puede ser escogido de tal manera que la expresión se efectúe de una manera constitutiva o solamente en un tejido determinado, en un momento determinado del desarrollo de la planta o en un momento que ha sido determinado por influencias externas. Es apropiado por ejemplo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell y colaboradores, Nature 313 (1985), 810-812 o el documento de patente de los EE.UU US 5.352.605), que garantiza una expresión constitutiva en todos los tejidos de una planta y la construcción artificial de promotor, que se describe en el documento de solicitud de patente internacional WO/9401571. Otro ejemplo distinto es el promotor de ubiquitina (véase p.ej. el documento US 5.614.399) así como los promotores de los genes de poliubiquitina procedentes de maíz (Christensen y colaboradores, véase cita anterior). Sin embargo, también se pueden utilizar unos promotores, que son activados solamente en un momento que ha sido determinado por influencias externas (véase por ejemplo el documento WO/9307279). Pueden presentar un interés especial en este contexto unos promotores de proteínas de choque térmico (en inglés heat-shock), que permiten una sencilla inducción. Además, se pueden utilizar los promotores, que en un determinado tejido de la planta conducen a una expresión de secuencias conectadas posteriormente, por ejemplo en un tejido activo fotosintéticamente. Ejemplos de ellos son el promotor de ST-LS1 (Stockhaus y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), el promotor de Ca/b (véanse p.ej. los documentos US 5.656.496, US 5.639.952, Bansal y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3654-3658) y el promotor SSU de Rubisco (véanse p.ej. los documentos US 5.034.322.y US 4.962.028). Han de mencionarse además unos promotores, que son activos en los órganos almacenadores de almidón de las plantas que se han de transformar. Estos son, p.ej. en el caso del maíz, los granos de maíz, mientras que en el caso de la patata son los tubérculos. Para la sobreexpresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en la patata, se puede utilizar por ejemplo el promotor B33 del gen de patatin (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29). Unos promotores específicos para las semillas ya se han descrito para diferentes especies de plantas. Así, p.ej. el promotor USP procedente de Vicia faba, que garantiza una expresión específica para las semillas en V. faba y otras plantas (Fiedler y colaboradores, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein y colaboradores, Mol Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).

Además, se pueden emplear también unos promotores específicos para frutos, tales como p.ej. los que se describen en el documento WO 9101373. De manera especialmente preferida se utilizan promotores para una expresión específica en el endospermo, tales como p.ej. el promotor de glutelina (Leisy y colaboradores, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng y colaboradores, Plant J. 4 (1993), 357-366), el promotor HMG procedente de trigo, el promotor USP, el promotor de faseolina o promotores de genes de zeina procedentes de maíz (Pedersen y colaboradores, Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio y colaboradores, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93). Con ayuda de promotores específicos para el endospermo es posible aumentar la cantidad de los transcritos de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en el endospermo, en comparación con el endospermo de unas correspondientes plantas de tipo salvaje.

De manera especialmente preferida se utiliza el promotor shrunken-1 (sh-1) procedente de maíz (Werr y colaboradores, EMBO J. 4 (1985), 1373-1380).

Además, puede estar presente una secuencia de terminación, que sirve para la terminación correcta de la transcripción así como para la adición al transcrito de una cola de poly-A, a la que se atribuye una función en el caso de la estabilización de de los transcritos. Tales elementos han sido descritos en la bibliografía (compárese p.ej. Gielen y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) y son permutables arbitrariamente.

Es posible por consiguiente la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en células de plantas.

Por consiguiente, el presente invento se refiere asimismo a un procedimiento para la producción de células de plantas transgénicas, que comprenden la introducción de una molécula de ácido nucleico o de un vector conforme al invento en células de plantas. En este caso están a disposición de un experto en la especialidad diferentes sistemas de transformación de plantas, p.ej. se ha investigado intensamente la utilización de un ADN-T para la transformación de células de plantas y se ha descrito en el documento EP-A-120.516; y en las citas de Hoekema: The Binary Plant Vector System (el sistema de vectores vegetales de plantas), Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), capítulo V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An, EMBO J. 4 (1985), 277-287.

Para la transferencia de los ADN a la célula de planta, unos explantes de plantas se pueden cultivar concomitantemente, de manera conveniente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. A partir del material infectado de las plantas (p.ej. trozos de hojas, segmentos de tallos, raíces, pero también protoplastos o células de plantas cultivadas en suspensión) entonces se pueden regenerar de nuevo plantas enteras en un medio apropiado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección de células transformadas. Las plantas obtenidas de esta manera pueden ser investigadas en cuanto a la presencia del ADN introducido. Otras posibilidades de la introducción de ADN ajenos, mediando utilización del procedimiento biolístico o mediante transformación de protoplastos, son conocidas (compárese p.ej. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (Plantas transgénicas. En: biotecnología un tratado comprensivo de volúmenes múltiples) (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, coordinadores de edición), volumen 2, 627-659, VCH Weinheim - Nueva York - Basilea - Cambridge).

Unos sistemas alternativos para la transformación de plantas monocotiledóneas son la transformación mediante el enfoque biolístico, la asimilación de ADN en protoplastos que ha sido inducida por medios eléctricos o químicos, la electroporación de células parcialmente permeabilizadas, la macroinyección de ADN en inflorescencias, la microinyección de ADN en microsporas y pro-embriones, la asimilación de ADN por un polen en germinación y la asimilación de ADN en embriones por hinchamiento (véanse p.ej. Lusardi, Plant J. 5 (1994), 571-582; Paszkowski, Biotechnology 24 (1992), 387-392).

Mientras que la transformación de plantas dicotiledóneas a través de sistemas de vectores del plásmido Ti con ayuda de Agrobacterium tumefaciens está bien consagrada, unos nuevos trabajos apuntan a que también las plantas monocotiledóneas son muy perfectamente accesibles a la transformación mediantes vectores que se basan en Agrobacterium (Chan, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei, Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri, Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould, Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney, Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).

Tres de los sistemas de transformación que arriba se han mencionado pudieron ser consagrados en el pasado para diferentes cereales: la electroporación de tejidos, la transformación de protoplastos y la transferencia de ADN mediante disparo de partículas en tejidos y células regenerables (para la recopilación, véase Jähne, Euphytica 85 (1995), 35-44). La transformación de trigo ha sido descrita de manera diversa en la bibliografía (para una recopilación: véase Maheshwari, Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).

En particular, la transformación de maíz fue descrita de manera múltiple en la bibliografía (compárense p.ej. los documentos WO 95/06128, EP 0513849, EP 0465875, EP 292435; Fromm y colaboradores, Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm y colaboradores Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel y colaboradores, Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc y colaboradores Theor. Appl. Genet. 80 (1990), 721-726).

También fue descrita ya la transformación con éxito de otras especies de cereales, p.ej. para la cebada (Wan y Lemaux, véase cita anterior; Ritala y colaboradores véase cita anterior; Krens y colaboradores Nature 296 (1982), 72-74) y para el trigo (Nehra y colaboradores, Plant J. 5 (1994), 285-297).

En el caso de la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento en plantas existe fundamentalmente la posibilidad de que la proteína sintetizada pueda ser localizada en cualquier compartimiento arbitrario de la célula de planta. Con el fin de conseguir la localización en un determinado compartimiento, región codificadora debe de ser unida eventualmente con unas secuencias de ADN que garanticen la localización en el respectivo compartimiento. Tales secuencias son conocidas (véanse por ejemplo Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29).

Como secuencia de señal plastídica se puede utilizar por ejemplo la del sistema de ferrodoxina:NADP+ oxidorreductasa (FNR) procedente de espinaca. Esta secuencia contiene la región no traducida en 5' así como la secuencia flanqueadora de péptido de transito del ADNc de la proteína plastídica ferrodoxina: NADP+ oxidorreductasa procedente de espinaca (los nucleótidos -171 hasta + 165; Jansen y colaboradores, Current Genetics 13 (1988),
517-522).

Además, como secuencia de señal plastídica se puede utilizar por ejemplo el péptido de tránsito de la proteína cerosa (en inglés waxy) procedente de maíz más los primeros 34 aminoácidos de la proteína cerosa madura (Klösgen y colaboradores, Mol Gen Genet. 217 (1989), 155-161). Además de esto, se puede utilizar el péptido de tránsito de la proteína cerosa procedente de maíz (véase más arriba) también sin los primeros 34 aminoácidos de la proteína cerosa madura.

Además, se puede concebir la utilización de las siguientes secuencias de señales plastídicas: la secuencia de señal de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa (Wolter y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Nawrath y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 12760-12764); la secuencia de señal de la NADP-malato deshidrogenasa (Gallardo y colaboradores, Planta 197 (1995), 324-332); la secuencia de señal de la glutatión reductasa (Creissen y colaboradores, Plant J. 8 (1995), 167-175).

El presente invento concierne por consiguiente también a unas células de plantas transgénicas, que habían sido transformadas con una o varias molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) conforme(s) al invento, así como a unas células de plantas transgénicas, que proceden de células transformadas de tal manera. Tales células contienen una o varias de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, estando unida(s) ésta(s) preferiblemente con unos elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción en el seno de células de plantas, en particular con un promotor. Tales células se pueden diferenciar de unas células de plantas presentes de un modo natural, en el hecho de que ellas contienen por lo menos una molécula de ácido nucleico conforme al invento.

Las células de plantas transgénicas pueden ser regeneradas de acuerdo con técnicas conocidas de un experto en la especialidad para formar plantas enteras. Las plantas obtenibles por regeneración de las células de plantas transgénicas conformes al invento son asimismo un objeto del presente invento.

Son además un objeto del invento unas plantas que contienen las células de plantas conformes al invento, que se han descrito más arriba. En el caso de las plantas conformes al invento se puede tratar en principio de plantas de cualquier especie arbitraria de plantas, es decir plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. De manera preferida, se trata de plantas útiles, es decir de unas plantas que son cultivadas por los seres humanos para finalidades de nutrición o para finalidades técnicas, en particular industriales. De manera preferida, el invento se refiere a células de plantas procedentes de plantas que forman fibras (p.ej. lino, cáñamo, algodón), que almacenan aceite (p.ej. colza, girasol, soja), que almacenan azúcares (p.ej. remolacha azucarera, caña de azúcar, mijo azucarero, bananos) y plantas que almacenan proteínas (p.ej. leguminosas).

En otra forma adicional de realización, el invento se refiere a plantas forrajeras (p.ej. hierbas forrajeras y de prado (alfalfa, trébol, etc.)), o a plantas de hortalizas, (p.ej. tomate, lechuga, achicoria).

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En una forma preferida de realización, el invento se refiere a plantas que almacenan almidón (p.ej. trigo, cebada, avena, centeno, patata, maíz, arroz, guisante, mandioca, haba de mung), son particularmente preferidas las plantas de maíz, arroz, trigo y patata.

En una forma preferida de realización, las células de las plantas conformes al invento presentan, en comparación con unas correspondientes células de plantas no modificadas genéticamente de plantas de tipo salvaje, una actividad aumentada de una proteína conforme al invento. Éstas son de manera preferida unas células de tejidos que almacenan almidón, en particular células procedentes de tubérculos o del endospermo, de manera preferida células procedentes de tubérculos de patata o del endospermo de plantas de maíz, trigo o arroz.

El concepto de "elevación de la actividad" significa en este contexto, en el marco del presente invento, una elevación de la expresión de una molécula de ácido nucleico conforme al invento, que codifica una proteína con actividad de enzima ramificadora, una elevación de la cantidad de una proteína con actividad de enzima ramificadora y/o una elevación de la actividad de una proteína con actividad de enzima ramificadora en las plantas.

La elevación de la expresión se puede determinar por ejemplo mediante una medición de la cantidad de transcritos que codifican tales proteínas, p.ej. mediante un análisis de borrón de transferencia Northern o una RT-PCR (una reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa). Una elevación significa en este contexto, de manera preferida, una elevación de la cantidad de transcritos, en comparación con unas células de plantas no modificadas genéticamente, en por lo menos un 10%, de manera preferida en por lo menos un 20%, en particular en por lo menos un 50% y de manera especialmente preferida en por lo menos un 75%.

La elevación de la cantidad de la proteína con actividad de enzima ramificadora se puede determinar por ejemplo mediante un análisis de borrón de transferencia Western. Una elevación significa en este contexto preferiblemente una elevación de la cantidad de una proteína con actividad de enzima ramificadora, en comparación con unas correspondientes células no modificadas genéticamente, en por lo menos un 10%, de manera preferida en por lo menos un 20%, en particular en por lo menos un 50% y de manera especialmente preferida en por lo menos un 75%.

La elevación de la actividad de la enzima ramificadora se puede determinar por ejemplo de acuerdo con el método descrito en la cita de Lloyd y colaboradores, (Biochem. J. 338 (1999), 515-521). Una elevación significa en este contexto preferiblemente una elevación de la actividad de la enzima ramificadora en por lo menos un 10%, de manera preferida en por lo menos un 20% y de manera especialmente preferida en por lo menos un 50% y de manera muy especialmente preferida en por lo menos un 75%.

Se encontró de un modo sorprendente que unas plantas, que contienen células de plantas conformes al invento con una actividad elevada de una enzima ramificadora conforme al invento, sintetizan un almidón modificado en comparación con el de unas correspondientes plantas de tipo salvaje no modificadas genéticamente. El almidón modificado puede haber sido modificado por ejemplo en sus propiedades físicas y químicas, en particular en la relación de amilosa/amilopectina, el grado de ramificación, la longitud media de las cadenas, el contenido de fosfato, el comportamiento de viscosidad, el tamaño de los granos de almidón, la distribución de las cadenas laterales y/o la forma de los granos de almidón en comparación con un almidón sintetizado en plantas de tipo salvaje, de manera tal que éste sea mejor apropiado para finalidades especiales de utilización.

Además, se encontró de un modo sorprendente que en unas células de plantas conformes al invento, en las cuales se ha elevado la actividad de la enzima ramificadora conforme al invento, se ha modificado la composición del almidón de una manera tal que éste, en comparación con un almidón procedente de correspondientes plantas de tipo salvaje, presenta una resistencia de gel aumentada y/o un contenido disminuido de fosfato y/o una viscosidad pico disminuida y/o una temperatura de engrudamiento disminuida y/o un tamaño disminuido de los granos de almidón y/o una distribución modificada de las cadenas laterales.

El concepto de "resistencia de gel elevada" significa en este contexto una elevación en por lo menos un 10%, de manera preferida en por lo menos un 50%, en particular en por lo menos un 100%, en por o menos 200% y de manera especialmente preferida en por lo menos un 300% en comparación con la resistencia de gel de un almidón procedente de plantas de tipo salvaje. La determinación de la resistencia de gel se efectúa en este contexto tal como se describe más adelante.

El concepto de "contenido disminuido de fosfato" significa, en conexión con el presente invento, el hecho de que el contenido total de fosfato combinado covalentemente y/o el contenido de fosfato en la posición C-6 del almidón sintetizado en las células de plantas conformes al invento, se han disminuido en por lo menos un 20%, de manera preferida en por lo menos un 40%, de manera especialmente preferida en por lo menos un 60% y en particular en por lo menos un 80% en comparación con un almidón procedente de células de plantas de correspondientes plantas de tipo salvaje.

La determinación del contenido total de fosfato o respectivamente del contenido de fosfato en la posición C-6 puede efectuarse de acuerdo con el método descrito más adelante.

El concepto de "viscosidad pico disminuida" significa, en conexión con el presente invento, una disminución de la viscosidad pico en por lo menos un 10%, de manera preferida en por lo menos un 25%, en particular un 50%, de manera especialmente preferida un 75% en comparación con la viscosidad pico de almidones procedentes de plantas de tipo salvaje.

El concepto de "temperatura disminuida de engrudamiento" significa en el presente contexto una disminución de la temperatura de engrudamiento en por lo menos 0,5ºC, preferiblemente en por lo menos 1,0ºC, en particular en por lo menos 2,0ºC, de manera especialmente preferida en por lo menos 3,0ºC, en comparación con la temperatura de engrudamiento de almidones procedentes de plantas de tipo salvaje.

La determinación de la viscosidad pico y de la temperatura de engrudamiento se efectúa con ayuda de un aparato analizador Rapid Visco, del modo que se describe más adelante.

Los conceptos de "viscosidad pico" y de "temperatura de engrudamiento" son habituales para un experto en la especialidad.

El concepto de "tamaño disminuido de los granos de almidón" significa que la proporción porcentual de granos de almidón que tienen un tamaño de granos de hasta 15 \mum, en comparación con plantas de tipo salvaje, se ha aumentado en por lo menos un 10% de manera preferida en por lo menos un 30%, en particular en por lo menos un 50%, un 100% y de manera especialmente preferida en por lo menos un 150%.

La determinación del tamaño de granos del almidón se efectúa con ayuda de un aparato medidor fotográfico de la sedimentación del tipo "Lumosed" de la entidad Retsch GmbH, Alemania, del modo que se describe más adelante.

Por el concepto de "distribución modificada de las cadenas laterales" debe de entenderse en este contexto una elevación de la proporción de cadenas laterales con un DP (grado de polimerización) de 6 a 9 en por lo menos un 25%, de manera preferida en por lo menos un 50%, en particular en por lo menos un 100% y de manera especialmente preferida de por lo menos un 200%, en comparación con la proporción de cadenas laterales con un DP de 6 a 9 de una amilopectina procedente de plantas del tipo salvaje.

En otra forma de realización del invento, por el concepto de una "distribución modificada de las cadenas laterales" debe de entenderse una elevación de la proporción de cadenas laterales con un DP de 6 a 8, de manera preferida de 6 a 7, en por lo menos un 25%, de manera preferida en por lo menos un 50%, en particular en por lo menos de un 100% y de manera especialmente preferida en por lo menos un 200% en comparación con la proporción de cadenas laterales que tienen un correspondiente grado de polimerización de una amilopectina procedente de plantas de tipo salvaje.

La determinación de la proporción de cadenas laterales se efectúa a través de la determinación de la proporción porcentual de una determinada cadena lateral en la proporción total de todas las cadenas laterales. La proporción total de todas las cadenas laterales se determina a través de la determinación del área total por debajo de los picos, que representan en el cromatograma de HPCL los grados de polimerización DP de 6 a 30. La proporción porcentual de una determinada cadena lateral en la proporción global de todas las cadenas laterales se determina a través de la determinación de la relación del área por debajo del pico, que representa a esta cadena lateral en el cromatograma de HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento), con respecto al área total. De manera preferida se utiliza el programa AI-450, versión 3.31 de la entidad Dionex, EE.UU.

La presente divulgación se refiere a un almidón, cuya amilopectina presenta en comparación con la amilopectina de almidones de plantas de tipo salvaje, unas cadenas laterales con un DP = 5.

El presente invento se refiere además a un procedimiento para la producción de una planta transgénica, que sintetiza un almidón modificado, realizándose que

(a): una célula de planta es modificada genéticamente mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico conforme al invento y/o de un vector conforme al invento, cuya presencia o cuya expresión conduce a la elevación de la actividad de una proteína con la actividad de una enzima ramificadora;

(b): a partir de la célula según la etapa (a) se regenera una planta; y

(c): a partir de la planta producida según la etapa (b) se producen eventualmente otras plantas adicionales, que contienen unas células, las cuales a su vez contienen una molécula de ácido nucleico conforme al invento o un vector conforme al invento.

En una forma preferida de realización del procedimiento, el almidón está modificado de tal manera, que presenta una resistencia aumentada de gel y/o un contenido disminuido de fosfato y/o una viscosidad pico disminuida y/o una temperatura de engrudamiento disminuida y/o un tamaño disminuido de los granos de almidón y/o una distribución modificada de las cadenas laterales en comparación con un almidón procedente de unas correspondientes plantas de tipo salvaje.

Los conceptos de "resistencia aumentada de gel", "contenido disminuido de fosfato", "viscosidad pico disminuida", "temperatura disminuida de engrudamiento", "tamaño disminuido de los granos de almidón" y "distribución modificada de las cadenas laterales" se definen en este contexto tal como ya se ha hecho más arriba.

La modificación genética introducida según la etapa (a) significa lo mismo que ya se explico más arriba en otro contexto con las plantas conformes al invento.

La regeneración de plantas de acuerdo con la etapa (b) puede efectuarse de acuerdo con métodos conocidos para un experto en la especialidad.

La producción de plantas adicionales de acuerdo con la etapa (b) del procedimiento conforme al invento puede efectuarse p.ej. mediante reproducción vegetativa (por ejemplo a través de plantones, tubérculos o por medio del cultivo de callos o de la regeneración de plantas enteras) o mediante una reproducción sexual. La reproducción sexual tiene lugar en este caso preferiblemente de una manera controlada, es decir que se cruzan entre sí y se reproducen unas plantas seleccionadas con unas determinadas propiedades.

El presente invento se refiere también a las plantas obtenibles mediante los procedimientos conformes al invento.

El presente invento se refiere también a un material de reproducción de plantas conformes al invento así como a las plantas transgénicas producidas de acuerdo con el procedimiento conforme al invento. El concepto de material de reproducción comprende en este contexto aquellos componentes de la planta, que son apropiados para la producción de descendientes por una vía vegetativa o generativa. Para la reproducción vegetativa son apropiados por ejemplo plantones, cultivos de callos, rizomas o tubérculos. Otro material de reproducción distinto comprende por ejemplo frutos, semillas, plántulas, protoplastos, cultivos celulares, etc. De manera preferida, en el caso del material de reproducción se trata de tubérculos y semillas.

Las células de plantas y las plantas transgénicas conformes al invento sintetizan, en virtud de la expresión de una molécula de ácido nucleico conforme al invento o de un vector conforme al invento, cuya presencia o cuya expresión conducen a una elevación de la actividad de una enzima ramificadora, en comparación con unas correspondientes células de plantas no modificadas genéticamente de plantas de tipo salvaje, un almidón, que ha sido modificado en sus propiedades físicas y químicas, en particular la resistencia de gel y/o el comportamiento de engrudamiento y/o el tamaño de los granos del almidón y/o el contenido de fosfato y/o la distribución de las cadenas laterales, en comparación con un almidón sintetizado en plantas de tipo salvaje.

Los conceptos de "resistencia aumentada de gel", "contenido disminuido de fosfato", "viscosidad pico disminuida", "temperatura disminuida de engrudamiento", "tamaño disminuido de los granos de almidón" y "distribución modificada de las cadenas laterales" se definen en este contexto tal como ya se ha definido más arriba.

El presente invento se refiere además a un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la etapa de la extracción del almidón a partir de una (célula de) planta y/o a partir de partes que almacenan almidón de una tales plantas. De manera preferida, un tal procedimiento comprende también la etapa de la cosecha de las plantas cultivadas y/o de las partes que almacenan almidón de estas plantas, antes de la extracción del almidón, y de manera especialmente preferida además la etapa de la cultivación de plantas conformes al invento antes de la cosecha. Los procedimientos para la extracción del almidón de plantas o de partes que almacenan almidón de plantas, son conocidos para un experto en la especialidad. Además, se describen procedimientos para la extracción del almidón a partir de diferentes plantas que almacenan almidón, p.ej. en ``Starch: Chemistry and Technology [Almidón: química y tecnología] (coordinadores de edición) Whistler, BeMiller und Paschall (1994), 2ª edición, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; véase p.ej. el capítulo XII, páginas 412-468: almidones de maíz y de sorgo: producción; de Watson; capítulo XIII, páginas 469-479: almidones de tapioca, arrurruz y sagú: producción; de Corbishley y Miller; capítulo XIV, páginas 479-490: almidón de patata: producción y utilizaciones; de Mitch; capítulo XV, páginas 491 a 506: almidón de trigo: producción, modificación y utilizaciones; de Knight y Oson; y capítulo XVI, páginas 507 a 528: almidón de arroz: producción y utilizaciones; de Rohmer y Klem; almidón de maíz: Eckhoff y colaboradores, Cereal Chem. 73 (1996), 54-57, la extracción de un almidón de maíz a la escala industrial se consigue por regla general mediante la denominada molienda en húmedo (en inglés "wet milling")). Los dispositivos, que se utilizan habitualmente en el caso de los procedimientos para la extracción de un almidón a partir de un material de plantas son aparatos separadores, decantadores, hidrociclones, secadores por atomización y secadores de capa fluidizada.

Los almidones obtenibles a partir de las plantas, las células de las plantas o las partes de las plantas conformes al invento pueden ser modificadas posteriormente de acuerdo con procedimientos conocidos para un experto en la especialidad, y se adecuan en una forma no modificada o modificada para diferentes utilizaciones en el sector alimentario o no alimentario.

Fundamentalmente, la posibilidad de empleo del almidón se puede subdividir en dos grandes sectores. Uno de los sectores abarca los productos de hidrólisis del almidón, principalmente glucosa y eslabones de glucanos, que se obtienen por medio de procedimientos enzimáticos o químicos. Ellos sirven como sustancia de partida para otras modificaciones químicas y otros procesos, tales como una fermentación. Para obtener una reducción de los costos, pueden ser importantes en este contexto la sencillez y la realización barata de un procedimiento de hidrólisis. Actualmente, éste discurre en lo esencial por una vía enzimática mediando utilización de una amiloglucosidasa. Se podría imaginar un ahorro de los costos mediante el empleo de una menor cantidad de enzimas. Una modificación estructural del almidón, p.ej. un aumento del área de superficie del grano o una estructura estérea, que limita la accesibilidad para las enzimas empleadas, podría realizar esta función.

El otro sector, en el que se utiliza el almidón a causa de su estructura polimérica como un denominado almidón natural, se clasifica en otros dos sectores de empleo adicionales:

1. Industria alimentaria

Un almidón es una sustancia aditiva clásica para muchos alimentos, en los cuales él toma a su cargo en lo esencial la función de la aglutinación y fijación de sustancias aditivas acuosas, o respectivamente provoca una elevación de la viscosidad o sino una formación aumentada de gel. Unas importantes características de propiedades son los comportamientos de fluidez y de sorción, las temperaturas de hinchamiento y engrudamiento, la viscosidad y el rendimiento de espesamiento, la solubilidad del almidón, la transparencia y la estructura del engrudo, las estabilidades frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la capacidad para la formación de películas, la estabilidad frente a la congelación y la descongelación, la digestibilidad así como la capacidad para formar compuestos complejos p.ej. con iones inorgánicos u orgánicos.

2. Industria no alimentaria

En este gran sector, el almidón se puede emplear como una sustancia auxiliar para diferentes procesos de producción o respectivamente como una sustancia aditiva en productos técnicos. En el caso de la utilización del almidón como sustancia auxiliar, hay que mencionar aquí en particular las industrias del papel y del cartón. El almidón sirve en este contexto en primer término para la retardación (retención de materiales sólidos), la aglutinación de partículas de materiales de carga y materiales finos, como material de consolidación y para la deshidratación. Además de ello se aprovechan las favorables propiedades del almidón en lo que se refiere a la rigidez, a la dureza, al sonido, al tacto, al brillo, a la lisura, a la resistencia a la disgregación así como a las superficies.

2.1 Industria del papel y del cartón

Dentro del proceso de producción de papel hay que establecer diferencia entre cuatro sectores de uso, a saber la superficie, el estucado, la masa y la atomización.

Los requisitos en cuanto al almidón en lo que se refiere al tratamiento superficial son en lo esencial un alto grado de blancura, una viscosidad adaptada, una alta estabilidad de la viscosidad, una buena formación de películas, así como una pequeña formación de polvo fino. En el caso de la utilización en el estucado desempeña un importante cometido el contenido de materiales sólidos, una viscosidad adaptada, una alta capacidad de fijación y aglutinación así como una alta afinidad para los pigmentos. Como adición a la masa tiene importancia una distribución rápida, uniforme y exenta de pérdidas, una alta estabilidad mecánica y una retención total en el flujo de papel. En el caso del empleo del almidón en el sector de atomización y rociada tienen importancia asimismo un contenido adaptado de materiales sólidos, una alta viscosidad así como una alta capacidad de fijación.

2.2 Industria de los pegamentos

Un gran sector de empleo de los almidones consiste en la industria de los pegamentos, en donde las posibilidades de empleo se clasifican en cuatro sectores parciales: la utilización como una cola pura de almidón, la utilización en el caso de colas de almidón tratadas con agentes químicos especiales, la utilización del almidón como una adición a resinas sintéticas y a dispersiones poliméricas, así como la utilización de almidones como agentes extendedores para pegamentos sintéticos. Un 90% de los pegamentos constituidos sobre la base de almidón se emplean en los sectores de producción de cartón ondulado, producción de sacos de papel, bolsas y bolsitas o cucuruchos, producción de materiales compuestos para papel y aluminio, producción de cartonajes, y colas humectables renovadamente para sobres de cartas, sellos de correo, etc.

2.3 Industria de materiales textiles y de agentes para el cuidado de materiales textiles

Un gran sector de empleo para los almidones como agente auxiliar y sustancia aditiva es el sector de la producción de materiales textiles y agentes para el cuidado de materiales textiles. Dentro de la industria textil hay que establecer diferencia entre los siguientes cuatro sectores de empleo: El empleo del almidón como agente de apresto, es decir como sustancia auxiliar para el alisamiento y la consolidación del comportamiento de trepa para la protección contra las fuerzas de tracción que actúan al tejer en telar, así como para la elevación de la resistencia a la abrasión al tejer en telar, un almidón como agente para el apresto de materiales textiles, sobre todo después de unos tratamientos previos que empeoran la calidad, tales como blanqueo, tinción, etc., un almidón como agente de espesamiento en el caso de la producción de pastas de tinción para la evitación de difusiones de colorantes así como un almidón como adición a agentes de urdidura para hilos de costura.

2.4 Industria de los materiales de construcción

El cuarto sector de empleo es la utilización de los almidones como una adición en el caso de materiales de construcción. Un ejemplo es la producción de planchas de cartón yeso, en el que el almidón mezclado en la papilla de yeso se engruda con el agua, se difunde junto a la superficie de la plancha de yeso y allí fija el cartón a la plancha. Otros sectores de empleo son la adición a las mezclas para fibras de limpieza y minerales. En el caso de un hormigón transportable, el almidón se puede emplear con el fin de retrasar el fraguado.

2.5 Estabilización de los suelos

Otro mercado para el almidón se ofrece en el caso de la producción de agentes para la estabilización de los suelos, que se emplean en el caso de movimientos de tierra artificiales para la protección provisional de partículas del suelo frente al agua. Unos productos combinados a base del almidón y de unas emulsiones de polímeros se han de equiparar de acuerdo con los actuales conocimientos en cuanto a su efecto de disminución de la erosión y del encostramiento a los productos hasta ahora empleados, pero en cuanto al precio están situados manifiestamente por debajo de
éstos.

2.6 Empleo en el caso de agentes fitoprotectores y fertilizantes

Modificación de las propiedades específicas de las formulaciones. Así, el almidón se puede emplear para la disminución de la mojadura de agentes fitoprotectores y fertilizantes, para la liberación dosificada de las sustancias activas, para la transformación de sustancias activas líquidas, volátiles y/o malolientes en sustancias moldeables, estables y microcristalinas, para la mezcladura de compuestos incompatibles y para la prolongación de la duración de la acción por medio de una disminución de la descomposición.

2.7 Fármacos, medicina e industria cosmética

Un sector adicional de empleo consiste en el sector de los fármacos, de la medicina y de la industria cosmética. En la industria farmacéutica el almidón se puede emplear como agente aglutinante para tabletas o para la dilución de agentes aglutinantes en cápsulas. Además el almidón puede servir como agentes disgregantes de tabletas, puesto que ellas absorben líquido después de la deglución y después de un corto tiempo se hinchan en tal grado que la sustancia activa es puesta en libertad. Los polvos para espolvorear lubricantes y vulnerarios medicinales son otras posibilidades de utilización. En el sector de la industria cosmética, el almidón se puede emplear por ejemplo como soporte para sustancias aditivas a polvos para espolvorear, tales como perfumes y ácido salicílico. Un sector de utilización relativamente grande para el almidón se encuentra en las pastas dentífricas.

2.8 Adición de almidones a carbones y briquetas

Un sector de empleo aconseja al almidón como sustancia aditiva al carbón y a las briquetas. El carbón puede ser aglomerado o respectivamente briqueteado con alto valor cuantitativo con una adición de almidón, con lo cual se impide una desintegración prematura de las briquetas. La adición del almidón se encuentra situada en el caso de carbón para parrillas de asar entre 4 y 6%, en el caso de un carbón con poder calorífico aumentado entre 0,1 y 0,5%. Por lo demás, el almidón se adecua como agente aglutinante, puesto que mediante su adición al carbón y las briquetas se puede disminuir de manera manifiesta la expulsión de sustancias nocivas.

2.9 Preparación de lodos de minerales y de carbón

El almidón se puede emplear además en el caso del tratamiento de lodos de minerales y de carbón como agente de floculación.

2.10 Sustancia auxiliar para fundición

Otro sector de empleo se encuentra como un aditivo para sustancias auxiliares de fundición. En el caso de diferentes procedimientos de fundición y moldeo por colada se necesitan unos machos que se producen a base de arenas mezcladas con agentes aglutinantes. Como agente aglutinante se emplea hoy en día predominantemente una bentonita, que se ha mezclado con unos almidones modificados, en la mayor parte de los casos con almidones hinchables.

La finalidad de la adición de un almidón es la elevación de la resistencia a la fluidez así como el mejoramiento de la resistencia de fijación. Además de esto, los almidones hinchables pueden presentar otros requisitos técnicos de producción, tales como los de ser dispersables en agua fría, rehidratables, bien miscibles en arena y presentar una alta capacidad de fijación de agua.

2.11 Empleo en la industria de los cauchos

En la industria de los cauchos el almidón se puede emplear para el mejoramiento de las calidades técnicas y ópticas. Los motivos son en este caso el mejoramiento del brillo superficial, el mejoramiento del tacto y del aspecto exterior, para esto el almidón, antes de la vulcanización en frío, es esparcido sobre las superficies vulcanizadas pegajosas de materiales de caucho, así como el mejoramiento de la imprimibilidad del caucho.

2.12 Producción de materiales sustitutivos de los cueros

Una posibilidad adicional de uso y venta de los almidones modificados consiste en la producción de materiales sustitutivos de los cueros.

2.13 Almidón en polímeros sintéticos

En el sector de los materiales sintéticos, se delinean los siguientes sectores de empleo: La incorporación y fijación de productos secuenciales del almidón en el proceso de elaboración (el almidón es solamente un material de carga, no existe ninguna fijación directa entre un polímero sintético y un almidón) o alternativamente, la incorporación y fijación de productos secuenciales del almidón en la producción de polímeros (un almidón y un polímero pasan a formar una fijación firme).

La utilización del almidón como material de carga puro no es competitiva en comparación con las otras sustancias u otros materiales tales como un talco. Se observa un cuadro distinto, cuando pasan a ser importantes las propiedades específicas de los almidones y con ello se modifica manifiestamente el perfil de propiedades de los productos finales. Un ejemplo de esto es la utilización de productos de almidones en la elaboración de materiales termoplásticos, tales como los de polietileno. En este caso, el almidón y el polímero sintético se combinan mediante expresión o extrusión concomitante en la relación de 1:1 para formar una tanda patrón (en inglés "master batch"), a partir de la cual se pueden producir diversos productos con un polietileno granulado mediando utilización de técnicas habituales de procesos. Mediante la incorporación y aglutinación del almidón en láminas de polietileno se puede conseguir una permeabilidad aumentada a las sustancias en el caso de cuerpos huecos, una permeabilidad mejorada al vapor de agua, un comportamiento antiestático mejorado, un comportamiento antiapelmazante mejorado, así como una aptitud mejorada para la impresión con tintas acuosas.

Otra posibilidad se encuentra en el uso del almidón en espumas de poliuretanos. Con la adaptación de los derivados de almidones así como mediante la optimización técnica de procesos es posible regular de una manera deliberada la reacción entre los polímeros sintéticos y los grupos hidroxi de los almidones. El resultado de esto son unas láminas de poliuretanos, que mediante el uso de un almidón adquieren los siguientes perfiles de propiedades: una disminución del coeficiente de dilatación térmica, una disminución del comportamiento de contracción, un mejoramiento del comportamiento frente a compresión y tensiones, un aumento de la permeabilidad al vapor de agua sin ninguna modificación de la absorción de agua, una disminución de la inflamabilidad y de la densidad de hendiduras, ningún escurrimiento de partes combustibles, ausencia de halógenos y un envejecimiento disminuido. Unas desventajas que actualmente están todavía presentes, son una resistencia disminuida a la compresión así como una resistencia disminuida frente a los golpes.

El desarrollo de productos ya no se restringe entre tanto solamente a láminas. También se pueden producir unos productos sólidos de materiales sintéticos, tales como macetas, planchas y cubetas, con un contenido de almidón situado por encima de un 50%. Además, se han de valorar favorablemente ciertas mezclas de almidones y polímeros, puesto que ellas presentan una degradabilidad biológica muchísimo más alta.

Una importancia extraordinaria la han adquirido además los polímeros por injerto con almidón, a causa de su extremada capacidad de fijación de agua. Éstos son productos con una cadena principal a base de un almidón y de un retículo lateral de un monómero sintético, injertado de acuerdo con el principio del mecanismo de encadenamiento de radicales. Los polímeros de injerto con almidón, hoy en día disponibles, se distinguen por una mejor capacidad de fijación y retención de hasta 1.000 g de agua por cada g de almidón, junto con una alta viscosidad. Los sectores de uso para estos superabsorbentes se han propagado grandemente en los últimos años y se encuentran en el sector de la higiene, con productos tales como pañales y colchones, así como en el sector agrícola, p.ej. en el caso de granulaciones de simientes.

Son decisivos para el empleo de los nuevos almidones modificados por tecnología genética, por una parte, la estructura, el contenido de agua, el contenido de proteínas, el contenido de lípidos, el contenido de fibras, el contenido de cenizas y de fosfato, la relación entre amilosa y amilopectina, la distribución de masas moleculares, el grado de ramificación, el tamaño y la forma de los granos así como la cristalinidad y, por otra parte, también las propiedades que desembocan en las siguientes características: el comportamiento de fluidez y de sorción, la temperatura de engrudamiento, la viscosidad, el rendimiento de espesamiento, la solubilidad, la estructura y la transparencia de los engrudos, la estabilidad frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la formación de geles, la estabilidad frente a congelación y descongelación, la formación de compuestos complejos, la fijación de yodo, la formación de películas, la fuerza adhesiva, la estabilidad frente a enzimas, la digestibilidad y la reactividad.

La producción de almidones modificados mediante intervenciones de tecnología genética en una planta transgénica puede modificar, por una parte, las propiedades del almidón obtenido a partir de la planta, en el sentido de que ya no aparecen como necesarias otras modificaciones adicionales mediante procedimientos químicos o físicos. Por otra parte, los almidones modificados mediante procedimientos de tecnología genética pueden ser sometidos a otras modificaciones químicas y/o físicas adicionales, lo cual conduce a otros mejoramientos adicionales de la calidad para determinados de los sectores de empleo que arriba se han descrito. Estas modificaciones químicas y físicas son fundamentalmente conocidas. En particular se trata en este contexto en unas modificaciones por:

- tratamiento por calor

- tratamiento por ácidos

- producción de éteres de almidones

: éteres alquílicos, éteres O-alílicos, éteres hidroxialquílicos, éteres O-carboxilmetílicos de almidones, éteres de almidones que contienen N, éteres de almidones que contienen P, éteres de almidones que contienen S

- producción de almidones reticulados

- producción de polímeros de injerto con almidones

- oxidación y

- esterificaciones, que conducen a la formación de almidones tratados con fosfato, nitrato, sulfato, xantato, acetato y citrato. Otros ácidos orgánicos se pueden emplear asimismo para la esterificación.

En otra forma de realización adicional, el presente invento se refiere a partes de plantas cosechables de plantas conformes al invento, tales como frutos, raíces almacenadoras, raíces, flores, capullos, vástagos o troncos, preferiblemente semillas o tubérculos, conteniendo estas partes cosechables las células de plantas conformes al invento.

En un aspecto adicional, el presente invento se refiere a una región reguladora, que de un modo natural codifica la transcripción de una molécula de ácido nucleico conforme al invento que arriba se ha descrito, que codifica una enzima ramificadora procedente de bacterias del género Neisseria, y que controla en células bacterianas, conteniendo la región reguladora una secuencia de nucleótidos que se selecciona entre el conjunto que se compone de:

(a): secuencias de nucleótidos que comprenden los nucleótidos 1 a 169, de la secuencia de nucleótidos que se representa en SEQ ID NO: 1, y

(b): la secuencia de nucleótidos de la región reguladora, que está contenida en la inserción en el plásmido DSM 12425.

En el marco del presente invento se entiende por el concepto de "región reguladora" una región que influye sobre la especificidad y/o sobre la magnitud de la expresión de una secuencia de gen, por ejemplo de tal manera que la expresión aparece como respuesta a una excitación externa determinada o en un momento determinado. Tales regiones reguladoras están situadas por regla general en una zona, que es designada como promotor. El concepto de "promotor" comprende, en el marco del presente invento, unas secuencias de nucleótidos que son necesarias para la iniciación de la transcripción, es decir para la fijación de la polimerasa de ARN, y puede comprender p.ej. también la(s) caja(s) TATA.

Los nucleótidos 1 a 169 de la secuencia representada en SEQ ID NO:1 pertenecen a la región reguladora del gen de la enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans. Unas putativas secuencias de promotores se encuentran en las posiciones 36 a 44, 51 a 55 y 157 a 162, tratándose en el caso de la secuencia "GGGAGA" posiblemente de una secuencia de Shine-Dalgarno.

La presente divulgación se refiere asimismo a moléculas de ADN recombinantes, que comprenden una región reguladora conforme al invento.

De manera preferida, en una de tales moléculas de ADN recombinantes la región reguladora está unida con una secuencia de ADN heteróloga. En este contexto, la expresión "heteróloga" significa que una tal secuencia no está unida de un modo natural con la región reguladora.

Además, una de tales moléculas de ADN recombinantes puede contener otros elementos reguladores adicionales, que tienen importancia para la transcripción y/o la traducción en el seno de células bacterianas, p.ej. intensificadores de la transcripción o de la traducción.

Además, la presente divulgación se .refiere a unas células anfitrionas, que han sido transformadas con una región reguladora conforme al invento, con una molécula de ADN recombinante o con un vector.

La presente divulgación se refiere además a unos vectores, que contienen una región reguladora conforme al invento o una molécula de ADN recombinante conforme al invento. Tales vectores comprenden p.ej. también plásmidos, cósmidos, bacteriófagos, virus, etc., que habitualmente se utilizan para métodos de tecnología molecular.

La enzima ramificadora conforme al invento se puede utilizar en un procedimiento in vitro para la preparación de \alpha-1,4 glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 mediando utilización del substrato sacarosa y una combinación de enzimas a base de una amilosacarasa y de la enzima ramificadora. Por un "procedimiento in vitro" se entiende en el marco del presente invento una conversión química, es decir una reacción que transcurre fuera de un organismo vivo. El concepto "in vitro" significa en particular que el procedimiento conforme al invento transcurre dentro de un recipiente de reacción. De manera especialmente preferida, el concepto "in vitro" significa que la reacción tiene lugar en ausencia de células vivas.

Una ventaja de un tal procedimiento consiste en que es posible regular el grado de ramificación y que mediante esta regulación las propiedades del glucano sintetizado se pueden adaptar a la respectiva utilización planificada del glucano. Así existe posiblemente en el sector de la utilización como material de encapsulación en el sector químico, la posibilidad de conseguir, por medio de un ajuste deliberado del grado de ramificación, una optimización de la velocidad de liberación de sustancias activas como medicamentos.

En conexión con el procedimiento in vitro antes mencionado, se entiende como una amilosacarasa (sacarosa: 1,4-\alpha-D-glucano 4-\alpha-glucosiltransferasa, E.C. 2.4.1.4.), una enzima que cataliza la conversión química de la sacarosa en \alpha-1,4-glucanos insolubles en agua y fructosa. Para esta enzima se propone el siguiente esquema de reacción:

Sacarosa + (\alpha-1,4-D-glucano)_{n} \rightarrow D-fructosa+(\alpha-1,4-D-glucano)_{n}+1.

En este caso se trata de una reacción de transglucosilación. Los productos de esta reacción son \alpha-1,4-glucanos insolubles en agua y fructosa. La transglucosilación puede tener lugar en ausencia o en presencia de moléculas aceptoras. Tales moléculas aceptoras pueden ser p.ej. polisacáridos tales como p.ej. maltooligosacáridos, dextrina o glicógeno. Cuando una de tales moléculas aceptoras es un \alpha-1,4-glucano oligómero lineal, el producto resultante de la reacción de transglucosilación mediante la amilosacarasa es un \alpha-1,4-glucano lineal polímero. Cuando la reacción de transglucosilación se lleva a cabo mediante la amilosacarasa en ausencia de aquellas moléculas aceptoras, se obtiene un glucano con una molécula de fructosa terminal. Dentro del marco de la presente divulgación se designa como \alpha-1,4-glucanos a todos los productos obtenibles mediante una amilosacarasa, en ausencia o presencia de moléculas aceptoras.

Para el mecanismo de reacción de una transglucosilación mediante una amilosacarasa en ausencia de una molécula aceptora, se propone el siguiente esquema de reacción:

G-F + n(G-F) \rightarrow G_{n}-G-F + nF,

realizándose que G-F es sacarosa, G es glucosa, F es fructosa y G_{n}-G-F es un \alpha-1,4-glucano.

Para el mecanismo de reacción de una transglucosilación mediante una amilosacarasa en presencia de una molécula aceptora se propone el siguiente esquema de reacción:

mG-F + G_{n} \rightarrow G_{n}-m + mF,

realizándose que G_{n} es una molécula aceptora de polisacáridos, G_{n}-m es un polisacárido que se compone de un aceptor más una cadena de \alpha-1,4-glucano adyacentemente sintetizada, G-F es sacarosa, F es fructosa y G es glucosa.

Para la transglucosilación mediante una amilosacarasa no se necesitan cofactores de ningún tipo.

Para la realización del procedimiento son apropiadas en principio todas las amilosacarasas que catalizan la síntesis de \alpha-1,4-glucanos lineales partiendo de sacarosa.

Se conocen hasta ahora unas amilosacarasas procedentes de algunas especies de bacterias, en particular principalmente procedentes de especies de Neisseria (MacKenzie y colaboradores, Can. J. Microbiol. 24 (1978), 357-362).

De manera preferida se utiliza por lo tanto una amilosacarasa de origen procariótico. Se conocen hasta ahora por ejemplo amilosacarasas procedentes de Neisseria perflava (Okada y Hehre, J. Biol. Chem. 249 (1974), 126-135; MacKenzie y colaboradores, Can. J. Microbiol. 23 (1977), 1303-1307) o de Neisseria canis, Neisseria cinerea, Neisseria denitrificans, Neisseria sicca y Neisseria subflava (MacKenzie y colaboradores, Can. J. Microbiol. 24 (1978, 357-362)). Además, el documento de solicitud de patente internacional WO 95/31553 describe una amilosacarasa procedente de Neisseria polysaccharea. De manera especialmente preferida se utiliza una amilosacarasa secretada de un modo natural por un procariota.

En una forma preferida de realización del procedimiento se utiliza una amilosacarasa procedente de Neisseria polysaccharea.

La enzima, que es expresada en Neisseria polysaccharea, es extremadamente estable, se fija muy firmemente a los productos de la polimerización y es inhibida de una manera competitiva por el producto de reacción fructosa (MacKenzie y colaboradores, Can. J. Microbiol. 23 (1977)1303-1307). En el caso de la especie de Neisseria, Neisseria polysaccharea, se secreta la amilosacarasa (Riou y colaboradores, Can. J. Microbiol. 32 (1986), 909-911), al contrario de lo cual en otras especies de Neisseria ésta permanece en la célula. De manera muy especialmente preferida se utiliza una amilosacarasa con la secuencia de aminoácidos indicada en Seq ID No. 5.

En otra forma de realización preferida se utiliza una amilosacarasa purificada.

Como una amilosacarasa purificada se entiende en este contexto una enzima que está ampliamente libre de componentes celulares de las células, en las cuales es sintetizada la proteína. De manera preferida, el concepto de "amilosacarasa purificada" significa una amilosacarasa que presenta un grado de pureza de por lo menos un 70%, de manera preferida de por lo menos un 85% y de manera especialmente preferida de por lo menos un 90%.

El empleo de una proteína purificada para la preparación de \alpha-1,4-glucanos ofrece diferentes ventajas. En comparación con los procedimientos, que trabajan con unos extractos proteínicos parcialmente purificados, el medio de reacción del procedimiento conforme al invento no contiene ningún resto de la cepa de producción (microorganismo), que se utiliza con el fin de purificar la proteína o producirla por tecnología genética.

Además, mediante el empleo de la proteína purificada se pueden observar ciertas ventajas para el uso en las industrias alimentaria y farmacéutica. Mediante la composición definida del medio de reacción, y que ha sido liberada de todos lo componentes innecesarios, también el producto es definido con mayor exactitud en sus componentes. Esto conduce a un procedimiento de autorización esencialmente menos extenso para estos productos producidos por biotecnología en las industrias alimentaria y farmacéutica, en particular puesto que estos productos no deberían tener ninguna traza de un organismo transgénico.

En el marco del presente invento se entiende como una enzima ramificadora (\alpha-1,4-glucano: \alpha-1,4-glucano 6-glucosiltransferasa, E.C. 2.4.1.18) una proteína que cataliza una reacción de transglucosilación, en la que unos enlaces en \alpha-1,4- de un donante de \alpha-1,4-glucano son hidrolizados y las cadenas de \alpha-1,4-glucano que se liberan en este caso son transferidas a una cadena de aceptor de \alpha-1,4-glucano y en este contexto son transformados en enlaces \alpha-1,6.

En una forma preferida de realización del procedimiento in vitro que se ha descrito, se utiliza una enzima ramificadora purificada. Por una enzima ramificadora purificada se entiende en este contexto una enzima que está ampliamente exenta de componentes celulares de las células, en las que es sintetizada la proteína. De manera preferida el concepto de "enzima ramificadora purificada" significa que la enzima tiene un grado de pureza de por lo menos un 70%, de manera preferida de por lo menos un 85% y de manera especialmente preferida de por lo menos un 90%.

Además, en el procedimiento in vitro que se ha descrito, se utilizan de manera preferente unas proteínas producidas por vía recombinante. Por este concepto se entienden unas proteínas, que se habían producido mediante el recurso de que en una célula anfitriona se incorpora una secuencia de ADN que codifica la respectiva proteína y allí se lleva a expresión. La proteína puede luego ser recuperada a partir de la célula anfitriona y/o a partir del medio de cultivo. La célula anfitriona es en este caso de manera preferente una bacteria o un protista (p.ej. hongos, en particular levaduras, algas) tal como se define p.ej. en la obra de Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" [microbiología general] (editorial Georg Thieme 1985, 1-2). De manera especialmente preferida, las proteínas se secretan a partir de la célula anfitriona. La producción de tales células anfitrionas para la producción de una proteína recombinante puede efectuarse de acuerdo con los métodos conocidos para un experto en la especialidad. Una recopilación acerca de diferentes sistemas de expresión se encuentra p.ej. en la cita Methods in Enzymology (métodos en enzimología) 153 (1987), 385-516, y en Bitter y colaboradores, (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544), Sawers y colaboradores, Applied Microbiology and Biotechnology (microbiología y biotecnología aplicadas) 46 (1996), 1-9, Billman-Jacobe, Current Opinion in Biotechnology (opinión actual en biotecnología) 7 (1996), 500-504, Hockney, Trends in Biotechnology (tendencias en biotecnología) 12 (1994), 456-463, y Griffiths y colaboradores, Methods in Molecular Biology (métodos en biología molecular) 75 (1997), 427-440.

Se describen vectores de expresión en la bibliografía en gran extensión. Ellos contienen, junto con un gen marcador de selección y con un origen de replicación que asegura la replicación en el anfitrión escogido, por regla general un promotor bacteriano o vírico así, como en la mayor parte de los casos una señal de terminación para la transcripción. Entre el promotor y la señal de terminación se encuentran por lo menos un sitio de corte por restricción o un poliengarzador, que hacen posible la inserción de una secuencia de ADN codificadora. Como secuencia de promotor se puede utilizar, siempre que ella sea activa en el organismo anfitrión escogido, la secuencia de ADN que regula de un modo natural la transcripción del correspondiente gen. Esta secuencia, sin embargo, puede ser intercambiada por otras secuencias de promotores. Se pueden utilizar tanto unos promotores, que dan lugar a una expresión constitutiva del gen, como también unos promotores inducibles, que permiten una regulación deliberada de la expresión del gen conectado a continuación. Unas secuencias de promotores bacterianos y víricos con estas propiedades se describen detalladamente en la bibliografía. Unas secuencias reguladoras para la expresión en microorganismos (p.ej. E. coli, S. cerevisiae) se han descrito suficientemente en la bibliografía. Unos promotores, que permiten una expresión especialmente fuerte del gen conectado a continuación son p.ej. el promotor T7 (Studier y colaboradores, Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), los promotores lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer y colaboradores, en Rodríguez y Chamberlin (coordinadores de edición), promotores, estructura y función; Praeger, Nueva York, (1982), 462-481; DeBoer y colaboradores Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25), \lambdap1, rac (Boros y colaboradores, Gene 42 (1986), 97-100). Por regla general, las cantidades de proteínas alcanzan su cénit desde el centro hacia el final de la fase logarítmica del ciclo de crecimiento del microorganismo. Para la síntesis de proteínas se utilizan por lo tanto de manera preferida unos promotores inducibles. Éstos conducen con frecuencia a unos rendimientos más altos de la proteína que los promotores constitutivos. La utilización de promotores constitutivos fuertes conduce, a través de la transcripción y la traducción constante de un gen clonado, con frecuencia a que se pierda energía para otras esenciales funciones de las células y con ello se decelere el crecimiento de las células. (Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie biotecnología molecular) (1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin Oxford página 342.). Con el fin de alcanzar un valor óptimo de la cantidad de proteína, se usa por lo tanto con frecuencia un procedimiento en dos etapas. En primer lugar, las células anfitrionas son cultivadas en condiciones óptimas hasta llegar a una densidad celular relativamente alta. En la segunda etapa, se induce luego la transcripción, según sea el tipo del promotor empleado. Es especialmente apropiado en este contexto un promotor tac inducible por lactosa o IPTG (= isopropil-\beta-D-tiogalacto-piranósido) (deBoer y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25). Se describen asimismo en la bibliografía señales de terminación para la transcripción.

La transformación de la célula anfitriona con el ADN que codifica una correspondiente proteína, se puede llevar a cabo por regla general de acuerdo con métodos clásicos, tal como p.ej. se describen en Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual [clonación molecular: un manual de curso de laboratorio], 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Press, Nueva York). La cultivación de la célula anfitriona se efectúa en unos medios nutritivos, que satisfacen las necesidades de la célula anfitriona que en cada caso se utiliza, en particular tomando en consideración el valor del pH, la temperatura, la concentración de sal, la aireación, los antibióticos, las vitaminas, los elementos trazas, etc.

La purificación de la enzima producida por las células anfitrionas puede efectuarse de acuerdo con métodos habituales de purificación, tales como los de precipitación, cromatografía con intercambio de iones, cromatografía de afinidad, filtración a través de gel, cromatografía de fase inversa HPLC, etc.

Por medio de una modificación de los ADN expresados en las células anfitrionas se puede producir en la célula anfitriona un polipéptido, que en virtud de determinadas propiedades puede ser aislado con mayor facilidad a partir del medio de cultivo. Así, existe la posibilidad de expresar la proteína que se ha de expresar como una proteína de fusión con una secuencia adicional de polipéptido, cuyas propiedades específicas de fijación hacen posible el aislamiento de la proteína de fusión por medio de una cromatografía de afinidad. (p.ej. Hopp y colaboradores Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93).

En una forma preferida de realización del procedimiento in vitro que se ha descrito, se utilizan unas enzimas que se habían producido por vía recombinante y habían sido secretadas por la célula anfitriona en el medio nutritivo, de manera tal que no se necesita ninguna disgregación de células ni ninguna purificación adicional de la proteína, puesto que la proteína secretada se puede recuperar a partir del material sobrenadante. Para la eliminación de componentes residuales del medio de cultivo se pueden emplear unos métodos habituales en la técnica de procedimientos, tales como p.ej. los de diálisis, ósmosis inversa, métodos de cromatografía, etc. Lo mismo es válido también para el aumento de concentración de la proteína secretada dentro del medio de cultivo. La secreción de proteínas mediante microorganismos es mediada normalmente por péptidos de señal en el extremo terminal de N (secuencia de señal, péptido director (leader)). Unas proteínas con esta secuencia de señal pueden atravesar la membrana celular del microorganismo. Una secreción de proteínas se puede conseguir mediante el recurso de que la secuencia de ADN, que codifica este péptido de señal, es adosada a la correspondiente región que codifica la enzima.

Es preferido un péptido de señal presente de un modo natural, por ejemplo el de la amilosacarasa procedente de Neisseria polysaccharea.

De manera muy especialmente preferida el péptido de señal es la \alpha-CGTase procedente de Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler y colaboradores J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291) o un péptido de señal, tal como es codificado por los nucleótidos 11529-11618 de la secuencia que es accesible en el banco de genes GenBank bajo el número de acceso X86014.

Alternativamente, las enzimas utilizadas en el procedimiento in vitro que se ha descrito pueden haber sido producidas también mediando utilización de un sistema de transcripción y traducción in vitro, que conduce a la expresión de las proteínas, sin el empleo de microorganismos.

En otra forma preferida de realización adicional, la amilosacarasa y/o la enzima ramificadora están inmovilizadas junto a un material de soporte.

Una inmovilización de las enzimas ofrece la ventaja de que las enzimas se pueden recuperar y utilizar múltiples veces como catalizadores de la reacción de síntesis, de una manera sencilla a partir de la mezcla de reacción. Puesto que la purificación de enzimas presenta por regla general intensos costos y un intenso consumo de tiempo, una inmovilización y una reutilización hacen posible un considerable ahorro de costos. Una ventaja adicional la constituye el grado de pureza de los productos de reacción, que no contienen ningún residuo de proteínas.

Para la inmovilización de proteínas están a disposición un gran número de materiales de soporte, pudiendo efectuarse el acoplamiento al material de soporte a través de enlaces covalentes o no covalentes (para una recopilación véase: Methods in Enzymology 135, 136, 137). Una amplia propagación como material de soporte la tienen p.ej. agarosa, un alginato, una celulosa, una poli(acrilamida), una sílice o un nylon.

En otra forma preferida de realización del procedimiento se utiliza un extracto enzimático en bruto (parcialmente purificado) de una amilosacarasa y/o de la enzima ramificadora conforme al invento. Como un extracto en bruto se entiende en este contexto una preparación de amilosacarasa y/o de enzima ramificadora con un grado de pureza disminuido al contrario que una enzima purificada (véanse por ejemplo los Ejemplos 5 y 6).

En una forma preferida de realización, en el caso del procedimiento in vitro que se ha descrito, la modificación del grado de ramificación de los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 se consigue mediante la modificación de la relación de actividades proteínicas de la enzima ramificadora a la de la amilosacarasa. Por la relación de actividades proteínicas se entiende en este caso la relación la relación de las actividades proteínicas empleadas (u) de la amilosacarasa a la de la enzima ramificadora. La determinación de las actividades proteínicas se puede efectuar en este contexto tal como se describe en los Ejemplos 7 y 8. En el caso de la realización del procedimiento (véase el Ejemplo 9) se puede utilizar una relación de actividades proteínicas (unidades de amilosacarasa/unidades de la enzima ramificadora) situada en el intervalo de 1/4.000 a 2.000/1.

En una forma de realización preferida, la relación de actividades proteínicas está situada en un intervalo de 1/1.500 a 1.500/1.

En otra forma preferida de realización adicional, la relación de actividades proteínicas está situada en un intervalo de 1/800 a 1.300/1.

En una forma de realización especialmente preferida, la relación de actividades proteínicas está situada en un intervalo de 1/400 a 1.200/1.

Por medio de la modificación de la relación de actividades proteínicas es posible la modificación del grado de ramificación de los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6-que se han obtenido, desde 0,05% a 35%.

En una forma de realización preferida es posible la modificación del grado de ramificación en la posición 6 de los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 que se han obtenido, de 0,15% a 25%, en particular de 0,20% a 15% y de manera muy especialmente preferida de 0,25% a 12%.

Con ayuda del procedimiento conforme al invento es posible en particular producir unos productos que tienen un grado de ramificación más alto que el glicógeno.

Por el concepto de grado de ramificación se entiende en el marco del presente invento la proporción media de ramificaciones en la posición O-6 en comparación con todas las unidades de glucosa unidas de otra manera distinta, que se puede determinar por medio de un análisis de la metilación (véase el Ejemplo 10).

En otra forma preferida de realización adicional, en el caso del procedimiento in vitro que se ha descrito, la modificación del peso molecular del producto se consigue mediante la modificación de la relación de actividades proteínicas de la enzima ramificadora a la de la amilosacarasa. En este caso, es particularmente posible que se modifique la relación de actividades proteínicas durante la reacción, que conduce a la síntesis de los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6.

En otra forma preferida de realización adicional del procedimiento in vitro que se ha descrito, está previsto que el procedimiento se lleve a cabo con unas diversas concentraciones de sacarosa. Es posible en principio la realización en un intervalo de concentraciones de preferiblemente 1% a 80% de sacarosa (en peso/volumen), de manera preferida en un intervalo de 5% a 50% y de manera especialmente preferida en un intervalo de 10% a 40%.

En conexión con el presente invento, el peso molecular es determinado mediante experimentos de dispersión de la luz (Light Scattering from Polymer solutions [dispersión de la luz a partir de soluciones de polímeros], coordinador de edición: Huglin. M. B., Academic Press, London, 1972) de acuerdo con Berry (J. Chem. Phys. 44 (1966), páginas 4550 y siguientes).

Con ayuda del procedimiento in vitro que se ha descrito, es posible en particular ajustar en el intervalo de 1.000 a 3.000 x 10^{6} el peso molecular de los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 que se han preparado mediante el procedimiento. De manera preferida, los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 que se han preparado, tienen un peso molecular situado en el intervalo de 100.000 a 1.500 x 10^{6}, en particular en el intervalo de 100.000 a 1.000 x 10^{6}, de manera preferida en el intervalo de 262.000 a 1.000 x 10^{6} y de manera especialmente preferida en el intervalo de 262.000 a 499 x 10^{6}.

Los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6, obtenibles mediante el procedimiento in vitro que se ha descrito, tienen un grado de ramificación que está situado por encima del grado de ramificación que se alcanza cuando se emplea la actividad de una amilosacarasa, y que como máximo está situado en 25% en moles.

De manera preferida, los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6, que son obtenibles, tienen un grado de modificación de 0,05% a 20%, situado de manera preferida en el intervalo de 0,15% a 17%, en particular en el intervalo de 0,2% a 15%, de manera especialmente preferida en el intervalo de 0,25% a 13%, y de manera muy especialmente preferida en el intervalo de 0,3% a 12%.

De manera preferida, el grado de ramificación está situado en el intervalo de 0.35% a 11%, y en particular en el intervalo de 0,4% a 10,5%.

Los \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6, que son obtenibles mediante el procedimiento in vitro que se ha descrito, se pueden utilizar, tal como más arriba se ha descrito para el almidón, en la industria alimentaria y en la industria no alimentaria.

El plásmido pBB48, producido en el marco del presente invento fue depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) [Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares] reconocida como centro de depósito internacional, con sede en Braunschweig, República Federal Alemana, de modo correspondiente a los requisitos del convenio de Budapest, el 25 de Septiembre de 1998, bajo el número de depósito DSM 12425.

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La Figura 1 muestra esquemáticamente la estructura del plásmido pBB48 (DSM 12425).

La Figura 2 muestra una serie de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 en diverso grado, que habían sido producidos mediante el procedimiento conforme al invento y que habían sido teñidos a continuación con una solución de Lugol.

De izquierda a derecha: amilosacarasa (izquierda), amilosacarasa + unas cantidades decrecientes de actividad de la enzima ramificadora. Los máximos de absorción de las correspondientes muestras estaban situados en 615 nm, 483 nm, 500 nm, 526 nm, 534 nm, 560 nm, 577 nm.

La Figura 3 muestra un cromatograma de HPLC de un producto (A) del procedimiento (altamente ramificado, que ha sido desramificado con isoamilasa y de una muestra (B) de glicógeno de hígado de rata, que ha sido desramificado con una isoamilasa.

La Figura 4 muestra el esquema del análisis de la metilación.

La Figura 5 muestra un diagrama de los resultados de los análisis de la muestra 7 descrita en los Ejemplos 9 y 10 después de una etapa y después de dos etapas de metilación. Los valores para las metilaciones en 2, 3, 6 son de 96,12% o respectivamente 96,36%.

La Figura 6 muestra una representación gráfica de las proporciones de unidades de glucosa terminales ("2346 Me") y unidas en 6 ("23 Me") de las muestras de glucanos que se han investigado.

Las Figuras 7 y 8 muestran unos cromatogramas de gases de las muestras 3 y 7 que se han descrito en los Ejemplos.

La Figura 9 muestra esquemáticamente el plásmido pBE-fnr-Km.

La Figura 10 muestra un gel de actividad para la enzima ramificadora.

La Figura 11 muestra la representación esquemática de un perfil de RVA.

La Figura 12 muestra la distribución de tamaños de granos de los linajes 143-13A y 143-59A en comparación con la del tipo salvaje.

La Figura 13 muestra el aumento con microscopio del tamaño de los granos de almidón de los linajes 143-13A, 143-34A y 143-59A en comparación con granos de almidón de plantas de tipo salvaje (microscopio óptico de la entidad Leitz, Alemania).

La Figura 14 muestra la resistencia de gel de los almidones de diferentes linajes transgénicos en comparación con unos almidones procedentes de plantas de tipo salvaje, determinada con ayuda de un aparato analizador de la textura.

La Figura 15 muestra el perfil de RVA de los almidones de los linajes 143-11A, 143-13A, 143-59A en comparación con el del tipo salvaje.

Las Figuras 16 a 18 muestran los resultados de unas cromatografías por HPLC, que representan el modelo de las distribuciones de cadenas laterales de los linajes 143-WT (= tipo salvaje), 143-13A y 143-59A.

La Figura 19 muestra los gradientes de elución utilizados para las cromatografías que se han representado en las Figuras 16 a 18.

La Figura 20 muestra la desviación porcentual de cadenas laterales con determinadas longitudes de cadenas de los almidones investigados en las Figuras 16 hasta 18 con respecto del tipo salvaje.

Los siguientes Ejemplos explican el invento

Materiales

Tampón de disgregación:: 100 mM de Tris/HCl de pH 8,5; 5 mM de Na_{2}EDTA; 2 mM de DTT; 1 mM de Pefabloc®

Tampón de lavado:: 50 mM de Tris/HCl de pH 8,5; 5 mM de Na_{2}EDTA; 10% de glicerol)

Tampón HIC:: 50 mM de fosfato de potasio de pH 7,0; 5 mM de EDTA; 2 mM de DTT; 10% de glicerol

Glicógeno de ostra del tipo II procedente de ostras (Sigma G8751)

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Métodos Analítica de un almidón (a) Determinación de la relación de amilosa/amilopectina

Se aisló, de acuerdo con métodos clásicos, un almidón a partir de plantas de patata, y se determinó la relación de amilosa a amilopectina de acuerdo con el método descrito por Hovenkamp-Hermelink y colaboradores (Potato Research 31 (1988), 241-246).

(b) Determinación del contenido de fosfato

En el almidón pueden estar fosforiladas las posiciones C2, C3 y C6 de las unidades de glucosa.

Para la determinación del contenido de grupos de fosfato en la posición C6 se hidrolizaron 100 mg de un almidón en 1 ml de HCl 0,7 M durante 4 horas a 95ºC (Nielsen y colaboradores, Plant Physiol. 105 (1994), 11-117). Después de una neutralización con KOH 0,7 M para la determinación de glucosa-6-fosfato se sometieron 50 ml del material hidrolizado a un ensayo óptico - enzimático. La modificación de la absorción de la tanda de ensayo (100 mM de imidazol/HCl; 10 mM de MgCl_{2}; 0,4 mM de NAD; 2 unidades de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa procedente de Leuconostoc mesenteroides; a 30ºC) se vigiló a 334 nm.

La determinación del contenido total de fosfato se efectuó de acuerdo con el método de Ames (Methods in Enzymology VIII (1966), 115-118).

Se mezclan aproximadamente 50 mg del almidón con 30 \mul de una solución etanólica de nitrato de magnesio y se incineran durante tres horas a 500ºC en un horno de mufla. El residuo se mezcla con 300 \mul de ácido clorhídrico 0,5 M y se incuba durante 30 min a 60ºC. A continuación, una parte alícuota se completa hasta 300 \mul con ácido clorhídrico 0,5 M, se añade a una mezcla de 100 \mul de ácido ascórbico al 10% y de 600 \mul de molibdato de amonio al 0,42% en ácido sulfúrico 2 M y se incuba durante 20 min a 45ºC.

Sigue una determinación fotométrica a 820 nm, tomando en consideración una serie de calibración de fosfato como patrón.

(c) Determinación de la resistencia de gel (en un aparato analizador de la textura)

2 g de un almidón (TS = como sustancia seca) se engrudan en 25 ml de H_{2}O (compárese el RVA) y a continuación se almacena en estado cerrado a 25ºC de modo estanco al aire durante 24 h. Las muestras se fijan por debajo de la sonda (estampa circular) de un aparato analizador de la textura TA-XT2 de la entidad Stable Micro Systems y se determina la resistencia de gel con los siguientes parámetros:

1

(d) Perfil de viscosidades

2 g de un almidón (como sustancia seca) se recogen en 25 ml de H_{2}O y se utilizan para el análisis en un aparato analizador Rapid Visco Analyzer (Newport Scientific Pty Ltd., Investment Support Group, Warriewod NSW 2102, Australia). El funcionamiento del aparato se efectúa de acuerdo con los datos del fabricante. Para la determinación de la viscosidad de la solución acuosa del almidón, la suspensión de almidón es calentada en primer lugar desde 50ºC a 95ºC, con una velocidad de 12ºC por minuto. A continuación, la temperatura es mantenida durante 2,5 min a 95ºC. Después de esto la solución es enfriada desde 95ºC a 50ºC, con una velocidad de 12ºC por minuto. A lo largo de todo el período de tiempo se determina la viscosidad.

La determinación de la temperatura de engrudamiento se efectúa a través de la pendiente de la curva de viscosidad en función del tiempo. Si la pendiente de la curva es mayor que 1,2 (este valor es preestablecido por el usuario), el programa de ordenador identifica la temperatura medida en este momento como temperatura de engrudamiento.

(e) Determinación de glucosa, fructosa y sacarosa

La determinación de los contenidos de glucosa, fructosa y sacarosa se efectúa de acuerdo con el método descrito por Stitt y colaboradores (Methods in Enzymology 174 (1989), 518-552).

(f) Análisis de la distribución de cadenas laterales de la amilopectina

La distribución de cadenas laterales o respectivamente la preparación previa se determina tal como se ha descrito en la cita de Lloyd y colaboradores (Biochem. J. 338 (1999), 515-521). En tal contexto hay que hacer mención al hecho de que en el caso de este método es desramificada solamente la amilopectina y de que la amilosa, antes de la desramificación de la amilopectina, es separada de la amilopectina mediante una precipitación con timol. Se escogen las siguientes condiciones de elución (representación simplificada, el perfil exacto de elución puede tomarse de la Figura 19).

2

(g) Determinación de los tamaños de granos

La determinación de los tamaños de granos se llevó a cabo con un medidor fotográfico de la sedimentación del tipo "Lumosed" de la entidad Retsch GmbH, Alemania.

La distribución de tamaños de granos se determinó en una solución acuosa y se efectuó de acuerdo con los datos de fabricante así como basándose en la bibliografía de p.ej. H. Pitsch, determinación de tamaños de granos; LABO-1988/3 Fachzeitschrift für Labortechnik, Darmstadt.

(h) Capacidad de fijación de agua

Para la determinación de la capacidad de fijación de agua, el residuo, después de la separación de la parte soluble mediante centrifugación del almidón hinchado a 70ºC, se pesó. La capacidad de fijación de agua (WBV, acrónimo de Wasserbindevermögen del almidón) fue referida a la pesada inicial de almidón corregida por la masa soluble.

WBV (g/g) = (residuo - (pesada inicial de la porción soluble))/(pesada inicial de la porción soluble)

Ejemplo 1 Aislamiento de una secuencia de ADN genómico que codifica una enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans

Para el aislamiento de la enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans se estableció primeramente una biblioteca genómica de ADN. Para esto, se cultivaron unas células de Neisseria denitrificans de la cepa que ha sido depositada como ATCC 14686 en la ATCC, sobre placas de agar y sangre de Columbia y a continuación se cosechan. El ADN genómico fue aislado y purificado de acuerdo con el método de Ausubel y colaboradores. (en: Current Protocolls in Molecular Biology [protocolos actuales en biología molecular] (1987); J. Wiley & Sons, NY). Después de una digestión parcial por restricción con la endonucleasa de restricción Sau3A se efectuó una ligación con el ADN de vector de fago cortado con BamH I (lambdaZAP Express de Stratagene). Después de la excisión in vivo de la biblioteca de fagos, los plásmidos obtenidos se transformaron en el seno del mutante (PGM-) de E. coli (Adhya y Schwartz, J. Bacteriol. 108 (1971), 621-626). Este mutante forma, al crecer sobre maltosa, unos polisacáridos lineales que aparecen de color azul después de la tinción con yodo. Se sembraron 60.000 transformantes sobre placas de agar YT con IPTG (1 mM), kanamicina (12,5 mg/l) y maltosa (1%) y después de una incubación durante 16 horas se trataron en fase de vapor con yodo a 37ºC. 60 colonias de bacterias, que después del tratamiento en fase de vapor con yodo tenían un color rojo, un color pardo o un color amarillo, se seleccionaron y a partir de ellas se aisló el ADN plasmídico (Birmboim-Doly, Nucleic Acid Res. 7, 1513-1523). Los plásmidos aislados fueron a continuación utilizados para la retransformación del mismo mutante (PGM-) de E. coli (Adhya y Schwartz, J. Bacteriol. 108 (1971), 621-626). Después de una repetida siembra en placas y de un tratamiento repetido en fase de vapor con yodo, los clones se pudieron reducir desde 60 a cuatro materiales aislados. De estos cuatro plásmidos se llevó a cabo un análisis por restricción, que en la totalidad de los cuatro plásmidos mostró un fragmento de EcoR I de igual tamaño (1,6 kb) (Figura 1).

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Ejemplo 2 Análisis de secuencias del fragmento genómico del plásmido pBB48

A partir de un clon (pBB48), obtenido de modo correspondiente al Ejemplo 1, que tenía una inserción con un tamaño de aproximadamente 3,9 kb en el vector pBK-CMV (de Stratagene), se aisló el fragmento de EcoRI de 1,6 kb (Geneclean, Bio101) y con la finalidad de la secuenciación del ADN se clonó en el vector pBluescript cortado con EcoRI. El plásmido así obtenido fue secuenciado. Con ayuda del plásmido de partida pBB48 se determinaron, después de esto, la secuencia de ADN que codifica la enzima ramificadora total así como la secuencia de regiones flanqueadoras (SEQ ID NO: 1). El plásmido pBB48 se representa en la Fig. 1. El plásmido ha sido depositado bajo el número DSM 12425.

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Ejemplo 3 Expresión de la enzima ramificadora en células de E. coli recombinantes

En las cepas de laboratorio de E. coli se expresa por lo general una enzima ramificadora endógena (glgB). Por este motivo, para la detección de la actividad de la enzima ramificadora se usó la mutante G6MD2 de E. coli. La cepa Hfr G6MD2 E. coli (del E. coli Genetic Stock Center, Universidad de Yale, CGSC nº 5080) es portadora de una deleción extendida en la región del gen de síntesis de glucanos (glgA, glgB, glgC). Para la detección de la actividad de la enzima ramificadora, esta mutante se transformó con el plásmido pBB48 y a partir de las células multiplicadas se preparó un extracto en bruto. Las proteínas de este extracto en bruto fueron separadas por electroforesis en un gel de poli(acrilamida) y para la detección de la actividad de la enzima ramificadora se incubaron seguidamente con y sin fosforilasa b de conejo (100 mM de citrato de Na, de pH 7,0; AMP, glucosa-1-fosfato). Solamente en el gel estimulado en la fosforilasa aparecieron unas bandas de color violeta, lo cual apunta a una fuerte actividad de la enzima ramificadora.

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Ejemplo 4 Producción in vitro de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 con extractos en bruto de proteínas en el sistema exento de células

Para la expresión de la enzima ramificadora, la mutante de E. coli G6MD2 se transformó con el plásmido pBB48. Las células se cultivaron con un medio YT con kanamicina (12,5 mg/l) durante 16 h mediando sacudimiento en el matraz de Erlenmeyer. Después de una centrifugación (con 5.000 xg) el sedimento obtenido se lavó con 100 mM de Tris/HCl, de pH 7,5, y con 1 mM de DTT, y después de haberlo suspendido en el mismo tampón, las células se disgregaron con una sonda por ultrasonidos. Una centrifugación adicional (con 10.000 xg) separó los desechos celulares desde las proteínas solubles y proporcionó un material sobrenadante de color amarillento con una concentración de proteínas de aproximadamente 10 mg/ml.

De este extracto en bruto de proteínas, obtenido de esta manera, se añadieron luego diferentes cantidades (100 \mul, 10 \mul, 1 \mul, 0,1 \mul, 0,01 \mul, 0,001 \mul) en común con una cantidad en cada caso constante de una amilosacarasa en 50 ml de citrato de Na 100 mM de pH 7,0 con 20% de sacarosa y 0,02% de aziduro de Na. Después de unas pocas horas, se pudieron observar los primeros enturbiamientos en la mezcla de reacción. Después de tres días se centrifugó y los productos resultantes se lavaron con agua desionizada.

Los productos son solubles en DMSO y pueden ser caracterizados por medio de la medición de un espectro de absorción con una solución de Lugol. A través de éste es posible una estimación del grado de ramificación de los productos producidos. Para esto, la solución en DMSO se diluyó fuertemente con agua, se mezcló con una solución de Lugol e inmediatamente después se midió el espectro desde 400 nm hasta 700 nm en un espectrofotómetro de Beckmann (véase la Fig. 2).

Una separación de cadenas laterales disociadas con isoamilasa sobre una columna de Carbopak PA100 mediante una HPLC (DIONEX; agente eluyente: 150 mM de NaOH con gradientes de acetato de Na 1 M) muestra para un producto fuertemente ramificado el mismo modelo que para un glicógeno de hígado de rata desramificado con isoamilasa (Fig. 3).

Una separación de cadenas laterales después de una incubación con una pululanasa apareció solamente en muy pequeña medida.

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Ejemplo 5 Purificación de la enzima ramificadora y secuenciación en el extremo terminal de N de la proteína

Para el aislamiento de la enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans a partir de células de E. coli Hfr G6MD2 recombinantes (véase más arriba), que habían sido transformadas con el pBB48, se centrifugó primeramente un cultivo durante una noche de estas células. El precipitado celular fue suspendido a continuación en 3 volúmenes de un tampón de disgregación y se disgregó a una presión de aproximadamente 16.000-17.000 psi (1.120-1.190 kg/cm^{2}) en la prensa de French. Después de una centrifugación durante una hora a 10.000 g, el material sobrenadante fue diluido hasta el volumen 4 veces mayor por adición de un tampón de lavado, en un procedimiento discontinuo (en inglés batch) se fijó a DEAE celulosa DE52 y se rellenó en una columna de cromatografía, que había sido lavada con 2 a 3 volúmenes de columna del tampón de lavado. Después de esto, para la elución se estableció un gradiente lineal de NaCl 1 M. Las fracciones con actividad de la enzima ramificadora (véase el Ejemplo 8) fueron reunidas, mezcladas con (NH_{4})_{2} SO_{4} (concentración final 20% (p/v)) y aplicadas sobre una columna de TSK Butyl-Toyopearl 650M. Después de haber lavado con 2 a 3 volúmenes de columna del tampón HIC, que previamente se había mezclado adicionalmente con una solución de sulfato de amonio que tenía un grado de saturación de 20% (114 g de sulfato de amonio por litro), la enzima ramificadora fue eluída mediando empleo de un gradiente de sulfato de amonio descendente linealmente desde 20% a 0% en el tampón HIC. Las fracciones con actividad de enzima ramificadora fueron reunidas. Para el aumento de la concentración de la proteína se repitió a continuación la etapa de purificación con las fracciones reunidas mediando utilización de una columna pequeña de TSK Butyl-Toyopearl 650M (de Tose Haas (Montgomery Ville, Pensilvania)). La proteína purificada fue aplicada a continuación sobre un gel de poli(acrilamida), sometida a transferencia de motas (en alemán geblottet) sobre una membrana de PVDF, luego llevada nuevamente a disolución y secuenciada en el extremo terminal de N por la entidad WITA GmbH, Teltow, Alemania, de acuerdo con el método de Edman. La secuencia obtenida se presentó como: MNRNXH (SEQ ID NO:3).

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Ejemplo 6 Purificación de una amilosacarasa

Para la producción de una amilosacarasa se utilizaron unas células de E. coli, las cuales habían sido transformadas con un ADN, que codificaba una amilosacarasa procedente de Neisseria polysaccharea. El ADN tiene la secuencia de nucleótidos que se representa dentro de SEQ ID NO:4 y procede de una biblioteca genómica de N. polysaccharea.

Un cultivo durante la noche de estas células de E. coli, que secretaban la amilosacarasa procedente de Neisseria polysaccharea, fue separado por centrifugación y vuelto a suspender en aproximadamente 1/20 volúmenes de un tampón de citrato de sodio 50 mM de (pH 6,5), 10 mM DTT (ditiotreitol) y 1 mM de PMSF (fluoruro de fenil metilsulfonilo). A continuación las células fueron disgregadas dos veces a 16.000 p.s.i. (1.120 kg/cm^{2}) con una prensa French. Después de esto, al extracto celular se le añadió 1 mM de MgCl_{2} así como benzonasa (de Merck; 100.000 unidades; 250 unidades \mul^{-1}) en una concentración final de 12,5 unidades ml^{-1}. A continuación, la tanda se incubó a 37ºC mediando ligera agitación durante por lo menos 30 min. El extracto se dejó reposar sobre hielo por lo menos durante 1,5 horas. A continuación, se centrifugó durante 30 min a 4ºC a aproximadamente 40.000 g hasta que el material sobrenadante fuese relativamente transparente.

Se llevó a cabo una filtración previa con una membrana de PVDF (de Millipore "Durapore", véase cita anterior), que poseía un diámetro de poros de 0,45 \mum. El extracto se dejó reposar durante una noche a 4ºC. Antes de la realización de la cromatografía de HI (acrónimo de hydrophobic interaction = interacción hidrófoba), el extracto se mezcló con NaCl sólido, y se ajustó a una concentración de 2 M de NaCl. A continuación se centrifugó de nuevo durante 30 min a 4ºC y a aproximadamente 40.000 mg. Después de esto, el extracto fue liberado de los últimos residuos de E. coli, al ser filtrado con una membrana de PVDF (de Millipore "Durapore", véase más arriba) que tenía un diámetro de poros de 0,22 \mum. El extracto filtrado se separó sobre una columna de Butylsepharose-4B (de Pharmacia) (volumen de la columna: 93 ml, longitud: 17,5 cm). Aproximadamente 50 ml del extracto con una actividad de amilosacarasa de 1 a 5 unidades \mul^{-1} se añadieron a la columna. A continuación, las proteínas que no se habían fijado con 150 ml del tampón B se separaron por lavado desde la columna (tampón B: 50 mM de citrato de sodio de pH 6,5, 2 M de NaCl). La amilosacarasa fue eluída finalmente con ayuda de un gradiente lineal descendente de NaCl (desde 2 M hasta 0 M de NaCl en 50 mM de citrato de sodio en un volumen de 433 ml con una velocidad de afluencia de 1,5 ml min^{-1}), que había sido generado con un sistema de bombeo automático (FPLC, de Pharmacia). La elución de la amilosacarasa se efectuó entre 0,7 M y 0,1 M de NaCl. Las fracciones fueron recogidas, desalinizadas a través de una columna de PD10 Sephadex (de Pharmacia) estabilizadas con 8,7% de glicerol, comprobadas en cuanto a la actividad de amilosacarasa y finalmente congeladas en un tampón de almacenamiento (8,7% de glicerol, 50 mM de citrato).

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Ejemplo 7 Determinación de la actividad de amilosacarasa

La determinación de la actividad de amilosacarasa se efectúa mediante el recurso de que una proteína purificada o un extracto proteínico en bruto se añade en diferentes diluciones en tandas de 1 ml, que contienen 5% de sacarosa, 0,1% de dextrina y 100 mM de citrato de pH 6,5, y se incuba a 37ºC. Después de 0 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 240 min, 300 min y 360 min se sacan de esta tanda sendas porciones de 10 \mul y por inmediato calentamiento a 95ºC se termina la actividad enzimática de la amilosacarasa. En el ensayo fotométrico acoplado se determina a continuación la proporción de la fructosa puesta en libertad por la amilosacarasa. Para esto, se añaden desde 1 \mul hasta 10 \mul de la muestra desactivada en 1 ml de un tampón de imidazol 50 mM de pH 6,9, 2 mM de MgCl_{2}, 1 mM de ATP, 0,4 mM de NAD^{+} y 0,5 U/ml de hexocinasa. Después de una adición secuencial de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (procedente de Leuconostoc mesenteroides) y de la fosfoglucosa isomerasa, se mide la modificación de la absorción a 340 nm. A continuación, con ayuda de la ley de Lambert-Beer se calcula la cantidad de fructosa que se ha puesto en libertad.

Si se pone en relación el valor obtenido con el momento de la toma de muestras, entonces se puede determinar el número de las unidades (1U = \mumol de fructosa/min) (por cada \mul del extracto proteínico o respectivamente por cada \mug de la proteína purificada).

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Ejemplo 8 Determinación de la actividad enzimática de una enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans

La determinación de la actividad enzimática de la enzima ramificadora se llevó a cabo apoyándose en un método descrito en la bibliografía (Krisman y colaboradores, Analytical Biochemistry 147 (1985), 491-496; Brown y Brown, Meth. Enzymol. 8 (1966), 395-403). El método se basa en el principio de la afinidad disminuida para la fijación de yodo de glucanos ramificados en comparación con \alpha-1,4-glucanos no ramificados.

Para la determinación de la actividad enzimática de la enzima ramificadora, se añadieron en una placa de microtitulación enfriada una serie de muestras de diferentes diluciones de la enzima ramificadora. A continuación, la reacción se comenzó por medio de una adición en cada caso de 190 \mul de una mezcla de reacción con amilosa (formulación véase más adelante) y se incubó a 37ºC en el armario de incubación. Exactamente después de 30 min, se detuvo la reacción mediante la adición de 100 \mul de una solución de Lugol (0,5 mM) y las muestras se midieron en el aparato lector de placas de microtitulación (de Molecular Devices) a 650 nm. Como testigo sirvió una tanda sin amilosa. La muestra de referencia con el valor de extinción máximo, que contenía amilosa pero nada de enzima ramificadora, presentó una DO_{650} =1,2 [DO_{650} = densidad óptica a 650 nm].

Para la mejor comparabilidad de ensayos independientes, se utiliza para la evaluación solamente la dilución de una muestra, que conduce durante el período de tiempo de incubación de 30 min a una disminución de la DO_{650} en 0,5 unidades.

Definición de una unidad de actividad (U) de la enzima ramificadora

Media unidad de la enzima ramificadora es la cantidad de enzima que en el ensayo descrito da lugar a una disminución desde 1,2 a 0,7 de la DO_{650} en 0,5 unidades en el transcurso de 30 min.

Formulación de la mezcla de reacción con amilosa

1 ml de una solución al 0,5% de amilosa (fabricante: Fluka; amilosa procedente de patata) en p/v (peso/volumen) en DMSO se añade mediando agitación a 10 ml de un tampón de citrato de Na (100 mM, pH 6,5, 0,02% p/v NaN_{3}). La solución original transparente se diluye, para efectuar la medición, nuevamente a 1:4 hasta 1:8 con un tampón de citrato de Na. La absorción con una solución de Lugol debería estar situada en el ensayo en 1,2 (máximo) en el caso de la muestra de referencia empleada.

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Ejemplo 9 Preparación de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 con diferentes grados de ramificación

Para la preparación de \alpha-1,4-glucanos ramificados en \alpha-1,6 con diferentes grados de ramificación, una solución al 20% de sacarosa (en p/v) se mezcló en un volumen de reacción de 10,86 ml con una amilosacarasa purificada procedente de Neisseria polysaccharea (véase el Ejemplo 6) y con una enzima ramificadora purificada procedente de Neisseria denitrificans (véase el Ejemplo 5). Según fuese la tanda de ensayo, estas dos enzimas se emplearon en diferentes relaciones de las actividades proteínicas (determinación de amilosacarasa: véase el Ejemplo 7; determinación de la enzima ramificadora, véase el Ejemplo 8) (véase la Tabla 1):

Formulación de amilosacarasa: 6,2 U/mg; 1,8 mg/ml

Formulación de enzima ramificadora: 75 U/mg; 6,9 mg/ml

TABLA 1

3

Ejemplo 10 Determinación del grado de ramificación mediante un análisis de la metilación

El grado de ramificación de los glucanos obtenidos se determinó a continuación por medio de un análisis de la metilación.

1. Investigaciones llevadas a cabo

-: metilación de todos los grupos OH libres de las muestras de glucanos, en cada caso determinaciones dobles

-: hidrólisis de los polímeros permetilados, seguida por la reducción en C-1 y la acetilación de la mezcla de monómeros

-: análisis por cromatografía de gases y cuantificación de los productos de la reacción

La puesta en claro del grado de ramificación de las muestras de glucanos se efectuó a través de un análisis de la metilación (véase la Figura 4). Los grupos OH libres del polímero se marcan mediante una transformación en el éter metílico.

La descomposición para dar los monómeros se efectúa mediante una hidrólisis con ácidos y conduce a unas moléculas de glucosa parcialmente metiladas, que se presentan en forma de piranósido/furanósido así como en forma de \alpha- y \alpha-glucósidos. Estas variantes son enfocadas por reducción con NaBH_{4} en el respectivo derivado de sorbitol parcialmente metilado. Mediante la acetilación final de los grupos OH libres se pueden investigar los productos de reacción mediante una cromatografía de gases.

La siguiente tabla muestra la consistencia así como la solubilidad en DMSO de los glucanos obtenidos

TABLA 2

4

2. Parte experimental a) Preparación de la soluciones en DMSO

Se prepararon unas soluciones al 1% (p/v) en DMSO. No todas las muestras eran bien solubles a la temperatura ambiente: las 1, 3 y 13 tuvieron que ser calentadas a 110ºC durante 30 minutos. Exceptuando las soluciones 1 y 3, que eran ligeramente turbias, resultaron unas soluciones ópticamente transparentes (véase la Tabla 2).

b) Metilación

2 ml de la solución en DMSO (es decir, 20 mg de un polímero) se transfirieron a un matraz con nitrógeno que tenía una capacidad de 50 ml, se mezclaron en una corriente de N_{2} con 5 equivalentes/OH (eq./OH) de una solución de dimsilo recientemente preparada, y se agitaron durante 30 minutos. Las soluciones se volvieron en tal caso turbias y viscosas. El contenido del matraz se congeló en un baño de hielo, se mezcló con 10 eq./OH de yoduro de metilo y después de la descongelación se agitó durante por lo menos 2 h. Antes de la segunda etapa de desprotonación y metilación, se eliminó en vacío el yoduro de metilo en exceso.

El tratamiento se efectuó después de haber eliminado el yoduro de metilo en exceso por medio de una adición de 50 ml de agua y una extracción repetida 5 veces, cada vez con 10 ml de diclorometano. La fase orgánica se liberó a continuación de las trazas de DMSO mediante una extracción con agua repetida 3 veces, se secó con CaCl_{2}, se filtró y se concentró por evaporación. Los productos se presentaban como unas películas transparentes, ligeramente amarillentas.

Con ayuda de la muestra 7 se comprobó en primer lugar cuántas etapas de metilación son necesarias para realizar la permetilación de los grupos hidroxilo. Después de la primera metilación, se trató la mitad de la tanda y la otra mitad se metiló de nuevo. Después de la descomposición de ambas muestras se compararon los resultados de los análisis por GC (cromatografía de gases). Se mostró que la reacción, ya después de una etapa de metilación, era casi cuantitativa (véase la Figura 5). Con el fin de verificar una eventual ramificación en C-3, que también ser confundida por una inframetilación en esta posición, en cada caso se hizo seguir una segunda metilación.

La Figura 5 muestra un diagrama de los resultados de los análisis de la muestra 7 después de una etapa y de dos etapas de metilación; los valores para la metilación en 2,3,6 son de 96,12% o respectivamente de 96,36%.

c) Hidrólisis

2 mg de la muestra metilada se pesaron inicialmente en un vaso a presión con una capacidad de 1 ml, se mezclaron con 0,9 ml de ácido trifluoroacético 2 M y se agitaron a 120ºC durante 2,5 h. Después del enfriamiento del vaso, se concentró por evaporación en una corriente de N_{2}. Para la eliminación de las trazas del ácido se añadió tres veces tolueno y éste se separó por soplado.

TABLA 3 Datos de la metilación

5

d) Reducción

El residuo de la precedente etapa de reacción se mezcló con 0,5 ml de una solución amoniacal 0,5 M de NaBD4 y se agitó durante 1 h a 60ºC. El reactivo se destruyó cuidadosamente con algunas gotas de ácido acético glacial, el borato resultante se eliminó mediante una adición repetida cinco veces de ácido acético metanólico al 15% y una subsiguiente separación por soplado en forma del éster trimetílico de ácido bórico.

e) Acetilación

El residuo de la precedente etapa de reacción se mezcló con 50 \mul de piridina y 250 \mul de anhídrido de ácido acético y se agitó durante 2 h a 95ºC. Después del enfriamiento, la mezcla de reacción se añadió gota a gota a 10 ml de una solución saturada de NaHCO_{3} y se extrajo cinco veces con diclorometano. Los productos de reacción en la fase orgánica se investigaron por cromatografía de gases (acerca de los productos véase la Figura 4).

f) Cromatografía de gases

Las investigaciones por cromatografía de gases se llevaron a cabo en un aparato de la entidad Carlo Erba GC 6000 Vega serie 2 con una entrada sobre la columna y un detector de FID. Las separaciones se efectuaron en una columna capilar de sílice fusionada Supelco SPB5 (diámetro interno 0,2 mm, longitud 30 m) con hidrógeno como gas portador y a una presión de 80 kPa. Se utilizó el siguiente programa de temperaturas:

60ºC (1 min) -25ºC/min \rightarrow 130ºC-4ºC/min \rightarrow 280ºC.

3. Resultados

La evaluación de los cromatogramas de gases se efectuó mediante identificación de los picos, integración de las áreas de superficie de los picos y corrección de los datos con ayuda del concepto ECR de Sweet y colaboradores (Sweet y colaboradores Carbohydr. Res. 40 (1975), 217).

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Los compuestos con 1,6-anhidro, que se pueden observar en los casos de las muestras 1 y 3, han de ser atribuidos al alto grado de ramificación en C-6. Éste conduce durante la hidrólisis a unos monómeros con un grupo OH libre en C-6, que puede reaccionar ulteriormente en las condiciones de reacción para dar estos derivados. Las porciones deben de ser sumadas al calcular el grado de ramificación para dar el valor de "2,3-Me".

La Figura 6 es una representación gráfica de las proporciones de unidades de glucosa terminales ("2346Me") y enlazadas en 6 ("23"Me) de las muestras de glucanos investigadas.

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TABLA 4 Resultados de los análisis en % en moles: las designaciones abreviadas (A, B, etc.) corresponden a las dadas en la Fig. 1; "16AnhPy" = 1,6-anhidro-4-O-acetil-2,3-di-O-metil-D-glucopiranosa, "16AnhFu" = 1,6-anhidro-5-O-acetil-2,3-di-O-metil-D-glucofuranosa; "Me1" y "Me2" designan dos análisis independientes de la metilación de las respectivas muestras

6

7

8

Ejemplo 11 Preparación de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 con diferentes pesos moleculares

Para la preparación de \alpha-1,4-glucanos ramificados en las posiciones \alpha-1,6 con diferentes pesos moleculares, se mezcló una solución al 20% (p/v) de sacarosa en un volumen de reacción de 10,86 ml con una amilosacarasa purificada procedente de Neisseria polysaccharea (véase el Ejemplo 6) y con una enzima ramificadora purificada procedente de Neisseria denitrificans (véase el Ejemplo 5). Según fuese la tanda de ensayo, estas dos enzimas se emplearon en diferentes relaciones de actividades proteínicas (determinación de la actividad de amilosacarasa: véase el Ejemplo 7; de la enzima ramificadora: véase el Ejemplo 8) (véase la Tabla 1). La determinación de los pesos moleculares y del radio de inercia Rg se efectuó mediante dispersión de luz láser (Light Scattering from Polymer solutions [dispersión de luz a partir de soluciones de polímeros], coordinador de edición: Huglin, M. B., Academic Press, Londres, 1972). Para esto, las muestras 1-11 secadas se disolvieron en una mezcla de DMSO y H_{2}O (en la relación 90:10) y se analizaron diferentes diluciones (desde aproximadamente 2,5 g/l hasta 0,25 g/l) en un aparato medidor de la dispersión de la luz (SOFICA, Societe francaise d'instruments de controle et d'analyses. Le Mesnil Saint-Denis, Francia). Los datos obtenidos de esta manera se evaluaron de acuerdo con Berry (J. Chem. Phys. 44 (1966), 4550 y siguientes).

TABLA 5

9

Ejemplo 12 Preparación de una casete de expresión para la transformación de plantas con el fin de realizar la expresión plastídica de una enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans

Con la utilización de los oligonucleótidos BE-5' y BE-3' (SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7) se amplificó mediante una PCR la secuencia que codifica la enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans, partiendo del plásmido pBB48 (depositado en la Deutsche Sammlung für Mikroorgansimen und Zellkulturen (DSMZ) en Braunschweig, República Federal Alemana, bajo el número de depósito DSM 12425). Los materiales amplificados obtenidos a partir de esto se digirieron con las endonucleasas de restricción SalI y SdaI y se clonaron en el plásmido pBinARfnr cortado con SalI y SdaI. El plásmido resultante a partir de esto se designó con el nombre pBE-fnr-Km (Fig. 9):

Condiciones de la reacción PCR

Tampón y polimerasa de Boehringer Mannheim (Pwo polimerasa nº: 1644947)

10

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Condiciones de reacción

11

El plásmido pBE-fnr-Km se utilizó para la transformación de plantas de patata de acuerdo con métodos clásicos (véase más arriba).

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Ejemplo 13 Identificación y detección de plantas de patata transgénicas con actividad enzima ramificadora

Mediante un análisis de transferencia de borrón Northern se pudieron identificar, entre las plantas de patatas transgénicas producidas de acuerdo con el Ejemplo 12, aquellas que tenían el ARNm de una enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans. Para la detección de la actividad de la enzima ramificadora en plantas transformadas de una manera estable, el material de las hojas de las plantas a investigar se congeló en nitrógeno líquido y a continuación se desmenuzó en un mortero previamente enfriado con nitrógeno líquido. Antes de que el material desmenuzado se descongelase, se efectuó una adición de un tampón de extracción (50 mM de citrato de sodio, pH 6,5, 4 mM de DTT, 2 mM de cloruro de calcio). A aproximadamente 100 mg del material de las plantas (peso fresco) se añadieron aproximadamente 200 \mul de un tampón de extracción. Los componentes sólidos de la suspensión a base del material desmenuzado de las plantas y del tampón de extracción se separaron por centrifugación (10.000x g). Una parte alícuota del material sobrenadante transparente obtenido a partir de esto, se mezcló con una cuarta parte del volumen de extracto del tampón de elución (40% de glicerol, 250 mM de Tris de pH 8,8, 0,02% de azul de bromofenol) y se separó en el gel de poli(acrilamida (véase más adelante), con una intensidad de corriente eléctrica constante de 20 mA por cada gel. (Antes de que los extractos proteínicos hubieran sido aplicados, se efectuó una electroforesis de los geles durante 20 minutos en las condiciones que más arriba se han indicado). Después de que el colorante azul de bromofenol, presente en el tampón de elución, hubiera salido desde el gel, se terminó la electroforesis. El gel fue a continuación equilibrado cinco veces en un tampón de lavado (100 mM de citrato de sodio de pH 6,5) cada vez en una cantidad cinco veces mayor del volumen del gel, en cada caso durante 20 minutos mediante agitación a la temperatura ambiente. A continuación, el gel se incubó durante 16 horas a 30ºC en una cantidad cinco veces mayor del volumen del gel del tampón de incubación (100 mM de citrato de sodio de pH 6,5, 5% de sacarosa, 0,625 unidades de amilosacarasa purificada procedente de Neisseria polysaccharea (acerca de la purificación de la enzima y la determinación de la actividad véase más arriba). Después haber vaciado el tampón de incubación, y después de la adición de una solución de Lugol (diluida a 1:5), el glucano que había sido formado por la amilosacarasa en combinación con la enzima ramificadora era visible como una banda de color pardo azulado (Fig. 10). La totalidad del gel de poli(acrilamida) restante se tiñe de azul en este caso mediante la actividad de amilosacarasa presente en el tampón de incubación.

Composición del gel de poli(acrilamida):

a): Gel de separación

: 375 mM de Tris de pH 8,8

: 7,5% de poli(acrilamida) (Biorad nº EC-890)

: Para la polimerización:

: 1/2.000 volúmenes de TEMED

: 1/100 volúmenes de persulfato de amonio

b): Gel de recogida

: 125 mM de Tris de pH 6,8

: 4% de poli(acrilamida) (Biorad nº EC-890)

: Para la polimerización:

: 1/2.000 volúmenes de TEMED

: 1/100 volúmenes de persulfato de amonio

c): Tampón de electroforesis

: 375 mM de Tris de pH 8,8

: 200 mM de glicina.

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Ejemplo 14 Análisis del almidón de plantas que tienen una actividad aumentada de la enzima ramificadora

A partir de plantas de patatas transgénicas, que se habían producido de acuerdo con los Ejemplos 12 y 13, se aisló un almidón de acuerdo con procedimientos clásicos y se investigó en lo que se refiere a sus propiedades físicas y químicas. En tal caso, se comprobó que el almidón formado a partir de las plantas de patatas transgénicas se diferencia, p.ej. de un almidón sintetizado en plantas de tipo salvaje, en su contenido de fosfato y en las propiedades de viscosidad y engrudamiento determinadas mediante un RVA. Los resultados de la caracterización físico-química de los almidones modificados, que se basan en los métodos de análisis arriba descritos, se representan en la siguiente Tabla

12

Leyendas:

143-13A; 143-11A, 143-59A: plantas de patatas transgénicas, que sobreexpresan la enzima ramificadora procedente de Neisseria denitrificans

RVA = aparato analizador Rapid Visco Analyzer

Max = viscosidad máxima = viscosidad pico

Min = viscosidad mínima

Fin = viscosidad al final de la medición

Set = retroceso = diferencia entre min y fin

T = temperatura de engrudamiento

Los valores porcentuales están referidos al tipo salvaje (= 100%) con excepción del contenido de amilosa.

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Los resultados del análisis con RVA, del análisis de la distribución de tamaños de granos y de la resistencia del gel se reproducen también en las Figuras 11 a 15.

Además, las Figuras 16 a 18 muestran los resultados de unas cromatografías HPLC, que constituyen el modelo de la distribución de cadenas laterales de los linajes 143-WT (=tipo salvaje), 143-13A y 143-59A. La Figura 19 muestra en este caso el gradiente de elución que se utilizó en conexión con el análisis por HPLC. En la Figura 20 se representa, además de ello, la desviación porcentual de cadenas laterales con determinadas longitudes de cadena desde el tipo salvaje.

Las siguientes dos Tablas explican como se efectuó en este contexto el cálculo de las proporciones de cadenas laterales.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7

13

Las áreas de pico en las columnas A 1, A 2, C 1 y C 2 fueron determinadas con el programa de aplicación AI-450 versión 3.31 de la entidad Dionex.

TABLA 8

14

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> PlantTec Biotechnologie GmbH

\hskip1cm

Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Moléculas de ácidos nucleicos que codifican una enzima ramificadora procedente de bacterias de género Neisseria así como procedimiento para la preparación de alfa-1,4-glucanos ramificados en alfa-1,6

\vskip0.400000\baselineskip

<130> C1434PCT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2475

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (170)..(2458)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

15

16

17

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 762

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

19

20

21

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2914

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria polysaccharea

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (957)..(2867)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

23

24

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 636

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria polysaccharea

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

27

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neisseria denitrificans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

Claims

1. Molécula de ácido nucleico que codifica una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria, seleccionada entre el conjunto que se compone de

(a): moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, que comprende la secuencia de aminoácidos que se indica dentro de SEQ ID NO: 2;

(b): moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la región codificadora que se indica dentro de SEQ ID NO: 1;

(d): moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la región codificadora contenida en la inserción en el plásmido DSM 12425 para una enzima ramificadora;

(e): moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria, cuya secuencia en la región de los primeros 100 aminoácidos presenta una identidad entre secuencias de por lo menos un 65% con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada dentro de SEQ ID NO: 2;

(f): moléculas de ácidos nucleicos, cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a), (b), (c), (d) y/o (e), y que codifican una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria; y

(g): moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia se diferencia de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (f) a causa de la degeneración del código genético.

2. Vector que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Vector de acuerdo con la reivindicación 2, estando la molécula de ácido nucleico unida en orientación en el mismo sentido (in sense) con unas secuencias reguladoras, que garantizan la transcripción en células procarióticas o eucarióticas.

4. Célula anfitriona, que es transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 2 o 3.

5. Procedimiento para la producción de una enzima ramificadora a partir de una bacteria del género Neisseria, siendo cultivada una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 4 en unas condiciones que permiten la expresión de la proteína, y siendo aislada la proteína a partir de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

6. Procedimiento para la producción de una enzima ramificadora a partir de una bacteria del género Neisseria, siendo producida la proteína en un sistema de transcripción y traducción in vitro mediando utilización de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

7. Enzima ramificadora codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 u obtenible mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6.

8. Anticuerpo, que reconoce específicamente una proteína de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Utilización de una proteína de acuerdo con la reivindicación 7, para la preparación de \alpha-1,4-glucanos ramificados en \alpha-1,6 en sistemas in vitro.

10. Célula de planta transgénica que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, estando la molécula de ácido nucleico unida con unas secuencias reguladoras, que garantizan la transcripción en células de plantas.

11. Célula de planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10, estando unida la molécula de ácido nucleico con una secuencia, que codifica una secuencia de señal, que garantiza la localización de la proteína codificada en los plastidios de las células.

12. Planta transgénica que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 10 u 11.

13. Procedimiento para la producción de una planta transgénica, realizándose que

(a): una célula de planta es modificada genéticamente mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o de un vector de acuerdo con la reivindicación 2 o 3;

(b): a partir de la célula producida de acuerdo con la etapa (a) se regenera una planta; y

(c): a partir de la planta producida de acuerdo con la etapa (b) se producen eventualmente otras plantas adicionales, que contienen unas células, que a su vez contienen una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o un vector de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3.

14. Partes de plantas cosechables de plantas de acuerdo con la reivindicación 12 o de plantas obtenibles mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, conteniendo estas partes de plantas unas células de plantas transgénicas de acuerdo con la reivindicación 10 u 11.

15. Célula de planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 12, procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 y partes de plantas de acuerdo con la reivindicación 14, siendo la planta una planta de patata y procediendo las células de plantas y las partes de plantas de plantas de patata.

16. Procedimiento para la producción de un almidón, que comprende la extracción del almidón a partir de plantas transgénicas de acuerdo con la reivindicación 12 o 15, a partir de plantas transgénicas mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 o 15, a partir de partes que almacenan almidón de una de tales plantas o a partir de células de plantas de acuerdo con la reivindicación 10, 11 o 15.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, siendo producido un almidón de patata, que, en comparación con un almidón procedente de correspondientes plantas de tipo salvaje, presenta una proporción porcentual aumentada en por lo menos un 10% de granos de almidón que tienen un tamaño de granos de hasta 15 \mum.

18. Región reguladora, que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el conjunto que se compone de:

(a): secuencias de nucleótidos, que comprenden los nucleótidos 1 a 169 de la secuencia de nucleótidos que se representa en SEQ ID NO:1; y

(b): la secuencia de nucleótidos de la región codificadora, que está contenida en la inserción en el plásmido DSM 12425.