ES2246227T3 - Moleculas de acido nucleico que codifican alternansacarasa. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de alternansacarasa seleccionada del grupo constituido por: (a) moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la forma madura de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2 o la secuencia de aminoácidos que es codificada por el cDNA contenido en el plásmido DSM 12666; (b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ. ID No. 1 o la secuencia de nucleótidos del cDNA contenido en el plásmido DSM 12666 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente; (c) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia de aminoácidos tiene una homología de al menos 40% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2; (d) moléculas de ácido nucleico, una de cuyas cadenas se hibrida con una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a) o (b); (e) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento biológicamente activo de la proteína que es codificada por una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c) o (d); y (f) moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía, debido a la degeneración del código genético, de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c), (d) o (e).

Description

Moléculas de ácido nucleico que codifican alternansacarasa.

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una alternansacarasa. Además, esta invención se refiere a vectores, células hospedadoras y células vegetales transformadas con las moléculas de ácido nucleico descritas en esta memoria, y plantas que contienen dichas células. Además, se describen métodos para preparar plantas transgénicas que debido a la inserción de las moléculas de DNA que codifican una alternansacarasa, sintetizan el carbohidrato alternano. Adicionalmente, se describen métodos para la preparación de alternano.

Se citan más adelante documentos de la técnica anterior, el contenido de cuyas descripciones se incluye en la presente solicitud por referencia a los mismos.

El alternano es un polisacárido compuesto de unidades de glucosa. Las unidades de glucosa están enlazadas unas a otras por enlaces glicosídicos \alpha-1,3 y \alpha-1,6, y dichos dos tipos de enlaces aparecen predominantemente de manera alternante. Sin embargo, el alternano no es un polisacárido lineal, sino que puede contener ramificaciones (Seymour et al., Carbohydrate Research 74, (1979), 41-62). Debido a sus propiedades fisicoquímicas, las posibilidades de aplicación del alternano en la industria farmacéutica, por ejemplo como soporte de ingredientes farmacéuticamente activos y como aditivo en la industria textil, de los cosméticos y alimentaria han sido expuestas (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993) 77-85; Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997), 278-283). Además, el alternano puede utilizarse como sustituto para la goma arábiga (Coté, Carbohydrate Polymers 19, (1992), 249-252).

La industria tiene un gran interés en métodos biotecnológicos para preparación de oligosacáridos y polisacáridos, y en particular del alternano que es difícilmente accesible o no es accesible en absoluto a la síntesis orgánica clásica. En comparación con el enfoque clásico de la química orgánica de síntesis, los procesos biotecnológicos ofrecen ventajas. Por ejemplo, las reacciones catalizadas enzimáticamente exhiben como regla especificidades mucho mayores (regioespecificidad, estereoespecificidad) y velocidades de reacción más altas, transcurren en condiciones de reacción más suaves y conducen a mayores rendimientos. Estos factores son de importancia excepcional en la preparación de nuevos oligosacáridos y polisacáridos.

El alternano se prepara enzimáticamente con el uso de enzimas que poseen la actividad biológica de las alternansacarasas. Las alternansacarasas pertenecen al grupo de las glucosiltransferasas que, partiendo de la sacarosa, son capaces de catalizar la formación de alternano y fructosa. Hasta ahora, se han encontrado únicamente alternasas en la bacteria Streptococcus mutans (Mukasa et al. (J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 2055-2063); Tsumori et al. (J. Gen. Microbiol. 131 (1985), 3347-3353)) y en cepas específicas de la bacteria Gram-positiva Leuconostoc mesenteroides donde aquéllas están, como regla, presentes junto con otras enzimas formadoras de polisacáridos, tales como por ejemplo dextransacarasas formadoras de dextrano, o junto con enzimas degradantes de polisacáridos, tales como alternanasas. Por tanto, las cepas existentes naturalmente producen también dextrano además de alternano.

Hasta ahora, el alternano se ha preparado en un sistema exento de células utilizando proteínas parcialmente purificadas o por fermentación utilizando cepas productoras de alternansacarasa de Leuconostoc mesenteroides.

Se han descrito diversos métodos de purificación para la purificación de las alternansacarasas (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77-85; López-Munguía et al., Annals New York Academy of Sciences 613 (1990), 717-722; Coté y Robyt, Carbohydrate Research 101 (1982), 57-74). Estos métodos son complejos y relativamente costosos, y, como regla, conducen a bajos rendimientos de proteína (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278-283). Ninguno de estos métodos hace posible la producción de la proteína alternansacarasa en condiciones de pureza elevada, por lo que la secuenciación de la proteína y el aislamiento de las secuencias de DNA correspondientes no han tenido éxito hasta ahora. Si la proteína alternansacarasa purificada de acuerdo con estos métodos se utiliza para preparación in vitro de alternano, entonces los residuos de la proteína dextransacarasa contenidos en la preparación de alternansacarasa producen impurezas de dextrano en el alternano producido. La separación de alternano y dextrano consume un tiempo relativamente largo y es costosa (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278-283). Otra desventaja de las impurezas de la proteína dextransacarasa contenidas en la preparación enzimática de la proteína alternansacarasa es el hecho de que una parte del sustrato sacarosa se convierte en dextrano y no en alternano, lo cual da como resultado una reducción del rendimiento de alternano.

La preparación fermentativa por medio de Leuconostoc conduce también a la formación de mezclas de los productos alternano y dextrano. Con objeto de aumentar la cantidad de alternansacarasa a partir de cepas de Leuconostoc se han aislado mutantes, tales como el mutante NRRL B-21138, que secretan la alternansacarasa y conducen a una mayor proporción de la cantidad de alternansacarasa formada con relación a dextransacarasa. No obstante, si se fermentan tales mutantes con sacarosa, el alternano obtenido continúa presentando impurezas de dextrano (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278-283).

Como se puede ver por la técnica anterior arriba expuesta, no ha sido posible proporcionar hasta ahora la proteína alternansacarasa altamente purificada.

Por esta razón, la presente invención aborda el problema de proporcionar medios y métodos que permitan la preparación de alternano de una manera que ahorra tiempo y es económica.

Este problema se resuelve por la provisión de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones de patente.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que posee la actividad biológica de una alternansacarasa seleccionada del grupo constituido por

(a)

moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la forma madura de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2 o la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA contenido en el plásmido DSM 12666;

(b)

moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ. ID No. 1 o la secuencia de nucleótidos del cDNA contenido en el plásmido DSM 12666 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente;

(c)

moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia de aminoácidos tiene una homología de al menos 40% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2;

(d)

moléculas de ácido nucleico, una de cuyas cadenas se hibrida con las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a) o (b);

(e)

moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento biológicamente activo de la proteína que es codificada por una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c) o (d); y

(f)

moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía, debido a la degeneración del código genético, de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c), (d) o (e).

Por consiguiente, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que poseen la actividad biológica de una alternansacarasa, codificando preferiblemente dichas moléculas proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2.

Debe entenderse que una enzima que posee la actividad enzimática o biológica de una alternansacarasa (E.C. 2.4.1.140) significa una enzima que es capaz de catalizar la conversión de sacarosa en alternano y fructosa. Esta conversión puede ocurrir tanto en presencia como en ausencia de aceptores externos (por ejemplo maltosa, isomaltosa, isomaltotriosa, etc.). En ausencia de aceptores externos, las alternansacarasas procedentes de sacarosa catalizan la liberación de fructosa y alternano de peso molecular alto, un polisacárido compuesto de unidades de glucosa, cuya cadena principal está constituida por unidades de glucosa conectadas predominantemente unas a otras de modo alternante por enlaces glicosídicos \alpha-1,3 y \alpha-1,6. En relación con el porcentaje de unidades de glucosa enlazadas por \alpha-1,3 y \alpha-1,6, la bibliografía ofrece valores diferentes. De acuerdo con Mukasa et al. (J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 2055-2063), el alternano está constituido por 76% en moles de glucosa con enlaces \alpha-1,3 y 24% en moles de glucosa con enlaces \alpha-1,6. Tsumori et al. (J. Gen. Microbiol. 131 (1985), 3347-3353) describen el alternano como un poliglucano que contiene 49,1% en moles de glucosa con enlaces \alpha-1,6 y 33,9% en moles de glucosa con enlaces \alpha-1,3 con 13,6% en moles de glucosa terminal y 3,3% en moles de glucosa con ramificaciones \alpha-1,3,6. En presencia de aceptores externos, tales como maltosa, isomaltosa, isomaltotriosa y metil-\alpha-D-glucano, la alternansacarasa puede catalizar la síntesis de cadenas de \alpha-D-glucano, en las cuales los residuos de glucosa están conectados de modo predominante alternativamente por enlaces glicosídicos \alpha-1,6 y \alpha-1,3, y la síntesis de fructosa en estos aceptores de polisacáridos. Dependiendo del aceptor utilizado, los productos formados tienen estructuras diferentes. La actividad enzimática de una alternansacarasa puede detectarse, por ejemplo, como ha sido descrito por López-Munguía (Annals New York Academy of Sciences 613 (1990), 717-722) o como se describe en los ejemplos de la presente solicitud.

La invención se refiere en particular a moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia de nucleótidos indicada bajo SEQ. ID No. 1 o una parte de la misma, y preferiblemente a moléculas que comprenden la región codificante indicada en SEQ. ID No. 1 o secuencias de ribonucleótidos correspondientes.

Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una alternansacarasa y cuya primera cadena se hibrida con una de las moléculas arriba descritas.

La presente invención se refiere también a moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, que tiene una homología, es decir una identidad de al menos 40%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, de modo especialmente preferible al menos 80% y en particular al menos 90% con la secuencia entera de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2, poseyendo la proteína la actividad biológica de una alternansacarasa.

La presente invención se refiere también a moléculas de ácido nucleico, que codifican una alternansacarasa y cuya secuencia se desvía debido a la degeneración del código genético de las secuencias nucleotídicas de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas.

La invención se refiere también a moléculas de ácido nucleico que poseen una secuencia que es complementaria a la totalidad o una parte de las secuencias mencionadas anteriormente.

La secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ. ID No. 1 codifica por ejemplo una alternansacarasa extracelular. La secreción es asegurada por una secuencia señal que comprende los aproximadamente 39 primeros grupos de aminoácidos N-terminales de la SEQ. ID No. 2. En ciertas circunstancias, puede ser deseable que solamente la proteína madura se exprese sin secuencias señal existentes naturalmente y/o junto con otras secuencias señal. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico arriba descritas codifican al menos la forma madura de una proteína que posee la actividad biológica de una alternansacarasa.

En la presente invención, el término "hibridación" significa hibridación en condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente en condiciones severas, como se describe por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{nd} edition (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. Dentro de un significado especialmente preferido, el término "hibridación" significa que la hibridación tiene lugar en las condiciones siguientes:

Tampón de hibridación:

2 x SSC; 10 x solución Denhardt (Fikoll 400 + PEG + BSA; relación 1:1:1); 0,1% SDS; EDTA 5 mM; Na_{2}HPO_{4} 50 mM; 250 \mug/ml de DNA de esperma de arenque; 50 \mug/ml de tRNA; o

\quad

0,25 M de tampón de fosfato de sodio, pH 7,2; EDTA 1 mM, SDS al 7%

Temperatura de hibridación T

= 60ºC

Tampón de lavado:

2 x SSC; SDS al 0,1%

Temperatura de lavado T

= 60ºC.

Las moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden, en principio, codificar alternansacarasas procedentes de cualquier organismo que exprese tales proteínas.

Las moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las moléculas de la invención pueden aislarse por ejemplo de genotecas genómicas de microorganismos. Alternativamente, aquéllas se pueden preparar por ingeniería genética o síntesis química.

Tales moléculas de ácido nucleico pueden identificarse y aislarse con el uso de las moléculas de la invención o partes de estas moléculas o complementos inversos de estas moléculas, por ejemplo por hibridación de acuerdo con métodos estándar (véase por ejemplo Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{nd} edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY).

Moléculas de ácido nucleico que poseen la misma o sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que se indica en SEQ. ID No. 1 o partes de la misma pueden utilizarse, por ejemplo, como sondas de hibridación. Los fragmentos utilizados como sondas de hibridación pueden ser también fragmentos sintéticos que se preparan por técnicas de síntesis usuales, y cuya secuencia coincide sustancialmente con la de una molécula de ácido nucleico de la invención.

Las moléculas que se hibridan con las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden también fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas que codifican una alternansacarasa de la invención. En este caso, se entiende que los fragmentos significan partes de las moléculas de ácido nucleico que son suficientemente largas para codificar una de las proteínas descritas, exhibiendo preferiblemente la actividad biológica de una alternansacarasa. En este contexto, el término derivado significa que las secuencias de estas moléculas difieren también de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas en una o más posiciones y exhiben un alto grado de homología con estas secuencias. En este contexto, homología significa una identidad de secuencia de al menos 40%, en particular una identidad de al menos 60%, preferiblemente mayor que 80% y de modo particularmente preferible mayor que 90%. Desviaciones de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas pueden haberse producido por deleción, sustitución, inserción y/o recombinación.

Preferiblemente, el grado de homología se determina por comparación de la secuencia respectiva con la secuencia de nucleótidos de la región codificante de SEQ. ID No. 1. Cuando las secuencias que se comparan no tienen la misma longitud, el grado de homología se refiere preferiblemente al porcentaje de residuos nucleotídicos en la secuencia más corta que son idénticos a los residuos nucleotídicos en la secuencia más larga. El grado de homología puede determinarse convencionalmente utilizando programas de ordenador conocidos tales como el programa ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673- 4680) distribuido por Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) y Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE) en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Alemania. ClustalW puede descargarse también de varios sitios en la web que incluyen IGBMC (Instituto de Genética y de Biología molecular y Celular, B.P. 163, 67404 Illkirch Cedex, Francia; ftp://ftp-igbmc.u-trasbg.fr/pub/) y EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) y todos los sitios con espejos para el EBI (Instituto Europeo de Bioinformática, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, Reino Unido).

Cuando se utiliza la versión 1.8 del programa ClustalW para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, idéntica en un 90% a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se ajustan de la manera siguiente para los alineamientos de secuencias de DNA: KTUPLE=2; TOPDIAGS=4; PAIRGAP=5; DNAMATRIX:IUB; GAPOPEN=10, GAPEXT=5, NAXDIV=40, TRANSITIONS: sin ponderar.

Para los alineamientos de secuencias de proteínas utilizando la versión 1.8 del programa ClustalW los parámetros son los siguientes: KTUPLE=1; TOPDIAG=5; WINDOW=5, PAIRGAP=3; GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0,05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.

Adicionalmente, homología significa preferiblemente que la proteína codificada exhibe una identidad de secuencia de al menos 40%, más preferiblemente de al menos 60%, todavía más preferiblemente de al menos 80%, en particular de al menos 90% y de modo particularmente preferido de al menos 95% con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2.

Homología significa además que existe una equivalencia funcional y/o estructural entre las moléculas de ácido nucleico correspondientes o las proteínas codificadas por ellas. Las moléculas de ácido nucleico que son homólogas a las moléculas arriba descritas y representan derivados de estas moléculas son, como regla general, variaciones de estas moléculas que representan modificaciones que tienen la misma función biológica. Dichas variaciones pueden ser variaciones existentes naturalmente, por ejemplo secuencias de otros microorganismos, o mutaciones, y dichas mutaciones pueden haberse formado naturalmente o pueden haberse producido por mutagénesis deliberada. Adicionalmente, las variaciones pueden ser secuencias producidas por síntesis. Las variantes alélicas pueden ser variantes existentes naturalmente o variantes producidas por síntesis o variantes producidas por técnicas de DNA recombinante.

En una realización adicionalmente preferida, el término "derivado" abarca una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende al menos uno, más preferiblemente al menos tres, todavía más preferiblemente al menos cinco, en particular al menos diez y de modo particularmente preferido al menos veinte de los motivos peptídicos seleccionados del grupo constituido por

a) MKQQE (SEQ ID NO: 22),

b) KKVPV (SEQ ID NO: 23),

c) KDDEN (SEQ ID NO: 24),

d) IDGNL (SEQ ID NO: 25),

e) YVADS (SEQ ID NO: 26),

f) HLRKN (SEQ ID NO: 27),

g) NENTP (SEQ ID NO: 28),

h) NVDGY (SEQ ID NO: 29),

i) NPDLK (SEQ ID NO: 30),

j) SNDSG (SEQ ID NO: 31),

k) NTFVK (SEQ ID NO: 32),

l) ISGYL (SEQ ID NO: 33),

m) SNAAL (SEQ ID NO: 34),

n) RQYTD (SEQ ID NO: 35),

o) QLYRA (SEQ ID NO: 36),

p) DDKAP (SEQ ID NO: 37),

q) TRQYT (SEQ ID NO: 38),

r) ITFAG (SEQ ID NO: 39),

s) NQYKG (SEQ ID NO: 40),

t) LFLNA (SEQ ID NO: 41),

u) QVSDT (SEQ ID NO: 42),

v) LITLN (SEQ ID NO: 43),

w) GRYVH (SEQ ID NO: 44),

x) TAPYG (SEQ ID NO: 45),

y) VVDYQ (SEQ ID NO: 46),

z) LSGQE (SEQ ID NO: 47).

Las proteínas codificadas por las diferentes variantes de las moléculas de ácido nucleico de la invención poseen ciertas características que tienen todas ellas en común. Éstas incluyen por ejemplo actividad enzimática, peso molecular, reactividad inmunológica, conformación, etc., y propiedades físicas, tales como por ejemplo el comportamiento de migración en electroforesis en gel, comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, pH óptimo, temperatura óptima, etc.

La alternansacarasa (E.C. 2.4.1.140) es una enzima perteneciente al grupo de las glucosiltransferasas. Hasta ahora, no se ha encontrado actividad de alternansacarasa en las plantas, sino únicamente en la bacteria Streptococcus mutans (Mukasa et al. (J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 2055-2063); Tsumori et al. (J. Gen. Microbiol. 131 (1985), 3347-3353)) y en cepas específicas de la bacteria Leuconostoc mesenteroides, por ejemplo en NRRL B-1355, NRRL B-1498 y NRRL B-1501. Como regla, estas cepas contienen diferentes glucosiltransferasas y secretan dextransacarasas aparte de alternansacarasas si aquéllas se dejan crecer en medios que contienen sacarosa. Como regla general, estas dos sacarasas poseen una alta afinidad de fijación a los polisacáridos sintetizados por ellas (López-Munguía et al., Annals New York Academy of Sciences 613 (1990), 717-722) con el resultado de que estos polisacáridos tienen que separarse de la proteína en la purificación de las enzimas de cepas de Leuconostoc mesenteroides que crecen en medio que contiene sacarosa (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77-85; Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278-283).

En ausencia de aceptores externos, las alternansacarasas, partiendo de sacarosa, catalizan la liberación de fructosa y alternano de peso molecular alto, un polisacárido que está compuesto de unidades de glucosa, y cuya cadena principal está constituida por unidades de glucosa enlazadas predominantemente unas a otras de modo alternativo por enlaces glicosídicos \alpha-1,3 y \alpha-1,6 y que, de acuerdo con datos de medida por dispersión de la luz, deberían tener un peso molecular de > 10^{7} (Coté, Carbohydrate Polymer 19 (1992), 249-252). Hasta la fecha no se ha publicado informe alguno acerca de un alternano que posea un residuo terminal fructosa. Sin embargo, la existencia de una unidad terminal fructosa en el alternano no puede excluirse por completo. López-Munguía et al. (Enzyme Microb. Technol. 15 (1993) 77-85) describen que el alternano es resistente a la degradación por dextranasas. Sin embargo, el mismo puede ser degradado por las denominadas alternanasas, por lo cual pueden producirse oligómeros en forma de anillo de alternano de grado de polimerización diferente (Biely et al., Eur. J. Biochem. 226 (1994), 633- 639). El tratamiento ultrasónico del alternano de peso molecular alto permite reducir el peso molecular del alternano a < 10^{6} (Coté, Carbohydrate Polymers 19 (1992), 249-252). Si se preparan soluciones acuosas de este alternano tratado ultrasónicamente, estas soluciones exhiben propiedades reológicas comparables a las de las soluciones acuosas de goma arábiga. El denominado "alternano límite" que tiene un peso molecular de aproximadamente 3500 puede producirse por degradación enzimática utilizando isomaltodextranasa de Arthrobacter globiformis (NRRL B-4425) (Coté, Carbohydrate Polymer 19 (1992), 249-252).

En presencia de aceptores externos, tales como por ejemplo maltosa, isomaltosa, isomaltotriosa y metil-\alpha-D-glucano, la alternansacarasa cataliza en dichos aceptores de sacáridos la síntesis de cadenas \alpha-D-glucano, en las cuales los restos glucosa están enlazados predominantemente de modo alternativo por enlaces glicosídicos \alpha-1,6 y \alpha-1,3, y la síntesis de fructosa. Dependiendo del aceptor utilizado, los productos resultantes tienen estructuras diferentes y un peso molecular que es menor que el del alternano de peso molecular alto y un grado de polimerización de < 15. Debido al grado de polimerización, se hace referencia también a menudo a estos productos como oligoalternanos (Pelenc et al., Sciences Des Aliments 11 (1991), 465-476). Sin embargo, dentro del marco de la presente invención, estos productos de bajo peso molecular que pueden prepararse en presencia de aceptores externos pueden designarse también como alternano.

En la preparación de oligoalternanos por medio de la proteína alternansacarasa parcialmente purificada, la maltosa es un aceptor (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77-85) produciendo altos rendimientos de oligoalternano. La panosa (grado de polimerización (g.p.) de 3) es el primer producto aceptor que se forma a partir de maltosa por la formación de un enlace glicosídico \alpha-1,6.

En contraste con esto, la isomaltosa es un aceptor menos eficaz que conduce a rendimientos más bajos de oligoalternano (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77-85).

La alternansacarasa es relativamente estable y tiene un período de semi-vida de 2 días en 50 mM de tampón acetato, pH 5,4 a 40ºC (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77-85). La enzima exhibe actividad máxima a una temperatura de 40ºC y un valor de pH de 5,6 (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77-85).

En ausencia del sustrato sacarosa, la alternansacarasa cataliza reacciones de desproporción que conducen a un reordenamiento (parcial) del alternano. En particular, cuando los autores de la presente invención utilizaron preparaciones de alternansacarasa parcialmente purificadas que contenían contaminaciones de dextransacarasa para preparar oligoalternanos, se encontraron tasas de desproporción altas que conducen a un reordenamiento completo del oligoalternano (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77-85).

Para el peso molecular de la alternansacarasa de acuerdo con la determinación por SDS PAGE, pueden encontrarse valores numéricos diferentes: 135 kDa, 145 kDa, 172 kDa y 196 kDa, respectivamente (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278-283; Kim & Robyt, Enzyme Microb. Technol. 16 (1994), 659-664; Zhanley & Smith, Applied and Environmental Microbiology 61(3) (1995) 1120-1123).

La actividad enzimática de una alternansacarasa puede demostrarse por ejemplo como se describe en López-Munguía et al., (Annals New York Academy of Sciences 613 (1990), 717-722), o como se describe en los ejemplos de la presente solicitud.

Una unidad de actividad (1 u) puede definirse como la cantidad de enzima que conduce a la liberación de 1 \mumol de fructosa en un minuto.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser moléculas de DNA, en particular moléculas genómicas. Además, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser moléculas de RNA. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden obtenerse por ejemplo a partir de fuentes naturales o puede producirse sintéticamente o por técnicas recombinantes.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención permiten preparar células hospedadoras que producen proteína alternansacarasa recombinante de alta pureza y/o en cantidades suficientes, y plantas producidas por ingeniería genética que poseen actividad de estas enzimas que conducen a la formación de alternano in planta. Dentro del marco de la presente invención, el término "alta pureza" significa que la proteína de acuerdo con la invención tiene un grado de pureza de al menos 80%, preferiblemente de al menos 90%, y todavía más preferiblemente de al menos 95%. Además, se proporcionan medios y métodos que pueden utilizarse para preparar alternano utilizando células hospedadoras y/o para preparar la proteína alternansacarasa recombinante. Por consiguiente, la provisión de las moléculas de ácido nucleico de la invención permite la preparación de alternano de alta pureza por métodos que son relativamente económicos y consumen relativamente poco tiempo.

En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico de la invención se derivan de microorganismos, preferiblemente de bacterias, más preferiblemente de bacterias Gram-positivas y en particular preferiblemente de bacterias pertenecientes al género Leuconostoc. Son particularmente preferidas las moléculas de ácido nucleico procedentes de bacterias pertenecientes a la especie Leuconostoc mesenteroides.

La invención se refiere también a oligonucleótidos que se hibridan específicamente a una molécula de ácido nucleico de la invención. Tales oligonucleótidos tienen una longitud de preferiblemente al menos 10, en particular al menos 15, y de modo particularmente preferible de al menos 50 nucleótidos. Los mismos se caracterizan porque se hibridan específicamente a las moléculas de ácido nucleico de la invención, es decir que no se hibridan o se hibridan sólo en una porción muy pequeña a secuencias de ácido nucleico que codifican otras proteínas, en particular otras glucosiltransferasas. Los oligonucleótidos de la invención pueden utilizarse por ejemplo como iniciadores para técnicas de amplificación tales como la reacción PCR o como sonda de hibridación para aislar genes afines.

Además, la invención se refiere a vectores, en particular plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores utilizados comúnmente en tecnología genética, que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención descritas anteriormente. En una realización preferida de la invención, los vectores de la invención se prestan por sí mismos a la transformación de células fúngicas o células de microorganismos. Preferiblemente, tales vectores son adecuados para transformar células vegetales. De modo particularmente preferible, dichos vectores permiten la integración de las moléculas de ácido nucleico de la invención, posiblemente junto con regiones reguladoras flanqueantes, en el genoma de la célula vegetal. Ejemplos de los mismos son vectores binarios que pueden utilizarse en la transferencia de genes mediada por Agrobacterias, y algunos están ya disponibles comercialmente.

En otra realización preferida, las moléculas de ácido nucleico contenidas en los vectores están conectadas a elementos reguladores que aseguran la transcripción y síntesis de un RNA traducible en células procariotas o eucariotas.

La expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención en células procariotas o eucariotas, por ejemplo en Scherichia coli, es interesante dado que permite una caracterización más precisa de las actividades enzimáticas de las enzimas codificadas por estas moléculas. Además, es posible expresar estas enzimas en tales células procariotas o eucariotas que están exentas de enzimas causantes de interferencia, tales como dextransacarasas u otras enzimas formadoras de polisacáridos o degradantes de polisacáridos. Adicionalmente, es posible insertar diferentes mutaciones en las moléculas de ácido nucleico por métodos usuales en biología molecular (véase por ejemplo Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{nd} edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY), que conducen a la síntesis de proteínas que tienen posiblemente propiedades biológicas modificadas. Por una parte, es posible en relación con esto producir mutantes de deleción en los cuales se producen moléculas de ácido nucleico por deleciones progresivas desde el extremo 5' o 3' de la secuencia de DNA codificante, y dichas moléculas de ácido nucleico conducen a la síntesis de proteínas correspondientemente más cortas. Tales deleciones en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos, por ejemplo, permiten identificar secuencias de aminoácidos que son responsables de la secreción de la enzima en microorganismos (péptidos de tránsito).

Esto permite la preparación deliberada de enzimas que ya no son secretadas por la eliminación de las secuencias correspondientes, pero que permanecen en el interior de la célula del organismo hospedador correspondiente o están localizadas en otros compartimientos, por ejemplo en los plásmidos, mitocondria, vacuola, debido a la adición de otras secuencias señal.

Por otra parte, la introducción de mutaciones puntuales es concebible también en posiciones en las cuales una modificación de la secuencia de aminoácidos influye por ejemplo en la actividad enzimática o el control de la enzima. De esta manera, es posible por ejemplo producir mutantes que poseen una estereo- y regio-selectividad modificada o un valor K_{m} modificado o que ya no están sujetos a los mecanismos de control existentes normalmente en la célula y realizados por la vía de un control alostérico o modificación covalente.

Además, pueden prepararse mutantes que poseen un sustrato modificado o especificidad de producto. Adicionalmente, es posible preparar mutantes que tienen un perfil actividad-temperatura modificado.

Adicionalmente, en el caso de la expresión en plantas, la inserción de mutaciones en las moléculas de ácido nucleico de la invención permite aumentar la tasa de expresión génica y/o la actividad de las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de la invención.

Para ingeniería genética en células procariotas, las moléculas de ácido nucleico de la invención o partes de estas moléculas pueden introducirse en plásmidos que permiten mutagénesis o modificación de secuencia por recombinación de secuencias de DNA. Los métodos estándar (véase Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY, EE.UU.) permiten la realización de intercambio de bases o la adición de secuencias naturales o sintéticas. Los fragmentos de DNA pueden conectarse unos a otros por aplicación de adaptadores y enlazadores a los fragmentos. Además, pueden utilizarse medidas de ingeniería que proporcionan sitios de rescisión adecuados o eliminan DNA en exceso o sitios de rescisión. En aquellos casos en los cuales son posibles inserciones, deleciones o sustituciones, pueden utilizarse mutagénesis in vitro, "reparación de iniciadores", restricción o ligación. En general, un análisis de secuencia, análisis de restricción y otros métodos de bioquímica y biología molecular se llevan a cabo como métodos de análisis.

Además, la invención se refiere al plásmido pAlsu-pSK (véase Fig. 2 y Ejemplo 2) que ha sido depositado en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen y Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, bajo el No. de acceso DSM 12666 el 4 de Febrero de 1999, y a moléculas de ácido nucleico contenidas en la inserción del plásmido DSM 12666 y que codifican una proteína que posee la actividad enzimática de una alternansacarasa. Además, la presente invención se refiere también a moléculas de ácido nucleico que se hibridan a la inserción del plásmido DSM 12666. Asimismo, la presente invención se refiere a moléculas ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos se desvía de la de las moléculas de ácido nucleico de la inserción del plásmido DSM 12666, debido a la generación del código genético. Adicionalmente, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que tienen una homología, es decir una identidad de secuencia de al menos 40%, preferiblemente de al menos 60%, más preferiblemente de al menos 80%, todavía más preferiblemente de al menos 90%, y de modo muy preferible de al menos 95% a la secuencia de la inserción del plásmido DSM 12666.

Otra realización de la invención se refiere a células hospedadoras, en particular células procariotas o eucariotas transformadas con una molécula de ácido nucleico de la invención arriba descrita o con un vector de la invención, y a células descendiente s de dichas células transformadas y que contienen una molécula de ácido nucleico o vector de la invención. De acuerdo con otra realización preferida, las células hospedadoras son células de microorganismos. En el contexto de la presente invención, el término "microorganismo" comprende bacterias y todos los protistas (v.g., hongos, en particular levaduras, algas) como se define en la obra de Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1985, 1-2). Una realización preferida de la invención se refiere a células de algas y células hospedadoras pertenecientes a los géneros Aspergillus, Bacillus, Saccharomyces o Pichia (Rodríguez, Journal of Biotechnology 33 (1994), 1835-146, Romanos, Vaccine, Vol. 9 (1991), 901 y siguientes. Una realización particularmente preferida de la invención se refiere a células de E. coli. La alternansacarasa es secretada de modo especialmente preferible por la célula hospedadora. La preparación de tales células hospedadoras para la producción de alternansacarasa recombinante puede llevarse a cabo por métodos conocidos por una persona experta en la técnica.

En una realización preferida de la invención, las células hospedadoras de la invención no exhiben actividades enzimáticas causantes de interferencia en ningún caso, tales como las de las enzimas formadoras de polisacáridos y/o degradantes de polisacáridos.

Una revisión de sistemas de expresión diferentes está contenida por ejemplo en Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, en Bitter et al. (Methods in Enzymology 152 (1987), 516-544) y en Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463), Griffiths et al, Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440). Una revisión de los sistemas de expresión de levadura ha sido dada por ejemplo por Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279), Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19), Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93), Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496), Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745) y Buckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072).

Los vectores de expresión han sido ampliamente descritos en la bibliografía. Como regla general, aquéllos contienen no sólo un gen marcador de selección y un origen de replicación que asegura la replicación en el hospedador seleccionado, sino también un promotor bacteriano o vírico, y en la mayoría de los casos una señal de terminación para la transcripción. Entre el promotor y la señal de terminación existe al menos un sitio de restricción o un polienlazador que permite la inserción de una secuencia de DNA codificante. La secuencia de DNA que controla naturalmente la transcripción del gen correspondiente puede utilizarse como la secuencia promotora, si la misma es activa en el organismo hospedador seleccionado. No obstante, esta secuencia puede intercambiarse también por otras secuencias promotoras. Es posible utilizar promotores que producen una expresión constitutiva del gen y promotores inducibles que permiten un control deliberado de la expresión del gen post-conectado. Secuencias promotoras bacterianas y víricas que poseen estas propiedades se describen en detalle en la bibliografía. Secuencias reguladoras para la expresión en microorganismos (por ejemplo E. coli, S. cerevisiae) se describen suficientemente en la bibliografía. Promotores que permiten una expresión particularmente alta del gen post-conectado son por ejemplo el promotor T7 (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), lacUV5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., en Rodríguez y Chamberlin (compiladores), Promoters, Structure and Function; Praeger, Nueva York, (1982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25), lp1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100). Como regla general, las cantidades de proteína son máximas desde el punto medio hasta aproximadamente el final de la fase logarítmica del ciclo de crecimiento de los microorganismos. Por esta razón, se utilizan preferiblemente promotores inducibles para la síntesis de proteínas. Estos promotores conducen a menudo a rendimientos de proteína mayores que los promotores constitutivos. El uso de promotores constitutivos fuertes conduce a la transcripción y traducción continuas de un gen clonado y esto tiene a menudo como resultado que se pierde energía para otras funciones celulares esenciales con el efecto de que el crecimiento de las células se ralentiza (Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie (1995). Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlín, Oxford, p. 342). Por esta razón, a fin de obtener una cantidad óptima de proteína, se utiliza a menudo un proceso en dos etapas. Primeramente, las células hospedadoras se cultivan en condiciones óptimas hasta una densidad de células relativamente alta. En el segundo paso, se induce luego la transcripción dependiendo del tipo de promotor utilizado. En conexión con esto, es particularmente adecuado un promotor tac que puede ser inducido por lactosa o IPTG (= isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido) (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25). Señales de terminación para la transcripción se describen también en la bibliografía.

La transformación de la célula hospedadora con DNA codificante de una alternansacarasa puede, por regla general, llevarse a cabo por métodos estándar, como se describe por ejemplo en Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2^{nd} edition (1989), Cold Spring Harbour Press, Nueva York, Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1990). La célula hospedadora se cultiva en medios nutrientes que cumplen los requisitos de la célula hospedadora particular utilizada, en particular con respecto al valor de pH, temperatura, concentración de sal, aireación, antibióticos, vitaminas, elementos traza, etc.

Además, la invención se refiere a proteínas y fragmentos biológicamente activos de las mismas, que son codificados por las moléculas de ácido nucleico de la invención y a métodos para su preparación, en donde una célula hospedadora de acuerdo con la invención se cultiva en condiciones que remiten la síntesis de la proteína, y la proteína se aísla subsiguientemente de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la alternansacarasa es una proteína producida recombinantemente. En el contexto de la presente invención, es una proteína preparada por inserción de una secuencia de DNA que codifica la proteína en una célula hospedadora y expresión de la misma en ella. La proteína puede aislarse luego de la célula hospedadora y/o del medio de cultivo.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención permiten ahora preparar células hospedadoras que producen proteína alternansacarasa recombinante de alta pureza y/o en cantidades suficientes. Dentro del marco de la presente invención, el término "alta pureza" significa que la proteína de acuerdo con la invención tiene un grado de pureza de al menos 80%, preferiblemente de al menos 90%, y todavía más preferiblemente de al menos 95%. Los métodos costosos y que consumen mucho tiempo ya mencionados anteriormente, por los cuales la proteína alternansacarasa que puede obtenerse hasta la fecha sólo a partir de cepas particulares de Leuconostoc puede purificarse de otros componentes tales como por dextransacarasas y polisacáridos, se evitan, dado que la alternansacarasa puede producirse en células hospedadoras que no poseen actividades sintetizadoras de polisacáridos adversas de ningún tipo. Además, pueden utilizarse también células hospedadoras y vectores, que permiten la producción de la proteína alternansacarasa en ausencia de sacarosa, con el resultado de que ya no es necesaria una separación adicional de la proteína alternansacarasa de los polisacáridos. Además, la selección de células hospedadoras y vectores adecuados permite proporcionar la proteína alternansacarasa en cantidades suficientes, lo cual no ha sido posible con los sistemas descritos hasta ahora.

La alternansacarasa producida por las células hospedadoras puede purificarse por métodos de purificación convencionales, tales como precipitación, cromatografía de cambio iónico, cromatografía de afinidad, filtración en gel, cromatografía HPLC de fase inversa, etc. La modificación de las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican una alternansacarasa y que se expresan en las células hospedadoras, permite producir un polipéptido en la célula hospedadora que es más fácil de aislar del medio de cultivo debido a propiedades particulares. Así, la proteína a expresar puede expresarse como una proteína de fusión con una secuencia de polipéptidos adicional, cuyas propiedades de fijación específicas permiten el aislamiento de la proteína de fusión por cromatografía de afinidad (v.g. Hopp et al., Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93).

Otra realización de la invención se refiere a proteínas que poseen la actividad enzimática de una alternansacarasa, en particular la de microorganismos, preferiblemente microorganismos Gram-positivos, particularmente microorganismos del género Leuconostoc, y de modo particularmente preferible la de Leuconostoc mesenteroides. El peso molecular de la proteína indicado en SEQ. ID No. 2, tal como se determina por cálculo, es 228,96 kDa. La invención se refiere también a alternansacarasas que poseen un peso molecular de 229 kDa \pm 120 kDa, preferiblemente 229 kDa \pm 50 kDa, y de modo particularmente preferible 230 kDa \pm 25 kDa. El peso molecular de la proteína madura, tal como se determina por cálculo, es 224,77 kDa.

La provisión de las moléculas de ácido nucleico de la invención, por primera vez, hace posible preparar células vegetales que expresan alternansacarasa por medio de ingeniería genética, lo cual no era posible hasta ahora, debido a que los métodos clásicos de cultivo no permiten la expresión de genes bacterianos y fúngicos en las plantas.

La invención se refiere también por tanto a células de plantas transgénicas transformadas por una molécula de ácido nucleico de la invención o un vector de la invención o procedente de dichas células, estando la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que tiene la actividad biológica de una alternansacarasa bajo el control de elementos reguladores que permiten la transcripción de un mRNA traducible en células vegetales.

La introducción de la actividad de las proteínas de la invención, por ejemplo por expresión de moléculas de ácido nucleico correspondientes, abre la posibilidad de producir alternano en células vegetales modificadas correspondientemente por ingeniería genética. Por tanto, es posible la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención en células vegetales, permitiendo la introducción de una actividad adicional correspondiente de alternansacarasa que no está presente en el tipo salvaje. Además, es posible modificar las moléculas de ácido nucleico de la invención de acuerdo con métodos conocidos por las personas expertas, a fin de obtener alternansacarasa de la invención que poseen por ejemplo dependencias modificadas de la temperatura o especificidades de sustrato o producto. Tales métodos han sido ya descritos con mayor detalle anteriormente en un contexto diferente.

Se dispone de una pluralidad de técnicas por las cuales puede insertarse DNA en una célula vegetal hospedadora. Estas técnicas incluyen la transformación de células vegetales por T-DNA utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, la fusión de protoplastos, inyección, electroporación de DNA, inserción de DNA por el método biolístico y otras posibilidades.

El uso de la transformación mediada por agrobacterias de células vegetales ha sido investigado extensamente y descrito suficientemente en el documento EP 120 516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al. Crit. Rev. Plant Sci. 4 (1993), 1-46 y An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287. Con relación a la transformación de patatas, véase por ejemplo Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8 (1989), 29-33).

La transformación de plantas monocotiledóneas por medio de vectores basados en Agrobacterium ha sido también descrita (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng et al, Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Conner y Dormisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al. Transgenic Res. 2 (1993), 252-265). Un sistema alternativo para transformar plantas monocotiledóneas es la transformación por el método biolístico (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24 (1994) 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), transformación de protoplastos, electroporación de células parcialmente permeabilizadas, inserción de DNA por fibras de vidrio. La transformación de maíz en particular ha sido descrita repetidamente en la bibliografía (véanse por ejemplo los documentos WO 95/06128, EP 0 513 849, EP 0 465 875, EP 292 435; Fromm et al, Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726).

La transformación con éxito de otros tipos de cereales ha sido descrita también, por ejemplo de la cebada (Wan and Lemaux, supra; Ritala et al., supra, Krens et al., Nature 296 (1982), 72-74) y trigo (Nehra et al., Plant J. 5 (1994), 285-297). Generalmente, cualquier promotor activo en células vegetales es adecuado para expresar las moléculas de ácido nucleico en células vegetales. El promotor puede seleccionarse también de modo que la expresión en las plantas de la invención ocurre constitutivamente o sólo en un tejido particular, en un momento particular del desarrollo de la planta o en un momento determinado por influencias externas. El promotor puede ser homólogo o heterólogo a la planta.

Promotores adecuados son por ejemplo el promotor de RNA 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (véase por ejemplo el documento US-A-5.352.605) y el promotor ubiquitina (véase por ejemplo el documento US-A-5.614.399) que se prestan por sí mismos a expresión constitutiva, el promotor B33 del gen patatina (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) que se presta por sí mismo a una expresión específica del tubérculo en las patatas o un promotor que asegura la expresión en tejidos fotosintéticamente activos únicamente, por ejemplo el promotor ST-LS1 (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO, J. 8 (1989) 2445- 2451), el promotor Ca/b (véanse por ejemplo los documentos US-A-5.656.496, US-A-5.639.952, Bansal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3654- 3658) y el promotor SSU de Rubisco (véanse por ejemplo los documentos US-A-5.034.322; US-A-4.962.028) o el promotor glutelina del trigo que se presta por sí mismo a expresión específica del endospermo (promotor HMW) (Anderson, Theoretical and Applied Genetics 96, (1998), 568-576, Thomas, Plant Cell 2 (12), (1990), 1171-1180), el promotor glutelina del arroz (Takaiwa, Plant Mol. Biol. 30 (6) (1996), 1207- 1221, Yoshihara, FEBS Lett. 383 (1996), 213-218, Yoshihara, Plant and Cell Physiology 37 (1996), 107-111), el promotor encogido del maíz Chaas, EMBO J. 8 (11) (1990), 3447-3452, Werr, Mol. Gen. Genet. 202 (3) (1986), 471-475, Werr, Mol. Gen. Genet. 212 (2), (1988), 341-350), el promotor USP, el promotor phaseolin (Sengupta-Gopalan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 3320-3324, Bustos, Plant Cell 1 (9) (1989), 839-853, o promotores de los genes zeína del maíz (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93). Sin embargo, pueden utilizarse también promotores que son activados únicamente en un momento determinado por influencias externas (véase por ejemplo el documento WO 93/07279). En relación con esto, pueden ser particularmente interesantes promotores de proteínas de choque térmico que permiten inducción simple. Además, pueden utilizarse promotores específicos de semillas tales como el promotor USP de Vicia faba que asegura una expresión específica de la semilla en Vicia faba y otras plantas (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). Además, pueden utilizarse también promotores específicos de frutos, tal como se describe en el documento WO 91/01373.

Adicionalmente, puede estar presente una secuencia de terminación, que sirve para terminar correctamente la transcripción y añadir una cola poli-A al transcrito, lo que se cree tiene una función en la estabilización de los transcritos. Tales elementos se describen en la bibliografía (véase por ejemplo Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) y pueden ser reemplazados a discreción.

Tales células pueden distinguirse de las células vegetales existentes naturalmente, entre otras cosas, por el hecho de que aquéllas contienen una molécula de ácido nucleico de la invención que no existe naturalmente en estas células. Además, tales células de plantas transgénicas de la invención pueden distinguirse de las células de plantas existentes naturalmente en que aquéllas contienen al menos una copia de la molécula de ácido nucleico de la invención integrada de manera estable en su genoma.

Además, las células vegetales de la invención pueden distinguirse preferiblemente de las células vegetales existentes naturalmente por al menos una de las características siguientes: si la molécula de ácido nucleico insertada de la invención es heteróloga para la célula vegetal, se encuentra entonces que las células de plantas transgénicas tienen transcritos de las moléculas de ácido nucleico insertadas de la invención. Las últimas pueden detectarse por ejemplo por análisis mediante transferencia Northern. Las células vegetales de la invención contienen preferiblemente una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico insertada de la invención. Esto puede demostrarse por ejemplo por métodos inmunológicos, en particular por análisis mediante transferencia Western.

Las células de plantas transgénicas pueden regenerarse para dar plantas enteras de acuerdo con métodos conocidos por las personas expertas en la técnica.

La presente invención se refiere también a las plantas que pueden obtenerse por regeneración de las células de plantas transgénicas de la invención. Adicionalmente, aquélla se refiere a plantas que contienen las células de plantas transgénicas arriba descritas.

En la mayoría de las plantas, los fotoasimilados en la forma de azúcares formados durante la fotosíntesis en una planta, es decir principalmente en la forma de sacarosa, son transportados a los órganos diana correspondientes. Dado que la sacarosa es el sustrato de la reacción de polimerización de la alternansacarasa, todas las plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas pueden, en principio, modificarse por la molécula de ácido nucleico de la invención con respecto a la expresión de alternansacarasa.

La expresión en plantas de las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican una proteína que tiene la actividad enzimática de una alternansacarasa puede, por ejemplo, utilizarse para conseguir una modificación de la viscosidad de los extractos obtenidos posiblemente a partir de las plantas, consiguiéndose dicha modificación por la síntesis de alternano. En relación con esto son interesantes por ejemplo los tomates. La expresión de una alternansacarasa en un fruto de tomate conduce a la síntesis de alternano y da como resultado una modificación de la viscosidad de los extractos obtenidos a partir de estos frutos, por ejemplo para la producción de puré de tomate o ketchup de tomate.

La expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención es particularmente ventajosa en aquellos órganos de la planta que tienen un alto contenido de sacarosa o almacenan sacarosa. Tales órganos son por ejemplo la remolacha de la remolacha azucarera o la caña de la caña de azúcar. Dado que estas plantas no almacenan normalmente en ningún caso cantidades apreciables de almidón, los alternanos sintetizados por la alternansacarasa a partir de estas plantas podían aislarse en la forma pura.

El sitio en el que tiene lugar la biosíntesis de la sacarosa en la célula vegetal es el citosol. El sitio de almacenamiento, en cambio, es la vacuola. Durante su transporte hasta el tejido de almacenamiento de la remolacha azucarera o la patata o durante su transporte al endospermo de las semillas, la sacarosa tiene que atravesar el apoplasto. Por tanto, los tres compartimientos, es decir el citosol, la vacuola y el apoplasto se prestan por sí mismos a la expresión de las moléculas de ácido nucleico para la síntesis del alternano. Adicionalmente, los plástidos se prestan también a ello por sí mismos, como podía demostrarse por ejemplo por la expresión de fructosil-transferasas bacterianas en los amiloplastos. Dichas fructosil-transferasas que requieren análogamente sacarosa como sustrato, eran capaces de mediar la formación de "amilofructano" en amiloplastos (Smeekens, Trends in Plant Science, Vol. 2, No. 8 (1997), 286-288).

En el caso de las plantas productoras de almidón tales como patatas y maíz, en las cuales la biosíntesis del almidón y el almacenamiento del almidón tienen lugar normalmente en los amiloplastos, una expresión de la alternansacarasa en apoplastos, en el citosol o en la vacuola podría conducir a una síntesis adicional de oligosacáridos y/o polisacáridos en estos compartimientos, lo cual puede significar un aumento global en el rendimiento.

Dado que en el caso de las patatas el almidón sintetizado en los amiloplastos puede separarse del alternano sintetizado en el apoplasto, en el citosol o en la vacuola, puede utilizarse la misma planta para recuperar almidón y alternano.

Además, se conocen plantas transgénicas de patata y maíz, en las cuales la síntesis de almidón en los tubérculos y granos respectivamente está inhibida por completo debido a la inhibición de la ADP-glucosa-pirofosforilasa por un constructo antisentido. En el caso de las patatas, se acumulan en lugar de ello azúcares solubles, en particular sacarosa y glucosa, por ejemplo en los tubérculos (Müller-Röber et al., EMBO J. 11 (1992), 1229-1238). El alternano puede prepararse en el citosol, la vacuola o el apoplasto de estas plantas por la expresión de una alternansacarasa que utiliza sacarosa como sustrato.

Por tanto, en otra realización de la invención, las células vegetales de la invención se caracterizan adicionalmente por una actividad reducida de ADP-glucosa-pirofosforilasa (AGPasa) comparada con las células correspondientes de las plantas de tipo salvaje.

Moléculas de DNA que codifican AGPasa son bien conocidas por las personas expertas en la técnica y se describen por ejemplo en Müller-Röber et al. (Mol. Gen. Genet. 224 (1) (1990), 136-146). Por utilización de moléculas de DNA que codifican una AGPasa es posible producir plantas por medio de técnicas de DNA recombinante (por ejemplo por un método antisentido, una ribozima o un método de cosupresión) que exhiben una actividad reducida de AGPasa. Adicionalmente, mutantes de AGPasa, por ejemplo de maíz (quebradizo-2 y encogido-2), con actividad reducida de AGPasa son conocidos por las personas expertas en la técnica.

El término "reducida" significa preferiblemente una reducción de la actividad de AGPasa de al menos 10%, más preferiblemente al menos 50% y todavía más preferiblemente de al menos 80% en comparación con las células de tipo salvaje correspondientes.

La actividad de una AGPasa puede determinarse de acuerdo con Müller-Röber et al. (Mol. Gen. Genet. 224 (1) (1990), 136-146) o con métodos conocidos por una persona experta en la técnica.

La reacción que es catalizada por la alternansacarasa se distingue por el hecho de que se transfiere directamente un resto glucosa desde la sacarosa a un aceptor de carbohidratos existente. En contraste, en el caso de las plantas, la biosíntesis de los glucanos lineales a partir de sacarosa transcurre de tal manera que la sacarosa se separa primeramente en glucosa y fructosa, las cuales se convierten luego cada una en ADP-glucosa intermedia activada. El resto glucosa es transferido por la enzima almidón-sintasa desde la ADP-glucosa a un glucano ya existente, con lo cual se libera ADP. La conversión de la sacarosa en dos moléculas de ADP-glucosa requiere varias reacciones que consumen energía. Por esta razón, el consumo de energía de la reacción catalizada por la alternansacarasa es sustancialmente menor que el consumo de energía en la síntesis de polisacáridos a partir de sacarosa en las células vegetales, lo que puede conducir a un rendimiento incrementado de oligo y/o polisacáridos sintetizados en las plantas que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención.

En la expresión de las moléculas de ácido nucleico en plantas existe en principio la posibilidad de que la proteína sintetizada pueda estar localizada en cualquier compartimiento de la célula vegetal (v.g. en el citosol, plástidos, vacuola, mitocondria) o la planta (v.g. en el apoplasto). Para conseguir la localización en un compartimiento particular, la región codificante tiene que estar enlazada, en caso necesario, a secuencias de DNA que aseguran la localización en el compartimiento correspondiente. Las secuencias señal utilizadas tienen que disponerse cada una en el mismo marco de lectura que la secuencia de DNA que codifica la enzima.

Con objeto de asegurar la localización en los plástidos, es concebible utilizar uno de los péptidos de tránsito siguientes: de la Ferredoxina plastídica: NADP+ oxidorreductasa (FNR) de espinaca que se incluye en Jansen et al. (Current Genetics 13 (1988), 517-522). En particular, puede utilizarse la secuencia comprendida entre los nucleótidos-171 y 165 de la Secuencia de cDNA descrita en dicho documento, que comprende la región 5' no traducida así como la secuencia que codifica el péptido de tránsito. Otro ejemplo es el péptido de tránsito de la proteína cérea del maíz que incluye los 34 primeros residuos de aminoácido de la proteína cérea madura (Klösgen et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989), 155-161). Es posible también utilizar este péptido de tránsito sin los 34 primeros aminoácidos de la proteína madura. Adicionalmente, pueden utilizarse los péptidos señal de la subunidad pequeña de ribulosa-bisfosfato-carboxilasa (Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 12760-12764), de la NADP-malato-deshidrogenasa (Gallardo et al., Planta 197 (1995), 324-332), de la glutatión-reductasa (Creissen et al., Plant J. 8 (1995), 167-175) o de la proteína R1, Lorberth et al. (Nature Biotechnology 16 (1998), 473-477).

Con objeto de asegurar la localización en la vacuola, es concebible utilizar uno de los péptidos de tránsito siguientes: la secuencia N-terminal (146 aminoácidos) de la proteína patatina Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106) o las secuencias señal descritas por Matsuoka y Neuhaus, Journal of Experimental Botany 50 (1999), 165-174; Chrispeels y Raikhel, Cell 68 (1992), 613-616; Matsuoka y Nakamura, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 834-838; Bednarek y Raikhel, Plant Cell 3 (1991), 1195-1206; Nakamura y Matsuoka, Plant Phys. 101 (1993), 1-5.

Con objeto de asegurar la localización en la mitocondria, es por ejemplo concebible utilizar el péptido tránsito descrito por Braun et al. (EMBO J. 11, (1992), 3219-3227). Para asegurar la localización en el apoplasto, es concebible utilizar uno de los péptidos de tránsito siguientes: secuencia señal del gen II inhibidor de proteinasa (Keil et al., Nucleic Acid Res. 14 (1986), 5641-5650; Von Schaewen et al., EMBO J. 9 (1990), 30-33), del gen levansacarasa de Erwinia amylovora (Geier y Geider, Phys. Mol. Plant Pathol. 42 (1993), 387-404), de un fragmento del gen patatina B33 de Solanum tuberosum, que codifica los 33 primeros aminoácidos (Rosahl et al., Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 214- 220) o del descrito por Oshima et al. (Nucleic Acid Res. 18 (1990), 181).

La secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID No. 1 codifica una alternansacarasa extracelular. La secreción es asegurada por una secuencia señal que comprende los aproximadamente 39 primeros residuos de aminoácido N-terminales de la SEQ ID No. 2.

Las plantas transgénicas pueden, en principio, ser plantas de cualquier especie vegetal, es decir que pueden ser plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Preferiblemente, las plantas son plantas útiles cultivadas por el hombre para su alimentación o para propósitos técnicos, en particular industriales. Aquéllas son preferiblemente plantas que almacenan almidón, por ejemplo especies de cereales (centeno, cebada, avena, trigo, mijo, sagú, etc.), arroz, guisante, guisante de médula, mandioca y patata; tomate, colza, soja, cáñamo, lino, girasol, fríjol de vaca o arrurruz, plantas formadoras de fibras (v.g. lino, cáñamo, algodón), plantas almacenadoras de aceite (v.g. colza, girasol, soja) y plantas almacenadoras de proteínas (v.g. legumbres, cereales, habas de soja). La invención se refiere también a árboles frutales y palmas. Además, la invención se refiere a plantas forrajeras (v.g. hierbas de forraje y pasto, tales como alfalfa, trébol, ballico), hortalizas (v.g. tomate, lechuga, achicoria) y plantas ornamentales (v.g. tulipanes, jacintos). Se prefieren las plantas almacenadoras de azúcar y/o almacenadoras de almidón. Son particularmente preferidas la caña de azúcar y la remolacha azucarera, así como las plantas patata, maíz, arroz, trigo y tomate.

Un objeto adicional de la invención es un método para la producción de células de plantas transgénicas y plantas transgénicas que, en comparación con las células de tipo salvaje no transformadas/plantas de tipo salvaje no transformadas sintetizan alternano. En este método, la expresión y/o la actividad de las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de la invención está incrementada en comparación con las células de tipo salvaje/plantas de tipo salvaje correspondientes que no exhiben expresión y/o actividad alguna de alternansacarasa. En particular, dicho método comprende la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención en células vegetales. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención está enlazada preferiblemente a un promotor que asegura la expresión en células vegetales. En una realización particularmente preferida, el método comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula vegetal y regeneración de una planta a partir de esta célula.

Un aumento en la expresión de este tipo puede, v.g., ser detectado por análisis de transferencia Northern. El aumento de actividad puede detectarse por ensayo de extractos proteínicos en cuanto a su actividad de alternansacarasa derivada de las células vegetales. La actividad enzimática de una alternansacarasa puede medirse, por ejemplo, como se describe en López-Munguía et al. (Annals New York Academy of Sciences 613, (1990), 717-722) o como se describe en los ejemplos de la presente solicitud.

La invención se refiere también a material de propagación de las plantas de la invención. El término "material de propagación" comprende aquellos componentes de la planta que son adecuados para producir progenie vegetativa o generativamente. Medios adecuados para propagación vegetativa son por ejemplo esquejes, cultivos de callo, rizomas o tubérculos. Otro material de propagación incluye por ejemplo frutos, semillas, plantas de semillero, protoplastos, cultivos de células, etc. Los materiales de propagación preferidos son tubérculos y semillas. La invención se refiere también a partes cosechables de las plantas de la invención tales como, por ejemplo, frutos, semillas, tubérculos o rizomas.

Otra realización de la invención se refiere a métodos para preparación de alternano que comprenden el paso de extraer y aislar alternano a partir de una planta de la invención.

La extracción y el aislamiento de alternano de una planta de la invención pueden realizarse por métodos estándar, tales como precipitación, extracción y métodos cromatográficos.

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Además, la presente invención se refiere a alternano que puede obtenerse a partir de una plana de la invención o a partir de material de propagación de la invención.

Además, la presente invención se refiere a un método para preparación de alternano y/o fructosa, en el cual una célula hospedadora de la invención secreta una alternansacarasa en un medio de cultivo que contiene sacarosa y se aísla(n) alternano y/o fructosa a partir del medio de cultivo.

Una realización preferida del método de la invención utiliza una alternansacarasa producida recombinantemente y secretada por la célula hospedadora en el medio de cultivo, evitando así la necesidad de fragmentar las células y purificar la proteína ulteriormente, dado que la proteína secretada puede obtenerse a partir del sobrenadante. Los componentes residuales del medio de cultivo pueden separarse por métodos usuales en la tecnología de procesamiento, tales como diálisis, ósmosis inversa, métodos cromatográficos, etc. Esto mismo es aplicable a la concentración de la proteína secretada en el medio de cultivo. La secreción de proteínas por microorganismos está mediada normalmente por péptidos señal N-terminales (secuencia señal, péptido conductor, péptido de tránsito). Las proteínas que poseen esta secuencia señal pueden atravesar la membrana celular del microorganismo. Puede conseguirse una secreción de proteínas por adición de la secuencia de DNA que codifica este péptido señal a la región correspondiente que codifica la alternansacarasa.

Se prefiere el péptido señal natural de la alternansacarasa expresada, siendo particularmente preferido el de la alternansacarasa de Leuconostoc mesenteroides NRRL B 1355 (véanse los aproximadamente 25 a 45 primeros residuos de aminoácido N- terminales de SEQ ID No. 2).

Es muy preferido el péptido señal de una \alpha-CGTasa de Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler et al., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291) o un péptido señal tal como el codificado por los nucleótidos 11529-11618 de la secuencia disponible bajo el número de acceso en GenBank X86014.

La preparación de alternano y/o fructosa no requiere derivados activados de glucosa ni co-factores, como son necesarios en la mayoría de las reacciones de síntesis para polisacáridos que existen en las células. Por tanto, pueden cultivarse microorganismos secretores de alternansacarasa en medio que contiene sacarosa, conduciendo la alternansacarasa secretada a una síntesis de alternano y fructosa en el medio de cultivo.

Contrariamente a las células hospedadoras de Leuconostoc mesenteroides, que secretan alternansacarasa por naturaleza, las células hospedadoras utilizadas de acuerdo con la invención tienen la ventaja de que no secretan proteínas que originen reacciones secundarias sintetizadoras de polisacáridos adversos, tales como dextransacarasa, con el resultado de que fuera de la célula hospedadora, aparte del alternano, no puede formarse ningún otro polisacárido que, como regla general, puede separarse del alternano únicamente por procedimientos costosos y que consumen mucho tiempo. Además, las células hospedadoras de acuerdo con una realización preferida de la invención no tienen actividad secundaria alguna degradante de los polisacáridos adversos, que en caso contrario podría conducir a pérdidas en el rendimiento del alternano producido.

El método de la invención produce fructosa aparte de alternano. La fructosa puede utilizarse para el aislamiento económico de los denominados "jarabes ricos en fructosa" (HFCS). Los métodos convencionales para preparación de fructosa por una parte conducen a la desintegración enzimática de la sacarosa por medio de una invertasa o al desdoblamiento del almidón en unidades de glucosa, producida en la mayoría de los casos por hidrólisis ácida, y a la conversión enzimática subsiguiente de la glucosa en fructosa por las glucosa-isomerasas. Sin embargo, ambos métodos conducen a mezclas de glucosa y fructosa. Los dos componentes tienen que separarse subsiguientemente uno de otro por métodos cromatográficos.

La separación de los dos productos de la reacción del método de la invención, o la separación de los productos de la reacción a partir del sustrato sacarosa puede realizarse por ejemplo con el uso de membranas que permiten la penetración de la fructosa, pero no la penetración de sacarosa y/o alternano. Si se proporciona la eliminación continua de la fructosa por la vía de una membrana de este tipo, se produce una conversión más o menos completa de la sacarosa.

El aislamiento de alternano y fructosa puede realizarse por métodos estándar o puede realizarse como se describe v.g. en los ejemplos prácticos.

De acuerdo con una realización del método, las células hospedadoras proceden de microorganismos, preferiblemente de Escherichia coli.

En otra realización, el método de la invención trabaja con células hospedadoras fúngicas, en particular células de levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae. Las células de levadura que producen alternano en medio que contiene sacarosa a causa de la actividad enzimática de una alternansacarasa, no pueden utilizarse fácilmente, dado que las levaduras secretan una invertasa que descompone la sacarosa extracelular. Las levaduras aprovechan las hexosas resultantes por la vía de un transportador de hexosa. Sin embargo, se ha descrito una cepa de levadura (Riesmeyer et al EMBO J. 11 (1992), 4705- 4713) que lleva un gen suc2 defectuoso, y por consiguiente no puede secretar invertasa. Además, estas células de levadura no contienen un sistema de transporte capaz de importar sacarosa en las células. Si una cepa de este tipo se modifica por medio de las moléculas de ácido nucleico de la invención de tal modo que secrete una alternansacarasa en el medio de cultivo, se sintetizarán entonces fructosa y alternano en el medio que contiene sacarosa. La fructosa resultante puede ser absorbida subsiguientemente por las células de levadura.

En otra realización preferida de este método, la célula hospedadora de la invención está presente en una forma inmovilizada.

Como regla general, las células hospedadoras se inmovilizan por inclusión de las células en un material adecuado, tal como alginato, poliacrilamida, gelatina, celulosa o quitosano. Sin embargo, la adsorción o fijación covalente de las células a un material soporte es también posible (Brodelius y Mosbach, Methods in Enzymology Vol. 135 (1987), 222-230). Una ventaja de la inmovilización de células es que la misma permite conseguir densidades de células sustancialmente mayores que lo hace el cultivo en medio de cultivo líquido. Esto da como resultado una mayor productividad. Además, los costes para agitación y aireación del cultivo disminuyen al igual que lo hacen los costes para las medidas a fin de mantener la esterilidad. Otro aspecto importante es la posibilidad de una producción continua de alternano con el resultado de que las fases no productivas que existen regularmente en los procesos de fermentación pueden evitarse o al menos reducirse en gran parte.

Otra realización de la invención se refiere a un método para preparar alternano y/o fructosa, en el cual

a)

una solución que contiene sacarosa se pone en contacto con una proteína de la invención en condiciones que permiten la conversión de sacarosa en alternano y/o fructosa; y

b)

el alternano y/o la fructosa se aísla(n) a partir de la solución.

En esta realización, la invención se refiere por tanto a un método para preparación de alternano y/o fructosa in vitro por medio de una preparación enzimática exenta de células. En este caso, los microorganismos que secretan por ejemplo alternansacarasa se cultivan hasta la fase estacionaria en un medio que contiene sacarosa que permite la formación de la proteína alternansacarasa. Después de la eliminación de las células del medio de cultivo por centrifugación, la enzima secretada puede recuperarse del sobrenadante. La enzima puede añadirse subsiguientemente a soluciones que contienen sacarosa a fin de sintetizar alternano y/o fructosa. En comparación con la síntesis de alternano arriba descrita en un sistema no exento de células, este método ofrece la ventaja de que las condiciones de reacción pueden controlarse mejor y los productos de reacción son sustancialmente más puros y más fáciles de purificar. La purificación de la proteína puede llevarse a cabo como se ha descrito ya anteriormente.

Una realización preferida del método de la invención utiliza una alternansacarasa purificada. Debe entenderse que el término alternansacarasa purificada significa una enzima que está en gran parte exenta de componentes celulares de las células en las cuales la proteína se sintetiza y no exhibe contaminación alguna con proteínas que posean actividades sintetizadoras de polisacáridos (v.g. dextransacarasas) o actividades degradantes, y/o no contienen contaminación alguna con aceptores (polisacáridos). El término "alternansacarasa purificada" significa preferiblemente una alternansacarasa que tiene un grado de pureza de al menos 70%, preferiblemente al menos 85%, y de modo parcialmente preferible al menos 95%.

El uso de una proteína purificada para preparación de alternano y/o fructosa ofrece diversas ventajas. Comparado con los métodos que operan con extractos de proteínas parcialmente purificados, el medio de reacción del método de la invención no contiene residuo alguno de la cepa de producción (microorganismo) que se utiliza para la purificación de la proteína o para su preparación por ingeniería genética.

Además, el uso de la proteína purificada es ventajoso para aplicaciones en las industrias alimentaria y farmacéutica. Gracias al hecho de que el medio de reacción está definido en su composición y exento de todos los componentes innecesarios, el producto está análogamente definido de modo más preciso en lo que se refiere a sus componentes. Como consecuencia de esto, el procedimiento para la obtención de la aprobación por las industrias alimentaria y farmacéutica de estos productos producidos por ingeniería genética requiere sustancialmente menos documentación, debido especialmente a que estos productos no exhibirían traza alguna de un microorganismo transgénico.

Además, contrariamente a los métodos in vitro descritos hasta ahora en sistemas exentos de células que utilizan preparaciones de alternansacarasa parcialmente purificadas, el método de la invención que utiliza una alternansacarasa purificada tiene la ventaja de que permite preparar alternano de alta pureza sin la existencia de contaminaciones de dextransacarasa y dextrano, debido a la alta pureza de la proteína de la invención. Además, el método de la invención permite la producción de alternano con rendimientos altos, sin las pérdidas causadas por ejemplo por reacciones secundarias adversas de una dextransacarasa, que podrían convertir parte del sustrato sacarosa en dextrano no deseado, cuya separación del alternano sería únicamente posible utilizando métodos costosos y que consumen mucho tiempo.

El método de la invención produce fructosa además de alternano. La fructosa puede utilizarse para la recuperación económica de los denominados "jarabes con alto contenido de fructosa" (HFCS). El método de la invención proporciona productos de alta pureza, debido al uso de una alternansacarasa purificada. Por tanto, en comparación con los métodos convencionales para preparación de HFCS a partir de almidón de maíz, que comprenden pasos de proceso costosos para eliminar las sales tampón por intercambio iónico (Crabb y Mitchinson, TIBTECH 15 (1997), 349-352) el método de la invención no requiere una purificación costosa de la fructosa.

Otra realización preferida del método de la invención utiliza una alternansacarasa preparada recombinantemente.

De acuerdo con otra realización preferida, la enzima que posee la actividad enzimática de una alternansacarasa está inmovilizada sobre un material soporte.

La inmovilización de la alternansacarasa ofrece la ventaja de que la enzima que es el catalizador de la reacción de síntesis puede recuperarse fácilmente de la mezcla de reacción y reutilizarse varias veces. Dado que la purificación de las enzimas es normalmente costosa y consume mucho tiempo, la inmovilización y reutilización de las enzimas permiten un ahorro sustancial de costes. Otra ventaja es el grado de pureza de los productos de reacción que no contienen proteína residual alguna.

Existen muchos materiales soporte disponibles para la inmovilización de proteínas, y el acoplamiento al material soporte puede hacerse por enlaces covalentes o no covalentes (para una revisión véase: Methods in Enzymology 135, 136, 137). Materiales soporte ampliamente utilizados incluyen por ejemplo agarosa, alginato, celulosa, poliacrilamida, sílice o nailon.

De acuerdo con otra realización de la invención, la alternansacarasa (inmovilizada sobre un material soporte) está presente entre dos membranas, una de las cuales permite que penetre la fructosa, pero no la sacarosa y el alternano, permitiendo la otra la penetración de la sacarosa, pero no del alternano. El suministro con sustrato se produce a través de la membrana que permite que la atraviese la sacarosa. El alternano sintetizado permanece en el espacio entre las dos membranas y la fructosa liberada puede separarse continuamente del equilibrio de reacción por la vía de la membrana que permite únicamente que la atraviese la fructosa. Una disposición de este tipo permite una separación eficiente de los productos de reacción, y por tanto la producción de fructosa pura.

Además, la separación de fructosa por cromatografía de intercambio iónico ha sido descrita ("Starch Hydrolysis Products, Worldwide Technology, Production, and Application", recopilado por F.W. Schenck, R.E. Hebeda, (1992), VCH Publishers, Inc., Nueva York).

Así pues, el uso de alternansacarasas para preparar fructosa pura por una parte implica la ventaja de que el sustrato relativamente económico sacarosa puede utilizarse como el material de partida, y por otra parte que puede aislarse fácilmente la fructosa de la mezcla de reacción sin conversiones enzimáticas o métodos cromatográficos adicionales.

Además, la invención se refiere a métodos para preparación de alternano y/o fructosa, en los cuales

a)

una solución que contiene sacarosa se pone en contacto con una proteína de la invención y moléculas aceptoras en condiciones que permiten la conversión de sacarosa en alternano y/o fructosa; y

b)

el alternano y/o la fructosa se aísla(n) de la solución.

Dentro del marco de la presente invención, se entiende que una molécula aceptora significa una molécula en la cual una alternansacarasa es capaz de catalizar una reacción de extensión de cadena. El aceptor que puede añadirse a la mezcla de reacción al comienzo de la reacción es preferiblemente un carbohidrato o un derivado de carbohidrato. El uso de aceptores externos conduce a la producción de productos de peso molecular bajo que se designarán alternano en el contexto de la presente invención. El aceptor carbohidrato es preferiblemente un oligo- o polisacárido, en particular un polisacárido ramificado, tal como dextrina, glucógeno o amilopectina, preferiblemente un polisacárido lineal, y de modo particularmente preferible un sacárido seleccionado del grupo constituido por maltosa, isomaltosa, isomaltotriosa y metil-\alpha-D-glucano. Si ocurre una extensión de la cadena de alternano en estos aceptores, se forman entonces productos que tienen un peso molecular mayor que el material de partida. En el caso en que se utilizan maltosa, isomaltosa, isomaltotriosa y metil-\alpha-D-glucano, se obtienen productos que tienen un peso molecular menor que el alternano que pueden prepararse en ausencia de aceptores de carbohidrato externos.

La magnitud del peso molecular de los oligoalternanos preparados depende de la relación sacarosa/aceptor utilizada. Por ejemplo, el grado de polimerización de los productos aumenta a medida que aumenta la relación sacarosa/isomaltosa.

Además, la relación sacarosa/aceptor tiene cierta influencia en el rendimiento de oligoalternano. Por ejemplo, el rendimiento de oligoalternano aumenta a medida que disminuye la relación sacarosa/isomaltosa.

Los métodos descritos hasta ahora para producción de oligoalternano con el uso de alternansacarasas que según reivindican los autores han sido purificadas (Pelenc et al., Sciences Des Aliments 11 (1991), 465-476) proporcionaban únicamente mezclas de productos de oligoalternano y oligodextrano, en presencia del aceptor carbohidrato maltosa. En este caso, la síntesis de oligodextrano es atribuible probablemente a contaminaciones con dextransacarasa de la preparación de alternansacarasa. En comparación con este método, el método de la invención ofrece la ventaja de que el uso de la proteína alternansacarasa producida recombinantemente que no contiene contaminante alguno de dextransacarasa permite la preparación de oligoalternano sin la formación simultánea de oligodextrano. Así, el método de la invención hace posible proporcionar oligoalternano, sin requerir pasos costosos adicionales de purificación para la separación de oligodextrano.

De acuerdo con otra realización preferida, la enzima que posee la actividad enzimática de una alternansacarasa está inmovilizada sobre un material soporte.

De acuerdo con otra realización preferida del método de la invención, se utiliza una alternansacarasa producida recombinantemente.

Por último, la presente invención se refiere a un método para preparación de productos cosméticos o productos alimenticios que comprende uno de los métodos arriba descritos de fabricación de alternano de la invención y la formulación del alternano así obtenido en una forma que es adecuada para una de las aplicaciones del producto correspondiente arriba mencionadas.

Estas y otras realizaciones se describen y son evidentes para una persona experta y están abarcadas por la descripción y los ejemplos de la presente invención. Bibliografía adicional en relación con uno de los métodos, medios y aplicaciones arriba descritos, que pueden utilizarse dentro del significado de la presente invención, puede obtenerse de la técnica anterior, por ejemplo de bibliotecas públicas, por ejemplo por el uso de medios electrónicos. Este propósito puede ser atendido, inter alia, por bases de datos públicas, tales como la "medline", que están accesibles de Internet, por ejemplo bajo la dirección http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Otras bases de datos y direcciones son conocidas por las personas expertas y pueden obtenerse de Internet, por ejemplo bajo la dirección http://www.lycos.com. Una revisión de fuentes e información en relación con patentes y solicitudes de patente en biotecnología está contenida en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Descripción de las figuras

Fig. 1:

Mapa lineal de la región entera de la secuencia que se clonó después del escrutinio de una genoteca genómica de Leuconostoc mesenteroides NRRL B 1355 por los fragmentos solapantes correspondientes de los clones AS-19B1, AS-19B2, AS-28B y AS-28Ba.

Fig. 2:

Mapa del plásmido pAlsu-pSK

Fig. 3:

Cromatograma HPLC: preparación de oligoalternano en presencia de maltosa (Ejemplo 2).

Fig. 4:

Mapa del plásmido pAlsu-pET24a

Fig. 5:

SDS PAGE con ensayo subsiguiente de la actividad de sacarasa (véase Ejemplo 6).

Se utilizan los extractos proteínicos siguientes

1 + 2): E. coli BL21 (DE3) que contiene pAlsu-pET24a-3

3 + 4): E. coli BL21 (DE3) que contiene pAlsu-pET24a-7

5 + 6): E. coli BL21 (DE3) que contiene pAlsu-pET24a-21

7 + 8): E. coli BL21 (DE3) que contiene pAlsu-pET24a

1, 3, 5, 7) cultivo antes de inducción con IPTG

2, 4, 6, 8) cultivo obtenido al final de la operación de cultivo

Fig. 6:

Cromatograma HPLC de dextrano T10

Fig. 7:

Cromatograma HPLC de dextrano T10 después de digestión con dextranasa.

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Fig. 8:

Cromatograma HPLC de oligoalternano.

Fig. 9:

Cromatograma HPLC de oligoalternano después de digestión con dextranasa.

Fig. 10:

Mapa de la casete de expresión que incluye el polienlazador del plásmido pBinAR-N.

Fig. 11:

Mapa del plásmido pat-Alsu-Hyg.

Fig. 12

Mapa del plásmido fnr-Alsu-Hyg.

Ejemplos

Vectores utilizados en los ejemplos:

1. pBinAR-N

Por el uso de métodos estándar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd}issue; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU. (1989)) los autores de la invención introdujeron un polienlazador diferente (véase figura 10) entre el promotor 35S y el terminador OCS en el plásmido pBinAR (Höfgen y Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230). El plásmido resultante se designó pBinAR-N.

2. pBinAR-Hyg-N

Los autores de la invención aislaron por métodos estándar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd}issue; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU. (1989)) un fragmento EcoRI/HinDIII a partir de pBinAR-N que contenía el promotor 35S, el polienlazador y el terminador OCS. Este fragmento de ligó luego en los mismos sitios de restricción del plásmido pBIB-Hyg (Becker, Nucleic Acids Research 18 (1990), 203). El plásmido resultante se designó pBinAR-Hyg-N.

3. pBinAR-pat-Hyg

Por utilización de los oligonucleótidos Sp-pat-5' y Sp-pat-3' (véanse SEQ ID No. 48 y SEQ ID No. 49) se amplificaron moléculas de DNA codificantes del péptido conductor de la proteína patatina de la patata (véase SEQ ID NO: 50, que difiere de la secuencia utilizada por Sonnewald et al. Plant J. 1 (1991), 95-106) por un método PCR utilizando el plásmido pgT5 (Rosahl et al., Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 214-220; Sonnewald et al. Plant J. 1 (1991), 95-106) como molde. Los productos PCR resultantes se cortaron por las enzimas de restricción XbaI y SalI y se ligaron luego en el plásmido pBinAR-Hyg-N que se linealizó antes utilizando las enzimas de restricción SpeI y SalI. El plásmido resultante se designó pBinAR-pat-Hyg.

Condiciones de la PCR

Tampón y polimerasa de Boehringer Mannheim (Polimerasa Pwo No. 1644947)

DNA	0,2 ng
10x tampón + MgSO_{4}	5 \mul
dNTPs (10 mM cada uno)	1 \mul
Iniciador Sp-pat-5'	120 nM
Iniciador Sp-pat-3'	120 nM
Polimerasa Pwo	1,0 unidades
Agua destilada	hasta 50 \mul

Condiciones de reacción

Paso 1	95ºC	2:30 min
Paso 2	95ºC	0:30 min
Paso 3	64ºC	0:30 min
Paso 4	72ºC	0:30 min
	(más 1 s por ciclo)
Paso 5	72ºC	5:00 min

Los pasos 2 a 4 se repitieron 35 veces de una manera cíclica.

4. pBinAR-FNR-Hyg

Utilizando los oligonucleótidos Sp-fnr-5' y Sp-fnr-3 (véase SEQ ID NO: 51 y 52) se amplificaron moléculas de DNA codificantes del péptido del tránsito de la proteína FNR a partir de espinaca por un método PCR que utilizaba el plásmido p6SocFNR-15 (Jansen et al., Current Genetics 13, (1988), 517-522) como molde. Los productos PCR resultantes se cortaron con XbaI y SalI y se clonaron luego en el pBinAR-Hyg-N abierto con SpeI/SalI. El plásmido resultante se designó pBinAR-fnr-Hyg.

Condiciones de la PCR

Tampón y polimerasa de Gibco BRL (DNA-polimerasa Taq Platino de Alta Fidelidad No. 1304-011)

DNA	0,2 ng
10 x tampón	5 \mul
MgSO_{4}	2,0 \mul
dNTPs (por 10 mM)	1 \mul
Iniciador Sp-fnr-5'	150 nM
Iniciador Sp-fnr-3'	150 nM
Polimerasa Taq Platino Hifi	1,5 unidades
Agua destilada	Hasta 50 \mul

Condiciones de reacción

Paso 1	95ºC	2:30 min
Paso 2	95ºC	0:30 min
Paso 3	58ºC	0:30 min
Paso 4	68ºC	0:20 min
	(más 1 s por ciclo)
Paso 5	68ºC	3:00 min

Los pasos 2 a 4 se repitieron 35 veces de una manera cíclica.

Ejemplo 1 Clonación de alternansacarasa a partir de Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355 Aislamiento y secuenciación de la alternansacarasa

La cepa Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355 se cultivó en 1 l de Caldo MRS de Lactobacilos (Difco) complementado con 5% de sacarosa a 28ºC durante 2 días. Después de someter el cultivo a centrifugación a 20.000 x g durante 30 minutos, se mezcló el sobrenadante con el mismo volumen de ácido tricloro-acético al 10% y se agitó a 4ºC durante 16 horas. Esta solución se sometió luego a centrifugación a 10.000 x g durante 30 minutos. El precipitado así obtenido se disolvió en 4,5 ml de Tris-HCL 40 mM, pH 8,8, y se neutralizó subsiguientemente con (aproximadamente 0,5 ml) de base Tris 2 M. Esta solución de proteínas se entregó a la compañía Toplab Gesellschaft für angewandte Biotechnologie mbH, Martinsried, Alemania, para secuenciación de la proteína. En esta compañía, la solución de proteínas se separó por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, se tiñó el gel con Azul Coomassie y se separó subsiguientemente la tinción con ácido acético al 10%. Para la digestión enzimática de la proteína, las bandas de proteína se cortaron del gel, se prensaron a través de un tamiz y se fragmentaron (poros de 30 \mum x 100 \mum). El gel triturado se lavó luego con tampón de incubación semiconcentrado (Tris 12,5 mM, EDTA 0,5 mM de pH 8,5) durante 2 minutos. Subsiguientemente, se sometió el mismo a centrifugación, se separó el tampón y se secó el gel en el "Speedvac" durante 1 hora (aproximadamente 5% de agua residual, semejante a caucho). Subsiguientemente, se preparó una solución de endoproteinasa LysC en 400 \mul de Tris/HCl 12,5 mM, pH 8,5 (enzima:proteína = 1:10) y 0,1% de laurilmaltosa. Se añadieron 200 \mul de esta solución a la muestra y se incubaron en el agitador de sacudidas térmico de bloque a 37ºC durante una noche. Para eluir los fragmentos peptídicos, se llevó a cabo una incubación durante una hora con TFA al 1%, dos veces, seguido por centrifugación, y subsiguientemente por elución con 10% de ácido fórmico, 20% de isopropanol y 60% de acetonitrilo durante 3 horas. Los fragmentos peptídicos obtenidos se separaron luego unos de otros por HPLC (columna Superspher 60 RP select B (Merck, Darmstadt)) de 2 mm x 125 ml; tampón A, ácido trifluoroacético al 0,1%; tampón B: TFA al 0,085% en acetonitrilo; caudal: 0,2 ml/min; gradiente: 5-60% en 60 min; detección a 206 nm. Los fragmentos peptídicos obtenidos se secuenciaron luego en un secuenciador automático Procise 492 (Applied Biosystems, PE); siendo el procedimiento la degradación escalonada de Edman en una modificación de acuerdo con Hunkapiller (Hunkapiller et al., Meth. Enzymol. 91 (1983), 399-413). Se identificaron 6 secuencias peptídicas diferentes (véanse SEQ ID Nos. 5 a 9, SEQ ID No. 21) que se designaron lysC-66, lysC-67, lysC-82, lysC-83, lysC-88 y "término N".

Preparación de una genoteca genómica de DNA a partir de Leuconostoc mesenteroides NRRL B1355

Se cultivó Leuconostoc mesenteroides NRRL B1355 (adquirido de ATCC) en 100 ml de medio YT (Sambrook et al., loc. cit.) que contenía adicionalmente 2% (peso/volumen) de glucosa y tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 7,0 a 28ºC durante 36 horas. Después de cosechar las células por centrifugación, se aisló el DNA genómico de acuerdo con Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Greene and John Wiley & Sons (1994), EE.UU.).

Se digirieron parcialmente 100 \mug de DNA genómico de Leuconostoc mesenteroides NRRL B1355 con 0,001 unidades de la enzima de restricción Sau3A durante 30 minutos, se extrajeron subsiguientemente con fenol:clorofor-
mo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se precipitaron con etanol. 2,5 \mug del DNA parcialmente digerido obtenido de Leuconostoc mesenteroides NRRL B1355 se ligaron con DNA-ligasa T4 en 1 \mug del vector cortado con BamHI y desfosforilado pBKCMVBamHI (Stratagene) en las condiciones indicadas por el fabricante (Stratagene, manual de instrucciones de vectores fagémidos pBK y kit de ligación con DNA-ligasa T4). 2 \mul de la mezcla de ligación se empaquetaron con Gigapack III Gold (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se guardaron después que se hubo determinado la cantidad de contenido de fago.

Preparación de la sonda para aislamiento del gen de alternansacarasa

A partir de las secuencias peptídicas lysC-66 (SEQ ID No. 5), lysC-67 (SEQ ID No. 6), lysC-82 (SEQ ID No. 7), lysC-83 (SEQ ID No. 8) y lysC-88 (SEQ ID No. 9) obtenidas después de digestión con tripsina de la proteína alternansacarasa purificada (véase arriba) los péptidos lysC-82 y lysC-83, después de haberse sometido a traducción inversa, se seleccionaron para la síntesis de oligonucleótidos degenerados (SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11). Dichos oligonucleótidos sirvieron como iniciadores en una reacción PCR sobre DNA genómico de NRRL B1355. Todas las posiciones dentro de los oligonucleótidos representados como N se reemplazaron por inosina en la síntesis de iniciadores.

Condiciones de la Reacción PCR

La mezcla de reacción se preparó con los tampones suministrados para polimerasa Taq (Compañía Gibco BRL).

Mezcla de reacción

Polimerasa Taq (Gibco) DNA	100 ng (NRRL-B1355 genómico)
DNTPs	2,5 mM para cada nucleótido
Iniciador	10 \mul de una solución que contenía 0,2 \mumol
10 x tampón	5 \mul
Cloruro de magnesio	2 mM
Polimerasa	1 unidad
Agua	hasta 50 \mul
Paso 1	95ºC 3'
Paso 2	95ºC 1'
Paso 3	58ºC 2'
Paso 4	72ºC 2'
Paso 5	72ºC 10'

Cuarenta repeticiones de los pasos 2 a 4

Un fragmento de 837 pb (SEQ ID No. 12) resultante de esta reacción PCR, cuyos extremos se hicieron romos con DNA-polimerasa T4, se clonó en el vector pBlueSkript cortado con SmaI (Stratagene). El plásmido resultante se designó pAlsu-PCR-lysc82/83. Después de secuenciación de la inserción y traducción ayudada por ordenador en las secuencias de proteína correspondientes, se llevó a cabo una comparación de bases de datos en la base de datos SwissProt. Esta comparación mostró homologías con glicosil-transferasas conocidas (P49331, P11001, P68987, P13470, P27470, y P29336).

Aproximadamente 5.000 fagos de la genoteca de DNA genómico de Leuconostoc mesenteroides NRRL B1355 se extendieron en placas utilizando las cepas bacterianas y soluciones nutrientes indicadas por el fabricante (Stratagene), y después de incubación a 37ºC durante 12 horas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Esto fue seguido por desnaturalización de los fagos por inmersión de los filtros de nitrocelulosa en cloruro de sodio 1,5 M, solución de sosa cáustica 0,5M durante 2 minutos y neutralización de los filtros por inmersión en cloruro de sodio 1,5M, Tris-HCl 0,5M, pH 8,0 durante 5 minutos. Después de enjuagar los filtros en Tris-HCl 0,2M, 2 x SSC, el DNA de fago se unió a las membranas por reticulación UV (Stratalinker de la compañía Stratagene, 120.000 \muJ durante 30 segundos). Los filtros se incubaron en una solución de prehibridación (5 x SSC, 0,5% BSA, 5 x Denhardt, 1% SDS, tampón de fosfato de sodio 40 mM, pH 7,2, 100 ml/g de DNA de esperma de arenque, formamida al 25%) a 42ºC durante 6 horas. 30 ng de la inserción aislada procedente del plásmido pAlsu-PCR-lysc82/83 se marcaron radiactivamente por medio de un kit multiprima (Boehringer Mannheim) utilizando \alpha-^{3}2P dCTP (ICN Biomedicals). Esta sonda radiactiva se añadió a la mezcla de prehibridación y los filtros se incubaron en esta mezcla de hibridación a 42ºC durante una noche. Después de la eliminación de la mezcla de hibridación, los filtros se lavaron tres veces en una solución de lavado (0,1 x SSC, 0,5% SDS) a 55ºC durante 15 minutos. Se puso luego sobre el filtro una película de rayos X (Kodak) durante 18 horas. Las colonias de fago, que producían señales de hibridación, se identificaron, aislaron, resuspendieron en medio SM y se extendieron luego nuevamente en placas en una disolución de tal modo que las mismas podían ser reconocidas como placas simples. Después que estos fagos se transfirieron a filtros de nitrocelulosa y se sometieron a tratamiento adicional e hibridación en condiciones como las descritas anteriormente, se obtuvieron fagos de hibridación como materiales aislados individuales por medio de la sonda génica radiactiva utilizada. Después de escisión in vivo de los fagos aislados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene), los clones AS-19B1 y AS-19B2 pudieron aislarse como plásmidos. Después de la secuenciación completa de ambos clones (Agowa) (SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14) ambas secuencias exhibían una superposición de 1008 pb. La unión de SEQ ID No. 13 con SEQ ID No. 14 seguida por traducción ayudada por ordenador de todos los marcos de lectura posibles permitió identificar un marco de lectura continuo, que comenzaba con el codón ATG (correspondiente a las bases 678 a 670 en SEQ ID No. 1). Dado que no pudo encontrarse ningún codón de parada en este marco de lectura compuesto, se aislaron clones adicionales a fin de obtener la secuencia codificante completa de la
alternansacarasa.

Para ello, se examinaron de nuevo aproximadamente 5.000 fagos de la genoteca de DNA genómico de L. mesenteroides NRRL B1355 respecto a hibridación por medio de un subfragmento del clon AS-19B2 marcado radiactivamente utilizando el kit multiprima (Boehringer Mannheim), como se ha descrito arriba. La sonda de hibridación se preparó con el uso del fragmento HindIII (sitio de restricción en la inserción de AS- 19B2)/SalI (que corta el vector fagémido pBKCMV en el polienlazador) de AS-19B2. Dicho fragmento contiene 372 bases del extremo 3' de las secuencias que codifican el marco de lectura arriba descrito. El escrutinio de la genoteca de fago, la elección, y la transformación de los fagos en plásmidos se llevaron a cabo en las condiciones arriba descritas. Después del análisis completo de la secuencia de los clones AS-28B (véase SEQ ID No. 15) y AS-29Ba (SEQ ID No. 16) así aislados, fue posible identificar una superposición de 960 bases idénticas (correspondientes a las bases 4863 a 5823 en SEQ ID No. 1) entre los clones AS- 19B2 (SEQ ID No. 14) y AS-28B y una superposición de 567 bases idénticas (correspondientes a las bases 5256 a 5823 en SEQ ID No. 1) entre los clones AS-19B2 y AS-29Ba (SEQ ID No. 16). Los clones AS-28B y AS-29Ba tienen 1523 bases idénticas (correspondientes a las bases 5256 a 6779 en SEQ ID NO.: 1). Después de unión ayudada por ordenador de los clones AS-19B1, AS-19B2 y AS-28B apareció un marco de lectura continuo que comenzaba con el codón ATG (bases 678 a 680 en la secuencia completa). Este marco de lectura no contiene tampoco un codón de parada. Después de la unión de los clones AS-19B1, AS-19B2, AS-28B y AS-29Ba, fue posible identificar un marco de lectura que comenzaba con el codón "ATG" (correspondiente a las bases 678 a 680 en SEQ ID No. 1) y que terminaba con "TAA" (correspondiente a las bases 6849 a 6851 en SEQ ID No. 1) que codificaba 2057 aminoácidos. Además de la región codificante, la secuencia de DNA entera, aislada e identificada de los clones compuestos (SEQ ID Nos.: 13-16) contiene 677 bases en la región 5' y 2469 bases en la región 3' que representan secuencias que no codifican alternansacarasa
(véase Fig. 1).

Ejemplo 2 Construcción del plásmido pAlsu-pSK para la transformación de E. coli y ensayo de los extractos proteínicos para actividad enzimática

Los plásmidos AS-19B1, AS-19B2, AS-28B y AS-29Ba (véase el Ejemplo 1) se unieron de la manera siguiente: se insertó un fragmento NotI- (sitio de restricción en el polienlazador del vector pBK CMV, compañía Novagen)/ClaI del clon AS-19B1 en el vector pBlueScript SK (compañía Stratagene) en los mismos sitios de restricción (= primer paso de clonación). La inserción consecutiva del fragmento ClaI/ShoI de AS-19B2, el fragmento XhoI/MluI de AS-28B y MluI/BsaBI (fragmento cortado con BsaBI clonado en el sitio de restricción romo ApaI del vector) de AS-28B en el clon obtenido por el primer paso de clonación produjo el plásmido pAlsu-pSK (véase Fig. 2). Este plásmido contiene la secuencia codificante completa de la alternansacarasa de Leuconostoc mesenteroides NRRL B1355 así como secuencias no codificantes de 677 pares de bases (región promotora) en la región 5' y 539 pb en la región 3' (SEQ ID No. 17).

\newpage

El plásmido pAlsu-pSK se transformó luego en E. coli (DH5\alpha-, compañía Fermentas). Las bacterias se cultivaron luego a 27ºC durante 2 días en 50 ml de "caldo Terrific" (cuya composición se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{nd} edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (complementado con 0,5% de glucosa)) o en un medio de fermentación que tenía la composición siguiente: KH_{2}PO_{4} 1,5 g/l, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5,0 g/l, NaCl 0,5 g/l, citrato de sodio 1,0 g/l, Fe2^{+}SO_{4} x 7H_{2}O 0,075 g/l, extracto de levadura 0,5 g/l, triptona 1,0 g/l, glucosa 15,0 g/l, MgSO_{4} x 7H_{2}O 0,3 g/l, CaCl_{2} x 2 H_{2}O 0,014 g/l, sales minerales 10 ml/l, H_{3}BO_{3} 2,5 g/l, CoCl_{2} x 6H_{2}O 0,7 g/l, CuSO_{4} x 5 H_{2}O 0,25 g/l), MnCl_{2} x 4H_{2}O 1,6 g/l, ZnSO_{4} x 7H_{2}O 0,3 g/l, Na_{2}MoO_{4}
x 2H_{2}O 0,15 g/l, vitamina B1 (tiamina) 0,005 g/l.

Todos los cultivos contenían 100 mg/l de ampicilina. Las células se recogieron luego por centrifugación, se resuspendieron en 2 ml de tampón de fosfato de Na 50 mM, de pH 7,2 y se machacaron en una Prensa Francesa. Subsiguientemente, aquéllas se sometieron de nuevo a centrifugación para eliminar las partículas sólidas de las células trituradas, y el sobrenadante (al que se hace referencia en lo sucesivo como extracto (de proteínas)) se utilizó después de filtración en condiciones estériles (Sterivex GV 0,2 \mum, Millipore) para análisis ulteriores.

Preparación in vitro de alternano por medio de extractos de proteínas

Para la preparación in vitro de alternano, 200 \mul de cada uno de los extractos obtenidos se examinaron en 2 ml cada uno de tampón de citrato de Na 100 mM de pH 6,5 y sacarosa al 20% (p/v) respecto a actividad en presencia y ausencia de 100 \mul de maltosa 10 mM. La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 24 horas. En la precipitación subsiguiente con el mismo volumen de etanol en ausencia de maltosa no se encontró polímero precipitable alguno. En el lote que contenía maltosa, la cromatografía HPLC (columna Dionex PA-100, tampón de pasada NaOH 150 mM, tampón de elución NaOH 150 mM + gradiente de tampón de acetato de sodio 3M) demostró la formación de oligómeros (véase Fig. 3).

Gel de actividad

Se aplicaron 20 ml de cada uno de los extractos proteínicos individuales a un gel de SDS-PAA al 6% y se separaron a una intensidad de corriente de 20 mA por gel. (Antes de la aplicación a los geles, los extractos no se incubaron a 95ºC). Subsiguientemente, los extractos se examinaron respecto a actividad de sacarasa de acuerdo con el método de Miller y Robyt (Analytical Biochemistry 156 (1986), 357-363).

El control (dextransacarasa NRRL-B-512F, véase el Ejemplo 3 para su preparación) exhibía actividad de polimerización. Los extractos proteínicos de las células de E. coli arriba descritas que contenían el plásmido pAlsu-pSK, no exhibían actividad alguna de formación de polímero.

Ejemplo 3 Clonación y expresión de dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides NRRL-B512F Aislamiento de DNA genómico

Se cultivó Leuconostoc mesenteroides NRRL-B512F (obtenido de ATCC) a 28ºC durante 48 horas en medio YT (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2^{nd} edition (1989), Cold Spring Harbor Press, Nueva York) que contenía adicionalmente 1% de sacarosa y tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 7,0. Después de recoger las células por centrifugación, se aisló el DNA genómico de acuerdo con Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Greene and John Wiley & Sons (1994), EE.UU.).

Amplificación por PCR del Gen de Dextransacarasa y Clonación en pET24a

Para la expresión recombinante de dextransacarasa en E. coli, el gen codificante de dextransacarasa se clonó en el vector de expresión pET24a (Novagen) después de amplificación por PCR. Para este propósito, se introdujo un sitio de restricción EagI en el extremo 5' de las secuencias codificantes de la dextransacarasa y un sitio de restricción XhoI en el extremo 3', junto con los iniciadores PCR utilizados (5'b512-1: 5'-ACTgCggCCgCATgCCATTTACAgAAAAAg-3'; SEQ ID No. 3 y 3'b512: 5'-ACTgCTCgAgTTATgCTgACACAgCATTTC-3'; SEQ ID No. 4) derivados de la secuencia del documento WO 89/12386. Se llevó a cabo la clonación subsiguiente en los sitios de restricción correspondientes del polienlazador de pET24a. El plásmido resultante se designó UL5-20.

Condiciones de la reacción PCR

Se utilizaron tampón y polimerasa de la compañía Gibco BRL.

DNA:	100 ng (NRRL-B512F genómico)
10 x tampón	5 \mul
MgCl_{2}	4 mM
Iniciador 5'	50 ng
Iniciador 3'	50 ng
DNTP	1 mM de cada nucleótido
Pfu-polimerasa	0,5 unidades
Agua	hasta 50 \mul
Paso 1	95ºC, 4 minutos
Paso 2	95ºC, 1 minuto
Paso 3	55ºC, 1 minuto
Paso 4	72ºC, 5 minutos
Paso 5	72ºC, 10 minutos

Se hicieron 40 repeticiones de los pasos 2 y 4.

Preparación de dextransacarasa recombinante

Células E. coli BL21(DE3) que contenían el plásmido UL5-20 se cultivaron en medio YT (véase arriba) a 37ºC hasta una densidad óptica DO_{600} = 0,8. Subsiguientemente, las células se sometieron a inducción con IPTG 0,2 mM y se cultivaron de nuevo a 18ºC durante 24 horas. Después de recoger las células por centrifugación y resuspender las mismas en tampón de fosfato de sodio, pH 5,2, las células se trituraron en una Prensa Francesa. La solución obtenida se liberó de componente insolubles por centrifugación y se obtuvo el sobrenadante que contenía dextransacarasa y al que se hace referencia en lo sucesivo como el extracto.

Ejemplo 4 Amplificación por PCR de la Región Codificante de Alternansacarasa y Clonación en pET24a

La región codificante de alternansacarasa se amplificó en una reacción PCR (véanse las condiciones de reacción más adelante) con DNA genómico de la cepa NRRL B1355 de Leuconostoc mesenteroides como molde. Se introdujo un sitio de restricción NheI en el extremo 5' por medio de los iniciadores A1-4 (SEQ ID No. 18), y un sitio de restricción SalI en el extremo 3' por medio del iniciador A1-5 (SEQ ID No. 19). Se aisló un fragmento de aproximadamente 6200 pb.

A1-4: 5'-GGG CCC GCT AGC ATG AAA CAA CAA GAA ACA GT

A1-5: 5'-CCC GGG GTC GAC CTT TGT CGA ATC CTT CCC

Condiciones de reacción de la PCR (kit de la compañía Gibco BRL)

DNA	1 \mul
10 x tampón	5 \mul
10 mm x dNTP	2 \mul
MgSO_{4} 50 mM	2 \mul
Iniciador por 1 \mul DNA-polimerasa Platinum	0,2 \mul
Agua destilada	37,8 \mul
Paso 1	95ºC, 2 minutos
Paso 2	95ºC, 20 segundos
Paso 3	47ºC, 20 segundos
Paso 4	68ºC, 7 minutos (prolongado en 3 segundos por ciclo)
Paso 5	68ºC, 15 minutos

Los pasos 2 a 4 se repitieron 35 veces en total antes de la realización del paso 5.

El fragmento PCR obtenido se purificó de acuerdo con métodos estándar, se trató con las endonucleasas de restricción NheI y SalI, se ligó al vector pET24a (de la compañía Novagen) que se había cortado análogamente con estas enzimas, y el producto de ligación se transformó en E. coli. Después de preparación del plásmido y digestión de restricción, se seleccionaron tres clones positivos. Los mismos se designaron pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7 y pAlsu-pET24a-21 (véase Fig. 4), respectivamente. Todos ellos contenían la secuencia indicada en SEQ ID No. 20 como inserción.

Ejemplo 5 Expresión de la Alternansacarasa Recombinante en E. coli en Cultivos de Frasco de Sacudidas y en el Fermentador Cultivo en Frasco de Sacudidas

Los plásmidos pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7, pAlsu-pET24a-21 y pET24a se transformaron en E. coli BL21 (DE3), de la compañía Novagen, y después de cultivo inicial a 37ºC durante 3 horas en 3 ml de medio YT (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{nd} Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) se cultivaron cada uno en matraces de sacudidas en 2 réplicas en 50 ml de medio mínimo de Davis (Manual DIFCO, Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology, 10^{th} edition, Detroit, Michigan, EE.UU. (1984)) que contenía 0,2% de glucosa en lugar de dextrosa como fuente de carbono a 37ºC hasta que se alcanzó una densidad óptica DO_{600} de aproximadamente 0,8. Después de centrifugación y resuspensión, uno de los dos cultivos réplica se cultivó en Medio Mínimo de Davis (DMA) que contenía 1% de lactosa como fuente de carbono e inductor a 27ºC durante otras 16 horas. Las células de los cultivos individuales se recogieron después de centrifugación, se resuspendieron en tampón de acetato de sodio 50 mM de pH 5,3, y se preparó un extracto de proteínas como se describe en el Ejemplo 2.

Fermentador

El clon pAlsu-pET24a-21 transformado en E. coli BL21(DE3) se cultivó en un fermentador de 2 litros (Biostad B; B. Braun, Melsungen) en las condiciones siguientes:

Medio

Medio de fermentación: KH_{2}PO_{4} 1,5 g/l, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5,0 g/l, NaCl 0,5 g/l, citrato de sodio 1,0 g/l, Fe2^{+}SO_{4} x 7H_{2}O 0,075 g/l, extracto de levadura 0,5 g/l, triptona 1,0 g/l, glucosa 15,0 g/l, MgSO_{4} x 7H_{2}O 0,3 g/l, CaCl_{2} x 2 H_{2}O 0,014 g/l, sales minerales 10 ml/l, H_{3}BO_{3} 2,5 g/l, CoCl_{2} x 6H_{2}O 0,7 g/l, CuSO_{4} x 5 H_{2}O 0,25 g/l), MnCl_{2} x 4H_{2}O 1,6 g/l, ZnSO_{4} x 7H_{2}O 0,3 g/l, Na_{2}MoO_{4} x 2H_{2}O 0,15 g/l, vitamina B1 (tiamina) 0,005 g/l.

Fuente de carbono: Glucosa (1,5% (p/v)) está presente en el medio, y se añade solución de glucosa al 70% (p/v).

Control automático del pH por amoniaco y ácido fosfórico a pH 7,0 \pm 0,1. Se ajusta una concentración de 20% de pO_{2} en el medio por control con el agitador.

Condiciones

Se inocularon 1,5 l de medio de fermentación con 50 ml del precultivo.

Las células se cultivaron primeramente a 37ºC hasta que se consumió la glucosa presente. Se cultivaron luego aquéllas a la misma temperatura y con una tasa de alimentación de 9 g de glucosa x l^{-1} x h^{-1} hasta que se alcanzó una densidad óptica DO_{600} = 40. En este momento, la temperatura del caldo de cultivo se rebajó a 20ºC y la cantidad de adición de glucosa se rebajó a 2 g x l^{-}2 x h^{-1}. A una temperatura de cultivo de 20ºC, se sometió el cultivo a inducción con IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido (Sigma)) 0,2 mM. Después de cultivar a 20ºC durante 18 horas más, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 5,3 y se preparó un extracto como se describe en el Ejemplo 2.

Ejemplo 6 Ensayo SDS-PAGE de la Actividad de la Alternansacarasa Recombinante, Oxidación con Ácido Peryódico Tinción de Acuerdo con Schiff

Se prepararon extractos proteínicos a partir de cultivos de E. coli en matraces de sacudidas (cepa BL21(DE3)), que contenían los plásmidos pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7, pAlsu-pET24a-21 y pET24a (control), respectivamente. Se prepararon dos extractos diferentes en cada caso a partir de las células transformadas con los diferentes extractos, preparándose uno de dichos extractos antes de la inducción con IPTG y preparándose el otro después de inducción con IPTG al final del cultivo. la actividad de estos extractos de cultivos en matraces de sacudidas (véase el Ejemplo 5) se detectó por separación mediante SDS-PAGE de las proteínas, seguida por eliminación del SDS por lavado con tampón de acetato de sodio 50 mM de pH 5,3 e incubación de los geles en acetato de sodio 50 mM de pH 5,3, sacarosa al 5% (p/v) a 37ºC durante 16 horas, seguido por oxidación con ácido peryódico del polímero formado y tinción por medio de reactivo ácido de Schiff (Miller y Robyt, Analytical Biochemistry 156, (1986), 357-363).

La Fig. 5 muestra que no se ha encontrado actividad de sacarasa para ninguno de los extractos (preparación del extracto antes y después de inducción con IPTG) que contenga el vector de clonación pET24a. En el caso de las cepas que se habían transformado con los plásmidos pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7 y pAlsu-pET24a-21, respectivamente, todos los extractos de proteínas exhibían actividad de sacarosa al final de la fase de inducción (concentrada en una banda).

Antes de la inducción con IPTG no se encontraban dichas bandas de actividad.

Dado que el polímero formado en el gel puede teñirse de acuerdo con los métodos arriba descritos para el reactivo ácido de Schiff, puede suponerse que no está compuesto de unidades con enlaces \alpha^{{\sim}}1,3 puras que no conducirían a tinción alguna.

Dado que el gen contenido en los vectores pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7 y pAlsu-pET24a-21, respectivamente, se aisló de la cepa de Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355 que expresa al menos una dextran-sacarasa aparte de alternansacarasa, no fue posible determinar inequívocamente con este método de tinción si la secuencia de ácido nucleico contenida en el plásmido codifica realmente una alternansacarasa. Dextranos y alternanos pueden detectarse ambos por este método dado que ambos polímeros contienen enlaces \alpha1,6.

Ejemplo 7 Ensayos para la Actividad Enzimática de Alternansacarasas Preparadas Recombinantemente Después de Tratamiento Térmico y para la Especificidad de la Alternansacarasa

A fin de probar las actividades de polimerización, se utilizaron extractos de cultivos en matraces de sacudidas (véase el Ejemplo 5). Se añadieron 100 \mul de extracto en cada caso a 2 ml de tampón de reacción (acetato de sodio 50 mM de pH 5,3, sacarosa al 20%) y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Para comparación, se utilizaron un extracto desactivado por un tratamiento de 10 minutos a 95ºC, y un extracto de E. coli BL21 (DE3) que contenía el vector pET24a. Se encontró formación de polímero únicamente en el lote que no se había desactivado, mientras que el lote tratado a 95ºC durante 10 minutos y el lote con el extracto de BL21 (DE3) que contenía pET24a no exhibían formación alguna de polímero. Después de la adición del mismo volumen de etanol absoluto a todos los lotes, únicamente pudieron precipitarse polímeros a partir del lote que no se había desactivado. Este descubrimiento es una indicación clara de la actividad de alternansacarasa, dado que la dextransacarasa presente en NRRL B-1355 se desactiva por un tratamiento a 45ºC durante 30 minutos, mientras que la alternansacarasa se permanece activa en estas condiciones (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77-85). El ensayo enzimático por una prueba enzimática acoplada de la glucosa y fructosa liberadas y de la sacarosa contenida todavía en la mezcla de reacción después de 24 horas, respectivamente, revelaron que estaba presente únicamente fructosa en el extracto que no se había desactivado.

Para la realización del ensayo enzimático, se añade proteína purificada o extracto de proteína bruto en diluciones diferentes a lotes de 1 ml que contienen 5% de sacarosa y acetato 50 mM, pH 5,5 y se somete a incubación a 37ºC. Después de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos y 30 minutos, se retiran en cada caso 10 \mul de estos lotes y se termina la actividad enzimática de la alternansacarasa por calentamiento inmediato a 95ºC. Subsiguientemente, en el ensayo fotométrico acoplado, se determinan las porciones de fructosa y glucosa liberadas por la alternansacarasa y la porción de sacarosa consumida, respectivamente. Para este propósito, se ponen de 1 \mul a 10 \mul de la muestra desactivada en 1 ml de tampón de imidazol 50 mM, pH 6,9, MgCl_{2} 2 mM, ATP 1 mM, NAD 0,4 mM y 0,5 U/ml de hexoquinasa. Después de adición secuencial de aproximadamente 1 u de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (de Leuconostoc mesenteroides), aproximadamente 1 u de fosfoglucosa-isomerasa y aproximadamente 5 u de invertasa, se mide la alteración de la adsorción a 340 nm. Subsiguientemente, se calcula la cantidad de fructosa y glucosa liberadas y de sacarosa consumida, respectivamente, de acuerdo con la ley de Lambert-Beer.

En los lotes de control (desactivación del extracto por tratamiento con 95ºC y extracto de E. coli que contenía pET24a) no se encontró liberación significativa alguna de fructosa ni disminución alguna de sacarosa, respectivamente, en el lote de reacción al cabo de 24 horas. Estos resultados confirman que la especificidad de la sacarasa codificada por los plásmidos pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7 y pAlsu-pET24a-21, respectivamente, es la de una glucosiltransferasa. La especificidad de una fructosil-transferasa, cuya presencia se ha descrito para algunas cepas del género Leuconostoc debe excluirse, dado que en caso contrario debería haberse encontrado glucosa.

Ejemplo 8 Producción de Alternano por Medio de Alternansacarasa Preparada en E. coli

Se añadieron 100 ml de extracto obtenido por fermentación de E. coli BL21 (DE3) que contenía el plásmido pAlsu-pET24a-3 (véase Ejemplo 4) a 900 ml de tampón de reacción (acetato de sodio 50 mM de pH 5,3, 20% de sacarosa) y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. La adición de la misma cantidad de etanol absoluto a la mezcla de reacción hizo que precipitase el alternano formado. Después de lavar dos veces el precipitado con etanol al 50%, se secó el mismo por liofilización. El rendimiento de polímero seco basado en la cantidad de sacarosa utilizada en la reacción era 60%.

Ejemplo 9 Análisis HPLC de Alternano y Dextrano Después de Digestión con Dextranasa

Se disolvieron en cada caso 100 mg del polímero preparado en el Ejemplo 7 y 100 mg de dextrano T10 (Pharmacia) en 1 ml de agua. Se añadieron 40 \mul de cada una de estas soluciones a 700 \mul de tampón de reacción (fosfato de potasio 50 mM de pH 5,7, 8 unidades de dextranasa, ICN Biomedicals Inc. No. 190097), y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. Se analizaron 50 \mul de las soluciones de polímero no tratadas con dextranasa (véase Fig. 6) y 50 \mul de las soluciones de polímero tratadas con dextranasa (Fig. 7) por HPLC (Dionex, columna PA-100, NaOH/gradiente NaOH-NaAc).

En el caso de dextrano T10, puede verse claramente la escisión del polímero en moléculas diferentes de pesos moleculares inferiores. El dextrano entero de peso molecular alto se convierte por la dextranasa en unidades más pequeñas (principalmente isomaltosa). En contraste, en el caso del alternano, aparecen únicamente oligosacáridos de cadena corta en pequeñas cantidades después de incubación con dextranasa. La mayor parte del alternano no es digerible por la dextranasa. Este descubrimiento sugiere que el producto preparado por la alternansacarasa recombinante no es dextrano, sino alternano que se sabe es difícilmente accesible a la digestión enzimática por la dextranasa (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77-85).

Ejemplo 10 Preparación In Vitro de Alternano en Ausencia de Dextranasa

Se añadieron 100 \mul de extracto de cultivos en matraces de sacudidas (véase Ejemplo 5) a 2 ml de tampón de reacción (acetato de sodio 50 mM, pH 5,3, sacarosa al 20%). Se añadieron adicionalmente 50 unidades de dextranasa (Biomedicals Inc. No. 190097) a otro lote. Dos lotes correspondientes que contenían dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1512F en lugar del extracto enzimático sirvieron como controles; a uno de estos dos lotes se había incorporado adicionalmente por mezcla dextranasa.

Después de precipitación con etanol, el lote de reacción con dextransacarasa y dextranasa no exhibía formación alguna de polímero. Se encontró que todos los restantes lotes exhibían formación de polímero.

Ejemplo 11 Preparación in vitro de Oligoalternano y Análisis HPLC

Se preparó oligoalternano como se describe en el Ejemplo 2, con un extracto de proteínas en presencia de maltosa y se detectó subsiguientemente (véase Fig. 8) por cromatografía HPLC (véase Ejemplo 2). Para comparación, una porción de este lote se mezcló con 50 unidades de dextranasa (Biomedicals Inc. 190097) después de preparación de oligoalternano y se llevó a cabo asimismo la separación subsiguiente por cromatografía HPLC (véase Fig. 9). Una comparación de los dos cromatogramas indica que no sólo la altura de los dos picos que pueden asignarse al oligoalternano (anómeros \alpha y \beta) (tiempo de retención entre 15,87 y 16,61 minutos) sino también la altura de todos los restantes picos, cuyos primeros signos son ya visibles sin dextranasa, se mantienen inalteradas. Este descubrimiento sugiere que la alternansacarasa preparada recombinantemente permite la preparación de oligoalternano sin la producción simultánea de oligodextrano. El oligodextrano sería propenso a la digestión por dextranasa, lo que se habría demostrado en una disminución de la altura de los picos en el cromatograma HPLC, si estuviera presente oligodextrano.

Ejemplo 12 Análisis de Metilación del Alternano

Para analizar ulteriormente el alternano producido in vitro se llevó a cabo un análisis de metilación:

Permetilación

La permetilación se realizó como ha sido descrito por Ciucanu y Kerek (Carbohydr. Res. 131 (1984), 209-218) por utilización de NaOH/MeI en DMSO o utilizando un método modificado de acuerdo con Hakomori (Journal of Biochemistry 55 (1964 FEB), 205-208) que está basado en el uso de Li-Dimsyl/Mel (Dimsyl = carbanión metilsulfinilo) recién preparado en DMSO a la temperatura ambiente.

Todas las reacciones se efectuaron en atmósfera de nitrógeno. Los productos de permetilación se aíslan por extracción del exceso de yoduro de metilo mediante el uso de diclorometano. El DMSO y las sales se separaron al final por lavado.

Degradación en sorbitacetatos parcialmente metilados (análisis de metilación)

Los glucanos permetilados se hidrolizaron con ácido trifluoroacético 2N a 120ºC durante 1-3 horas. Después de enfriamiento, se separó el ácido mediante nitrógeno. A continuación, los glucanos resultantes se co-destilaron con una pequeña cantidad de tolueno, después de lo cual se redujeron por NaBD_{4} en amoniaco 1N y finalmente, se acetilaron con piridina/anhídrido acético (3 h, 90ºC). Los productos se extrajeron con diclorometano y se lavaron con NaHCO_{3}. Los productos contenidos en la fase orgánica se analizaron por cromatografía de gases.

Análisis de los productos acetilados

Los productos acetilados se analizaron por cromatografía de gases que se realizó con un cromatógrafo fabricado por la compañía Carlo-Erba, modelo GC 6000 Vega, equipado con un inyector sobre la columna, un CPSol8CB 25 m y un detector FID. Como gas portador se utilizó hidrógeno (80 kPa).

La identificación e integración de los picos se realizaron como ha sido descrito por Sweet et al. (Carbohydr. Res. 40 (1975), 217).

Resultados

Se identificaron por cromatografía de gases los componentes principales siguientes:

Sorbita acetilada en Posición	Interpretación
1,5	Glucopiranosa terminal
1,3,5	Glucopiranosa enlazada en posición 3
1,5,6	Glucopiranosa enlazada en posición 6
1,3,5,6	Glucopiranosa enlazada en posición 3,6

Adicionalmente, se encontraron también pequeñas cantidades (cantidad relativa 0,2-0,4% en moles) de los componentes siguientes: sorbita-1,4,5 y -1,3,4,5 y otro componente tetraacetilado (1,5,x,y). Se supone que estos componentes se deben a metilación incompleta.

Se encontraron las cantidades siguientes para los componentes arriba mencionados en experimentos diferentes que se realizaron por cambio de la longitud de hidrólisis (indicada en negrita por el número de horas) (MA = análisis de metilación 1; MA-b = análisis de metilación 2):

Valores en % en moles
Ac en Pos	MA (1 h)	MA (2 h)	MA (3 h)	MA-b (2 h)
1,5	10,49	10,56	9,17	12,71
1,3,5	31,69	34,70	32,95	23,12
1,4,5	0,70	0,30	0,36	0,33
1,5,6	47,02	44,17	47,23	54,62
1,3,4,5	0,27	0,22	0,25	0,31
1,5,x,y	0,19	0,32	0,36	0,24
1,3,5,6	9,64	9,73	9,68	8,67

Ejemplo 13 Construcción de una casete de expresión para plantas: expresión vacuolar y plastídica de una alternansacarasa

Utilizando el plásmido pAlsu-pET24a como molde y los iniciadores PCR Al-5'-1.2 y Al-3'-2.2 (véanse SEQ ID NO 53 y 54) los autores de la presente invención amplificaron la región codificante de alternansacarasa de Leuconostoc mesenteroides que se cortó luego por las enzimas de restricción SalI y PstI. Después de ello, los fragmentos resultantes se clonaron en plásmidos digeridos con SalI y SdaI a) pBinAr-pat-Hyg y b) pBinAR-fnr-Hyg. Los plásmidos resultantes se designaron a) pat-Alsu-Hyg (véase figura 11) y b) fnr-Alsu-Hyg (véase figura 12).

Nota: El péptido señal de secreción bacteriana se eliminó de los cds por elección de los iniciadores PCR.

Condiciones de la PCR

Tampón y polimerasa de Boehringer Mannheim (polimerasa Pwo No. 1644947)

DNA	0,5 ng
10x tampón + MgSO_{4}	5 \mul
dNTPs (en cada caso 10 mM)	2 \mul
Iniciador Sp-AS-5'	100 nM
Iniciador Sp-AS-3'	100 nM
Polimerasa Pwo	1,0 unidades
Agua destilada	hasta 50 \mul

Condiciones de reacción

Paso 1	95ºC	2:30 min
Paso 2	95ºC	0:30 min
Paso 3	47ºC	0:30 min
Paso 4	68ºC	7:00 min
	(más 3 s por ciclo)
Paso 5	68ºC	15:00 min

Los pasos 2 a 4 se repitieron 35 veces de una manera cíclica.

Ejemplo 14 Análisis por transferencia Northern para expresión de alternansacarasa en plantas transgénicas

Hojas o tubérculos de plantas de patata transformadas por agrobacterias con los plásmidos pat-Alsu-Hyg y fnr-Alsu-Hyg, respectivamente, se pulverizaron en un molino, tipo MM 200, (Retsch GmbH & Co. KG, 42781 Haan, Alemania) a 30 Hz durante 50 s. El RNA se extrajo de acuerdo con Logemann et al. (Anal. Biochem. 163 (1987), 16-20). Se cargaron 50 \mug de RNA por muestra sobre geles de agarosa al 1% que contenían formaldehído. Después de electroforesis, el RNA se transfirió a membranas de nailon (Hybond N, Amersham, Reino Unido) por el método de transferencia capilar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} issue; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU. (1989)). La fijación de los ácidos nucleicos a la membrana se realizó por reticulación UV (Stratalinker, por Stratagene).

Las membranas se prehibridaron a 42ºC en tampón de hibridación (formamida al 25% (v/v), fosfato de sodio 250 mM, pH 7,2, cloruro de sodio 250 mM, EDTA 1 mM, SDS al 7% (p/v), polietilenglicol 6000 al 25% (p/v), 0,25 mg/ml de DNA de esperma de salmón cizallado) durante 6 h. Después de ello se realizó la hibridación a 42ºC durante una noche en tampón de hibridación que contenía adicionalmente una sonda radiomarcada. La sonda radiactiva se preparó utilizando el Kit de Marcación de DNA Random Primed (Boehringer Mannheim, 1004760) y el fragmento KpnI/XhoI de aprox. 4 kb del plásmido pAlsu-pSK de acuerdo con el manual de los fabricantes. Las membranas se lavaron a 50ºC una sola vez durante 20 min en 3xSSC (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} issue; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU. (1989)) seguido por un solo lavado durante 20 min en 0,5xSSC antes de exposición de la membrana a una película de rayos X durante una noche.

<110> MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZÜR FÖRDERUNG DER WISSENSCHAFTEN e.V.

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<120> Moléculas de Ácido Nucleico que Codifican Alternansacarasa

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<130> D1042 PCT

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<140>

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<141>

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<160> 54

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 9321

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<212> DNA

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<213> Leuconostoc mesenteroides

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<220>

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<221> CDS

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<222> (678)..(6848)

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<400> 1

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1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

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<210> 2

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<211> 2057

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<212> PRT

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<213> Leuconostoc mesenteroides

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<400> 2

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12

13

14

15

16

17

18

19

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<210> 3

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

actgcggccg catgccattt acagaaaaag

\hfill

30

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<210> 4

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

actgctcgag ttatgctgac acagcatttc

\hfill

30

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<210> 5

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Leuconostoc mesenteroides

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<400> 5

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\sa{Lys Thr Asn Glu Val Phe Leu}

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<210> 6

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Leuconostoc mesenteroides

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<400> 6

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\sa{Lys Phe Asp Ser Asp Arg Leu}

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<210> 7

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Leuconostoc mesenteroides

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<400> 7

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\sa{Lys Asn Met Gln Asp Thr Phe Thr Phe Asp Gln Leu Ala Gln Gly Met}

\sac{Glu Phe Tyr}

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<210> 8

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Leuconostoc mesenteroides

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<400> 8

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\sa{Lys Ser Thr Glu Trp Leu Arg Asp Ala Ile Asp Leu Phe Val Lys}

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<210> 9

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Leuconostoc mesenteroides

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<400> 9

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\sa{Lys Gly Ser Glu Phe Leu Leu Ala Asn Asp Ile Asp Asn Ser Asn Pro}

\sac{Ile Val Gln Ala Glu Gln}

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<210> 10

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

ytgrtcraan gtraangtrt cytgcatrtt ytt

\hfill

33

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<210> 11

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaygcnathg ayytnttygt naar

\hfill

24

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<210> 12

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<211> 837

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<212> DNA

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<213> Leuconostoc mesenteroides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210>13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2862

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leuconostoc mesenteroides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210>14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3970

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leuconostoc mesenteroides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210>15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1917

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leuconostoc mesenteroides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210>16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4066

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leuconostoc mesenteroides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210>17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7387

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leuconostoc mesenteroides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcccgcta gcatgaaaca acaagaaaca gt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccggggtcg acctttgtcg aatccttccc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6204

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leuconostoc mesenteroides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Thr Asn Ser Asn Val Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Gln Gln Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Val Pro Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Asp Glu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Asp Gly Asn Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Val Ala Asp Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Leu Arg Lys Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Glu Asn Thr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Val Asp Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Pro Asp Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asn Asp Ser Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Thr Phe Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Ser Gly Tyr Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asn Ala Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gln Tyr Thr Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Leu Tyr Arg Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Asp Lys Ala Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Arg Gln Tyr Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Thr Phe Ala Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Gln Tyr Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Phe Leu Asn Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Val Ser Asp Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ile Thr Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Tyr Val His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ala Pro Tyr Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Asp Tyr Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 47

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\sa{Leu Ser Gly Gln Glu}

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<210> 48

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 48

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\hskip-.1em\dddseqskip

tctagactgc aaaatggcaa ctacta

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26

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<210> 49

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 49

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgacggtt tcatttggag tagtta

\hfill

26

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<210> 50

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<211> 276

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<212> DNA

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<213> Solanum tuberosum

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<400> 50

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35

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<210> 51

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 51

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gcgtactcta gacgtactcc gccatgacca c

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31

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<210> 52

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 52

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gcgtacgtcg acggccctga tgggtcccat

\hfill

30

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<210> 53

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 53

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ggccgggtcg acgatacaaa ttcgaatgtc gctg

\hfill

34

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<210> 54

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia artificial

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<400> 54

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ggccggctgc aggttaccct cctttgtcga atc

\hfill

33

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Claims (24)

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de alternansacarasa seleccionada del grupo constituido por:

(a)

moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la forma madura de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2 o la secuencia de aminoácidos que es codificada por el cDNA contenido en el plásmido DSM 12666;

(b)

moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ. ID No. 1 o la secuencia de nucleótidos del cDNA contenido en el plásmido DSM 12666 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente;

(c)

moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia de aminoácidos tiene una homología de al menos 40% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2;

(d)

moléculas de ácido nucleico, una de cuyas cadenas se hibrida con una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a) o (b);

(e)

moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento biológicamente activo de la proteína que es codificada por una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c) o (d); y

(f)

moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía, debido a la degeneración del código genético, de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c), (d) o (e).

2. Un oligonucleótido o polinucleótido que se hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

4. El vector de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la molécula de ácido nucleico está conectada en orientación de sentido a elementos reguladores que aseguran la transcripción y síntesis de un RNA traducible en células procariotas o eucariotas.

5. El plásmido pAlsu-pSK depositado bajo el número de acceso DSM 12666.

6. Una célula hospedadora transformada con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o un vector de la reivindicación 3 ó 4 o descendiente de una célula de este tipo.

7. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, que es una célula de un microorganismo.

8. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, que es una célula de E. coli.

9. Un método para preparar una proteína o fragmento de la misma, teniendo dicha proteína o fragmento de la misma actividad de alternansacarasa, en donde una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 se cultiva en condiciones que permiten la síntesis de la proteína, y en donde la proteína se aísla de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

10. Una proteína o fragmento de la misma que tiene actividad de alternansacarasa codificada por una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 9, que no exhibe contaminación alguna con una proteína que tiene una actividad de síntesis de polisacáridos.

11. Una célula de planta transgénica transformada con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o un vector de la reivindicación 3 ó 4, o descendiente de una célula de este tipo, en donde dicha molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que tiene actividad de alternansacarasa se encuentra bajo el control de elementos reguladores que permiten la transcripción de un mRNa traducible en células vegetales.

12. Una planta que contiene las células vegetales de la reivindicación 11.

13. La planta de acuerdo con la reivindicación 12, que es una planta útil.

14. La planta de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, que es una planta que almacena azúcar o que almacena almidón.

15. Material de propagación de una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, comprendiendo dicho material de propagación las células vegetales de la reivindicación 11.

16. Un método para preparar alternano que comprende los pasos de extraer y aislar el alternano de una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

17. Un método para preparar alternano y/o fructosa, en donde:

a)

una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 secreta una alternansacarasa en un medio de cultivo que contiene sacarosa; y

b)

se aísla(n) alternano y/o fructosa del medio de cultivo.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la célula hospedadora está inmovilizada.

19. Un método para preparar alternano y/o fructosa, en donde:

a)

una solución que contiene sacarosa se pone en contacto con una proteína de la reivindicación 10 en condiciones que permiten la conversión de sacarosa en alternano y/o fructosa; y

b)

se aísla(n) alternano y/o fructosa de la solución.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la proteína está inmovilizada sobre un material soporte.

21. Un método para preparar alternano y/o fructosa, en donde

a)

una solución que contiene sacarosa se pone en contacto con una proteína de la reivindicación 10 y moléculas aceptoras en condiciones que permiten la conversión de la sacarosa en alternano y/o fructosa; y

b)

se aísla(n) alternano y/o fructosa de la solución.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la molécula aceptora se selecciona del grupo constituido por maltosa, isomaltosa, isomaltotriosa y metil-\alpha-D-glucano.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en donde la proteína está inmovilizada.

24. Un método para preparar productos cosméticos o productos alimenticios que comprende un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23 y la formulación del alternano resultante en una forma adecuada para uso como producto cosmético o alimenticio.